Lucía Mayela Gayosso

Desarrollo de líneas celulares competentes para la replicación de priones humanos
mediante la reprogramación de fibroblastos de pacientes genéticamente susceptibles
El objetivo del proyecto es obtener una línea celular capaz de replicar priones humanos in vitro.
Fibroblastos provenientes de biopsias de pacientes humanos que portan mutaciones en el gen
responsable de las enfermedades priónicas son reprogramadas y diferenciadas a neuronas. Las
neuronas reprogramadas se utilizan para infectarlas con priones humanos obtenidos a partir del
propio donante o familiares de éste. Los inóculos humanos se adaptarán previamente in
vitro para aumentar las posibilidades de éxito.
La enfermedad
Las enfermedades espongiformes transmisibles (EETs) también conocidas como enfermedades
priónicas pertenecen a un grupo de enfermedades neurodegenerativas mortales que afectan a los
seres humanos y animales y para las que no hay una terapia disponible (1). Las EETs pueden
tener diversos orígenes, incluyendo hereditario, esporádico e infeccioso. La enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (ECJ) en humanos, la tembladera en ovejas, la encefalopatía espongiforme
bovina (EEB) y el desgaste crónico en ciervos (DCC) son las formas más comunes de las
enfermedades priónicas. En general se caracterizan por ser enfermedades infecciosas que
presentan largos períodos de incubación durante los cuales no se muestran síntomas ni signos
clínicos. A lo largo de este período silente de la enfermedad, el agente infeccioso encuentra su
camino hacia el cerebro y comienza una lenta pero continua replicación en el sistema nervioso
central (SNC). La naturaleza del agente infeccioso de las EETs ha sido el centro de una
apasionada controversia por varias razones (2): 1) La hipótesis más aceptada propone que la
PrPSc, una forma anormalmente conformada de la proteína del prión PrPC, es el único
componente del agente infeccioso y que su propagación no implica la función de un ácido
nucleico (1). 2) No se han detectado diferencias químicas que permitan distinguir entre estas dos
isoformas de la PrP. 3) La conversión parece implicar un cambio estructural mediante el cual la
proporción de hélices α de la nueva estructura disminuye a favor de una mayor concentración de
láminas
(3). Estos cambios estructurales también se ven reflejados por alteraciones en sus
propiedades bioquímicas y biológicas: PrPC es soluble en detergentes no-desnaturalizantes,
mientras que PrPSc es insoluble; PrPC es fácilmente digerida por proteasas, mientras que PrPSc es
parcialmente resistente. 4) El mecanismo por el cual se propaga la enfermedad in vivo ha sido un
tema de intensa investigación. En el momento de la infección, la proporción de moléculas de
PrPSc inoculadas en comparación con el número de moléculas de PrPC endógenas es muy baja.
Sin embargo, cuando los individuos muestran los primeros signos clínicos de la enfermedad, la
cantidad de PrPSc en el cerebro aumenta exponencialmente. Este hallazgo sugiere que la PrPSc se
replica in vivo a expensas de la proteína celular PrPC y que PrPSc cataliza su conversión. Esto
tiene como resultado la formación constante y exponencial de la isoforma asociada a la
enfermedad. El primer paso en la replicación de los priones parece ser la interacción específica
entre PrPSc y PrPC. La existencia de una asociación física entre las dos isoformas durante el
proceso infeccioso está apoyada por la especificidad de secuencia observada en la transmisión de
los priones (4, 5) y por la producción intensa in vitro de nuevas moléculas de PrPSc después de
que niveles indetectables de PrPSc entren en contacto con suficientes cantidades de PrPC (4, 5).
En humanos se han descrito numerosas mutaciones que están implicadas directamente con la
enfermedad (6, 7). Las mutaciones se encuentran localizadas en la fase abierta de lectura del gen
prnp que codifica la PrPC, una pieza clave en el desarrollo de las EETs, y son responsables
aproximadamente del 10% de todas las enfermedades priónicas en humanos. La presencia de
alguna de estas mutaciones desencadena inevitablemente el desarrollo de la enfermedad aunque
esta ocurre a tiempos tardíos. Se desconoce el mecanismo molecular por el cual una proteína
mutada (PrPC) desencadena el proceso morboso dado que no todas las mutaciones tienen el
mismo tipo de penetrancia y el inicio de la enfermedad es altamente variable dependiendo de
parámetros aún desconocidos.
Las técnicas
En éste proyecto buscamos replicar priones humanos en cultivos celulares, objetivo nunca
conseguido hasta el día de hoy, se utilizan tres técnicas: Infección priónica de cultivos celulares,
ii) Reprogramación y diferenciación de fibroblastos a neuronas y iii), Replicación in vitro de
priones.
Infección priónica de cultivos celulares
En los últimos años varios grupos han obtenido replicación estable de priones en algunas líneas
celulares. La mayoría de los resultados satisfactorios se han realizado utilizando líneas celulares
derivadas de neuroblastomas murinos (C-1300) y en particular de la sublínea N2A (8, 9). Otros
tipos celulares de origen murino (GT1) (10), así como líneas celulares de rata (PC12) que
también han podido ser infectadas con priones murinos (11, 12); asi como en otros tipos
celulares (RK13, COS y otras) que expresen niveles adecuados de PrP ovina,. Los resultados
obtenidos tras su inoculación (13) ponen de manifiesto que la capacidad de replicación de los
priones en cultivos celulares depende por una parte de los niveles de expresión de la PrP y por
otra parte de la identidad de secuencia entre la PrP del inóculo y la PrPexpresada.
Desafortunadamente, esta estrategia se ha utilizado insatisfactoriamente tratando de replicar
otros priones como priones de hámster, bovinos e incluso humanos. Muchas otras estrategias,
todas ellas encaminadas a replicar priones bovinos y humanos han resultado negativas. La falta
de una línea celular humana capaz de replicar priones en cultivos in vitro está limitando
enormemente el estudio de los priones y el diseño de nuevas terapias.
Reprogramación celular. De fibroblastos humanos a neuronas
Con la reprogramación celular devolvemos el epigenoma de una célula madura a un estado
indiferenciado y pluripotente. Siguiendo el trabajo pionero de Shinya Yamanaka quien el pasado
mes de octubre del 2012 ganó el Premio Novel; mediante la técnica de reprogramación mediante
la expresión de factores de transcripción que controlan el circuito molecular de pluripotencia,
oct4, sox2, klf4 y c-myc, a través de vectores virales (14-18). Con esta técnica lo que hacemos es
obtener a partir de células adultas y accesibles, como los fibroblastos de la piel, líneas celulares
pluripotentes que son idénticas al individuo del que proceden, denominadas iPS (induced
pluritpotent stem cells). Las células que son reprogramadas a un estado indiferenciado y
pluripotente, pero con la carga genética de los individuos de quien proceden, son propagadas y
re-diferenciadas in vitro para estudiar la diferenciación neuronal e identificar rasgos diferenciales
que puedan estar implicados en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Además
permiten evaluar la susceptibilidad individual al efecto de diversas moléculas con potencial
terapéutico que puede o no ser común a las diferentes formas familiares y esporádicas de una
enfermedad. Esta tecnología es especialmente valiosa para el estudio de las enfermedades del
sistema nervioso ya que nos proporciona por primera vez la oportunidad de estudiar neuronas
humanas in vitro, procedentes de individuos afectos y portadores de mutaciones que predisponen
a ciertas enfermedades como las priónicas que afectan específicamente a determinados tipos
neuronales. Debido a la rápida innovación en cuanto a técnicas de diferenciación neuronal in
vitro estamos induciendo la transdiferenciación de los fibroblastos directamente a neuronas
mediante expresión de 4 factores de transcripción reduciendo la obtención de neuronas a tan solo
3 semanas.
Replicación in vitro de priones (PMCA)
Recientemente nuestro grupo ha desarrollado una estrategia que imita in vitro algunas de las
etapas implicadas en la replicación de priones in vivo, pero con una cinética acelerada (19-21). El
método llamado “amplificación cíclica de proteínas mal-plegadas”, del inglés PMCA, se
compone de ciclos de replicación basados en dos fases. Durante la primera fase la muestra que
contiene cantidades mínimas de PrPSc y un exceso de PrPC, se incuba para inducir el crecimiento
de los polímeros de PrPSc. En la segunda fase la muestra se somete a sonicación con el fin de
romper los polímeros de PrPSc, multiplicando de esta forma el número de semillas o núcleos
(19), los cuales se incrementarán de manera exponencial en cada ciclo. El carácter cíclico del
sistema permite el uso de tantos ciclos como sean necesarios para alcanzar el estado de la
amplificación adecuado para la detección de PrPSc en la muestra. Esta técnica ofrece la
posibilidad de ampliar la cantidad de PrPSc en la muestra a los niveles que pueden ser fácilmente
detectados por las técnicas bioquímicas actuales, llegando a detectar hasta una única unidad de
infección (22). Por otro lado, el método in vitro imita fielmente el proceso in vivo de replicación
de priones mantenimiento sus características más importantes: la infectividad (19) y los
fenómenos de barrera de transmisión (23) y de cepas de priones (24). La correlación entre los
datos in vivo y nuestros resultados in vitro sugieren que la PMCA es una herramienta muy
valiosa para adaptar in vitro cepas priónicas humanas para su posterior utilización en la infección
de los nuevos cultivos celulares generados.
Resultados
Hemos observado que las neuronas obtenidas a los 70 días de diferenciación, expresan
adecuados niveles de la proteína celular (sana), lo cual nos lleva a pensar que al ser infectadas
con priones humanos se obtendrá una infección y replicación de distintos priones humanos.
Conclusiónes
Teniendo en cuenta todos los intentos fallidos para la generación de líneas celulares capaces de
replicar priones humanos, nuestra firme hipótesis se basa en que tendremos éxito en la
replicación de priones en neuronas humanas debido a la combinación de éstos tres
procedimientos hasta ahora nunca aplicados de forma conjunta: i) utilización de células de
pacientes sanos o enfermos que portan una mutación que proporciona susceptibilidad a la
enfermedad priónica. ii) Diferenciaciñon de fibroblastos del paciente hacia neuronas, tipo celular
diana de los priones y iii) utilización de dos tipos de inóculos: priones humanos provenientes de
pacientes emparentados con los donantes de las células a reprogramar y priones humanos
previamente adaptados in vitro mediante PMCA. Disponer de un cultivo celular capaz de replicar
priones humanos tendrá de un valor incalculable para el avance en este tipo de enfermedades.
Tendremos la posibilidad de evaluar nuevos fármacos, estudiar los mecanismos moleculares
implicados en esta enfermedad, así como utilizar los cultivos celulares para mejorar el
diagnóstico.
Bibliografía
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