estudio de la capacidad de convolvulus arvensis l

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DE Convolvulus arvensis L. PARA TOLERAR Y
ACUMULAR SELENIO
Gustavo CRUZ JIMÉNEZ1, Jorge L. GARDEA-TORRESDEY2,3, José R. PERALTA-VIDEA
2
Ma. Guadalupe DE LA ROSA ÁLVAREZ4, Ma. Irene CANO RODRÍGUEZ4, Jaime
ROMERO GONZÁLEZ4, Elena RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ3, Eduardo DURÁN CASTRO1
1
Universidad de Guanajuato. Facultad de Química. Departamento de Farmacia. Colonia
Noria Alta s/n. Guanajuato, Guanajuato, C.P. 36050. Tel: +52 (473) 732 – 20006 ext.
8130, Fax: +52 (473) 732 – 20006 ext. 8108. e-mail: [email protected],
[email protected]. 2The University of Texas at El Paso. Department of Chemistry.
[email protected], [email protected]. 3The University of Texas at El Paso. Environmental
Science and Engineering, Ph.D. Program. [email protected]. 4Universidad de Guanajuato.
Facultad de Química. Departamento de Ingeniería Química. [email protected],
[email protected], [email protected]
Palabras clave: tolerancia, acumulación, convolvulus, selenio, fitorremediación
RESUMEN
Convolvulus arvensis L. es una planta que ha demostrado su capacidad de tolerar
y acumular metales, características que han sido consideradas para proponer su
posible uso en fitorremediación. En el trabajo se evalúa a C. arvensis para
determinar su posible uso en la fitorremediación de selenio (Se). Las semillas de
C. arvensis fueron germinadas en un medio que contiene una solución nutritiva de
Hoagland modificada y agar con diferentes concentraciones de Se (0, 5, 10, 20 y
40 mg/L). La tolerancia fue evaluada de acuerdo a los efectos que tuvo el Se en el
porcentaje de germinación, producción de plántulas, crecimiento de la planta y
contenido de clorofila. El porcentaje de germinación y contenido de clorofila no fue
afectado significativamente (p<0.05) en el rango de concentraciones de Se
estudiado al compararse con el control. Sin embargo, se observó que la cantidad
de plántulas fué reducida significativamente en el tratamiento de 40 mg/L de Se.
En concentraciones ≥ 5 mg/L, el Se tuvo un efecto significativo (p<0.05) en la
elongación de raíz, tallo y hojas. C. arvensis acumuló mayor cantidad de Se en la
raíz en comparación con el tallo o hojas. La parte aérea de las plántulas acumuló
cantidades por encima de los 100 mg/kg, lo anterior indica que puede ser
considerada como un acumulador moderado de Se. Por los resultados anteriores,
C. arvensis puede ser recomendado para su uso en fitorremediación de lugares
donde la concentración de Se disponible para las plantas sea menor de 5 mg/L.
INTRODUCCIÓN
El selenio (Se) es un nutriente necesario para animales y humanos, pero que en
concentraciones elevadas puede producir síntomas de toxicidad (Pinochet et a.
1999). El principal problema del Se es el estrecho margen que existe entre las
concentraciones en que se presenta un efecto benéfico y tóxico (Johnson, 2000).
1
En algunas regiones, como el Valle de San Joaquín en los Estados Unidos, las
altas concentraciones de Se encontradas en los sedimentos y agua han producido
efectos tóxicos en aves y los organismos acuáticos (Ohlendorf et al. 1986; Enberg
et al. 1998; Neal, 1995). Por lo tanto, diferentes estrategias y métodos han sido
propuestos con el fin de remover el Se en áreas contaminadas por éste elemento
(Dhillon y Dhillon, 2001). La fitorremediación (el uso de plantas para reducir los
niveles de contaminación en el ambiente) se ha recomendado como una
tecnología apropiada para reducir los niveles de Se encontrados dispersos en
grandes áreas. Esta nueva tecnología es de menor costo y más amigable con el
ambiente (Chaney et al. 1997). Por lo tanto, para propósitos de fitorremediación,
es necesario investigar plantas que puedan acumular Se en niveles de cientos a
miles de mg/kg (en el tejido seco) y que además puedan tolerar elevados niveles
del mismo (Feist y Parker, 2001; Siegel, 2001).
Algunas especies que crecen en regiones seleníferas del género Astragalus,
Stanleya, y Oonopsis pueden incorporar cantidades de Se que van del orden de
los miles de mg/kg en tejido seco en tallos y hojas. Estas especies pueden
considerarse como acumuladores primarios, de acuerdo a la clasificación
propuesta por Beath (Rosenfeld y Beath, 1964). Existen otras especies del género
Atriplex y Astragalus que acumulan Se en el orden de cientos de mg/kg en tejido
seco, y son considerados como acumuladores secundarios. Las especies no
acumuladoras integran en sus tejidos menos de 30 mg/kg (Rosenfeld y Beath,
1964). Especies del género Brassica acumulan Se en grandes cantidades sin
mostrar síntomas de fitotoxicidad. Debido a estas características, pueden
considerarse como acumuladores secundarios de Se, aunque no se encuentren
de manera natural en suelos seleníferos (Dhillon & Dhillon, 2001). El estudio y la
búsqueda de nuevas especies acumuladoras primarias y secundarias de Se
pueden servir como base para futuras aplicaciones biotecnológicas en el área de
la fitorremediación.
C. arvensis L. es una especie capaz de crecer en áreas donde existen metales en
gran concentración (Hickey y King, 1998; Del Rio et al. 2002). Por otro lado,
estudios realizados en condiciones controladas, C. arvensis fue capaz de resistir
altas concentraciones de metales (Gardea-Torresdey et al. 2004).
Las
características anteriormente mencionadas sugieren un posible uso de esta planta
en fitorremediación. Por lo tanto, se realizó un estudio de la capacidad de
tolerancia y acumulación de Se en C. arvensis usando agar como medio de
crecimiento de la planta. Los estudios de tolerancia se basaron en los efectos
producidos por el Se en la germinación, producción de plántulas y crecimiento de
raíz, tallo y hojas, y contenido de clorofila en hojas de C. arvensis a diferentes
niveles de Se. La capacidad de acumulación de Se fue determinada por la
cantidad de Se incorporada por los diferentes tejidos de C. arvensis cuando fué
expuesta a diferentes concentraciones de Se. Los detalles del estudio se
muestran a continuación.
2
MATERIALES Y MÉTODOS
Germinación de C. arvensis. Las semillas de C. arvensis fueron obtenidas en la
región fronteriza de Cd. Juárez, Chihuahua. Posteriormente, las semillas se
esterilizaron con hipoclorito de sodio al 4% durante 30 minutos y con agitación
constante (Jones y Darrah, 1993). Después, las semillas fueron lavadas tres veces
con agua desionizada estéril. Aproximadamente 30-40 semillas fueron sembradas
en agar solidificado en recipientes de plástico Glad® de 946 mL de capacidad, que
previamente fueron esterilizados usando hipoclorito de sodio comercial al 8%
durante 30 minutos. Los recipientes fueron cubiertos con películas de polietileno
esterilizadas de la misma manera que los envases de plástico. La preparación del
agar fue a partir de una solución nutritiva Hoagland modificada (Peralta-Videa et
al. 2002). Las concentraciones finales de las sales contenidas en la solución
nutritiva fueron: KNO3 (2.55x10-4 M); Mg(NO3)·6H2O, (9x10-4M); Fe(NO3)3·6H2O,
(1.0x10-5M); H3BO3, (2.31x10-5M), MnCl2·4H2O, (4.0x10-6M); CuSO4·5H2O(4.4x107
M); Zn(NO3)2·6H2O, (3.70x10-7M); Ca(NO3)2·4H2O, (3.57x10-4M); KH2PO4,
(9.68x10-4M); MoO3, (6.95x10-8M); CaCl2·2H2O, (2.14x10-3M). Na2SeO4 fue
adicionado en el medio con el fin de obtener los diferentes tratamientos con 0, 5,
10, 20 y 40 mg/L de Se. Las soluciones finales se ajustaron a un pH=5.8, se les
adicionó agar en una concentración de 5g/L y las mezclas fueron esterilizadas
usando un autoclave a una temperatura de 115°C y 1.1 kg cm-2 de presión durante
15 min. Aproximadamente 200 mL de medio con agar fueron adicionados en los
recipientes de plástico y se dejó solidificar. Para el sembrado se usó una campana
de flujo laminar. Se hicieron tres réplicas de cada tratamiento para fines
estadísticos y así poder evaluar germinación, producción de plántulas, crecimiento
de tejidos y acumulación de Se en C. arvensis a diferentes niveles de Se. Las
semillas sembradas en el agar se colocaron en una cámara de crecimiento con un
fotoperíodo de 12 hrs luz/ 12 hrs oscuridad durante 21 días.
Efecto del Se en el crecimiento de la planta. Las semillas sin germinar y las
plántulas fueron contadas para determinar su porcentaje de germinación y el
porcentaje de plántulas obtenidas en cada tratamiento. Las plántulas fueron
lavadas usando HCl 0.01M y agua desionizada. El contenido de clorofila fue
cuantificado usando un medidor de clorofila (SPAD-502 Chlorophyll Meter, Minolta
Co. Ltd, Osaka, Japan). La raíz principal, tallo y hojas de cada plántula fueron
medidos para determinar su crecimiento. La tolerancia fue valorada de acuerdo a
los parámetros de % de germinación, producción de plántulas, longitud de raíz,
tallo y hojas, y del contenido de clorofila en las hojas.
Determinación de Se acumulado en C. arvensis. Las plántulas fueron divididas
en raíces, tallos y hojas. Posteriormente fueron secadas a 60°C por 48 hrs en una
estufa. Después del secado, las muestras fueron pesadas, y digeridas agregando
5 mL de HNO3 concentrado (de alta pureza) y usando un horno de microondas
(PE Multiwave, Anton Paar® GmbH). La digestión se llevo a cabo en vasos
presurizados y cerrados para evitar pérdidas de Se. El contenido de Se en los
tejidos fue cuantificado por Espectrometría de Emisión Atómica con Plasma
Acoplado Inductivamente (EEA-PAI; ICP-OES, Optima 4300 DV, Perkin Elmer
3
Instruments, Norwalk, Connecticut). La señal analítica para Se fue medida a
196.026 nm de acuerdo al método EPA (US-EPA, 1983). Los coeficientes de
correlación obtenidos de las curvas de calibración de los estándares de Se fueron
de 0.999 o mayores. Los datos de germinación, crecimiento, contenido de clorofila
y acumulación de Se, fueron analizados estadísticamente, utilizando análisis de
varianza y la prueba de Tukey para detectar diferencias significativas entre
tratamientos con p<0.05.
RESULTADOS
Efectos de Se en la germinación y crecimiento de C. arvensis. Los resultados
de la prueba de germinación, producción de plántulas y contenido de clorofila
realizada en C. arvensis usando agar como soporte y diferentes concentraciones
de Se es mostrado en la Tabla I. El criterio de germinación para este estudio fue
el de considerar como “germinada” todas aquellas semillas que presentaran una
radícula con una longitud mayor a 2 mm. En el caso de las plántulas, fueron
consideradas todas aquellas semillas que además de germinar se desarrollaron y
presentaron raíz, tallo y hoja. En la tabla se observa que las semillas tienen un
bajo porcentaje de germinación, como es evidente en los resultados del control, en
el cual el porcentaje de germinación es 41.9%. Sin embargo, en una concentración
de 10 mg/L hubo un ligero incremento (44.5%) aunque no significativo. En
concentraciones de 20 y 40 mg/L se observó un decremento a 32.5% y 33.4%,
respectivamente. En todos los tratamientos con Se al compararse con el control,
no se observaron diferencias significativas (p<0.05) de acuerdo a la prueba de
Tukey. Por otro lado, se observó que la producción de plántulas disminuyó
significativamente (p<0.05) a una concentración de 40 mg/L con respecto al
control. Es probable que la toxicidad del Se redujo la división celular después de
la germinación, originando una menor cantidad de plántulas.
Tabla I. Porcentaje de germinación, porcentaje de plántulas obtenidas y contenido
de clorofila en C. arvensis cultivado en agar a diferentes concentraciones de Se.
Las letras minúsculas diferentes, que se encuentran como subíndices, indican que
existen diferencias significativas entre cada tratamiento (p<0.05) de acuerdo a la
prueba de Tukey. Los resultados expresan el promedio ± error estándar (n=3).
Concentración de
Germinación
Plántulas
Clorofila
(%)
(%)
(SPAD)*
Se
(mg /L)
34.5 ± 1.1(39)**
41.9 ± 4.1
35.5 ± 5.7 a
0
41.3 ± 3.5
20.5 ± 5.0 ab
35.1 ± 1.8 (29)
5
44.5 ± 11.9
22.8 ± 2.9 ab
30.6 ± 1.8 (27)
10
32.5 ± 0.4
29.8 ± 1.2 ab
32.3 ± 1.3 (38)
20
33.4 ± 3.5
15.9 ± 1.4 b
35.9 ± 1.4 (37)
40
*SPAD = Valores en unidades SPAD (Soil Plant Analytical Division)
** Los valores en paréntesis indican el número de hojas utilizadas para realizar el análisis estadístico del contenido de
clorofila.
4
En cuanto al contenido de clorofila determinada en las hojas de C. arvensis
usando el medidor de clorofila, la Tabla I muestra que aunque el valor del control
(34.5) fué menor que los obtenidos en los tratamientos de 5 y 40 mg/L (35. 1, y
35.9, respectivamente), las diferencias no fueron estadísticamente significativas.
Sin embargo, a concentraciones de 20 y 40 mg/L de Se, las plántulas presentaron
clorosis moderada en sus hojas secundarias. Este efecto no fue observado en las
hojas primarias.
Los efectos del Se en la elongación de las plántulas se muestra gráficamente en la
Figura 1. La figura muestra que existen diferencias significativas en la longitud de
raíz, tallo y hoja (p<0.05) entre las plántulas expuestas al Se y las del control. La
longitud media de las raíces en el control fue de 122.2 mm. Sin embargo, el valor
promedio de las raíces tratadas con 5 mg/L de Se fue de 17.2 mm. Por lo tanto, la
elongación de la raíz fue reducida en un 86 % en comparación con el control.
Además, se observó de manera visual que las raíces expuestas a Se presentaron
síntomas de toxicidad como la perdida de raíces laterales y la formación de un
ángulo con respecto al tallo. Estas deformaciones en la forma de la raíz no fueron
observadas en el control. También fué notorio que en las raíces expuestas a
grandes concentraciones de Se, la formación de un color rojo-rosado, que esta
relacionado con la formación de Se coloidal (NAS, 1976).
Los tallos en el control presentaron una elongación promedio de 60 mm, mientras
que las expuestas a 5 mg/L de Se tienen una elongación de 30 mm. Esta
diferencia fue estadísticamente significativa (p<0.05). La longitud de los tallos de
las plántulas expuestas a 40 mg/L de Se fue estadísticamente menor que los tallos
expuestos a 5 y 10 mg/L de Se. Como sucedió en las raíces, algunos tallos
presentaron un color rojo-rosado.
La elongación de las hojas fue reducida significativamente (p<0.05) en la
presencia de Se en comparación con las hojas del control (Figura 1). Sin
embargo, en cada caso, no existieron diferencias significativas en la elongación de
la hoja entre los diferentes tratamientos por arriba de 5 mg/L. En otras especies
como Salsola kali, Medicago sativa L. y Brassica oleracea L cv. Maghi,
concentraciones elevadas de metales (Cd, Cr, Cu, Ni, Zn, y Co) redujeron la
producción de biomasa o redujeron la elongación de raíces o tallos (de la Rosa et
al. 2004; Peralta-Videa et al. 2001, 2002; Chatterjee y Chatterjee, 2000). Estos
síntomas están relacionados a efectos fitotóxicos por acumulación de metales.
Los síntomas causados por la acumulación de Se fueron parecidos a los causados
por los metales mencionados con anterioridad (Euliss and Charmichel, 2004;
Bañuelos et al. 1997).
5
140
a
Longitud (mm)
120
100
Raíz
80
Tallo
60
Hoja
a
40
b
20
a
b
b
b
b
b
b
bc
b
b c
b
0
0
5
10
20
40
Concentración de Se en agar (mg/L)
Figura 1. Longitud de raíz, tallo, y hoja para C. arvensis después de 21 de
exposición a Se en agar. Las letras en minúscula representan diferencias
significativas en la longitud entre los tratamientos del mismo tejido (p<0.05) de
acuerdo a la prueba de Tukey. Las barras de error indican el error estándar (n=3).
Acumulación de Se en C. arvensis. Los resultados de la acumulación de Se en
C. arvensis se muestra en la Figura 2. Existe un incremento en la acumulación de
Se en los tejidos de las plántulas conforme se aumenta la concentración de Se en
el medio. La cantidad de Se acumulado por las raíces fue 453 y 1393 mg/kg en
tejido seco de C. arvensis en medios con 5 y 40 mg/L de Se, respectivamente, lo
cual representa un aumento en acumulación de aproximadamente 67.5%. Las
concentraciones de Se en los tallos fueron de 144 y 298 mg/kg en tejido seco para
los tratamientos de 5 y 40 mg/L de Se, respectivamente. Estas cantidades fueron
significativamente diferentes (p<0.05). Las cantidades de Se encontradas en las
hojas de las plántulas expuestas a 10 y 40 mg/L de Se fueron significativamente
diferentes (p<0.05). También en la Figura 2 se observa una tendencia general en
la acumulación de Se en la raíz en comparación con el tallo y la hoja para cada
uno de los tratamientos. Es probable que C. arvensis metabolice Se a nivel de
6
Concentración de Se
(mg/kg tejido seco)
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
aA
aA
Raiz
Tallo
Hoja
ab
abA
bcB bcB
5
bc
b
10
abB abB
aB aB
20
40
Concentración de Se en agar (mg/L)
Figura 2. Concentración de Se en raíz, tallo y hoja de C. arvensis después de 21
días de exposición a Se usando agar como medio. Las letras minúsculas indican
diferencias significativas en la acumulación de Se en el mismo tejido entre los
diferentes tratamientos (p<0.05). Las letras en mayúsculas indican diferencias
significativas (p<0.05) en la acumulación de Se entre raíz, tallo y hoja en el mismo
tratamiento. Las barras de error representan el error estándar (n=3).
raíz para evitar la toxicidad de Se en la hoja. De esta manera, las funciones como
la de producción de clorofila no se ve afectada. Debido a la cantidad de Se
acumulada en la parte aérea de C. arvensis (por encima de 100 mg/kg en tejido
seco) es posible considerar a esta planta como una planta acumuladora
secundaria de Se, de acuerdo a la clasificación de Beath (Rosenfeld and Beath,
1964).
DISCUSIÓN
C. arvensis acumuló Se en su parte aérea (tallo y hoja) en concentraciones
mayores de 100 mg/kg en tejido seco, por lo que de acuerdo a la clasificación
propuesta por Beath, puede considerarse como una especie secundaria
acumuladora de Se (Rosenfeld and Beath, 1964). La especie bajo estudio fue
capaz de germinar y producir plántulas aún en concentraciones de 40 mg/L de Se
(como selenato SeO42-) usando agar como medio de crecimiento. En base a los
estudios de germinación y contenido de clorofila, no hubo diferencias significativas
(p<0.05) entre los diferentes tratamientos (5 a 40 mg/L de Se) al compararse con
el control. Un efecto significativo en la reducción del porcentaje de producción de
7
las plántulas (p<0.05) fue observado cuando éstas crecieron en un medio con 40
mg/L de Se. Por los resultados anteriores, se puede considerar a C. arvensis
como una especie acumuladora secundaria de Se y puede ser considerada para
su uso en fitorremediación. Sin embargo, debido a la reducción estadísticamente
significativa (p<0.05) en la elongación de raíz, tallo y hoja observada en
concentraciones mayores a los 5 mg/L de Se, se recomienda su uso para lugares
donde los niveles de Se disponible para las plantas sea menor de 5 mg/L.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo otorgado por las siguientes dependencias: NIH
(National Institute of Health, USA), UTEP-CERM (The University of Texas at El
Paso-Center for Environmental Resource Management, USA), DOE (Department
of Energy, HBCU/MI, USA), CONACyT (Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología, México), CONCyTEG (Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de
Guanajuato, México) y al acuerdo Universidad de Guanajuato-SEP-PROMEP
(Secretaría de Educación Pública, México). También se agradece la valiosa
colaboración del Ing. Baltazar Corral Díaz de la Universidad Autónoma de Ciudad
Juárez.
REFERENCIAS
Bañuelos G.S., Ajwa H.A., Wu L., Guo X., Akohoue., y Zambrzuski S. (1997).
Selenium-induced growth reduction in Brassica land races considered for
phytoremediation. Ecotoxicol. Environ. Saf. 36, 282-287.
Chaney R. L., Malik M., Brown S. L., Brewer E. P., Angle J. S., y Baker A. J. M.
(1997). Phytoremediation of soil metals. Curr. Opin. Biothecnol. 8, 279-284.
Chatterjee J., y Chatterjee C. (2000). Phytotoxicity of cobalt, chromium and copper
in cauliflower. Environ. Pollut. 109, 69-74.
De la Rosa G., Peralta-Videa J.R., Montes M., Parsons J.G., Cano-Aguilera I, y
Gardea-Torresdey J.L. (2004). Cadmium uptake and translocation in tumbleweed
(Salsola kali), potential Cd-hyperaccumulator desert plant species: ICP/OES and
XAS studies. Chemosphere. 55, 1159-1168.
Del Rio M., Font R., Almela C., Velez D., Montoso R., y Bailon A.D.H. (2002).
Heavy metals and arsenic uptake by wild vegetation in the Guadiamar river area
alter the toxic spill of the Aznalcollar mine. J. Biotechnol. 98, 125-137.
Dhillon K.S., y Dhillon S. K. (2001). Restoration of selenium–contaminated soils.
En: Environmental Restoration of metals–contaminated soils. CRC Press. Boca
Raton, FL. pp 208-218.
8
Enberg R.A., Westcot D.W., Delamor M., y Holz D.D. (1998). “Federal and state
perspectives on regulation and remediation of irrigation-induced selenium
problems”. En: Environmental Chemistry of Selenium. Marcel Decker, Inc. New
York, N.Y. pp. 14-17.
Euliss K.W. y Carmichael J.S. (2004). The effects of selenium accumulation in
hidroponically grown canola (Brassica napus). Journal of Young Investigators. 10.
http://www.jyi.org/volumes/volume10/issue1/articles/euliss.html.
Accesado el:
02/08/04.
Feist L. J. y Parker D. R. (2001). Ecotypic variation in selenium accumulation
among populations of Stanleya pinnata. New Phyto. 149, 61-69.
Gardea-Torresdey J. L., Perata-Videa J. R., Montes M., De la Rosa G., y CorralDiaz B. (2004). Bioaccumulation of cadmium, chromium and copper by
Convolvulus arvensis L.: impact on plant growth and uptake of nutritional elements.
Bioresour. Technol. 92, 229-235.
Hickey M. y King C. (1988). 100 families of flowering plants. Cambridge University
Press. New York, NY. pp. 371-373.
Johnson T. M., Bullen T. D., y Zawislanki P. T. (2000). Selenium stable isotope
ratios as indicators of source and cycling of selenium results from the Northern
Beach of San Francisco Bay. Environ. Sci. Technol. 34, 2075-2079.
Jones D. L. y Darrah P. R. (1993). Re-sorption of organic compounds by roots of
Zea mays and its consequences in the rhizosphera. Plant and soil. 153, 47-59.
NAS, National Academy of Sciences. (1976). Selenium. National Research
Council. Washington, D.C., pp. 66-69
Neal R.H. (1995). “Selenium”. En: Heavy Metals in soils. Chapman and Hall. New
York, N.Y. 2da. Edición. pp. 276-279.
Ohlendorf H. M., Hoffman D. J., Saiki M. K. y Aldrich T. W. (1986). Embryonic
mortality and abnormalities of acuatic birds: apparent impacts of selenium of
irrigation drainwater. Sci. Total Environ. 52, 49-63.
Peralta J.R, Gardea-Torresdey J.L., Tiemann K.J., Gomez E., Arteaga S., Rascon
E., y Parsons J.G. (2001). Uptake and effects of five heavy metals on seed
germination and plant growth in alfalfa (Medicago sativa L.). Bull. Environ.
Contam. Toxicol. 66, 727-734.
Peralta-Videa J.R., Gardea-Torresdey J.L., Gomez E., Tiemann K.J., Parsons J.G.,
y Carrillo G. (2002). Effect of mixed cadmium, copper, nickel and zinc at different
pHs upon alfalfa growth and heavy metal uptake. Environ. Pollut. 119, 291-301.
9
Pinochet H., De Gregori I., Lobos M. G., and Fuentes E. (1999). Selenium and
copper in the vegetables and fruits grown on long-term impacted soils from
Valparaíso region, Chile. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 63, 327-33.
Rosenfield I. and Beath O. A. (1964). Selenium geobotany, biogeochemistry,
toxicity, and nutrition. Academic Press, New York. pp 91-93.
Siegel F.R. (2002). Environmental geochemistry of potentially toxic metals.
Springer. Germany. p. 169.
US-EPA, United States Environmental Protection Agency (1983). Methods for
chemical analysis of water and waste. EPA-600/4-79-020, Methods 3051 y 270.3.
10