(productos derivados).

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NTE INEN 0636 (1982) (Spanish): Cacao
(productos derivados). Determinación del
almidón(Método enzimático)
CDU: 663.91


 Norma Técnica
Ecuatoriana
CACAO
(Productos derivados)
DETERMINACION DEL ALMIDON (Método Enzimático)
AL 02.06-301
INEN 636
1981-07
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
1. OBJ ETO
1.1 Esta norma establece el método para determinar el contenido de almidón en la pasta de cacao, cacao en
polvo y chocolates.
2. ALCANCE
2.1 Esta norma se aplica al almidón natural, a la fécula natural, a los productos obtenidos por extracción a
partir de sus almidones y a los productos que en ellos se incluyen.
2.2 Esta norma es generalmente aplicable a los productos que han tenido un tratamiento hidro-térmico.
3. RESUMEN
3.1 Dispersión del almidón por calentamiento en agua hirviente, seguido de un tratamiento en autoclave;
hidrolisada la gluco-amilasa, el almidón dispersado es transformado en glucosa y determinado espectrofotométricamente por el método de la glucosa-oxidasa.
4. INSTRUMENTAL
4.1 Balanza analítica. Sensible al 0,1 mg.
4.1.1 Autoclave, con temperatura regulable a145°C.
4.2 Espectrotómetro, regulable a 540 nm.
4.3 Aparatos apropiados para la molienda.
3
4.4 Matraz Erlenmeyer de 100 cm .
3
4.5 Matraz aforado de 250 cm .
4.6 Baño con agitador y regulador de temperatura ajustado a 55 ° C ± 1 °C.
4.7 Filtra plegable de 10 cm de diámetro, para filtración corriente, de calidad analítica.
4.8 Tubos del ensayo de 18 mm de diámetro.
3
4.9 Pipetas de 0,2-0,4-0,5- 0,6-0,8-1,0-2,0-2,5 y 5,0 cm .
4.10 Plancha eléctrica de calentamiento. con regulador de temperatura ajustado a 37°C ± 1 °C.
(Continúa)
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5. REACTIVOS

5.1 Gluco-amilasa, extraída de Rhizopus delemer (ver Anexo A).
3
5.2 Solución acética (pH 4.8). Disolver 120 cm de ácido acético cristalizable y 164 g de acetato de sodio
3
anhidro, diluir a 1 000 cm con agua destilada.
3
5.3 Solución estándar de glucosa. Disolver 500 mg de glucosa anhidra en agua destilada y diluir al 000 cm .
3
5.4 Solución estándar diluida de glucosa de 50 mg por 1 000 cm . Disolver 1/10 de la solución (5.3) en 1
3
000 cm de agua. (Esta solución no debe ser utilizada en menos de cuatro horas desde el momento de su
preparación).
5.5 Soluciones testigo, para trazar la curva de calibración. Se preparan soluciones testigo transfiriendo 0,2;
3
0,4; 0,6; 0,8 y 1,0 cm de la solución 5.4 correspondientes a 10, 20, 30, 40 y 50 µg de glucosa; completar
3
a 1 cm con agua destilada; enseguida proseguir como se anota en 7.12.
5.5.1 Trazar la curva de calibración para cada serie de ensayos.
5.6 Solución al 1% de tiosalicilato de etileno de sodio y de mercurio (mertiolato de sodio).
5.7 Solución patrón de trisfosfato de glicerol. Disolver 36,3 g de trihidroxi -metil-amina-metano (tris) y 50 g
3
de fosfato diácido de sodio NaH2PO4 (o 45,5 g de NaH2PO4 anhidro) en 500 cm de agua destilada. Añadir 400
3
cm de glicerol bidestilado. Ajustar el pH a 7,0 con el ácido fosfórico antes de completar a 1 000 cm
3
con el
agua.
3
5.8 Glucosa-oxidasa-peroxidasa (reactivo). Disolver dentro de 100 cm de la solución patrón de tris-fosfato
glicerol (5.7) 30 mg de glucosa oxidasa de Aspergillus niger-tipo II (sigma), 3 mg de peroxidasa de raifort tipo I
(sigma), 10 mg de dicloruro de ortodianisidina (sigma) CH3O (NH2) C6H3C6H3 (NH2) O CH3.2HCI. Esta mezcla
puede ser conservada a + 4°C dentro de un frasco de color oscuro, por lo menos10 días.
5.9 Solución 18 N de ácido sulfúrico.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
6.1 Sí la muestra es semisólida o sólida (pasta de cacao y/o chocolate), se coloca el recipiente que la contiene,
cerrado herméticamente, en una estufa o baño María entre 45 ° ± 5 ° C, y se lo mantiene allí hasta que la
muestra alcance tal temperatura (lo suficiente para ablandar la muestra completamente).
6.2 Homogeneizar la muestra ablandada, agitando varias veces el recipiente que lo contiene (preferiblemente
con la ayuda de un agitador mecánico), hasta que ésta adquiera consistencia espesa o cremosa.
6.3 Sumergir el frasco en agua helada, agitando continuamente hasta cuando la temperatura de la muestra
llegue al punto de congelación y la masa se haya solidificado, o sea hasta una fina condición granular, para
desmenuzar o rallar.
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6.4 En los chocolates con ingredientes y rellenos, antes de desmenuzar o mientras se desmenuza la muestra,
se deben extraer los productos agregados, utilizando una espátula o un instrumento adecuado.
6.5 Cuando se trata de productos en polvo, mezclar la muestra completamente antes de extraer la porción de
ensayo.
7. PROCEDIMIENTO
7.1 La determinación debe efectuarse por duplicado sobre la misma muestra preparada.
7.2 Pesar 4 g de muestra preparada, para productos de cacao que no contengan azúcar, y 10 g de muestra,
para productos de cacao que contengan azúcar.
7.3 Transferir la muestra a un mortero, agregar 25 cm de éter y cautelosamente moler.
7.4 Decantar y, una vez que el producto grueso se haya sedimentado, filtrar et éter junto con el material fino
suspendido, sobre un papel filtro de 11 cm de diámetro y de textura suficientemente fina, para que pueda ser
retenido el almidón crudo.
7.5 Repetir, si es necesario, el tratamiento 7.4, hasta que toda la grasa se haya removido.
7.6 Transferir el residuo libre de grasa, nuevamente al mortero, y por medio de un chorro de agua fría, trasladar
el residuo nuevamente al filtro, y lavarlo hasta que todo el azúcar se haya removido (en caso de productos
3
azucarados, el filtrado no deberá ser mayor de 500 cm .); finalmente, secar de acuerdo a lo indicado en la
Norma INEN 536.
7.7 Del material seco, pesar aproximadamente 0,5 g de muestra con aproximación a 0, 1 mg, y colocarlo en un
matraz Erlenmeyer de 100 cm (ver 4.4), previamente tarado, y agregar progresivamente y con agitación
3
constante para disgregar el producto de 20 a 25 cm de agua.
7.8 Asegurarse que el pH de la solución acuosa esté entre 5 y 7; en caso contrario, lograr llevar a este pH.
Luego hacer un primer desdoblamiento del almidón, poniendo la suspensión a la ebullición y manteniéndola en
ésta por tres minutos, luego trasladar el matraz Erlenmeyer tapado con un pequeño tapón al autoclave a 135°C
(4.1), por el tiempo de 1 hora y a una presión de 0,319 pascales (3,19 bar) (ver nota 1).
7.9 Sacar el matraz Erlenmeyer con su contenido del autoclave y mantenerlo a una temperatura de 55°C,
3
3
agregar 2,5 cm de la solución acética (5.2) y 0,5 cm de la solución de mertiolato de sodio (5.6). Llevar el
matraz Erlenmeyer y su contenido hasta que juntos adquieran una masa, igual a 45 ± 1 g, por adición de agua.
7.10 Colocar el matraz Erlenmeyer y su contenido dentro de un baño de agua (4.6) regulada a 55° ± 1°C,
3
añadir 5 cm de la solución de gluco-amilasa (5.1) y poner en funcionamiento al agitador.
_________________
NOTA 1. La dispersión dentro del agua a ebullición no es suficiente para destruir la estructura del grano de almidón; es
necesario, dentro de los casos de almidones ricos en amilasa, elevar la temperatura a 140 – 145 °C.
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7.11 Después de dos horas de hidrólisis, filtrar la dispersión sobre el papel filtro plegable (4.7) y recoger el
3
filtrado en el matraz aforado de 250 cm (4.5), lavar el residuo y el filtro, y llevar a la marca con agua desti3
lada; esta solución deberá contener entre 10 y 50 mg de glucosa por cm .
3
3
7.12 Transferir 1 cm de la solución 7.11 dentro de un tubo de ensayo, añadir 2 cm del reactivo glucosa-oxidasa. Dejar que la reacción se desarrolle a la oscuridad y a una temperatura de 37 ± 1°C, durant e 30
3
minutos. Luego añadir 2 cm de la solución de ácido sulfúrico 18 N y determinar la absorvancia a 540 nm,
utilizando el espectrofotómetro calibrado con el blanco (ver 7.14).
7.13 Determinar el contenido de almidón presente en la muestra, utilizando la curva de calibración (ver 5.5).
7.14 Realizar un solo ensayo en blanco con todos los reactivos, sin la muestra, y siguiendo el mismo procedimiento a partir de 7.12; reemplazar la solución de glucosa por agua destilada, para cada determinación o serie
de determinaciones.
8. CÁLCULOS
8.1 El contenido de almidón en porcentaje de masa, en una muestra de cacao (o sus productos derivados),
se calcula mediante la ecuación siguiente:
m1
A = 0,9 x
10
6
250
x
V1
x
Vo
100
x
1
100
x
m
=
100 – P
m 1 x V1
2,25 x
Vo x m x (100 - p)
Siendo:
A
= contenido de almidón, en porcentaje de masa.
m
= masa de la muestra del ensayo, en g.
m1 = masa obtenida en la curva de calibración, en micro-organismos.
3
3
Vo = volumen de la solución llevada a 250 cm después de la hidrólisis, en cm .
3
V1
= volumen de la alícuota hidrolizada diluida, en cm .
P
= pérdida por calentamiento, en porcentaje de masa.
9. ERRORES DE MÉTODO
9.1 La diferencia entre los resultados de una determinación efectuada por duplicado no debe exceder de
2%; en caso contrario, debe repetirse la determinación.
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10. INFORME DE RESULTADOS
10.1 Como resultado final, debe reportarse la media aritmética de los dos resultados de la determinación.
10.2 En el informe de resultados, deben indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse, además, cualquier condición no especificada en esta norma, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.
10.3 Deben incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra.
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ANEXO A
MÉTODO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD GLUCO-AMILASA
A.1 Terminología.
A.1.1 Unidad Internacional (UI) de gluco-amilasa es la cantidad de ésta liberada a partir del almidón fluido
de 1 micromol de glucosa en un minuto, dentro de las condiciones señaladas en este anexo.
A.2 Resumen.
A.2.1 Hidrolizar a 37°C (pH 4,8) una solución de almidón fluido correspondiente a la mitad de una cantidad determinada de gluco-amilasa; la glucosa liberada será proporcional a la duración de la hidrólisis.
A.2.2 La determinación de la glucosa será efectuada por el método descrito en esta norma.
A.3 Reactivos.
3
A.3.1 Solución al 0,01 g por cm de almidón fluido.
A.3.2 Gluco-amilasa, extraída de Rhizopus delemar.
A.4 Aparatos.
3
A.4.1 Matraz Erlenmeyer de 10 cm .
A.5 Procedimiento.
3
A.5.1 Pesar, con aproximación a 0,1 mg, una masa de gluco-amilasa, de tal manera que 1 cm de la solución a dosificar (A.5.3) corresponda a la liberación de 45 µg de glucosa en 15 minutos.
3
3
A.5.2 Añadir a la solución de ensayo 5 cm de la solución de almidón fluido (A.3.1) y 0,2 cm de la solu3
ción acética (5.2), completar a 10 cm con el agua y colocar la solución a 37° ± 1°C.
A.5.3 Hidrolizar la muestra durante 5, 10, 15 minutos, tomar una parte alícuota del hidrolizado (Vo) y diluir dentro las condiciones indicadas en A.5.1. Luego tomar una alícuota del hidrolizado (V1), que correspondería al volumen final del hidrolizado.
A.5.4 Dosificar la glucosa dentro de la solución de ensayo, siguiendo el modo operativo descrito en esta
norma (numerales 7.12 - 7.13).
A.5.5 Efectuar un ensayo en blanco en iguales condiciones que lo indicado anteriormente, pero sin la gluco-amilasa.
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A.6 Cálculos.
A.6.1 Después de haber verificado la relación lineal entre el tiempo de hidrólisis y la cantidad de glucosa liberada, la actividad de la gluco-amilasa en unidades internacionales por gramo de preparación enzimática se
calcula mediante la ecuación siguiente:
m1 – mo
UI =
1
x
180 x t1
10
x
m
V1
x
Vo
1

Siendo:
UI
= actividad de la glucosa-amida en UI por gramo.
m
= masa de la muestra del ensayo, en g.
t1
= tiempo de hidrólisis, en minutos.
3
m1 = masa de glucosa liberada durante el tiempo t1, correspondiente a 1 cm del hidrolísado diluido,
en microgramos.
mo = masa de glucosa liberada durante el tiempo t1 al curso del ensayo en blanco, en microgramos.
180 = masa de un micromol de glucosa.
3
Vo = volumen de la parte alícuota tomada a partir de la hidrólisis (5.3), en cm .
V1
3
= volumen final tomado del hidrolizado después de la dilución, en cm (5.3).
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APÉNDICE Z
Z.1 NORMAS A CONSULTAR
INEN 536 Cacao (Productos derivados). Determinación de la pérdida por calentamiento.
Z.2 BASES DE ESTUDIO
Norma Internacional ISO/DIS 5554. Meet products. Determination of strach content. (Reference Method). International Organization for Standardization. Ginebra, 1976.
Norma Centroamericana ICAITI. 34086 h 8. Harina de origen vegetal. Determinación del contenido de almidón. Instituto Centroamericano de Investigación y Tecnología Industrial. Guatemala, 1974.
Norma Francesa V 03-606. Amidons et Fécules. Dosage de I’amidon. (Methode enzymatique ). Association
Francaise de Normalisation. París, 1973.
Norma Francesa V 03-603. Amidons et Fécules. Dosage de I’amidon. (Mathode aw chlorure de calcium).
Association Francaise de Normalisation. París, 1967.
Método AOAC de Análisis. Starch. Official First Action. Association of Official Analytical Chernists. Washington,
1970.
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INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
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Econ.
Sr.
Ing.
Ing.
Ing.
Dr.
Sr.
Ing.
Ramiro Báez
Eduardo Torres
Flavio Yannuzzelli
Ricardo Illingworth
Vicente IIlingworth
Vicente Arrigo
Heriberto Rodríguez
Hilario Cabanilla
Ing.
Adalberto Sen Sang
Sr.
Dr.
Sr.
Ing.
Sr.
Econ.
Sr.
Ing.
Ing.
Ing.
Dra.
Joel Cevallos
Jorge Sotomayor
Eduardo Márquez
Jaime Vera
Miguel Marchán
Samuel Castro
Roberto Sadum
Alfredo Narváez
Alfonso Herdoíza
Eduardo Vega
Leonor Orozco
MICEI
General Superintendente
SALCO
La Universal
Universidad Técnica de Ambato
INEDECA
INEDECA
Programa de Desarrollo y Diversificación de
Cultivos Agrícolas. MAG
Programa de Crédito Industrial y Asistencia
Técnica a la Pequeña Industria. MICEI
Cámara de Comercio de Guayaquil
Exportadora Santa Fe
Jorge Salcedo Cía. Ltda.
INIAP
INIAP
INIAP
AEDEZ
Banco de Fomento
CENDES
INEN
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