1 pontificia universidad javeriana facultad de ciencias carrera

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
VALORACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL PRODUCTO
EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS
ALCOHÓLICAS
MARIA PAULA TORRES TORRES
PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de Microbiólogo Industrial
BOGOTA, D.C
Julio 19 de 2007
1
VALORACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL PRODUCTO
EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS
ALCOHÓLICAS
MARIA PAULA TORRES TORRES
APROBADO
___________________________
Olga Lucía Mondragón Flórez
Microbióloga
DIRECTORA
_____________________
______________________
Jennifer Alejo
Adriana Páez
Microbióloga
Microbióloga
JURADO
JURADO
BOGOTÁ, D.C.
Julio 19 de 2007
2
VALORACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL PRODUCTO
EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS
ALCOHÓLICAS
MARIA PAULA TORRES TORRES
______________________________
_________________________
Dra. Ángela Umaña Muñoz. M.Phill
Dr. Luís David Gómez. MSc.
Decana académica
Director de carrera
BOGOTÁ, D.C.
Julio 19 de 2007
3
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos
por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se
publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las
tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
4
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado a Dios por poner en mi camino cada etapa de
mi vida en el momento y en el lugar adecuado. A mis papás Guillermo y
Patricia, por haberme brindado toda su sabiduría, su amor y sobre todo su
apoyo incondicional en todo momento y en todas las decisiones que he
tomado y por haber realizado grandes esfuerzos a lo largo de toda mi
carrera para que pudiera ser una gran profesional; a mi hermana Catalina
por su amor, consejos y apoyo brindado a tiempo; a mi familia en general
por ser guías a lo largo de este recorrido; a Janeth Arias por su amistad y
asesoría para la realización de este trabajo; a mis amigos por la paciencia
y ayuda que me dieron en todo momento; a Olga Lucía por su apoyo y
amistad incondicional para que terminará con éxito los últimos semestres
de mi carrera y finalmente a cada una de las personas que de alguna
manera llegaron a mi vida en diferentes circunstancias llenándome de
alegría, amor y fortaleza para finalizar con éxito esta etapa de mi vida.
5
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. Introducción…………………………………………………………………..1
2. Marco Teórico………………………………………………………………..3
2.1.
Levadura………………………………………………………………….3
2.1.1. Levadura cervecera……………………………………………………..3
2.1.1.2. Morfología (Forma) y composición celular………………………….3
2.1.1.3. Composición de la célula de la levadura……………………………4
2.1.1.3.1. Proteínas……………………………………………………………..5
2.1.1.3.2. Ácidos nucleicos……………………………………………………..5
2.1.1.3.3. Paredes celulares…………………………………………………...5
2.1.1.3.4. Membranas…………………………………………………………..6
2.2.
Crecimiento y Multiplicación celular…………………………………...6
2.2.1. Curva de crecimiento microbiano……………………………………....6
2.2.1.1. Fase de adaptación……………………………………………………7
2.2.1.2. Fase logarítmica……………………………………………………….8
2.2.1.3. Fase estacionaria………………………………………………………9
2.2.1.4. Fase de muerte………………………………………………………...9
2.3. Reproducción de la levadura……………………………………………...9
2.3.1. Reproducción Sexual (Meiosis)………………………………………...9
2.3.2. Reproducción Asexual (Mitosis)………………………………………10
2.3.2.1. División celular………………………………………………………..10
2.3.2.2. Esporas vegetativas………………………………………………….10
2.3.2.3. Gemación……………………………………………………………..10
2.3.2.3.1. Reproducción por Gemación……………………………………..10
2.3.2. Factores que intervienen en la reproducción de la levadura………11
2.3.2.1. Oxígeno………………………………………………………………..11
6
2.3.2.2. Temperatura…………………………………………………………..11
2.3.2.3. Composición del mosto (sustrato nutritivo)………………………..11
2.4. Floculación de la levadura………………………………………………11
2.4.1. Hidrofobosidad………………………………………………………….12
2.4.2. Potencial Zeta…………………………………………………………..12
2.4.3. Interacción proteínas – azúcares……………………………………..12
2.4.4. Factores que influyen en la floculación………………………………12
2.5. Mutación de la levadura………………………………………………….13
2.5.1. Mutaciones más comunes en el proceso cervecero………………..13
2.5.1.1. Floculación…………………………………………………………….13
2.5.1.2. No asimilación de la maltotriosa…………………………………....13
2.5.1.3. Precipitación temprana………………………………………………13
2.5.1.4. Respiración deficiente……………………………………………….13
2.6. Levaduras salvajes……………………………………………………….14
2.7. Metabolismo de los carbohidratos………………………………………14
2.7.1. Glucólisis………………………………………………………………..15
2.7.2. Ciclo de Krebs………………………………………………………….18
2.8.
Bacterias lácticas como contaminantes……………………………..20
2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo…………….20
2.8.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lácticas y subproductos.
2.8.2.1.
Nitrógeno……………………………………………………………23
2.8.2.2. Oxígeno………………………………………………………………..23
2.8.2.3. Subproductos que pueden afectar la calidad del producto……...23
2.9.
Factores que afectan el rendimiento del alcohol…………………...24
2.9.1. Cambios de pH durante la fermentación…………………………….24
2.9.1.2. Absorción de bases por la levadura………………………………..25
2.9.2. Producción de ácidos………………………………………………….25
2.9.3. Floculación de la levadura…………………………………………….26
2.10. Proceso de elaboración de la cerveza………………………………27
2.10.1. Molienda………………………………………………………………..27
2.10.2. Proceso en Pailas……………………………………………………..28
2.10.3. Filtración del Mosto……………………………………………….......28
7
2.10.4. Ebullición del Mosto………………………………………………......29
2.10.5. Enfriamiento del Mosto……………………………………………….30
2.10.6. Fermentación………………………………………………………….31
2.10.6.1. Principales transformaciones que tiene lugar
durante la
fermentación……………………………………………………………………33
2.10.6.1.2. Consumo de oxígeno…………………………………………….33
2.10.7. Maduración.……………………………………………………………35
2.10.7.1. Dos etapas………………………………………………………..…36
2.10.7.2. Fermentar hasta el extracto límite………………………………...36
2.10.8. Filtración………………………………………………………….…….38
2.10.9. Envasado………………………………………………………………39
3.
Justificación………………………………………………………………40
4.
Objetivos del proyecto…………………………………………………..41
4.1. Objetivo general…………………………………………………………..41
4.2. Objetivos específicos……………………………………………………..41
5.
Materiales y Métodos…………………………………………………...42
5.1. Tipo de estudio……………………………………………………………42
5.2. Análisis Microbiológicos…………………………………………………44
5.3. pH, Tiempos, Temperaturas y Métodos de Incubación………………45
5.4. Técnicas Empleadas……………………………………………………..45
5.4.1. Siembra en Placa……………………………………………………….45
5.4.2. Filtración por membrana……………………………………………….46
5.4.3. Recuento en cámara de Neubauer…………………………………...47
5.4.3.1. Levadura en Proceso de Fermentación y Maduración…………..47
6.
Resultados …………………………………........................................48
7.
Discusión de Resultados……………………………………………….58
8.
Conclusiones…………………………………………….......................72
9.
Recomendaciones………………………………………………………73
10.
Referencias Bibliográficas……………………………………………...74
11.
Anexos……………………………………………………………………78
8
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Porcentaje de la Materia seca remanente………………………….4
Tabla 2. Análisis Microbiológicos…………………………………………….44
Tabla 3. pH, Tiempos, Temperaturas y Métodos de Incubación…………45
Tabla 4. Agua acueducto de Cali…………………………………………….48
Tabla 5. Enjuagues Tanques (Fermentaciones y Maduraciones)………..49
Tabla 6. Agua de Empuje y Mosto…………………………………………...50
Tabla 7. Propagación de la Levadura………………………………………..51
Tabla 8. Fermentaciones y Maduraciones…………………………………..51
Tabla 9. % Petite Mutants (Respiración Deficiente)………………………..54
Tabla 10. Agua Desairada…………………………………………………….55
Tabla 11. Tierra Diatomácea………………………………………………….55
Tabla 12. BBT`s………………………………………………………………..56
Tabla 13. Sifón (Cerveza sin pasterizar)…………………………………….56
Tabla 14. Conteo celular Fermentaciones…………………………………..56
Tabla 15. Conteo celular Maduraciones…………………………………….57
9
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Morfología Saccharomyces cerevisiae…………………………….3
Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilización
de la glucosa………………………………………………………...16
Figura 3. Ciclo del ácido tricarboxílico (Ciclo de Krebs)…………………...19
Figura 4. Fermentación de glucosa por bacterias ácido lácticas…………21
Figura 5. Proceso Cervecero…………………………………………………42
Figura 6. Material para toma de muestras…………………………………..43
Figura 7. Enjuague Tanque 107……………………………………………...49
Figura 8. Medios Utilizados en (Propagación, Fermentación
y Maduración)………………………………………………………52
10
RESUMEN
Este trabajo se realizó con el objetivo de evaluar la calidad microbiológica
del producto en proceso en una planta productora de bebidas alcohólicas.
Como primera medida se hizo una revisión del proceso típico cervecero
llevado a cabo en la planta con el fin de identificar los puntos críticos
claves durante la producción y para llevar a cabo el cumplimiento de los
objetivos planteados al inicio de esta valoración, se tomaron muestras en
cada una de las etapas identificadas, donde el manejo de las muestras se
realizó,
utilizando
material
estéril
(botellas
biológicas)
y
su
almacenamiento previo a la siembra se llevó a cabo bajo condiciones de
refrigeración para evitar multiplicación de microorganismos presentes en
éstas o proliferación de contaminantes por mal manejo de las mismas,
para garantizar la trazabilidad de este estudio, los resultados obtenidos
durante todo el proceso de investigación, fueron consignados en un
formato que previamente fue establecido. Para el aislamiento e
identificación de los diferentes microorganismos se llevaron a cabo las
técnicas de siembra en superficie y profundidad, recuento en cámara de
Neubauer y filtración por membrana, utilizando medios altamente
selectivos que garantizaran el éxito de la siembra y a su vez se respetó
pH, tiempos, temperatura y métodos de incubación que ya habían sido
estandarizados. Los resultados encontrados en la mayor parte de las
etapas de producción fueron consistentes a lo largo del estudio puesto
que no se identificaron microorganismos ajenos o contaminantes del
proceso cervecero, sin embargo donde se encontraron variantes de la
levadura al observar los indicadores, las muestras no se salen de los
parámetros establecidos para encontrar este tipo de mutación durante el
proceso fermentativo, entrando dentro de especificaciones. Finalmente,
se pudo concluir que la estandarización que se tiene actualmente del
proceso es la adecuada y con la cual se puede garantizar una óptima
calidad del producto terminado.
11
Palabras Claves: Valoración de la calidad, Producción de cerveza,
Variantes de levadura
ABSTRACT
Present work had an objective to evaluate microbiological quality of
product in process at alcoholic beverage industry plant. First was doing a
review of typical process at plant goes to identify critical points during
production and objectives since that validation started.
All parts of process were sampling using sterile material (sample bottles)
and there were package refrigerated.
Results were consigned in a previously established format to have a
guaranty of tradability of present study.
To the isolation of microorganisms techniques used were: counting
chamber Neubauer and membrane filtration using selective mediums
under standardized conditions like pH, time, temperature and incubation
methods.
Results showed that in all time of present study, measures were
consistent because didn´t find foreign microorganisms, however, where
we found yeast variants, samples didn´t going out of established
parameters.
Finally, we can conclude that standardization of process is adequate to
guaranty the quality of finished product.
Keys
words:
evaluate
microbiological
microorganisms, yeast variants
12
quality,
beer
production,
1. INTRODUCCIÓN
La premisa fundamental de una empresa productora de bebidas
alcohólicas es que la calidad de sus productos surge como consecuencia
de hacer las cosas bien desde el comienzo, en forma ordenada y
metódica, es así como en el proceso de elaboración se ha observado que
uno de los aspectos más importantes para esta empresa consiste en
garantizar una excelente calidad de su producto, por medio de un riguroso
control, la utilización de una buena y adecuada materia prima y la
realización de un óptimo proceso de fabricación, logrando así el objetivo
de la satisfacción de sus clientes, tanto externos como internos, en el
marco de un proceso integrador de todas las áreas involucradas en el
sistema de calidad.
En la medida que se avanza en el proceso de elaboración de la cerveza,
se evidencia que dentro de cada una de las etapas de elaboración existen
muchos riesgos que pueden afectar el producto en proceso organoléptica,
fisco- químico y microbiológicamente y de esta manera influir en la calidad
del producto terminado.
En el control de la calidad se encuentran involucrados no solo el control
proceso,
las
especificaciones
y
el
muestreo,
sino
también
los
procedimientos de organización, documentación y autorización que
aseguran se lleven a cabo las pruebas pertinentes para verificar el
cumplimiento de los estándares internacionales y de está manera
asegurar que la calidad es satisfactoria.
Es así como el objetivo de este trabajo de investigación es valorar la
calidad microbiológica del producto en proceso empleado en cada una de
las etapas de producción de bebidas alcohólicas, con el fin de identificar
los microorganismos típicos o posibles contaminantes, que puedan
13
afectar la calidad del proceso de elaboración y de esta manera establecer
por medio de los resultados obtenidos, si éstos afectan la calidad del
producto terminado.
14
2. MARCO TEORICO
2.1. Levadura
Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen principalmente
por gemación, son organismos eucarióticos, es decir que tienen una
membrana nuclear bien definida que envuelve el núcleo (Adams et al,
1998).
Las levaduras son las causantes principales de la fermentación de los
alimentos, lo cual puede ser perjudicial (deterioro) o favorable (producción
de cervezas, vinos, pan, quesos, enzimas, etc) (Adams et al, 1998).
2.1.1. Levadura cervecera
Saccharomyces cerevisiae tiene como característica que al final de
la fermentación se va al fondo del tanque, se conoce como
levaduras de profundidad y su temperatura óptima de fermentación
es de 10 – 14 °C (Aguilar, 2003).
2.1.1.2. Morfología (Forma) y composición celular
S. cerevisiae tiene forma esférica, elipsoide u ovoide. Su tamaño varía
con la edad de la célula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras.
Puede vivir aislada o formando colonias (Aguilar, 2003).
Fuente: El cervecero en la práctica, 2002.
Figura 1. Morfología de Saccharomyces cerevisiae.
15
La célula está constituida aproximadamente por:
P-glucanos (polisacárido)
40%
Mananos (polisacárido)
40%
Proteínas
8%
Lípidos (grasas)
7%
Sustancias inorgánicas
3%
Hexosamina y quitina
2%
2.1.1.3. Composición de la célula de la levadura
Con el objeto de producir una nueva célula, todos los compuestos
presentes en la célula se deben incrementar. La célula de levadura tiene
alrededor del 75 – 80% de agua (Adams et al, 1998).
El contenido de otros materiales es usualmente expresado como % de la
materia seca remanente.
% DE LA MATERIA SECA REMANENTE
Minerales:
8%
Carbohidratos:
40%
Material nitrogenado:
Proteínas
64%,
peptonas
10%,
aminoácidos
8%,
ácidos nucleicos.
Lípidos:
1% - 2%
( 5% P2O5 ; 3%K2O)
(glucógenos,
Betaglucanos, etc)
Fuente. El cervecero en la práctica, 2002
Tabla 1. Porcentaje de la Materia Seca Remanente
16
2.1.1.3.1. Proteínas
Alrededor del 50% del material celular (seco) puede ser material
proteínico. Las proteínas presentes son principalmente enzimas y
proteínas estructurales. Las proteínas se combinan con los ácidos
nucleicos para formar los sitios para la síntesis de nuevas proteínas. Las
proteínas son sintetizadas en la levadura a partir de los aminoácidos, la
formación de los enlaces péptidos requieren energía, la cual es portada
por el ATP (Klimovitz, 2002). Algunos aminoácidos de los requeridos
están presentes en el mosto y son transportados dentro de la célula y
concentrados allí por los aminoácidos-permeasas; la eficiencia de este
transporte es diferente para cada aminoácido, así que los aminoácidos
disponibles dentro de la célula para la síntesis de proteínas no están
necesariamente en la misma proporción que en el mosto. Si un
aminoácido no esta disponible dentro de la célula, la levadura puede
sintetizarlo por sí misma (Klimovitz, 2002).
2.1.1.3.2. Ácidos nucleicos
Constituyen alrededor del 18% del material celular nitrogenado. Dirigen la
síntesis de proteínas, la secuencia de las cuatro bases en el ácido
nucleico determina la secuencia de los aminoácidos en la proteína que se
está sitentizando. Proporcionan la información genética necesaria para
sintetizar las proteínas (Klimovitz, 2002).
2.1.1.3.3. Paredes celulares
Compuestas principalmente de polisacáridos, entre ellos la manosa y la
glucosa que forma los mananos y beta glucanos. Una considerable
cantidad de proteínas también está presente con algunos componentes
menores tales como fosfatos. Durante la fermentación la composición de
la pared celular cambia (Aguilar, 2003).
17
2.1.1.3.4. Membranas
Las membranas rodean el citoplasma y las mitocondrias de la célula de
levadura. Están compuestas por mananos, proteínas y materiales grasos,
estos últimos son principalmente esteroles y glicéridos. La membrana
citoplasmática es semipermeable y regula el flujo de nutrientes hacia el
interior de la célula y el de subproducto hacia el exterior (Aguilar, 2003).
2.2. Crecimiento y multiplicación celular
El crecimiento celular es el incremento ordenado de todos los
constituyentes de la célula viva, es el desarrollo individual, su estudio
implica conocer los modelos que explican la generación y síntesis de
macromoléculas, como se sintetiza la pared celular y que enzimas
participan, etc; además de los aspectos bioquímicos interesa conocer
también como se transportan y ensamblan las macromoléculas y de
donde se ensamblan (Klimovitz, 2002).
La multiplicación celular, por otra parte, se refiere al estudio del aumento
del número de individuos en un población; su estudio implica conocer la
cinética de la multiplicación, velocidad con que se sucede, relaciones que
tiene con el medio ambiente, con los productos y con el consumo de
sustratos, cambios fisiológicos y morfológicos que se suceden (Klimovitz,
2002).
2.2.1. Curva de crecimiento microbiano
Cuando un microorganismo (bacteria, hongo o levadura) se le inocula en
un medio de cultivo apropiado para su desarrollo y se le dan las
condiciones óptimas para su crecimiento, este presenta una curva de
crecimiento típica, donde fácilmente se podría graficar en función del
tiempo la concentración celular (número de células por unidad de volumen
18
del cultivo) o concentración de biomasa microbiana (gramos de células
microbianas en sustancia seca por unidad de volumen de cultivo)
(Ingledew, 1996).
2.2.1.1. Fase de adaptación
Esta fase recibe diversos nombres, se consideran de adaptación cuando
la población inicial se localiza en un medio ambiente que les favorece
para
su desarrollo; en estas condiciones los individuos necesitan
adaptarse a ese medio ambiente generando abundante actividad
metabólica pero sin multiplicarse; se producen enzimas e incremento en
los componentes estructurales especialmente los citoplasmáticos, las
células adsorben gran cantidad de agua y hacia el final de esta fase
presentan un tamaño mayor que el normal (se considera tamaño normal
el que presentan durante la fase logarítmica). En esta fase hay mayor
consumo de oxígeno por célula que en cualquier otra fase y se observa
además incremento en la concentración del ARN mientras que el ADN
permanece constante; el tiempo de duración depende de las condiciones
del medio ambiente: prolongado si son desfavorables, corto si son
favorables e inclusive puede ser cero en el caso de que se traslade una
población en fase logarítmica a un medio similar si la dilución no es alta.
En muchos casos la fase de adaptación se prolonga demasiado, siendo
más correcto denominarla de latencia; en estos casos las condiciones
para el desarrollo son muy desfavorables (pH, baja temperatura, falta de
nutrientes, etc) y el organismo solamente esta subsistiendo (Ingledew,
1996).
A la fase de adaptación se le denomina también fase LAG. El cambio de
la fase LAG a la fase LOG se denomina de aceleración positiva; la
reproducción celular comienza y poco a poco se va aumentando la
velocidad de crecimiento (Adams el al, 1998).
19
2.2.1.2. Fase logarítmica
En esta fase se representa también cambios citomorfológicos; la célula se
vuelve fisiológicamente joven y se encuentra en su estado más normal; en
el caso de las bacterias todas las células reaccionan al Gram en forma
homogénea y es en esta fase en donde se describe si son Gram Positivas
o Gram Negativas. La célula tiene composición normal constante,
mientras que la composición del medio varía. El metabolismo es bastante
activo y dirigido esencialmente a obtener energía y construir para
multiplicarse, por eso es esta fase se producen los metabolismos
primarios (Ingledew, 1996).
La pared celular es más delgada que en otras fases y esto hace que la
población sea más sensible a los agentes fisicoquímicos. El tiempo de
duración depende del organismo y de las condiciones del medio, si estas
son favorables el tiempo será menor, puesto que al ocurrir metabolismo
se genera una mayor población y el material nutriente se agotara más
rápidamente (Klis et al, 2002).
A medida que se sucede el metabolismo van cambiando las condiciones
del medio, por ejemplo el pH; en estas condiciones se reduce la velocidad
del crecimiento, (fase de desaceleración), esta disminución también se ve
afectada por el agotamiento de los nutrientes y porque el metabolismo
produce sustancias tóxicas que se van acumulando, ejemplo, los
alcoholes, aldehídos, etc; las cuales tienen efecto antimicrobiano
(Ingledew, 1996).
A medida que transcurre el tiempo, las condiciones se tornan más
desfavorables hasta que se llega a un estado de equilibrio en el cual se
produce ligera multiplicación pero también muerte; este estado se
denomina fase estacionaria (Ingledew, 1996).
20
2.2.1.3. Fase estacionaria
La población se equilibra; se presentan también cambios morfológicos:
decrece el tamaño de la célula, aumenta el espesor de la pared celular
como un mecanismo de resistencia para contrarrestar las condiciones
adversas del medio ambiente; hay variación en la actividad metabólica y
se sintetizan principalmente los metabolitos secundarios (Klis et al, 2002).
A la cantidad de células que alcanzan esta fase se le denomina
crecimiento total.
2.2.1.4. Fase de muerte
Disminuye el número de células viables; al aumentar la mortalidad
disminuye la concentración en biomasa a la autólisis; la población puede
llegar a un punto tal de auto esterilización en el que los individuos mueren
por las mismas condiciones que han generado (Klis et al, 2002).
Esta fase es muy importante desde el punto de vista bioquímico ya que en
ella se generan sustancias de mucho interés especialmente los
antibióticos (Ingledew, 1996).
2.3. Reproducción de la levadura
La levadura se puede reproducir de dos formas diferentes: sexual y
asexual.
2.3.1. Reproducción sexual (Meiosis):
En este proceso se realiza la fecundación uniéndose dos células
sexuales.
Los dos núcleos de las células se unen formando uno, mezclándose el
material genético de los dos “padres”.
21
De este tipo de reproducción resultan cuatro células hijas, cada una con la
mitad de los cromosomas iniciales (Klimovitz, 2002).
2.3.2. Reproducción asexual (Mitosis):
Se caracteriza porque sin fecundación, un solo individuo puede producir
una célula exacta (Klimovitz, 2002).
Este tipo de reproducción puede ocurrir de tres maneras:
2.3.2.1. División celular: es una simple división de la célula formando un
nuevo individuo a partir del que se esta dividiendo (bacterias y algunos
tipos de levaduras) (Klimovitz, 2002).
2.3.2.2. Esporas vegetativas: la célula forma un cuerpo reproductor, que
una vez afuera y en condiciones del medio adecuadas produce un nuevo
organismo (bacterias y hongos) (Klimovitz, 2002).
2.3.2.3. Gemación: es la más importante en este caso porque es la
principal forma en que se reproduce la levadura cervecera (Klimovitz,
2002).
2.3.2.3.1. Reproducción por Gemación
La célula madre produce un pequeño “brote” en la pared celular, que
aumenta gradualmente y se estructura poco a poco como una nueva
célula de levadura (Klimovitz, 2002).
Cuando la célula “hija” ha alcanzado el desarrollo adecuado, se separa de
la célula “madre” por estrangulación dejando una cicatriz en la pared
celular (Klimovitz, 2002).
22
Es posible llegar a tener “cadenas celulares” cuando una “madre” tiene
varias formaciones de nuevas células al mismo tiempo y a su vez las
células en crecimiento empiezan a ser “madres” de otras nuevas, sin
haber terminado de separarse (Klimovitz, 2002).
2.3.2. Factores que intervienen en la reproducción de la levadura
2.3.2.1. Oxígeno: A mayor oxigeno, entonces mayor es la velocidad de
reproducción
2.3.2.2. Temperatura: A mayor temperatura, mayor velocidad, teniendo
en cuenta que la temperatura óptima de desarrollo se encuentra entre
25ºC y 30ºC
2.3.2.3. Composición del mosto (sustrato nutritivo): debe contener los
nutrientes requeridos para la formación de la nueva célula
2.4. Floculación de la levadura
La floculación es una propiedad física, donde las células de la levadura se
adhieren unas con otras, formando grupos que rápidamente sedimentan
(levaduras de fondo) o alcanzan la superficie del liquido (levaduras de
superficie) (Klimovitz, 2002).
Una levadura que flocule bien facilita la separación y recolección de la
levadura, disminuye tiempos de proceso y evita que pase excesiva
cantidad de levadura a maduración (riesgos de autolisis) (Klimovitz,
2002).
Los mecanismos físicos por medio de los cuales la levadura flocula son:
23
2.4.1.
Hidrofobosidad:
la
pared
celular
presenta
características
hidrófobas (repele el agua) lo que hace que se aglomeren. Esta propiedad
esta asociada a la edad de la célula (Klimovitz, 2002).
2.4.2. Potencial Zeta: Es una medida de la carga eléctrica de la
superficie celular. La reducción en esta carga favorece el acercamiento
celular (y por ende la floculación). La carga superficial se afecta por el pH
del medio y la presencia de sustancias “buffer” como los fosfatos
(Klimovitz, 2002).
2.4.3. Interacción proteínas – azúcares: Existe una proteína llamada
lectina que tiene la propiedad de “reconocer” (atraer) sacáridos como la
manosa. Como la pared celular de la levadura es rica tanto en lectina
como en manosa se considera factible que estos compuestos se atraigan
entre si uniendo las células (Klimovitz, 2002).
2.4.4. Factores que influyen en la floculación
Una levadura que carezca de los factores genéticos de la floculación no
podrá flocular.
A menor temperatura la levadura entra en un estado de “latencia” que
activa el sistema de floculación.
A menor pH se activa la floculación por la neutralización de cargas en la
pared celular. Durante la fermentación hay una caída de pH por lo que la
levadura tiende a flocular al final.
El calcio favorece la formación de lectina en la pared celular y facilita la
unión lectina-manosa entre las células de la levadura.
24
La presencia de azúcares (como la manosa) o de proteínas tipo lectina en
el mosto puede bloquear los sitios de atracción de la pared de la célula e
interrumpir la floculación (Klimovitz, 2002).
2.5. Mutación de la levadura
Se conoce como mutación los cambios que ocurren en la información
genética de la célula (DNA) inducido por factores externos y que pueden
generar variaciones en el metabolismo o comportamiento celular,
asociados a la fracción de DNA alterado (Heggart, 1999).
En el proceso cervecero se pueden favorecer las mutaciones por malas
prácticas
de
manejo
almacenamiento,
de
tratamiento
la
levadura
ácido,
(condiciones
contaminación
externas
con
de
levaduras
diferentes, etc). Sin embargo nos es muy común que se presenten
mutaciones a gran escala en el proceso típico cervecero (Heggart, 1999).
2.5.1. Mutaciones más comunes en el proceso cervecero
2.5.1.1. Floculación: La levadura no flocula adecuadamente (separación
difícil)
2.5.1.2. No asimilación de la maltotriosa: genera fermentaciones
frenadas
2.5.1.3. Precipitación temprana: la levadura se precipita al fondo del
tanque antes de terminar de fermentar
2.5.1.4. Respiración deficiente: la levadura presenta deficiencias en su
respiración generando malas fermentaciones y un perfil de subproductos
totalmente diferente. Se conoce como “petite mutant” (Klimovitz, 2002).
25
2.6. Levaduras salvajes
Se considera como “levadura salvaje” o “silvestre” cualquier espécimen
que no corresponda al utilizado en el proceso y que aparece como
contaminante del medio o equipos de trabajo (Heggart, 1999).
No todas las levaduras salvajes originan defectos en el producto, pero son
indeseables ya que pueden llegar a competir con la levadura del proceso.
Algunos tipos de levadura salvaje, pueden producir velos (turbidez), malos
olores, sabores anormales, floculación deficiente y fermentación diferente.
Las levaduras salvajes se pueden identificar por diferentes formas:
•
Forma de las células (redondas, ovales, alargadas, etc)
•
Tamaño de la célula
•
Forma de agrupamiento de las células (aisladas, cadenas, etc).
•
Forma de reproducción
•
Metabolismo fermentativo.
Algunas de las levaduras salvajes más comunes en cervecería son:
Saccharomyces elipsoideus, S. turbidans, S. pastorianus, S. chevaliere.
Cándida utilis, C. tropicales y C. mycodema (Heggart, 1999).
2.7. Metabolismo de los carbohidratos
Las células de levadura necesitan una fuente de energía química libre
para crecer, debido a que muchos de los componentes de la célula
26
requieren de ésta para ser sintetizados. Parte de esta energía es obtenida
por el rompimiento de los azúcares simples, como la glucosa, pero esto
no ocurre en una forma simple y rápida; en cambio las células obtienen la
mayoría de sus requerimientos inmediatos de energía del rompimiento del
ATP, en el cual los grupos fosfato pueden ser removidos por una enzima
de la levadura, liberando gran cantidad de energía, ésta es entonces
utilizada por las enzimas para el crecimiento de la levadura. El ATP es
producido en la célula de la levadura por dos mecanismos de formación
diferentes: La glucólisis y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de
Krebs), el segundo de los cuales es mucho más complejo y eficiente que
el primero (Kandler, 1983).
La glucólisis puede ser conducida aeróbica y anaeróbicamente; cuando
es aeróbica el producto final es el ácido piruvíco que entra al ciclo de
Krebs; cuando es anaeróbica el producto final es el alcohol (Kandler,
1983).
2.7.1. Glucólisis (Embden – Meyerhof – Parnas)
La ruta glicolítica o también denominada Embden Meyerhof Parnas es la
utilizada por Saccharomyces cerevisiae y consiste en la degradación de
los azúcares presentes en un medio de cultivo para la obtención de
energía y otros intermediarios necesarios para el crecimiento de la
levadura. Durante el proceso son producidos cantidades sustanciales de
etanol, CO2 y calor gracias a la acción de enzimas las cuales, al interior
de la célula, catalizan diversas reacciones que resultan en la producción
de dos moléculas de ácido pirúvico, estas a su vez por la acción de la
enzima piruvato descarboxilasa en condiciones anaeróbicas, en dos
moléculas de acetaldehído y dos de CO2 y finalmente dos moléculas de
etanol a partir del acetaldehído por acción de la enzima alcohol
deshidrogenasa y cuya reacción podría resumirse así:
27
Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ ------------ 2 Piruvato + 2ATP + 2NADH+
2H++ Calor
2 piruvatos + 2NADH + 2H+ ------------------ 2 Etanol + 2CO2 + 2NAD
Algo del ácido pirúvico producido y otros intermediarios pueden ser
usados por la levadura en variedad de rutas metabólicas como sustrato
para la generación de nuevas células, algo de glicerol es generado a
partir de uno de los intermediarios de la ruta: la dihidroxiacetona,
dependiendo de las condiciones, de manera que no puede desligarse el
metabolismo respiratorio del fermentativo pues esta
ruta metabólica
opera tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis
generándose energía en forma de ATP y calor respectivamente. (Jacques
et al, 1999).
rd
Fuente: The alcohol textbook 3 edition page 61.
Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilización de la glucosa.
28
Los hechos principales de la fermentación son:
1. Activación de la glucosa con dos moléculas de ATP (reacciones 1 y 3).
2. Isomerización de la glucosa.
3. Rompimiento del azúcar de 6 carbonos en 2 de 3 carbonos cada uno.
4. Oxidación de los fragmentos con NAD coenzima. El NADH2 reducido es
liberado dentro de la célula. La oxidación libera ATP es entonces
regenerado (etapas 6 y 9) removiendo fosfatos de los compuestos de 3
carbonos por el ADP.
5. El NADH2 reducido que se libera es oxidado, reduciendo el
acetaldehído (formado por al ácido pirúvico) a etanol. El NAD libre es
liberado y puede ser aprovechado para la fermentación de otro azúcar.
Parte del NADH2 también puede ser usado para formar ácido láctico.
El ATP producido puede ser usado como fuente de energía por la
levadura. Algunos de los compuestos intermedios también son usados
para el crecimiento de la levadura, tales como el ácido pirúvico pueden
ser liberados de la célula de levadura a la cerveza, nuevamente el ácido
pirúvico es un ejemplo. Cuando esto pasa, la levadura queda con un
exceso de NADH2 es usado para formar glicerol a partir de la
dihidroxiacetona fosfato (Harper, 2004).
Después del alcohol y CO2, el principal subproducto de la fermentación
por levadura es el glicerol.
El ácido pirúvico durante la fermentación es usado, en la parte, para la
producción de aminoácidos y parte queda en la cerveza.
29
2.7.2. Ciclo de ácidos tricarboxílicos (Ciclo de Krebs)
La fermentación vía glucólisis es muy poco eficiente en la liberación de
energía y formación de ATP, ya que alrededor del 95% de las calorías
utilizables de los azúcares del mosto permanece en el alcohol formado
durante la fermentación. En presencia de oxígeno, mucha más energía
aprovechable en la formación de ATP puede ser obtenida de la glucosa
(Harper, 2004).
Después de la glucólisis el ácido pirúvico formado pasa a través de una
serie de reacciones conocidas como el ciclo del ácido cítrico.
Las reacciones son mostradas en la gráfica, en donde se puede observar
que forman un ciclo. Al comienzo el ácido oxalacético se combina con el
ácido acético en la forma de acetil-coenzima A. Cuando el ciclo se
completa, el resultado neto es la oxidación del ácido acético a CO2 y
agua; el ácido oxalacético es liberado para comenzar otra vez el ciclo con
otra molécula de ácido acético obtenida del ácido pirúvico. El hidrógeno
removido en las fracciones intermedias del ciclo en la forma de coenzimas
reductoras puede ser oxidado en presencia de oxígeno por una serie de
reacciones que generan más ATP (Harper, 2004).
Transferencia de hidrógeno o electrones del hidrógeno a través del
sistema citocromo.
El resultado final es producir alrededor de 38 ATP de una molécula de
glucosa. La fermentación sin oxígeno produce sólo dos ATP a partir de
una molécula de glucosa.
30
Fuente: Harper: Bioquímica ilustrada, 2004.
Figura 3. Ciclo del Ácido Tricarboxílico (Krebs)
Algunos compuestos intermedios del ciclo TCA son usados por la
levadura para su crecimiento. Por ejemplo, acetil-CoA y a - cetoglucano.
Pequeñas cantidades de algunos ácidos del ciclo son liberados por la
célula de la levadura y contribuyen a la acidez de la cerveza. Por ejemplo
al ácido succínico. Los ácidos unidos a la coenzima A son muy inestables
y algunas veces reaccionan para formar ésteres, los cuales tienen una
gran influencia en el aroma de la cerveza (Harper, 2004).
Las reacciones de la glucólisis ocurren dentro de la célula, en el
citoplasma. Las TCA también ocurren dentro de ella, pero sólo en una
parte muy especializada en la célula, llamada mitocondria. La mitocondria
puede ser formada solamente a partir de otra mitocondria algunas veces
31
durante la gemación de la levadura, una célula hija puede formarse sin
mitocondrias. Cuando esto ocurre la célula hija y toda su descendencia no
podrán nunca formar mitocondrias por lo tanto, crecen muy lentamente en
los medios de cultivo de laboratorio, porque no pueden usar el oxigeno del
aire para crecer más eficientemente; forman sólo pequeñas colonias en el
agar; por esta razón estas levaduras son llamadas “petite verdant o
respiratorias deficientes” (RD). (Heggart, 1999).
Las levaduras RD producen fermentaciones pobres, con poca atenuación
y tienden a liberar gran cantidad de diacetilo en la cerveza. Por esta razón
las levaduras con cierto porcentaje de RD deben ser descartadas
(Klimovitz, 2002).
2.8. Bacterias lácticas como contaminantes
El grupo de bacterias lácticas está constituido por cocos y bacilos que
comparten propiedades fisiológicas y bioquímicas y cuyo metabolismo
generador de energía es fermentativo, los sustratos fermentables son
azúcares que incluyen variedad de monosacáridos, disacáridos y
polialcoholes y cuyo producto final principal es el ácido láctico y en
algunos casos el único dependiendo de la ruta metabólica que utilicen
para convertir los carbohidratos, de ahí que las bacterias lácticas pueden
dividirse en dos grupos según los productos resultantes de la
fermentación de glucosa (Jacques et al, 1999).
2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo
El grupo de bacterias lácticas denominado homofermentativo produce
virtualmente un único producto de fermentación: el ácido láctico, mientras
el grupo heterofermentativo produce etanol y CO2 además de ácido
láctico. Dicha diferencia está determinada por la presencia o ausencia de
la enzima aldolasa, una de las enzimas claves en la glicólisis; los
32
heterofermentadores, carentes de aldolasa, no pueden descomponer el
difosfato hexosa a fosfato triosa, en lugar de ello, oxidan la glucosa 6fosfato a 6-fosfogluconato y entonces lo decarboxilan a pentosa fosfato, la
cual se transforma en triosa fosfato y acetilfosfato por medio de la enzima
fosfocetolasa (Jacques et al, 1999).
Esta triosa fosfato se convierte finalmente en ácido láctico con la
producción neta de 1 ATP, mientras el acetilfosfato acepta electrones del
NADH generado durante la producción de pentosa fosfato y así se
convierte en etanol sin producción de ATP (Jacques et al, 1999).
Debido a esto, los heterofermentadores producen sólo un mol de ATP a
partir de glucosa a diferencia de los homofermentadores que producen
dos moles de ATP igualmente a partir de glucosa (Jacques et al, 1999).
Fuente: modify of carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria, 1983.
Figura 4. Fermentación de glucosa por bacterias ácido lácticas.
33
Estas rutas para el metabolismo de carbohidratos llevadas a cabo por las
bacterias acido lácticas pueden igualmente dividir este grupo en tres
clases: homofermentativos obligados, heterfermentativos facultativos y
heterofermentativos obligados, las especies de homofermentativos
obligados el único producto final a partir de hexosas es el ácido láctico y
la vía glicolítica es la única utilizada, las especies de este grupo producen
la enzima aldolasa pero no producen la fosfocetolasa, lo cual las inhabilita
para fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999).
Las especies de heterofermentativos facultativos poseen las dos enzimas
aldolasa y fosfocetolasa “inducible”, pues logran fermentar pentosas y
gluconato sólo bajo ciertas condiciones pues la ruta de a fosfocetolasa es
inhibida en presencia de glucosa. (Jacques et al, 1999) y finalmente, las
especies lácticas heterofermentativas obligadas generan una mezcla de
productos finales bajo condiciones normales usando cualquiera de las
vías metabólicas; estos productos finales incluyen ácido láctico, ácido
acético, etanol y CO2 así como pequeñas cantidades de ácidos fórmico y
succínico, estos organismos excepto algunas cepas específicas, pueden
fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999).
2.8.2.
Requerimientos
nutricionales
de
bacterias
lácticas
y
subproductos
Las necesidades nutricionales de las bacterias lácticas son muy similares
a las de las levaduras convirtiéndose así en sus principales antagonistas
por nutrientes esenciales y factores de crecimiento que algunas veces
están presentes en cantidades limitadas en los sustratos de fermentación,
así como que son capaces de metabolizar las mismas fuentes de carbono
para realizar su tipo de fermentación (Jacques et al, 1999).
34
2.8.2.1. Nitrógeno: varios aminoácidos y vitaminas son necesarias para
el
crecimiento
de
ácido
lácticas,
algunas
homofermentativas
y
heterofermentativas poseen enzimas proteasas y pueden degradar las
proteínas en formas asimilables de nitrógeno, sin embargo esta
característica no es general y la mayoría de ellas toman el nitrógeno
necesario del medio de cultivo en el que se hallen, de manera que en este
sentido son fuertemente competitivas frente a las levaduras en sistemas
de fermentación (Bely et al, 2003).
2.8.2.2. Oxígeno: las bacterias lácticas se han descrito como anaerobias,
sin embargo se ha demostrado que prefieren ambientes microaerofílicos y
pueden sobrevivir en ambientes donde el oxígeno está completamente
ausente, manejando una tasa de crecimiento baja (Oliveira, 1999).
Este tipo bacteriano carece de las enzimas catalasa y superoxido
dismutasa, las cuales son usadas por bacterias aeróbicas para convertir
compuestos tóxicos: el peróxido de hidrógeno y el superóxido
respectivamente, ambos formados durante sus procesos respiratorios
(Jacques et al, 1999).
Saccharomyces cerevisiae produce catalasa y crece adecuadamente bajo
condiciones aeróbicas, con el oxigeno como requerimiento principal en los
primeros estados de la fermentación por lo que se constituye en otra
ventaja competitiva de las bacterias lácticas bajo condiciones anaerobias
en la fermentación de la levadura. (Jacques et al, 1999).
2.8.2.3. Subproductos que pueden afectar la calidad del producto
La producción de algunos compuestos por bacterias contaminantes
contribuye a la disminución de la calidad del producto final de la
fermentación así como el desarrollo mismo del proceso pues el
microorganismo fermentador puede ver afectada su fisiología por la
35
presencia de sustancias extrañas y/o en altas cantidades (Jacques et al,
1999).
Los ácidos láctico y acético son productos que afectan notablemente las
características organolépticas del producto (etanol), pues se producen a
partir de él, así como la acroleína y el diacetil, una cetona que puede
producirse durante la fermentación cuando el piruvato es convertido a
ácido láctico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus son los
responsables de dicha producción, no obstante, las levaduras producen
diacetil durante los primeros estados de la fermentación pero este es
removido por la acción de varias enzimas y por la presencia de algunos
aminoácidos en el medio (Jacques et al, 1999).
2.9. Factores que afectan el rendimiento de alcohol
Un gran número de factores pueden reducir el rendimiento de alcohol y
disminuir la productividad de la planta, estos factores pueden ser
reducidos o eliminados para minimizar las perdidas de sustrato y
maximizar las ganancias en términos de producto (Oliveira, 1999).
2.9.1. Cambios de pH durante la fermentación
El pH de la cerveza varía entre 3.9 – 4.5; en parte se debe a las
diferencias en los mostos, pero también a las diferencias en la
fermentación. Por ejemplo, un mosto dado produce una cerveza con pH
4.4 cuando se fermenta con levadura de producción normal y puede
producir cervezas con pH 3.9 cuando se fermenta con levadura recién
salida del propagador (Klimovitz, 2002). El pH cae rápidamente en las
primeras etapas de la fermentación, lo que significa que se presenta
incremento en la concentración de iones H+ o acidez.
36
2.9.1.2. Absorción de bases por la levadura
La remoción de bases o álcalis del mosto puede hacer que esté se vuelva
más ácido. Por muchos años, se asumió que la levadura usa los iones
fosfato básicos H2PO4–2 como fuente de fosfatos para el crecimiento, y
que la perdida de ésta base causa el descenso del pH durante la
fermentación (Klimovitz, 2002).
Sin embargo se ha demostrado que la levadura usa sólo el ion H2SO4- el
cual es ligeramente básico. Por lo tanto, el uso de los fosfatos produce
solamente alrededor del 10% del aumento de la acidez durante la
fermentación (Klimovitz, 2002).
Los aminoácidos básicos son usados por la levadura y la pérdida de éstos
produce un 30% del cambio de acidez.
2.9.2. Producción de ácidos
El CO2 producido durante la fermentación es débilmente ácido. Esto
produce un 10% del cambio de acidez.
Los ácidos orgánicos, especialmente el succínico, láctico, pirúvico y
málico producidos por la levadura, producen otro porcentaje del cambio
de acidez durante la fermentación. La levadura puede excretar algunos
iones H+ directamente a la cerveza pero esto no ha sido demostrado aún
(Klimovitz, 2002).
Ya que la malta es la fuente de compuestos básicos como los iones
fosfato y los aminoácidos, el contenido de malta también influye en el pH
de la cerveza. A mayor cantidad de malta, mayor cantidad de compuestos
37
básicos presentes al comienzo de la fermentación y mayor el pH de la
cerveza (Klimovitz, 2002).
2.9.3. Floculación de la levadura
Al finalizar la fermentación, las células de levadura forman agrupaciones
probablemente hasta de 100 células; la levadura S. cerevisiae atrapa
burbujas de CO2 y flota.
El que la levadura por sí misma, se remueva del mosto fermentado
después de que ha cumplido a cabalidad su función metabólica, es una
de las principales características deseables en la levadura cervecera; a
esta característica se le designa con el nombre de floculación (Klimovitz,
2002).
Existen muchas definiciones de floculación de la levadura pero una de las
más aceptadas dice: Floculación es el fenómeno por medio del cual las
células de levadura se adhieren en grumos y sedimentan rápidamente del
medio en el cual se encuentran suspendidas (Klimovitz, 2002).
Las características de floculación de un cultivo puro de levadura en
particular, es una de las propiedades más importantes que se tiene en
cuenta al seleccionar una cepa de lavadura para propósitos cerveceros
(Klimovitz, 2002).
Los factores que influyen en la floculación de la levadura son:
1. Características genéticas de la levadura.
2. La presencia de iones Ca++ en solución; la cantidad requerida varía de
acuerdo con la cepa. Algunos investigadores han encontrado que otros
iones divalentes tales como Mg y Mn pueden, aparentemente ejercer la
acción del calcio.
3. La temperatura.
4. Cantidad de glucógeno almacenado en la célula.
38
5. El contenido de fósforo mananos, los cuales se han encontrado en la
pared exterior de la célula de levadura al final de la fermentación, pero
durante la fermentación no. Una teoría dice que existe atracción
electrostática entre las cargas negativas del fosfato y las positivas del
calcio, ocasionando la agrupación de las células (Hornsey, 2003)
2.10. Proceso de elaboración de la cerveza
La cerveza, al igual que otras bebidas similares producidas con cereales,
es sometida a fermentación pero no a destilación. Las materias primas
que intervienen en el proceso son agua, lúpulo y cebada, suplida a veces
por el maíz, el arroz o el azúcar (Hough, 1990).
2.10.1. Molienda
Tanto la malta como los cereales sin maltear (trigo, avena, centeno,
maíz, arroz), tienen que pasar por el molino que rompe el grano, dando
lugar a la harina y otras partes fijas (Hornsey, 2003).
La molienda consiste en destruir el grano, respetando la cáscara o
envoltura y provocando la pulverización de la harina. La malta es
comprimida entre dos cilindros pero evitando destruir la cáscara lo
menos posible, pues ésta servirá de lecho filtrante en la operación de
filtración del mosto; a su vez el interior del grano en una harina lo más
fina posible. Estas dos condiciones, cáscara entera y harina fina no
podrán respetarse si el grano no está seco (excepción molienda
húmeda) y muy bien desagregado, una tercera exigencia es un buen
calibrado de la malta. La molienda debe ser también regulada según el
cocimiento posterior (Hornsey, 2003).
39
2.10.2. Proceso en Pailas
En esta parte del proceso se extraen de la malta y eventualmente de los
granos crudos la mayor cantidad de extracto y de la mejor calidad posible
en función al tipo de cerveza que se busca fabricar. La extracción se logra
principalmente por hidrólisis enzimática, solamente un 10% de la
extracción es debida a una simple disolución química. Las amilasas
desdoblan el almidón en dextrinas y maltosa, principalmente las enzimas
proteolíticas desdoblan las proteínas complejas en materias nitrogenadas
solubles, la fitasa desdobla la fitina en inositol y fosfato, etc. Estas
transformaciones enzimáticas han sido ya empezadas durante el
malteado a un ritmo menos intenso del que sucederá en el cocimiento;
donde debido a la acción de las diferentes temperaturas y la gran
cantidad de agua las reacciones suceden muchas veces en forma
explosiva (Hough, 1990).
Cuantitativamente el desdoblamiento del almidón en azúcares y dextrinas
es el más importante. Las principales reacciones que ocurren durante el
cocimiento por acción de las amilasas son formación de dextrinas,
formación de maltosa y en menor proporción formación de glucosa
(Hough, 1990).
2.10.3. Filtración del Mosto
Una vez disueltas las materias solubles por el cocimiento es necesario
separar el mosto de la parte insoluble llamada orujo o afrecho. La
operación se realiza en dos fases: primero el flujo del mosto y luego la
operación de lavado del extracto que contiene el afrecho (Verstrepen,
2003). El mosto y el agua de lavado deben ser claros pues si se aporta
durante la operación demasiadas sustancias mal disueltas, la clarificación
de la cerveza será demasiado difícil. La calidad de la cerveza puede ser
también alterada por un lavado de afrecho con agua alcalina pues los
polifenoles y sustancias amargas de la cáscara de la malta se disuelven
40
muy fácilmente en agua alcalina aún más si se tiene en cuenta que el
lavado se hace en agua a una temperatura máxima de 75 ºC; ésta no
puede exceder ese límite, pues se corre el riesgo de disolver almidón
presente aún en el afrecho, lo que conllevaría a problemas de turbiedad y
fermentación posteriores (Verstrepen, 2003).
2.10.4. Ebullición del Mosto
La
finalidad
de
la
ebullición
es
estabilizar
enzimática
y
microbiológicamente el mosto, buscar la coagulación de las proteínas.
La destrucción de las enzimas es realizada para evitar que sigan
desdoblando a lo largo de la fermentación, las amilasas podrían seguir
desdoblando las dextrinas y éstas se transformarían enteramente en
alcohol (Hornsey, 2003). La esterilización del mosto es obtenida por
simple ebullición, pues su reacción es ligeramente ácida. La coagulación
de las materias proteínicas debe hacerse lo mejor posible, pues si
subsisten en el mosto ocasionarían problemas en la fermentación,
provocando fácilmente turbiedad en la cerveza embotellada. La
esterilización y la destrucción de las enzimas es fácil de realizar, un
cuarto de hora de ebullición es generalmente suficiente (Hornsey, 2003).
La coagulación de proteínas es mucho más difícil, se realiza por etapas,
la primera es la desnaturalización que consiste en la ruptura de puentes
de hidrógeno en la molécula de proteína, pasando del estado hidratado
al deshidratado, manteniéndose en suspensión únicamente por su carga
eléctrica; luego de la desnaturalización se produce la coagulación
propiamente dicha por agrupación de micelios deshidratados; es aquí
donde el pH juega un papel muy importante, pues la coagulación será
eficiente si se realiza en el punto isoeléctrico; como existen muchas
proteínas en el mosto se ha optado por el pH 5.3 como el más
conveniente (Hornsey, 2003). Durante la ebullición, la coloración
también aumenta sobre todo por la formación de melanoidinas, también
41
por oxidación de taninos, estas dos reacciones son favorecidas por el pH
elevado. Por último a lo largo de la ebullición se forman productos
reductores que contribuyen a la calidad y estabilidad de cerveza
(Hornsey, 2003).
El lupulado del mosto se realiza tradicionalmente durante esta operación,
es decir, en la paila de ebullición. El amargor es obtenido por
isomerización de los ácidos y del lúpulo; esta isomerización es incompleta
debido principalmente al pH del mosto, el pH óptimo de isomerización es
de 9. Existen muchas lupulonas y humulonas en el lúpulo; cada uno de
estos compuestos donará su isómero respectivo; el conjunto es conocido
como isohumulonas pues son esencialmente quienes donan el amargor
deseado (Verstrepen, 2003).
2.10.5. Enfriamiento del Mosto
El mosto obtenido por sacarificación de la malta o de los adjuntos y por
proteólisis de las proteínas de la malta, es llevado a ebullición durante
hora y media con el lúpulo para otorgarle el amargo, a lo largo de esta
ebullición la esterilización completa es obtenida gracias al pH que oscila
alrededor de 5.3 (Hough, 1990). Los precipitados proteicos son
eliminados por sedimentación, filtración o centrifugación; el mosto es
enseguida enfriado a la temperatura de inoculación de la levadura, esta
temperatura depende del tipo de levadura empleada y del tipo de cerveza
a fabricar entre 6 a 20ºC (Hough, 1990). Durante el enfriamiento un nuevo
precipitado de polifenoles-proteínas se forma, por un lado por enlaces de
hidrógeno y también por la falta de solubilidad de las prolaminas. La
presencia de este nuevo precipitado juega un rol esencial sobre la
formación de H2S por la levadura (Verstrepen, 2003).
El mosto enfriado, en principio estéril, debe ser aireado antes del inicio de
la fermentación, de no ser aireado la tasa de mortalidad de la levadura
aumentaría a tal punto que ésta no podría ser reutilizada; la oxigenación
42
del mosto antes del inicio de la fermentación permite a la levadura
sintetizar ácidos grasos insaturados (oleícos, linoleícos, y linolénicos), en
ausencia de estos ácidos grasos la pared celular esta sujeta a
alteraciones
lo
cual
lo
hace
más
permeable
a
los
ésteres
correspondientes a los alcoholes superiores que ella misma forma
(Klimovitz, 2002).
La composición del mosto es muy variable en función al tipo de cerveza
fabricada, su densidad puede variar entre 2 a 20 grados Plato (ºP), es
decir que puede contener de 2 a 20g de soluto por 100g de líquido; a su
vez puede ser rico o no en aminoácidos y péptidos en función de la
importancia de la proteólisis y de la proporción de adjuntos utilizados
(Klimovitz, 2002). La relación maltosa/dextrinas es igualmente variable de
acuerdo al método de cocimiento escogido. De manera general se puede
decir que el mosto es un medio incompleto, normalmente carente de
aminoácidos y ácidos grasos insaturados pues es imposible obtener un
crecimiento rápido y completo de levadura; cosa que no sucede si se
tratara de un medio sintético a base de extractos de levadura (Klimovitz,
2002).
2.10.6. Fermentación
Hasta esta etapa se ha preparado un líquido complejo y se ha purificado
cuidadosamente hasta el momento de agregar la levadura cervecera para
producir su fermentación (Hornsey, 2003).
Inicialmente, se agrega al mosto frío, levadura en una cantidad calculada,
para que quede en el mosto de 8 a 10 millones de células por cc. Para la
fermentación de mosto concentrado, se usa un millón de células por cc
por cada grado plato del mosto (Hornsey, 2003). La cantidad de levadura
previamente determinada se diluye en el mosto y luego se inyecta a la
línea de mosto frío durante el enfriamiento. La cantidad total de levadura
43
que se inyecta se calcula teniendo el cuenta el volumen de mosto que va
contener la tina de fermentación (Hornsey, 2003).
La temperatura inicial de fermentación puede variar entre 6 a 10 ºC. Una
vez que se inicia la fermentación se aprecian como cambios notorios, el
descenso
del
extracto,
la
producción
de
gas
carbónico
y
el
desprendimiento de calor; durante la fermentación se controla el
descenso de la densidad regulando la temperatura con atemperadores
(serpentines o chaquetas), por los cuales circula agua fría o salmuera o
agua glicolada a temperaturas que oscilan entre 1 a 2 ºC para el caso del
agua y de -5 a -10 ºC para el caso de la salmuera o el agua glicolada
(Xiao, 2004).
Para recolectar el gas carbónico que se desprende de la fermentación,
comúnmente el tanque está conectado por la parte superior con dos
tuberías; una que va a la intemperie y la otra que va a la planta de
purificación de gas carbónico. En la planta de gas carbónico, éste es
purificado y licuado con el fin de inyectarlo posteriormente a la cerveza
(Hornsey, 2003).
Cuando se alcanza el extracto límite o sea hasta donde se le va a dejar
fermentar se abre el frío para conseguir enfriar la cerveza y para que la
levadura se alimente (Xiao, 2004). Se consigue enfriar la cerveza hasta 5
ºC y se suspende el envió de gas carbónico a la planta, luego se bombea
la cerveza a los tanques de maduración y se recupera la levadura
(Hornsey, 2003).
A la cantidad de levadura obtenida en cada fermentación se le denomina
cosecha de levadura, lo normal es obtener 4 veces la cantidad de
levadura agregada (Hornsey, 2003).
Al final de esta cuando los azucares han sido transformados hasta alcohol
y gas carbónico se tendrá la cerveza. Después de la fermentación la
44
cerveza es separada de la levadura, la cual puede ser utilizada para
fermentar más mosto, posteriormente.
La fermentación juega un rol esencial en la calidad de la cerveza, en
particular gracias a los productos secundarios como los alcoholes
superiores y ésteres; es también la etapa de la fabricación más difícil de
controlar (Xiao, 2004). La levadura que es reutilizada de una fermentación
a otra no tiene un metabolismo estable; ésta se va degenerando.
2.10.6.1. Principales transformaciones que tiene lugar
durante la
fermentación
2.10.6.1.2. Consumo de oxígeno
Durante la fermentación, se distinguen dos procesos muy diferentes en el
metabolismo de la levadura. El primero de ellos es el proceso de
crecimiento o multiplicación celular, el cual es caracterizado por un
incremento en el número de células. El segundo es el proceso del
extracto, es decir, consumo del extracto y formación de alcohol (Klimovitz,
2002).
Después de que la célula se ha adaptado a la presión osmótica del mosto
y los nutrientes han permeado hacia el interior de ella, comienza el
proceso de crecimiento. La multiplicación requiere energía, está es
proporcionada por los azúcares que son metabolizados por una larga
cadena de reacciones enzimáticas. Primero que todo, la energía
producida por estas reacciones es usada para el principal propósito de la
vida; la multiplicación (Klimovitz, 2002).
Para obtener una buena multiplicación celular, el mosto debe ser aireado.
Es bien sabido que el oxígeno juega un papel muy importante en el
crecimiento celular o mejor, en la formación de la membrana celular. La
membrana celular está compuesta fundamentalmente por proteínas,
carbohidratos y materiales grasos, de los cuales los más importantes son
45
los esteroles y los glicéridos; los glicéridos son compuestos en los que el
glicerol está unido a ácidos grasos, algunos de ellos insaturados
(Klimovitz, 2002).
La síntesis de los esteroles y de los ácidos grasos insaturados son dos de
las pocas reacciones en el metabolismo de la levadura, que requieren
oxígeno molecular (Klimovitz, 2002).
La energía producida a partir de los carbohidratos es acumulada en forma
de ATP; éste puede ser utilizado en la formación de acetil-CoA (Coenzima
A) la cual reacciona de muchas formas diferentes. Durante la etapa de
crecimiento la célula de levadura utiliza este compuesto activo para la
síntesis de esteroles y de ácidos grasos insaturados, consumiendo el
oxígeno; consecuentemente, la cantidad de oxígeno proporcionado al
mosto con la aireación es decisiva para la multiplicación celular. Cuando
el oxígeno ha sido consumido, cesa la síntesis de esteroles y ácidos
grasos y por lo tanto la acetil-CoA puede ser utilizada en otras reacciones
(Klimovitz, 2002).
Muchos investigadores han asociado con el metabolismo de los lípidos en
la levadura, la formación durante la fermentación, de los ésteres
encontrados en la cerveza, los cuales constituyen un grupo importante
entre los compuestos volátiles de la cerveza debido a su fuerte y
penetrante aroma a frutas (Heggart, 1999).
Los ésteres son formados por la combinación de un ácido orgánico y un
alcohol con la pérdida de agua.
Los ésteres encontrados en cerveza son normalmente ésteres del ácido
acético. La formación de ésteres requiere energía, no es una reacción
espontánea. El acetato activo o acetil-CoA, que es formado en la levadura
por el ácido pirúvico, es un compuesto de alta energía (Verstrepen, 2003).
46
El ácido acético unido a la coenzima es inestable y puede fácilmente
separarse a ácido acético libre, que en presencia del alcohol puede
formar el correspondiente acetato, utilizando la energía del acetil-CoA
(Harper, 2004).
Otros ácidos como el pirúvico, que también son formados durante la
fermentación, no forman ésteres muy fácilmente debido a que no se
encuentran unidos a coenzimas en enlaces de alta energía (Harper,
2004).
El ácido succínico se encuentra unido a la coenzima A y los ácidos son
elaborados por la levadura a partir de sus enlaces con la coenzima A, así
que los ésteres de estos ácidos se encuentran en la cerveza pero a muy
bajas concentraciones. La mayor parte del aroma de la cerveza se debe a
acetatos (Verstrepen, 2003).
La acetil—Coenzima A participa en una variedad de reacciones
metabólicas, entre las cuales se destacan su oxidación cíclica por la vía
del TCA y su papel en la formación de las unidades fundamentales para la
síntesis de los ácidos grasos (Harper, 2004).
La producción de ésteres está influenciado por cualquier factor que afecte
tanto la biosíntesis como el consumo de acetil Coenzima A.
2.10.7. Maduración
Es la etapa siguiente a la fermentación y comprende todo el tiempo que
dure la cerveza en los tanques a baja temperatura antes de ser filtrada.
Comúnmente se divide en dos etapas que son reposo y acabado, entre el
reposo y el acabado puede haber una prefiltración, pre-enfriamiento y precarbonatación (Klimovitz, 2002).
47
La maduración se puede hacer:
2.10.7.1. Dos etapas
Reposo y acabado y durante el reposo hacer una segunda fermentación,
en el paso de reposo a acabado la temperatura es de 2 a 3 ºC y en
acabado se puede enfriar a -1 ºC (Klimovitz, 2002).
2.10.7.2. Fermentar hasta el extracto límite
Este sistema es americano y en el paso de fermentación a reposo se
efectúa el enfriamiento y entre reposo y acabado, pre-carbonatación,
prefiltración y pre-enfriamiento y durante la filtración final se hace también
enfriamiento (Klimovitz, 2002).
Los objetivos de la maduración consisten en acumular o almacenar
cerveza, dejar sedimentar en forma natural la materia amorfa y la
levadura que aún tiene la cerveza, refinación del sabor por eliminación de
las sustancias volátiles que causan el sabor verde, separación por
precipitación de los compuestos que se forman al ser enfriada la cerveza,
es muy importante considerar que la cerveza se enturbia al ser enfriada
después de haber sido filtrada, otro de los objetivos es completar la
atenuación límite que no ha sido alcanzada en la fermentación y también
se busca carbonatar la cerveza (Klimovitz, 2002).
Al recibir la cerveza en un tanque de maduración es necesario
contrapresionar para evitar la salida de gas y la formación de espuma. Es
un factor que puede contribuir a la deficiencia de espuma. Durante la
maduración la cerveza debe mantenerse bajo presión de 0.3 a 0.5
atmósferas para evitar la oxidación y facilitar la clarificación (la levadura
con presión tiende a sedimentarse y más con frío) y se evita el exceso de
48
purga. Al recibo la contrapresión puede ser con aire o con gas carbónico.
Después se deja bajar la presión con el objeto de efectuar purga y
eliminar aire en la parte vacía del tanque. Luego se cierra y se sostiene
algo de presión porque de lo contrario, se daría una eliminación de
muchas sustancias volátiles y se afecta el aroma de la cerveza. El tanque
no se llena completamente (Klimovitz, 2002).
Si la maduración es muy larga o prolongada el sabor se suaviza
demasiado, pierde cuerpo, pierde amargo y queda muy simple.
Con respecto a la temperatura de cerveza en maduración se especifica
entre -2 y 0 ºC si se hace segunda maduración se pasa a la etapa de
reposo de 2 a 3ºC y cuando se pasa al acabado se enfría a -2ºC. Si es
mayor de 0ºC puede presentarse autólisis de la levadura que pasa a
maduración afectando el sabor, se presentan coagulaciones de las
sustancias que precipitan en frío (proteosas o peptonas - taninos) y por
tanto se obtienen cervezas químicamente inestables, también por esta
temperatura alta no se obtiene una buena clarificación y por lo tanto
cervezas muy turbias al final de la maduración que causan problemas en
la filtración. Al subir la temperatura se puede aumentar el efecto de la
oxidación (Heggart, 1999).
En referencia al tiempo de la maduración cuando se hace en una sola
etapa se deja de 2 a 3 semanas. Cuando es en dos etapas el tiempo de la
primera etapa dura comúnmente 2 semanas y el tiempo de acabado o
segunda etapa dura aproximadamente una semana. La producción debe
ser programada de tal manera que la cerveza tenga una maduración
uniforme (Klimovitz, 2002).
Si el tiempo es corto menos de 15 días es posible que se obtenga un mal
sabor, no precipiten las sustancias que causan estabilidad química
deficiente, no se clarifique bien la cerveza originando problemas de
filtración (Klimovitz, 2002).
49
Al final de la maduración como se va a llevar a cabo una filtración y por lo
tanto una eliminación de la levadura se tendrá que proteger la cerveza
agregándole antioxidantes para que se combinen con el oxígeno y evitar
que se combine con la cerveza pudiéndose emplear ácido ascórbico o
bisulfito de sodio o potasio y para mejorar la clarificación de la cerveza se
emplean clarificantes que pueden ser gelatina, viruta y una mezcla de
bentonita con ácido tánico (Heggart, 1999). La clarificación normal de la
cerveza en maduración es afectada por maltas muy frescas sin el debido
tiempo de reposo, temperaturas altas en maduración, alto extracto
fermentable residual, poco tiempo de maduración, falta de presión positiva
en los tanques de maduración y también por maltas mal modificadas o
con un alto contenido de beta glucanos (Heggart, 1999).
2.10.8. Filtración
Después de la maduración y antes del embotellamiento, la cerveza pasa
de nuevo por una filtración con tierra diatomácea que elimina los últimos
restos que puedan quedar de la fermentación y también los restos de
nitrógeno que durante la maduración han formado una especie de
mucosa, lo que podría provocar más adelante que la cerveza saliera
turbia (Hornsey, 2003).
2.10.9. Envasado
Antes de llevar la cerveza a la máquina de llenado se inyecta CO2 en los
tanques hasta conseguir la saturación deseada, para que la cerveza
salga de su recipiente con una buena capa de espuma (Hornsey, 2003).
Para alargar el tiempo de conservación de una cerveza, sin que cambie
de aspecto, se esteriliza por medio de la pasteurización después del
envasado (las botellas pasan por un túnel con agua a 70ºC), o con una
50
pasteurización flash antes de envasar (durante el recorrido del tanque a
la cadena de envasado la cerveza se calienta hasta 65º C) (Hornsey,
2003).
51
3. JUSTIFICACIÓN
La calidad de la cerveza en el sentido más amplio, es la suma de todas
aquellas características que le permiten a un producto llenar los requisitos
del mercado y atraer a los consumidores para quienes está dirigido; la
calidad también es usada para denotar la ausencia de defectos y,
mientras que el término se aplica tanto al empaque como al proceso de
elaboración del producto, sólo este último aspecto será evaluado en este
proyecto.
Las cervecerías generan y recolectan grandes cantidades de información
con respecto a características específicas de la producción de la cerveza
tanto en producto en proceso como en el producto terminado, la cual
requiere ser analizada de una manera confiable para que se constituya en
una herramienta básica para el control de su proceso.
Considerando esto, se hace importante la necesidad de conocer el
comportamiento microbiológico de la cerveza, en cada una de sus etapas
de producción, para que al obtener los datos, dicha información
contribuya a mejorar la calidad, consistencia del producto y confiabilidad
del proceso que se lleva a cabo, para establecer finalmente que los
análisis realizados son precisos y repetibles, que están utilizando los
controles proceso adecuados, para que los cerveceros puedan centrar su
atención en la administración y mejora continua del proceso.
52
4. OBJETIVOS DEL PROYECTO
4.1. Objetivo general
Evaluar la calidad microbiológica del producto en proceso en una planta
productora de bebidas alcohólicas.
4.2. Objetivos específicos
•
Determinar el número de células de levadura en los tanques de
fermentación y maduración durante el proceso de elaboración del
producto mediante el recuento en cámara de Neubauer
•
Determinar la presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no
Saccharomyces en los procesos de fermentación y maduración.
•
Evaluar la presencia de mutantes de levaduras del proceso
(Respiración Deficiente (RD) y Variants)
•
Determinar la presencia de bacterias contaminantes del proceso:
coliformes y ácido lácticas.
53
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Tipo de estudio
Esta investigación se realizó de manera experimental y se valoró la
calidad microbiológica del producto en proceso, para esto se realizó la
toma de muestras en cada una de las etapas de producción de la cerveza
Figura 5. Se determinó que aunque existen puntos del proceso donde se
pueda presentar contaminación por factores externos a los de la
producción propiamente dicha, estos no afectan la calidad del producto
terminado.
Figura 5. Proceso Cervecero
54
El manejo de las muestras se realizó, utilizando material estéril (botellas
biológicas y Frascos Shoot) y su almacenamiento previo a la siembra se
llevó a cabo bajo condiciones de refrigeración para evitar cualquier foco
de contaminación
ajeno al proceso de las muestras que fueron
evaluadas.
Figura 6. Material para toma de muestras
55
Los resultados obtenidos durante todo el proceso de investigación, fueron
consignados en el formato previamente establecido por la Empresa
(Anexo 1).
5.2. Análisis Microbiológicos del proceso
MUESTRAS
Chase Water
PCA
(Agua de Empuje)
1ml
Mosto
1ml
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
MAC
RAKA
MYGP
CONKEY
WLN
WLD
RAY
SDM LISINA TTC FRECUENCIA
0.2ml
Diario
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml v
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
X
Diario
0.2ml
0.2ml v
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
X
Diario
0.2ml
0.2ml v
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
X
C/Propagac.
0.2ml
20ml
250ml
Diario
0.2ml
20ml
250ml
Semanal
Diario
Fermentaciones
24 – 96 H
Maduraciones
4 – 6 días
Propagación en
cada etapa
1ml
BBT
Sifón
Agua Desairada
Tanques y Torres
1ml
100ml
Semanal
Acueducto
1ml
100ml
Semanal
Tierra Diatomácea
0.2ml
0.2ml
Tabla 2. Análisis Microbiológicos
56
Semanal
5.3. pH de medios de cultivo, Tiempos, Temperaturas y Métodos de
Incubación
Medio
WLN
pH
5.5 - 5.8
Tº
Incubación
Tiempo
Incubación
25ºC
5 días
Comentario
Leer a los 3 días y si esta
negativo incubar 2 días más
Método de
Incubación
Microorganismo
Levaduras/hongos
Aerobio
/bacterias
Leer a los 3 días y si esta
WLD
5.5 - 5.8
Raka Ray 5.4 ± 0.2
25ºC
5 días
negativo incubar 2 días más
Aerobio
Bacterias
25ºC
7 días
--------------------
Anaerobio
Mic.Ácido lácticos
Leer a los 5 días y si esta
Lisina
4.8 ± 0.2 *
25ºC
7 días
negativo incubar 2 días más
Lev Salvaje no
Aerobio
Saccharomyces
Aerobio
Levadura salvaje
Aerobio
Bacterias
Leer a los 5 días y si esta
SDM
-----
25ºC
7 días
negativo incubar 2 días más
Leer a las 48 Horas y si esta
PCA
7.0 ± 0.2
30ºC
4 días
negativo incubar 2 días más
Bacterias
PCA
7.0 ± 0.2
44ºC
48 Horas
- - - - - - - - - -- - - - - - - -
Aerobio
Termotolerantes
7.1 ± 0.2
30ºC
48 Horas
-------------------
Aerobio
Coliformes
Agar Mac
Conkey
Agar Mac
Coliformes
Conkey**
7.1 ± 0.2
44ºC
48 Horas
------------------
Aerobio
Termotolerantes
MYGP
5.0 - 6.0
25ºC
4 días
------------------
Aerobio
RD (petite mutans)
WLN
5.5 - 5.8
25ºC
5 días
-------------------
Aerobio
Variants (verdants)
Tabla 3. pH, Tiempos, Temperaturas y Métodos de Incubación
* pH después de adicionar el ácido láctico
** El manual de Oxoid recomienda no incubar más de 48 Horas el agar
Mac Conkey ya que puede dar resultados confusos. (Sept. 27 de 2006)
5.4. Técnicas Empleadas
5.4.1. Siembra en Placa
Para el aislamiento e identificación de los diferentes microorganismos que
pueden crecer en los medios de cultivo mencionados anteriormente, se
57
utiliza la técnica de siembra en superficie, donde se inocula 0,2 ml de la
muestra a evaluar y se lleva a cabo la homogenización de ésta utilizando
la espátula de Digralski.
Para llevar a cabo la siembra en el medio Plate count agar, se utiliza la
siembra en profundidad, donde se inocula 1 ml de la muestra y
posteriormente se adiciona el medio de cultivo líquido a una temperatura
adecuada para evitar la muerte de los microorganismos o inhibición de los
microorganismos, la homogenización se realiza de manera manual
haciendo suaves movimientos giratorios de la caja de petri.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación adecuado para cada medio
de cultivo, se realiza el recuento de unidades formadoras de colonias
(UFC); Estos recuentos dan la pauta de la cantidad de microorganismos
presentes en una muestra, como también el grado de contaminación o
concentración de microorganismos, en productos industriales (Escobar,
2002).
5.4.2. Filtración por membrana
La filtración por membrana se ha convertido en una parte importante de la
tecnología de la separación en los últimos decenios. Su importancia
radica en el hecho de que trabaja sin la adición de productos químicos y
conducciones de proceso fáciles y bien dispuestas. La membrana
funciona como una pared de separación selectiva. Ciertas sustancias
pueden atravesar la membrana, mientras que otras quedan atrapadas en
ella. Es un proceso de bajo coste energético. La mayor parte de la
energía requerida es la necesaria para bombear los líquidos a través de la
membrana.
Al llevar a cabo el recuento de las UFC sólo deben ser
contadas las colonias que se han formado en la membrana y dicho
número se divide por el volumen filtrado.
58
5.4.3. Recuento en cámara de Neubauer
5.4.3.1. Levadura en Proceso de Fermentación y Maduración
1. Mezclar vigorosamente la muestra a analizar.
2. Tomar 1 ml de muestra utilizando una pipeta graduada y verter en tubo
falcon de 10 ml.
3. Adicionar 9 ml de ácido acético al 10% (únicamente para las muestras
de fermentación)
4. Se mezcla nuevamente la muestra utilizando el vortex.
5. Montar la muestra en la cámara y realizar el recuento en el cuadrante
del centro
6. El recuento de células obtenidas se multiplica por los 5 cuadrantes
donde se llevó a cabo el conteo, por el factor de la cámara 104 y por el
factor de dilución utilizado 101.
59
6. RESULTADOS
Los datos utilizados para la construcción de las tablas que aparecen en
este capítulo, salvo que se indique lo contrario en el texto, son los datos
promedio de la totalidad de los resultados obtenidos durante el tiempo en
el cual se evaluó la calidad microbiológica de cada una de las etapas de
producción.
Parámetro
Nº
Muestras
analizadas
5
Acueducto
(Enero)
Acueducto
(Febrero)
Acueducto
(Marzo)
Acueducto
(Abril)
Acueducto
(Mayo)
PCA
% DE
UFC/ml
Mac
Conkey
UFC/100cm3
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
Tabla 4. Agua Acueducto de Cali
Parámetro
Enjuague
tanque 101
Enjuague
tanque 102
Enjuague
tanque 103
Enjuague
tanque 104
Enjuague
tanque 105
Enjuague
tanque 106
Enjuague
tanque 107
Enjuague
tanque 108
Enjuague
Nº
Muestras
analizadas
PCA
WLN
WLD
UFC/ml
UFC/ml
UFC/ml
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
(1)
20
0
0
40
0
0
80%
0
100%
0
95%
% DE
0
20
(1)
20
0
0
5
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
60
tanque 109
Enjuague
tanque 110
Enjuague
tanque 401
Enjuague
tanque 402
Enjuague
tanque 403
Enjuague
tanque 404
Enjuague
tanque 408
Enjuague
tanque 409
Enjuague
tanque 410
Enjuague
tanque 411
Enjuague
tanque 412
Enjuague
tanque 1
Enjuague
tanque 2
Enjuague
tanque 3
Enjuague
tanque 4
Enjuague
tanque 5
20
(1)
20
0
0
90%
0
0
10
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
20
0
0
0
100%
Tabla 5. Enjuagues de Tanques [fermentación (101 – 110), Maduración
(401 – 412) y Filtración (1 - 5)]
Figura 7. Enjuague Tanque 103
61
Parámetro
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Nº
Cocimiento
Nº
Muestras
analizadas
PCA
UFC/ml
WLN
UFC/ml
WLD
UFC/ml
Mac
Conkey
UFC/ml
% DE
1-5
3
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
8 - 12
9
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
16 - 20
19
5
1
0
0
0
0
0
NA
NA
100%
100%
24 - 28
25
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
32 - 36
34
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
40 – 44
42
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
48 – 52
50
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
56 – 60
60
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
64 - 68
66
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
72 – 76
73
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
80 - 84
5
0
0
0
0
100%
Tabla 6. Agua de Empuje y Mosto
62
Parámetro
Propagación A
Hls
80
Propagación A
Mac
Conkey
UFC/ml
Raka
Medio
Ray
Lisina
WLN
WLD
SDM
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml
0
0
0
0
0
0
% DE
100%
120
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación B
80
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación B
120
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación C
80
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación C
120
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación D
80
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación D
120
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación E
80
0
0
0
0
0
0
100%
Propagación E
120
0
0
0
0
0
0
100%
Tabla 7. Propagación de Levadura
Parámetro
Fermentación
24 Horas
Nº
Muestras
Analizadas
Mac
Conkey
UFC/ml
Raka
Medio
Ray
Lisina
WLN
WLD
SDM
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml
80
0
0
0
0
0
0
100%
80
0
0
0
0
0
0
100%
80
0
0
0
0
0
0
100%
80
0
0
0
0
0
0
100%
80
0
0
0
0
0
0
100%
80
0
0
0
0
0
0
100%
80
0
0
0
0
0
0
% DE
Fermentación
48 Horas
Fermentación
72 Horas
Fermentación
96 Horas
Maduración
4 Días
Maduración
5 Días
Maduración
6 Días
Tabla 8. Fermentaciones y Maduraciones
63
100%
Figura 8. Medios de Cultivo Utilizados para el análisis de muestras
(Propagación, Fermentaciones y Maduraciones)
64
Clase de Levadura
/Generación
A
A
A
A
A
A1
A1
A1
A1
A2
A2
A2
A3
A3
A3
A3
B
B
B
B
B1
B1
B1
B1
B2
B2
B2
B2
B3
B3
B3
C
C
C
C
C1
C1
C1
C1
C2
C2
C2
C2
C3
Tanque N°
102
107
104
103
108
106
109
105
101
110
107
104
103
102
108
106
109
105
101
110
107
104
103
102
108
106
109
105
101
110
107
102
108
106
109
105
107
101
110
102
103
108
106
105
65
% Petite mutants
0%
0%
0%
0%
0,71%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,75%
0%
0%
0%
0,65%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,69%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,59%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
C3
C3
C4
C4
C4
D
D
D
D
D
D1
D1
D1
D1
D2
D2
D2
D2
D2
D3
D3
D3
D3
D3
E
E
E
E
E
E1
E1
E1
E1
E2
E2
E2
E2
E3
E3
E3
E3
103
107
101
110
102
103
104
109
106
105
107
110
101
108
102
103
104
109
106
107
105
103
101
110
102
103
104
107
102
101
103
107
108
106
101
109
102
103
104
110
106
Tabla 9. Respiración Deficiente
66
0%
0%
0%
0%
0,81%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,59%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
Nº Muestras
analizadas
Parámetro
Agua desairada
Tanque 1
Agua desairada
Tanque 2
Agua desairada
Entrada Torre
Agua desairada Salida
Torre
Agua desireada Salida
Torre
PCA
Mac Conkey
UFC/ml
UFC/100cm3
22
0
0
100%
22
0
0
100%
22
0
0
100%
22
0
0
100%
22
0
0
100%
Tabla 10. Agua Desairada
Parámetro
Tierra
Diatomácea
(Enero)
Tierra
Diatomácea
(Enero)
Tierra
Diatomácea
(Febrero)
Tierra
Diatomácea
(Febrero)
Tierra
Diatomácea
(Marzo)
Tierra
Diatomácea
(Marzo)
Tierra
Diatomácea
(Abril)
Tierra
Diatomácea
(Abril)
Tierra
Diatomácea
(Mayo)
Tierra
Diatomácea
(Mayo)
Nº
Muestras
analizadas
WLN
WLD
UFC/ml
UFC/ml
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
5
0
0
100%
% DE
Tabla 11. Tierra Diatomácea
67
% DE
Parámetro
BBT
Tanque 1
Nº
Muestras
Analizadas
Mac
Raka
Conkey WLN
Ray
UFC/ml UFC/ml UFC/ml
PCA
UFC/ml
80
0
0
9.8
0
100%
80
0
0
9.8
0
100%
80
0
0
9.4
0
100%
80
0
0
7
0
100%
80
0
0
9.2
0
100%
% DE
BBT
Tanque 2
BBT
Tanque 3
BBT
Tanque 4
BBT
Tanque 5
Tabla 12. Tanques Análisis BBT`s
Parámetro
Sifón Poker
Nº
Mac
Raka
Muestras Conkey WLN
Ray
Analizadas UFC/ml UFC/ml UFC/ml
Sifón Costeña
30
0
9.8
0
% DE
100%
30
0
9.4
0
100%
Tabla 13. Sifón (Cerveza sin pasterizar)
Recuentos Celulares Fermentaciones UFC/ml
Promedio
Tanque
Enero
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
1,2E+06
1,7E+06
1,4E+06
1,4E+06
1,3E+06
1,4E+06
1,9E+06
1,3E+06
1,7E+06
2,3E+06
Febrero
1,3E+06
2,2E+06
1,1E+06
1,7E+06
1,6E+06
1,2E+06
1,2E+06
1,8E+06
2,0E+06
1,4E+06
Marzo
Abril
Mayo
2,0E+06
1,8E+06
1,3E+06
2,1E+06
1,5E+06
2,3E+06
1,6E+06
1,3E+06
1,4E+06
1,9E+06
1,8E+06
1,5E+06
2,3E+06
2,6E+06
1,8E+06
2,1E+06
1,5E+06
1,8E+06
2,1E+06
1,7E+06
1,7E+06
1,1E+06
1,2E+06
1,9E+06
2,1E+06
1,1E+06
1,8E+06
1,5E+06
2,2E+06
1,3E+06
Tabla 14. Conteos Celulares Fermentaciones
68
Recuentos Celulares Maduraciones UFC/ml
Promedio
Tanque
Enero
Febrero Marzo
Abril
401
1,2E+04 1,4E+04 1,3E+04 1,9E+04
402
1,7E+04 1,4E+04 1,4E+04 1,3E+04
403
2,0E+04 1,3E+04 1,5E+04 1,6E+04
404
1,8E+04 2,1E+04 2,3E+04 1,3E+04
408
1,3E+04 1,1E+04 1,6E+04 1,2E+04
409
2,2E+04 1,7E+04 1,2E+04 1,8E+04
410
1,7E+04 1,2E+04 2,1E+04 1,8E+04
411
1,1E+04 1,9E+04 1,1E+04 1,5E+04
412
1,8E+04 1,5E+04 2,3E+04 2,1E+04
Tabla 15. Conteos Celulares Maduraciones
69
Mayo
1,7E+04
2,3E+04
1,4E+04
1,9E+04
2,0E+04
1,4E+04
2,2E+04
1,3E+04
1,8E+04
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Tradicionalmente la calidad se ha definido como el nivel de conformidad
de un producto a su diseño o especificaciones. Esta calidad es la que se
puede generar y controlar dentro de la fábrica, logrando de esta manera
acreditar una marca cuya personalidad se caracteriza por una serie de
parámetros, unos de orden legal, otros típicos del proceso tales como
controles físico-químicos, organolépticos y microbiológicos y unos más
frutos del diseño de imagen del producto, por esto, para cada una de las
cervezas que elabora, está establecida una norma o parámetro que define
exactamente la calidad que se debe alcanzar; sin embargo, aunque
pueden existir variaciones en las materias primas, mano de obra y el
proceso propiamente dicho, se deben evitar al máximo diferencias entre
los distintos lotes durante el proceso de fabricación, esto con el fin de
obtener un producto homogéneo, lo que implica una estandarización del
proceso de producción; por esto se desarrolló un sistema de control en
cada una de las fases del proceso para limitar la presencia de
contaminantes, que terminan afectando finalmente a los consumidores;
para asegurar esto, se hace imprescindible impedir, entre otros, la
presencia de patógenos y de contaminantes indeseables. Ambos
aspectos, en especial el primero, se consiguen mediante la pasterización
y otros sistemas de eliminación (García, 2007). Pero para certificar la
inocuidad de la producción, se requieren distintos procesos de verificación
y es precisamente en este punto donde se evaluó la calidad
microbiológica del producto identificando algunas de las desviaciones que
se pueden presentar y de esta manera con los resultados obtenidos
brindar un apoyo durante el proceso de elaboración, para que una vez
finalizada la producción se asegure que el producto cuando sale al
mercado cumple con las especificaciones establecidas.
Un plan de control incluye la periódica toma de muestras a lo largo de
todo el proceso para su análisis directo al microscopio y a través de
70
medios de cultivo adecuados para obtener crecimiento de colonias y
realizar una verificación más especializada de las mismas, características
que no son posibles de identificar en una muestra en fresco (Hornsey,
2003). El control microbiológico se ocupa del estudio y determinación de
los microorganismos diferentes a la levadura cervecera cultivada, que
pueden contaminar el producto influyendo en la calidad del producto
terminado (Hornsey, 2003).
Para garantizar que el proceso inicia libre de microorganismos
contaminantes, se evaluó la calidad del agua potable suministrada por el
acueducto municipal de Cali, ésta se tuvo en cuenta debido a que algunas
de las tuberías de la cervecería se encuentran deterioradas y podrían
convertirse en una fuente de contaminación importante puesto que
pueden aportar una carga microbiana que podría terminar en una
alteración de todos los procesos llevados a cabo en la cervecería; se
realizaron análisis microbiológicos para identificación de mesófilos y
coliformes los cuales usualmente indican la presencia de otros
contaminantes microbiológicos. El límite máximo de coliformes totales es
de 0 UFC/100 cm3 y ninguna muestra debe contener E. coli o coliformes
fecales en 100 cm3 de de agua (Decreto 475), durante todo el transcurso
de esta evaluación se obtuvo un recuento de cero unidades formadoras
de colonias (UFC/100cm3); estos resultados garantizaban, que el agua
utilizada en la cervecería en los diferentes procesos como enjuagues de
tanques o como agua de dilución, se mantenían libre de contaminación
microbiológica.
Partiendo de este hecho, se evaluaron los enjuagues realizados a los
diferentes tanques que se encuentran en la planta (fermentación,
maduración y filtración) y que son utilizados para almacenamiento de
materia prima y producto, puesto que durante el proceso de elaboración
de cerveza se producen precipitados, tanto de sales inorgánicas como de
productos orgánicos y adherencias de los mismos a las superficies de los
depósitos, las tuberías y otras piezas del equipo con las que entra en
71
contacto el mosto y la cerveza , el no mantener una adecuada rutina de
limpieza le estaría agregando esta contaminación al producto en proceso
y por consiguiente contaminaría tuberías, mangueras y demás (Klimovitz
et al, 2002). Estos precipitados están constituidos fundamentalmente por
sales de calcio, magnesio, proteína desnaturalizada y levadura que en
caso de no ser eliminados durante el enjuague realizado, estarían
proporcionando
nutrientes
y
protección
a
los
microorganismos
contaminantes (Klimovitz et al, 2002).
La rutina de limpieza, supone primero un lavado con agua, que va
seguido por rociado a alta velocidad de un fluido germicida como Soda
cáustica a concentraciones del 3%, a una temperatura de 80^85°C, se
realiza un segundo enjuague y se adiciona posteriormente ácido nítrico a
una concentración que oscila entre 2 – 2.5%, después se somete a un
último enjuague utilizando una presión aproximada de 80 – 150 con una
ducha (Khatcher) de agua potable fría, finalmente se realiza un último
enjuague utilizando dióxido de cloro, el cual supera varias de las
limitaciones asociadas con residuales libres y asociados del cloro
(Klimovitz et al, 2002). El dióxido de cloro es un oxidante más estable y
fuerte que el cloro y más efectivo, no sólo para desinfectar más
rápidamente a niveles residuales más bajos que el cloro, sino para oxidar
muchos materiales y remover olores. No forma trihalometanos o
clorofenoles, y no reacciona con amoníaco. Con el dióxido de cloro,
dosificaciones más bajas son requeridas para mantener un residual de
desinfección de 0.3mg/L (Hornsey, 2003), por lo tanto éste no solo
esteriliza, si no que a su vez facilita la limpieza.
Es en este punto donde de una manera aséptica y con la botella estéril
que contiene una cantidad adecuada de tiosulfato de sodio a una
concentración previamente establecida, el operario tomaba la muestra y la
llevaba al laboratorio, donde era almacenada en la nevera a una
temperatura promedio de 4ºC, posteriormente, al analizar los resultados
72
obtenidos se encontró que del total de muestras analizadas 3 tuvieron
crecimiento, al hacer el análisis de causas se encontró que debido a fallas
operacionales la concentración utilizada en los sanitizantes empleados
para llevar a cabo el aseo se había realizado de manera incorrecta,
causando este tipo de contaminación, sin embargo, en las demás
muestras no se evidenció crecimiento de ningún microorganismo típico o
ajeno del proceso cervecero en los diferentes medios de cultivo utilizados
WLN y WLD, indicando de esta manera que el inicio de los procesos
llevados a cabo en dichos tanques se podían llevar a cabo de manera
adecuada y que si durante una etapa posterior del proceso se llegará a
encontrar algún tipo de contaminación, ésta fuera una variable para
descartar.
El proceso de producción inicia con el cocimiento del mosto, cuya
composición determina las propiedades de la cerveza como producto
terminado. Antes de iniciar con el enfriamiento del mosto se pasa por el
tanque agua caliente o agua de empuje, esta operación se realiza debido
a que el punto letal de algunos microorganismos varía con las especies y
al hacerla pasar a una temperatura promedio de 70ºC se garantiza la
eliminación de la mayoría de los microorganismos que no pueden
sobrevivir bajo esas condiciones de calor (Hough, 1990); para esta
muestra
fueron
evaluadas
la
presencia
de
mesófilos,
bacterias
termorresistentes y ácido lácticas, descartando cualquier posibilidad de
contaminación y garantizando que el enfriamiento del mosto se iniciara de
una manera adecuada. El mosto tiene que contener la cantidad correcta
de azúcares fermentables y nutrientes para la levadura y precursores de
sabor, éste es microbiológicamente inestable ya que constituye un medio
ideal para la mayoría de las bacterias Gram negativas y algunas Gram
positivas tolerantes a los antisépticos del lúpulo, además contiene
carbohidratos simples, amino nitrógeno, minerales y micro nutrientes
como vitaminas, por esto nunca se almacena a temperaturas por debajo
de 55 0C por breve que sea el tiempo antes de añadirle el inóculo de
cultivo (Hough, 1992). Bacterias como Lactobacillus delbrueckii, y otras
73
formadoras de endosporas, como son termófilas, pueden contaminar el
mosto, multiplicarse rápidamente a temperaturas entre 50 - 650C y
provocar
acidez.
Otras
bacterias,
que
conforman
la
familia
Enterobacteriaceae, al desarrollarse en el mosto producen derivados
sulfurados
y
fenólicos que afectan el sabor final de la cerveza
(Verstrepen, 2003).
El mejor momento para hacer el muestreo es usualmente en el tanque de
mosto caliente, puesto que es ahí donde se mezcla el cocimiento
completo y se determina su volumen (Klimovitz et al, 2002). El mosto
terminado fue analizado para asegurarse que la cerveza tendrá el extracto
deseado, el color, el sabor, la espuma y la calidad microbiológica
requerida para dar inicio al proceso de fermentación. Al mosto se le
evaluó la presencia de mesófilos, coliformes y bacterias ácido lácticas,
obteniendo 0 UFC/ml en todos los cocimientos evaluados, indicando de
esta manera que la filtración, tiempos y temperaturas que se tienen ya
estandarizados,
son
adecuados
para
evitar
la
proliferación
de
microorganismos ajenos al proceso; sin embargo si se hubiera presentado
algún tipo de contaminación microbiana, ésta podría ser suprimida
durante las etapas siguientes, fermentación y maduración (Klimovitz et al,
2002).
La inoculación de la levadura se lleva a cabo inmediatamente después del
enfriamiento
del
mosto,
ya
que
éste
puede
contaminarse
microbiológicamente con facilidad (Hornsey, 2003). Es importante notar
que para poder producir una cosecha de levadura en un estado óptimo
fisiológico para inoculación, deben tomarse una serie de pasos
incrementales (Aguilar, 2003). Estos incrementos reintroducen a las
células en crecimiento activo a una nueva fuente de nutrientes, de manera
que el cultivo nunca se detenga a consecuencia de una privación de
nutrientes (Hornsey, 2003). Igualmente, el mantener una concentración
mínima inicial de por lo menos 106 células/ml por ºP, tiende a reducir el
74
riesgo de una contaminación microbiana por varias razones; en primer
lugar porque no se queda un exceso de nutrientes sin asimilar por mucho
tiempo y en segundo lugar porque el metabolismo de las levaduras tiende
a bajar rápidamente el pH del mosto a niveles subóptimos para muchos
microorganismos que dañan el mosto, tales como coliformes y otras
bacterias entéricas mencionadas anteriormente (Hornsey, 2003).
Durante los procedimientos de incremento, deben llevarse a cabo pruebas
para asegurarse que la levadura que está siendo propagada este libre de
contaminación especialmente con bacterias y levaduras salvajes (Heggart
et al, 1999), por esto se evaluó la presencia de levaduras tipo
Saccharomyces y tipo no Saccharomyces en medios de cultivo
adecuados
para
evidenciar
el
crecimiento
de
este
tipo
de
microorganismos como lo son el SDM y el medio lisina. La mayoría de las
levaduras salvajes o tipo no Saccharomyces pueden amenazar el éxito de
una operación cervecera, ya que pueden competir de manera efectiva
(aeróbica, anaeróbicamente, o ambos) por los nutrientes del mosto
utilizados por las levaduras cerveceras y producir una variedad de
sabores y aromas indeseables similares a los producidos por bacterias
contaminantes (Verstrepen et al, 2003). Algunas levaduras salvajes
excretan amilasas y/o proteasas, y como resultado pueden reducir los
componentes deseados en el producto final tales como las dextrinas o
proteínas, dejando la cerveza opaca, característica indeseada. El
crecimiento de número significativo de células de levaduras silvestres
tiene el potencial de alterar las características de floculación del cultivo de
producción, lo que a su vez puede resultar en una fermentación
suspendida (Aguilar, 2005); al observar los resultados que se obtuvieron
se ve claramente que este tipo de microorganismos no afectó ninguna de
las propagaciones que se llevaron a cabo durante este tiempo.
Así mismo, se evaluó para las fermentaciones, la presencia de bacterias
contaminantes del proceso tales como coliformes y ácido lácticas,
75
encontrando en todos los casos un crecimiento nulo, y para garantizar el
éxito de la fermentación se analizó también la presencia de mutantes de
levaduras del proceso; aspecto muy importante a tener en cuenta puesto
que al ser definida la mutación de la levadura como el cambio estable,
heredable, en el DNA, que típicamente resulta en la generación de una
forma nueva, alternada de gen, y un nuevo fenotipo (característica
observable), podría afectar de manera considerable el proceso de
fermentación (Philiph, 1985).
Las mutaciones son usualmente detectadas mediante la pérdida o
alteración observable de una función particular, tal como la asimilación de
una fuente de nitrógeno o de carbono. De las muchas mutaciones que
pueden ocurrir y tienen un efecto significativo en la fermentación, sólo tres
son usualmente observadas. Estas son: pérdida de la habilidad de
fermentar maltotriosa, pérdida de floculencia y deficiencia respiratoria; las
dos primeras son a menudo el resultado de un daño al DNA cromosomal
encontrado en el núcleo de la célula, mientras que la tercera es a menudo
el resultado de un daño genético al DNA localizado en la mitocondria
celular (Ha et al, 2002). Los cultivos que pierden la habilidad de fermentar
maltriosa, atenúan al mosto incompletamente, ya que la maltriosa es un
carbohidrato abundante en el mosto; por otro lado los cultivos que pierden
su habilidad de floculación tienden a sobreatenuar al mosto, y, a menos
de que sean removidos mediante centrifugación, pueden resultar en
sabores indeseados de autólisis (Ha et al, 2002). Mutantes cromosomales
espontáneos, o variantes, ocurren en promedio en aproximadamente una
en un millón de células (Adams, 1998). Como resultado, estás células no
producen rápidamente diferencias notables a una fermentación. El
resultado para estos análisis fue negativo lo que indicó que la
propagación comenzaba de una manera adecuada, dando paso a la
fermentación,
la
cual
iniciaba
su
contaminantes.
76
proceso
sin
ningún
tipo
de
La fermentación es uno de los procesos más importantes y complejos en
las operaciones de una cervecería. Frecuentemente, el maestro cervecero
enfrenta los retos de cambios en el aroma y sabor a consecuencia de un
inexplicable comportamiento y desempeño de la levadura durante la
fermentación (Verstrepen, 2003).
Tradicionalmente la fermentación cervecera es descrita como el proceso
en donde los carbohidratos fermentables son transformados en etanol y
numerosos subproductos y por medio de las interacciones con otros
constituyentes del mosto, muchos de los compuestos de sabor en la
cerveza se desarrollan (Oliveira, 1999).
A pesar de su complejidad, la fermentación es dependiente en gran
medida de tres parámetros básicos: la composición del mosto (nutrientes
para la levadura); la levadura; y las condiciones de proceso (como tiempo,
temperatura, volumen, presión, forma y tamaño del tanque, agitación y
corrientes en el mosto en fermentación (Kelsall, 1995).
Durante la fermentación debe hacerse cumplir un estricto control de
calidad para asegurar que ésta procede normalmente y que la levadura
está sana, libre de contaminación y que actúa como se espera tanto en
suspensión como en floculación (Kelsall, 1995).
Los contaminantes típicos en un proceso de fermentación de este tipo
crecen en los primeros estadíos de la fermentación hasta que los
descensos de pH y la elevación en la concentración de etanol le resultan
adversos (Heggart at al, 1999).
Pediococcos y Lactobacilos, pueden proliferar en esta etapa, ya que al ser
los Lactobacilos generalmente insensibles a los amargos del lúpulo,
sobreviven en un 5% de etanol, y son capaces de crecer en un rango de
temperatura de 5 - 50ºC (Funahashi, 1998). Los Lactobacilos son
77
heterofermentativos, y producen ácido láctico, ácido acético, dióxido de
carbono, etanol y glicerol como productos finales (Funahashi, 1998).
Algunos hasta pueden producir diacetilo; mientras que los Pediococcos
son los únicos cocos que se conocen pueden crecer en cerveza; crecen
bien en ambientes anaeróbicos o microaerofílicos a temperaturas que van
de 9 – 25ºC (Jacques et al, 1999). Al igual que los Lactobacilos, los
Pediococos crecen bajo las condiciones ácidas encontradas durante la
fermentación.
Los
Pediococos
son
fermentadores
homolácticos,
produciendo ácido láctico como producto final. También pueden producir
suficiente diacetilo para alterar seriamente el sabor y el aroma de la
cerveza (Jacques et al, 1999). Pediococos también pueden causar
viscosidad en la cerveza a consecuencia de la producción de cápsulas de
polisacáridos formados por azúcares, proteínas y ácidos nucleicos
(Jacques et al, 1999).
Las muestras tomadas en los diferentes puntos críticos de control a lo
largo de este proceso, se inocularon en un medio que inhibe
selectivamente el crecimiento de las levaduras de cerveza, pero permiten
el crecimiento de contaminantes (WLD), el cual está suplementado con el
antibiótico ciclohexamida, las levaduras de cerveza tradicionales son
sensibles al ciclohexamida, mientras que muchos de los microorganismos
de cervecería son resistentes y por ende forman colonias en un medio
diferencial. Otro medio de cultivo utilizado fue Raka Ray, al cual se le
añade Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno sorbitan), puesto que este
compuesto es un conocido estimulante para el crecimiento de bacterias
lácticas tales como Lactobacilos y Pediococos (Klimovitz et al, 2002), sin
embargo y pese a que se utilizaron medios altamente selectivos, dichos
microorganismos no fueron identificados en todas las muestra analizadas,
garantizando una óptima calidad del proceso fermentativo que se llevó a
cabo.
78
Las levaduras cerveceras son anaerobias facultativas, eso es, pueden
cambiar de fermentación a respiración y viceversa. También son de los
pocos selectos organismos eucarióticos que pueden sobrevivir (mientras
haya una fuente de carbono fermentable disponible) la pérdida total o
grandes alteraciones del DNA mitocondrial asociado con en primer lugar
componentes de transporte de electrones requeridos para la respiración, y
en segundo lugar con la síntesis de proteína mitocondrial, y crecer
indefinidamente como un mutante de deficiencia respiratoria (Heggart,
1999).
Esto puede significar una pérdida muy significativa de información
genética para una célula de levadura, ya que el genoma mitocondrial
cuenta con aproximadamente el 15% (rango 5 – 25%) del DNA total de
una levadura. Esta forma de mutación es irreversible, y significa que el
número de estos mutantes puede incrementarse rápidamente si ocurre
una alta tasa de mutación y si estos mutantes sobreviven y se reproducen
(Ha et al, 2002). Combinando la naturaleza irreversible de la mutación y el
hecho que la observación de las colonias con respiración deficiente son
menores en tamaño que las colonias silvestres cuando son vistas de
manera macroscópica en placas de medio sólido MYGP, tales levaduras
son llamadas como “positivas - petit” o variants, porque los mutantes
estables de deficiencia respiratoria pueden ser aislados. Bajo condiciones
aeróbicas, los mutantes de deficiencia respiratoria crecen más lentamente
que las células de tipo silvestre porque no pueden respirar (Klimovitz et al,
2002). También son incapaces de metabolizar fuentes de carbono no
fermentables, tales como lactato, glicerol y etanol. Bajo condiciones
anaeróbicas, los mutantes de deficiencia respiratoria pueden crecer a la
misma tasa lenta como las células de tipo silvestre, ya que ambas usan
sendas fermentativas (Ha et al, 2002). Efectivamente, los mutantes de
deficiencia respiratoria pueden demostrar tasas normales, reducidas, o
aumentadas de glicólisis; estos mutantes de deficiencia respiratoria
cuando son recubiertos con 1% de 2,3,5 – cloruro de trifeniltetrazolium
79
(TTC), pueden ser fácilmente identificadas como colonias blancas a
consecuencia de su inhabilidad de reducir la sal de tetrazolium de incolora
a roja, colonias con suficiencia respiratoria adquieren un color rojo
mientras que las mutantes con deficiencia respiratoria permanecen
blancas (Hornsey, 2003) , al evaluar este parámetro se encontró que esta
característica se presenta en la fermentación puesto que de las 85
muestras analizadas, sólo en 7 se evidenció respiración deficiente, sin
embargo al observar los indicadores, las muestras no se salen de los
rangos establecidos los cuales permiten hasta un 5% para encontrar este
tipo de mutación durante el proceso fermentativo.
Otro tipo de contaminantes que se pueden presentar corresponde al
grupo de los coliformes, los cuales pueden crecer en un rango de pH de 4
a 8 (con un óptimo de 6.7), pero no pueden tolerar mucho alcohol, y por
eso sólo crecen en las primeras fases de una fermentación (Heggart,
1999), por este motivo se analizaron muestras que estuvieran dentro de
las 24 – 48 horas de fermentación en el medio de cultivo Mac Conkey el
cual arroja resultados 48 horas después, encontrando 0 UFC/ml y
asegurando que la fermentación arrancaba sin ningún alterante
microbiano de esta clase, éstos a su vez pueden ser utilizados para
decidir si se resiembra la levadura del fermentador, o se descarta.
Se conoce también que en los fermentadores, los coliformes pueden
producir etanol, dióxido de carbono, ácido acético, ácido láctico, fenoles,
acetaldehído, dimetil sulfuro, y otros compuestos que llevan a sabores
extraños en el producto final (Hornsey, 2003), luego el muestreo se
extendió durante todo el proceso que dure la etapa de fermentación,
analizando de esta manera también muestras que se encontraban dentro
de las 72 y 96 horas de fermentación, antes de que iniciaran su paso a los
tanques de maduración donde se analizaron muestras que llevaran de 4
a 6 días en este proceso, encontrando finalmente en ambos casos que los
resultados obtenidos correspondían a los que se esperaba inicialmente y
80
que al finalizar dichos procesos se garantizará la satisfacción de los
estándares de calidad establecidos, puesto que el crecimiento de
microorganismos no cerveceros puede resultar en una cerveza fuera de
estándar, además de provocar alteraciones organolépticas, dependiendo
del contaminante, que pueden incluir acidificación, producción de
diacetilo, sabores fenólicos extraños, olores estercolares, y otros off
flavours (Verstrepen at al, 2003). Sin duda alguna,
la contaminación
microbiana de la levadura de cultivo puede resultar en muy serias
alteraciones en la calidad y características esperadas del producto final.
Aunque en este trabajo solo se evaluó la calidad microbiológica, también
se realizan pruebas físico-químicas que incluyen el chequeo de
parámetros tales como tiempo, temperatura, pH, oxígeno, contenidos de
extracto y alcohol, análisis de sabor y la concentración de células de
levadura, procedimiento que si se tuvo en cuenta en este estudio debido a
que los conteos celulares durante el transcurso y al final de la
fermentación deben encontrarse alrededor de 106 células/ml, parámetro
que se cumplió en los conteos realizados, esta información se puede
utilizar para determinar que la levadura pueda flocular correctamente y a
su vez de paso a una fermentación secundaria que se lleva a cabo en la
etapa de maduración (Hough, 1990), donde también se llevaron a cabo
conteos, los cuales oscilaban en el rango de 104 células/ml por tratarse
del período de maduración, en este punto dichos recuentos son
importantes para determinar que el número de células en suspensión
presentes antes de la estabilización y filtración, son los ideales y cumplen
con el estándar, ayudando de esta manera a la eficiencia del proceso de
filtración.
Después de la maduración y antes del envasado, la cerveza pasa de
nuevo por una filtración con tierra diatomácea que elimina los últimos
restos que puedan quedar de la fermentación y también los restos de
nitrógeno que durante la maduración han formado una especie de
81
mucosa, lo que podría provocar más adelante que la cerveza saliera
turbia (Klimovitz et a, 2002), se tomaron muestras de esta tierra
encontrando 0UFC/ml en ambos medios WLN y WLD, garantizando de
esta manera que esta no interfiere en la calidad de la cerveza que llega
a BBT (tanques de cerveza brillante), sino que por el contrario es un
excelente medio filtrante, al analizar las muestras de los BBT por medio
de filtración por membrana se obtiene crecimiento de levadura en el
medio WLN donde aunque se observa crecimiento en el medio pese a
que ya ha pasado por un filtro anteriormente esta muestra, sin embargo
este crecimiento es permitido porque se trata de levadura cervecera y no
de un contaminante microbiano, no obstante se tienen especificaciones
los cuales indican que para entrar en el rango, el recuento no debe
sobrepasar las 10 UFC/ml y al interpretar estos resultados se encontró
que todos las muestras analizadas alcanzaban a entrar en dicha
especificación. Las pruebas para determinar la presencia de otros
microorganismos fueron negativas en todos los casos.
Antes de llevar la cerveza a las envasadoras, se inyecta CO2 en los
tanques hasta conseguir la saturación deseada, para que la cerveza
salga de su recipiente con una buena capa de espuma y no se oxide
fácilmente (Hornsey, 2003). Para alargar el tiempo de conservación de
una cerveza, sin que cambie de aspecto, la cerveza pasa por una
pasteurización después del envasado (las botellas pasan por un túnel
con agua a 70ºC), o con una pasteurización flash antes de envasar
(Klimovitz, 2002). Una botella antes de pasar por este proceso se
conoce con el nombre de sifón y en este caso también se analizaron
muestras para descartar presencia de bacterias acido lácticas,
coliformes o esporulados que hayan podido proliferar en algún momento
del proceso entre la filtración y el embotellado, pero los resultados
únicamente muestran presencia de levadura en cantidades permisibles o
dentro de especificación.
82
Finalmente es importante recordar que un control de calidad
microbiológico rutinario no resolverá necesariamente los problemas de
contaminación. Sin embargo, ayudará a identificar el problema, cuando
éste surja, para que puedan tomarse las medidas apropiadas para
eliminar tal problema (Klimovitz, 2002). Un control de calidad
microbiológico también revelará los problemas que ocasionalmente
surgen en un producto terminado que no sea resultado de una
contaminación microbiana, permitiendo que se pueda orientar un análisis
de causas.
83
8. CONCLUSIONES
•
Se determinó por medio del recuento en cámara de Neubauer que el
número de células viables de levadura durante el transcurso y al final
de la fermentación son los adecuados para que la levadura pueda
flocular correctamente.
.
•
En la etapa de maduración, se determinó que el número de células en
suspensión presentes antes de la estabilización y filtración, son los
ideales, cumplen con el estándar, ayudando de esta manera a la
eficiencia del proceso de filtración.
•
No se evidenció presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no
Saccharomyces durante las etapas de propagación, fermentación y
maduración, que pudieran afectar la calidad del proceso y del
producto.
•
Se evaluó la presencia de mutantes de levaduras de proceso (Variants
y Respiración Deficiente (RD), este último tipo de microorganismos se
encontró en fermentaciones, sin embargo, los resultados de los
análisis cumplen los rangos o parámetros establecidos.
•
Se evaluó en el proceso la presencia de microorganismos mesófilos,
coliformes y bacterias ácido lácticas, obteniendo 0 UFC/ml en todos
las fases evaluadas, indicando de esta manera que tiempos y
temperaturas de los procesos de cocción, la filtración y los controles
proceso que se tienen ya estandarizados, son adecuados para evitar
la proliferación de microorganismos contaminantes.
84
9. RECOMENDACIONES
•
Durante los meses en que se valoró la calidad microbiológica del
producto en proceso, los resultados encontrados fueron consistentes
debido a que no se evidenció presencia de microorganismos
contaminantes, sin embargo hubo presencia de mutantes de levadura
(respiración
deficiente)
que
a
pesar
especificaciones, es recomendable
de
estar
dentro
de
llevar a acabo un estudio de la
levadura utilizada en el proceso, realizando diferentes ensayos para
verificar su variabilidad a través del tiempo, así como su capacidad
fermentativa o posible deformación del genotipo de la cepa utilizada.
•
Se sugiere evaluar la técnica de filtración por membrana realizando un
estudio que incluya diferentes volúmenes en el momento de filtrar con
el fin de recuperar un mayor número de contaminantes, lo que llevaría
a analizar un mayor número de muestras, esto debido a que
posiblemente la cantidad filtrada no es suficiente para identificar el
crecimiento de microorganismos que podrían causar un inadecuado
perfil sensorial al causar off – flavours.
•
Se aconseja realizar un estudio comparativo con diferentes marcas de
cervezas tanto nacionales como internacionales, para evaluar la
influencia que tiene los diferentes tipos de levadura utilizada y que
finalmente influyen en el perfil sensorial de cada una de las marcas.
85
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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89
11. ANEXOS
11.1. Medios de cultivo
11.1.1. Wallerstein Laboratories Nutrient Médium (WLN y WLD)
WLN: Medio de cultivo utilizado para la diferenciación de levaduras,
levaduras salvajes y bacterias.
WLD: Este medio es más selectivo puesto que lleva cicloheximida para
inhibir el crecimiento de levaduras
Fórmula
g/L
WLN Wallersteins
medium (Oxiod)
nutrient 80,0
WLD (Medio diferencial)
80.0
Cicloheximida
0.133
pH = 5,5 –5,8 (Si es necesario ajustar el pH utilizando ácido clorhídrico)
Autoclavar a 121°C por 15 minutes.
Atemperar el medio a 50°C antes de servirlo en las cajas de petri
11.1.1.2. Interpretación
Saccharomyces cerevisiae puede crecer como una colonia blanca, verde pálido
o azul verdosas, la interpretación se realiza de una manera sencilla, si el
crecimiento de las colonias es espaciado y poco abundante.
Otras especies de Saccharomyces y otros géneros de levaduras salvajes
generalmente se distinguen fácilmente del típico crecimiento que tiene la
levadura en WLN, porque la morfología de las otras colonias es notablemente
diferente
(arrugadas,
levantadas,
ásperas,
polvorolientas),
y
su
color
generalmente difiere también, pasando de blanco por sombras de azul, a verde.
90
11.1.1.3. Estimación de Variants
La levadura típica crece con un aspecto cremoso, verdes con un
pequeño centro amarillo
o pequeñas colonias verde oscuro. Las
colonias son de 2 - 3 mm, levantados y las orillas son enteras.
Todas las colonias que difieren de esta descripción (por ejemplo, orillas
no enteras, el tamaño de la colonia más pequeño, el color, las colonias
brillantes, blancas y más oscuras), puede ser considerada para ser
variantes de la levadura típica.
Estas variaciones (mutaciones), a diferencia de la deficiencia respiratoria,
son desconocidas, y por lo tanto, los efectos en la calidad de cerveza son
también desconocidos.
Sin embargo, asumiendo que pueden ser perjudiciales en la calidad de la
cerveza, una especificación de <5% de variantes es permitida dentro del
proceso.
11.1.1.4. Cálculo
Contar el número total de colonias
Contar el número total de colonias variantes (variants)
Número total de colonias variantes x 100
Número total de colonias
= % variants.
11.1.2. Raka Ray
Medio selectivo para el aislamiento y de bacterias ácido lácticas que
pueden crecer en el proceso. Lactobacillus y Pediococous se discernirán
en este medio.
91
Varios de los componentes de este medio (extracto de hígado, extracto
de levadura y N-acetilglucosamina) se han incluido para que se de una
mejor recuperación de bacterias ácido lácticas.
Sorbitan mono-oleato es incluido como un estimulante para bacterias
ácido lácticas en general. La fructosa presente le sirve como la fuente
esencial de carbohidrato para Lactobacillus fructivorous mientras que la
maltosa presente es tomada por Lactobacillus que no puede utilizar la
glucosa, la cual puede ser utilizada por Pediococous
La selectividad incrementada por la adición de 3 g/L de de 2
phenylethanol para inhibir el crecimiento de microorganismos Gramnegativos y 7 mg de cycloheximide para inhibir levaduras.
Fórmula
g/L
Raka-Ray Agar
(Oxoid code: CM 777)
77,1
Suplemento por Litro
Sorbitan mono-oleato
10,0ml
Cicloheximida
0,007 g
2 – Phenylethanol
3,0 g
pH 5,4 ± 0,2
Autoclavar a 121°C por 15 minutes.
Atemperar el medio a 50-55°C y asépticamente adicionar 3ml de
phenylethanol por litro y posteriormente distribuir en las cajas de petri.
11.1.2.1. Incubación
Una vez realizada la siembra, incubar las cajas en jarras de anaerobiosis
a 25°C por 4 días, verificar la formación de colonias, si no se observa
crecimiento se dejan 3 días más.
92
11.1.2.2. Interpretación
Las bacterias ácido lácticas crecen como colonias brillantes, cremosas.
La confirmación positiva de bacterias ácidas lácticas se debe realizar
utilizando la coloración de Gram (positivo) y la prueba de Catalasa
(negativo).
11.1.3. Agar Mac Conkey
Medio para la detección y numeración de Enterobacterias. Este medio es
diferencial para la detección de coliformes
Este medio contiene además de otros componentes, lactosa, sales
biliares, cristal violeta y rojo neutro como indicador.
El cristal violeta presente en el medio sirve para inhibir el crecimiento de
microorganismos Gram-positivos
Las propiedades diferenciales del medio, se lleva a cabo por acción de los
ácidos producidos por la fermentación de la lactosa, reacción evidenciada
gracias a la presencia del indicador rojo neutro y la absorción de éste por
las colonias para ocasionar las colonias color rojo ladrillo.
Fórmula
g/L
Mac Conkey Agar No. 3 (Oxoid)
51.1
11.1.3.1. Interpretación
Los coliformes se desarrollarán en este medio con colonias que van
desde rosadas oscuras a colonias rojas. Las bacterias Gram-positivos
bacteria son inhibidas en este medio y por lo tanto no pueden crecer.
Otras especies de Gram-negativos pueden crecer pero su color es casi
translúcido.
93
Streptococcus faecalis
y algunas otras levaduras salvajes pueden
crecer sobre este medio.
11.1.4. Plate Count Agar (PCA)
Este es un medio de cultivo útil para la enumeración de una gran variedad
de bacterias, ya que no es ni selectivo ni diferencial y general es utilizado
para recuperar una gran gama de microorganismos que puedan estar
presentes en una muestra para propósitos de enumeración. En este
medio pueden crecer un alto rango de bacterias y levaduras salvajes.
Fórmula
g/L
Plate Count Agar (Oxoid)
17,5
pH = 7,0
11.1.5. Malt Extract, Yeast Extract, Glucose, Peptone Broth (MYGP)
Medio utilizado para el crecimiento de levaduras y levaduras salvajes y en
cervecería para realizar el test de respiración deficiente.
Fórmula
g/L
Extracto de malta
3
Extracto de levadura
3
Glucosa
10
Peptona
5
Bacto-Agar
30
Las células de levadura con respiración deficiente a menudo aparecen
como pequeñas colonias en este medio, estas levaduras carecen ciertas
enzimas respiratorias y han sido asociadas con el crecimiento pobre y la
producción desfavorable del sabor durante la etapa de fermentación, así
como viabilidades más bajas de levadura.
94
Para ser utilizado en el test de respiración deficiente en levaduras, es
necesario adicionar el medio Triphenyl Tetrazolium Cloride Agar (TTC),
utilizando la técnica doble capa de agar.
La prueba realizada en este medio depende del hecho si esas enzimas
respiratorias estuvieron presentes, es decir si la levadura tuvo una
respiración adecuada, entonces al adicionar el medio TTC, la sal sin color
que contiene el tetrazolium es reducida a la forma insoluble (trifenil) y
forma un pigmento rojo.
11.1.6. Triphenyl Tetrazolium Cloride Agar (TTC)
Fórmula
g/L
Triphenyl
chloride
tetrazolium 0,5
Glucosa
5,0
Bacto-Agar
15,0
11.1.6.1. Interpretación
Respiración Normal o suficiente las colonias se tornan de rosado a rojo.
Respiración deficiente, las colonias (petites) permanecen blancas.
11.1.6.1.2. Cálculo:
N = Número total de UFC (Rosadas o Rojas)
Nv = Número total de UFC con Respiración deficiente (Blancas)
N x 100 = X
N + Nv
100 – X = % RD
95
11.1.7. Schwarz Differential Medium (SDM)
Medio para la diferenciación de levaduras típicas del proceso cervecero
de levaduras salvajes.
El complejo Silfito-fucsina inhibe las levaduras de cervecería si se utiliza
en una concentración de 0.3 - 0.35%.
El medio es, por lo tanto, selectivo para el crecimiento de la mayoría de
las levaduras salvajes, y
la apariencia de las colonias de levaduras
salvajes puede es fácilmente detectable.
Fórmula
g/L
Extracto de malta
3,0
Extracto de levadura
3,0
Glucosa
10,0
Peptona
5,0
Fucsina Básica
0,47
Sulfito de sodio
2.92
Dextrina
0,11
Bacto-Agar
20,0
No se Autoclava porque puede ser inhibida la acción del complejo sulfitofucsina, pero se debe calentar y una vez empiece a hervir se debe dejar
por 15 minutos para garantizar la adecuada esterilización.
Incubar las cajas de petri una vez servidas durante toda la noche a 30ºC
antes de ser utilizado para realizar algún análisis.
11.1.7.1. Interpretación
El medio cambia su color inicial durante el período de incubación,
tornándose rojo oscuro.
96
La presencia de colonias rosadas fácilmente discernibles de cualquier
descripción (por ejemplo, suaves, mucoides, arrugadas), indica la
presencia de levaduras salvajes.
11.1.8. Medio Lisina
Este medio contiene lisina como la única fuente de nitrógeno, lo cual lo
hace ideal para la diferenciación Saccharomyces sp, de levaduras tipo no
Saccharomyces sp
Al sembrar las muestras en este medio es importante que todo el
nitrógeno que pueda venir de otra parte sea eliminado, por esto es
importante realizar previamente las diluciones con solución salina.
Algunas bacterias pueden crecer sobre el medio lisina, por eso es
importante confirmar la morfología típica de las levaduras salvajes a
través del microscopio.
Fórmula
g/L
Lisina medio
65
Lactato de potasio 50%
10 ml
Ácido Láctico 10%
1 ml
11.1.8.1. Interpretación
La apariencia típica de una levadura salvaje se diferencia de otras
colonias por la presencia de una especie de neblina en el fondo del
medio, diferenciándolas de otras levaduras que no se han desarrollado.
Esto indicaría la presencia de levaduras de tipo no Saccharomyces.
97
11.2. Muestra de Cálculo
11.2.1. Muestra de cálculo para obtener resultados en el medio WLN
en las muestras de BBT y Sifón.
N = Número de UFC
X = Número de cuadrantes en los que se dividió la caja para realizar
conteo
20 = Volumen de muestra filtrado.
N x (X) = UFC/ml
20
Ejemplo: Resultado Promedio Tanque 1 BBT
N = 49
X= 4
20 = Volumen de muestra filtrado.
49 x 4 = 9.8 UFC/ml
20
Especificación: b 10 UFC/ml
11.2.2. Muestra de cálculo para obtener Porcentaje de Petite mutants
(Respiración Deficiente)
N = Número total de UFC (Rosadas o Rojas)
Nv = Número total de UFC con Respiración deficiente (Blancas)
N x 100 = X
N + Nv
98
100 – X = % RD
Ejemplo: Tanque 102 Generación de Levadura C4
N = 123
Nv = 1
123 x 100 = 99.19%
123 + 1
100 – 99.19 = 0.81 % RD
Especificación: 5% de RD
11.2.1. Muestra de cálculo para resultados siembra en superficie
N = UFC/ml x 5
Multiplico por 5 debido a que el volumen sembrado corresponde a 0.2ml
Ejemplo: Enjuague tanque 103
N = 4 UFC/ml x 5
UFC/ml = 20
99
11.3. Formato para la recolección de Resultados Obtenidos
ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DEL PRODUCTO EN PROCESO - CERVEZAS
CÓDIGO
FECHA
MUESTRA
HORA
TANQUE
Nº
COCIMIENTO
EDAD
VOL. DE
MUESTRA
PCA
(UFC/ml)
Mac
Conkey
(ufc/ml)
100
WLN
(UFC/ml)
WLD
(UFC/ml)
Raka
Ray
(UFC/ml)
ID
SDM
(UFC/
ml)
Lisina
(UFC/
ml)
WLN
Varia
nts
MYGP
RD
D.E/F.D.E.
OBSERVACIONES
101