Micrurus CLAHT, Uruguay

a
Vivas Ja, Salazar A Ma, Sánchez E Eb, Rodríguez-Acosta Ac, Ibarra Ca, Guerrero Ba.
Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Caracas - Venezuela. bTexas A&M University-Kingsville, Kingsville-U.S.A. cUniversidad Central de
Venezuela, Caracas, Venezuela. [email protected]
Las serpientes venenosas han sido clasificadas en las familias: Colubridae, Viperidae, Atractaspididae, Hidrophiidae y Elapidae; en esta última se encuentra la subfamilia Elapinae que incluye las serpientes coral, representadas por 3
géneros: Maticora, Micruroides y Micrurus. Los Micrurus abundan en Estados Unidos, México, América Central y Sur América. El envenenamiento por este género causa principalmente efectos neurotóxicos, que enmascara otras
actividades relacionarse con complicaciones clínicas, entre estas sobre el sistema hemostático que podrían ocasionar daño renal, hepático y manifestaciones hemorrágicas por inhibidores de funciones plaquetarias, actividades pro o
anti-coagulantes, actividades anti o pro-fibrino(geno)líticas, las cuales al ser aisladas, podrían ayudar a aumentar la eficacia de los anti-venenos, y tener aplicabilidad como componentes anti-trombóticos o anti-hemorrágicos.
VENENOS: Veneno de M. t. tener y M. f. fulvius obtenido del Centro de Investigación en Toxinas Naturales-Universidad de Texas- USA. Venenos de Micrurus isozonus de diversas localidades geográficas de
Venezuela del Serpentario del Instituto de Medicina Tropical de la UCV.
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA: Perfil electroforético: método de Laemmli (1970); Perfil cromatográfico: Veneno M. t. tener fraccionado sobre columna Superdex-200 (10 x 300 mm).
CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA: Actividad letal: dosis letal cincuenta (DL50), en ratones BALB/c, por el método de Spearman-Karben (1963).
ACTIVIDADES HEMOSTÁTICAS:
AGREGACIÓN PLAQUETARIA: Plaquetas (450 µL/ 300.000 plaquetas/mm3) se incuban x 4 min a 37 C con veneno o fracción (entre 1 y 100 µg), luego se agrega ADP (10 µM concentración final) y se
determina tramitancia durante 8 min. Control positivo: plaquetas tratadas con Tris 0,05 M- NaCl 0,15 M, pH 7,4.
ACTIVIDAD AMIDOLÍTICA: La detección de enzimas semejantes a las del sistema hemostático en veneno o fracciones, se determina con sustratos cromogénicos (Guerrero y Arocha-Piñango (1992). La
actividad proteolítica específica es expresada en UA/min/mg.
ACTIVIDAD COAGULANTE: Se mezclan 0,1 mL de plasma humano fresco citratado con 0,1 mL de veneno o fracciones (entre 0,01 a 0,5 mg/mL), se incuba a 37 °C y se determina el tiempo de coagulación
en seg. Control trombina estándar. La actividad se expresa en UI/mL de trombina.
ACTIVIDAD FIBRINOGENOLÍTICA: El veneno crudo (VC) se mezcla con fibrinógeno humano (Fg), a diferentes relaciones Fg: VC, se incuba x 24 h a 37 C. El ensayo también se realiza en presencia de
inhibidores de metaloproteasas (EDTA 10 mM), proteasas de serina (benzamidina 10mM, aprotinina 100 UI/mL), o cisteíno proteasas (ácido iodoacético 10 mM). Las cadenas del Fg se evalúan por
electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS-Tricina (Schagger y Jagow, 1987).
ACTIVIDAD FIBRINOLÍTICA SOBRE PLACAS DE FIBRINA: Método de Marsh y Arocha-Piñango (1973). Sobre el gel de fibrina formada se coloca la muestra (10 μL / 10 - 50 μg) y luego de 24 h a 37 C se
determina el diámetro del área de lisis. La actividad se expresa en mm2 del área de lisis de fibrina/µg de proteína.
ACTIVIDAD DEL VENENO SOBRE ENZIMAS DE LA HEMOSTASIA: El efecto del veneno crudo sobre la actividad de trombina, factor Xa y plasmina, se evalúa con substratos cromogénicos. Se mezclan VC
(20 μg) con la enzima (0,25 nKcat de plasmina; 0,1 UI de trombina; y 0,05 UI de factor Xa) y se incuba por 30 min a 37 ºC. Luego se agrega el tampón recomendado y el sustrato cromogénico correspondiente.
Después de 10 min a 37 ºC se determina la DO a 405 nm. El efecto sobre la enzima es expresado en porcentaje. Se toma como 100 % la actividad de la enzima incubada con solución tampón.
Estudio con venenos del género Micrurus
2) Efecto sobre la agregación plaquetaria: Los venenos
1) Letalidad de los venenos de Micrurus: El veneno más
inhiben entre 59 y 95% la agregación plaquetaria inducida
potente es el de M. fulvius fulvius (0,32 mg/Kg), seguido por los
por ADP. Los venenos de M. isozonus de Venezuela,
venenos de M. isozonus (entre 0,52 y 0,61 mg/Kg). El M. t. tener
inhiben entre 50 y 68 %. El M. t. tener es el más activo,
es el menos activo, con una DL50 de 0,78 mg/Kg (Tabla 1).
con un porcentaje de inhibición de 95,2 % (Tabla 2).
Estudios con el veneno de Micrurus tener tener
1) Perfil electroforético: Bajo condiciones no reducidas, el veneno
muestra ~ 13 bandas entre 4 y 148 kDa. Bajo condiciones reducidas,
se observa un grupo de bandas entre 4 y 22 kDa, 3 bandas entre 36 y
64 kDa y una banda entre 98 y 148 kDa (Fig. 1).
3) Efecto de venenos de Micrurus sobre la actividad del factor
Xa, trombina y plasmina: Los venenos inhiben la actividad de
plasmina, de Venezuela, el M. isozonus del Distrito Capital es el más
activo y de los Estados Unidos, el M. t. tener en relación a M. f.
fulvius es más activo. La actividad del FXa fue ligeramente inhibida
solo por los M. isozonus. La actividad de trombina no es afectada
por ninguno de los venenos en estudio (Tabla 3).
2) Perfil cromatográfico: El cromatograma obtenido con el veneno de M. t. tener sobre la columna
Superdex G-200 10/300 se muestra en la Fig. 2. A 280 nm se observan 16 fracciones, numeradas desde F1
hasta F16, las cuales representan componentes con tiempos de retención entre 0 y 80 min.
Fig. 1. SDS-PAGE en gradiente del 8-20%
del veneno de M. t. tener (50 μg )
Fig. 2. Cromatograma del veneno de M. t. tener
(5 mg/100 μL) - Columna Superdex 200 10/300
equilibrada con tampón acetato de amonio 50
mM, pH 6,9.
1) marcador de peso molecular
2) Veneno, condiciones no reducidas
3) Veneno, condiciones reducidas.
Elución a 0,4 mL/minuto. DO a 280 nm. Números
indican las fracciones en orden de elución.
3) Actividad fibrinogenolítica: La actividad de M. t. tener, a la relación 100:10 (Fg:veneno)
y a distintos tiempos de incubación, se muestra en la Fig. 3 A. Rápida degradación de las
cadenas Aα, iniciándose a los 5 min, con una degradación completa a 1 h; lenta
degradación de las cadenas Bβ, que se inicia a las 18 h y se completa a las 24 h. Las
cadenas γ no se degradan a la relación y tiempos evaluados. La actividad fibrinogenolítica
en presencia de inhibidores de proteasas (Fig 3 B) muestra que la degradación es
prevenida por inhibidores de metaloproteasas y cisteinoproteasas (líneas 4, 5 y 8). Los
inhibidores de serino-proteasas no modifican el patrón de degradación (líneas 6 y 7).
4) Actividad fibrinolítica del veneno de M. t. tener: La actividad del veneno de M. t. tener
en placas de fibrina se muestra en la Fig. 4, donde se observa una área de lisis de 16 mm2
con 25 µg del veneno, y un halo blanco alrededor de la lisis (Fig. 4B); con 50 µg de veneno
se produce una lisis de 49 mm2 con el halo blanco de mayor tamaño y definición (Fig. 4C).
La plasmina (0,25 nKcat) produce un área de lisis de 418 mm2 (Fig. 4A).
Fig. 4. Actividad fibrinolítica del veneno de M. t. tener en placas de fibrina, a 24 h de
incubación. A) plasmina 0,25 nKcat; B y C) veneno 25 y 50 μg, respectivamente.
Fig. 3. Actividad fibrinogenolítica del veneno de M. t. tener (M.t.t). Gel SDS-PAGE al 8 % en condiciones reducidas,
coloreado con azul de Coomassie. A) Diferentes tiempos de incubación a 37 C, a una relación Fg:veneno 100:10.
Líneas 1) Marcadores de peso molecular; 2) Fg control (25 μg); 3): Fg + M.t.t a 5 min; 4-8) Fg + M.t.t a 1, 2, 4, 18 y
24 h; 9) M.t.t 2,5 g. B) Fg + M.t.t (preincubado 2 horas con inhibidores de proteasas), a una relación 100:10.
Líneas: 1) Marcadores de peso molecular; 2) Fg control (25 μg); 3) Fg + Mtt; 4) Fg + (Mtt + EDTA); 5) Fg + (Mtt +
EGTA); 6) Fg + (Mtt + benzamidina); 7) Fg + (Mtt + aprotinina); 8) Fg + (Mtt + acido iodoacético).
5) Actividad coagulante: Bajo las condiciones ensayadas el veneno de M. tener tener
hasta 50 μg, no presentó actividad pro-coagulante sobre plasma. A dosis de 1-10 μg de
veneno y Fibrinógeno como sustrato, se induce la formación de un gel inestable de
fibrina a los 25-30 seg.
Este es el primer reporte de actividades sobre la hemostasia- anti y pro coagulante, fibrino(geno)litica y anti-plasmina- en venenos de serpientes del género Micrurus, las
cuales pueden explicar alteraciones sistémicas observadas en pacientes en contacto con serpientes de este género. En casos donde el cuadro neurotóxico no es tan
relevante, las manifestaciones hemorrágicas que pueden aparecer con complicaciones si el tratamiento no es recibido a tiempo. La purificación y caracterización de
estos componentes con acción sobre la hemostasia, entre estos el anti-plasmina y anti-factor Xa, puede ser útiles herramientas terapéuticas, además de facilitar el
estudio de mecanismo de acción a nivel de hemostasia de estos venenos de serpientes de coral.
Financiado por: IVIC y FONACIT (PG-2005000400).