Módulo Ingeniería Genética Agropecuaria Luz Mery Bernal

Módulo Ingeniería Genética Agropecuaria
Luz Mery Bernal Parra. Ph.D.
4. Estructura del ADN
Para entender la ingeniería genética y la tecnología del ADN recombinante, debemos
recordar los conceptos básicos de biología molecular.
Todo organismo, aún el más simple, contiene una enorme cantidad de información. Esta
información se encuentra almacenada en una macromolécula que se halla en todas las células:
el ADN (ácido desoxirribonucleico). Este ADN está dividido en sub-unidades (la cantidad varía
de acuerdo con la especie) llamadas genes. Cada gen contiene la información necesaria para
que la célula sintetice una proteína. Así, el genoma (y por consecuencia el proteoma), va a ser
el responsable de las características del individuo (altura, color, resistencia a enfermedades o
a plagas, número de frutos, presencia o ausencia de estructuras, etc.).
La estructura de la doble hélice del ADN fue descrita por James Watson y Francis Crick en
1953. Dicho descubrimiento es un hito en la historia de la biología y su modelo propuesto ha
sido ampliamente confirmado.
Según este modelo, la molécula de ADN está constituida por dos largas cadenas de
nucleótidos con polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido
está formado por un azúcar: la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de cuatro
tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) y un grupo fosfato.
Imagen tomada del curso: “PCR una herramienta en el diagnóstico”. Salto, Uruguay
Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando largas cadenas. La
estructura fosfato-pentosa recorre el esqueleto de la hélice, mientras que las bases se
disponen formando un ángulo recto con el eje de la misma.
Las dos cadenas de polinucleótidos que constituyen una molécula de ADN se mantienen
unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas
complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas (dos puentes de hidrógeno entre
A y T, y tres puentes de hidrógeno entre G y C)
La estructura de un determinado ADN está definida por la ordenación o "secuencia" de las
bases nitrogenadas en la cadena de polinucleótidos, ocupando precisamente en esta
secuencia de bases la información genética del ADN.
La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (A-T; G-C),
implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas determina automáticamente
el orden de la otra, por ello se dice que las cadenas son complementarias.
Representación esquemática de la molécula de ADN. Estructura tridimensional de la doble
hélice. Tomada del curso: “PCR una herramienta en el diagnóstico”. ATgen. Salto, Uruguay
Detrás de cualquier carácter de un organismo, existe un gen o un grupo de genes responsables
por su expresión. La estructura que gobierna la expresión de los genes es esencialmente la
misma en todos los organismos y se localiza en el mismo ADN, esta estructura se denomina
operón y fue postulada por Jacob y Monod en 1961, como resultado de las investigaciones en
Escherichia coli. Existe una región promotora, una región secuenciadora y una región
terminadora, que en conjunto actúan dentro del proceso de la expresión génica.
La región promotora establece el momento, la manera y el lugar de acción del gen. La región
secuenciadora es el gen propiamente dicho, o sea, el responsable de la síntesis de proteínas
que cumplirá una función específica determinando una característica física en un organismo.
Esta región se transcribe en ARN mensajero (ARNm) y se traduce en una secuencia de
aminoácidos que constituirán una proteína. La región terminadora especifica el final del gen
y determina algunas propiedades del ARNm así como los niveles de expresión del gen.
La carga genética de un determinado organismo no puede ser idéntica a la de otro, aunque se
trate de la misma especie. Sin embargo, debe ser similar para que la reproducción se pueda
concretar. Una de las propiedades más importantes del ADN, y gracias a la cual fue posible la
evolución, es la de dividirse y fusionarse con el ADN de otro individuo de la misma especie
para lograr descendencia diversificada.
Otra particularidad de esta molécula es su universalidad. No importa cuán diferente sean dos
especies: el ADN que contengan será de la misma naturaleza: ácido nucleico.
Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta el concepto de gen, surgen algunas
cuestiones: ¿Son compatibles las cargas genéticas de especies distintas? ¿Puede el
gen de una especie funcionar y manifestarse en otra completamente distinta? ¿Se puede
aislar y manipular el ADN?
La respuesta a todas estas preguntas se resume en dos palabras: Ingeniería Genética.
La Ingeniería Genética es una rama de la genética que se concentra en el estudio del ADN,
pero con el fin de su manipulación. En otras palabras, es la manipulación genética de
organismos con un propósito predeterminado.
Lección 5. Historia
El ADN había sido identificado en 1869 como un constituyente del núcleo por el científico suizo
Frederick Miescher. No fue sino hasta 1946 cuando Edward Tatum y Joshua Lederberg, de la
Universidad de Yale, demostraron que el ADN era el material de la herencia en bacterias.
Cruzaron cepas de Escherichia coli mutantes, cada una de las cuales era portadora de una
deficiencia nutricional diferente, y obtuvieron una prole bacteriana deficitaria en los requisitos
nutricionales de cada progenitor. Las deficiencias se complementaban mutuamente. Esto
demostró que el ADN era una molécula capaz de alterar la herencia y, por tanto, la genética
bacteriana. Más tarde se probó que la misma molécula era el material hereditario de todas las
células vivas.
En 1953 James Watson y Francis Crick postularon la estructura helicoidal complementaria del
ADN en los laboratorios Cavendish de Cambridge. Construyeron un modelo tridimensional del
ADN basado en las configuraciones energéticamente más favorables que eran compatibles
con los parámetros helicoidales proporcionados por los datos de la cristalografía de rayos X
producidos por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King's College de Londres. En 1962
Crick, Watson y Wilkins fueron galardonados con el Premio Nobel por este trabajo. Crick y
Watson demostraron cómo se interrelacionan las tres subunidades importantes de la molécula
de ADN. Establecieron que el ADN es un polímero macromolecular compuesto de tres tipos
de unidades: desoxirribosas (azúcares de cinco carbonos), fosfatos y bases que contienen
nitrógeno. Existen dos tipos de bases, las purinas (adenina y guanina) y las pirimidinas (timina
y citosina). Las bases se unen en pares específicos mediante puentes de hidrógeno: adenina
(A) con timina (T) y guanina (G) con citosina (C). El número de puentes de hidrógeno determina
el apareamiento de las bases de una manera fija, con tres puentes de hidrógeno entre G y C
y dos entre A y T. Los nucleótidos, compuesto cada uno de ellos por un azúcar, un fosfato y
una base, polimerizan en largas cadenas polinucleótidas mediante enlaces fosfodiéster entre
5' y 3'.
En 1958 Frank Stahl y Matthew Meselson, del California Institute of Technology, demostraron
que la replicación del ADN implica la separación de las cadenas complementarias de la doble
hélice y la obtención de idénticas dobles hélices hermanas mediante la replicación
semiconservativa del ADN. Utilizaron diferencias de densidad para separar las moléculas de
ADN parentales de sus moléculas hijas. Primero cultivaron Escherichia coli en un medio muy
rico en isótopos pesados: LC y N. Debido a su densidad y una vez incorporados los isótopos,
el ADN más pesado puede ser claramente separado del ADN más ligero mediante
centrifugación a gran velocidad en cloruro de cesio. Cuando las células portadoras del ADN
pesado fueron transferidas a un medio normal, «ligero», permitiendo que se multiplicaran en
una generación, todo el ADN pesado fue reemplazado por ADN que pesaba la mitad que el
anterior. Esto indicó la presencia de un proceso de replicación semi-conservativo, por el cual
cada molécula hija poseía una cadena pesada procedente de su progenitor y una nueva
cadena, más ligera.
La «molécula de ADN en doble hélice de Watson y Crick» posee en su estructura bioquímica
la información genética que permite la transmisión exacta de la información genética de una
generación a otra, al mismo tiempo que especifica la secuencia de aminoácidos de las cadenas
polipeptídicas de todas las proteínas necesarias para la célula. La replicación del ADN aporta
propiedades especiales. La totalidad de su información puede ser copiada de forma muy
precisa mediante la separación de sus cadenas, seguida de la síntesis de dos cadenas
completamente nuevas. Este mecanismo de replicación del ADN implica la existencia de
diversos sistemas enzimáticos que poseen la habilidad de reparar una cadena rota o dañada.
El trabajo de investigación sobre los sistemas enzimáticos de la replicación del ADN fue
iniciado por Arthur Kornberg en la Universidad de Stanford. En 1958 la ADN-polimerasa I fue
aislada y utilizada para sintetizar ADN en un tubo de ensayo. Usando una cadena de ADN
como molde, la ADN -polimerasa I es capaz de sintetizar una cadena complementaria
mediante la formación de enlaces fosfodiéster entre bases apropiadas. Este trabajo tuvo su
continuación en 1960 con el descubrimiento de la ARN-polimerasa, una enzima capaz de
sintetizar cadenas de RNA (ácido ribonucleico) usando el ADN monocatenario como molde.
Se observó que las células eucariotas contienen tres ARN-polimerasas diferentes, cada una
con un papel funcional distinto. El ARN ribosómico (rARN) se transcribe a partir de genes del
ADN-ribosómico (rADN) mediante la enzima ARN-polimerasa I. La síntesis del ARN mensajero
(mARN) está catalizada por la ARN-polimerasa II y la subsiguiente adición de la cola poliadenina es llevada a cabo por la enzima poli-A-sintetasa. Aproximadamente al mismo tiempo
se descubrió el ARN mensajero y se demostró que organiza los aminoácidos en proteínas.
En 1956 experimentos realizados por Francis Crick confirmaron la hipótesis de que los
mensajes genéticos del ADN son transmitidos por su secuencia de pares de bases. Se observó
que tres bases adyacentes (un triplete) codifican para cada aminoácido, constituyendo un
codón. Mediante el uso de una molécula de ARN mensajero sintético que consistía únicamente
en uracilo (poli-U) se encontró el primer fragmento del código genético.
En 1961 se localizaron los genes responsables de proporcionar resistencia antibiótica a las
bacterias en cromosomas supernumerarios llamados plásmidos. Estos últimos son muy
importantes, pues pueden ser utilizados como vehículos o vectores para transportar moléculas
de DNA extrañas y clonadas. En 1967 se descubrió la enzima ADN-ligasa que es capaz de
unir (ligar) cadenas de ADN entre sí. Tres años más tarde se purificaba la primera
endonucleasa de restricción a partir de bacterias, estas enzimas cortan el ADN únicamente en
sitios específicos. En 1978 el Premio Nobel de Medicina fue otorgado conjuntamente a Warner
Arber, Ramillón Smith y Daniel Mathans por el descubrimiento de dichas enzimas y su
aplicación en biología molecular.
El conocimiento y el uso de las ligasas y las endonucleasas de restricción permitieron la unión
entre sí de fragmentos de ADN creados por una enzima de restricción. La primera molécula de
ADN recombinante fue generada en 1972 en la Universidad de Stanford por Paul Berg. Un año
más tarde se insertaban fragmentos de ADN extraños en ADN plasmídico, creando así
plásmídos quiméricos. Estos plásmidos pudieron ser insertados funcionalmente en Escherichia
coli, y el ADN extraño pudo replicarse y clonarse junto con el ADN plasmídico y bacteriano.
Este gran progreso hizo posible que se pueda clonar cualquier gen o fragmento de ADN en
células bacterianas.
En 1975, en la Universidad de Edimburgo, E. M. Southern desarrolló la técnica que permite
blotar ADN en filtros de nitrocelulosa partiendo de geles de agarosa. Esta técnica se conoce
con el nombre de Southern blot y permite hibridar ADN digerido con enzimas de restricción,
con sondas de ADN o ARN marcadas radiactivamente. La técnica de Southern blot ha facilitado
enormemente la capacidad de localizar moléculas de DNA.