Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

ANALIZADORES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
1
Analizadores
Cuadrupolo (Q)
Trampa de iones (IT)
Sector magnético-eléctrico
(BE)
Tiempo de vuelo (TOF)
Resonancia iónica
ciclotrónica (ICR)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
2
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
3
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Cuando un ion m/z deja la fuente:
mv2/2 = z e V = Ec
El tiempo (t) requerido para volar d es:
v=d/t
m (d2 / t2) / 2 = z e V
t2 = m d2
2zeV
t = m d2 1/2
z2eV
m / z puede ser calculado a partir de t
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
4
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
t = m d2 1/2
z2eV
Ejemplo:
V = 2000 v
d=1m
t H+= 1.7 µs
No tiene límite de m
t 2500 = 50 µs
1/2
t2 – t1 = d2
z2eV
( m2 )1/2 – ( m1 )1/2
fullereno C60 +.
t 720 = 27.665 µs
C5913C +. t 721 = 27.684 µs
∆t = 19 ns
Para mejorar la resolución: aumentar el largo del tubo
disminuír la dispersión en energías
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
5
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
s0
sa
sd
v
m/z
Detector
E
t = t0 + ta + td
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
6
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
E kin = zeU
E kin = 21 mv 2
s
v=
t
m
t = t 0 + ( 2 sa + sd )
2 zeU
m = a + b ⋅t
2
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
7
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
t=
2 mk / z e
V0 + ε −
ε
D0 / V0 + mk / 2 z e
L0 /
V0 + ε
ε : energía inicial del ion (eV)
D0 : distancia de extracción
L0 : distancia en la zona de deriva
V0 : voltaje de extracción
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
8
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Problema: Picos anchos (baja resolución).
Causa: Iones con la misma masa tienen diferentes velocidades
(dispersión de energía)
Muestra + matriz
Iones de igual masa con diferentes velocidades
+
+
+
Para mejorar la resolución: disminuír la dispersión en energías
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
9
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Problema: Picos anchos (baja resolución).
a
c
b
d
Causas: Iones con la misma masa
a- parten a distinto tiempo
b- parten de diferentes puntos
c- tienen diferente velocidad
d- poseen
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA inicial
diferente dirección
Plano de enfoque
espacial
Extracción en dos etapas
10
Analizadores
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
11
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
¿Cómo compensar la dispersión de energía inicial (y tiempo y espacio) de
iones de igual masa?
Time-lag focusing TLF
Delayed Extraction (DE)
Pulse ion extraction (PIE)
TOF con Reflectrón
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
12
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Delayed Extraction (DE)
0V
Iones de igual masa y
diferente velocidad
+
+
Detector
+
1: No se aplica ningún campo eléctrico. Los iones difunden durante el ¨delay time¨.
+20 kV
+
+
+
+18 kV
2: Se aplica un campo eléctrico. El gradiente hace que los iones más lentos se
aceleren más.
+
+
+
0V
3: Los iones lentos alcanzan a los rápidos en el detector.
Placa de
muestra
¨Grid¨de
potencial
Facultad
de Ciencias
Exactas y Naturales
UBA
variable
13
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Potenciales de extracción - DE
Potencial variable (% del
potencial acelerador potencial acelerador)
(15-25) kV
+20 kV
Potential
Ground grid
+18 kV (90%)
Gradient
Al tubo
de
vuelo
Región de ionización
El gradiente de potencial y el tiempo de demora (delay time) deben
ser ajustados para obtener la máxima resolución para un dado rango
de masa.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
14
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Potenciales de extracción - DE
Son parámetros interactivos
Kompact Maldi IV – Shimadzu-Kratos
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
15
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Delayed Extraction (DE) vs tiempo
¨Pulse Delay Time¨
potencial de aceleración
Pulso láser
kV
potencial variable
tiempo
¨delay time¨ de
extracción (25-1000 ns)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
16
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Mejoras en la resolución por DE
Linear mode
Reflector mode
delayed
extraction
R=1,100
10600
10800
continuous
extraction
R=125
11000
11200
11400
11600
m/z
muestra: mezcla de ADN (36-mer)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
17
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
Es un espejo iónico que somete a los
iones a un campo eléctrico uniforme
repulsivo, que los refleja.
Detector
Ion Source
Reflectrón (espejo iónico)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
18
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
reflectrón
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
19
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
E kin = zeU
E kin = 21 mv 2
reflectrón
s
v=
t
m
t = t 0 + ( 2 sa + sd )
2 zeU
m = a + b ⋅t
2
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
20
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
+
+
x
y
Enfoca los iones
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
21
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
Distancia penetrada por un ion de vix en el reflectrón :
x=K/qE
K energía cinética del ion
E campo en el reflectrón
Supongamos dos iones i e i´ con igual m y K´/K = a2
K = 0.5 m vix2
vix = (2 K / m)1/2
K´ = 0.5 m vi´x2
vi´x= (2 K´/ m)1/2 = (2 K a2 / m)1/2
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
vi´x = a vix
22
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
El tiempo fuera del reflectrón :
t = d / vix
vi´x = a vix
t´ = d / vi´x = d / a vix
t´ = t / a
El tiempo dentro del reflectrón :
x=K/qE
x´ = K´ / q E = a2 K / q E = a2 x
Cuando llega a x: v = 0
v (promedio) = v ix / 2
en el reflectrón
t = 2 t0 = 2 x /(v ix / 2)
tr = 4 x / vix
t´r = 4 x´ / vi´x = 4 a2 x/ a vix = 4 a x /vix
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
t´r = a tr
23
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Reflectrón
t´ = t / a
(K´/K = a2)
t´r = a tr
El tiempo total de vuelo :
tT = t + tr
t´T = t´ + t´r = t / a + a t
Si a > 1 el ion con exceso de Ec tiene un vuelo más corto fuera y más
largo dentro del reflectrón
Lo opuesto con a < 1
Con los valores adecuados de E, V y d se compensan totalmente
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
24
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Modo lineal
¾ Masas
altas (> 50 kDa)
¾ Alta sensibilidad
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
25
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Modo Delayed Extraction (DE)
¾
¾
¾
Masas más bajas (< 40 kDa)
Buena resolución
Alta sensibilidad
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
26
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Modo reflectrón
¾
¾
¾
Masas bajas (< 10 kDa)
Alta resolución
Baja sensibilidad
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
27
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Placa Extracción
de muestra grids
Atenuador
Prisma
Laser
Selector
tiempo
de iones
detector
Lineal
Reflector
detector
Reflector
Celda de
colisión
cámara
vacío
vacío
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
28
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
reflectrón
Kompact Maldi IV – Shimadzu-Kratos
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
29
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Resolución y precisión en la determinación de melitina
Resolution = 18100
15 ppm error
8000
6000
Resolution = 14200
Counts
24 ppm error
4000
Resolution = 4500
2000
55 ppm error
0
2840
2845
2850
Mass Exactas
(m/z)
Facultad de Ciencias
y Naturales
UBA
2855
30
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Mejoras en la resolución por DE
Linear mode
Reflector mode
Modo lineal
delayed
extraction
R=1,100
10600
10800
Modo reflectrón
continuous
extraction
R=125
11000
11200
11400
11600
continuous
extraction
R=650
delayed
extraction
R=11,000
6130
6140
6150
6160
6170
m/z
m/z
muestra: mezcla de ADN (36-mer)
muestra: mezcla de ADN (20-mer)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
31
Analizadores
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
Características generales:
Límite de m/z: ilimitada
API
Resolución: relativa s/lineal o reflectrón (10000)
Se puede acoplar a otros analizadores (TOF, Q, LT, BE) y a
pocas fuentes de ionización (MALDI)
Lím. detección: 1-10 pg
Velocidad de scaneo: muy rápida (> 106 u/s)
Más difícil realizar EM/EM sin otros analizadores
Símbolo
Requerimiento de vacío: 10-7 torr (mín)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
Reflectrón
Lineal
32
Analizadores
Espectrometría de masa tándem con un
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
PSD (post-source decay)
¨Prompt fragmentation¨ : indistinguible en tiempo y espacio del evento de la
ionización.
Fragmentación metaestable (cuando ocurre en la zona de aceleración es
perjudicial)
Fragmentación post-fuente (Post-source fragmentation)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
33
Analizadores
Espectrometría de masa tándem con un
Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)
TOF-TOF
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
34
Tandem
Híbridos
Q-TOF
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
35
Tandem
Híbridos
Q-TOF
Removeable
Sample cone
Extraction
cone
Z-Spray
Ion source
Transfer
optics
Quadrupole
(resolving)
Hexapole
(collision cell)
Reflectron
Waters-Micromass
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
¨modo V¨
36
Tandem
Híbridos
Q-TOF
Waters-Micromass
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
¨modo W¨
37
Tandem
Híbridos
Ions in
P
u
s
h
e
r
Q-TOF
V2
V1
V1 > V2
“W” Mirror
MCP
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
38
Tandem
Híbridos
Q-TOF
peptideo HR
argentina2 69 (3.182) M3 [Ev-130948,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Cm (60:77)
1206.733
100
TOF MS ES+
3.47e4
Espectro ESI de una mezcla de péptidos
%
2003.204
2017.231
1914.172
1220.740
1286.338
1387.857
1300
1400
2031.243
1900.182
0
mass
1200
1500
1600
1700
1800
1900
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
2000
2100
39
Tandem
Híbridos
Q-TOF
peptideo CID950
argentina5 MaxEnt 3 7 [Ev-82828,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp)
1: TOF MSMS 950.00ES+
1588.97
100
Espectro ESI MS/MS del ion m/z 1900
1503.92
1602.99
%
1517.93
1178.73
1192.75
411.26
527.33
541.34
312.21326.21
213.13 298.19
0
72.08 85.09
100
793.48
810.51
652.40
442.27
524.31
779.47
542.28
1900.16(M+H) +
1062.66
878.54
977.60 1048.65
1107.69
1404.85
1617.00
1291.78
1801.10
1907.04
M/z
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
1500
1600
1700
1800
1900
40
Tandem
MS/MS en un TOF
TOF - Modo reflectrón (ReTOF)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
41
Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source
Decay (PSD)
[M+H]+
100
75
50
25
80
Iones PSD
de masas
bajas
85
90
95
t/m
100 105 110 115
Iones PSD
de masas
altas
Ion molecular
Precursor
Detector
DE
MALDI
target
Ion gate
U1
Uacc Up
U2
Región libre de campo
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
42
Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
Selección de precursor (¨Ion gating¨)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
43
Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
(mpH)+
(mpH) v = (m1H) v + m2 v
E0 = 0.5 (mpH) v2
E 1 = E0
(m1H)+ + m2
J
en modo lineal llegan a igual tiempo
v2 = 2 E0 / (mpH)
m1H / mpH
E1 = 0.5 (m1H) v2
en modo reflectrón se diferencia
mpH+ de sus fragmentos
Inconveniente: no se enfocan convenientemente
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
44
Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
Espejo PSD R = 1.00
___ MH+ (PM 1000) enfocado
---- AH+ (PM 700) no enfocado
..... BH+ (PM 300) no enfocado
Espejo PSD R = 0.7
___ MH+ (PM 1000) no enfocado
---- AH+ (PM 700) enfocado
..... BH+ (PM 300) no enfocado
Espejo PSD R = 0.3
___ MH+ (PM 1000) no enfocado
---- AH+ (PM 700) no enfocado
..... BH+ (PM 300) enfocado
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
45
Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay
(PSD)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
46
Tandem
MS/MS en un TOF
Post-Source Decay (PSD)
Reflectrón de campo curvo: permite obtener el espectro completo de
fragmentos
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
47
Tandem
MS/MS en un TOF
PSD
14000 P
G
R
F
PF
S
R
b8886.5
Bradykinin, MW 903.47
12000
Sequence: NH2-PRGFSPFR-COOH
10000
Counts
8000
y7
807.5
402.2
P
y3
70.2
b5
748.3
486.2
371.1 419.3
6000
R
302.1
y1
112.2155.1
175.2
4000
2000
F
120.3
b1
b2
195.1
y6
b4
b3
399.2
252.2
y2
710.4
y4
468.2
506.3
332.2
790.3
b7
y5
730.4
653.2
98.1
0
100
200
300
500 y Naturales
600
Facultad de400
Ciencias Exactas
UBA
Mass (m/z)
700
800
90048
Bibliografía
-Time-of-Flight Mass Spectrometry. Instrumentation and Applications in
Biological Research. R. J. Cotter. 1996. ACS
- Time-of-Flight Mass Spectrometry and its Applications. Ed. E. W. Schlag.
1994. Elsevier
- Mass Spectrometry. Principles and Applications. De Hoffmann, E.,
Charette, J. y Stroobant, V. 1996. John Wiley & sons Ltd.
- Mass Spectrometry. J. H. Gross. 2004. Springer
- Practical Organic Mass Spectrometry. Chapman J. R. 1993. John Wiley
& sons Ltd
- Manuales Voyager y Kompact MALDI IV
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
UBA
49