Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico
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57 Mara Elisa Daltabuit Test 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 3 TESIS DOCTORALES o N. 57 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN CALOSTRAL Y HORIZONTAL DEL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV) EN OVINO Memoria presentada por la Licenciada en Veterinaria Doña Mara Elisa Daltabuit Test para obtar al grado de Doctor en Veterinaria NEKAZARITZA, ARRANTZA ETA ELIKADURA SAILA DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACIÓN Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Vitoria-Gasteiz, 2006 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 4 DALTABUIT TEST, Mara Elisa Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico y molecular para el estudio de la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino / memoria presentada por Mara Elisa Daltabuit Test para optar al grado de Doctor en Veterinaria. – 1a ed. – Vitoria-Gasteiz : Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia = Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2006 p. ; cm. – (Tesis doctorales ; 57) Tesis-Universidad de Zaragoza ISBN 84-457-2399-5 1. Maedi-Visna, Enfermedad del-Tesis doctorales. I. Euskadi. Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación. II. Título III. Serie 619:616.98:578.82/.83(043) Edición: 1.a Febrero 2006 © Administración de la Comunidad Autónoma del País Vasco Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación Internet: www.euskadi.net Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Donostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz Fotocomposición: Composiciones RALI, S. A. Particular de Costa, 8-10, 7.a - 48010 Bilbao Impresión: Lankopi, S. A. Colón de Larreategui, 16 - 48001 Bilbao ISBN: 84-457-2399-5 D.L.: BI-471-06 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 5 El Dr. Eduardo Berriatua Fernández de Larrea, investigador del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER). Hace Constar: Que el trabajo titulado: “Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico y molecular para el estudio de la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino” presentado por Dña. Mara Elisa Daltabuit Test, ha sido realizado bajo su dirección y cumple con los requisitos exigidos para optar al título de Doctor en Veterinaria. Derio a 22 de Febrero de 2005 Fdo. Dr. Eduardo Berriatua Fernández de Larrea 5 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 7 La realización de este trabajo, ha sido posible gracias a la financiación recibida de los proyectos “MAEDI CONTROL” SED2003011 del Departamento de Agricultura y Pesca del Gobierno Vasco, RTA01-107-C3-3 del Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA) de España y al CRAFT PROJECT “SRLV-C” QLK2 – CT – 2001 – 70356 del V Programa Marco de la UE. Así mismo la autora de esta memoria ha disfrutado de una ayuda para gastos de estancia del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER). 7 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 9 A mis Papás 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 10 AGRADECIMIENTOS Quiero dar las gracias a mi director de tesis Eduardo Berriatua Fernández de Larrea por la organización y dirección de este trabajo. A Ramón Juste por haberme brindado la oportunidad de desarrollar este trabajo en NEIKER y por estar dispuesto a ayudarme en todo momento. Quiero agradecer especialmente a Vega y Josune por compartir conmigo “el camino de la tesis” y por darme su apoyo, comprensión y ayuda, no les podré agradecer lo suficiente. A Sorkunde, Ana H., Xeider, Esmeralda, Itziar, Julio y David por el enorme apoyo en la recta final de la tesis. De todos ustedes he aprendido algo, muchas gracias. A toda bajo cubierta, Bea, Idoia, Natalia y Mónica por hacer que mis días terminaran siempre con una sonrisa. Al resto de los compañeros NEIKER, por hacer que me sintiera en todo momento como en casa. A Imanol y a Juan Carlos por haber ayudado en la obtención de muestras en las frías mañanas de Enero. Quiero dar las gracias a todos los que se volvieron mis “cuates-NEIKER” han hecho que mi estancia en Bilbao sea inolvidable. A Alfredo por aguantar mis etapas “de buenas” y “de malas” y ser mi apoyo en todo momento. Y finalmente a los cuates-México con quienes pasar tan solo un minuto merece la pena. 10 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 11 ESKER ONAK Eskerrak eman nahi nizkioke nire tesi zuzendari izan den Eduardo Berriatua Fernández De Larreari, lan hau zuzentzeagatik eta gidatzeagatik. Ramon Justeri, NEIKER-en lan hau egiteko aukera eman zidalako eta momentu orotan ni laguntzeko prest egon delako. Eskerrak eman nahi dizkiet, bereziki, Vegari eta Josuneri, tesiaren bide luze honetan eman didaten laguntasunarengatik eta babesarengatik. Ezingo dizuet nahikoa eskertu. Sorkunderi, Ana H.-ri, Xeiderri, Esmeraldari, Itziarri, Juliori eta Davidi ere eskerrik beroenak, tesiaren azkeneko momentuetan eman dizkidaten animoengatik. Zuengandik guztiongandik zerbait ikasi dut, eskerrik asko. Teilatupekoei; Beari, Idoiari, Nataliari eta Monicari. Gainera, egunak irribarre batekin bukatzen lagundu didazue. NEIKER-eko gainontzeko lagunei, bertan egon naizen denbora luze honetan etxean banengo bezala sentiarazteagatik. Imanoili eta Juan Karloseri, Urtarrileko goiz hotzetan laginak jasotzen laguntzeagatik. Eskerrak eman nahi dizkiet, orobat, nire “cuates-Neiker” bihurtu diren guztiei, beraiek bihurtu baitituzte ahaztezin Bilbon pasa ditudan urteak. Alfredori, nire une “onak” eta “txarrak” jasateagatik, eta nire sostengua izan delako momentu guztietan. Eta azkenik, eskerrak nire lagun mexikar guztiei; benetan merezi du zuekin une bakar bat bera ere igarotzeak. 11 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 13 ABREVIATURAS ELISA-i: Ensayo de inmunoabsorción enzimática indirecto. FL: Finish Landrace. G: Guanina. HIS: Hibridación in situ. IDGA: Inmunodifusión en gel de agar. IF: lle de France Ig: Inmunoglobulina. IHQ: Inmunohistoquámica. IL: Interleucuina. IL-1: Interleucina 1. IL-2: Interleucina 2. IL-6: Interleucina 6. IL-8: Interleucina 8. IL-16: Interleucina 16. IN: Integrasa. INRA: Institute Nationale de la Reserche Agricole. LTR: Long Terminal Repeat. LVPR: Lentivirus de los pequeños rumiantes. MA: Matriz. MCP-1: Sustancias quimiotácticas para monocitos. MHC: Complejo mayor de histocompatiblidad. MV: Maedi-Visna. NC: Nucleo cápside. NEIKER: Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario. nm: Nanómetros. NPO: Neumonía progresiva ovina. NSVM: Norwegian School of Veterinary Science. ABC: Advidina estreptoavidina biotina. Ac: Anticuerpo. Acp: Anticuerpos precipitantes. Acpc: Anticuerpos policlonales. Acm: Anticuerpos monoclonales. Acn: Anticuerpos neutralizantes. ADN: Ácido desoxirribonucleico. ADNc: Ácido desoxirribonucleico complementario. AEC: Artritis encefalitis caprina. APO: Adenomatosis pulmonar ovina. ARN: Acido ribonucleico. ARNm: ARN mensajero. ARNt: ARN transferencia. C: Citocina. CA: Cápside. CAPV: Comunidad Autónoma del País Vasco. CE: Células epiteliales. CEM: Células epiteliales mamarias. CFS: Células de fluido sinovial. CSIC-UPNA: Instituto de Agro-biotecnología y Recursos Naturales. CL: Células de leche. CMSC: Células de membrana sinovial de cabra. CS: Células somáticas. DAB: Diaminobenzidina. DO: Densidad óptica. EC: Efecto citopático. ELISA: Ensayo de inmunoabsorción enzimática. ELISA-d: Ensayo de inmunoabsorción enzimática directo. 13 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 14 SNC: Sistema nervioso central. SU: Envoltura externa. TEM: Transmision electron microscope. TM : Glicoproteína de la transmembrana. TNF-?: Factor de necrosis tumoral alpha. TR: Transcriptasa reversa. UniEdi: Universidad de Edimburgo. UniMil: Università Degli Studi di Milano. UniUtr: Universidad de Utrecht. UV: Ultravioleta. VAEC: Virus de la Artritis Encefalitis Caprina. VAIE: Virus de la Anemia Infecciosa Equina. VIB: Virus de la Inmunodeficiencia Bovina. VIF: Virus de la Inmunodeficiencia Felina. VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana. VMV: Virus Maedi-Visna. VNPO: Virus de la Neumonía Progresiva Ovina. VIS: Virus de la Inmunodeficiencia de los Simios. WB: Western Blot. OIE: Organización Internacional de Epizootias. ORF: Open Reading Frames. pb: Pares de bases. PBS: Solución de fosfato salino. PBMC: Células mononucleares de sangre periférica. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. PCR-n: Reacción en cadena de la polimerasa nested. PCR-sn: Reacción en cadena de la polimerasa semi-nested. PCO: Plexo coroideo ovino. PRu: Pequeños rumiantes. PP: Polipurinas. PR: Proteasa. PRPsc: PRP-Scrapie. Q-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. RTM: Proteína transmembranal recombinante. SDS: Dodecil sulfato sódico. SEM: Scanning electron microscope. SFB: Suero fetal bovino. SFO: Suero fetal ovino. 14 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 15 ÍNDICE 1. RESUMEN / LABURPENA / SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1. Agente etiológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1. Morfología de la partícula viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2. Ciclo de replicación viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2.1. Entrada del virus en la célula hospedadora . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2.2. Transcripción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2.3. Integración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2.4. Expresión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2.5. Síntesis, Ensamblaje y Maduración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.3. Implicaciones de la replicación viral en la variabilidad de los LVPR . . . 2.1.4. Tropismo viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Respuesta inmune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1. Respuesta inmune humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2. Respuesta inmune celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3. Inmunidad pasiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3.1. Inmunidad en el neonato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3.1.1. Sistema inmune neonatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. Cuadro clínico y lesiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1. Forma pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2. Forma nerviosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.3. Forma mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.4. Forma articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. Diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1. Diagnóstico de la enfermedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.1. Diagnóstico Clínico- Lesional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.1.1. Forma Pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.1.2. Forma Mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.1.3. Forma Nerviosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.1.4. Forma Articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.2. Diagnóstico Diferencial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.2.1. Forma Pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.2.2. Forma Mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.2.3. Forma Nerviosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1.2.4. Forma Articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 33 34 35 35 36 36 36 37 38 38 39 39 40 41 41 41 42 42 43 44 44 45 45 45 45 45 45 45 46 46 47 47 49 15 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 16 2.4.2. Diagnóstico de la infección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.1. Diagnóstico Viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.1.1. Aislamiento Viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.1.2. Microscopía Electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.1.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) . . . . . . 2.4.2.1.4. Reacción en cadena de la Polimerasa- Cuantitativa (Q-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.2. Diagnóstico Inmunológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.2.1. Inmunodifusión en gel de agar (IDGA) . . . . . . . . . . 2.4.2.2.2. Ensayo de Inmunoabsorbancia Enzimática (ELISA) 2.4.2.2.3. Inmunohistoquímica (IHQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.2.4. Hibridación in Situ (HIS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.2.5. Inmunoelectrotransferencia (WESTERN BLOT) . . 2.5. Epidemiología y control del VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.1. Aspectos históricos y distribución geográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.2. Modos de transmisión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.2.1. Transmisión Aerógena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.2.2. Transmisión Lactógena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.2.3. Transmisión Intrauterina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.3. Otras vías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.3.1. Iatrogénica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.4. Factores de riesgo de la infección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.5. Prevención y control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 55 55 55 57 58 58 59 59 60 60 60 61 62 62 62 63 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA Y ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS PCRS DE LVPR MÁS EMPLEADAS EN EUROPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1. Abordaje experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2. Obtención del banco de muestras de sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.3. Obtención de suero y realización del ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.4. Obtención de células blancas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.5. Obtención de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.6. Concentración y pureza de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.7. Secuenciación de aislados de LVPR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.8. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9. Ensayos PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9.1. Estrategias de comparación de ensayos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9.2. Tipos de ensayo de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9.3. Condiciones y formato de reacción de PCR . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1. Banco de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 69 70 70 71 72 73 73 74 74 74 75 75 75 75 77 77 16 49 49 49 50 51 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 17 3.3.2. 3.3.3. 3.3.4. 3.3.5. 3.3.6. Secuenciación de ADN y diseño de cebadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ensayos de LTR-PCR en las muestras europeas intercambiadas . . . . . . Ensayos de PCR con el “kit-1” en las muestras locales . . . . . . . . . . . . . Ensayos de PCR con el “kit-2” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Comparación de LTR-PCR (Derio) y POL-PCR (Pamplona) . . . . . . . . . 3.3.6.1. Porcentaje de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA positivos . . . . . . 3.3.7. Grado de concordancia entre las técnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.8. Variabilidad genética en los cebadores del proyecto Craft . . . . . . . . . . . 3.3.8.1. Cebadores Gin5-F y Gin3-R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.8.2. Cebadores Craft F y Craft R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.8.3. Cebadores OsloF y OsloR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.8.4. Cebadores POL F y POL R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.8.5. Cebadores LTR F y LTR R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 79 79 80 81 81 82 83 83 84 85 86 86 87 4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS SEROPOSITIVAS Y LA RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR VMV EN CORDEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 4.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.2.1. Abordaje experimental y población de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.2.2. Obtención de muestras, análisis de AC por ELISA y detección de provirus MV mediante LTR-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 4.2.3. Obtención de CS y componentes no celulares de calostro . . . . . . . . . . . 94 4.2.4. Obtención de ARN del sobrenadante de calostro . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 4.2.5. Tratamiento con DNAsas en las muestras de ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 4.2.6. Concentración y pureza del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 4.2.7. Diseño de la GAG-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 4.2.8. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 4.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 4.3.1. Cebadores y condiciones de reacción de la GAG-PCR . . . . . . . . . . . . . . 97 4.3.2. Porcentaje de ensayos de PCR y ELISA positivos . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 4.3.3. Comparación de técnicas de diagnóstico en calostro y sangre . . . . . . . . 99 4.3.4. Seroprevalencia en corderos criados con calostro VMV-Seropositivo según el estado de VMV-PCR del calostro y el modo de ingestión del calostro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 4.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTAL POR VMV EN OVINO LATXO ADULTO CRIADO BAJO DISTINTAS PRESIONES DE INFECCIÓN A VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 5.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 17 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 18 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 5.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.1. Diseño experimental y población de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2. Obtención de muestras y ensayos de PCR y ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.1. Porcentaje de ovejas ELISA y PCR positivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2. Incidencia acumulada de seroconversión según la edad y el estado de PCR durante el primer año de vida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.3. Relación entre resultados de ELISA y PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 106 106 106 107 107 108 108 109 6. CONCLUSIONES FINALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 7. APÉNDICE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 8. ANEXOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 18 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 19 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2.1. Figura 2.2. Figura 2.3. Figura 2.4. Figura 2.5. Figura 3.1. Familia Retroviridae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ubicación de los genes de los Retrovirus de los pequeños rumiantes . . . . Estructura de la LTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Replicación Retroviral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Patogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ubicación geográfica de los rebaños seleccionados (1,3 y 11 Arkaute, 2 y15 Markina-Xemein, 4 Antzuola, 5 Zestoa, 6 Legazpia, 7 Oñati, 8 y 9 Beizama, 10 Muskiz, 12 Derio, 13 Tolosa, 14 Gaintza) . . . . . . . . . . . . . . Figura 3.2. Esquema de los pasos a seguir en el ELISA Indirecto ELITEST . . . . . . . Figura 3.3. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin5-F en el gen gag Figura 3.4. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin3-R en el gen gag Figura 3.5. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft F en el gen gag Figura 3.6. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft R en el gen gag Figura 3.7. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo F en el gen gag Figura 3.8. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo R en el gen gag Figura 3.9. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL F en el gen pol Figura 3.10. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL R en el gen pol Figura 3.11. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR F en la región LTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 3.12. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR R en la región LTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 4.1. Zona amplificada por los cebadores gag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 4.2. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag F en el gen gag Figura 4.3. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag R en el gen gag Figura 5.1. Porcentaje de ovinos ELISA y LTR-PCR positivos según la edad en grupos de animales criados en condiciones de baja (grupo L) y alta (grupo H) presión de infección a VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 5.2. Incidencia acumulativa de ovinos ELISA-seropositivos según la edad en grupos de animales criados en condiciones de baja (grupo L) y alta (grupo H) presión de infección a VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 5.3. Porcentaje y coeficiente de concordancia, kappa, de las técnicas de diagnóstico de anticuerpos frente a VMV ELISA y de provirus VMV LTR-PCR según la edad de los ovinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 34 35 37 37 39 71 73 84 84 84 85 85 85 86 86 86 87 96 97 97 107 108 109 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 21 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 2.1. Tabla 3.1. Clasificación Viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Pruebas de PCR desarrolladas para el diagnóstico de SRLV entre 1992 y 2001 disponibles en la literatura científica internacional . . . . . . . . . . . . . . 70 Tabla 3.2. Rebaños ovinos y caprinos seleccionados para crear un banco de muestras 72 Tabla 3.3. Cebadores empleados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 Tabla 3.4. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y temperaturas de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Tabla 3.5. Resultados de ELISA y PCR para la selección de muestras a enviar a la Universidad de Utrecht e INRA de Lyon para secuenciación yestudio de variabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Tabla 3.6. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios del proyecto empleando las PCRs en el “Kit-1” con muestras locales . . . . . . . 79 Tabla 3.7. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios del proyecto empleando las PCRs en el “Kit-2” con muestras locales . . . . . . . 81 Tabla 3.8. Proporción de positivos a las técnicas LTR-PCR, POL-PCR y ELISA en muestras de corderos del rebaño experimental Arkaute tomadas entre el nacimiento y los 300 días de edad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 Tabla 3.9. Resultados discordantes y kappa entre los ensayos de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 Tabla 3.10. Resultados entre los ensayos LTR y ELISA a los 300 días . . . . . . . . . . . . . 83 Tabla 4.1. Cebadores empleados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Tabla 4.2. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y temperaturas de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 Tabla 4.3. Porcentaje de PCR-positivos en muestras de calostro y sangre de ovejas tomadas el día del parto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Tabla 4.4. Porcentaje de ELISA-positivos en muestras de calostro y sangre de oveja tomadas el día del parto y en muestras de sangre tomadas un mes antes del parto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Tabla 4.5. Resultados discordantes, concordantes y coeficiente kappa entre parejas de técnicas de diagnóstico PCR y ELISA de VMV en muestras de calostro y sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 Tabla 4.6. Porcentaje de corderos ELISA-positivos a los 300 días de edad en función del estado de PCR del calostro, el modo de ingestión del calostro y el volumen de calostro ingerido mediante biberón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 21 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 23 1. RESUMEN LABURPENA SUMMARY 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 25 1. RESUMEN En esta tesis se investigan aspectos del diagnóstico, epidemiología y control de la infección por el VMV en ovino. Se realizaron estudios para (i) comparar la validez diagnóstica de hasta siete ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de VMV integrado en células (provirus) y libre, (ii) investigar la presencia de VMV en calostro de ovejas seropositivas y su relación con la infección en corderos y (iii) estudiar la transmisión horizontal del VMV en ovino adulto sometido a distintos grados de presión de infección de VMV. Parte del estudio comparativo de las PCRs se llevó a cabo en el seno de un proyecto del V Programa Marco de la Dirección General de Investigación de la Comisión Europea dirigido a la elaboración de un ensayo de PCR para la detección de LVPR de espectro paneuropeo. Se realizó un análisis de sensibilidad y especificidad diagnóstica con cinco ensayos de los laboratorios de lentivirus ovinos de las Universidades de Lyon (Francia), Utrecht (Holanda), Oslo (Noruega), en el Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales, CSIC-UPNA de Pamplona y en el Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER) de Derio. Con todos los ensayos fue posible detectar LVPR de origen ovino y caprino y en general la especificidad de las técnicas fue buena. Sin embargo, la sensibilidad de los ensayos varió considerablemente dependiendo del ensayo, el origen de las muestras y el laboratorio donde se realizó el ensayo. Globalmente, la PCR desarrollada en Derio para amplificar secuencias de la región “long terminal repeats” (LTR) mostró una sensibilidad comparativamente más alta que el resto de PCRs en ADN de muestras de sangre de ovinos de Europa. Para investigar la infección por VMV asociada al consumo de calostro se analizó la presencia de anticuerpos frente a VMV y de VMV integrado y libre en calostro de ovejas seropositivas y la seropositividad a los 300 días de edad en corderos que consumieron este calostro durante las primeras 24 horas de vida. Se identificó VMV en calostro empleando la LTR-PCR y se diseñó una nueva PCR para detectar secuencias del gen gag (Gag-PCR) del VMV. La Gag-PCR permitió detectar provirus y VMV libre no asociado a células somáticas (CS) mediante un protocolo de purificación de ARN viral, retrotrasncripción y amplificación de ADNc viral. Se observó una buena correlación entre las PCRs indicando que en calostro la presencia de provirus va asociada a la presencia de virus libre y el porcentaje de calostros seropositivos fue superior al de calostros PCR-positivos. La probabilidad de ser seropositivo a los 300 días de edad se asoció independientemente a la presencia de virus en calostro, al modo en que se tomó el calostro, con biberón o mamado de la oveja y al volumen de calostro ingerido. Los corderos que tomaron con biberón el calostro ovino tuvieron más riesgo de infección que los que lo tomaron de la madre y las posibles causas de esto se discuten en detalle. El riesgo de infección fue también mayor al aumentar la cantidad de calostro PCR-positivo ingerido excepto en los que tomaron un volumen de calostro superior a la mediana, en los que el riesgo fue independiente del estado de PCR del calostro. Estos resultados indican que la cantidad de virus en calostro de oveja seropositiva varía substancialmente según los individuos y que probablemente la mayoría de los calostros seropositivos tienen VMV. Sin embargo cuando la cantidad de VMV presente es baja, sólo se infectan los corderos que consu25 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 26 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... men un volumen alto de calostro. A efectos prácticos de control de VMV estaría justificado el empleo de la PCR para identificar calostros de riesgo de infección cuando no fuese posible conseguir alternativas de calostro ovino no infectado o destruir el VMV calentando el calostro a 56°C antes de administrarlo. Al final del estudio anterior, las corderas pasaron a formar parte del rebaño experimental infectado de VMV de ovejas de raza Latxa en ordeño de NEIKER y se mantuvo un grupo de machos castrados en un edificio separado para estudiar la transmisión horizontal en cada grupo mediante ELISA y LTR-PCR. En dos años la prevalencia de infección ascendió del 16% al 60% en el grupo de hembras de reposición y del 14% al 18% en el grupo de machos. Además la mayoría de las hembras se infectaron en los primeros 6 meses después de entrar en el rebaño de ordeño. Por un lado, los hallazgos realizados en las hembras refuerzan el conocido riesgo de transmisión horizontal de VMV en rebaños lecheros latxos y demuestran que la probabilidad de infección con VMV no aumenta con la edad como se observa cuando se emplea la técnica serológica IDGA, menos sensible que el ELISA. Por otro lado, la casi nula incidencia de VMV entre los machos demuestra que en determinadas condiciones, la estabulación de ovinos infectados y libres de VMV no implica necesariamente un contagio horizontal significativo. Nuevos estudios para identificar los factores de riesgo de la excreción y transmisión de VMV en el rebaño serán de gran utilidad para entender mejor la epidemiología del VMV y diseñar estrategias más precisas de control de la infección por VMV. 26 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 27 1. RESUMEN, LABURPENA, SUMMARY LABURPENA Tesi honetan Maedi-Visna birusak (MVB) ardietan eragindako infekzioaren diagnostikoa eta esparru epidemiologikoa ikertu da. Horretarako, zeluletan barneratutako (probirusa) eta libre dagoen MVB detektatzeko asmotan, Polimerasaren erreakzio kateatu (PCR) teknika desberdinak parekatu dira; ardi seropositiboen oritzetako birusaren presentzia aztertu eta honen erlazioa arkumeen infekzioan ikuskatu da eta gradu desberdineko infekziodun ardi helduen transmisio horizontala ikertu da. Espektro europearra duen hausnarkari txikien lentibirus detekziorako PCR baten diseinuaren helburuarekin zuzenduriko “V Programa Marco de la Dirección General de Investigación de la comisión Europea” delako proiektuan barneratua izan da PCR desberdinen parekapen azterketa. PCR desberdinen espezifikotasuna eta sentsibilitatea zehazteko Lyon-go (Frantzia), Ultrecht-eko (Herbeherak) eta Oslo-ko (Norvegia) Unibertsitateetako ardi lentibirusak ikertzen dituzten laborategiek, Iruñeako Agrobioteknologia eta baliagai naturalen institutuak (CSIC-UPNA) eta Derioko Nekazal ikerketa eta garapenerako euskal erakundeak (Neiker) parte hartu dute. Laborategi desberdinetan, ardi eta ahuntz jatorrietako lentibirusak detektatzea ahalbideratu da eta orokorrean tekniken espezifikotasuna ona izan da. Bestalde, sentsibilitateari dagokionez, entsaiu, laginen jatorria eta entsaiua burututako laborategi aldagaiak kontutan hartuta, hau ainitz aldatzen dela ikusi da. Orokorrean Derion garatutako “Long terminal repeats” (LTR) eskualdea anplifikatzeko PCR-ak inork baino sentsibilitate handiagoa erakutsi du Europako ardi odol laginetan. Oritz kontsumoarekin erlazionaturiko infekzioa aztertzeko; a)MVB-ren aurkako antigorputzen presentzia, b)probirus gisa edo birus librearen agerpena ardi seropositiboen oritzetan eta d)bizitzako lehen 24 ordutan oritz hau dastatutako arkumeen seropositibitatea 300 egunetara ikuskatu da. PCR-LTR teknika erabiliz, MVB-ren presentzia oritzean detektatua izan da eta bide batez, Gag-PCR genearen sekuentzia detektatzeko PCR berri bat diseinatua izan da. Azken PCR honen bidez eta birusaren RNA-ren purifikazio, retrotranskripzio eta DNA osagarriaren anplifikazioaren bitartez, MVB librea detektatzea ahalbideratu da. PCR desberdinen arteko korrelazio egokia ikusi da, oritzean ageri den probirusa, birus librearen agerpenarekin erlazionatuta dagoela gaineratuz eta oritz seropositiboen portzentaia, PCR positiboak diren oritzen portzentaia baino handiagoa izan delarik. 300 eguneko adinarekin seropositiboa izateko probabilitatea oritzeko birusaren agerpenarekin, oritza hartutako moduarekin (biberoiarekin edo zuzenean ardi-dititik hartuta) eta edandako oritz bolumenarekin independienteki erlazionatua izan da estatistikoki. Honela, infekzio arriskua latzagoa izan dela biberoia hartu duten animalietan eta oritz kantitate gehiago hartu dutenetan ikusi da. Medianari dagokion bolumena baino gehiago hartutako animalietan berriz, infezio-arriskua oritzaren PCR emaitzarekiko independientea izan da. Emaitza hauekin, ardiaren arabera birusaren presentzia oritzean asko aldatzen dela, oritz seropositibo gehienak birusa dutela baina birusaren agerpena eskasa denean oritz bolumen handia dastatzen duten arkumeak soilik infektatzen direla ondorioztatzen da. MVB-ren kontrola bideratuz, PCR-aren erabilera infekzio arriskua duten oritzen detekziorako egokia litzateke oritz ez infektatua erabili edo MVB oritza 56°C-tara berotuz hil ezin izanez gero. 27 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 28 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... ELISA eta LTR-PCR-az transmisio horizontala ikertzeko, aipaturiko entsaiua amaituz, arkume emeak Neikerrek MVB-az infektaturik duen latxa-ardien artalde esperimentalera pasa eta zikiratutako ar talde bat beste gune batetan mantendu dira. Bi urteren buruan infekzioaren prebalentzia %16-tik %60-ra igo da emeen kasuan eta %14-tik %18-ra arren kasuan, eme gehienak lehen sei hilabeteko epean infektatuak izan direla gaineratuz. Alde batetik, emeetan ikerturikoak, birusaren transmisio horizontalak latxa-esne artaldeetan duen garrantzia aldarrikatu du eta adinarekin infekzioaren probabilitatea ez dela handitzen agarrezko geletan egindako inmunodifusio teknika diagnostikoak (ELISA baino sentsibilitate gutxiagoko teknika) babesten duen bezela ondorioztatzen da. Bestalde, arretan birusaren agerpen ia ezak, infektaturiko eta animalia osasuntsuak batera ikuiluratzeak transmisio horizontalaren kutsapena ondorioztatzen ez duela kasu guztietan sustatzen du. MVB-ren epidemiologia eta honen kontrola hobe bideratzeko, birusaren iraizketa eta transmisioan eragiten duten faktoreen ikerketa ezinbestekotzat ikusten da. 28 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 29 1. RESUMEN, LABURPENA, SUMMARY SUMMARY This thesis investigates diagnostic and epidemiologic aspects of maedi visna virus (MVV) infection in sheep. Studies were carried out to (i) compare diagnostic validity of seven different polymerase chain reaction (PCR) tests for the detection of proviral and free MVV, (ii) study the presence of MVV in calostrum of seropositive ewes and its relationship with infection in lambs and (iii) study horizontal transmission of MVV in adult sheep subjected to varying MVV-infection pressure. The comparative PCR studies were part of a European project (CRAFT) whos main objective was to design a PCR assay to detect small ruminant lentiviruses (SRLV) across Europe. A sensibility and specificity study was performed in five PCR assays developed and used by the Universities of Lyon (France), Utrecht (Holland), and Oslo (Norway), the Agrobiotecnology and Natural Resources Institute (CISIC-UPNA) (Pamplona-Spain) and the Basque Institute for Agricultural Research and Development NEIKER-Derio (VizcayaSpain). It was possible to detect ovine and caprine SRLVs with all the assays and overall the specificity of the tests was very good. Yet, the sensibility varied considerably between assays, according to the origin of the samples, the animal species and the laboratory that carried out the test. The most sensitive test in ovine samples was the one developed in NEIKER that amplifies a DNA fragment in the long terminal repeats (LTR) region of proviral SRLV. To study the MVV-infection in lambs associated to the consumption of colostrum, the presence of anti-MVV antibodies and cell-integrated and cell-free MVV was investigated in colostrum of seropositive sheep and an analysis was carried out to investigate the relationship between consumption of MVV-containing colostrum in the first 24 hours of life and seropositivity at 300 days-old. Proviral MVV was identified in colostrum somatic cells (SC) using the LTR-PCR assay and a new PCR targeting sequences in the gag gene of MVV. This Gag-PCR also allowed detecting cell-free MVV in colostrum following a protocol of viral RNA purification, retrotranscription and amplification of complementary DNA. There was a good positive correlation between PCRs indicating that in colostrum the presence of provirus is associated to the presence of cell-free virus and the number of antibody-positive (seropositive) colostrum samples was higher than the number of PCR-positive colostrum samples. The risk of being seropositive at 300 days of age was independently associated with the quantity of virus present in the colostrum, the mode of feeding the colostrum (naturally suckled or bottle-feed) and the volume of colostrum ingested. Lambs that consumed colostrum by bottle had a higher risk of infection than those that naturally suckled colostrum form their dams and the possible reasons for this are discussed. The risk of infection increased with increasing PCR-positive colostrum volume except in lambs that consumed more colostrum than the median, in which case the risk was independent of the PCR result of the colostrum. These results indicate that the quantity of virus in colostrum of seropositive ewes varies substantially between individuals and that probably the majority of seropositive colostrums contain MVV. However, when the viral concentration in colostrum is low and not detectable by PCR, only lambs 29 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 30 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... that consume a high volume become infected. From a practical MVV-control point of view, it would be justified to use the PCR to identify MVV-containg colostrum when not possible to obtain alternative MVV-free colostrum or inactivate MVV by heating the colostrum to 56°C before feeding it. When the previous experiment ended, horizontal MVV-infection was investigated in some of these lambs including a group of ewe-lambs that joined NEIKER’s experimental MVV-infected, housed, Latxa dairy-flock as replacemente ewes and a group of castrated rams maintained in a separate building with no other sheep, using ELISA and LTR-PCR. In a twoyear period the prevalence of infection raised from 16% to 60% in the group of the replacement ewes while in the group of the castrated rams the prevalence went from 14% to 18%. Moreover, the majority of ewes became infected in the first 6 months after entering the dairy flock. The findings in the ewes reinforce the well-known risk of horizontal MVV-transmission in housed latxa sheep and demonstrates that the risk of MVV-infection does not increase with age as shown when MVV-infection was investigated using the AGID serological technique that is less sensitive than ELISA. On the other hand the almost null incidence of MVVinfection among the rams demonstrates that in certain conditions, housing infected and noninfected ovines does not necessarily result in significant horizontal infection. New studies to identify risk factors for MVV-excretion and -transmission in infected flocks will allow a better understanding of the epidemiology of MVV and the design of more precise MVV-control strategies. 30 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 31 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 33 2.1. AGENTE ETIOLÓGICO El virus Maedi-Visna (VMV) forma parte de la familia Retroviridae, género lentivirus y subgénero lentivirus de los pequeños rumiantes (LVPR) [155] (Tabla 2.1). Tabla 2.1. Clasificación Viral Familia Género Retroviridae Alpharetrovirus Betaretrovirus Gammaretrovirus Deltaretrovirus Epsilonretrovirus Lentivirus Subgénero Especies Lentivirus Bovino Virus de la inmunodeficiencia Bovina Virus de la enfermedad de Jembrana Lentivirus Equino Anemia infecciosa Equina Lentivirus Felino Virus de la inmunodeficiencia Felina Lentivirus del Puma 14 Lentivirus de Pantera LentivirusOvino/Caprino Virus de la Artritis Encefalitis Caprina (VAEC) Lentivurs caprino Brasileño Lentivirus caprino Virus Visna Virus Maedi-Visna (VMV) Virus Maedi-Visna EV-1 Virus Maedi-Visna SA-OMVV Lentivirus Ovino Lentivirus de los pequeños rumiantes (SRLV) Lentivirus de Primates Virus de la inmunodeficiencia humana Retrovirus del Simio SRV-2 Virus de la inmunodeficiencia del Simio-Humano Spumavirus Retrovirus Tipo D PUBMED. Taxonomía Los virus ARN en general y en particular los lentivirus son virus muy variables ya que su ARN Polimerasa tiene un alto porcentaje de error y no presentan un corrector de error [165]. Las distintas cepas de Maedi-Visna (MV) y Artritis Encefalitis Caprina (AEC), se han englobado y denominado “lentivirus de los pequeños rumiantes” (LVPR) (Figura 2.1) 33 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 34 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... VIH-2 I VIS smm II VIS syk VIH-1 III VIS cpz R e t r o v i r i d a e VIS agm IV VIS mnd V VMV VAEC VAIE VIB VIF Fields Virology 1996 Figura 2.1. Familia retroviridae Querat y col. (1984) clasificaron a los LVPR en base a sus propiedades estructurales, genéticas y de replicación en dos tipos. El tipo I o virus con composición de proteínas similares al VMV, tienden a ser altamente citopáticos, causando lisis en cultivos celulares, altamente patogénicos in vivo y además inducen la producción de anticuerpos neutralizantes. El tipo II o virus con composición de proteínas similares al VAEC no producen citolisis, ocasionan infecciones persistentes en cultivos celulares, exhiben baja patogenicidad en animales infectados y no inducen la formación de anticuerpos neutralizantes [178]. 2.1.1. Morfología de la partícula viral Los lentivirus se componen aproximadamente de 60% de proteína, 35% de lípidos, 3% de carbohidratos y 1% de ARN [173]. Los viriones son envueltos, con un diámetro de 80-130 nm. El genoma se encuentra en el interior de la nucleocápside (NC) y presenta transcriptasa inversa (TR). La cápside (CA) se encuentra rodeada por una capa de proteína de matriz (MA). Además, el virión presenta una envoltura externa (SU) compuesta por una bicapa de lípidos que contiene la proteína transmembranal (TM) [43, 155, 173]. El genoma de doble cadena de ARN, contiene tres genes estructurales y cada uno codifica para dos o más proteínas: 1. El gen gag (Antígeno Específico de Grupo) codifica 3 proteínas: La CA (p25), la NC (p14) y la MA (p17) que estimula una fuerte respuesta de anticuerpos durante la infección [173, 192]. 2. El gen pol (Polimerasa ) codifica la TR, la enzima dUTPasa, necesaria para la infección en macrófagos [169], la Integrasa (IN) que facilita la integración del provirus en el genoma de la célula [155, 169] y la Proteasa (PR) que es esencial para la infectividad y maduración del VMV [169]. 34 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 35 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3. El gen env (Envoltura), codifica las glicoproteínas, la TM, la SU que contiene los epítopos reconocidos por los anticuerpos neutralizantes y que sirven para la interacción del virus con el receptor de la célula hospedadora [43, 155, 173]. Los LVPR presentan tres genes accesorios: 1. vif (Factor de Infectividad Viral), es el único gen accesorio conservado en el genoma de los LVPR que induce una débil respuesta inmune in vivo. El gen vif se requiere para una eficiente replicación y patogenicidad del virus in vivo [100, 101, 155, 173, 192]. 2. tat, previene la terminación prematura de la transcripción incrementando la expresión génica viral in vivo [112, 155, 173, 192]. 3. rev (Regulador de la expresión de proteínas del Virión) [101]. Codifica una proteína que está involucrada en los empalmes (“splicing”) de los transcriptos de ARN viral. El gen rev es bipartito y se localiza en una pequeña región de la extremidad 5’ del gen env y una región más grande en la región 3’ del mismo gen [46, 155, 173, 192] (Figura 2.2) Figura 2.2. Ubicación de los genes de los Lentivirus de los Pequeños Rumiantes 2.1.2. Ciclo de replicación viral 2.1.2.1. Entrada del virus en la célula hospedadora El virus entra en la célula hospedadora (monocitos/macrófagos y células tipo fibroblásticas) por los mecanismos de fusión o endocitosis mediados por los receptores glicoproteicos de la envoltura viral (gp135, SU) [173], que se unen a los receptores específicos presentes en la superficie de la célula hospedadora. Actualmente se conoce poco acerca del origen de los receptores celulares a los que se unen los LVPR (VMV y VAEC). En 1991 Dalziel y col. propusieron que el receptor prove35 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 36 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... nía del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase II [63]. Crane y col. (1991) presentaron dos proteínas de 15 y 45 kDa, que se identificaron como proteínas asociadas a membrana pero que no pertenecían al CMH [49]. Lyall y col. (2000) describen el receptor como un componente proteínico presente en la superficie celular [149]. Sin embargo, varios autores defienden que el VAEC y el VMV utilizan receptores celulares diferentes [31, 105, 111] (Figura 2.4). 2.1.2.2. Transcripción En el momento en que el virus penetra en el citoplasma de la célula hospedadora y se libera de su envoltura, comienza la retrotranscripción del ARN viral a una doble cadena de ADN que permanece dentro de la nucleocápside. La transcripción es modulada por la unión de ciertas proteínas reguladoras como tat y rev. En la región U5 hay un sitio de unión inicial con una secuencia complementaria a la secuencia 3’ del ARNt. Estos sitios marcan el comienzo de la síntesis de la cadena negativa de ADN viral, que servirá de molde para la síntesis posterior de la cadena complementaria de ADN. La síntesis de la cadena negativa de ADN viral se inicia en dos secuencias ricas en purinas, también llamadas Polipurinas (PP) [173, 192] (Figura 2.4). 2.1.2.3. Integración Al finalizar la síntesis de la doble cadena de ADN, éste es transportado por las proteínas de la nucleocápside al núcleo de la célula. Este ADN lineal es integrado en el ADN del hospedador con ayuda de la integrasa viral. Una vez integrado en monocitos la replicación del virus no comenzará hasta que los monocitos maduren a macrófagos [157] (Figura 2.4). 2.1.2.4. Expresión La expresión del ADN viral se produce en dos pasos (i) la transcripción de ADN en ARN y (ii) la traducción y síntesis proteínica. La transcripción del ADN a ARN se produce cuando la caja TATA es reconocida por la Polimerasa II del ARN celular [173]. La extremidad 5’ del ARN viral comienza con una región llamada R seguida por una secuencia única llamada U5, mientras que en la extremidad 3’ hay una única secuencia U3 seguida por una región R. Esta región contiene la señal y el sitio de unión de una Poli-A final, característica del ARNm de las células eucariotas. De esta manera la organización general de la molécula de ARN viral es R-U5-gag-pol-env-U3-RAAAA.... [119, 192]. Al finalizar este proceso se habrá generado el ARN genómico y el ARNm necesarios para la síntesis del ARN viral y de las proteínas virales [34, 46, 173] (Figura 2.3). 36 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 37 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA U3 R U5 Promotor Región Moduladora Región aumentadora DNA Cromosomal Transcripción Genes Virales Sitio Caja SP-1 TATA Figura 2.3. Estructura de la LTR. 2.1.2.5. Síntesis, Ensamblaje y Maduración La síntesis de las proteínas virales se produce una vez sintetizado el ARN viral y a partir de 2 ARNm distintos: (i) Un ARNm de 35s que codifica para los precursores de las proteínas gag y pol, (ii) Un ARNm de 25s que codifica para el precursor de la proteína env. Cada precursor se sintetiza en dos lugares distintos de la célula huésped. El precursor de la proteína env entra a la cisterna del retículo endoplásmico durante la síntesis y es llevada al complejo de Golgi donde es glicosilada tras lo cual es transportada a la membrana plasmática. El precursor de las proteínas gag y pol se sintetiza en los polirribosomas libres del citoplasma celular, sigue la misma ruta glicosilándose y alcanzando la membrana plasmática. Junto con el ARN viral, los precursores de gag, pol y env comienzan el ensamblaje de la nucleocápside en la parte interna de la membrana plasmática. Posteriormente se da la gemación con la unión de la nucleocápside a proteínas env ya fijadas como peplómeros en la membrana plasmática [155, 173]. Figura 2.4. Replicación Retroviral 37 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 38 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Los precursores proteínicos son lisados post-transcripcionalmente por una proteasa viral obteniendo así proteínas virales maduras [155] (Figura 2.4). 2.1.3. Implicaciones de la replicación viral en la variabilidad de los LVPR Como ya se ha mencionado la replicación de los retrovirus se acompaña por una alta frecuencia de mutaciones puntuales, inserciones y deleciones. Se estima que en cada ciclo de replicación ocurren alrededor de 3x10-5 mutaciones lo cual sugiere que la enzima TR sufre errores frecuentes [155]. Los sitios de mutación no se distribuyen de modo totalmente aleatorio, son menos frecuentes en los genes gag, pol y partes del gen env, mientras que las zonas del gen env que codifican los lugares de unión de los anticuerpos, son altamente variables [155, 173]. Hay también una alta frecuencia de recombinaciones entre genomas de retrovirus en células doblemente infectadas. La recombinación es un evento temprano que ocurre antes de la integración, durante la TR para formar ADN viral. Juntas la frecuencias de mutaciones y recombinaciones en VMV exceden por mucho cualquier otro virus animal [155]. El concepto de “quasi” especies viral fue propuesto por Manfred Eigen y se define como “una población compleja que se perpetúa por sí misma formada por diversas entidades que actúan como un todo”. El factor por lo que los virus ARN en general y los lentivirus en particular existen como quasi-especies es atribuido al hecho de que poseen polimerasas de ARN que tienen intrínsicamente altos porcentajes de errores y un deficiente mecanismo de corrección. El porcentaje de error de la polimerasa del ARN viral es directamente responsable del tamaño e integridad de la quasi especie; un porcentaje de error bajo está asociado con una “quasi” especie que ocupa volúmenes pequeños de espacio secuencial. Por otro lado un porcentaje de error alto resulta en una “quasi” especie que ocupa grandes volúmenes de espacio secuencial [155]. Se sabe que el tipo de virus que infecta originalmente persiste en el animal coexistiendo con las nuevas variantes y que la progresión de la enfermedad no está ligada con la aparición de nuevas variantes. El virus de VAEC presenta considerable variación de cepas [77, 155, 165]. Esta variabilidad no es sólo un instrumento del lentivirus para evadir la respuesta inmune del hospedador y facilitar la persistencia de la infección sino que también podría estar involucrado en la habilidad de estos virus de cruzar la barrera de especie y de mostrar capacidades patogénicas distintas. Este fenómeno tiene obvias implicaciones para el diseño de las pruebas de diagnóstico, desarrollo de vacunas y drogas para el control de la enfermedad [155, 165]. 2.1.4. Tropismo viral Las células blanco del VMV son preferentemente de la línea celular monocito/macrófago [35, 86, 87, 189] y el virus también es capaz de infectar otras células incluidas las células dendríticas y epiteliales. Tanto las células dendríticas como los monocitos son las células 38 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 39 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA encargadas de transportar a los lentivirus por sangre y linfa a los tejidos diana. [93]. Sin embargo, el virus no comienza su replicación hasta el momento en que los monocitos maduran a macrófagos en los tejidos, aprovechando para su replicación los mecanismos de replicación propios de estas células [156]. La ausencia de replicación en sangre y linfa se supone relacionada con la capacidad del virus de eludir en muchos casos una respuesta inmune celular y humoral temprana [35, 87, 168]. Los órganos blancos afectados por los LVPR son los pulmones, glándulas mamarias, articulaciones y sistema nervioso central (SNC) [24, 29, 146, 159]. Por otro lado aunque la infección productiva es en células de la línea monocito/macrófago in vitro los LVPR son capaces de infectar gran variedad de células como se explica en el apartado de diagnóstico por cultivo celular. 2.2. RESPUESTA INMUNE La infección por los LVPR, estimula en el hospedador una respuesta inmune mediada por anticuerpos y células que no es capaz de acabar con la infección y que mantiene a los animales persistentemente infectados. La duración de la infección es larga, de varios años en la mayoría de los casos y se distinguen varias fases cronológicas. Tras la infección existe un periodo largo asintomático en el que la carga viral es baja, seguido de un periodo sintomático relativamente corto antes de producirse la muerte [6, 169]. (Figura 2.5). Seroconversión Síntomas clínicos Latencia Génesis Lesional Muerte Inicio de Lesiones Infección Figura 2.5. Patogenia 2.2.1. Respuesta inmune humoral Los anticuerpos (Ac) presentes en la infección por LVPR son de tipo precipitantes (Acp) y neutralizantes (Acn) [97]. Los primeros Anticuerpos en aparecer ya sea por una infección natural o experimental son los Acp. 39 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 40 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... En estudios experimentales, la detección de estos anticuerpos fue entre las semanas 1 y 8,5 post infección. Los anticuerpos neutralizantes se detectaron más tarde, entre 1 y 5 meses post-infección y son específicos de cepa. [25, 67, 207]. Klein y col. (1985) demuestran que los aislados altamente citolíticos producen una mayor respuesta inmunológica a Acn que las cepas poco citolíticas. [126]. Las razones por las que los Acn son inefectivos para eliminar la enfermedad pueden ser varias. Por un lado la capacidad de mutación del virus que implica la aparición de variantes antigénicas que no reconocen los Acn [169], además la afinidad del virus por los macrófagos es mayor que la afinidad entre el virus y los anticuerpos [122] y algunos epítopos de neutralización podrían ser “secuestrados” por moléculas de carbohidratos y pasar desapercibidos al sistema inmune del hospedador [16, 17]. La respuesta inmune se desarrolla principalmente frente a las proteínas virales p25, gp105, p16 y p14 [118] y la infección por VMV produce Acn restringidos a la subclase IgG1. De este modo Bird y col. (1995) demostraron mediante Western Blot una nula presencia de anticuerpos de la subclase IgG2 tras la infección [21]. Esta deficiencia en IgG2 limitaría la capacidad de opsonización y fagocitosis de las partículas virales [24]. 2.2.2. Respuesta inmune celular La respuesta inmune celular se presenta entre 1 y 4 semanas post infección y vuelve a los niveles basales de 4 a 12 semanas después [95, 133, 207]. En infecciones por VMV, se invierte la relación de linfocitos CD4+/CD8+ aumentando el porcentaje de linfocitos T CD8+, que facilitan el control de la carga viral eliminando células infectadas y produciendo citoquinas inhibidoras [16, 22, 33]. La producción de factores quimiotácticos estimula la migración de linfocitos y neutrófilos a los órganos diana provocando las lesiones características del VMV [6]. La infección por LVPR causa una alteración en la producción de interleucinas y sustancias quimiotácticas para monocitos (MCP-1) [135, 241]. Así, aumenta sobre todo la producción de interleucina 8 (IL-8), que se produce en mayor grado por los macrófagos alveolares de animales infectados, y que es responsable de atraer linfocitos y neutrófilos al tejido infectado provocando por ejemplo la alveolitis característica del MV [32, 138, 169]. Por otro lado, en animales sintomáticos los niveles de interleucina-2 (IL-2) disminuyen y también la expresión de receptores de la IL-2 en linfocitos T CD8+ [20, 35, 74, 139]. Además se ha observado que en infecciones por VAEC se incrementa la expresión de interleucina 16 (IL-16) en los PBMC y en células de membrana sinovial, fluido sinovial, suero y sobrenadante de cultivos de células mononucleares de sangre periférica [200]. Además Craig y col. (1997) observaron un aumento del factor de necrosis tumoral alpha (TNF-α) en infecciones de LVPR cuya función es regular la expresión de otras citoquinas como la interleucina-1 (IL-1) y la interleucina-6 (IL-6), la actividad de los macrófagos y la expresión de moléculas de adhesión de las células endoteliales [48]. En ese mismo año Woodall y col. (1997) utilizando una cepa con tropismo respiratorio, no detectaron alteraciones en los niveles de TNF-α por lo que no toda la red de citocinas es afectada [235]. 40 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 41 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.3. Inmunidad pasiva No hay una transferencia prenatal eficiente de inmunoglobulinas entre la oveja y el cordero ya que la placenta es de tipo sindesmocorial. Por ello la glándula mamaria de los pequeños rumiantes ha asumido el papel de transferir la inmunidad pasiva de la madre a la cría [166]. Durante las últimas dos a tres semanas de gestación la glándula mamaria acumula una gran cantidad de calostro rico en inmunoglobulinas disponible para la cría inmediatamente después del nacimiento. El mecanismo del transporte de inmunoglobulinas de la sangre materna a la glándula mamaria es selectivo específicamente para las inmunoglobulinas IgG1. Estas moléculas, se unen por medio de su fracción FC a la membrana intracelular de las células epiteliales de los acinis, por pinocitosis pasan al interior del citoplasma donde por pinocitosis inversa salen al lúmen de los alvéolos [166]. Después de la ingestión del calostro, y tras haber pasado por la gotera esofágica, la caseína es almacenada en el abomaso y el suero rico en IgG1 pasa al intestino delgado. Los anticuerpos son absorbidos y pasan a la circulación fetal por células epiteliales inmaduras que permiten la transferencia de éstas. Este proceso continúa durante las primeras 32 horas de vida hasta que las células inmaduras se reemplazan por células maduras incapaces de seguir permitiendo el paso de las macromoléculas [166]. La glándula mamaria se encuentra fuertemente infiltrada por linfocitos y macrófagos durante el proceso de calostrogénesis, la mayoría de los linfocitos presentes son CD8+ y CD5- [166]. El periodo de protección inmunitaria conferida depende directamente de la concentración de anticuerpos específicos en el calostro, el volumen de calostro ingerido por la cría y la vida media de la inmunoglobulina circulante. La duración de la inmunidad pasiva, generalmente se encuentra entre 6 semanas y 6 meses [166]. 2.2.3.1. Inmunidad en el neonato Después de que los corderos hayan ingerido calostro, la concentración de anticuerpos IgG1, IgG2, IgM e IgA en suero aumenta considerablemente y es la IgG1 la que se encuentra en mayor cantidad. A partir del día 16 después del nacimiento hasta el día 32 las concentraciones de anticuerpos se mantienen estables o aumentan, indicando un balance entre el catabolismo y la producción endógena de inmunoglobulinas por parte de los pequeños rumiantes [166]. 2.2.3.1.1. Sistema inmune neonatal Los órganos linfoides secundarios y el timo se desarrollan fundamentalmente antes del nacimiento pero la placenta evita que el sistema inmune neonatal tenga relación con antíge41 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 42 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... nos exógenos e inmunoglobulinas. Los linfocitos predominantes en el feto son las células T que empiezan a circular a partir del día 72 de gestación, los CD8, CD4 y células T γ δ de la madre también se encuentran circulando en el feto [166]. La placa de Peyer ileocecal es el lugar donde se produce la linfopoyesis y es la fuente principal de las células B en la oveja. Aparecen a partir del día 75 de gestación y al día 120 se encuentran completamente maduras. Durante los 10 primeros días después del nacimiento, el 90% de los linfocitos son reemplazados [166]. 2.3. CUADRO CLÍNICO Y LESIONES Los ovinos pueden estar infectados con el VMV durante toda su vida sin presentar sintomatología y la aparición de síntomas coincide a menudo con infecciones secundarias bacterianas, cambios en la alimentación y situaciones de estrés incluidas las fisiológicas como la gestación, el parto y la lactación [57, 202]. Lo más común es que los signos clínicos se presenten en animales mayores de dos años [65]. El VMV puede provocar lesiones multisistémicas y las cuatro formas clínicas pueden aparecer de forma individual o mixta [57]. La forma pulmonar (Maedi) es la más común con presencia de neumonía intersticial crónica; La forma nerviosa (Visna) cursa con meningoencefalomielitis y coroiditis no purulenta [56,156,203], la forma mamaria se presenta como una mamitis intersticial; la última manifestación clínica y menos frecuente es la forma articular que cursa con artritis de carácter crónico no supurativo [148]. 2.3.1. Forma pulmonar La forma respiratoria (Maedi) tiene un periodo de incubación prolongado que puede durar de meses a varios años, siendo los tres a cuatro años de vida la edad en la que más frecuentemente aparece [57, 65]. El primer signo que se puede apreciar es una pérdida progresiva de peso que puede conducir finalmente a la caquexia sin que se observe anorexia. El signo más característico es la disnea, con aumento en la frecuencia respiratoria, respiración abdominal, extensión del cuello, dilatación de ollares y jadeo. A consecuencia de la insuficiencia respiratoria, se desarrolla intolerancia al ejercicio que provoca el retraso en la marcha [148]. En ocasiones, probablemente a causa de infecciones secundarias, se ha descrito la existencia de tos seca con poca o nula descarga nasal [65, 146, 233]. El animal permanece alerta y sólo presenta fiebre si hay infecciones secundarias [156]. A medida que evoluciona la enfermedad, las ovejas permanecen cada vez más tiempo postradas hasta morir a causa de insuficiencia respiratoria [65, 146]. La muerte es inevitable, sin producirse la recuperación clínica una vez que aparecen los síntomas [65]. Las lesiones macroscópicas consisten en un aumento del peso y del volumen de los pulmones que no se colapsan al abrir la cavidad torácica y en los que a veces se detectan 42 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 43 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA impresiones costales. Es característica la aparición de un fino punteado grisáceo subpleural de hasta 1,5 mm de diámetro que afecta de forma difusa a todo el órgano [12]. Los bordes pulmonares, en especial los dorsales, se redondean, la consistencia es gomosa, homogéneamente firme y poco elástica [12, 146, 161]. El parénquima adopta una coloración aclarada, y la superficie de sección es seca, sin producción de exudado salvo en los casos en que haya infecciones bacterianas asociadas. Los nódulos linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales aparecen aumentados de tamaño y presentan coloración blanquecina [73, 90, 180]. Microscópicamente las lesiones pulmonares típicas son una neumonía intersticial e hiperplasia linfoide difusa. Se observa engrosamiento de los septos interalveolares con infiltración de células mononucleares, hiperplasia de las células de músculo liso y fibrosis [158]. Se desarrollan folículos linfoides perivasculares, en torno a vías respiratorias, o dispersos en el parénquima, en ocasiones con centros germinales [12, 218]. En los nódulos linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales se observa una hiperplasia de las áreas corticales y paracorticales [53, 73, 90, 173, 180, 218]. 2.3.2. Forma nerviosa La forma nerviosa (Visna) se presenta generalmente en animales mayores de dos años [53, 65, 156, 160, 174] aunque el periodo de incubación tiende a ser menor que en Maedi [65] y el curso clínico se prolonga desde unas semanas hasta un año. Las ovejas presentan retraso en la marcha e incapacidad para seguir al rebaño a causa de incoordinación en el movimiento. Esta inestabilidad provoca caídas múltiples y se agrava hasta llegar a producir parálisis de las extremidades posteriores y, con el tiempo, incluso las anteriores, hasta culminar con la postración del animal. Al igual que ocurre en la presentación respiratoria de la enfermedad el animal se encuentra alerta, responde ante estímulos externos, no presenta fiebre ni disminuye su consumo de alimento [65, 156] Las lesiones macroscópicas en encéfalo y en médula espinal no son frecuentes [199], sin embargo, de estar presentes, aparecen como áreas grisáceas de malacia en la sustancia blanca periventricular principalmente en cuerpo calloso, fornix, corteza frontotemporal y en el hipocampo. En ocasiones puede llegar a apreciarse un engrosamiento granular de los plexos coroideos y opacidad de las meninges. En la médula espinal las lesiones pueden adoptar forma de cuña con su base en las meninges o localizarse alrededor del conducto ependimario. A nivel microscópico se aprecia una encefalomielitis no purulenta desmielinizante crónica. Las lesiones se distribuyen fundamentalmente en torno al sistema ventricular del encéfalo. Las características más sobresalientes son la aparición de manguitos perivasculares, desmielinización (secundaria) y malacia. La respuesta inflamatoria consiste en una gliosis e infiltración de células plasmáticas, linfocitos y macrófagos [12, 65, 146, 148, 156]. En los plexos coroideos, además de una coroiditis no purulenta, puede llegar a observarse la aparición de folículos linfoides con centros germinativos [221]. 43 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 44 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 2.3.3. Forma mamaria Por lo general la forma mamaria de la enfermedad se observa en animales de entre tres y cinco años aunque en algunos casos puede reconocerse desde el año de vida [109, 227]. Si el proceso es únicamente mamario el curso clínico es prolongado ya que no suele causar la muerte del animal [148]. Algunos autores señalan que la glándula mamaria es más susceptible al virus que otros órganos [216] y que dependiendo de la raza puede ser el órgano más afectado [146]. El signo clínico más evidente es la presencia de una mastitis indurativa difusa, bilateral, crónica, no dolorosa que se acompaña de un aumento de tamaño de los nódulos linfáticos retromamarios [146]. Las lesiones provocan una disminución en la producción de leche [227] que puede evolucionar hasta agalaxia [146]. Macroscópicamente en la glándula mamaria se observa aumento de tamaño y consistencia. La superficie de corte presenta un aspecto húmedo, liso y con pérdida del aspecto glandular [227]. La lesión microscópica característica es la presencia de una mastitis intersticial crónica con hiperplasia de folículos linfoides (con centros germinales activos). La inflamación afecta al parénquima glandular y a los conductos galactóforos. En el primero se produce una infiltración difusa por linfocitos, macrófagos y plasmocitos que pueden llegar a reemplazar los acini. En torno a los conductos galactóforos se desarrolla una hiperplasia de folículos linfoides que protruyen hacia la luz provocando la obstrucción total o parcial de los conductos dando lugar a atrofia y desaparición del tejido alveolar [88]. Este proceso se acompaña de fibrosis que contribuye a la estenosis ductal [12]. En los nódulos linfáticos retromamarios, al igual que en los mediastínicos, se observa una hiperplasia linfoide [173]. 2.3.4. Forma articular Esta forma de presentación es infrecuente y se describe sobre todo en ovejas mayores de dos años y la manifestación clínica más evidente es la cojera y marcha envarada [58, 148, 156, 161]. A nivel macroscópico las articulaciones más afectadas son carpo, tarso y bolsa atlantal. En estas localizaciones puede apreciarse engrosamiento y congestión de las membranas sinoviales y de la cápsula articular. El cartílago articular puede presentar erosiones en los casos avanzados. La cantidad de líquido sinovial está aumentada, en ocasiones con fibrina. Los tejidos periarticulares pueden verse afectados con fibrosis, hemorragias petequiales especialmente en tendones, destrucción del hueso articular y mineralización [58, 88]. Microscópicamente la lesión consiste en una sinovitis proliferativa crónica. Se puede apreciar una hiperplasia de la membrana sinovial con infiltración perivascular de macrófagos, linfocitos, células plasmáticas, y en ocasiones formación de folículos linfoides. En casos avanzados las lesiones son más degenerativas que inflamatorias. Las lesiones se extienden a las estructuras periarticulares en las que se puede observar fibrosis, focos de necrosis y calcificación [58]. 44 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 45 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.4. DIAGNÓSTICO 2.4.1. Diagnóstico de la enfermedad 2.4.1.1. Diagnóstico Clínico- Lesional El diagnóstico mediante examen clínico de animales afectados de VMV puede ser útil en animales en fase sintomática. A continuación se describen los síntomas clínicos más destacables en las distintas formas clínicas de infección por VMV. 2.4.1.1.1. Forma Pulmonar El diagnóstico clínico, se realiza comúnmente en animales mayores de tres o más años de edad [146]. Los síntomas son intolerancia al ejercicio, fatiga respiratoria y retraso en la marcha. Aumenta la frecuencia respiratoria, hay presencia de respiración abdominal con extensión del cuello, dilatación de ollares y jadeo, poca presencia de tos y de flujo nasal [65, 146, 233]. El animal permanece alerta sin fiebre al menos que existan infecciones bacterianas secundarias [156]. La muerte es inevitable y no se produce la recuperación después de la aparición de los signos [65]. 2.4.1.1.2. Forma Mamaria Los signos clínicos pueden aparecer a partir del año y medio de edad con mamitis indurativa no dolorosa y con aumento de tamaño de los nódulos linfáticos retromamarios [146]. Se puede presentar disminución de la producción de leche hasta llegar a una agalaxia [146, 227]. 2.4.1.1.3. Forma Nerviosa Aparece en animales mayores a dos años [53, 66, 156]. Las ovejas muestran retraso en la marcha a causa de incoordinación en el movimiento e inestabilidad que provocan caídas múltiples, llegando incluso a producirse la parálisis de las extremidades posteriores y anteriores. El animal se encuentra siempre alerta y responde a estímulos externos, no se observan cambios en el consumo del alimento [66, 156]. 2.4.1.1.4. Forma Articular Se presenta en ovejas mayores de dos años y clínicamente se caracteriza por la aparición de cojera, engrosamiento de las articulaciones, sobre todo las del carpo y tarso y adelgazamiento crónico [53, 156, 161]. 45 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 46 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 2.4.1.2. Diagnóstico Diferencial 2.4.1.2.1. Forma Pulmonar 1) Adenocarcinoma Pulmonar Ovino (APO) El Adenocarcinoma Pulmonar Ovino está asociado etiológicamente con un Betaretrovirus [155]. El proceso se presenta en animales adultos a partir de los dos años de vida y la presentación clásica de la APO se caracteriza por presencia de fluido en el tracto respiratorio, tos, disnea progresiva y pérdida de condición corporal [146]. En el examen post mortem se observa que la lesión es focal y consiste en áreas tumorales de color blanquecino-grisáceo de diferente extensión y en donde la estructura normal del tejido pulmonar se pierde por la transformación tumoral. El desenlace de esta enfermedad, como en el Maedi, es fatal [146]. A menudo coexisten ambas enfermedades en el mismo animal [92]. 2) Neumonía Atípica Hay numerosos agentes implicados en el desarrollo de esta enfermedad. Principalmente intervienen Mycoplasma ovipneumoniae y Mannheimia haemolytica y menos constantemente pueden estar implicados otros agentes. Se afectan generalmente animales jóvenes que sufren de forma frecuentemente subclínica una neumonía broncointersticial en las áreas craneoventrales pulmonares quedando el resto del parénquima sin afectar. Macroscópicamente las zonas consolidadas presentan una tonalidad entre grisácea y rojiza. Las vías respiratorias contienen una secreción de mucosa a purulenta [92]. 3) Neumonía Enzoótica Causada por Mannheimia haemolytica, a diferencia del Maedi suele afectar a ovejas de todas las edades con curso agudo o sobreagudo. Los animales presentan fiebre, tos y descarga nasal. La lesión pulmonar consiste en una neumonía aguda fibrinosa con focos de necrosis que afecta a las áreas craneoventrales aunque, cuando el curso de la enfermedad se alarga, puede dar lugar también a una pleuritis fibrosa [92, 146]. A nivel microscópico es característica la presencia de leucocitos con morfología ahusada en los alvéolos y que son comúnmente denominados células en grano de avena o “oat shaped” [114]. 4) Neumonías Parasitarias Principalmente se encuentran implicadas tres especies de nematodos, Dictyocaulus filaria, Protostrongylus rufescens y Muellerius capillaris. Los animales pueden encontrarse afectados a partir de los dos meses de edad [146]. La aparición de signos clínicos depende de la edad y del grado de parasitación, pudiendo dar lugar a tos, secreción nasal mucosa o mu46 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 47 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA copurulenta y pérdida de peso corporal. En la necropsia se aprecia una lesión focal que consiste en la presencia de placas grisáceo-verdosas o de atelectasia en las zonas dorsocaudales del pulmón. A nivel microscópico hay neumonía granulomatosa asociada a diferentes fases larvarias y organismos adultos del parásito e hiperplasia de musculatura lisa. [12, 146, 233]. 5) Pseudotuberculosis Pulmonar Es una infección producida por Corynebacterium pseudotuberculosis que puede cursar como una enfermedad respiratoria crónica cuyo signo clínico más evidente es la presencia de disnea intensa y adelgazamiento crónico del animal. La principal lesión asociada a esta enfermedad es una linfadenitis caseosa que, cuando afecta a los nódulos linfáticos mediastínicos y bronquiales, puede diseminarse al pulmón, originando así focos de necrosis caseosa en el parénquima pulmonar [27]. 2.4.1.2.2. Forma Mamaria 1) Agalaxia Contagiosa Afección producida por Mycoplasma agalactiae puede cursar de forma aguda o crónica. La enfermedad se asocia a tres presentaciones clínicas que incluyen mamitis bilateral, queratoconjuntivitis y artritis, que no siempre se presentan de forma conjunta en un mismo animal. Las características de la leche aparecen alteradas pudiendo evolucionar hacia una agalaxia con desaparición de acinis y fibrosis. En ocasiones puede ser imprescindible recurrir al diagnóstico inmunológico o etiológico debido a la similitud que pueden presentar en el cuadro clínico y lesional con la forma mamaria del MV [12, 92]. 2) Mastitis Bacterianas Las mamitis bacterianas pueden ser originadas por diferentes agentes etiológicos como Staphylococus aureus, Mannheimia haemolítica, o Escherichia colli entre otros. Los animales afectados pueden presentar fiebre y depresión. La glándula mamaria puede estar afectada unilateralmente, presentando tumefacción y secreción láctea frecuentemente alterada y puede observarse presencia de pus y/o sangre [24, 78]. 2.4.1.2.3. Forma Nerviosa 1) Scrapie El Scrapie, enfermedad producida por un prion (PrPsc), afecta a animales de entre dos y cinco años, aunque se ha descrito el proceso en animales menores del año de vida [83]. El cur47 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 48 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... so de esta afección es lento y se caracteriza por la existencia de hiperexcitabilidad, temblores, ataxia, prurito y pérdida de la condición corporal. La lesión sólo es apreciable microscópicamente, se localiza principalmente en el tronco del encéfalo y consiste en una degeneración vacuolar de las neuronas y del neuropilo característica [78, 146]. 2) Aujeszky Esta enfermedad de etiología herpesviral tiene un curso agudo con una clínica caracterizada por un intenso prurito, incoordinación, ataxia, postración y muerte. Macroscópicamente se puede apreciar congestión en el encéfalo, pulmón y nódulos linfáticos preescapulares. Histológicamente se aprecia congestión, hemorragias y desmielinización. En algunos de los casos se observan diferentes grados de meningoencefalomielitis no supurativa que puede variar de difusa a focal con presencia de manguitos perivasculares, gliosis y necrosis neuronal [221]. 3) Cenurosis El agente etiológico es una larva parasitaria, Coenurus cerebralis, que provoca lesiones traumáticas en su migración a través del encéfalo y compresión del parénquima nervioso al desarrollarse la vesícula. Microscópicamente en el infiltrado inflamatorio pueden observarse eosinófilos. Afecta principalmente a uno de los hemisferios cerebrales, provocando ceguera. Los animales caminan en círculos en el mismo sentido que las lesiones cerebrales [78, 146]. 4) Listeriosis Causada por una bacteria, Listeria monocytogenes, que se encuentra en ensilados preparados en condiciones inadecuadas o contaminados con tierra. El curso de la enfermedad es agudo y se afectan animales de cualquier edad. Los síntomas son parálisis facial, apatía, pérdida del equilibrio, movimientos en círculos, movimiento de lado a lado de la cabeza, nistagmo, movimiento anormal de ambos ojos, temblor labial y sialorrea. A nivel microscópico la lesión se localiza en el tronco del encéfalo y consiste en una meningoencefalitis purulenta con microabscesos y manguitos [13, 78, 146]. 5) Louping-ill Es una infección causada por un virus del género Flavivirus que se transmite por medio de garrapatas. La enfermedad afecta al sistema nervioso central de entre otras especies la ovina. Cursa de forma aguda, afectando principalmente a animales jóvenes (corderas y primalas) como un proceso febril y con síntomas nerviosos como ataxia, parálisis del tercio posterior, estado comatoso y muerte. Las lesiones sólo son detectables a nivel microscópico y 48 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 49 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA consisten en una meningoencefalomielitis no purulenta con necrosis neuronal especialmente a nivel de tronco del encéfalo y médula espinal [92]. 6) Intoxicación por falaris Es una patología de origen tóxico provocada por el consumo de plantas del género Phalaris. La enfermedad frecuentemente se presenta de forma aguda o crónica siendo menos común la presentación sobreaguda. El cuadro clínico se caracteriza por problemas de incoordinación, debilidad, temblores musculares, hiperexcitabilidad y movimientos verticales de la cabeza de forma continua. Posteriormente se produce postración con rigidez espástica de las extremidades. Macroscópicamente, al realizar secciones transversales del encéfalo, se llega a apreciar una coloración grisácea-verdosa principalmente en los cuerpos geniculados laterales. A nivel microscópico se aprecia acúmulo de pigmento granular en el citoplasma de las neuronas. Además hay gliosis, desmielinización y manguitos perivasculares [80]. 2.4.1.2.4. Forma Articular 1) Agalaxia Contagiosa La Agalaxia contagiosa provoca artritis no purulenta, especialmente en animales jóvenes. Los síntomas pueden llegar a desaparecer con la administración de antibióticos. Al igual que ocurre en la forma mamaria de la enfermedad puede ser imprescindible recurrir al diagnóstico inmunológico o etiológico debido a la similitud en el cuadro clínico y lesional con la forma artrítica del MV [13, 78, 146]. 2) Otras Artritis Bacterianas Bacterias como Brucella spp., Erisipelothrix rhusopatiae y Fusobacterium necrophorum producen inflamaciones articulares frecuentemente de carácter purulento, que resulta en cojera [13, 78, 146]. 2.4.2. Diagnóstico de la infección 2.4.2.1. Diagnóstico Viral 2.4.2.1.1. Aislamiento Viral El cultivo celular, es la técnica más utilizada para el aislamiento viral. Se basa en cultivar células provenientes de tejidos o fluidos, y presentarlos en forma de monocapa o suspensión, como células individuales, para su futura infección. Estas células están adaptadas a un 49 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 50 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... medio artificial, se mantienen a 37°C, con medio de cultivo, suero fetal bovino (SFB) u ovino (SFO) y antibióticos [34]. Sigurdsson y col. (1960) describieron por primera vez el aislamiento del VMV y el comportamiento viral in situ empleando cultivos celulares primarios de plexo coroideo ovino (PCO) [205]. El aislamiento viral de MV y AEC se ha llevado a cabo empleando una variedad de cultivos primarios y cultivos en línea. Cultivo primario de plexo coroideo ovino (PCO) [41, 47, 99, 145, 185, 201, 205, 208, 236], explantes de pulmón [76, 201], células fetales de testículo de macho cabrío [60], cultivos en línea de fibroblastos epidermales [136, 181, 191], cultivos primarios de células de la microglía caprina [15], en células de la línea monocito-macrófago [136, 214], células de membrana sinovial de cabra (CMSC) [62, 102, 117, 131, 153, 179, 190, 214], cultivos primarios de células de riñón ovino [47, 201], células de glándula mamaria ovino y caprino [141, 236], cultivos primarios de células epiteliales provenientes de leche de cabra [153], cultivos de células del endotelio aórtico de ovino [140], cultivos primarios de células de la granulosa [131] cultivos primarios de células epiteliales del oviducto caprino [131], cultivos de células corneales [27, 29, 58, 123]. Da Silva y col. inmortalizaron una línea de fibroblastos caprinos con el fin de utilizarlos para el diagnóstico de los LVPR [59]. El tiempo de infección celular varía de semanas a meses, dependiendo de la adaptación del virus a condiciones de laboratorio, dosis infectiva, diversidad de la cepa y la virulencia [205], la presencia de efectos citopáticos (EC) requiere de más de 2 a 3 pases para que se puedan apreciar debido a su replicación lenta [170]. Los EC que se pueden percibir tanto en cultivos primarios como en cultivos en línea son: la morfología celular se vuelve de forma circular y filiforme, cambios de color a grisáceo en el protoplasma, sin la presencia de granulocitos [173, 205]. El EC más característico en los LVPR es la formación de sincitios, generalmente de 5 a 30 núcleos por célula, al paso del tiempo, estas células gigantes mueren, se separan de la botella de cultivo y se liberan al medio [205]. Lamara y col. (2001) demostraron un efecto citopático a partir de los 6 días post infección, mientras que Sihvonen y col. (1980) y Simard y col. (2001) manifestaron la presencia de EC a los 14 días, Sigurdardóttir (1964), Baszler (1994), Celer (1997) y Lerondelle (1999) han observado un EC a partir de los 21 días post infección, Daltabuit y col. (1999) reporta un efecto citopático a partir de los 6 meses post infección [15, 41, 62, 131, 141, 201, 208, 210]. Por otro lado, Mselli-lakhal y col. (1999) y Singh y col. (1999) confirman la presencia de infección y de producción viral, sin la presencia de sincitios [154, 214]. El uso frecuente del cultivo celular es la obtención de grandes cantidades de virus como antígeno para las diferentes técnicas de diagnóstico como Western Blot, ELISA, Inmunodifusión y PCR, entre otras. 2.4.2.1.2. Microscopía Electrónica Existen fundamentalmente 2 tipos de microscopios electrónicos, el microscopio de transmisión de electrones (“transmision electron microscope” TEM) y el microscopio 50 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 51 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA de electrones por escáner (Scanning electron microscope SEM). En la investigación de estructura viral, la microscopía de transmisión de electrones es la técnica de elección, se llega a obtener dos tipos de información: (i) el número absoluto de partículas virales presentes en una preparación y (ii) presencia de la estructura viral [34]. Hoy en día la microscopía inmunoelectrónica “immunoelectron microscopy” está ganando terreno como un método rápido para el diagnóstico en muestras de tejido infectado [155]. Thormar (1961), describió las diferencias más aparentes entre cultivos celulares infectados y no infectados de plexo coroideo de ovino: la presencia de pequeñas partículas circulares que tienden a agruparse [222]. Coward y col. (1970) presentaron información sobre la infección de MV tanto en células de riñón de ovino y PCO, las células presentaron una forma alargada y presentación de viriones en gemación [47]. Mornex y col. (1994) encontraron presencia de partículas virales típicas a LVPR en cocultivos de lavados broncoalveolares [152]. Lee y col. (1996) con la técnica TEM y la SEM, compararon la replicación viral del MV, cepa EV-1 en macrófagos y en células epiteliales, encontrando presencia de viriones en vacuolas de macrófagos y partículas tipo A retrovirales intracitoplasmáticos en macrófagos [137]. 2.4.2.1.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) El diagnóstico basado en la reacción en cadena de la polimerasa, se define por la especificidad que se llegue a obtener entre la unión de los oligonucleótidos sintéticos y la secuencia diana. Utilizando una mezcla compleja de ácidos nucleicos y ADN Polimerasa termoestable, se produce una síntesis de ADN. Se lleva a cabo mediante un proceso automatizado de múltiples ciclos de alineamiento, extensión y desnaturalización resultando en una amplificación masiva de 2n órdenes de magnitud a partir de n ciclos de amplificación de la secuencia diana localizada entre los dos cebadores [34]. Existen variantes de la técnica tradicional de PCR para la detección de LVPR, la PCR anidada (PCR-n), consiste en la amplificación de un producto obtenido a partir de un amplificado de una PCR anterior y la PCR semianidada (PCR-sn) que emplea en la segunda PCR un cebador de los utilizados en la primera PCR. Cuando el objetivo es detectar virus libre es necesario realizar una RT-PCR purificando primero ARN y transcribiendo el ARN a ADN complementario (ADNc) utilizando una enzima TR. El éxito de la técnica de PCR, depende en gran medida de la elección del gen vírico y del diseño correcto de los cebadores que deben de ser específicos del virus [165, 169, 185, 236]. La gran sensibilidad potencial de la PCR permite identificar animales infectados con poca carga vírica. Además presenta la ventaja sobre los métodos serológicos de permitir la detección de infección en animales con anticuerpos calostrales y en animales infectados que no hayan desarrollado anticuerpos frente a la infección. Esto último es un hecho relativamente frecuente en las infecciones por lentivirus y se denomina “latencia serológica” o “gap” serológico [43, 44, 182] y es responsable de falsos negativos en pruebas serológicas [113, 143]. 51 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 52 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Durante los últimos años se han diseñado cebadores dirigidos a distintas regiones del genoma viral del MV y de la AEC, incluidas las regiones LTR, gag, pol y env [2, 8, 14, 27, 37, 39, 61, 79, 99, 113, 145, 165, 185, 230, 232, 236, 237]. En su trabajo Zanoni y col. (1992), diseñaron 3 parejas de cebadores dirigidos a distintos genes, los cebadores Gag y LTR se diseñaron en base al VMV Islándico y los cebadores Pol diseñados a partir del VAEC aislado por Crawford y col. (1980). Sólo la pareja de cebadores LTR amplificaron 6/6 muestras (100%), mientras que los cebadores Gag amplificaron 5/6 (83%) y los cebadores Pol (VAEC) detectaron el 4/6 (67%). Los autores concluyeron que las cepas de LVPR presentan gran variabilidad genética [236]. Por otra parte Rosati y col. (1995), analizaron cepas de VMV y VAEC de diferentes zonas geográficas con 4 pares de cebadores de las regiones LTR, env (proteína TM) y gag (proteínas p25 y p16) a partir de la cepa Islandesa K1514 de VMV. Los cebadores dirigidos a la región LTR amplificaron 100% (9/9) de las muestras, los cebadores Gag (p25) amplificaron 62,5% (5/8), los cebadores Env amplificaron 22.2% (2/9) y los cebadores Gag (p16) 11,1% (1/9). Los cebadores Env (TM) amplificaron una muestra más, al modificar la temperatura de hibridación. Rosati y col. también argumentaron que las diferencias de sensibilidad según los cebadores se deberían a la variabilidad genética entre las cepas de LVPR [185]. La posibilidad de detección precoz de la infección por VMV fue demostrada por Zanoni y col. (1990), empleando cebadores dirigidos al gen gag detectaron virus en células de plexo coroideo ovino a partir del día 1 post infección y efecto citopático 7 días después [237]. Daltabuit y col. (1999) desarrollaron una Gag-PCR con el fin de amplificar el VAEC en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cabras seropositivas. Las PBMC, fueron cocultivados con células de membrana sinovial de cabra (CMSC), 6 meses después se visualizó efecto citopático al mismo tiempo que se detectó provirus por PCR [62]. Reddy y col. (1993) empleando cebadores dirigidos a las regiones gag y pol del CAEV-co, llevaron a cabo reacciones de PCR en muestras positivas y negativas de PBMC, células del fluido sinovial de cabra (CFS) y células de leche (CL). Las PCR dirigidas a cabras seropositivas con cebadores Gag detectaron 18/20 PBMC-positivo, 8/8 CL-positivo y 5/5 CFS-positivo. En cabras seronegativas la Gag-PCR detectó 3/33 PBMC-positivos, 0/8 CLpositivos y 0/5 CFS-positivos, dos de las cabras seronegativas y Gag-PCR positivos, seroconvirtieron 2 meses después [179]. Wagter y col. (1998) desarrollaron una Gag-PCR con seis cebadores de cepas MV holandesas, francesas, islandesas y suizas. Tras probar los cebadores en muestras de campo de animales VMV-seropositivos y no infectados con el VMV, 1/9 animales del rebaño acreditado como libre de VMV fue Gag-positivo y 53/60 (88%) de animales seropositivos fueron Gag-positivos. Este último resultado podría indicar una baja sensibilidad de la PCR frente al ensayo serológico. Por otro lado estos autores demostraron que la sensibilidad de la GAGPCR incrementaba al aumentar el volumen de muestra de sangre de 10 ml frente a los 3 ml empleados por Walter y col. [232]. 52 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 53 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Brodie y col. (1993), emplearon una Gag-PCR y una LTR-PCR de lentivirus ovinos y detectaron provirus en leucocitos de lavado broncoalveolar, sangre, nódulo linfoide mediastínico y médula ósea. La sensibilidad de la técnica aumentó tras cultivar células infectadas aumentando así, la carga viral [28]. Johnson y col. (1992) estudiaron a 20 ovinos menores de 1 año, con presencia de ARN viral detectado por Hibridación in situ y sólo el 10% (2/20) eran seropositivos a VMV. Tras la obtención se cultivaron los PBMC y 14 días después el 70% (14/20) fueron LTR, Hibridación in situ positivos y en cocultivo presentaron efecto citopático [113]. Amorena y col. (1992) diseñaron 3 parejas de cebadores para una POL-PCR y 3 parejas para una Env-PCR, a partir de secuencias Islándicas de MV. Se analizaron 5 cepas incluidas, 3 Islándicas, 1 sudafricana (SA-OMVV) y 1 británica (EV-1). Tanto la Env-PCR como la POL-PCR detectaron las 3 cepas Islandesas mientras que una sola pareja de cebadores Env detectaron la SA-OMVV y ninguna de las 2 PCR detectaron la cepa británica EV-1 [8]. Zanoni y col. (1996), desarrollaron PCRs para la región LTR, y para los genes gag, env y pol del VMV y fueron capaces de detectar hasta 10 copias del ADN molde. La sensibilidad de las PCRs en muestras de sangre y leche fue menor que la del ELISA, sin embargo en muestras de animales seronegativos, el 50% fueron PCR positivos. Los autores sugieren una seroconversión tardía como razón de los resultados [239]. Extramiana y col. (2002) evaluaron una LTR-PCR con respecto a un ELISA y una IDGA en muestras de sangre, leche y tejido. Los resultados obtenidos de sensibilidad y especificidad con respecto al conjunto de muestras fue de 98% y 100% respectivamente, mientras que los resultados de sensibilidad obtenidos por tipo de muestra fue del 84% (sangre), 67% (leche) y 88% (tejido) y una especificidad del 100% [79]. Narayan y col. (1983) demostraron que para visualizar un amplicón en un gel de agarosa se necesita partir de aproximadamente 3000 monocitos con 30 a 240 células infectadas [157]. Barlough y col. (1994) diseñaron una PCR doble anidada con el propósito de mejorar la sensibilidad de la PCR tradicional. Los cebadores fueron elaborados a partir de la secuencia de CAEV-co [192] y dirigidos al gen gag y pol. Se aplicó la PCR a muestras de PBMC de animales seropositivos por ELISA. El 69,4% de las muestras amplificaron utilizando la GAG-PCR y el 16,3% fueron positivos a la POL-PCR. Al momento de emplear el protocolo anidado Gag-POL-PCR el porcentaje de positivos se redujo al 14,3%. Sin embargo, la concordancia fue alta (κ= 0,912) entre la PCR doble anidada y el ELISA. Los autores proponen, eliminar el Southern Blot y utilizar la PCR doble anidada para detectar a los falsos positivos de pruebas serológicas [14]. Celer Jr y col. (2000) desarrollaron una PCR-sn, los cebadores fueron diseñados a partir del genoma del VMV para detectar el gen gag. La Gag-PCRsn detectó un 70% (21/30) de los seropositivos y un 8,8% (6/68) de los seronegativos [39]. Leroux y col. (1997), diseñaron una RT-PCR para detectar LVPR en muestras de leche y secreciones mamarias, de ovinos y caprinos infectados de forma experimental y de forma 53 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 54 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... natural [144]. Se diseñaron cebadores degenerados para la región pol de virus locales. La POL-RT-PCR detectó 8/8 ovinos, 9/9 caprinos infectados de forma natural y todas las muestras provenientes de animales seropositivos, también detectó un animal seronegativo que provenía de un grupo seropositivo y este resultado sugiere que la expresión viral en células de leche puede presentarse con anterioridad a la seroconversión y que la POL-RT-PCR podría ser una técnica tan confiable como el cultivo celular, más sencillo y rápido. Los autores destacan el uso de cebadores diseñados directamente en cepas locales evitando de esta forma la variabilidad genética y por tanto los falsos negativos [144]. Vitu y col. (1997) desarrollaron una RT-PCR para detectar VAEC en leucocitos de leche. Se observó viremia intermitente con la RT-PCR al igual que en cocultivo, sin embargo los animales se mantuvieron seropositivos durante el transcurso del ensayo. La concordancia entre IDGA y RT-PCR fue del 67% [230]. Schoborg y col. (2002) desarrollaron una RT-PCR para detectar la región gag de la cepa CAEV-co [197]. Zhang y col. (2000) desarrollaron una PCR cuantitativa de competición (QC-PCR) para detectar una región conservada del gen pol del VMV. Observaron ADN viral en macrófagos alveolares y en monocitos de sangre periférica, también observaron mayor carga viral en macrófagos alveolares detectaron una mayor carga viral en animales que presentaron lesiones histopatológicas [240]. 2.4.2.1.4. Reacción en cadena de la Polimerasa-Cuantitativa (Q-PCR) Esta técnica permite la detección y cuantificación de ácidos nucleicos. A diferencia de la PCR convencional, esta técnica se basa en la detección fluorescente la cual aumenta proporcionalmente al tiempo en que el producto de PCR es amplificado. Las estrategias de marcaje del amplicón se basan en sondas (Taqman, “Molecular beacons” y “Scorpions”) o SYBR green que aumentan la especificidad del amplicón cuantificado y permite el desarrollo de reacciones multiplex [124]. La detección de la fluorescencia se realiza mediante filtros de emisión optimizados para el uso de los fluoróforos. Permite obtener y registrar la cantidad de fluorescencia emitida durante cada ciclo, y es posible monitorear la reacción de PCR durante la fase exponencial, donde el aumento significativo del producto de PCR se correlaciona con la cantidad de ácido nucleico diana. Existen dos métodos para cuantificar el ADN o ARN, cuantificación relativa y absoluta. La cuantificación relativa determina la cantidad de moléculas, relativizadas frente a uno o varios genes endógenos o “housekeeping genes”, ideal para análisis de expresión génica. La cuantificación absoluta permite obtener el número exacto de moléculas referido a una recta estándar, ideal para detección de partículas virales siendo posible la cuantificación de menos de 5 copias del molde de ADN o ARN y con una desviación estándar menor al 2% [124]. Klein y col. (1999) desarrollaron un protocolo de PCR cuantitativa para detectar distintos aislados del lentivirus de la inmunodeficiencia felina [125]. Gudmundsson y col. (2003) utiliza54 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 55 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ron esta técnica para estudiar la infección y patogenia del VMV, los ensayos fueron dirigidos a los genes, gag, pol, env, tat, rev y vif [96]. 2.4.2.2. Diagnóstico Inmunológico Los anticuerpos frente a las infecciones por lentivirus aparecen poco después de producirse la infección en la mayoría de los animales y aunque no protegen contra la enfermedad, son indicadores de la infección. Entre las principales técnicas serológicas que se han empleado para el diagnóstico de anticuerpos en los LVPR se incluyen la Inmunodifusión en gel de agar (IDGA), el ensayo de inmunoabsorbancia enzimática (ELISA), Inmunohistoquímica y el Western Blot. 2.4.2.2.1. Inmunodifusión en gel de agar (IDGA) La IDGA es todavía la prueba más extendida en la mayoría de los laboratorios del mundo [40] y es la prueba de referencia por la Organización Internacional de Epizootias (OIE). Consiste en detectar anticuerpos precipitantes en un medio de agar empleando antígeno viral soluble. La reacción Ag-Ac genera bandas en el gel visibles a simple vista. La IDGA utiliza como antígeno, el VMV o el VAEC, que se produce a partir de cultivo celular de plexo coroideo o pulmón fetal ovino [3, 52]. Los antígenos más usados en la IDGA es el del VMV [164, 185]. Los anticuerpos que se detectan van dirigidos a la proteína de superficie gp135, la proteína de cápside p25 en el caso de VMV y la p28 en caso de VAEC y la proteína de matriz p16 [41]. Se ha demostrado que el VMV es de limitado valor diagnóstico para el VAEC [52] y su baja sensibilidad se atribuye a una divergencia entre las proteínas de gag (25%) y env (40%) de VAEC y VMV, y a las diferentes cepas víricas. Otro aspecto relacionado con la baja sensibilidad es que la IDGA requiere la participación de múltiples interacciones epítopos-anticuerpos para obtener un resultado positivo [52, 128, 129, 164, 179]. En la década de los noventa, Knowles y col. (1994) reportaron una sensibilidad del 91% y una especificidad del 100% para la prueba IDGA-LVPR con respecto a inmunoprecipitación [128]. En estudios más recientes Varea y col. (2001) observaron una sensibilidad del 76.3% y una especificidad de un 98.3% para la IDGA-LVPR frente a Western Blot [229]. 2.4.2.2.2. Ensayo de Inmunoabsorbancia Enzimática (ELISA) Las pruebas de ELISA se dividen en 5 categorías, (1) ELISA indirecto (ELISA-i) consiste en la fijación del antígeno en la placa al cual se unen los anticuerpos presentes en la muestra, la calidad de la purificación puede ser un factor limitante de la prueba, mientras mayor sea la pureza del antígeno mas alta será la sensibilidad y especificidad [27, 38, 71, 107, 121, 130, 175, 186, 193, 211, 228, 229, 231, 238] , (2) ELISA directo (ELISA-d), detecta antígeno o anticuerpo (3) ELISA sándwich directo detecta antígeno, (4) ELISA de competición, en donde compiten dos anticuerpos para la unión antígeno anticuerpo y (5) ELISA de bloqueo 55 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 56 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... donde compiten dos anticuerpos para la unión antígeno anticuerpo, sin embargo una incubación previa bloquea la unión entre uno de los dos anticuerpos [51]. En 1990, Simard y col. elaboraron un ELISA-i con antígeno de VMV que estimaron con una especificidad del 98,8% y con un 15,5% de sensibilidad más que la IDGA [212]. Del mismo modo Brodie y col. (1993) desarrollaron un ELISA-i con una sensibilidad del 92,3% y una especificidad del 94% [28]. Celer V. y col. (1993) con un ELISA-i de antígeno VAEC reportan una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100% en caprino y una sensibilidad del 81% y una especificidad del 87% en ovino con respecto al Inmuno Blot [38]. En este mismo año Vander y col. (1994) desarrollaron una ELISA-i con antígeno de VAEC, reportan una sensibilidad y especificidad del 94,4% y 100% con respecto a la inmunoprecipitación [228]. La técnica de ELISA-i utilizando proteínas recombinantes como p55 (gag), p25 (gag), p16 (gag), p14 (gag), p44 (TM), gp 135 (env) y la gp46 (TM) a diferencia de virus completo, tienen como ventaja, el ser de una mayor pureza. Kwang y col. (1993), presentaron una ELISA-i con una glicoproteína recombinante de la región transmembranal (TM) procedente del lentivirus ovino, los autores demostraron una mayor sensibilidad y especificidad que la IDGA [130]. El año siguiente, Kwang y col. (1994) describieron una ELISA-i de 3 péptidos distintos de la región TM, de esta manera aumentan la sensibilidad de la técnica, los autores argumentan que las ELISAs de segunda generación ofrecen un mejor equilibrio entre coste y capacidad diagnóstica. Clavijo y col. (1995), presentaron resultados de una ELISA-i de proteína transmembranal (TM), la sensibilidad fue del 98,8% y la especificidad fue del 97,2%, sin embargo, los autores manifiestan que al utilizar en paralelo un ELISA-i (TM) y un ELISA-i de proteína recombinante (p28) aumentaría la sensibilidad, así detectando un mayor número de falsos negativos. [45]. En 1997 Boshof y col. fusionan la proteína p25 y la TM obteniendo un ELISA con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100%. De Martini y col. (1999) repitieron la prueba con animales infectados experimentalmente y obtuvieron una sensibilidad de tan solo el 64% y una especificidad del 100%, aunque en animales infectados naturalmente la sensibilidad aumentó a un 84%, sospechando de la existencia de gran variabilidad entre cepas víricas [71]. Saman y col. (1999) utilizaron como antígeno una proteína recombinante p25 y un péptido derivado de la región inmunodominante de la proteína transmembranal, gp 46. La sensibilidad de la ELISA-i obtenido fue 99,5% y la especificidad 99,3% [193]. Varea y col. (2001) utilizando la misma ELISA-1 p25+gp46 obtuvieron una sensibilidad del 97,8% y una especificidad del 98,2% [229]. Se han comparado resultados de sensibilidad y especificidad entre ELISAs indirectos de proteínas recombinantes y ELISAs indirectos de virus completo, Celer y col. (1993) encontraron una sensibilidad del 50% y una especificidad del 100% para el ELISA-i P25 con respecto a Inmuno Blot [38]. Zanoni y col. (1994) compararon un ELISA-i con antígeno VMV completo, con un ELISA-i recombinante Gag-GST, la sensibilidad de la ELISA-i Gag GST fue del 86% y la especificidad del 99,3% [238]. 56 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 57 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La sensibilidad y especificidad de un ELISA-i de proteína transmembranal recombinante (RTM) descrito por Rosati y col. (1994), presentó una sensibilidad del 60% y una especificidad del 95% frente a una ELISA-i de virus completo [186]. Power y col. (1995) compararon dos ELISAs-i recombinantes, Gag p25 + p16 y la ELISA-i TM. Concluyeron que al combinar las dos pruebas, la sensibilidad y la especificidad aumentaron a 97,4% y 99,4%, respectivamente mientras que la de las técnicas individuales presentan una sensibilidad menor del 76,6% para la ELISA-i Gag y del 94,8% para la ELISA TM [175]. Pasick y col. (1998) compararon una ELISA-i combinando proteínas recombinantes de gag y de TM, la sensibilidad fue del 98% y la especificidad del 98,8%, mientras que la sensibilidad y especificidad de la ELISA-i de virus completo de AEC fue de 97,9% y 88,2% respectivamente [164]. En los ELISAS de competición se enfrentan el antígeno viral, anticuerpos monoclonales o policlonales y el suero problema. Fevereiro y col. (1999) enfrentan el suero problema con anticuerpos monoclonales a un antígeno del VMV, la sensibilidad de este ELISA de competición fue del 96% y una especificidad del 78% [82], Herrmann y col. (2003) describen una sensibilidad del 100% y una especificidad del 96% utilizando antígeno del VAEC [103, 104]. 2.4.2.2.3. Inmunohistoquímica (IHQ) Las técnicas de IHQ se basan en la detección de un antígeno mediante anticuerpos policlonales (Acpc) o monoclonales (Acm) específicos. Para facilitar la visualización de la reacción se emplea un sistema de amplificación de señal, habitualmente el complejo avidina estreptoavidina-biotina (ABC) y un sistema revelador, generalmente diaminobenzidina (DAB). Finalmente se visualizan los complejos antígeno–anticuerpo bajo el microscopio óptico [134]. Con esta técnica, se ha llegado a reportar la presencia de LVPR en distintos tejidos. Georgsson y col. (1989), en un ensayo experimental tras la inoculación intracerebral de VMV en ovinos utilizaron Amc dirigidos a epítopos de la p25, y p15, detectando y relacionando la presencia de antígeno viral con las lesiones nerviosas y los tipos celulares implicados [89]. Gelmetti y col. (2000) empleando una mezcla de Amc a las proteínas p27, p15 y gp105 del VMV, aumentaron la sensibilidad de la técnica, en este caso sobre muestras de pulmón [84]. Todos los autores mencionados han detectado la presencia de antígenos virales en células de la línea monocito-macrófago, pero también ha sido posible mostrar la presencia viral en células de otras líneas, como Bolea y col. (1998) que observaron la presencia de proteínas virales en células epiteliales y macrófagos de la glándula mamaria [24], Lerondelle y col. (1999) que con el fin de demostrar la expresión antigénica del VAEC en células de la glándula mamaria, infectaron cultivos celulares primarios y procesados por IHQ utilizando Acpc anti-queratina. Los autores proponen que las células epiteliales de glándula mamaria podrían 57 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 58 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... ser reservorios del virus y jugar un papel importante en la diseminación y patogénesis de la infección mamaria [141]. Lamara y col. 2001 señalaron la presencia del VAEC en células de la granulosa derivados del oviducto caprino, en presencia de Amc contra la p25 (VAEC) [131]. Preziuso y col. (2003) utilizando Amc frente a la proteína p28 del VMV, detectaron proteínas en las células intersticiales y en células epiteliales del epidídimo [177]. Estos dos últimos autores sugieren que estos tipos celulares podrían servir como reservorios del virus en la fase subclínica de la infección y ser potencialmente capaces de transmitir la infección a embriones [131] o al semen [177]. 2.4.2.2.4. Hibridación in situ (HIS) La Hibridación in situ es una técnica ampliamente utilizada para la detección de ARN viral en células infectadas utilizando sondas de ADN marcadas generalmente con ADN 35S sobre muestras de tejido o de cultivos celulares previamente fijados, tratados con proteinasa K, deshidratadas y secadas al aire, observando los resultados al microscopio óptico [7]. En las últimas décadas se ha utilizado esta técnica para el diagnóstico de los LVPR. Sanna y col, (1999) amplificaron secuencias de ADN de la región pol observando la presencia del VAEC en macrófagos, microglía, astrocitos, oligodendrocitos y plexo coroideo entre otros [195] Stowring y col. (1985), emplearon ambas técnicas para detectar ARN del VMV (HIS) en oligodendrocitos y astrocitos de zonas de desmielinización identificados por IHQ [220]. Gendelman y col. (1985) detectaron ARN del VMV en distintos tejidos, especialmente en los macrófagos alveolares, donde se observa una mayor presencia de ARN que de células en producción viral. Estos mismos autores, combinaron las técnicas de IHQ e HIS para visualizar el Ag viral y el ARN. Detectaron una mayor presencia de ARN en macrófagos en la membrana sinovial que de proteína viral [85, 87]. Anderson y col. (1994) detectaron proteína viral (p15) en macrófagos de membrana sinovial [9]. Roy y col. (1992) utilizaron sondas ADN para detectar ARN de VMV en cultivos celulares y utilizaron una combinación de HIQ y HIS para detectar tanto Ag viral como ARN dentro de la misma célula [188]. Carrozza y col. (2003) combinando HIS y HIQ lograron identificar diferentes tipos celulares portadores del genoma del VMV tanto en pulmón (neumocitos I y II, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos) como en la glándula mamaria (células epiteliales, endoteliales, macrófagos y fibroblastos) [37]. 2.4.2.2.5. Inmunoelectrotransferencia (WESTERN BLOT) La prueba de Western Blot (WB) consiste en someter el antígeno a una interacción específica con anticuerpos marcados directa o indirectamente. Tras separar proteínas de antígeno mediante electroforesis en gradientes de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico (SDSPAGE), las proteínas se transfieren a una hoja de nitrocelulosa y los lugares de unión no 58 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 59 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA específicos se bloquean y las tiras se incuban con antisuero y se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina con peroxidasa. Las reacciones se visualizan directamente tras la adición del sustrato enzimático [7]. Una muestra se considera positiva si se detectan al menos dos diferentes genes virales [30, 113, 155]. La prueba de WB detecta de forma precoz los anticuerpos frente a LVPR de infecciones naturales y experimentales [42, 91, 127]. De Martín y col. (1999) detectaron un 94% (31/33) de positivos a WB y el 0% (0/5) en controles negativos, siendo las pruebas de referencia ELISA e IDGA [71]. Diversos autores consideran el WB la “prueba de oro o referencia” para los ensayos de anticuerpos frente a LVPR [91, 225]. Sin embargo es una técnica laboriosa y poco práctica para estudios serológicos a gran escala y se utiliza principalmente en aquellos casos de confirmación, ayuda a verificar resultados dudosos [155]. 2.5. EPIDEMIOLOGÍA Y CONTROL DEL VMV 2.5.1. Aspectos históricos y distribución geográfica El VMV tiene una distribución mundial resultado de la exportación de distintas razas europeas ovinas y caprinas entre diferentes regiones del planeta y así estudios filogenéticos han revelado una similitud entre los lentivirus ovinos sudafricanos y cepas inglesas como EV-1 [172]. Un clásico ejemplo de transmisión y epidemia de VMV en una población como resultado de la importación de animales vivos infectados de VMV ocurrió en Islandia en la década de 1930. Este país que hasta entonces estaba libre de la enfermedad importó 20 carneros de raza Karakul de Alemania y tras mantenerlos en cuarentena durante 2 meses sin presentar síntomas de enfermedad fueron enviados a 14 granjas alrededor del territorio islandés. Aproximadamente 6 años después se presentaron brotes en dos de los rebaños donde se había introducido un carnero infectado por rebaño y en poco tiempo quedó patente que el Maedi era una enfermedad contagiosa con un periodo de incubación largo. Esta epidemia creció rápidamente favorecida por el tipo de manejo que se practicaba en Islandia. El manejo durante el periodo invernal se caracteriza por confinar a las ovejas en espacios pequeños y cerrados y durante los meses de verano, los diferentes rebaños se encuentran en pastoreo libre hasta el mes de octubre en que las ovejas se recogen del monte y se mantienen en rediles durante 3 días. Este segundo confinamiento favoreció la segunda fase de transmisión que sufrieron los rebaños islandeses [68, 106, 204]. Los animales importados estaban también afectados de APO y al principio se asociaron las muertes a esta enfermedad exclusivamente y no fue hasta 1939 en que el Maedi se reconoció como enfermedad independiente [209] 59 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 60 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... La etiología del Maedi se describió por Sigurdsson y col. en 1960 [205] y la etiología de Visna fue descrito por Sigurdardóttir y col en 1964 [201], pero no fue hasta 1965 que Thormar y col. clasificaron al virus, como virus Maedi Visna, un sólo agente que causa los distintas signologias [223]. Otros ejemplos de transmisión del VMV por importación de animales es el de Noruega por compra de ovinos daneses, Canadá por ovinos escoceses, Hungría por ovinos de rebaños ingleses, Francia por ovinos de razas holandesas y Finlandia por importaciones suecas [172]. 2.5.2. Modos de transmisión Los ovinos y caprinos se infectan con LVPR fundamentalmente después del nacimiento por consumo de calostro y leche de ovejas infectadas y por contacto horizontal con animales infectados que excretan virus en sus secreciones pulmonares. No se sabe exactamente cual de las dos vías de transmisión es más importante aunque recientemente se ha observado que cuando la transmisión horizontal es eficiente, el riesgo de seroconversión a VMV es independiente del modo de cría natural durante la lactancia, con madre seropositiva o seronegativa a VMV [18]. 2.5.2.1. Transmisión Aerógena Puesto que los LVPR infectan principalmente monocitos y se replican en macrófagos y estos abundan en el pulmón, Houwers y col. (1990) sugieren que este órgano es una fuente de gran cantidad de virus libre e integrado [106]. La posibilidad de transmisión aerógena de VMV quedó patente en la epidemia de Islandia anteriormente descrita. Más tarde, en 1979, De Boer y col. corroboraron la posibilidad de transmisión aerógena y observaron que a mayor tiempo de exposición mayor es la severidad de las lesiones [68]. La transmisión horizontal se relaciona fuertemente con el sistema de producción ovino, el clima y la mala ventilación y en zonas donde el clima es más benévolo y el confinamiento es menor, la transmisión horizontal es menos eficiente y el VMV se transmite de manera más lenta [106]. En condiciones similares la incidencia de nuevas infecciones en un rebaño depende la proporción de animales infectados [219] y en sistemas con estabulación de la proporción de infectados y el tiempo en el que los animales permanecen estabulados [18]. 2.5.2.2. Transmisión Lactógena De Boer y col. (1979) aislaron lentivirus ovinos a partir de leche de hembras seropositivas, dos a tres meses después de la lactancia y detectaron anticuerpos específicos en los corderos que fueron amamantados con leche infectada [68]. Otros autores han demostrado también la presencia de VMV en calostro y leche [142, 208] y la posibilidad de infectar corderos y cabritos tras la ingestión de calostro con LVPR [1, 75, 196]. 60 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 61 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Aunque se desconoce la fracción de infección que es atribuible al calostro y la leche y este aspecto es parte de los estudios realizados para esta tesis, en un estudio reciente se ha observado que aproximadamente el 16% de los corderos que tomaron calostro de ovejas seropositivas, durante las primeras 24h de vida, seroconvierte como resultado de ello [4]. Generalmente la infección se atribuye a macrófagos infectados presentes en calostro y leche [154, 209]. Sin embargo, en cultivos de células epiteliales mamarias (CEM) de cabras infectadas, se ha detectado la presencia de proteínas gag y env en los sobrenadantes lo que sugiere que las células producen de forma activa partículas virales. Además de en CEM y macrófagos, se han detectado proteínas y genoma viral, en células del intestino delgado de cabras infectadas con VAEC [154]. No se sabe bien el mecanismo de infección por vía intestinal. Houwers y col. (1990) describen que el intestino del cordero se encuentra permeable durante un periodo de tiempo dejando paso a los macrófagos infectados presentes en calostro [106]. Sin embargo, los resultados de los estudios hechos por Mselli-Lakhal y col. (1999), sugieren que los CEM y las partículas virales libres, pueden llegar a contribuir a la transmisión del VAEC, ya que estas células pueden transportar el virus en CEM a células epiteliales intestinales ya que se ha observado ARN en criptas de células intestinales caprinas. Los autores sugieren que la transmisión del VAEC podría ser más efectiva cuando ocurre a través de células homólogas [154]. Así mismo Preziuso y col. (2004) observaron que el VMV en células epiteliales (CE) presentes en calostro se mantienen en corderos durante dos días y por tanto esto podría facilitar la infección. El VMV presente en CE infectan a los macrófagos presentes en la lámina propia del intestino del cordero y posteriormente infectan a las placas de Peyer hasta llegar a infectar los nódulos linfáticos mesentéricos vía linfática [176]. 2.5.2.3. Transmisión Intrauterina La opinión generalizada es que la transmisión congénita del VMV es muy poco frecuente [23, 172]. Sin embargo, se han descrito lesiones típicas de neumonía progresiva ovina (NPO) en corderos nacidos por cesárea de madres infectadas [50] y se ha aislado virus de fetos de madres seropositivas [56, 206] e incluso de una oveja seronegativa que había estado en contacto con ovejas seropositivas [56]. Por otro lado De Boer y col. (1979) analizaron 30 fetos de hembras seropositivas y no detectaron virus en ninguno de ellos [69]. Más recientemente, Brodie y col. (1994) amplificaron VMV mediante PCR en 10% de fetos de madres de un rebaño infectado y estos autores sugieren que un título viral alto en la madre puede llegar a ser un factor importante en la transmisión uterina [26]. Puesto que en ocasiones podría ser difícil establecer con total seguridad el origen de la infección en corderos neonatos, Peterhans y col.(2004) sugieren comparar las secuencias obtenidas por la técnica de PCR de fetos obtenidos por cesárea, con las secuencias virales obtenidas de virus de la madre [172]. 61 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 62 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Lamara y col. (2002) describen la replicación in vitro del VAEC en células de la granulosa y del oviducto de cabra. Sin embargo, también demostraron que la zona pelúcida del embrión actúa como protección contra el VAEC [131, 132]. 2.5.3. Otras vías 2.5.3.1. Iatrogénica No se han descrito casos de transmisión iatrogénica en la literatura científica internacional. Más aún, Dawson y col. (1987) investigaron la transmisión de VMV en rebaños infectados donde se emplearon las mismas jeringas y agujas en varios animales pero ninguno de los animales seronegativos seroconvirtió a consecuencia de ello [64]. Sin embargo la posibilidad de transmisión iatrogénica no debe descartarse aunque se considera de poca importancia epidemiológica [106]. 2.5.4. Factores de riesgo de la infección En general, el riesgo de infección a los agentes patógenos depende de factores propios del agente patógeno, del hospedador y del medio ambiente que les rodea [224]. En infecciones experimentales con LVPR la ruta de infección y la dosis de virus administrada determina el riesgo de infección [142]. La estrecha relación entre la seroconversión a VMV y el grado de contacto con animales infectados y el tiempo de estabulación en los estudios observacionales antes mencionados [18, 69] sugiere que también en condiciones de campo la probabilidad de infección es proporcional al nivel de exposición a VMV. Existe sin embargo evidencia de diferencias en susceptibilidad a la infección por lentivirus según la edad, la raza y las características genéticas de los hospedadores. En varios estudios se ha observado que la incidencia de seroconversión a VMV según la técnica de IDGA aumenta con la edad hasta aproximadamente los 3 o 4 años de edad [18, 120, 226]. Sin embargo, como ya se ha explicado anteriormente esta técnica es relativamente poco sensible y la relación entre la edad y la infección a VMV se investiga en esta tesis empleando una técnica ELISA mucho más sensible. Existe evidencia de resistencia genética a las infecciones por el VAEC [189] y el virus de la leucosis enzoótica bovina [151] asociada a determinados alelos de genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Berriatua y cols. (2003), observaron que la probabilidad de seroconversión a VMV era menor para la progenie de ovejas seronegativas de cuatro o más años de edad que para las hijas de otras ovejas [18]. Es posible que el genotipo sea responsable de las diferencias en la susceptibilidad a las infecciones por VMV observadas entre razas. 62 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 63 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA El efecto raza ha sido ampliamente estudiado. De Boer y col.(1979), encontraron que la raza ovina Texel, era muy susceptible a la infección por MV y de 10 a 20% de los animales infectados, pertenecientes a rebaños seropositivos llegaban a presentar signología clínica [69]. En 1986, Cutlip y col. observaron que la raza Border Leicester presentaba significativamente más lesiones y signología clínica, que la raza Columbia [54]. Perk y col. (1995) indicaron que la raza Awassi es muy susceptible a contraer la infección aunque aparentemente poco propensa a desarrollar la enfermedad [171]. En Islandia, Palsson y col. (1976) observaron que ovinos F1 (ovinos islandeses X Border Leiceter) parecen comportarse como resistentes a la infección [162]. Houwers y col. (1989) estudiaron un rebaño durante 10 años, integrado por Finnish Landrace (FL), Ile de France (IF) y la generación F1 del cruce de ambas. En este rebaño, la raza FL fue más susceptible al VMV que la raza IF, de modo que el porcentaje de animales seropositivos al final del estudio fue 46% (35/76) para la FL y 5,6% (1/18) para la IF [110]. Snowder y col. (1990) al final de un estudio de 10 años, no observaron una diferencia en la seroprevalencia, entre 4 razas ovinas que integraban un solo rebaño, incluidas la Polypay, Rambouillet, Columbia y Targhee, a pesar de que al inicio de la experiencia, la seroprevalencia en los ovinos de raza Rambouilet era menor [217]. En Australia, Grewal y col. (1986) observaron una menor susceptibilidad al VAEC en cabras de la raza Saanen que en cabras de las razas Nubia, Alpina y Toggenburg [94]. Así mismo, Rowe y col. (1992) reportaron una menor susceptibilidad en cabras de la raza Saanen y Toggenburg que en la raza Alpina [187]. Finalmente en varios estudios se han observado diferencias de susceptibilidad a la infección por VMV asociadas al sexo [11, 213] pero los autores coinciden en destacar que estas diferencias estarían asociadas a un desigual manejo de las ovejas y los carneros del rebaño. 2.5.5. Prevención y control Hasta la fecha, no hay tratamientos comerciales eficaces contra los retrovirus animales. En 1978, Carroll y col. (1978) observaron que el interferón in vitro, no mantenía una baja replicación viral [36], sin embargo, Juste y col. (1997), utilizando interferón-tau observaron reducción de la viremia y retraso en la aparición de síntomas en corderos infectados con VMV [115-117]. Por otro lado, se han descrito vacunas contra LVPR pero los resultados no han sido buenos [55, 106, 150, 167] y los programas de control de los LVPR van dirigidos a la erradicación del agente infeccioso [106, 147]. Los Islandeses demostraron que es posible erradicar el virus de la cabaña de un país mediante sacrificio de rebaños completos afectados por la enfermedad seguido de un periodo de vaciado sanitario y reemplazo con animales de otros rebaños libres de infección [106, 147, 163]. Además se han descrito otros dos abordajes eficaces para eliminar el VMV de rebaños infectados, y la elección de uno u otro método depende de la prevalencia de la infección, del valor genético de los animales del rebaño y de los costos que sea posible asumir. Uno de los métodos consiste en realizar análisis serológicos periódicos cada seis meses, de todos los ani63 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 64 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... males de un rebaño y sacrificar los positivos y su progenie menor de seis meses y el otro método consiste en crear un rebaño separado a partir de corderos del rebaño original separados de las madres al nacimiento y criados artificialmente para evitar la transmisión lactógena [106, 172]. El abordaje de análisis serológico y sacrificio selectivo está particularmente indicado en rebaños con prevalencia de infección baja y la razón por la que es necesario realizar análisis periódicos es porque como se ha explicado anteriormente algunos animales pueden estar infectados y no presentar anticuerpos detectables [61, 147, 180, 234]. El método alternativo de crear un segundo rebaño completamente separado del infectado con corderos criados artificialmente desde el nacimiento es oportuno en rebaños con una tasa de infección alta donde no es económicamente factible eliminar a todos los animales seropositivos y en rebaños con animales de alto valor genético. Esta estrategia es cara ya que depende de la disponibilidad de naves y terreno para mantener a dos rebaños distintos. Además, la cría artificial de corderos es laboriosa y potencialmente peligrosa si no se realiza un encalostrado adecuado de los corderos y por ello algunos autores piensan que éste método no es muy útil a nivel de campo [106, 147]. El encalostrado de los corderos durante las primeras 24 horas de vida puede hacerse con calostro bovino o con calostro ovino calentado previamente a 56°C para destruir el VMV y posteriormente se deben realizar estudios serológicos de los corderos a los 6 meses de edad y después cada 6 meses para cerciorarse de la negatividad de los animales [106, 108, 147]. Como ya se ha indicado anteriormente, la cría artificial de los corderos durante la lactancia es sólo uno de los aspectos fundamentales de este abordaje y es necesario que el nuevo rebaño no entre en contacto con el rebaño infectado para evitar la transmisión horizontal [19]. Además de estas estrategias bien conocidas, Ferrer describió un abordaje para reducir gradualmente la seroprevalencia en rebaños extensivos de rasa aragonesa, consiste en ir eliminando los animales positivos al hacer el desecho anual, o simplemente dejar recría solamente de animales negativos [81]. Más recientemente Berriatua y cols. observaron que el número de animales que seroconvirtieron en diez rebaños lecheros de raza Latxa del País Vasco durante 2-5 años fue similar o inferior al número de animales que se eliminaron del rebaño por “desvieje” durante este tiempo y la tasa de desvieje osciló entre 14-25%. Esto indica que en estos rebaños hubiese sido posible reducir la seroprevalencia gradualmente sin necesidad de aumentar la tasa de desvieje por encima de valores considerados como normales, centrando el desvieje en animales seropositivos a VMV. Como se ha comentado anteriormente en este estudio se observó además que las hijas de madres seronegativas mayores de cuatro años tuvieron menor probabilidad de seroconvertir que las hijas de otras madres indicando que existe un componente genético heredable de resistencia y susceptibilidad a la infección. La selección de la reposición entre las hijas de madres mayores seronegativas facilitaría el control del VMV en el rebaño tanto por este aspecto como por el hecho de que se evita la transmisión lactógena de madre a hija y posiblemente se reduzca la circulación de virus en el rebaño [18]. Está claro que es esencial disponer de un conocimiento preciso de los modos de transmisión de VMV, su importancia relativa y otros aspectos de la epidemiología del VMV para 64 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 65 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA poder diseñar y poner en marcha nuevas estrategias de control de VMV que estén al alcance de la mayoría de los productores de ovino de este país y otros lugares del mundo. Un aspecto previo fundamental al control del VMV es disponer de las herramientas necesarias para la identificación precisa de los animales infectados para lo que, como se ha explicado, la inherente variabilidad del VMV podría ser un factor limitante importante en el diagnóstico y control de VMV. En esta tesis se describen estudios experimentales cuyos objetivos fueron ahondar en el conocimiento de los métodos de detección y transmisión del VMV. En el primer capítulo experimental se lleva a cabo un estudio comparativo de los ensayos de PCR de LVPR más empleados en Europa, el segundo capítulo aborda la detección y transmisión de VMV en calostro de ovejas infectadas y en el tercer y último capítulo se presenta un estudio de la importancia de la transmisión horizontal en ovejas en estabulación sometidas a una presión variable de infección de VMV. 65 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 67 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA Y ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS PCRs DE LVPR MÁS EMPLEADAS EN EUROPA 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 69 3.1. INTRODUCCIÓN Como ya se explicó anteriormente disponer de una herramienta de diagnóstico de la infección por LVPR fiable es indispensable para estudiar y poner en práctica métodos de prevención y control. Hasta hace una década, las técnicas de diagnóstico disponibles para MV y AEC eran principalmente de tipo serológico basadas en la detección de anticuerpos. La técnica de referencia para la Organización Internacional de Epizootias (OIE) es todavía la IDGA que si bien tiene una especificidad del 98,3%, su sensibilidad con respecto al WB es tan sólo del 76,3% [229]. A la ausencia de anticuerpos en animales infectados se le denomina “latencia serológica” y es una característica de las infecciones LVPR que podría ser consecuencia de la patogenia de la infección y de la capacidad de los lentivirus de eludir al sistema inmune [57, 202]. Esta hipótesis es compatible con la observación de que tras la infección hay una fase de viremia corta y el VMV tiende a localizarse en células y tejidos diana minimizando su presencia como virus libre en el torrente sanguíneo donde sería más vulnerable a la respuesta inmune del hospedador [232]. Cabe decir, sin embargo que la latencia serológica también podría estar relacionada con la sensibilidad limitada de la prueba serológica de IDGA empleada en la mayoría de los estudios de la infección por LVPR. Como ya se ha comentado actualmente existen pruebas serológicas más sensibles como los ELISAs recombinantes de tercera generación [193]. En cualquier caso, expertos en la infección por LVPR opinan que es posible que ninguna prueba serológica consiga cerrar totalmente el “gap serológico” [43, 44, 193] y por ello desde su descubrimiento se ha perseguido la obtención de una PCR para el diagnóstico de VMV. Actualmente existen numerosos ensayos de PCR para el diagnóstico de VMV (Tabla 3.1), sin embargo, el éxito de la aplicación de la PCR al diagnóstico de los LVPR ha sido limitado y la sensibilidad observada en estos trabajos osciló entre un 30-100%. Aunque no está del todo claro por qué las PCRs frente a los LVPR tienen resultados tan variables podría estar relacionado con el número escaso de muestras empleadas para validar los ensayos, la poca concentración de virus en sangre, la presencia de una sola copia de los genes gag, pol, env, tat, vif y rev frente a las dos copias de LTR en fase proviral y sobre todo, por la gran diversidad genética de los LVPR [236]. Con el fin de paliar algunas de las limitaciones de los estudios de PCR realizados hasta la fecha, la Unión Europea decidió financiar en 2001 un proyecto de investigación tipo CRAFT del V Programa Marco, con el objetivo de desarrollar una PCR válida para el diagnóstico de LVPR en Europa. En este proyecto participaron 8 centros de investigación de 6 países, incluidos la Universidad de Utrecht en Holanda (UniUtr), Animal Health Services Deventer Holanda, coordinadora del proyecto el Institute Nationale de la Recherche Agricole (INRA) de Lyon, el Instituto de Agro-biotecnología y Recursos Naturales (CSIC-UPNA) de Pamplona, el Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER) de Derio, la Norwegian School of Veterinary Science (NSVM) de Oslo, la Università Degli Studi di Milano (UniMil) y la Universidad de Edimburgo (UniEdi). Cada uno de estos laboratorios trabajó en colaboración con al menos dos empresas locales del sector ganadero que facilitaron la obtención de muestras. Finalmente también participó en el proyecto el Instituto Pourquier de Lyon cuyo objetivo fue dar un formato comercial al ensayo/s desarrollado en el proyecto. 69 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 70 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Este capítulo describe el trabajo desarrollado para diseñar y validar PCRs de espectro paneuropeo con especial énfasis en el trabajo realizado en NEIKER. Tabla 3.1. Pruebas de PCR desarrolladas para el diagnóstico de SRLV entre 1992 y 2001 disponibles en la literatura científica internacional Año de Autores publicación 1992 Zanoni y Col. 1992 1993 Johnson y Col. Reddy y Col. 1993 1994 Rimstad Barlough y Col. 1995 Rosati y Col. 1997 1998 1998 Leroux y Col. Wagter y Col. Travassos y Col. 2000 2002 Celer y Col. Extramiana y Col. Región Génica LTR Gag LTR Gag Gag Gag Gag dn-PCR gag /pol Gag Pol LTR gag - p25 Env gag - p16 pol (RT-PCR) Gag Env Pol gag (sn-PCR) LTR Fracción de resultados coincidentes con la técnica de referencia empleada Positivos (Se*) Negativos (Sp*) 6/6 (100%)1 5/6 (83%)1 14/20 (70%)2 18/20 (90%)3 5/5 (100%)3 5/5 (100%)3 25/27 (93%)4 NR NR NR 3/33 (9%)3 NR NR 20/81 (25%)4 13/94 (14%)4 61/94 (65%)4 13/94 (14%)4 9/9 (100%)1 5/8 (100%)1 2/9 (22%)1 1/9 (11%)1 17/17 (100%) 3 y 4 53/60 (88%)3 y 4 5/64 (8%)4 4/64 (6%)4 21/30 (70%)3 75/90 (83%)3 y 4 5/40 (13%)4 NR NR NR NR NR NR NR 1/9 (11%)3y4 NR NR 6/68(9%) 3 1/25 (4%) 3 y 4 Cultivo celular 2 Hibridación In situ 3 IDGA 4 ELISA 1 Se* y Sp*: sensibilidad y especificidad relativa NR: no realizado dn: Doble Anidada sn: Anidada 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.1. Abordaje experimental El abordaje inicial propuesto para seleccionar una PCR de espectro paneuropeo fue crear un banco de muestras de ovinos infectados y no infectados de LVPR, estudiar la variabilidad genética de virus de distintos orígenes geográficos y crear cebadores para regiones génicas conservadas en los aislados víricos de los distintos países. En caso de que no se observasen secuencias suficientemente conservadas se planteó como segunda alternativa comparar ensayos de PCR disponibles en los laboratorios participantes en el proyecto empleando las muestras del banco de muestras creado en la fase inicial del proyecto. 70 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 71 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... 3.2.2. Obtención del banco de muestras de sangre El objetivo inicial fue que cada laboratorio reuniese entre 50-100 muestras de pequeños rumiantes (PRu) no infectados y entre 100-250 muestras de PRu infectados. El criterio elegido para establecer el estado de infección de los animales fue el estado de seropositividad según un ELISA-i recombinante de tercera generación. En NEIKER se evaluó además el estado de infección de algunos animales empleando la PCR que amplifica un fragmento de las secuencias LTR del provirus integrado siguiendo el protocolo de Extramiana y col. (2002) [79]. Con el fin de seleccionar muestras para el banco de muestras, NEIKER realizó un sondeo serológico en 10 rebaños de ovejas lecheras de raza Latxa y 5 rebaños de cabras de raza Saanen y Murciano-Granadina de las 3 provincias de la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV) (Figura 3.1). La selección de los rebaños se basó en el conocimiento previo de la existencia/ausencia de infección de LVPR en los rebaños y en la predisposición del ganadero a colaborar en el estudio. De este modo se clasificaron en 3 grupos denominados A, B y C. En el Grupo A se incluyeron 7 rebaños ovinos supuestamente seropositivos, en el Grupo B se incluyeron 3 rebaños ovinos, presumiblemente seronegativos y en el Grupo C, se incluyeron 5 rebaños caprinos que se sospechaba que eran seropositivos al VAEC (Tabla 3.2). Figura 3.1. Ubicación geográfica de los rebaños seleccionados (1,3 y 11 Arkaute, 2 y15 Markina-Xemein, 4 Antzuola, 5 Zestoa, 6 Legazpia, 7 Oñati, 8 y 9 Beizama, 10 Muskiz, 12 Derio, 13 Tolosa, 14 Gaintza) En los rebaños del grupo A se tomaron un gran número de muestras sobre todo de animales menores de un año del rebaño experimental de NEIKER en Arkaute (A1), que participaban en un experimento de transmisión de LVPR por calostro [4]. De los rebaños del grupo B supuestamente negativos se tomaron muestras de todos los animales con el fin de comparar la ausencia de animales infectados y de los rebaños restantes se tomaron de 6 a 32 muestras de animales elegidos al azar. 71 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 72 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Tabla 3.2. Rebaños ovinos y caprinos seleccionados para crear un banco de muestras Grupo Especie Población Provincia Num. de muestras Estado serológico sospechado A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 Ovino Ovino Ovino Ovino Ovino Ovino Ovino Arkaute-G Markina Arkaute-A Antzuola Zestoa Legazpia Oñati A V A G G G G 186 15 10 21 6 6 6 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Total B8 B9 B10 250 Ovino Ovino Ovino Beizama-o Beizama-l Muskiz G G V Total C11 C12 C13 C14 C15 306 140 255 Negativo Negativo Negativo 701 Caprino Caprino Caprino Caprino Caprino Arkaute Derio Tolosa Gaintza Markina A V G G V Total 30 8 30 32 30 Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo 130 A= Álava V= Vizcaya y G= Guipúzcoa 3.2.3. Obtención de suero y realización del ELISA En NEIKER se empleó un ELISA-i comercial de tercera generación “ELITEST” [193] cuyos componentes y fases de reacción se esquematizan en la Figura 3.2. Los sueros se homogeneizaron en un agitador y se realizaron 3 diluciones consecutivas (1:10, 1:100 y 1:500) con diluyente de la muestra, añadiendo 100 µl de la última dilución a cada pocillo de la placa de ELISA. A continuación se recubrió la placa con parafilm, se agitó suavemente hasta homogeneizar y se incubó en una estufa a 37°C durante 1 hora. Tras la incubación se decantó el contenido de la placa con un volteado seco para impedir que se mezclaran los sueros. Seguidamente, se llevó a cabo el lavado de los pocillos cinco veces seguidas añadiendo 200 µl de solución de lavado (SDL) a cada pocillo, vaciando la placa con un volteado seco en cada ocasión. Tras los lavados, el exceso de líquido se eliminó mediante algunos golpes sobre papel secante. A continuación se preparó una dilución 1:10 del conjugado con diluyente del conjugado y se añadieron 100 µl de dilución a cada pocillo. Tras una nueva incubación a 37°C durante otra hora, se lavó la placa 5 veces con SDL de la misma forma que se ha descrito en el paso anterior. Seguidamente se preparó el sustrato tetrametil benzidina en sulfóxido de dimetilo, a una dilución 1:10 en tampón de sustrato y se añadieron 100 µl de esta dilución a cada pocillo, tapando la placa y dejándola incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez transcurridos, la reacción se paró añadiendo 100 µl de ácido sulfúrico 2M a cada pocillo. 72 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 73 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... La lectura se efectuó en un lector ELISA (Labsystems Multiskan MS) a dos absorbancias distintas: 450 nm y 570 nm. Para calcular el índice ELISA de cada suero, se determinó previamente el punto de corte, cuyo valor fue la densidad óptica (DO) del control positivo (P) menos la DO del control negativo (N) dividido entre cuatro más la densidad óptica del control negativo según la fórmula (P-N)/4+N. El suero se consideró como positivo si su densidad óptica era mayor o igual que el punto de corte y negativo si el valor de su DO era menor que el punto de corte1. Figura 3.2. Esquema de los pasos a seguir en el ELISA Indirecto ELITEST 3.2.4. Obtención de células blancas Se empleó el método de cloruro de amonio para obtener las células blancas de sangre periférica según describe Extramiana y col. (2002) [78]. Se partió de 5 ml de sangre con EDTA que se traspasó a 2 tubos estériles de polipropileno de 15 ml. A continuación se añadió cloruro de amonio estéril al 0,83% a una proporción 1:1 para lisar los glóbulos rojos, se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de una centrifugación a temperatura ambiente a 2.000 g (Megafuge 1,0 Haraeus) durante 10 minutos. Una vez obtenidas las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se lavaron dos veces con PBS y se dividieron a partes iguales en dos tubos de 1,5 ml de polipropileno, con 2 ml de PBS. Tras centrifugar los viales a 14.000 g en microcentrífuga (Biofuge Heraeus) durante 1 minuto, se decantó el sobrenadante y se almacenaron los PBMC a -20°C. 3.2.5. Obtención de ADN Se purificó el ADN siguiendo el método de fenol-cloroformo isoamílico [194]. Se resuspendieron los PBMC en 400 µl de TE tras lo cual se procedió a realizar una digestión protéica con proteinasa K (200 µl/ml) y SDS 1%. Incubando la muestra a 56°C durante 1 hora, y agitando cada 15 minutos. Al finalizar, se inactivó la proteinasa K a 96°C durante 10 minutos. A continuación se añadió, fenol-cloroformo-alcohol isoamílico 1:1:1 para separar los ácidos nucleicos, agitando la mezcla hasta homogeneizarla. Seguidamente se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. Al finalizar, se obtuvo la fase acuosa con los ácidos nucleicos (parte superior), y se le añadió cloroformo iso1 El control positivo se debe encontrar entre el rango de 0,5 y 1,0 y el control negativo entre 0,02 y 0,1 73 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 74 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... amílico a partes iguales, la muestra se agitó y se volvió a centrifugar siguiendo los mismos pasos anteriores, obteniendo la fase acuosa (parte superior). A continuación se añadieron 1,5 ml de etanol al 100% y acetato sódico y se incubó durante 24 horas a –20 °C con el fin de precipitar el ADN. Al término de las 24 horas, la muestra se centrifugó durante 20 minutos a 14.000 g decantando el sobrenadante y se realizaron 2 lavados con etanol al 75% centrifugando 14.000 g por 10 minutos. A continuación se decantó el etanol dejando los tubos boca abajo con el fin de secar los ácidos nucleicos durante 1 hora. Una vez secada la muestra se diluyó en 20 µl de agua estéril y se mantuvo a 56°C durante 10 minutos. Se trabajó con controles de extracción, sustituyendo el ADN con TE, para detectar contaminación. Las muestras se almacenaron a –20°C hasta el momento de necesitarlas. 3.2.6. Concentración y pureza de ADN Se midió la pureza y la concentración del ADN extraído con un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop technologies). Se tomaron 2 µl de muestra, calculando la pureza con el ratio de absorbancia 260/280nm, siendo que la longitud de onda 260 detecta ADN y la longitud de onda a 280 detecta proteínas. Un ratio de ~1.8 es aceptado como ADN puro, mientras que un ratio menor indica que el ADN presenta proteínas, fenol u otras contaminaciones. La concentración de ADN, se calculó multiplicando la A260 por la constante de análisis que en el caso de ADN es de 50 (Concentración = A260X50) [194]. 3.2.7. Secuenciación de aislados de LVPR Las tareas de secuenciación y estudio de la variabilidad genética de los aislados de LVPR las llevaron a cabo la UniUtr y el INRA empleando secuenciadores automáticos. Con este fin se pidió que cada laboratorio participante en el proyecto enviase 25 muestras de ADN de células sanguíneas de 20 animales infectados y 5 no infectados. En NEIKER se llevó a cabo un estudio de la variabilidad genética en las secuencia diana de los cebadores desarrollados por los distintos grupos del proyecto CRAFT y las publicadas en Genbank (htt://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) incluidas la NC_001452 (Virus Visna), NC_001511 (SA-OMV), M31646 (SA-OMV), M60610 (Islándica), M10608 (Islándica), S51392 (EV-1) y NC_001463 (VAEC). 3.2.8. Análisis estadístico Se empleó la técnica de chi-cuadrado de Yates para comparar proporciones en EpiInfo 6.0 (CDC, Atlanta) y se calculó el coeficiente kappa para medir el grado de concordancia entre dos técnicas según Dohoo y col. (2003) [72]. Se tomó un nivel de significancia del 5% (p<0,05). 74 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 75 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... 3.2.9. Ensayos PCR 3.2.9.1. Estrategias de comparación de ensayos En la comparación de los distintos ensayos de PCR participaron los centros de investigación de Pamplona, Derio, Oslo, Milán, Utrecht, Deventer y Edimburgo y se realizó en tres estadios cronológicos. Inicialmente cada laboratorio envió cinco muestras de ADN, cuatro de animales infectados y una de un animal negativo, a los demás laboratorios con el fin de probar la PCR propia en muestras de los demás laboratorios. Para la segunda y tercera fase, el Instituto Pourquier desarrolló y envió a cada centro un “kit” que incluía los reactivos de cada una de las PCRs comparadas para probar con muestras de ADN propias. En la segunda fase se compararon los cinco pares de cebadores (“Kit-1”) que se describen en el siguiente apartado y se solicitó que se probasen en 10 muestras positivas y 5 negativas. En la tercera fase se seleccionaron los tres pares de cebadores que tuvieron el mayor porcentaje de amplificaciones correctas en la segunda fase (“Kit-2”) y se solicitó a cada laboratorio que se ensayaran en 20 muestras positivas y 20 negativas. Además de los ensayos descritos anteriormente, Derio y Pamplona compararon sus respectivas PCRs, la LTR y la POL, con otras 222 muestras tomadas de corderos al nacimiento y a los 15, 30, 90, 180 y 300 días de edad, pertenecientes al ensayo de transmisión de calostro antes mencionado [4] (Tabla 3.2 grupo A1). 3.2.9.2. Tipos de ensayo de PCR Se evaluaron cinco ensayos de PCR distintos incluídos tres descritos en publicaciones internacionales y empleados rutinariamente por Lyon (Gag 1-PCR), Oslo (Gag 4- PCR), Derio (LTR-PCR) y Pamplona (POL-PCR), y dos ensayos diseñados a partir de los trabajos de secuenciación de este proyecto (Gag 2-PCR y Gag 3-PCR). El nombre, origen, secuencia diana, posición y tamaño del amplificado se presentan en la (Tabla 3-3) Como puede apreciarse los ensayos diseñados en el proyecto, el Gag 1,2 y de Lyon y el Gag 4- PCR de Oslo amplifican fragmentos de la región gag mientras que los ensayos de Derio y Pamplona amplifican secuencias LTR y pol, respectivamente. El tamaño de los amplicones osciló entre las 113 pb del Gag 4 y las 520 pb del Gag 1. Cabe señalar que los cebadores diseñados en Lyon incluyen posiciones degeneradas señaladas con las letras “D”, “M”, “N”, “R” e “Y” en las que se incluyen mezclas de nucleótidos en diferentes proporciones para facilitar la unión de los cebadores a posiciones hipervariables (Tabla 3.3). 3.2.9.3. Condiciones y formato de reacción de PCR La concentración de reactivos, el número de ciclos y temperatura de desnaturalización, hibridación y elongación de las PCRs empleadas se describen en la Tabla 3.4. En los dos 75 76 Pamplona POL pol LTR gag gag gag gag 218pb 291pb 113pb 150pb 405pb 520pb POL R 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 T C C C G A A T T T G T T T C T A C C C A T A G T A A A T G G C A T C A A G A T G C POL F 58,0°C 57,0°C C C A C G T T G G G C G C C A G C T G C G A G A 75,0°C T G A C A C A G C A A A T G T A A C C G C A A G 64,5°C LTR F LTR R G G C A T C A T G G C T A A T A C T T C T A A Oslo R 50,2°C 58,7°C C A A A C A G T G G C A A T G C A G C A T G Oslo F 65,0°C D A G N C C A T G C T G C A T D G C Y A C T G T 58,0°C T G A C A G A A G G R A A T T G T Y T R T G G Craft F 58,0°C Gin3-R C C A Y A R A C A A T T Y C C T T C T G T C A Craft R 61,0°C G M T A G A G A C A T G G Y G A G G C A R G Gin5-F 61,0° Tm D A G N C C A T G C T G C A T D G C Y A C T G T 58,0°C G M T A G A G A C A T G G Y G A G G C A R G Secuencia (5’- 3’ ) Gin3-R Gin5-F Tamaño Cebador de amplicón N= A+C+T+G R= A+G Y= C+T M= A+C D= A+T+G Derio Lyon Gag 3 LTR Lyon Gag 2 Oslo Lyon Gag 1 Gen Diana 09:58 Gag 4 Origen 2/3/06 Nombre Tabla 3.3. Cebadores empleados 01 TESIS 57 Página 76 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... “Kits”, las condiciones de desnaturalización, hibridación y elongación se mantuvieron flexibles y nuestro protocolo utilizó 40 y 50 ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación en las PCR del “Kit-1” y “Kit-2”, respectivamente y temperaturas y tiempo de hibridación de 60°C y 30 segundos para el “Kit-1” y de 55°C y 30 segundos para e “Kit-2”. El “Kit-1” incorporaba un “Primer Mix 5X” que contenía buffer con dNTPs pero no MgCl2 y 6 pares de cebadores (Gag 1,Gag 2,Gag 3, Gag 4,POL y LTR), mientras que en el “Kit-2” el “Pimer Mix 2X” incluía también MgCl2 y 3 pares de cebadores (Gag 3, Gag 4 y LTR) (Tabla 3.4). 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 77 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... Tabla 3.4. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y temperaturas de reacción Protocolo LTR Concentración Final Volumen Ciclos Temperatura Buffer 1X 2,5 µl 1 96°C/3’ dNTPs 200µM 0,2 µl 50 94°C/30’’ Mg2Cl 2,5µM 1,25 µl Cebador 1 0,4µM 0,5 µl Cebador 2 0,4 µM 0,5 µl Taq Polimerasa 2,5U 0,2 µl ADN 500ng 5,0 µl Reactivos Agua “Kit-1” 72°C/10’ 50 µl 1X 10 µl 1 95°C / 5’ Mg2Cl (25mM) 2,5mM 5 µl 40-50 95°C / 30’’ Cebador 1 (100µM) 0,4µM 0,2 µl 60°C / 30’’ Cebador 2 (100µM) 0,4µM 0,2 µl 72°C / 40’’ Polimerasa (5U/µl) 2,5 U 0,5 µl ADN 500ng 5,0 µl Agua PCR Mix 2X ( Buffer, dNTPs 0,5mM, Mg2Cl (4mM)* Cebadores (0,8 µM) 1 72°C / 10’ 29,1 µl Volumen total “KIT-2” 1 14,85 µl Volumen total PCR Mix 5X (Buffer, dNTPs 1mM) 70°C/1’30’’ 50 µl 1X 12,5 µl 1 95°C / 5’ Polimerasa (2U/µl) 2,5U 0,5 µl 50 95°C / 30’’ ADN 500ng 5,0 µl 55°C / 30’’ Agua 7,0 µl 72°C / 40’’ Volumen total 25 µl 1 72°C / 10’ * La concentración de MgCl2 se aumentó a 3,0mM en un segundo ensayo. 3.3. RESULTADOS 3.3.1. Banco de muestras De las 1.081 muestras de PRu analizadas mediante ELISA 237 muestras fueron positivas. Se realizó la LTR-PCR en 59 muestras ELISA positivas, incluidas 39 de ovejas y 20 de 77 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 78 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... cabras. Se obtuvo producto de amplificación en 37/59 muestras y las restantes 22 fueron LTRPCR negativas (Tabla 3.5). Finalmente se mandaron a la Universidad de Utrecht para su secuenciación, 25 muestras de ADN a una concentración final de 1,500ng 20 de ellas ELISA y LTR-PCR positivas y 5 ELISA y LTR-PCR negativos (Tabla 3.5). Tabla 3.5. 1.5 Resultados de ELISA y PCR para la selección de muestras a enviar a la Universidad de Utrecht e INRA de Lyon para secuenciación y estudio de variabilidad genética Grupo + – Número muestras ELISA positivas seleccionadas Resultados ELISA Núm. de animales LTR y ELISA positivas Núm. muestras enviadas para secuenciación LTR+ LTR– A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 186 15 10 21 6 6 6 61 15 10 6 6 6 6 125 0 0 15 0 0 0 3 6 6 6 6 6 6 3/3 4/6 5/6 3/6 5/6 4/6 4/6 2 2 2 2 2 2 2 – – – – – – – Tot.A 250 110 140 39 28/39 14 – B8 B9 B10 306 140 255 41 4 0 265 136 255 – – – – – – – – – – – – Tot.B 701 45 656 – – – – C11 C12 C13 C14 C15 30 8 30 32 30 29 1 26 25 1 1 7 4 7 29 6 1 6 6 1 3/6 0/1 4/6 2/6 0/1 2 – 2 2 – – – 2 2 1 Tot. C 130 82 48 20 9/20 6 5 Total 1.081 237 844 59 37/59 20 5 3.3.2. Secuenciación de ADN y diseño de cebadores Los trabajos de secuenciación realizados por Utretch y Lyon permitieron diseñar un par de cebadores de la región gag de un tamaño de 23 bases para el cebador Craft F y de 23 bases para el cebador Craft R. Estos cebadores no se diseñaron para trabajar juntos y el cebador superior Craft F se empleó con el cebador Gin3-R y el cebador Craft-R se utilizó con el cebador Gin5-F. El tamaño de los amplicones fue de 150 pb y 405 pb para los cebadores Gag 3 y Gag 2, respectivamente(Tabla 3-3). 78 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 79 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... 3.3.3. Ensayos de LTR-PCR en las muestras europeas intercambiadas En Derio se recibieron 15 muestras de ADN 4 positivas y 1 negativa de cada uno de los laboratorios de Pamplona, Lyon y Utrecht. No fue posible realizar los ensayos con las muestras de Utrecht por presentar una baja concentración de ADN. La proporción de LTR-PCR positivos en las muestras de Pamplona y Lyon fue 2/4 y 4/4, respectivamente. Por otro lado todas las muestras negativas enviadas fueron LTR-PCR negativas. 3.3.4. Ensayos de PCR con el “Kit-1” en las muestras locales Para evaluar la sensibilidad y especificidad del “Kit-1”, se emplearon un total de 779 muestras de ADN de oveja, incluidas 597 ELISA y PCR positivas y 182 ELISA y PCR negativas de los laboratorios de Derio, Oslo, Milán, Utrecht. Tabla 3-6. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios del proyecto empleando las PCRs en el “Kit-1” con muestras locales Fracción de resultados coincidentes Centro Cebadores Positivos (%) Negativos (%) Derio Gag 2 Gag 3 Gag 4 POL LTR 0/10 (0) 0/10 (0) 1/10 (10) 5/10 (50) 5/10 (50)* 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) Oslo Gag 1 Gag 2 Gag 3 Gag 4 POL LTR 0/50 (0) 7/50 (14) 1/50 (2) 25/50 (50) 17/50 (34) 2/50 (4) 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100) Milán Gag 1 Gag 2 Gag 3 Gag 4 POL LTR 0/15 (0) 0/15 (0) 0/15 (0) 8/86 (9) 0/15 (0) 22/63 (35) 10/10 (100) 10/10 (100) 10/10 (100) 10/10 (100) 10/10 (100) 10/10 (100) Utrecht Gag 1 Gag 2 Gag 3 Gag 4 POL LTR 4/7 (57) 7/9 (78) 3/10 (30) 4/8 (50) 2/4 (50) NI 2/2 (100) 1/1 (100) 1/1 (100) 2/2 (100) 1/1 (100) NI Total Gag 1 Gag 2 Gag 3 Gag 4 POL LTR 7/72 (10) 14/84 (17) 4/85 (5) 38/154 (25) 24/79 (30) 29/123 (24) 27/27 (100) 31/31 (100) 31/31 (100) 31/31 (100) 31/31 (100) 30/30 (100) 116/597 (19) 182/182 (100) Total * La sensibilidad aumentó a 8/10 al incrementar el número de ciclos de PCR de 40 a 50. NI: no se dispone de información. 79 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 80 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... El número de muestras empleadas para validar las PCRs varió según el laboratorio y la PCR empleada (Tabla 3.6). Aunque estaba previsto emplear 10 muestras positivas y 5 negativas por ensayo, el rango de muestras empleadas osciló entre las 86 muestras positivas de Milán para probar la Gag 4-PCR y la única muestra negativa que empleó Utrecht para probar la mayoría de las PCRs. La proporción de resultados coincidentes varió según la PCR, el laboratorio y el estado de VMV de la muestra (Tabla 3.6). El porcentaje de resultados coincidentes fue 100% en las muestras negativas y mucho menor en el caso de las muestras positivas. Las proporciones más altas para cada PCR y laboratorio en muestras positivas fueron 50% en Derio y 35% en Milán para la LTR, 50% en Derio y Utrecht y 34% en Oslo para la POL, 50% en Oslo y Utrecht para la Gag 4-PCR, 78% en Utrecht para la Gag 2-PCR, 57% en Utrecht para la Gag 1-PCR y 30% en Utrecht para la Gag 3-PCR. En conjunto la proporción de resultados positivos coincidentes fue numéricamente más alta para la POL-PCR, seguida de la Gag 4-PCR, LTR-PCR y la Gag 2-PCR (Tabla 3-6). Estadísticamente, sin embargo la proporción de resultados coincidentes fue similar para las PCRs Gag 1-PCR, Gag 2-PCR y Gag 3-PCR (p>0,05) pero mayor para la Gag 4-PCR que para la Gag 3-PCR (p<0,05). 3.3.5. Ensayos de PCR con el “KIT-2” Para realizar este experimento se seleccionaron las PCRs de Derio (LTR-PCR), Oslo (Gag 4-PCR) y Craft (Gag 3-PCR). A pesar de que los resultados con la POL fueron comparativamente buenos, los investigadores de Pamplona decidieron desestimar su inclusión en el “Kit-2” por haber comprobado en su laboratorio que carecía de la aparente sensibilidad que había demostrado en el “Kit-1”. Estos resultados se confirmaron posteriormente en los ensayos de comparación de la LTR-PCR y POL-PCR realizados en Derio y Pamplona que se describen en el apartado 3.3.6. En el ensayo “Kit-2”, se emplearon un total de 703 muestras, 583 muestras de ADN ovino y 120 muestras de ADN caprino. 339 muestras fueron ELISA y PCR positivas y 364 muestras ELISA y PCR negativas de los laboratorios de Derio, Oslo, Pamplona, Milán, DeventerUtrecht y Edimburgo. Al igual que en el ensayo “Kit-1”, el número de muestras empleadas para la validación varió entre los distintos laboratorios. En este experimento, el número de muestras positivas y negativas previstas eran 20 positivas y 10 negativas por ensayo, pero el rango de muestras empleadas osciló entre las 96 muestras positivas de Deventer-Utrecht para probar la LTR y 6 muestras negativas que empleó Edimburgo para probar la Gag 3-PCR (Tabla 3.7). El porcentaje de resultados coincidentes en muestras negativas no alcanzó el 100% en todos los laboratorios como con el “Kit-1” y el porcentaje osciló entre el 80-100% en la mayoría de los laboratorios y ensayos pero fue 25% y 65% en Edimburgo con la Gag 4-PCR y en Oslo con la Gag 3-PCR, respectivamente. En conjunto la proporción de resultados negativos coincidentes fue 93% para la LTR-PCR, 86% para la Gag 3-PCR y 82% para la Gag 4-PCR. 80 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 81 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... El porcentaje de resultados coincidentes en muestras positivas varió también según los laboratorios y ensayos. Así, el porcentaje osciló entre el 15% de la Gag 4-PCR en Derio y el 100% de la Gag 4-PCR y LTR-PCR en Edimburgo. En conjunto el porcentaje de resultados coincidentes en muestras positivas fue 78% para la LTR-PCR, significativamente superior que para la Gag 3-PCR y la Gag 4-PCR que fue 52% y 43%, respectivamente. Sin embargo la LTR-PCR tuvo el menor porcentaje de resultados positivos coincidentes en las pocas muestras de caprino analizadas. Tabla 3.7. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios del proyecto empleando las PCRs en el “Kit-2” con muestras locales Fracción de resultados coincidentes (%) Centro Cebadores Especie Positivos Negativos Derio Gag 3 Gag 4 LTR O O O 8/20 (40) 3/20 (15) 13/20* (65) 10/10 (100) 10/10 (100) 10/10 (100) Oslo Gag 3 Gag 4 LTR C C C 17/20 (85) 11/20 (55) 8/20 (40) 13/20 (65) 16/20 (80) 18/20 (90) Pamplona Gag 4 LTR O O 12/20 (60) 19/20 (95) 16/20 (80) 16/20 (80) Milán Gag 3 Gag 4 LTR O O O 7/20 (35) 4/20 (20) 14/20 (70) 20/20 (100) 20/20 (100) 17/20 (85) Deventer LTR O 81/96 (84) 144/152 (95) Edinburgh Gag 3 Gag 4 LTR O O O 3/7 (43) 8/8 (100) 8/8 (100) 5/6 (83) 2/8 (25) 8/8 (100) Total Gag3 Gag4 LTR O O O 35/67 (52) 38/88 (43) 143/184 (78) 48/56 (86) 64/78 (82) 213/230 (93) * 14/20 con una concentración de MgCl2= 2,5mM O = Ovino y C = Caprino 3.3.6. Comparación de LTR-PCR (Derio) y POL-PCR (Pamplona) 3.3.6.1. Porcentaje de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA positivos Para la comparación de los ensayos de PCR se utilizaron 222 muestras de 140 corderos tomadas al nacimiento y a los 15, 30, 90, 180 y 300 días de edad. Entre ellas, 84 muestras correspondían a corderos de 15 a 180 días de edad que habían tomado calostro de oveja sero81 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 82 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... positiva durante las primeras 24 horas de vida y no se emplearon para comparar las PCRs con el ELISA, quedando 138 muestras para analizar conjuntamente los tres ensayos. Como puede observarse en la Tabla 3.8, la LTR-PCR detectó animales positivos desde el nacimiento hasta los 300 días, mientras que las técnicas POL-PCR y ELISA detectaron animales positivos a partir de los 15 días. En conjunto el porcentaje de positivos varió según las técnicas y fue 22% (49/222) con la POL-PCR, 46% (102/222) con la LTR-PCR y 18% (25/138) con el ELISA (p<0,05) (Tabla 3.8). En la selección de 138 muestras el porcentaje de muestras positivas con POL-PCR y LTR-PCR fue 9% y 39%, respectivamente (p<0,05) (Tabla 3.8). La proporción de LTR-positivos según la edad de los animales tiene un carácter bimodal con un pico entre los 0 y 30 días de edad y otro posterior a los 300 días. Por el contrario la POL-PCR y el ELISA apenas detectaron positivos antes de los 300 días y la proporción de positivos por POL-PCR y LTR-PCR a los 300 días fue 42% y 50%, respectivamente. Tabla 3.8. Proporción de positivos a las técnicas LTR-PCR, POL-PCR y ELISA en muestras de corderos del rebaño experimental Arkaute tomadas entre el nacimiento y los 300 días de edad Días Muestras analizadas por PCR y no por ELISA (n=222) Muestras analizadas por PCR y ELISA (n=138) LTR POL ELISA LTR POL 0 15 30 90 180 300 5/9 (56) 16/21 (76) 18/27 (67) 16/42 (38) 34/97 (35) 13/26 (50) 0/9 (0) 3/21 (14) 6/27 (22) 4/42 (10) 25/97 (25) 11/26 (42) 0/9 (0) 1/9 (11) 0/15 (0) 1/31(3) 2/48 (4) 21/26 (81) 5/9 (56) 5/9 (56) 12/15 (80) 11/31 (36) 8/48 (17) 13/26 (50) 0/9 (0) 0/9 (0) 0/15 (0) 1/31 (3) 0/48 (0) 11/26 (42) Total 102/222 (46) 49/222 (22) 25/138 (18) 54/138 (39) 12/138 (9) 3.3.7. Grado de concordancia entre las técnicas La comparación por parejas de las técnicas PCR y ELISA indicó la existencia de un elevado número de resultados discordantes. En consecuencia, el coeficiente de concordancia kappa (k) fue regular (k=0,25± 0,06) entre la LTR-PCR y la POL-PCR, moderada entre la POLPCR y el ELISA (k=0,58±0,08) y baja entre la LTR-PCR y el ELISA (k=0,2) (Tabla 3.9). El grado de concordancia entre la LTR-PCR y la POL-PCR fue particularmente pobre antes de los 180 días, bueno a los 180 días (k=0,59±0,10) y regular a los 300 días (k=0,40±0,19). El grado de concordancia entre la POL-PCR y el ELISA fue pobre antes de los 300 días y moderado a los 300 días (k=0,43±0,16). No se observaron diferencias en el grado de concordancia entre la LTR-PCR y el ELISA según la edad (Tabla 3.9). 82 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 83 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... Sin embargo, al comparar las técnicas teniendo en cuenta el resultado acumulado de PCR y el de ELISA a los 300 días en los 26 corderos analizados, el grado de concordancia entre el ELISA y las PCRs mejoró y los valores de kappa fueron k= 0,35± 0,20 para ELISA y LTR-PCR, k= 0,44± 0,18 para ELISA y POL-PCR (Tabla 3.10). Tabla 3.9. Resultados discordantes y kappa entre los ensayos de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA Edad LTR/Pol Pol/ELISA POL+ POLELISA- ELISA+ LTR/ELISA Días LTR+ POL - LTRPOL+ κ 0 15 30 90 180 300 5 13 16 14 13 5 0 0 4 2 4 3 <0,2 0,09 <0,2 0,06 0,59 0,40 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 2 8 <0,2 <0,2 <0,2 <0,2 <0,2 0,43 5 5 12 11 8 3 0 1 0 1 2 9 <0,2 <0,2 <0,2 <0,2 <0,2 0,07 Total 66 13 0,25 1 12 0,58 44 13 0,03 κ LTR+ LTRELISA- ELISA+ κ κ = Kappa Tabla 3-10. Resultados entre los ensayos LTR y ELISA a los 300 días Días 300 Número de Muestras 26 LTR / ELISA LTR+ ELISA– LTR– ELISA+ LTR– ELISA– LTR+ ELISA+ Con Disc Kappa 3 4 4 15 73 27 0,35 POL / ELISA 300 26 POL+ ELISA– POL– ELISA+ POL– ELISA– POL+ ELISA+ Con Disc Kappa 1 6 6 13 73 27 0,44 3.3.8. Variabilidad genética en los cebadores del proyecto Craft 3.3.8.1. Cebadores Gin5-F y Gin3-R El cebador Gin5-F presenta 3 posiciones degeneradas, una en el nucleótido 2 necesaria para cubrir la variabilidad descrita en esa posición, pero otras dos en el nucleótido 14 y 21 innecesarias dado que se trata de posiciones conservadas en las siete secuencias analizadas. Por el contrario, el cebador no aparece degenerado en la posición 17 en la que se observa variabilidad con hasta 3 bases distintas en las 7 secuencias disponibles en GenBank (Figura 3.3). 83 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 84 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... El cebador Gin3-R presenta 4 posiciones degeneradas para abarcar la gran variabilidad descrita en la zona de hibridación. Sin embargo en la posición 22 aparece una variación en una de las secuencias que no se ha considerado a la hora de diseñar el cebador, su localización en el extremo 3’ del cebador sugiere que podría dar lugar a problemas de amplificación (Figura 3.4). Gin5-F NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ G M T - C - A - A - C - C - A - A 1 2 3 A G - - - - - - - 4 5 A 6 G A - - - - - - - 7 8 C 9 A T G G - - - - - - - - - - - - - - 10 11 12 13 Y G A C C C C C C C 14 15 16 G A C C A A A G 17 G C A - - - - - - - - - - - - - - 18 19 20 3’ R G A A A A A A A 21 22 R= A+G, Y= C+T, M= A+C Figura 3.3. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin5-F en el gen gag Gin3-R NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ D A G A - A - A - A - A - A - G - 1 2 3 N C C A T G C T G T - - - - - - - T - - - - - - - T - - - - - - - T - - - - - - - T - - - - - - - G - - - - - - - G - - - - - - - 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C 13 A 14 T 15 D T T T T T A T 16 G 17 C 18 Y C T T C C C T 19 A 20 C 21 T A 22 G 23 3’ T 24 N= A+C+T+G, Y= C+T, D= A+T+G Figura 3.4. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin3-R en el gen gag 3.3.8.2. Cebadores Craft F y Craft R El cebador Craft F presentó 3 posiciones degeneradas en los nucleótidos 11,18 y 20, sin embargo la variación sólo se presenta en estas posiciones en la secuencia caprina (NC_001463). Así mismo en el nucleótido 14 sólo sería complementaria a 3 de las 7 secuen- Craft F NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ T G - - - - - - - 1 2 A C A G A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 4 5 6 7 A G G - - - - - - - - - - - - - - 8 9 10 R A A G - G - G - G - G - G - A - 11 12 13 T T G T Y T R T T - - - C - A C - - - C - A C - - - C - A C - - - C - A T - - - C - A C - - - C - A T - - - A - T 14 15 16 17 18 19 20 21 R= A+G, Y= C+T Figura 3.5. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft F en el gen gag 84 3’ G G - - - - - - - 22 23 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 85 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... cias (Figura 3.5). Algo similar sucede con el cebador Craft R, que contiene 3 posiciones degeneradas para incluir las variaciones debidas a la secuencia caprina. El nucleótido 10 no hibridaría con 3/6 secuencias ovinas. En cualquier caso al tratarse de una posición central del cebador su influencia en la amplificación sería mucho menor (Figura 3.6). Craft R NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ C C - - - - - - - 1 2 A Y A R A - T - G - T - G - T - G - T - G - T - G - T - G - T - A 3 4 5 6 7 C A A T T - - - - - - G - - - G - - - - - - - - - - - G - - - - - 8 9 10 11 12 Y C C T T C T C - - - - - C - - - - - C - - - - - C - - - - - C - - - - - C - - - - - T - - - - - 13 14 15 16 17 18 19 3’ G T C A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 20 21 22 23 R= A+G, Y= C+T Figura 3.6. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft R en el gen gag 3.3.8.3. Cebadores OsloF y OsloR El alineamiento de las 7 secuencias de LVPR con la secuencia de los cebadores de Oslo, mostró homología en todas las bases del cebador OsloF excepto una en la posición 10 donde se observa variabilidad en 2/6 secuencias ovinas y en la secuencia caprina (Figura 3.7), mientras que en el cebador Oslo R se observó falta de homología en hasta cuatro posiciones. (Figura 3.8) OsloF NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ C 1 A A - - - - - - - 2 3 A 4 C 5 A 6 G T - - - - - - - 7 8 G G C A - - T - T - - - - T 9 10 11 12 A T G C A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 14 15 16 17 3’ G C A T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 18 19 20 21 22 Figura 3.7. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo F en el gen gag OsloR NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ G G - - - - - - - 1 2 C A - - - - - - - 3 4 T 5 C A - - - - - - - 6 7 T 8 G G C T - - - - - T T T - - - - - 9 10 11 T A A T A C T T G - - - - - - - - C - - - - - - C - - - - G - - - - - - G - - - - - - G - - - - - - G - - - - - - 12 13 14 15 16 17 18 19 3’ C T A A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 20 21 22 23 Figura 3.8. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo R en el gen gag 85 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 86 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 3.3.8.4. Cebadores POL F y POL R El cebador POL F presentó una complementariedad en 19/22 bases entre el cebador y las secuencias de LVPR y 3/22 uniones inespecíficas en las posiciones 2, 4 y 5 (Figura 3.9). Por otro lado, se observó variabilidad en 1/22 bases del cebador POL R (Figura 3.10). POL F NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ A 1 T A - G G - - - G 2 3 G T T G - - T G T G - G T 4 5 A 6 A A - - - - - - - 7 8 T 9 G G C - - - - - - - 10 11 12 A T C A A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 14 15 16 17 3’ G A T G C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 18 19 20 21 22 Figura 3.9. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL F en el gen pol POL R NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ T 1 C 2 C 3 C A A A A A A 4 G 5 A 6 A 7 T 8 T 9 3’ T G T T T C T A C C C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Figura 3.10. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL R en el gen pol 3.3.8.5. Cebadores LTR F y LTR R En el alineamiento de las 7 secuencias de LVPR se observó completa complementariedad en 20/24 nucleótidos presentes en el cebador LTR F. La variabilidad observada fue en el nucleótido 6 (2/7 secuencias) y en el nucleótido 10 (1/7 secuencia). En ésta última se observó además, una inserción de una timina en la secuencia caprina. (Figura 3.11). Por el contraLTR F NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ T G A C A C A G C A A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - T - - - TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A 12 T 13 G 14 T 15 A 16 A 17 C C G - - - - - - - - - - - - - - 18 19 20 C 21 A 22 Figura 3.11. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR F en la región LTR 86 A 23 3’ G 24 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 87 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... rio el cebador LTRR presenta el 100% de complementariedad con respecto a 7 secuencias de LVPR presentes en GenBank (Figura 3.12). LTR R NC_001452 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 NC_001463 5’ C C A C G T T G G G C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 G 12 C 13 C 14 A 15 G 16 C 17 T G C - - - - - - - - - - - - - - 18 19 20 G 21 A 22 G 23 3’ A 24 Figura 3.12. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR R en la región LTR 3.4. DISCUSIÓN En este proyecto se consiguió reunir a expertos en LVPR de toda Europa, crear un banco de muestras de lentivirus ovinos y caprinos paneuropeo y llevar a cabo un estudio comparativo de las técnicas de PCR más utilizadas en Europa. Los ensayos realizados indican que es posible detectar aislados víricos ovinos y caprinos de distintos países con una sola PCR. Sin embargo, la sensibilidad y el grado de concordancia de los cinco ensayos analizados varió sustancialmente y la PCR diseñada para amplificar secuencias LTR fue la que detectó un mayor porcentaje de animales aparentemente infectados y la que tuvo numéricamente la menor proporción de resultados potencialmente falsos negativos. No fue posible realizar una estimación de la sensibilidad y especificidad real de las PCRs porque como se explicó anteriormente, no existe una técnica de referencia para el diagnóstico de la infección por SRLV. Se empleó la mejor alternativa de validación posible considerando muestras positivas las pertenecientes a animales positivos a un ELISA recombinante y PCRs locales y muestras negativas las de animales negativos a ambas técnicas. El bajo grado de concordancia de las PCRs y la limitada sensibilidad de algunas de ellas se podría deber a una hibridación poco eficiente de los cebadores a las secuencias diana y/o a condiciones de reacción de PCR poco óptimas. Una hibridación deficiente asociada a variabilidad en las secuencias diana es probablemente la razón principal de la relativamente baja sensibilidad aparente puesto que el alineamiento y estudio comparativo de las secuencias en GenBank demostró alta variabilidad en las zonas de unión de ambos cebadores en todas las PCRs salvo la LTR. Esto último podría justificar la mayor sensibilidad de la LTR-PCR respecto a las otras PCRs. Por otro lado, la aparentemente menor sensibilidad de la LTR-PCR en muestras caprinas es compatible con la mayor variabilidad y la presencia de un nucleótido de inserción en la secuencia caprina. La variabilidad genética es un fenómeno bien conocido en otros retrovirus [165] y para intentar paliar la variabilidad en las secuencias diana los cebadores Gin5-F y Gin3-R [98], los 87 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 88 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... autores que diseñaron los cebadores Craft de este proyecto incluyeron posiciones degeneradas. Sin embargo, el estudio comparativo de los cebadores y las secuencias de GenBank demostraron que la posición de estos nucleótidos no se correspondió siempre con zonas variables y al contrario, no se incluyeron bases degeneradas en algunas posiciones hipervariables. Es poco probable que se trate de errores en el diseño o síntesis de los cebadores y cabría esperar que estos autores empleasen información propia no publicada sin considerar las siete secuencias publicadas a la hora de diseñar sus cebadores. En cualquier caso no cabe duda que la alta variabilidad en las secuencias y la presencia de un excesivo número de posiciones degeneradas reducen la eficiencia de hibridación del cebador con las secuencias diana. Las condiciones de reacción son otro factor crítico para obtener amplificación eficiente y en particular la temperatura de hibridación, el número de ciclos de PCR y la concentración de reactivos como el MgCl2. Diferencias en alguno de estos parámetros explicaría la variabilidad en los resultados obtenidos en un laboratorio con la misma PCR. Por ejemplo, en pruebas realizadas en Derio con la LTR-PCR la proporción de positivos con el “Kit-1” aumentó de 5/10 a 8/10 al aumentar el número de ciclos de PCR de 40 a 50 ciclos y con el “Kit-2” la proporción de positivos aumentó de 13/20 a 14/20 al incrementar la concentración de MgCl2 de 2mM a 3mM, pero estas diferencias no son estadísticamente significativas. Finalmente, cabe señalar que otro aspecto que explicaría la mayor sensibilidad de la LTR-PCR con respecto a otras PCRs es que en el provirus de los SRLV existen 2 secuencias LTR y sólo una copia de los genes gag y pol. Los animales con infección por SRLV tienen niveles de viremia muy bajos y se ha estimado que sólo 1 monocito de cada millón contiene provirus [106]. En estas circunstancias la presencia de dos copias de LTR en vez de una sola de otros genes podría afectar de modo crítico a la sensibilidad de la técnica. El estudio comparativo de las PCRs LTR-PCR y POL-PCR en 222 muestras pertenecientes a corderos entre el nacimiento y los 300 días de edad confirmaron la mayor sensibilidad de la LTR-PCR frente a la POL-PCR y un grado de concordancia regular entre las técnicas. No es posible saber con total certeza si todos los resultados positivos a la LTR-PCR son verdaderos positivos pero Extramiana y col. (2002) demostraron que su especificidad es del 100% [79]. En el presente trabajo la LTR-PCR detectó 9 positivos en 222 muestras de animales supuestamente negativos en los laboratorios de Oslo, Pamplona, Milán y Deventer. Alternativamente, los resultados positivos a una PCR y no a las otras técnicas podrían ser verdaderos positivos y constituir un ejemplo más de la conocida latencia serológica de los LVPR. Es posible que animales jóvenes infectados con dosis bajas de virus no seroconviertan poco tiempo después de producirse la infección. Más aún, el grado de concordancia entre las PCRs y el ELISA mejoró substancialmente al comparar el porcentaje acumulado de corderos PCRpositivos. Es bien conocido que la validez de las técnicas de diagnóstico varía en función de la población examinada como consecuencia de diferencias entre patógenos de distintas zonas geográficas y otros factores como por ejemplo el grado de exposición al patógeno y la edad de los animales [198]. Como se describe en el capítulo cinco, la correlación entre la LTR-PCR y el ELISA aumentó de modo muy significativo con la edad de los animales, lo cual sugiere que es muy probable que los resultados positivos obtenidos en este trabajo fueron correcta88 01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 89 3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA... mente interpretados y que la LTR-PCR es una técnica válida para detectar infección en animales jóvenes con infección reciente. La existencia de animales infectados y serológicamente negativos indicaría la utilidad de la PCR para el diagnóstico de animales infectados en programas de control de la enfermedad. Sin embargo el uso de esta técnica en estos programas podría verse limitado por su elevado coste comparado con los nuevos ELISAs recombinantes y por factores de tipo epidemiológico y de control del VMV. Por ejemplo, en un estudio reciente en rebaños lecheros latxos en régimen semi-intensivo se observó que la incidencia de VMV fue baja [18]. En estas circunstancias quizás no es esencial detectar la infección inmediatamente después de producirse, antes de que los animales seroconviertan. Este aspecto vuelve a debatirse en los próximos capítulos de esta tesis en los que se hacen nuevos estudios comparativos de la LTR-PCR y el ELISA recombinante para el diagnóstico de VMV en animales de distintas edades. 89 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 91 4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS SEROPOSITIVAS Y RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR VMV EN CORDEROS 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 93 4.1. INTRODUCCIÓN La vía lactógena es de gran importancia en la transmisión de los lentivirus de pequeños rumiantes [1, 70, 209] y se piensa que el riesgo de transmisión es máximo en el cordero neonato por el consumo de calostro de oveja infectada [110]. En un estudio reciente se observó que, efectivamente, el calostro de ovejas seropositivas es una buena fuente de infección pero no todos los corderos que tomaron calostro de madres seropositivas se infectaron [4]. Más aún la eficiencia de transmisión varió según la cantidad de calostro ingerida y según el modo de ingestión del calostro, mediante biberón o mamado directamente de la madre. Entre los que tomaron el calostro con biberón el porcentaje de seroconversión se asoció positivamente al volumen ingerido y osciló entre 29-61% mientras que en los que lo tomaron directamente de su madre sólo el 16% seroconvirtió. No se sabe por qué el riesgo de infección fue menor en los que mamaron y podría deberse a que los corderos que maman toman menos calostro, a que el amamantamiento se asocia con una producción mayor de saliva con propiedades anti-virales o que la toma mediante biberón favorece la aspiración de calostro y esto a su vez facilita la infección [4]. Independientemente de los factores descritos anteriormente, la ausencia de seroconversión en gran parte de los corderos que tomaron calostro de oveja seropositiva podría estar asociada a que algunas de las madres seropositivas no estuviesen realmente infectadas, es decir que fuesen falsamente seropositivas y a que exista una pobre correlación entre el estado serológico materno y la presencia de virus en calostro. En el citado trabajo se empleó un ELISA recombinante de tercera generación que se considera altamente específico (>98%) con lo que la probabilidad de obtener un falso positivo es muy baja. Por otro lado, como se describió en la revisión bibliográfica de la tesis aunque varios autores han demostrado la presencia de virus en calostro de ovejas seropositivas, tanto integrado en células como libre [144, 197, 230], no existen estudios cuantitativos de la relación entre el estado serológico materno, la presencia de virus en calostro y el riesgo de infección en los corderos ni trabajos comparativos entre distintas técnicas de diagnóstico de MVV en calostro. Es posible investigar la presencia de virus integrado en células calostrales mediante la LTR-PCR descrita en los capítulos anteriores sin embargo no es posible emplear esta técnica para detectar la presencia de virus libre ya que las secuencias LTR no se encuentran como tal en el ARN del virus libre. Este capítulo describe los resultados de un estudio cuyos objetivos fueron diseñar ensayos de PCR para detectar la presencia de virus libre e integrado en muestras de calostro, comparar dichas técnicas e investigar la relación entre la presencia de virus en calostro y la infección en los corderos. 4.2. MATERIALES Y MÉTODOS 4.2.1. Abordaje experimental y población de estudio Se llevaron a cabo ensayos de diagnóstico de VMV en sangre y calostro de oveja con el fin de: (i) detectar la presencia de anticuerpos ELISA frente a VMV en plasma sanguíneo 93 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 94 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... en muestras tomadas un mes antes del parto y una semana después del parto y en el componente no celular del calostro (ii) identificar provirus MV en células sanguíneas y en células somáticas (CS) calostrales mediante LTR-PCR y en CS mediante Gag-PCR y (iii) investigar la presencia de VMV libre en el componente no celular del calostro mediante una PCR transcriptasa inversa (Gag-RT-PCR). Una vez realizados estos ensayos se llevó a cabo un estudio comparativo de las técnicas de diagnóstico empleadas y finalmente se investigó la relación entre los resultados diagnósticos en calostro y el riesgo de infección en corderos que consumieron calostro con virus. Estos corderos pertenecían a tres grupos experimentales, PFO, PSOL y PSOH de un experimento diseñado para investigar la importancia relativa del calostro en la infección por VMV descritos en detalle por [4]. Brevemente, los corderos nacieron durante 3 años de ovejas seropositivas del rebaño experimental de NEIKER. Al nacimiento, los corderos del grupo PFO se mantuvieron con la madre en el seno del rebaño adulto y se les permitió mamar de modo natural. Por el contrario, los corderos PSOL y PSOH se separaron de la madre al nacimiento y se llevaron a una nave distinta sin ovinos adultos y se les proporcionó un volumen de calostro de oveja seropositiva según su peso al nacimiento. Los corderos PSOL tomaron entre 193-830 ml de calostro y los corderos del grupo PSOH tomaron entre 850-1390 ml de calostro. A partir de las primeras 24 horas de vida todos los corderos se criaron juntos en la nave separada del rebaño principal hasta los 300 días de edad, momento en el que se analizó la presencia de anticuerpos ELISA en los corderos. 4.2.2. Obtención de muestras, análisis de AC por ELISA y detección de provirus MV mediante LTR-PCR Las muestras de sangre se recogieron en tubos de 10 ml con anticoagulante EDTA y las muestras de calostro en envases de polipropileno de 50 ml. El procesado de las muestras de sangre para obtener plasma, células blancas y la realización de ELISA y la LTR-PCR se llevó a cabo según se describe en el capítulo ensayos de PCR para el diagnóstico de LVPR en Europa. 4.2.3. Obtención de CS y componentes no celulares de calostro Se partió de un volumen inicial de 35 ml de muestra de calostro y tras añadir 15 ml de PBS estéril para reducir su viscosidad, se centrifugó la mezcla a 2.000 g en una centrífuga Megafuge 1,0 (Haraeus) durante 10 minutos a 4°C. A continuación se eliminó la capa superior de grasa con una espátula de madera y se decantó el tubo para separar el sobrenadante de las CS. Se congeló el sobrenadante a –70°C para posteriormente realizar el ELISA y la GagRT-PCR. Se lavaron las CS tres veces resuspendiendo el sedimento en 30 ml de PBS y centrifugando a 2.000 g durante 10 minutos en cada ocasión. Finalmente se diluyeron las CS en 4ml de PBS y tras dividir la muestra en cuatro volúmenes iguales en tubos de 1,5 ml de polipropileno, se centrifugaron los tubos a 14.000 g en una microcentrífuga (Biofuge Heraeus) 94 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 95 4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS... durante 1 minuto, se decantó el sobrenadante y se almacenaron las CS a –20°C para posteriormente realizar una LTR-PCR y una Gag-PCR. 4.2.4. Obtención de ARN del sobrenadante de calostro Se utilizó el Kit Qiagen (RNeasy® Lipid Tissue Mini for total ARN isolation from adipose tissue, brain and other fatty animal tissues) para obtener ARN del sobrenadante de calostro siguiendo el protocolo descrito en el kit. Tras descongelar las muestras de sobrenadante, se separaron 100 µl y una vez a temperatura ambiente se añadieron 200 µl de cloroformo y tras homogenizar la muestra de manera vigorosa durante 15 segundos se centrifugó la mezcla a 12,000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de recuperar la fase acusa superior donde se encuentra el ARN. A continuación se añadieron 600 µl de etanol 70% a la fase acuosa y tras homogeneizar la mezcla con un vórtex durante varios segundos se pasó la mezcla a una columna (mini spin column) que se centrifugó a 8.000 g durante 15 segundos a temperatura ambiente con el fin de separar el componente líquido del ARN total que queda unido a la membrana de la columna. Para completar los 900 µl de mezcla fue necesario repetir este paso dos veces. A continuación se lavó la membrana añadiendo 700 µl de buffer RWI* y centrifugando durante 15 segundos a 8000g. Después se secó la columna en dos pasos, en el primero se añadieron 500 µl de Buffer RPE* y se centrifugó la columna durante 15 segundos a 8.000 g y en el segundo paso se añadieron 500 µl de Buffer RPE* y se centrifugó la columna durante 2 minutos a 8.000 g. Finalmente se recuperó el ARN de la membrana añadiendo 50 µl de agua libre de ARNsas y centrifugando la columna a 8.000 g durante 1 minuto y se congeló a –70 °C para su uso posterior. 4.2.5. Tratamiento con DNAsas en las muestras de ARN Se utilizó el Kit RQ1 ARNse free DNase,Promega® para tratar las muestras con DNAsas. En un vial de polipropileno de 1,5 ml se mezclaron 8 µl del ARN diluido en agua del paso anterior con 1,5 µl de RQ1 Rnase Free DNase 10X Reacción Buffer+, 3 µl de RQ1 Rnase Free Dnase+ y 2,5 µl de agua libre de nucleasas. A continuación se incubó la mezcla a 37°C durante 30 minutos y al término de la incubación se adicionó 1,5 µl de RQ1 Dnase stop solution+, aumentando la temperatura a 65°C durante 10 minutos con el fin de frenar la reacción. Finalmente se congeló la muestra –70°C hasta su posterior uso. 4.2.6. Concentración y pureza del ARN Se midió la pureza y la concentración del ARN extraído con un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop technologies). Se tomaron 2 µl de muestra, calculando la pureza con el ratio de absorbancia 260/280 nm. Un ratio de ~2,0 es aceptado como ARN puro, mientras que * Reactivo proporcionado por el KIT (Qiagen) + Reactivo proporcionado por el KIT (Promega) 95 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 96 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... un ratio menor indica baja pureza. La concentración de ARN, se calculó multiplicando la A260 por la constante de análisis que en el caso del ARN es de 40 (Concentración = A260X50) [194]. 4.2.7. Diseño de la GAG-PCR Se diseñaron una pareja de cebadores de la región gag del VMV, S51392 publicada en Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) (Figura 4-1). Para ello se realizó un estudio de las secuencias disponibles y se seleccionó una región conservada del gen gag, los cebadores se diseñaron reuniendo las condiciones adecuadas para una correcta amplificación obteniendo un fragmento de menos de 25 bases, con un porcentaje de guaninas (G) y citosinas (C) entre el 40 y 60% evitando la formación de dímeros y una Tm similar entre los cebadores. (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (112) M31646MVV(112) NC_001511MVV(112) M60610MVV(111) NC_001452MVV(111) S51392MVV(111) Consensus(112) (223) M31646MVV(220) NC_001511MVV(220) M60610MVV(219) NC_001452MVV(218) S51392MVV(220) Consensus(223) (334) M31646MVV(328) NC_001511MVV(328) M60610MVV(327) NC_001452MVV(326) S51392MVV(331) Consensus(334) (445) M31646MVV(439) NC_001511MVV(439) M60610MVV(438) NC_001452MVV(437) S51392MVV(442) Consensus(445) (556) M31646MVV(550) NC_001511MVV(550) M60610MVV(549) NC_001452MVV(548) S51392MVV(553) Consensus(556) (641) M31646MVV(635) NC_001511MVV(635) M60610MVV(634) NC_001452MVV(633) S51392MVV(638) Consensus(641) M31646MVV NC_001511MVV M60610MVV NC_001452MVV S51392MVV Consensus 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 111 GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAAAGTAGGGAAATACCCTTCACAGGACGAAAAGGCGCTGCTGGGGGACAGGAGGAGGGTTCGCAGCCCTGAG GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAAAGTAGGGAAATACCCTTCACAGGACGAAAAGGCGCTGCTGGGGGACAGGAGGAGGGTTCGCAGCCCTGAG GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGGAA-GTAGGGAATAGCCCTTCAGTGAAGGAGAAAGTGTTGCTTGGGCACAGGAGGAGGGTTCGCGACCCCTTA GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGGAA-GTAGGGAATAGCCCTTCAGTGAAAGAGAAAGTGTTGCTTGGGCACAGGAGGAGGGTTCGCGACCCCTTA GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAA-GTAGGGAATAACCCTTCGACGAAAGAAAAGGCGCTGCTTGGCGACAGGAGGAGGGCTCGCGACCCTGTA GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAA GTAGGGAATAACCCTTCA GAA GAAAAGGCGCTGCTTGGGGACAGGAGGAGGGTTCGCGACCCTGTA 112 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 222 --ACTTAAAGAAGGGGACGAGCCC-TCCGCCTGAACCTGAGGAGTGCAAAGGCAGCGCTAGTAAGAAAACCGCCGTGGTGAATCTAGATAGAGACATGGCGACGCAAGGCT --ACTTAAAGAAGGGGACGAGCCC-TCCGCCTGAACCTGAGGAGTGCAAAGGCAGCGCTAGTAAGAAAACCGCCGTGGTGAATCTAGATAGAGACATGGCGACGCAAGGCT GAA--AGACGGAGGGG-CGCGGGCGTCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTGGTAAGGAAGCCGCCGTGGTGAGGCTAGCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCT -AA--AGACGGAGGGG-CACGGGCGTCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTGGTAAGGAAGCCGCCGTGGTGAGGCTAGCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCT ATAGGAGAAGCAGGGG-CGAGCTC-TGGTCCTGGACCTGAGGAGGGCAAGTGCAGCGCTGGTAAGGAAACCGCCGTGGTGAGTCTAGATAGAGACATGGCGAAGCAAGGCT A AGAAG AGGGG CGAGC C TCCTCCTGGACCTGAGGAG GCAAG GCAGCGCTGGTAAGGAAACCGCCGTGGTGAGTCTAGATAGAGACATGGCGAAGCAAGGCT 223 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 333 CAAAGGAGAAGAAGGGATACCCTGAGCTCAAAGAGGTCATTAAGACAACATGTAAAATAAAGGTGGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGG CAAAGGAGAAGAAGGGATACCCTGAGCTCAAAGAGGTCATTAAGACAACATGTAAAATAAAGGTGGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGG CAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTTGTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGG CAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTTGTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGG CAAGAGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAAGAGGTAATAAGGAAAACATGTAGGATAAGAGTAGGCCCAAGGGAAGGAGAACCCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGG CAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAAGAGGTAATTAAGACAACATGTAAAATAAGGGTAGGGCCC GGGAAGGAGA CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGG 334 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 444 CCTTAAAAACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAACTCCAGAAGAAACAA CCTTAAAAACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAACTCCAGAAGAAACAA CATTAAAAACTATAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAACTCCGGAGGAAACAA CATTAAAAACTATAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAACTCCGGAGGAAACAA CATTAAAAACTGTAGACTTTATATTTGAAGATTTAAAAGGAGAGCCGTGGACCATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAACAGTTAACTCCAGAAGAGACAA CATTAAAAACT TAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGAC ATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAACAG TAACTCCAGAAGAAACAA 445 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 555 GTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAG GTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAG GCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAAACCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAG GCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAG GTAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACAATGGCTTGCCTTATGTGTAGTCAGCTGGGTATGAAACCCGAGACAGTGCAAGCAGCAAGGGGAATAATGCATATGAAAG GTAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACATTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAGGGGAATAATAAGTATGAAAG 556 570 580 590 600 610 620 630 640 650 666 AAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAGAAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGA AAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAGAAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGA AAGGACTACAAGAAAATAAGGAGGCCAAGGGGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTACCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGA AAGGACTACACGAAAATAAGGAGGCCAAGGGGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTATCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGA AAGGACTACAGGAGAATAAGGAGGAAAAGGAGAAAAAGGTAGAACAACTCTACCCTAATTTAGAGAAACATAGAGAAGTGTACCCTATTGTAAATCTGCAAGCAGGGGGGA AAGGACTACACGAAAATAAGGAGGA AAGGAGAAGAAGGTAGAACAACTCTACCC AACTTAGAGAAACATAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAAGCAGGAGGGA 641 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 751 TATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGA TATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGA TATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGA TATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGA TATTGTAAATCTGCAAGCAGGGGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGATTCAGTAGTCTTCCAGCAATTGCAAACTGTGGCTATGCAGCATGGCCTTGTGTCCGAGGATTTTGA TATTGTAAATTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGA Figura 4.1. Zona amplificada por los cebadores gag 4.2.8. Análisis estadístico Se empleo la técnica de chi-cuadrado de Yates para comparar proporciones en EpiInfo 6.0 (CDC, Atlanta) y se calculó el coeficiente kappa para medir el grado de concordancia entre dos técnicas según Dohoo y col. (2003) [72]. Se tomó un nivel de significancia del 5% (p<0,05). 96 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 97 4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS... 4.3. RESULTADOS 4.3.1. Cebadores y condiciones de reacción de la GAG-PCR En el alineamiento realizado a partir de las 6 secuencias del VMV obtenidas por GenBank, se observa un 100% de complementariedad (20/20 nucleótidos) entre los cebadores y la zona de hibridación (Figura 4.2 y Figura 4.3). Los cebadores diseñados amplifican un fragmento de 744 bases. La secuencia de los cebadores y el amplicón puede observarse en la Figura 4.1. La concentración de reactivos, el número de ciclos y las temperaturas de desnaturalización, hibridación y elongación de las PCRs empleadas se describen en la Tabla 4.2. 5’ Gag F G NC_00145 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 1 G 2 G 3 A 4 C 5 G 6 C 7 C 8 T 9 3’ G A A G T A A G G T A 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Figura 4.2. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag F en el gen gag 5’ Gag R T NC_00145 NC_001511 M31646 M60610 M10608 S51392 1 C 2 A 3 A 4 A 5 A 6 T 7 C 8 C 9 3’ T C G G A C A C A A G 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Figura 4.3. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag R en el gen gag Tabla 4.1. Cebadores empleados Nombre Diana Gag-PCR gag Tamaño del Cebador amplicón Secuencia ( 5’- 3’ ) Tm gag F G G G A C G C C T G A A G T A A G G T A 55,6°C gag R T C A A A A T C C T C G G A C A C A A G 54,8°C 744pb 97 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 98 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Tabla 4.2. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y temperaturas de reacción Protocolo Gag-PCR Concentración Final Volumen Ciclos Temperatura Buffer 1x 2,50 µl 1 95°C/5’ DNTPs 200 µM 2,50 µl 50 94°C/45’’ Mg2Cl 2,5 mM 1,25 µl 60°C/30’’ Cebador 1 0,5 µM 1,25 µl Cebador 2 0,5 µM 1,25 µl 3U 0,60µl 500 ng 5,0 µl Reactivos Taq Polimerasa ADN Agua 1 25 µl 5X 10 µl 1 50°C/30’ DNTPs 400 µM 2 µl 1 Cebador gag1 0,3 µM 1,5 µl 50 94°C/45’’ Cebador gag2 Gag-RT-PCR (Qiagen) RT-PCR enzyme mix 0,3 µM 1,5 µl 60°C/30’’ (Qiagen) 2 µl 72°C/1’30’’ 120 ng 7 µl 1 ARN 72°C/10’ 10,65 µl Volume Total Buffer (Mg2Cl) 72°C/1’30’’ Agua libre de ARNse 26 µl Volumen Total 50 µl 95°C/15’ 72°C/10’ 4.3.2. Porcentaje de ensayos de PCR y ELISA positivos Se realizaron 988 ensayos de PCR y ELISA en muestras de sangre y calostro de ovejas. La Tabla 4.3 presenta el porcentaje de positivos a ambas técnicas en muestras de calostro y sangre tomadas el día del parto y la Tabla 4.4 el porcentaje de resultados ELISA-positivos en las mismas muestras y en muestras de sangre tomadas un mes antes del parto. El porcentaje de resultados PCR-positivos osciló entre 49-54% y no se observaron diferencias según el tipo de muestra (p>0,05) (Tabla 4.3). Por el contrario, el porcentaje de resultados ELISA-positivos fue 79-84% y tampoco hubo diferencias significativas según el tipo de muestra y el mo98 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 99 4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS... mento en el que se tomaron las muestras (p>0,05) (Tabla 4.4). Entre las muestras de calostro ELISA-positivas procesadas por PCR, el 78% (78/100) fue positiva a una o más PCRs y el porcentaje de positivas según la técnica de PCR fue 56% (66/114) para la LTR, 62% (67/109) para la Gag-RT-PCR y 65% (73/112) para la Gag (p>0,05). Tabla 4.3. Porcentaje de PCR-positivos en muestras de calostro y sangre de ovejas tomadas el día del parto Tipo de PCR y muestra Año LTR sangre Gag calostro LTR calostro Gag-RT-PCR calostro Total Núm. %+ Núm. %+ Núm. %+ Núm. %+ A B C 59 67 6 73 33 20 62 62 19 58 53 42 64 62 19 61 39 42 54 67 19 52 55 32 239 258 63 Total 132 50 143 54 145 49 140 51 560 Tabla 4-4. Porcentaje de ELISA-positivos en muestras de calostro y sangre de oveja tomadas el día del parto y en muestras de sangre tomadas un mes antes del parto Tipo de muestra y momento de obtención Sangre Año Calostro Total Al parto 1 mes antes del parto Núm. %+ Núm. %+ Núm. %+ A B C 64 67 19 84 78 68 61 67 0 82 78 0 64 67 19 83 81 100 189 201 38 Total 150 79 128 81 150 84 428 4.3.3. Comparación de técnicas de diagnóstico en calostro y sangre El grado de resultados discordantes, concordantes, coeficiente kappa y grado de concordancia de las técnicas diagnósticas en calostro y sangre se describe en la (Tabla 4.5). El grado de concordancia para los ELISAs realizados en sangre y calostro fue muy bueno (Tabla 4.5). El grado de concordancia de las PCRs en las muestras de calostro fue bueno entre la LTR y las Gag (Gag y Gag-RT) y moderado entre la Gag-RT y la Gag. La concordancia entre la LTR en sangre y calostro también fue moderada. Finalmente la concordancia entre los resultados ELISA y PCR en calostro y sangre sólo fue regular. 99 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 100 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Tabla 4.5. Resultados discordantes, concordantes y coeficiente kappa entre parejas de técnicas de diagnóstico PCR y ELISA de VMV en muestras de calostro y sangre A) PCRs en muestras de calostro Ensayo - tipo de muestras Con* Dis* kappa Grado de concordancia Gag -RT-calostro Gag –calostro 79 21 0,58 moderado Gag-RT-calostro LTR-calostro 81 19 0,63 bueno Gag-calostro LTR-calostro 82 18 0,63 bueno Con* Dis* kappa Grado de concordancia Gag-calostro 2 ELISA calostro 70 30 0.40 regular LTR-calostro 2 ELISA calostro 63 37 0,28 regular B) ELISA2 y PCRs en muestras de calostro Ensayo - tipo de muestras C) ELISA2 y LTR-PCR en muestras de sangre Con* Dis* Kappa Grado de concordancia 63 37 0,25 regular Con* Dis* Kappa Grado de concordancia Gag-calostro LTR-sangre 67 33 0,34 regular LTR-calostro LTR-sangre 71 29 0,42 moderado Gag-RT calostro LTR-sangre 67 33 0,35 regular Con* Dis* kappa Grado de concordancia ELISA2 calostro LTR-sangre 61 39 0,22 regular ELISA2 calostro 2 ELISA sangre 98 2 0,95 muy bueno Ensayo - tipo de muestras 2 ELISA sangre LTR-sangre D) PCRs en muestras de calostro y sangre Ensayo - tipo de muestras E) ELISA2 en muestras de calostro y sangre Ensayo - tipo de muestras F) ELISAs en muestras de sangre 1 mes antes y poco después del parto Ensayo - tipo de muestras ELISA1 sangre 2 ELISA sangre Con* Dis* kappa Grado de concordancia 98 2 0,92 muy bueno ELISA 1 y 2 = ELISA un mes antes del parto y poco después del parto, respectivamente. Con y Dis* = % Resultados concordantes y discordantes, respectivamente. 100 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 101 4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS... 4.3.4. Seroprevalencia en corderos criados con calostro VMV-seropositivo según el estado de VMV-PCR del calostro y el modo de ingestión del calostro El porcentaje de corderos ELISA-positivos a los 300 días de edad varió según el estado VMV-PCR del calostro y el volumen de calostro ingerido mediante biberón (Tabla 4.6). De este modo, entre los corderos que mamaron de sus madres o tomaron cantidades medias y bajas de calostro con biberón, la proporción de corderos ELISA positivos a los 300 días fue significativamente mayor en los que tomaron calostro LTR-positivo que en los que tomaron calostro LTR-negativo. Sin embargo, para las PCRs Gag este efecto sólo se observó entre los corderos que tomaron cantidades medias y bajas de calostro mediante biberón. Finalmente, no se observó una relación entre el estado de LTR de la madre en sangre y la probabilidad de que los corderos fuesen seropositivos a los 300 días de edad. Tabla 4.6. Porcentaje de corderos ELISA-positivos a los 300 días de edad en función del estado de PCR del calostro, el modo de ingestión del calostro y el volumen de calostro ingerido mediante biberón Grupo experimental PFO PFO PSOH PSOH PSOL PSOL PFO PFO PSOH PSOH PSOL PSOL PFO PFO PSOH PSOH PSOL PSOL PFO PFO PSOH PSOH PSOL PSOL PFO PFO PSOH PSOH PSOL PSOL Tipo de ensayo Gag-RT Gag LTR PCR (todas) LTR (parto) Tipo de muestra Calostro Calostro Calostro Calostro Sangre Estado de PCR Número de animales % ELISA + a los 300 días de edad Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo 25 26 9 13 10 15 21 33 6 18 7 18 24 27 6 18 10 13 21 33 8 19 10 16 16 15 67 77 10 60 14 18 67 72 14 50 4 26 67 67 10 61 10 21 75 68 10 56 Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo 16 22 12 12 10 14 19 23 67 75 40 36 101 Valor de P 0,95 0,60 0,014 0,71 0,80 0,11 0,03 1 0,01 0,27 0,74 0,02 0,70 0,66 0,834 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 102 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 4.4. DISCUSIÓN Con el fin de estudiar la presencia de VMV asociado a células de calostro se empleó un ensayo LTR-PCR publicado por Álvarez y col. (2004) [4] y para estudiar la existencia de VMV libre, no asociado a células, se diseñó una nueva PCR con cebadores para amplificar un segmento del gen gag de VMV a partir de las 6 secuencias completas de VMV disponibles en el GenBank. El ensayo Gag se empleó también para detectar virus integrado. La proporción de calostros PCR-positivos fue similar para los tres ensayos (LTR, Gag y Gag-RT) y el porcentaje de resultados concordantes entre dos técnicas fue próximo al 80%, indicando una alta correlación entre la presencia de virus libre e integrado en el calostro. El estudio demuestra que los corderos que tomaron calostro PCR-positivos y sobre todo los que tomaron calostro LTR-positivo, tuvieron una probabilidad significativamente mayor de seroconvertir a los 300 días que los que tomaron calostro PCR-negativo, excepto los corderos que tomaron >830 ml de calostro mediante biberón (grupo PSOH). Esto último sugiere que la mayoría del calostro ingerido por los corderos del grupo PSOH contenía virus aunque en algunos casos en cantidad inferior a la detectable por PCR pero suficiente para producir infección cuando se toma una cantidad elevada de calostro. Por extensión es muy probable que los calostros PCR-negativos de los otros grupos (PFO y PSOL) también tuviesen virus aunque al consumirse en baja cantidad no se alcanzó el umbral de infección. De hecho, los niveles de seropositividad en los corderos de los grupos PFO y PSOL que tomaron calostro LTR-negativo oscilaron entre 4% y 10%, similares al de los corderos que tomaron calostro bovino [4]. Como ya se explicó diversos autores han demostrado la presencia de VMV en calostro de ovejas infectadas pero se desconoce la dosis mínima de virus en calostro capaz de producir infección. Cabe esperar que esta dosis no sea fija y dependa de otros factores como la cepa de virus y características propias de los animales. El empleo de nuevos ensayos capaces de cuantificar la cantidad de virus presente en calostro, como la PCR a tiempo real, permitirán un análisis más preciso de la relación entre la ingestión de calostro de madres infectadas y el riesgo de infección en los corderos. Se confirma el hallazgo realizado por Álvarez y col. (2004) [4] de que tomar el calostro mediante biberón es un factor de riesgo significativo en la transmisión del VMV vía lactógena y que se reduce considerablemente cuando los corderos maman directamente de sus madres. No se conocen las razones de ello y los citados autores sugirieron la posibilidad de que la administración de calostro mediante biberón podría facilitar la aspiración del calostro y la infección, y que el amamantado vaya asociado a un incremento de la producción de saliva. La cual contiene sustancias con propiedades antivirales. Desde el punto de vista del control este trabajo demuestra la utilidad de realizar ensayos de PCR en calostro para reducir el riesgo de infección en corderos. Esto sería especialmente útil de cara a seleccionar calostro para almacenar y usar con posterioridad. Es posible sin embargo, que el realizar PCRs para seleccionar calostros libres de virus sea una opción menos económica que las alternativas de someter el calostro a un tratamiento térmico que inactive el VMV o emplear calostro de vaca. 102 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 103 5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTAL POR VMV EN OVINO LATXO ADULTO CRIADO BAJO DISTINTAS PRESIONES DE INFECCIÓN A VMV 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 105 5.1. INTRODUCCIÓN Los ovinos se pueden infectar con VMV en edades tempranas por vía lactógena al consumir calostro y leche con VMV y durante su vida productiva por vía horizontal al estar en contacto con ovejas infectadas [184]. La importancia relativa de estas formas de transmisión y el estudio de la transmisión calostral ha sido objeto de varios estudios recientes mencionados en la revisión bibliográfica y el presentado en el quinto capítulo de esta tesis. Sin embargo, no se conocen bien los mecanismos y factores de riesgo asociados a la transmisión horizontal de VMV. En la epidemia registrada en Islandia se demostró que la transmisión horizontal es muy eficiente cuando se introducen animales con infecciones subclínicas en rebaños con condiciones de confinamiento elevado. Es muy posible que la eficacia de la transmisión horizontal varíe en rebaños donde el VMV es endémico y según el sistema de manejo del ganado. De hecho, ya se ha explicado que en un estudio reciente en rebaños lecheros latxos semi-intensivos del País Vasco en estabulación 2-6 meses/año, se observó que la incidencia de seroconversión a VMV no fue alta y que hubiese sido posible reducir gradual y progresivamente la seroprevalencia centrando el desvieje en animales seropositivos sin aumentar la tasa normal de desvieje del rebaño [18]. En el anterior trabajo, la seroconversión se incrementó al aumentar el grado de contacto con animales seropositivos y hasta los 4 años de edad y se observó una interacción entre ambas variables, de modo que para un grado de contacto con seropositivos similar, la probabilidad de seroconvertir aumentó con la edad hasta los 4 años de edad. Esto podría ser el resultado de una menor habilidad de las ovejas de mayor edad con respecto a las más jóvenes, de controlar la infección y esta mayor susceptibilidad de las ovejas mayores podría ser por ejemplo por padecer mayor estrés productivo y exposición acumulada al VMV. Alternativamente, las ovejas mayores expuestas de forma repetida al VMV desarrollaron anticuerpos detectables por la técnica IGDA con más facilidad que las ovejas más jóvenes, expuestas en menor grado a VMV. La técnica IGDA es muy específica pero recientemente se ha comprobado que su sensibilidad comparado con el ELISA recombinante empleado en los análisis de esta tesis es sólo 78% [229]. Al término del experimento para evaluar la importancia del calostro en la transmisión de VMV mencionado en los capítulos anteriores hubo la posibilidad de formar dos grupos experimentales de corderos de 1 año de edad mayoritariamente seronegativos y de someterlos a distintos niveles de exposición a VMV y comprobar indirectamente la eficacia de la transmisión horizontal en ganado estabulado mediante ELISA y PCR. Algunos de estos corderos habían sido PCR-positivos en alguna de las seis ocasiones en que se habían analizado durante el primer año de vida a pesar de no haber seroconvertido al año de edad. La posibilidad de seguir manteniendo estos animales en experimentación ofreció pues la posibilidad añadida de comprobar la relación entre haber sido PCR-positivo durante el primer año de vida y seroconvertir posteriormente y en general de evaluar la relación entre las técnicas PCR y ELISA que durante el primer año de vida fue sólo moderada. 105 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 106 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 5.2. MATERIALES Y MÉTODOS 5.2.1. Diseño experimental y población de estudio El estudio duró 3 años entre diciembre 2000 y noviembre 2003 y participaron 191 animales, de los cuales 176 habían participado previamente en el estudio de transmisión calostral de VMV antes mencionado [4, 5]. Al inicio del estudio los animales tenían 1 año de edad, 162 eran seronegativos a ELISA y 29 eran seropositivos. Entre los seronegativos, 124 individuos habían sido PCR-negativos en 6 muestreos desde el nacimiento hasta los 10 meses de edad y los 38 restantes habían sido PCR-positivos en al menos y sobretodo (82%) en una ocasión. Los animales se distribuyeron en dos grupos experimentales que se describen abajo, el grupo H sometido a un grado de exposición del VMV alto y el grupo L sometido a una exposición del VMV baja. La seroprevalencia por ELISA al inicio del experimento fue alrededor del 15% (ver resultados) en ambos grupos y a partir de entonces se analizó la presencia de anticuerpos ELISA cada seis meses y de VMV en sangre cada 12 meses hasta los 4 años de edad como máximo. El grupo H constó de 147 ovejas nacidas en enero del 2000, 2001 y 2002 que fueron introducidas como animales de reposición al rebaño experimental en producción lechera de NEIKER. En este rebaño las ovejas se estabulan durante un periodo de aproximadamente 6 meses en una nave de 35x13x4-m y pastan durante el resto del año. La seroprevalencia a VMV en este rebaño fue 66% (157/237) en diciembre de 2000, 42% (123/291) en diciembre del 2001 y 47% (128/271) en diciembre de 2002. El grupo L incluyó 44 machos castrados nacidos en enero 2001 y que se mantuvieron en una nave separada de 20x9x4-m3 diseñada con buena ventilación. Durante la duración del experimento no se introdujeron ovinos a esta nave excepto en enero 2002 en el que incorporaron 62 corderos recién nacidos que se mantuvieron en corrales separados durante los siguientes 10 meses. La seroprevalencia en este grupo de corderos fue 8% (5/60) y dos corderos fueron PCR-positivos. 5.2.2. Obtención de muestras y ensayos de PCR y ELISA Se tomaron muestras de sangre en tubos de vacío con EDTA cada seis meses excepto el primer año en que se obtuvieron muestras al principio y a final de año. Las muestras de sangre se procesaron para analizar anticuerpos en plasma con el ELISA y VMV integrado por LTR-PCR según se ha descrito en los capítulos anteriores. 5.2.3. Análisis estadístico Se empleo la técnica de chi-cuadrado de Yates para comparar proporciones en EpiInfo 6.0 (CDC, Atlanta) y se calculó el coeficiente kappa para medir el grado de concordan106 2/3/06 09:59 Página 107 5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTAL POR VMV EN OVINO LATXO... cia entre dos técnicas según Dohoo y col. (2003) [72]. Se tomó un nivel de significancia del 5% (p<0,05). 5.3. RESULTADOS 5.3.1. Porcentaje de ovejas ELISA y PCR positivas El porcentaje de animales ELISA-negativos y PCR-positivos en los grupos H y L se describen en la Figura 5.1. La prevalencia en el grupo H aumentó significativamente de un 16% en ovejas de un año de edad al 57% en ovejas de 3 años de edad (p<0.05) y se mantuvo estable a partir de los 3 años (p<0.05). Por el contrario la seroprevalencia en el grupo L fue 14% en carneros de 1 año de edad y no ascendió más allá del 18% en animales de 1,5 y 2 años y fue significativamente menor que en el grupo-H y en todas las edades exceptuando al año de edad (p<0.05). El porcentaje de PCR-positivos fue similar al porcentaje de ELISA-positivos entre grupos. En grupo H aumentó de 11% en ovejas de 1 año de edad a 49% en animales de 2 años y fue similar en edades posteriores, mientras que en el grupo L no varió significativamente según la edad y osciló entre 18% al año de edad y 14% a los 2 años Figura 5.1. Exceptuando al año de edad la proporción de PCR-positivos fue significativamente menor en el grupo L que en el H. (p<0.05). 100 ELISA grupo H ELISA grupo L PCR grupo H PCR grupo L 90 80 Seroprevalencia (%) 02 TESIS 57 70 60 50 40 30 20 10 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Edad (años) Figura 5.1. Porcentaje de ovinos ELISA y LTR-PCR positivos según la edad en grupos de animales criados en condiciones de baja (grupo L) y alta (grupo H) presión de infección a VMV 107 2/3/06 09:59 Página 108 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... 5.3.2. Incidencia acumulada de seroconversión según la edad y el estado de PCR durante el primer año de vida La incidencia acumulada de ELISA-positivos según la edad se presenta en la Figura 5.2. En el grupo H la incidencia aumentó a 27% 6 meses después de que los corderos se introdujeran al ensayo y disminuyó gradualmente a partir de entonces hasta 0% a los 4 años de edad. Estos resultados contrastan con los del grupo L dónde sólo un animal seroconvirtió entre 1 año y 1,5 años de edad (Figura 5.2). Dentro del grupo H, la proporción de corderos que seroconvirtieron durante el estudio fue 42% (11/26) para los corderos con algún resultado positivo de PCR durante el primer año de vida y 41% (31/91) en los que nunca fueron PCR-positivos durante el primer año de vida (p>0,05). La edad media de seroconversión fue de dos años de edad en ambos grupos. 100 90 Incidencia acumulada (%) 02 TESIS 57 80 grupo H grupo L 70 60 50 40 30 20 10 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Edad (años) Figura 5.2. Incidencia acumulativa de ovinos ELISA-seropositivos según la edad en grupos de animales criados en condiciones de baja (grupo L) y alta (grupo H) presión de infección a VMV 5.3.3. Relación entre resultados de ELISA y PCR Al final del experimento 109 ovinos no fueron nunca ELISA o PCR positivas, 78 fueron ELISA-positivos y PCR positivos al menos una vez, 3 ovinos fueron ELISA-negativos y PCR-positivos en una ocasión y 1 ovino fue ELISA-positivo y nunca PCR-positivo. Por tanto, el porcentaje de concordancia de los resultados acumulados de ELISA y PCR fue 98% y el grado de concordancia k=0,95, considerado como casi perfecto [72]. Sin embargo, el porcentaje y grado de concordancia entre el ELISA y la PCR varió conforme a la edad (Figura 5.3). El porcentaje de concordancia fue >88% a lo largo del tiempo y aumentó con la edad de k =0,63 (substancial) al año de edad a k=0,94 (muy bueno) entre ovejas de 4 años. 108 09:59 Página 109 5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTAL POR VMV EN OVINO LATXO... 100 1,0 80 0,8 60 0,6 40 0,4 concordancia kappa 20 0,2 0 0,0 1 2 3 coeficiente Kappa 2/3/06 % concordancia 02 TESIS 57 4 Edad (años) Figura 5.3. Porcentaje y coeficiente de concordancia, kappa, de las técnicas de diagnóstico de anticuerpos frente a VMV ELISA y de provirus VMV LTR-PCR según la edad de los ovinos 5.4. DISCUSIÓN Se considera que la transmisión horizontal del VMV es importante en todos los sistemas de producción ovina [184], particularmente en aquellos en los que las ovejas se estabulan durante largo tiempo [106]. Sin embargo, a pesar de que la prevalencia de VMV en el grupo L formado por 44 machos fue 14-18% sólo un animal se infectó durante los dos años que permanecieron estabulados. Por el contrario, el contagio vía horizontal fue relativamente eficiente en el grupo H y similar a lo observado en rebaños lecheros caprinos [1, 183] y en un estudio epidemiológico previo en ovejas latxas [18]. Sin embargo, en contraste con estudios previos, el riesgo de infección fue mayor inmediatamente después de que las ovejas del grupo H se introdujesen al resto del rebaño lechero y no aumentó hasta los 4 años. Este hallazgo es plausible biológica y epidemiológicamente y la explicación más probable es que las técnicas de ELISA y la PCR utilizadas en el presente ensayo permitieron detectar la infección antes que la técnica IDGA empleada en el estudio anterior. Comparativamente en este estudio se trabajó con pocos animales y no fue posible realizar una investigación precisa de la contribución independiente entre edad y grado de contacto horizontal entre ovejas infectadas. Sin embargo, el riesgo de seroconvertir en el grupo H fue marginalmente mayor en el primer año que en el año 2 cuando la seroprevalencia del rebaño al inicio del año fue de 65% y 41% respectivamente, pero similar al tercer año cuando la seroprevalencia fue 47%. La seroprevalencia en el rebaño al comienzo del periodo de exposición a VMV no es una variable con un valor pronóstico de la incidencia de seroconversión como la seroprevalencia media durante el periodo de exposición a VMV que tiene en 109 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 110 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... cuenta que el tamaño del rebaño no es fijo y hay ovejas que entran y salen en el intervalo entre los análisis [18]. Aún así el número de animales en el grupo L no varió y a pesar de una seroprevalencia inicial del 14% sólo un animal seroconvirtió después de 2 años. Claramente otras variables además de la seroprevalencia en el rebaño influyen en la incidencia de seroconversión. Los grupos H y L fueron distintos respecto a la edad de las ovejas infectadas, el estrés de producción y otros factores relacionados al manejo del rebaño. Los animales infectados del grupo L eran más jóvenes que los del grupo H y se ha visto que los corderos nacidos de ovejas que han estado infectados durante más tiempo tienen más riesgo de infectarse que corderos nacidos de ovejas con infecciones más recientes [184]. Es muy posible que la carga viral y la excreción de virus sea mayor en ovejas que llevan más tiempo infectadas que en las que llevan menos tiempo infectadas. Es probable que la cantidad de virus excretada por los machos infectados de este estudio estuviese por debajo del umbral de infección del VMV. La relación entre el estrés productivo y la susceptibilidad a las infecciones no está bien documentada, por ejemplo, las vacas lecheras de alta producción son más susceptibles a sufrir mamitis clínicas que las vacas de baja producción [215]. De modo similar las ovejas en producción lechera podrían estar más comprometidas inmunológicamente y ser más sensibles a la infección de VMV que machos castrados inactivos. Además, las ovejas del grupo H se alojaron en una nave con mayor densidad de animales, más vieja y con peor ventilación que la nave que albergó al grupo L y a los ovinos del grupo H se les ofreció la comida en una cinta que permitía el contacto nariz con nariz entre ovejas en vez de en pesebres unidireccionales empleados para el grupo L. Varios estudios han descrito diferencias en la seroprevalencia de VMV entre machos y hembras, sin embargo no hay razones biológicas aparentes que las justifiquen y se consideran asociadas al distinto manejo de carneros y ovejas en la mayoría de los rebaños [10, 213]. La correlación entre los resultados de ELISA y LTR-PCR en este estudio fue muy buena y significativamente mejor que durante los primeros 6 meses de vida [5]. Las dos técnicas son altamente específicas [79, 193, 229] y la diferencia en la sensibilidad podría deberse a que las técnicas miden procesos biológicos distintos. La LTR-PCR identifica provirus y el ELISA detecta anticuerpos y ambos no tienen necesariamente que estar presentes simultáneamente. El aumento de la concordancia de los ensayos con la edad sugiere que la viremia asociada a células se incrementa con el tiempo de infección. El riesgo de seroconvertir después de un año de edad fue independiente de haber tenido un resultado PCR-positivo en seis análisis realizados durante el primer año de edad. Esto puede indicar que algunos individuos y bajo circunstancias particulares podrían ser capaces de eliminar la infección. Sin embargo no hay evidencia de autocuración en infecciones por VMV y retrovirus en general. Alternativamente, es posible que estos animales se infectasen pero no produjesen anticuerpos tempranamente. Otra posibilidad es que algunos de los resultados PCR-positivos se hubiesen interpretado erróneamente. Como ya se describió en el primer capítulo experimental de esta tesis algunos laboratorios europeos obtuvieron algunos resultados aparentemente falsos positivos, sin embargo la prueba fue desarrollada y validada en nuestro laboratorio con un 100% de especificidad [79]. 110 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 111 5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTAL POR VMV EN OVINO LATXO... Los resultados de este estudio tienen implicaciones importantes desde el punto de vista del diagnóstico y control del VMV. Los ELISA recombinantes como el empleado en este estudio bastarían para el diagnóstico rutinario de la infección por VMV en ganado adulto puesto que su sensibilidad es similar a la de la LTR-PCR y este último ensayo es mucho más caro. Apenas hay estudios comparativos de distintos ensayos de PCR en la literatura internacional de VMV aunque como se describió en el capítulo cuatro la LTR-PCR fue más sensible que todas las otras PCR analizadas. Entre las implicaciones de este trabajo en el control del VMV cabe destacar que en vistas de que las corderas de reposición se infectan con facilidad al poco de entrar en el rebaño lechero principal, es quizás poco el beneficio que se puede obtener criándolas artificialmente para evitar la infección lactógena. Es posible sin embargo, que si se previene la transmisión lactógena y se retrasa la infección, las ovejas puedan alcanzar la etapa de máxima productividad antes de padecer efectos clínicos por VMV. Otro aspecto de control importante es que en determinadas circunstancias, como en las del grupo L, la infección horizontal puede mantenerse muy baja. Por extensión cabría esperar escasa transmisión horizontal en rebaños donde los animales tienen poco contacto entre sí. Esto, unido a una transmisión lactógena relativamente baja [5] podría explicar que la prevalencia de VMV en rebaños extensivos del sur de España sea escasa o nula (información pendiente de publicación) y que la enfermedad no se haya diagnosticado nunca en países como Australia y Nueva Zelanda [184] 111 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 113 6. CONCLUSIONES FINALES 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 115 (a) Elaboración de ensayos de PCR para el diagnóstico de las infecciones por LVPR en Europa y análisis comparativo de las PCRs de LVPR más empleadas en Europa: Primera: Es posible detectar LVPR de origen ovino y caprino de diferentes países de Europa con distintas PCRs pero la sensibilidad de la técnica varía substancialmente según el tipo de ensayo, el laboratorio que lo realiza y el origen geográfico y la especie de la que proviene la muestra. Segunda: Entre las PCRs analizadas la LTR-PCR fue más sensible que las PCRs que amplificaron secuencias gag y pol y esto podría estar asociado por un lado a una mayor heterogeneidad genética en las secuencias empleadas para diseñar los cebadores GAG y POL que en las secuencias de los cebadores LTR y por otro lado, a que en los provirus de los LVPR existen dos secuencias LTR y una sola secuencia gag y pol y esto duplica teóricamente la probabilidad de obtener un producto amplificado. Tercera: La LTR-PCR permitió detectar la infección en animales jóvenes con anticuerpos calostrales y en animales sin anticuerpos de lo que se deduce que la PCR puede cubrir las necesidades de diagnóstico durante un periodo en el que el ELISA no puede utilizarse. (b) Detección por PCR de VMV libre y asociado a células en calostro y sangre de ovejas seropositivas y la relación con la infección en corderos: Primera: Se observó una buena correlación entre los ensayos de PCR para secuencias LTR y gag de VMV libre y asociado a células en calostro de ovejas seropositivas indicando que cuando hay VMV en calostro coexisten ambas formas víricas. Segunda: No todos los calostros con anticuerpos frente a VMV fueron PCR-positivos, esto es compatible con que las técnicas miden procesos biológicos distintos y con que la cantidad de VMV existente en calostro varíe sustancialmente. Tercera: El riesgo de infección en los corderos por consumo de calostro con anticuerpos anti-VMV pero PCR-negativo a VMV es significativamente menor que el asociado al consumo de calostro PCR-positivo a VMV excepto cuando los corderos consumen gran cantidad de calostro. Esto refuerza la hipótesis de que la cantidad de VMV en calostro con anticuerpos frente a VMV varía pero que el virus está presente en la mayoría de los calostros con anticuerpos. Cuarta: En cualquier caso, la relación entre la presencia de virus en el calostro y el riesgo de seropositividad al año de edad dependió del modo de ingestión del calostro. 115 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 116 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... (c) Análisis mediante ELISA y LTR-PCR de la infección horizontal por VMV en ovino adulto de raza latxa criado bajo distintas presiones de infección a VMV: Primera: Se confirma experimentalmente la eficacia de la transmisión horizontal de VMV en rebaños de raza latxa en ordeño y se observa por primera vez que la transmisión es máxima durante el primer año de vida y aumenta con la edad hasta los 3 años de vida. Segunda: Se observó una buena correlación entre el estado de PCR y de ELISA a partir del año de edad compatible con una mayor probabilidad de viremia al aumentar el tiempo de infección. Tercera: Finalmente, este estudio demuestra que la infección horizontal entre animales infectados y sanos estabulados y en el mismo corral puede ser mínima y que sería de gran utilidad investigar más los aspectos que condicionan la transmisión del agente para facilitar el diseño de estrategias más precisas de control de la infección por VMV. 116 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 117 7. APÉNDICE 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 119 a) Diluyente de la muestra (DDM) = Tampón fosfato con cloruro sódico, Tritón 1, estabilizadores de proteína y kathon CG al 0,05% (conservador). b) Solución de lavado (SDL) = Tampón fosfato con 1,25% de Tween 20. c) Diluyente del conjugado (DDC) = Tampón fosfato con estabilizadores de la proteína y del enzima y Kathon CG 0,05% (conservador). d) Conjugado = Anticuerpos de conejo frente a IgG de oveja marcado con peroxidasa (HRP) e) Tetrametil Benzidina disuelta en Dimetil Sulfóxido (TMB): Sustancia reveladora. f) Tampón del substrato (TDS) = Tampón citrato fosfato con 0,006% de peróxido de hidrógeno. g) Fosfato Salino Estéril (PBS ) = 100mM NaCl, 3mM Na2HPO4 y KH2PO4, pH 7,8 con HCl h) TE estéril a pH 8.0 = 10mM Tris.Cl (pH 8,0), 1mM EDTA (pH 8,0) i) Dodecil Sulfato Sódico 10% (SDS) = 100g SDS, 900ml H20 a 68°C hasta disolver, corregir pH a 7,2 con HCL, ajustar el volumen a 1000ml con H20. j) Proteinasa K = 160U/ml k) Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamílico (25:24:1 ) l) Cloroformo: Alcohol Isoamílico (24:1) = 96ml de CHCL3, 4ml de C5H11OH m) Acetato Sódico 3M = 408,1g Acetato Sódico 3H20 en 800ml de H20, corregir pH a 7.0 con ácido acético, ajustar el volumen a 1000ml con H20. n) Bromuro de Etidio = 1mg/ml. o) Azul de Bromofoenol al 10% = 0,25% azul de bromofenol y sacarosa 40% p) Gel de agarosa al 2% = marca y calidad molecular en tampón TBE 1x q) TBE 1X = Tris Borato EDTA: Tris Base 1M, ácido bórico 1M y EDTA 20mM 119 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 121 8. ANEXOS 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 123 Anexo 1. Alineamiento del gen gag secuencias descritas en PubMed M10608gag M31646gag NC_001511gag S51392gag NC_001463gag M60610gag M60610gag#2 NC_001452gag Consensus (1) 1 10 20 30 40 (1) -----------------------------------------CCCTTC (1) ----------------------------------------------(1) ----------------------------------------------(1) AGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAAGTAGGGAATAACCCTTC (1) (1) (1) (1) (1) 50 (110) 110 120 130 140 150 M10608gag (69) GGGGCGCGGGCG-TCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACT M31646gag (1) ----------------------------------------------NC_001511gag (1) ----------------------------------------------S51392gag(110) CAGGGGCGAGCTCTGGTCCTGGACCTGAGGAGGGCAAGTGCAGCGCT NC_001463gag (1) ----------------------------------------------M60610gag (69) GGGGCGCGGGCG-TCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACT M60610gag#2 (69) GGGGCGCGGGCG-TCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACT NC_001452gag (1) ----------------------------------------------Consensus(110) GG GCG GC T TCCTGG CC GG CAAG GCA C CT (219) 219 M10608gag(177) M31646gag (27) NC_001511gag (27) S51392gag(219) NC_001463gag (48) M60610gag(177) M60610gag#2(177) NC_001452gag (27) Consensus(219) 230 240 250 260 (546) 546 M10608gag(501) M31646gag(351) NC_001511gag(351) S51392gag(546) NC_001463gag(372) M60610gag(501) M60610gag#2(501) NC_001452gag(351) Consensus(546) (655) 655 660 M10608gag(610) M31646gag(460) NC_001511gag(460) S51392gag(655) NC_001463gag(460) M60610gag(610) M60610gag#2(610) NC_001452gag(460) Consensus(655) 450 560 670 460 570 680 470 580 690 160 480 590 700 123 70 170 270 (328) 328 340 350 360 370 M10608gag(283) ACTATAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGAT M31646gag(133) ACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCT NC_001511gag(133) ACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCT S51392gag(328) ACTGTAGACTTTATATTTGAAGATTTAAAAGGAGAGCCGTGGACCAT NC_001463gag(154) ACATTAGATTACATGTTTGAGGACCATAAAGAGGAACCTTGGACAAA M60610gag(283) M60610gag#2(283) NC_001452gag(133) Consensus(328) (437) 437 M10608gag(392) M31646gag(242) NC_001511gag(242) S51392gag(437) NC_001463gag(263) M60610gag(392) M60610gag#2(392) NC_001452gag(242) Consensus(437) 60 180 280 380 490 600 710 80 190 290 390 500 610 720 90 200 300 400 510 620 730 109 218 310 410 520 630 740 327 420 530 640 750 436 545 654 763 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 124 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... M10608gag M31646gag NC_001511gag S51392gag NC_001463gag M60610gag M60610gag#2 NC_001452gag Consensus (764) 764 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 872 (719) CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGCTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG (569) CATGGACAAGCAAAGATATATTAGAAGTACTAGCCATGATGCCTGGAAATAGGGCGCAAAAAGAGTTAATACAGGGGAAATTAAATGAGGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG (569) CATGGACAAGCAAAGATATATTAGAAGTACTAGCCATGATGCCTGGAAATAGGGCGCAAAAAGAGTTAATACAGGGGAAATTAAATGAGGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG (764) CATGGACAAGCAAGGATATATTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGGAACAGAGCACAGAAAGAGCTGATTCAGGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGATGGGTAAG (569) CCTGGACAAGTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAAAGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAG (719) CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGTTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG (719) CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGTTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG (569) CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGCTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG (764) CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGCTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAGTTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAG M10608gag M31646gag NC_001511gag S51392gag NC_001463gag M60610gag M60610gag#2 NC_001452gag Consensus (873) 873 880 890 900 910 920 930 940 950 960 970 981 (828) ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTGGGACAAACCAATCAGCAGGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAG (678) GCAGAATCCCCCAGGGCCAAATGTCC------TTACTGTGGATCAGATTATGGGAGTCGGACAAACAAATCAACAGGCATCGCAAGCTAATATGGATCAGGCAAGACAG (678) GCAGAATCCCCCAGGGCCAAATGTCC------TTACTGTGGATCAGATTATGGGAGTCGGACAAACAAATCAACAGGCATCGCAAGCTAATATGGATCAGGCAAGACAG (873) GCAGAATCCGCCAGGGCCAAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATCATGGGAGTAGGACAAACAAATCAACAGGCATCACAGGCTAATATGGATCAACGAAGGGAA (678) GAATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATGGGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGCAAGGCAA (828) ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTAGGACAAACCAATCAGCAAGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAG (828) ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTAGGACAAACCAATCAGCAAGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAG (678) ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTGGGACAAACCAATCAGCAGGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAG (873) GCAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTAGGACAAACCAATCAGCAGGCATCTCAAGCTAATATGGATCAGGCAAGACAG M10608gag M31646gag NC_001511gag S51392gag NC_001463gag M60610gag M60610gag#2 NC_001452gag Consensus (982) 982 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 (931) ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACT (781) CTTTGCTTGCAGTGGGTAATAACAGCCTTGAGATCAGTAAGACATATGTCACACAGACCAGGAAATCCTATGCTGATAAAACAAAAGAATAGTGAAAGTTATGAAGATT (781) CTTTGCTTGCAGTGGGTAATAACAGCCTTGAGATCAGTAAGACATATGTCACACAGACCAGGAAATCCTATGCTGATAAAACAAAAGAATAGTGAAAGTTATGAAGATT (976) CTGTGCTTGCAGTGGGTCATAACAGCCTTGAGAGCGGTAAGGCATATGTCGCATAGGCCAGGTAACCCAATGCTGGTAAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGATT (787) ATATGCCTGCAATGGGTAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACATATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAACGAATGAGCCATATGAAGATT (931) ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACT (931) ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACT (781) ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACT (982) ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGATT (1091) 1091 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1199 M10608gag(1040) TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTGACGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACATTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAA M31646gag (890) TTATAGCAAGATTGCTAGAAGCAATTGATACAGAACCCGTCACGGATCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACTCTGTCGTTCACAAATGCTAGCACAGATTGTCAAA NC_001511gag (890) TTATAGCAAGATTGCTAGAAGCAATTGATACAGAACCCGTCACGGATCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACTCTGTCGTTCACAAATGCTAGCACAGATTGTCAAA S51392gag(1085) TCATAGCGAGGTTGCTGGAAGCAATTGATGCAGAACCAGTCACCGACCCTATAAAGACATATTTCAAAAGTGACTCTG-CATACACGAATGCTAGTACAGATTGTCAAA NC_001463gag (896) TTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGCCAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCT-AAAGCTAACACTATCTTATACAAATGCATCAGCAGATTGTCAGA M60610gag(1040) TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTAATGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACGTTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAA M60610gag#2(1040) TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTAATGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACGTTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAA NC_001452gag (890) TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTGACGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACATTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAA Consensus(1091) TCATAGCTCGCCTGCTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGT ACGGACCCTATAAAAACATATTT AAAAGTAAC TTGTCATATACAAATGCTAGCACAGATTGTCAAA (1200) 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1308 M10608gag(1148) AGCAGATGGATAGGACATTGGGGACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGC M31646gag (998) AACAAATGGACAGAGTGTTAGGGACAAGAGTCCAACAGGCATCAGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTCGGGACGTAGGATCAGAAGGATTTAAAATGCAGCTGTTAGC NC_001511gag (998) AACAAATGGACAGAGTGTTAGGGACAAGAGTCCAACAGGCATCAGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTCGGGACGTAGGATCAGAAGGATTTAAAATGCAGCTGTTAGC S51392gag(1193) AGCAAATGGACAGAGTCTTGGGAAATAGGGTCCAACAGGCATCAGTAGAAGAGA-GATGCAAGCATGTAGAGATGTAGGATCAGAAGGGTTTAAAATGCAACTGTTAGC NC_001463gag(1004) AGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGTACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGATCAGAAGGGTTCAAAATGCAATTGTTAGC M60610gag(1148) AGCAGATGGATAGGACATTGGGAACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGC M60610gag#2(1148) AGCAGATGGATAGGACATTGGGAACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGC NC_001452gag (998) AGCAGATGGATAGGACATTGGGGACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGC Consensus(1200) AGCAGATGGATAGGACATTGGGGACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTGTTAGC (1309) 1309 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 1417 M10608gag(1257) ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGAAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAAT M31646gag(1107) ACAGGCATTGAGACCGCCACGGAAGGAAGGAAAACAGGGAGTA---CAAAAATGCTATTACTGCGGGAAACCA-GGACATCTCGCAAGGCAATGCAGACAAGGAATAAT NC_001511gag(1107) ACAGGCATTGAGACCGCCACGGAAGGAAGGAAAACAGGGAGTA---CAAAAATGCTATTACTGCGGGAAACCA-GGACATCTCGCAAGGCAATGCAGACAAGGAATAAT S51392gag(1301) ACAGGCCTTGAGACCTCCACGAAAAGGAGGCAACGTAGGGTCAAGTCAAAAATGTTATAATTGTGGGAAAACAAGGACATCTTGCAAGACAATGCAGGCAAGGGATAAT NC_001463gag(1113) ACAAGCATTAAG---GCCAGGAAAAGGAAAAGGGAATGGACAGCCACAAAGGTGTTACAACTGTGGAAAACCG-GGACATCAAGCAAGGCAATGTAGACAAGGAATCAT M60610gag(1257) ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGAAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAAT M60610gag#2(1257) ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGAAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAAT NC_001452gag(1107) ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACAAAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGGAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAAT Consensus(1309) ACAAGCTTTGAGACCGCCAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGGAAACCA GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAAT 124 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 125 8. ANEXOS Anexo 2. Alineamiento parcial del gen gag secuencias descritas en PubMed, zona amplificada por los cebadores Gag 1,2,3 y 4 (1) 1 10 20 30 40 50 60 76 (1) GCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTCAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTT (1) GCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTCAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTT (1) GATAGAGACATGGCGACGCAAGGCTCAAAGGAGAAGAAGGGATACCCTGAGCTCAAAGAGGTCATTAAGACAACAT (1) ---------------------------------------------------------------------------(1) GATAGAGACATGGCGAGGCAAGTCTCCGGGGGGAAAAGAGATTATCCTGAGCTCGAAAAATGTATCAAGCATGCAT (1) GATAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTCAAGAGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAAGAGGTAATAAGGAAAACAT (1) ---------------------------------------------------------------------------(1) G TAGAGACATGGCGA GCAAGGCTCAA GGAGAAAAAGGGATACCC GAGCTCAA GA GT AT AA AAC T (77) 77 90 100 110 120 130 140 154 M10608gag1 (77) GTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACTATAGACT M60610gag1 (77) GTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACTATAGACT MVV31646gag1 (77) GTAAAATAAAGGTGGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGCCTTAAAAACCCTAGACT NC_001511gag1 (1) ------------------------------------TGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGCCTTAAAAACCCTAGACT NC_001463gag1 (77) GCAAGATAAAAGTTCGACTC---AGAGGGGAGCACTTGACAGAAGGAAATTGTTTATGGTGCCTTAAAACATTAGATT S51392gag1 (77) GTAGGATAAGAGTAGGCCCAAGGGAAGGAGAACCCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGCATTAAAAACTGTAGACT NC_001452gag1 (1) -----------------------GAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACTATAGACT Consensus (77) GTAA ATAA GT GG CCC GGGAAGGAGA CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACT TAGACT (155) 155 160 170 180 190 200 210 220 232 M10608gag1(152) TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAA M60610gag1(152) TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAA MVV31646gag1(152) TTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAA NC_001511gag1 (43) TTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAA NC_001463gag1(152) ACATGTTTGAGGACCATAAAGAGGAACCTTGGACAAAAGTAAAATTTAGGACAATATGGCAGAAGGTGAAGAATCTAA S51392gag1(155) TTATATTTGAAGATTTAAAAGGAGAGCCGTGGACCATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAACAGTTAA NC_001452gag1 (54) TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAA Consensus(155) TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGAC ATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAA AGCTAA (233) 233 240 250 260 270 280 290 300 310 M10608gag1(230) CTCCGGAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCA M60610gag1(230) CTCCGGAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCA MVV31646gag1(230) CTCCAGAAGAAACAAGTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCA NC_001511gag1(121) CTCCAGAAGAAACAAGTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCA NC_001463gag1(230) CTCCTGAGGAGAGTAACAAAAAAGACTTTATGTCTTTGCAGGCCACATTAGCGGGTCTAATGTGTTGCCAAATGGGGA S51392gag1(233) CTCCAGAAGAGACAAGTAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACAATGGCTTGCCTTATGTGTAGTCAGCTGGGTA NC_001452gag1(132) CTCCGGAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCA Consensus(233) CTCC GAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACATTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCA (311) 311 320 330 340 350 360 370 388 M10608gag1(308) TGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACACGAAAATAAGGAGGCCAAGG M60610gag1(308) TGAAACCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACAAGAAAATAAGGAGGCCAAGG MVV31646gag1(308) TGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAG NC_001511gag1(199) TGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAG NC_001463gag1(308) TGAGACCTGAGACATTGCAAGATGCAATGGCTACAGTAATCATGAAAGATGGGTTACTGGAACAAGAGGAAAAGAAGG S51392gag1(311) TGAAACCCGAGACAGTGCAAGCAGCAAGGGGAATAATGCATATGAAAGAAGGACTACAGGAGAATAAGGAGGAAAAGG NC_001452gag1(210) TGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACACGAAAATAAGGAGGCCAAGG Consensus(311) TGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAA GGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACACGAAAATAAGGAGGA AAGG (389) 389 400 410 420 430 440 450 466 M10608gag1(386) GGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTATCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAG M60610gag1(386) GGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTACCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAG MVV31646gag1(386) AAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAG NC_001511gag1(277) AAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAG NC_001463gag1(386) AAGACAAA--AGAGAAA----------------AGGAAGAGAGTG---TCTTCCCAATAGTAGTGCAAGCAGCAGGAG S51392gag1(389) AGAAAAAGGTAGAACAACTCTACCCTAATTTAGAGAAACATAGAGAAGTGTACCCTATTGTAAATCTGCAAGCAGGGG NC_001452gag1(288) GGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTATCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAG Consensus(389) AGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCC AACTTAGAGAAACATAG GAAGT TATCCTATTGTAAATTTGCAAGCAGGAG (456) 456 470 480 490 500 510 520 538 M10608gag1 M60610gag1 MVV31646gag1 NC_001511gag1 NC_001463gag1 S51392gag1 NC_001452gag1 Consensus M10608gag1(453) M60610gag1(453) MVV31646gag1(453) NC_001511gag1(344) NC_001463gag1(432) S51392gag1(456) NC_001452gag1(355) Consensus(456) GCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTG GCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTGGAAAGCAGTAGATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTCGCAAGCAGGGGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGATTCAGTAGTCTTCCAGCAATTGCAAACTGTGGCTATGCAGCATGGCCTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTG GCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTT 125 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 126 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Anexo 3. Alineamiento del gen pol secuencias descritas en PubMed M10608pol M60610pol M31646pol NC_001511pol S51392pol NC_001463pol NC_001452pol Consensus (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) ACAAGGAATAATATGCCATCATTGTGGAAAAAGAGGACATATGCAAAAGGACTGCCGGCAGAA---------------GAAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGC ACAAGGAATAATATGCCATCATTGTGGAAAAAGAGGACATATGCAAAAGGACTGCCGGCAGAA---------------GAAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGC -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TCCAAC---------------ATCACAGCAGGGAAACAGCAGGAGGGGGC ------------------------------------------------------------CAT---------------ACAGCTGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGC ------------ATGTCACAACTGTGGAAAGAGAGGACATATGCAAAAAGAATGCAGAGGAAAGAGAGACATAAGGGGAAAACAGCAGGGAAACGGGAGGAGGGGGA ------------ATGCCATCATTGTGGAAAAAGAGGACATATGCAAAAGGACTGCCGGCAGAA---------------GAAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGC ATG CA A TGTGGAAA AGAGGACATATGCAAAA GA TGC G C AA AAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGC M10608pol M60610pol M31646pol NC_001511pol S51392pol NC_001463pol NC_001452pol Consensus (108) (93) (93) (1) (36) (33) (96) (81) (108) CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCCAAAATAGAAATAAAAGTAGGAACAAGGTGGAAAAAATTATTAGTAGATACGGGGGCAG CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCCAAAATAGAAATAAAAGTAGGAACAAGGTGGAAAAAATTATTAGTAGATACGGGGGCAG ----------------------------------------------------------------------------------------------------------CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCAAAGATAGATATAAAGGTAGGGACAAATTGGAAAAAGGTATTAGTAGATACTGGGGCAG CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCTCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCAAAGGCAGAAATAAAGGTAGGGACAACATGGAGAATGTTATTAGTAGACACCGGAGCAG TACGTGTGGTGCCGTCCGCTCCTCCTATGGAATAACTTCAGCACCACCTATGGTTCAGGTCCGCATAGGTTCCCAGCAGAGGAACTTGTTATTTGATACCGGGGCGG CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCCAAAATAGAAATAAAAGTAGGAACAAGGTGGAAAAAATTATTAGTAGATACAGGGGCAG CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACC AA ATAGAAATAAA GTAGG ACAA GTGGAAAAA TTATTAGTAGATAC GGGGCAG M10608pol M60610pol M31646pol NC_001511pol S51392pol NC_001463pol NC_001452pol Consensus (215) (200) (200) (1) (143) (140) (203) (188) (215) ATAAAACTATAGTAACATCCCATGATATGTCAGGGATACCAAAGGGAAGGATAATATTACAGGGCATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGAACAAGTACAC ATAAAACTATAGTAACATCCCATGATATGTCAGGGATACCAAAGGGAAGGATAATATTACAGGGCATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGAACAAGTACAC ----------------------------------------------------------------------------------------------------------ATAGAACTATAGTAAGATATCATGACAATTCGGGAATACCCACAGGGAGAATAAAACTACAAGGGATAGGAGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGATAAAGTAGTA ATAGGACAATAGTAAGATATCATGATAATTCGGGAATACCAAAAGGAAGAATAAAATTGCAGGGTATAGGGGGAATTATAGAAGGAGAAAAATGGGACAAAGTGGCG ACCGAACTATAGTTAGATGGCATGAGGGCTCGGGAAACCCAGCCGGAAGGATAAAACTGCAAGGAATAGGAGGAATAGTAGAAGGAGAAAAATGGAATAATGTAGAA ATAAAACTATAGTAACATCCCATGATATGTCAGGGATACCAAAGGGAAGGATAATATTACAGGGCATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGAACAAGTACAC ATA AACTATAGTAA AT CATGATA TC GG ATACCAAA GGAAGGATAA ATTACAGGG ATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGA AAGTA A M10608pol M60610pol M31646pol NC_001511pol S51392pol NC_001463pol NC_001452pol Consensus (322) (307) (307) (1) (250) (247) (310) (295) (322) TTGCAATATAAAGATAAAATGATCAAAGGTACCATAGTGGTGTTAGCTACGAGTCCGGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGAGAGAATTGGGAATAGGATTAAT TTGCAATATAAAGATAAAATGATCAAAGGTACCATAGTGGTGTTAGCTACGAGTCCGGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGAGAGAATTAGGAATAGGATTAAT ------------------------------------GTGGTACTGCCCAGTAGTCCAGTAGAGGTATTAGGAAGGGATAATATGGCAAAATTAGACATAGGAATAAT ATACAATATAAAGAAAAAAGAATAGAAGGGACAATAGTGGTACTGCCCAGTAGTCCAGTAGAGGTATTAGGAAGGGATAATATGGCAAAATTAGACATAGGAATAAT TTACAGTATAAAGAAAAAAGAATCTTGGGTACAATAGTAGTACTGCCTAGCAGTCCAGTGGAGGTATTAGGAAGGGATAATA-GGGAGAATTAGGAATAGGACTAAT TTAGAATATAAAGGAGAAACAAGAAAGGGAACAATAGTAGTGTTACCACAAAGTCCAGTAGAAGTATTAGGACGAGATAACATGGCCCGATTTGGAATAAAGATAAT TTGCAATATAAAGATAAAATAATCAGAGGTACCATAGTGGTGTTAGCTACGAGTCCGGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGAGAGAATTGGGAATAGGATTAAT TT CAATATAAAGA AAAA AATCAAAGGTAC ATAGTGGTGTTACCTA 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ANEXOS (964) (948) (948) (606) (891) (888) (951) (936) (964) CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGGACTAGAAGAGCACAGGGGTATCGTGAACGAACTAGCATCATATATAGCGC CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGGACTAGAAGAGCACAGGGGTATCGTGAACGAACTAGCATCATATATAGCGC TCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATTTATATAGGGAGTGATTTGGATATAATGAAACACAGAGAGATAGTAGAAGAACTAGCTAGCTATATTGCCC TCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATTTATATAGGGAGTGATTTGGATATAATGAAACACAGAGAGATAGTAGAAGAACTAGCTAGCTATATTGCCC CCCTATGGTGCAATTTGGGATATATATGGATGATATCTATATAGGCAGTGATTTAGAAATGGGGGAACACAGAAGAATAGTAGAAGAACTTGCCAGTTATATTGCCC TCCAGAAATTCAATTTGGCATATATATGGATGATATTTACATAGGAAGTGATTTAGAAATTAAAAAGCATAGAGAAATAGTGAAAGATTTAGCCAATTATATTGCCC CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGGACTAGAAGAGCACAGGGGTATCGTGAACGAACTAGCATCATATATAGCGC CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGAAATAGAAGAGCACAGAGG ATAGTGAAAGAACTAGC A TATATTGCCC (1071) M10608pol(1055) M60610pol(1055) M31646pol (713) NC_001511pol (998) S51392pol (995) NC_001463pol(1058) NC_001452pol(1043) Consensus(1071) AATATGGATTCATGCTGCCTGAAGATAAGAGGCAAGAAGGATACCCGGCGAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTC AATATGGATTCATGCTGCCTGAAGATAAGCGGCAAGAAGGATACCCGGCTAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTC AGTATGGATTTATGTTACCAGAAGAAAAGAGACAAGAAGGGTATCCAGCAAAGTGGCTTGGATTTGAATTGCACCCAGAGAAATGGAGATTTCAGAAACATACACTT AGTATGGATTTATGTTACCAGAAGAAAAGAGACAAGAAGGGTATCCAGCAAAGTGGCTTGGATTTGAATTGCACCCAGAGAAATGGAGATTTCAGAAACATACACTT AATATGGGTTTATGCTGCCGGAAGAAAAGAGGCAAGAAGGGTATCCAGCAAATTGGCTTGGATTTGAACTACATCCAGAGAGATGGAAGTTTCAAAAACATAAGCTT AATATGGATTCACTCTGCCAGAAGAGAAGAGACAAAAGGGATATCCAGCAAAATGGCTAGGATTTGAACTACACCCGCAGACCTGGAAATTTCAGAAGCATACATTA AATATGGATTCATGCTGCCTGAAGATAAGAGGCAAGAAGGATACCCGGCTAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTC AATATGGATTCATGCTGCC GAAGA AAGAGGCAAGAAGGATATCCAGCAAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCT (1178) M10608pol(1162) M60610pol(1162) M31646pol (820) 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(1927) M10608pol(1911) M60610pol(1911) M31646pol(1569) NC_001511pol(1854) S51392pol(1851) NC_001463pol(1914) NC_001452pol(1899) Consensus(1927) ATTTATGTTGCGGAACTGGGACGAAGAAGTAATAAGAAACCCTATACAAGCGAGAATTATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAAATAGGGGTACATTGGGTGCCTG ATTTATGTTGCGGAACTGGGACGAAGAAGTAATAAGAAACCCTATACAAGCGAGAATTATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAAATAGGGGTACATTGGGTGCCTG ATTTATGAGAAGAAATTGGGATGAAGAAGTTATAAAGAACCCAATACAGGCTAGAATTATGAAATTAGTGCATGATAAGGAACAGATAGGGGTACATTGGGTACCTG ATTTATGAGAAGAAATTGGGATGAAGAAGTTATAAAGAACCCAATACAGGCTAGAATTATGAAATTAGTGCATGATAAGGAACAGATAGGGGTACATTGGGTACCTG GTTCATGATAAGGAACTGGGATGAAGAAGTTATAAAGAATCCAATACAGGCACGAATCATGAAGTTGATACATAGTAAGGAGAAGGTAGGGATACATTGGGTGCCAG ATTTTTATTAAGAAATTGGGATGAAGAAGTAATAAAGAATCCAATTCAAGCAAGAATTATGGAAATTGCCCACAAGAAAGATAGGATAGGAGTGCATTGGGTGCCAG ATTTATGTTGCGGAACTGGGACGAAGAAGTAATAAGAAACCCTATACAAGCGAGAATCATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAAATAGGGGTACATTGGGTGCCTG ATTTATGTTAAGGAACTGGGATGAAGAAGTAATAAAGAACCCAATACAAGC 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TTTAGGGTGCAAACTATGAAATGGTATGCGATGTTTGCCCCGAAATCATTGCAGTCTGATAACGGACCAGCATTTGTAGCAGAATCTACTCAGCTCTTAATGAAATA TTTAGGGTGCAAACTATGAAATGGTATGCGATGTTTGCCCCGAAATCATTGCAGTCTGATAACGGACCAGCATTTGTAGCAGAATCTACTCAGCTCTTAATGAAATA TTTAGAATCATGACTATAAGGTGGTATGGTCTGTTTGCCCCAAAGTCATTGCAGTCTGACAATGGACCAGCATTTGTAGCAGAGCCAACACAGCTACTAATGAAATA TTTAGAATCATGACTATAAGGTGGTATGGTCTGTTTGCCCCAAAGTCATTGCAGTCTGACAATGGACCAGCATTTGTAGCAGAGCCAACACAGCTACTAATGAAATA TTTAGAGTAACAACTATGAGGTGGTATGCTCTGTTCGCCCCAAAATCATTGCAGTCAGATTATGGGCCAGCATTTATAGCAGAAGCAACACAATTGTTAATGACATA TTCAGAATAAAAGTGATGCATTGGTATGCATTATTTGGTCCAGAGTCATTGCAGTCAGACAATGGACCTGCATTTGCAGCAGAGCCCACACAGCTGTTAATGCAATA TTTAGGGTGCAAACTATGAAATGGTATGCGATGTTTGCCCCGAAATCATTGCAGTCTGATAACGGACCAGCATTTGTAGCAGAATCTACTCAGCTCTTAATGAAATA TTTAGAGT AAAACTATGAA TGGTATGC TGTTTGCCCCAAAATCATTGCAGTCTGATAATGGACCAGCATTTGTAGCAGAA C ACACAGCT TTAATGAAATA 1927 2034 1940 2040 2141 2050 2150 2248 2800 2180 2380 2700 2810 2190 2390 2710 2820 2200 2400 2720 2830 128 2210 2410 2730 2840 2220 2420 2850 2230 2430 2440 2750 2860 2450 2550 2650 2870 2140 2354 2461 2568 2660 2760 2033 2247 2340 2540 2640 2740 2130 2330 2530 2630 2020 2120 2320 2520 2620 2010 2110 2310 2510 2610 2000 2100 2300 2500 2600 1990 2090 2290 2490 2590 1980 2080 2280 2480 2690 2790 2170 2370 2580 1970 2070 2270 2470 2676 2783 2060 2260 2569 1960 2160 2355 2360 2462 1950 2770 2675 2782 2889 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 129 8. ANEXOS (2890) M10608pol(2874) M60610pol(2874) M31646pol(2532) NC_001511pol(2817) S51392pol(2814) NC_001463pol(2877) NC_001452pol(2862) Consensus(2890) TTTGGGCATAGAACATACTACAGGGATCCCCTGGAACCCACAATCTCAAGCATTAGTAGAGAGAACACATCAGACGTTAAAGAATACATTAGAAAAACTTATACCTA TTTGGGCATAGAACATACTACAGGGATCCCCTGGAACCCACAATCTCAAGCATTAGTAGAGAGAACACATCAGACGTTAAAGAATACATTAGAAAAACTTATACCTA TTTGGGGATAACACACACAACAGGGATACCATGGAATCCCCAATCGCAAGCACTAGTAGAAAGAACTCATCAAACTCTAAAAAATACAATAGAAAAATTTGTTTCTA TTTGGGGATAACACACACAACAGGGATACCATGGAATCCCCAATCGCAAGCACTAGTAGAAAGAACTCATCAAACTCTAAAAAATACAATAGAAAAATTTGTTTCTA TCTAGGTGTAGAACACACAACCGGCATACCTTGGAATCCACAGTCTCAAGCTCTCGTAGAAAGAGCTCATCAGACTTTAAAGAAAACAATTGAAAAACTTGTTCCTA CCTAGGAGTAAAACACACAACAGGCATACCTTGGAATCCACAGTCTCAGGCTATAGTAGAAAGGGCACATCAACTATTGAAAAGCACTTTAAAGAAGTTCCAGCCAC TTTGGGCATAGAACATACTACAGGGATCCCCTGGAACCCACAATCTCAAGCATTAGTAGAGAGAACACATCAGACGTTAAAGAATACATTAGAAAAACTTATACCTA TTTGGG ATAGAACACACAACAGGGATACC TGGAATCCACAATCTCAAGCA TAGTAGAAAGAACACATCAGAC TTAAAGAATACATTAGAAAAACTT T CCTA (2997) M10608pol(2981) M60610pol(2981) M31646pol(2639) NC_001511pol(2924) S51392pol(2921) NC_001463pol(2984) NC_001452pol(2969) Consensus(2997) TGTTTAATGCGTTTGAATCAGCCCTCGCAGGGACCCTCATTACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAG TGTTTAACGCGTTTGAATCAGCCCTCGCAGGGACCCTCATTACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAG TGTTTGCCTCATTTGATTCAGCAATAGCCGCAGCATTAATCACACTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTCATATTTAATAAG TGTTTGCCTCATTTGATTCAGCAATAGCCGCAGCATTAATCACACTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTCATATTTAATAAG TGTTCTCTGCATTTGAATCACGTGTCGCAGCTGCATTAATAGCTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCGAGGGACAAGCCCTATGGATATATTCATATTTAATAAG AATTTGTCGCTGTAGAATCAGCCATAGCAGCAGCCCTAGTCGCCATAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTGGGGACAAGCCCTATGGATATTTTTATATATAATAAA TGTTTAACGCGTTTGAATCAGCCCTCGCAGGGACCCTCATTACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAG TGTTT CGC TTTGAATCAGCC TCGCAGC GCCCTAAT ACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAG (3101) M10608pol(3085) M60610pol(3085) M31646pol(2743) NC_001511pol(3028) S51392pol(3025) NC_001463pol(3088) NC_001452pol(3073) Consensus(3101) AAGGAACAACAAAGAATACAGCAACAAAGTAAATCAAAACAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA-CAAGAAAAAGAGGGCATCCAGGAGAGTGGCAAGGAC AAGGAACAACAAAGAATACAGCAACAAAGTAAATCAAAACAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA-CAAGAAAAAGAGGGCATCCAGGAGAGTGGCAAGGAC AAGGAACAGCAAAGAATACAACAGCAATCTACAAGAAATCAATCAAAATTTCGATTTTGTTATTACAGAG-TCAGGAAAAGAGGACACCCAGGCGAGTGGCTGGGAC AAGGAACAGCAAAGAATACAACAGCAATCTACAAGAAATCAATCAAAATTTCGATTTTGTTATTACAGAG-TCAGGAAAAGAGGACACCCAGGCGAGTGGCTGGGAC AAGGAACAGCAAAGAATACAACAACAGTATAAATTAAATCAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATT-CAGAGATCAGAAAAAGAGGACACCCGGGAGACTGGCTGGGAC AAAGAACAGAAAAGAATAAATAATAAATATAATAAAAATTCTCAAAAAATTCAATTCTGTTATTACAGAA-TAAGGAAAAGAGGACATC-AGGAGAGTGGAAAGGAC AAGGAACAACAAAGAATACAGCAACAAAGTAAATCAAAACAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA-CAAGAAAAAGAGGGCATCCAGGAGAGTGGCAAGGAC AAGGAACAGCAAAGAATACA CAACAAT TAAAT AAATCAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA TAAGAAAAAGAGGACATCCAGGAGAGTGGCAAGGAC (3208) M10608pol(3191) M60610pol(3191) M31646pol(2849) NC_001511pol(3134) S51392pol(3131) NC_001463pol(3193) NC_001452pol(3179) Consensus(3208) CAACACAGGTACTTTGGGGCGGGGACGGTGC-GATTGTAGTGAAAGACAGAGGCACAGATAGATATCTGGTGATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACC CAACACAGGTACTTTGGGGCGGGGACGGTGC-GATTGTAGTGAAAGACAGAGGCACAGATAGATATCTGGTGATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACC CAACACAGGTACTCTGGGAAGGGGAAGGAGC-AATCGTAATAAAAGATAAAAATCTAGAAAAGTATTTAGTCATAGCAAAAAAGGATGTTAAGTTCATACCGCAACC CAACACAGGTACTCTGGGAAGGGGAAGGAGC-AATCGTAATAAAAGATAAAAATCTAGAAAAGTATTTAGTCATAGCAAAAAAGGATGTTAAGTTCATACCGCAACC CGTCTCAGGTACTCTGGGAAGGGGAAGGAGC-TAAGATCGTAAAAGATAGAACTCTAGATAAGTATTTAGTAATAGCTAATAAAGATGTTAAATTCATACCGCAGCC CAACCCAGGTACTGTGGAAAGGGGAAGGAGCCAATTGTGGTAAAGGATATAGAAAGTGAAAAGTATTTAGTAATACCTTACAAAGATGCAAAATTCATCCCGCCACC CAACACAGGTACTTTGGGGCGGGGACGGTGC-GATTGTAGTGAAAGACAGAGGCACAGATAGATATCTGGTGATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACC CAACACAGGTACT TGGGAAGGGGAAGGAGC ATTGTAGTAAAAGATAGAG A AGATAAGTATTTAGT ATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACC 2890 2900 2997 3101 3208 2910 3010 3110 3220 2920 3020 3120 3230 2930 3030 3130 3240 2940 3040 3140 3050 3150 3250 129 2950 3260 2960 3060 3160 3270 2970 3070 3170 3280 2980 3080 3180 3290 3090 3190 3300 2996 3103 3207 3314 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 130 DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO... Anexo 4. Alineamiento parcial del gen POL, secuencias descritas en PubMed, zona amplificada por los cebadores POL M10608pol1 M31646pol1 NC_001511pol1 NC_001463pol1 S51392pol1 M60610pol1 NC_001452pol1 Consensus (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) ATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATA ACAGTAAATGGCATCAAGATGCTGGGTCATTACACTTAGACTTTGGGATACCCCGAACTGCAGCTGAGGATA ACAGTAAATGGCATCAAGATGCTGGGTCATTACACTTAGACTTTGGGATACCCCGAACTGCAGCTGAGGATA ACACAAAATGGCATCAAGATGCCCGATCATTGCATCTAGAATTTGAAATTCCAAGAACAGCAGCAGAAGACA -TAGTAAATGGCATCAAGATGCTCAATCATTGCATCTAGAATTTGACATACCAAGAACAGCGGCTCAAGATA ATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATA ATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATA ATA AAATGGCATCAAGATGCTG GTCATTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGAACAGC GCAGAAGATA M10608pol1 M31646pol1 NC_001511pol1 NC_001463pol1 S51392pol1 M60610pol1 NC_001452pol1 Consensus (73) (73) (73) (73) (73) (72) (73) (73) (73) TAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCA TTGTACAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCCAGCACAATAAGGGGAAGCAATAGGAGAGGAA TTGTACAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCCAGCACAATAAGGGGAAGCAATAGGAGAGGAA TAGTAAATCAATGTGAAATATGCAAAGAAGCGAGGACACCTGCAGTAATTAGAGGCGGAAACAAAAGGGGGG TAGTGCAACAATGTGAAATATGTCAAGAAAATAAAATGCCTAATACAATGAGAGGAAGTAACAAGAGGGGAA TAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCA TAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCA TAGT CAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACAATAAGAGGCAGTAATAAAAGGGG A (144) M10608pol1(144) M31646pol1(144) NC_001511pol1(144) NC_001463pol1(144) S51392pol1(143) M60610pol1(144) NC_001452pol1(144) Consensus(144) 1 73 144 10 80 150 20 90 160 30 100 170 40 110 180 50 120 190 60 130 200 72 144 218 ATAGACCATTGGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGA ATAGATCATTGGCAAGTAGACTATACACATTATGAGGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGA ATAGATCATTGGCAAGTAGACTATACACATTATGAGGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGA GTAAATCATTGGCAAGTGGATTATACCCATTATGAAAATATCATACTATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGA ATAGATCATTGGCAAGTGGATTACACTCATTTTGAAGATAAGATATTACTAGTATGGGTAGAAACAAATTCGGGA ATAGACCATTGGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGA ATAGACCATTGGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGA ATAGATCATTGGCAAGTAGACTATACCCATTATGAAGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGA 130 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 131 8. ANEXOS Anexo 5. Alineamiento del la región LTR, secuencias descritas en PubMed y zona amplificada por los cebadores LTR. M10608ltr1 M60610ltr1 M31646ltr1 NC_001511ltr1 NC_001463ltr1 S51392ltr1 NC_001452ltr1 Consensus (1) 1 10 20 30 40 50 60 70 80 (1) TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCTGCTTTTTTGCGCTAAGTCATGTAGCAGCTGATGCTTGAGTCATAACCGCAG (1) TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCTGCTTTTTTGC--TAAGTCATGTAGCAGCTGATGCTTGAGTCATAACCGCAG (1) TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCCGCTTGTAAACGCTAAATCATGTATCAGCTGATGCTTAGGTCATAACCGCAA (1) TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCCGCTTGTAAACGCTAAATCATGTATCAGCTGATGCTTAGGTCATAACCGCAA (1) -GACAAAGCAAAATGTAACCGCAAGTGCTGACAG-ATGTAACAGCTGACATATCAGCTGATGCTT-GCTCATG-CTGACA (1) TGACATAGCAAA-TGTAACCGCAAG------------GCGCAAAGTCATGTATCAGCTGATGCTTAAGTCATAACCACAA (1) TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCTGCTTTTTTGCGCTGAGTCATGTAGCAGCTGATGGTTAAGTCATAACCGCAG (1) TGACACAGCAAA TGTAACCGCAAGTTCTGCTT T TGCGCTAAGTCATGTATCAGCTGATGCTTAAGTCATAACCGCAA M10608ltr1 M60610ltr1 M31646ltr1 NC_001511ltr1 NC_001463ltr1 S51392ltr1 NC_001452ltr1 Consensus (81) 81 90 100 110 120 130 140 150 160 (80) ATGTAAACAAGTTGCCTATATAAGCCGCTTGCTAGCTGGGGAAAA-GCAGAGTGCTTTGGAGAGCTCGAAGGAAAGAGTC (78) ATGTAAACAAGTTGCCTATATAAGCCGCTTGCTAGCTGGGGAAAA-GCAGAGTGCTTTGGAGAGCTCGAAGGAAAGAGTC (80) TTGTAAACAAGTTGCCTATAAAAGCTGCTTGCTAGCTGGGAGAGA-TCAGAGCACTCTTGGGAG-TGGAAG------CTC (80) TTGTAAACAAGTTGCCTATAAAAGCTGCTTGCTAGCTGGGAGAGA-TCAGAGCACTCTTGGGAG-TGGAAG------CTC (77) CTGTAGCTCTGAGCTGTATATAAGGAGAA-GCTTGCTGCTTGCACTTCAGAGTTCTA-GGAGAG------T------CCC (68) TTGTAAACATGCTGCCTATAAAAGCTGCTTGCCTGTAGGTTGAG--GCAGAGTGCTTGGGAGAG----AACC-----CTC (80) ATGTAAACAAGTTGCCTATATAAGCCGCTTGCTAGCTGGGGAAAA-GCAGAGTGCTTTGGAGAGCTCGAAGGAAAGAGTC (81) TGTAAACAAGTTGCCTATATAAGC GCTTGCTAGCTGGG GAAA GCAGAGTGCTTTGGAGAG T GAAG CTC (161) 161 170 180 190 200 210 220 230 240 M10608ltr1(159) TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC----CTGAAAAGCTC----AATAAAGGAGT---TGGCTGATATCTGAGCT-TGCCTGGTT M60610ltr1(157) TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC----CTGAAAAGCTC----AATAAAGGAGT---TGGCTGATATCTGAGCT-TGCCTGGTT M31646ltr1(152) -CCGGGTCTCTCCTGCCTGA----CTGTGGAGA-C----AATAAAGGAGT---TACTTTACAACTGCGCT-AGCCTGGTT NC_001511ltr1(152) -CCGGGTCTCTCCTGCCTGA----CTGTGGAGA-C----AATAAAGGAGT---TACTTTACAACTGCGCT-AGCCTGGTT NC_001463ltr1(143) TCCTAGTCTCTCCTCTCCGAGGAGGTACCGAGACCTCAAAATAAAGGAGTGATTGCCTTACTGCCGAGTGGAGAGTGATT S51392ltr1(137) -CCTGGCCTCTCCTGCTTGCA---CTGGAGAGT-T----AATAAAGGAGT---TGGCTGTTC-CTGAGCT-GGTCTGGTT NC_001452ltr1(159) TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC----CTGAAAAGCTC----AATAAAGGAGT---TGGCTGATATCTGAGCT-TGCCTGGTT Consensus(161) TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC CTG AGAG C AATAAAGGAGT TGGCTGATA CTGAGCT GCCTGGTT (241) 241 250 260 270 280 290 300 310 320 M10608ltr1(227) ATT-------------ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG M60610ltr1(225) ATT-------------ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG M31646ltr1(218) ATT-------------ATCGGGATTCGTCACTAATTCTGTGCAACACCAGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG NC_001511ltr1(218) ATT-------------ATCGGGATTCGTCACTAATTCTGTGCAACACCAGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG NC_001463ltr1(223) ACTGAGCGGCCGGTGTATCGGGAGTCGTCCCTTAATCTGTGCAATACCAGAGCGGCTCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG S51392ltr1(203) TTT-------------TTCGGGATCCGTTACTAATTCCGTGCAATACCGGAGCGGGTCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG NC_001452ltr1(227) ATT-------------ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG Consensus(241) ATT ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGG 131 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 133 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 135 [1] Adams, D.S, Klevjer-Anderson, P., Carlson, J.L., McGuire, T.C., Gorham, J.R.: «Transmission and control of caprine arthritis-encephalitis virus», Am J Vet Res. 44 (1983) 1670-1675. [2] Agnarsdottir, G., Thorsteinsdottir, H., Oskarsson, T., Matthiasdottir, St Haflidadottir, B., Andresson, O.S., Andresdottir, V.: «The long terminal repeat is a determinant of cell tropism of maedi-visna virus», J Gen Virol. 81 (2000) 1901-1905. [3] Alkan, F., Tan, M.T.: «A comparative study on the diagnosis of maedi-visna infection in serum and colostrum samples using agar gel immunodiffusion (AGID) technique», Deut Tierarztl Woch. 105 (1998) 276-278. [4] Álvarez, V., Arranz, J., Daltabuit-Test, M., Leginagoikoa, I., Juste, R.A., Amorena, B., de Andres, D., Lujan, Ll., Badiola Diéz, J.J., Berriatua, E.: «Relative contribution of colostrum from Maedi-Visna virus (MVV) infected ewes to MVV-seroprevalence in lambs», Res Vet Sci. 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Identificación, origen y factores fisicoquímicos que condicionan la contaminación por elementos metálicos de sedimentos de ríos. ESTILITA RUIZ ROMERA 8. Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. ÁLVARO AUNOS GÓMEZ 9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS) para la fertilización de las praderas permanentes. MARTA RODRÍGUEZ JULIA 10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. MARÍA TERESA SANCHO ORTIZ 11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo tras el enterrado de la paja de cereal. JESÚS ÁNGEL OCIO ARMENTIA 12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria en la Comunidad Autónoma del País Vasco. BEATRIZ PÉREZ DE LAS HERAS 13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.): caracterización taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. AZUCENA SALAZAR BAYONA 14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebaños de ovejas latxas. ANA LUISA GRACIA PÉREZ 15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Comunidad Autónoma Vasca. DANIEL FERNÁNDEZ DE LUCO MARTÍNEZ 16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicus Boiss. et Reuter. VERÓNICA ARRIETA PICO 17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa. MILAGROS VIÑEGRA GARCÍA 18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influencia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. LUIS Mª. OREGUI LIZARRALDE 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 154 19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos ambiental, extractivo y comercial en la pesquería. JOSÉ AGUSTÍN MAIZ ALCORTA 20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Autónoma del País Vasco. J.J. ADURIZ RECALDE 21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfológicos y parámetros ambientales. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ 22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. AMELIA CERVELLO MARTÍNEZ 23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicas del queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). FRANCISCO C. IBAÑEZ MOYA 24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. Mariano GÓMEZ FERNÁNDEZ. 25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas de maíz. GOTZONE GARAY SOLACHI 26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. ADOLFO MENOYO PUELLES 27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. AMELIA ORTUBAY FUENTES 28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características microbiológicas y organolépticas del queso Idiazabal. FRANCISO J. PÉREZ ELORTONDO 29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. JUAN C. MARCO MELERO 30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis caprina y ovina por Mycobacterium bovis. Mª MONTSERRAT GUTIÉRREZ CANCELA 31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa (Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca de la trucha. ROSA Mª ECHARRI TOMÉ 32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia de los procesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ANA ISABEL NÁJERA ORTIGOSA 33. Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitrogenados durante la maduración del queso Idiazabal. Mª SOLEDAD VICENTE MARTÍN 34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y virus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad Autónoma Vasca. MARTA BARRAL LAHIDALGA 35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador, de la pasteurización y del tipo de cuajo. FELISA CHAVARRI DÍAZ DE CERIO 36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuesta inmune asociada a la vacunación. JUAN MANUEL CORPA ARENAS 37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ANA BELÉN EXTRAMIANA ALONSO 38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. MARÍA MERCEDES GARCÍA GOTI 39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los rebaños de raza Latxa de la CAPV. ROBERTO J. RUIZ SANTOS 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 155 40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio Histórico de Gipuzkoa (País Vasco). LUIS MARIO CHAUCHARD BADANO 41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuberculosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JOSEBA M. GARRIDO URKULLU 42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bovino lechero de la CAPV. RAQUEL ACHAERANDIO GALDOS 43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Metodología de laboratorio y modelización. VALENTÍN TERÉS TERÉS 44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micromamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural. HORACIO GIL GIL 45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoración e introducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. ANDRÉS LEGARZA ALBIZU 46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en la viabilidad de Pinus radiata D. Don. MIREN AMAIA MENA PETITE 47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfermedad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces. RAQUEL ARANGUREN RUIZ 48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detección, control sanitario y mejora genética. ANA MARÍA DÍEZ NAVAJAS 49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de producción de la CAPV. NEREA MANDALUNIZ ASTIGARRAGA 50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploide. LEIRE BARANDALLA URTIAGA 51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolíticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ÁNGELES BUSTAMANTE GALLEGO 52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlántico Norte. Josu Santiago Burrutxaga 53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónoma de euskadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. MARIO MICHEL RODRIGUEZ 54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., “cv Derio”) en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. HUGO MACÍA OLIVER 55. Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genética y Patogenia Molecular del Scrapie. DAVID GARCÍA CRESPO 56. Estudio epidemiológico y experimental de la transmisión y control del virus Maedi-Visna en ovino lechero de raza latxa del País Vasco. VEGA ALVAREZ MAIZTEGUI 57. Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico y molecular para el estudio de la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino. MARA ELISA DALTABUIT TEST 02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 156
