Enzima de restricción EcoRI

UNA INTRODUCCIÓN A LA
INGENIERÍA GENÉTICA
Direcciones de interés:
•
•
http://www.chimie-sup.fr/OGM.htm
Es una página en francés muy buena sobre OGM.
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•
http://www.jenabioscience.com/
Empresa que vende todo tipo de enzimas.
•
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/recursos_informaticos/concurso2000/3prem
io/viginsercion.html
Muy interesante: sencilla y con buenos esquemas sobre inserción de ADN en células
•
Enzima de restricción EcoRI
Cómo se unen dos fragmentos da ADN
cortados por la misma enzima de restricción
Cómo se unen dos fragmentos da ADN
cortados por la misma enzima de restricción
Cuatro ejemplos de enzimas de
restricción
CLONACIÓN DE UN GEN
EN UNA BACTERIA Y
EMPLEANDO UN
PLÁSMIDO COMO VECTOR
ADN RECOMBINANTE
CLONACIÓN DE UN GEN EN UNA BACTERIA Y EMPLEANDO UN
PLÁSMIDO COMO VECTOR
Algunos ejemplos de enzimas de restricción
Vector de ADN: Virus
Esquema de un virus
bacteriófago: es un vector
muy eficaz puesto que de
forma natural los virus inyectan
su material genético en células
Infección de una bacteria por un
bacteriófago
Vector: Cósmido
Plásmido
Pertenecientes al fago
Gel de agarosa: matriz o soporte
de la electroforesis
La agarosa es un polisacárido que se extrae
de ciertas algas. Está compuesto por un
disacárido, la agarobiosa que se repite en
largas cadenas.
(En realidad la agarosa es una parte de un
polisacárido más complejo llamado agar-agar
que se emplea habitualmente como medio de
cultivo bacteriano).
La agarosa se
disuelve en agua
caliente y al enfriarse
se transforma en un
gel (parece gelatina)
Electroforesis: autorradiografía
Este método ya ha quedado
anticuado
• Placa fotográfica
revelada: las
manchas claras sobre
fondo oscuro
corresponden a los
diferentes fragmentos
de ADN.
• En este caso, se han
separado fragmentos
de 5 muestras
diferentes.
Dispositivo para realizar la
electroforesis en gel
El dispositivo consta de:
 Una bandeja donde se verterá
el gel en estado líquido.
Un transformador que
suministra corriente eléctrica
continua.
Un peine que permitirá
excavar uno pocillos en el gel
donde se depositarán los
fragmentos de ADN a separar
en disolución
Este instrumento es una
micropipeta automática:
permite manejar cantidades
de líquido minúsculas con
gran precisión
VECTORES DE ADN NO
BIOLÓGICOS
Electroporación
Microinyección
Microproyectiles
• Se denomina biolística o
biobalística a la introducción de
DNA en células mediante la
aceleración (disparo) de
proyectiles de muy pequeño
tamaño (microproyectiles).
• Generalmente los
microproyectiles tienen
alredededor de una micra (10-6
m) de diámetro, y son de un
material inerte (oro o tungsteno).
• Los microproyectiles se pueden
recubrir de DNA, y se pueden
acelerar mediante pólvora, una
descarga eléctrica, o utilizando
gases a presión (por ejemplo
helio comprimido). De esta
forma se puede introducir DNA
en prácticamente cualquier tejido
de cualquier especie vegetal.
Este método se emplea para
obtener plantas transgénicas
PCR
Reacción
en Cadena de
la Polimerasa
Termociclador
• Un termociclador es
básicamente un
calentador que dispone
de un control automático
de ascenso y descenso
de temperatura y un
temporizador. Dentro, en
un recipiente, tiene lugar
la Reacción en
Cadena de la
Polimerasa
Secuenciación: método de Sanger
Secuenciación: método de Sanger
Ejemplo de fragmentos
que pueden formarse en
el recipiente con ddATP a
partir de la siguiente
secuencia:
5’-CTGACTTCGACAA-3’
ddAGCTGTT
ddAAGCTGTT
ddACTGAAGCTGTT
MATERIAL NECESARIO PARA LA
SECUENCIACIÓN:
•FRAGMENTO
DE ADN DE CADENA
DIDESOXINUCLEÓTIDOS
SENCILLA PARA SECUENCIAR
•DIDESOXINUCLEÓTIDOS
TRIFOSFORILADOS MARCADOS
•ADN POLIMERASA
•CEBADORES
Secuenciación: método de Sanger
Secuenciación: método de Sanger
Secuenciación: método de Sanger
Secuenciación automática: método
de Sanger modificado
Secuencia de un ADN tal y como la muestra
un secuenciador automático
Máquina de secuenciación
automática de ADN
Cómo funciona un biochip
Biochip con marcadores fluorescentes
Biochip
Fluorocromos
• Un fluorocromo es un componente de una molécula que hace que
ésta sea fluorescente. Este grupo funcional de la molécula es capaz
de absorber energía de una longitud de onda específica y de
emitirla en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir,
con menor energía). La cantidad de energía emitida y su longitud de
onda dependen del propio fluorócromocomo.
• Habitualmente, los fluorocromos absorben energía de tipo
ultravioleta y emiten en el rango de la luz visible.
• Hoy en día se conocen muchos tipos de fluorocromos de diferentes
colores.
• Esta tecnología es particularmente importante en el campo de la
bioquímica para el estudio de proteínas y en el análisis de ADN.
• Los fluorcromos se adosan a otras moléculas y sirven como
marcadores de éstas.