Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
Facultad de Medicina
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS
Evaluación de la citotoxicidad por acetaminofén en rata: Efecto de la
melatonina
T
E
S
I
S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN
FARMACOLOGÍA
PRESENTA
HECTOR ARTURO MAGAÑA
ASESORA
DRA. ESPERANZA GARCÍA MARTÍNEZ
1
INTRODUCCION
El hígado contribuye al mantenimiento de la homeostasis en los vertebrados
debido a su participación en procesos de biosíntesis y biodegradación. Además
representa la glándula secretora más voluminosa al generar la bilis; ésta facilita
la absorción intestinal de grasas y vitaminas liposolubles, permitiendo la
eliminación de productos del catabolismo, como la bilirrubina (Bowman y Rand,
1984; Frazier, 1995; González, 1996).
El hígado es una estructura heterogénea constituida por los siguientes
componentes:
1) Células parenquimatosas o hepatocitos
2) Células reticuloendoteliales (células de Kupffer)
3) Vías biliares
4) Vasos sanguíneos y células almacenadoras de grasa (Ito y cols., 1994;
González, 1996).
ESTRUCTURA MICROSCÓPICA DEL HÍGADO.
La unidad estructural del hígado consiste en un lobulillo poliédrico,
descrito en los cortes histológicos como un hexágono (Celis, 1994). Este
lobulillo parece estar organizado alrededor de la vena central, simplemente por
el aspecto histológico del hígado; sin embargo, desde una perspectiva
funcional, el lobulillo hepático también puede considerarse como un acino, con
su centro en el espacio portal (González, 1996; Leeson y Leeson, 1977). El
concepto del acino permite definir 3 zonas diferentes: la zona 1 o periportal
(PP), próxima a los vasos terminales portales y arteriales, la zona 2 o
intermedia (1), y la zona 3 o perivenosa (PV), situada alrededor de los vasos
terminales eferentes (Figura 1).
2
FIGURA 1. ESTRUCTURA MICROSCOPICA DEL HIGADO. El hígado está integrado
por masas de células epiteliales parenquimatosas (hepatocitos) dispuestas en
cordones que se ramifican y anastomosan, entre los que se encuentran espacios
sanguíneos sinusoidales. También se encuentran zonas denominadas áreas portales
o conductos portales que incluyen ramas de la arteria hepática, vena porta y
conductos biliares. Las zonas portales se disponen de forma tal que limitan los
lobulillos del tejido hepático. El lobulillo hepático tiene varios conductos portales en su
periferia, y en su centro tiene una vena central, tributaria de la vena cava inferior, de la
que parten cordones radiados de células parenquimatosas en un eje central. Esta
unidad estructural se repite miles de veces. Al observar los vasos aferentes (vena
porta y arteria hepática) en la periferia del lóbulo y los vasos eferentes (vena central)
en el centro del lóbulo, es evidente que la corriente sanguínea va de la periferia por los
conductos sinusoidales, entre los cordones de hepatocitos hacia la vena central. La
secreción de bilis de los hepatocitos fluye hacia los pequeños conductos biliares de la
periferia. Los espacios sinusoidales entre los cordones hepáticos están revestidos de
células retìculoendoteliales que se encuentran en una trarna de fibras reticulares finas
(Modificado de Gartner y Hiatt, 1994 y Leeson y Leeson, 1997).
3
Las tríadas portales (o espacios portales) que se sitúan en la periferia
del acino, a nivel de los ángulos del hexágono, contienen ramas intrahepáticas
de los conductos biliares, de la arteria hepática, y de la vena porta. La vena
central o vénula hepática terminal, como su nombre lo indica, se ubica en el
centro del lobulillo. Desde este punto irradian láminas de hepatocitos con el
espesor de una célula, que se extienden hasta el perímetro del lobulillo, donde
se continúan con las láminas o trabéculas de otros lobulillos. Entre las
trabéculas de hepatocitos están los sinusoides hepáticos, revestidos por
células endoteliales, células de Kupffer y las células para almacenamiento de
lípidos, denominadas células de Ito. Las células de Kupffer son macrófagos
tisulares capaces de fagocitar bacterias y otras células extrañas. Entre el
revestimiento endotelial y el parénquima hepático se sitúa un espacio
extracelular, el espacio de Disse, que se comunica con el espacio intravascular
por medio de fenestraciones del endotelio (Figura 1) (Beales y McLean, 1995;
Chanda y Mehendale, 1996a; González 1996).
El hígado presenta una doble circulación aferente: la que proviene del
intestino por la vena porta, y la de la circulación sistémica, por la arteria
hepática. El sistema de irrigación de la arteria hepática transporta sangre
oxigenada mientras que el sistema porta transporta sustancias asimiladas en la
digestión. La sangre aferente se distribuye en los hepatocitos a través de unos
capilares especializados o sinusoides y posteriormente se drena a través del
sistema de la vena hepática (González, 1996; Leeson y Leeson, 1977).
Los vasos sanguíneos de gran calibre, que ingresan a través del hilio
hepático, se dividen más adelante en pequeñas ramas interlobulillares de la
arteria hepática y la vena porta de los espacios portales. Desde estos últimos
los vasos interlobulillares distribuyen sangre hacia los sinusoides hepáticos,
que fluyen en dirección centrípeta hacia la vena central. Las venas centrales se
unen y forman venas sublobulillares que luego se fusionan para dar lugar a las
venas suprahepáticas (González, 1996; Jungermann y Katz, 1989; Leeson y
Leeson, 1977).
La bilis fluye en dirección opuesta a la de la sangre y es secretada por
los hepatocitos hacia el interior de los canalículos biliares; éstos están
formados por la aposición de las superficies laterales de los hepatocitos
4
contiguos. Desde los canalículos, la bilis fluye hacia los conductillos biliares
(conductos de Hering o colangiolos) en la periferia de las tríadas portales y
luego desemboca en una rama del conducto biliar intrahepático. En el interior
de cada lóbulo del hígado, los conductos biliares pequeños se fusionan de
manera progresiva y forman los conductos hepáticos derecho e izquierdo.
Las
células
del
parénquima
o
hepatocitos,
que
representan
aproximadamente el 60% del total de las células hepáticas son células en cuya
membrana plasmática existen tres zonas perfectamente diferenciadas: la
membrana sinusoidal (en contacto con los sinusoides), la membrana
intercelular y la membrana canalicular. Esta última contribuye a delimitar, junto
con la de otras dos o tres células adyacentes, los canalículos biliares, que
siguen un sentido opuesto al de la circulación y convergen para formar
finalmente el conducto biliar, el cual desemboca en el duodeno (González,
1996; Gartner y Hiatt, 1994).
Los hepatocitos de la zona 1 están expuestos a sangre con una elevada
concentración de oxígeno y solutos, mientras que los de la zona 3 se
encuentran bañados por sangre con menor concentración de nutrientes y
oxígeno (Figura 1).
Una de las funciones más importantes del hígado es la relacionada con
la biotransformación de un gran número de fármacos y toxinas.
Los mecanismos enzimáticos responsables de los procesos de
biotransformación son de dos tipos: las reacciones de Fase I y las reacciones
de Fase II. Las primeras son fundamentalmente reacciones de óxido-reducción
donde se incluyen los procesos de oxidación, reducción e hidrólisis. Las
enzimas más importantes implicadas en las reacciones de Fase I son las
oxidasas de función mixta del sistema del Citocromo P450 (CYP450). Las
reacciones de Fase II son reacciones de conjugación catalizadas por enzimas
transferasas e incluyen conjugación con sulfato, glucurónido y glutatión
(Bowman y Rand, 1984).
Debido a su gran irrigación sanguínea y al estrecho contacto que guarda
con los fármacos y con sus metabolitos, el hígado es el principal órgano que
está expuesto al daño producido por los metabolitos tóxicos resultantes de la
biotransformación de los fármacos (Hinson y Forkert, 1995).
5
LESIONES HEPÁTICAS TÓXICAS.
La gama de lesiones hepáticas agudas inducida por agentes químicos
es tan amplia que abarca todo el espectro de enfermedades hepáticas, desde
la colestasis (demostración morfológica de Ia presencia de pigmento biliar en
los canalículos biliares y los hepatocitos, que refleja una disminución del flujo
biliar a través de los canalículos y una reducción de la secreción de agua,
bilirrubina y ácidos biliares por parte del hepatocito) transitoria, y clínicamente
trivial, hasta la hepatitis fulminante fatal. Las lesiones hepáticas tóxicas
crónicas son igualmente diversas y conforman un espectro que abarca desde
una hepatitis persistente leve hasta una cirrosis activa (Rubin y Farber, 1992).
En general, ciertas sustancias químicas hepatotóxicas producen
invariablemente necrosis hepatocelular; las características que definen a las
lesiones hepáticas provocadas por estas hepatotoxinas “previsibles” son las
siguientes:
1) El agente responsable, en dosis suficientemente elevadas, siempre induce
necrosis hepatocelular.
2) El grado de la lesión hepática depende de la dosis.
3) Estos compuestos inducen el mismo tipo de lesiones en diferentes especies
(con algunas excepciones).
4) La necrosis hepatocelular es típicamente zonal y, con frecuencia,
centrilobular.
5) El periodo transcurrido entre la exposición a la toxina y el desarrollo de
necrosis hepatocelular es breve.
En la mayoría de los casos, la necrosis hepática tóxica es consecuencia
del metabolismo del compuesto por parte del sistema hepático de oxidasas de
función mixta del CYP450, y éste es responsable de la producción de especies
activas de oxígeno y metabolitos reactivos.
La mayoría de las reacciones provocadas por las drogas son
impredecibles y en muchos de los casos parecería que representan
manifestaciones de sensibilidad poco usual hacia un efecto colateral
relacionado con la dosis del fármaco. La predisposición a desarrollar
reacciones de hipersensibilidad puede presentarse en sujetos con vías
metabólicas diferentes a las de la mayoría de la población, o bien en aquellos
6
que responden de manera exagerada a un efecto farmacológico específico
distinto al efecto terapéutico deseado.
Las drogas y las sustancias químicas que ejercen efectos hepatotóxicos
previsibles y que actúan a través de sus metabolitos, típicamente provocan
necrosis centrilobular. Esta regionalización del daño se debe a que las enzimas
encargadas del metabolismo de las drogas presentan mayor actividad en las
zonas centrales. Algunos ejemplos de estos agentes incluyen el tetracloruro de
carbono, el acetaminofén y las toxinas del hongo Amanita phalloides. En las
zonas afectadas los hepatocitos presentan necrosis por coagulación y
acumulación variable de lípidos. Si la dosis de la hepatotoxina es lo
suficientemente alta, la necrosis puede afectar la totalidad del lobulillo. Sin
embargo, los pacieliles o bien fallecen de insuficiencia hepática aguda o se
recuperan sin secuelas (Rubin y Farber, 1992).
CARACTERÍSTICAS DEL ACETAMINOFÉN.
El
acetaminofén
(paracetamol,
N-acetil-p-aminofenol,
4-
hidroxiacetanilida, ó APAP) es un analgésico antipirético que se utiliza
actualmente en la clínica con humanos (Halmes y cols., 1995; Mìtchell y cols.,
1973a y b; Prescott y cols., 1974). A dosis terapéuticas [1.2 g/día en el hombre
(Katzung, 1991)] presenta una gran seguridad farmacológica (Prescott y
Critchley, 1983) y se considera como un sustituto seguro y de fácil adquisición
de la aspirina, ya que no presenta efectos secundarios tales como ulceración o
hemorragia gastrointestinal (Al-Obaidy y cols., 1995; Al-Obaidy y cols., 1996;
Chen y Lin, 1996).
Confiando en la seguridad farmacológica del APAP, inicialmente no se
llevaron a cabo estudios farmacológicos serios; sin embargo, cuando se
encontró que el APAP representaba el principal metabolito de la acetanilida y
de la fenacetina, dos fármacos utilizados en la clínica como analgésicos
(Bowman y Rand, 1984; Katzung, 1991) el interés sobre sus características y
propiedades fisicoquímicas y farmacológicas aumentó considerablemente.
Uno de los hallazgos más importantes sobre la farmacología del APAP fue el
reportado por Eder y cols., (1964), quienes reportaron estados necróticos
hepáticos en gatos a los que se administró una dosis diaria de 25-50 mg/kg de
acetaminofén durante 26 semanas. Dos años después, en estudios de
7
toxicidad aguda realizados en ratas, Boyd y Bereczky describieron un daño
hepático extensivo (Prescott y Critchley, 1983; Prescott y cols., 1971).
El control clínico de los pacientes que son admitidos en los centros
hospitalarios
con
daño
hepático
severo
causado
por
enfermedad,
envenenamiento accidental, o intentos suicidas con drogas hepatotóxicas como
el APAP o tetracloruro de carbono (CCI4 ) es un reto constante para los
médicos. La incidencia mundial de muerte por sobredosis de APAP (dosis >15
gramos) durante las dos décadas pasadas aumentó dramáticamente; la
necrosis hepática aguda, seguida de falla renal fulminante, ha sido la causa de
las muertes (Chanda y Mehendale, 1996a; Prescott y Critchley, 1983).
BIOTRANSFORMACION DEL ACETAMINOFÉN.
El principal órgano involucrado en el metabolismo del APAP es el hígado
(Bowman y Rand, 1984). En general, la biotransformación del APAP puede
abordarse desde dos condiciones diferentes (Figura 2): A) biotransformación de
dosis terapéuticas y B) biotransformación de sobredosis de APAP, o en
estados de intoxicación (Chen y Lin, 1996; Gibson y cols., 1996).
A) Biotransformación de dosis terapéuticas.
El metabolismo de los xenobióticos que, como el APAP, presentan
grupos fenólicos se realiza principalmente por mecanismos de conjugación con
ácido glucurónico y sulfato.
Las reacciones de conjugación con glucurónido son catalizadas por la
familia de enzimas de la difosfato glucuronosiltransferasa (UDP), enzimas que
se encuentran unidas a la membrana del retículo endoplásmico. Esta familia de
enzimas forma aglicones conjugando UDP-ácido glucurónico con los grupos
hidroxilo de los compuestos fenólicos (Figura 2) (Roberts y cols., 1995).
Las reacciones de sulfatación, por otra parte, son catalizadas por la
familia de enzimas diméricas de las aril-sulfotransferasas, que utilizan al 3’fosfoadenosin-5’-fosfosulfato
fonnando un éster sulfato
(PAPS)
como
donador
del
grupo
sulfato,
fenólica, adenosin-5’-monofosfato y fosfato
inorgánico (Liu y Klaassen, 1996; Roberts y cols., 1995).
En ratas, la sulfatación del APAP se reconoce como una reacción de
conjugación de alta afinidad y baja capacidad. La baja capacidad se debe a la
8
disponibilidad limitada de PAPS, que a la vez depende de la disponibilidad de
su precursor, el sulfato inorgánico (Liu y Klaassen, 1996; Roberts y cols.,
1995).
En general, la glucuronidación y la sulfalación incrementan la
hidrosolubilidad de los xenobióticos, disminuyendo el volumen de distribución y
permitiendo la inactivación de los compuestos para su rápida excreción tubular
renal (Roberts y cols., 1995).
La tercera ruta más importante en el metabolismo del APAP es la
oxidación a través del sistema microsomal de las oxidasas de función mixta del
CYP450, específicamente por las isoformas 2E1, 1A2 y 3A4 (Halmes y cols.,
1995; Webster y cols., 1996) que biotransforman el APAP a los derivados
oxidados 3-hidroxi-APAP, 3-metoxi-APAP y N-acetil-p-amino benzoquinona
imina (NAPQI) (Chen y Lin, 1996; Gibson y cols., 1996).
La eliminación de los productos del metabolismo de conjugación de
dosis terapéuticas de APAP se realiza a través de los riñones, como
conjugados de glucurónido o sulfato, y muy pequeñas cantidades como
conjugados de glutatión y NAPQI; ninguno de estos metabolitos resulta tóxico
para el organismo (Chanda y Mehendale, 1996a).
En neonatos, la función metabólica hepática es reducida debido a que la
maduración de las diferentes vías de biotransformación ocurre en diferentes
etapas del desarrollo postnatal. Aunque prácticamente todas las funciones
metabólicas se encuentran presentes a la edad de 3 meses, es hasta los 6
meses de edad que la capacidad metabólica se alcanza de forma total; sin
embargo, existen amplias variaciones (Ritschel, 1980). Por lo anterior, solo del
10 al 20% del APAP se metaboliza por procesos oxidativos, excretando los
productos de esta biotransformación (derivados 3-hidroxi o 3-metoxi) como
conjugados de GSH por la orina (Chen y Lin, 1996). Aunque en neonatos la
oxidación es cuantitativamente menos importante que la glucuronidación y la
sulfatación, toxicológicamente representa el aspecto más importante en el
metabolismo del APAP (Figura 2) (Al-Obaidy y cols., 1996).
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NHCOCH3
OH3
ACETAMINOFÉN
(N-acetil p-aminofenol; APAP)
FASE II
FASE I
Citocromo P450
AUDPG UDP-glucuronil
tranferasa
PAPS Sulfotransferasa
NHCOCH3
NHCOCH3
NHCOCH3
NHCOCH3
OCH3
O-glucurónido
OSO3
Conjugado con Glucurónido Conjugado con Sulfato
OH
3-Metoxi
Acetaminofén
NHCOCH3
OH
O
OH
3-Hidroxi N-acetil p-amino benzoquinona
Acetaminofén
Imina (NAPQI)
Glutatión
S-transferasa
GSH
NHCOCH3
EXCRECIÓN
RENAL
FASE II
S-GSH
O
Conjugado NAPQI-GSH
FIGURA 2. BIOTRANSFORMACION DEL ACETAMINOFÉN. Las dosis terapéuticas
del acetaminofén son metabolizadas principalmente en el hígado y excretadas por los
riñones, ya sea como un conjugado con yiucurónido o con sulfato (reacciones Fase II).
Una muy pequeña cantidad es biotransformada por el sistema de oxidasas del
citocromo P450 (reacciones Fase I) formando derivados oxidados y N-acetil p-amino
benzoquinona imina (NAPQI). Tanto los derivados oxidados como el NAPQI se
excretan por vía renal como conjugados con glutatión. De los tres metabolitos
oxidados del APAP, el NAPQI es el que se forma en mayor concentración y solo del 5
al 10% del acetaminofén es convertido a los derivados 3-hidroxi o 3-metoxi-APAP.
Ninguno de los metabolitos formados por biotransformación de dosis terapéuticas del
APAP resultan tóxicos para el organismo. AUDPGA, ácido uridil-5’-difosfoglucurónico;
PAPS, 3’- fosfoadenosin-5’-fosfosulfato; MFO, oxidasas de función mixta; GSH,
glutatión reducido (Modificado de Chanda y Mehendale, 1996a y b).
10
B) Biotransformación de dosis tóxicas.
Mientras que el APAP normalmente es biotransformado por procesos de
glucuronidación, sulfatación y oxidación a dosis terapéuticas, cuando la dosis
es excesiva estas rutas se saturan y el APAP excedente se metaboliza por el
sistema microsomal del CYP450.
En condiciones fisiológicas, la destoxificación del metabolito NAPQI,
formado por la oxidación del APAP, se realiza eficientemente por el glutatión
reducido (GSH), a través de la formación de conjugados 3-(GSH-S-yl)-APAP
(Gibson y cols., 1996; Webster y cols., 1996) que son excretados por el riñón
como conjugados de cisteína y ácido mercaptúrico (Figura 2) (Al-Obaidy y
cols., 1996; Webster y cols., 1996). Sin embargo, como consecuencia del uso
crónico, de las sobredosis, o de enfermedades hepáticas, las reservas de GSH
disponibles para conjugación con NAPQI se agotan, ocasionando acumulación
del NAPQI y , con ello, una necrosis hepática fulminante (Chen y Lin, 1996). De
esta forma, el metabolismo del APAP relacionado con el CYP450 parece jugar
un papel crítico en el daño hepático inducido por APAP, reconociéndose al
NAPQI como el metabolito tóxico causante del daño.
MECANISMOS DE LA HEPATOTOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN.
Los mecanismos por los cuales el APAP produce hepatotoxicidad aún
son tema de controversia, ya que mientras algunos estudios sugieren que la
unión covalente del NAPQI a macromoléculas es la responsable del daño
hepático, otros estudios proponen que los metabolitos reactivos del oxígeno
producidos durante la biotransformación del APAP a NAPQI generan estados
de estrés oxidativo responsables del daño hepático inducido por APAP
(Adamson y Harman, 1993; Halmes y cols., 1995; Mitchell y cols., 1973a;
Prescott y cols., 1974).
A continuación se describen las bases experimentales sobre las que se
fundamentan las teorías de la fijación covalente y la del estrés oxidativo.
1) Unión covalente a macromoléculas.
La primera teoría propuesta para la generación del daño hepático por
APAP propone que el metabolito NAPQI se une covalentemente a los grupos
11
tiol de macromoléculas celulares, principalmente a proteínas de membrana y
enzimas. Esta propuesta ha basado su teoría en análisis inmunoquímicos de
“Western blot” realizados en hígados de ratones tratados con dosis tóxicas del
fármaco, los cuales indicaron que a nivel hepático la unión covalente del
NAPQI ocurre en proteínas intracelulares especificas formando aductos 3(cisteín-S-yl)-APAP-proteína (Webster y cols., 1996). De acuerdo con Roberts y
cols. (1991), quienes también realizaron análisis inmunohistoquímicos de
ratones tratados con dosis tóxicas de APAP, los aductos formados por el APAP
se localizan solamente en el área centrilobular, el área reconocida como el sitio
blanco de la toxicidad por APAP, y no en las áreas periportales. Estos datos
apoyan la correlación entre la unión covalente y la hepatotoxicidad; sin
embargo, como ha sido puntualizado por Gillette (1974), la unión covalente
solamente representa un ensayo para la detección del metabolito reactivo, y no
para el mecanismo del daño, ya que éste podría producir la toxicidad por
mecanismos diferentes (Gibson y cols., 1996).
2) Estrés oxidativo generado por el metabolismo del acetaminofén.
La segunda teoría propuesta como el mecanismo de hepatotoxicidad por
APAP es el estrés oxidativo, una condición en la que el balance entre las
especies oxidantes y las defensas antioxidantes se inclina en favor de las
primeras debido a una sobreproducción de éstas o a una disminución de los
equivalentes reductores (Chen y Lin, 1996).
De acuerdo con esta teoría, el metabolito reactivo del APAP actúa como
un agente oxidante que produce estados de estrés oxidativo debido a la
generación de especies reactivas de oxígeno como el peróxido de hidrógeno,
los aniones superóxido, y el radical hidroxilo, generados durante la
biotransformación del APAP a NAPQI (Figura 3). El primer paso en esta
biotransformación comprende la oxidación de las dosis terapéuticas del APAP
al radical N-acetil-4-aminofenoxil y peróxido de hidrógeno. El radical N-acetil-4aminofenoxil formado, posteriormente es convertido por un ciclo oxidaciónreducción asociado con la producción de aniones superóxido en presencia de
oxígeno al metabolito N-acetil-p-amino benzoquinona imina (NAPQI) un
metabolito electrofílico reactivo (Figura 3) (Chen y Lin, 1996; Gibson y cols.,
1996).
12
Estas especies reactivas consumen el GSH disponible en las células
hepáticas, convierten parte del GSH a la forma difulfuro oxidado (GSSG),
producen lipoperoxidación, daño del DNA y oxidación de proteínas; es
importante señalar que el ion férrico puede tener una importante función
catalítica (Pal Yu, 1994).
El mecanismo de fijación covalente ha sido descartado como
responsable de la muerte celular mediante pruebas farmacológicas realizadas
con inhibidores enzimáticos que proporcionan información acerca del estrés
oxidativo generado durante el metabolismo del APAP. Con esto, es posible que
la necrosis hepática en realidad se relacione con la toxicidad de especies
reactivas de oxígeno y no con la fijación covalente; es decir, el metabolismo de
las sustancias químicas hepatotóxicas por el CYP450 origina lesión celular
irreversible por medio de mecanismos que no se relacionarían con la fijación
covalente de los metabolitos reactivos.
13
NHCOCH3
OH
Acetaminofén
(N-acetil p-aminofenol; APAP)
N-hidroxilación (Fase I)
OH
:N-COCH3
+
OH
H2O2
Peróxido de hidrógeno
N-acetil-4 aminofenoxil
Ciclo
oxidación-reducción
NHCOCH3
+
O2 -
O
N-acetil p-amino benzoquinona
Imina (NAPQI)
Aniones superóxido
Generación de OH .
y O2 -
Unión covalente a
macromoléculas
Estrés oxidativo
MUERTE CELULAR
FIGURA 3. MECANISMOS DE TOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN. En estados de
intoxicación por APAP las rutas de conjugación con glucurónido y sulfato se saturan y
el APAP excedente se metaboliza por el sistema de oxidasas del Citocromo P450 al
metabolito NAPQI, el cual se ha reconocido como el causante de la toxicidad. Los dos
mecanismos propuestos para la toxicidad por APAP son 1) la unión covalente a
macromoléculas de membrana y 2) la generación de estados de estrés oxidativo como
resultado de la biotransformación de APAP a NAPQI y por la acción de éste mismo.
Por su naturaleza electrofílica, y ante la deficiencia del GSH, el NAPQI se une
covalentemente a nivel de los grupos tiol de proteínas de membrana. Esta unión
puede desencadenar la muerte celular. Durante la oxidación del APAP por el subtipo
2E1 del CYP450, se forman especies reactivas derivadas del oxígeno como los
aniones superóxido (O2. ) y los radícales hidroxilo (OH. ), además de peróxido de
hidrógeno (H2O2). El intermediario N-acetil-4-aminofenoxil, formado por oxidación del
APAP, rápidamente es convertido a NAPQI por un ciclo oxidación-reducción en el que
se generan aniones superóxido. Tanto el peróxido de hidrógeno como los aniones
superóxido pueden producir la muerte celular. El NAPQI también puede generar
estados de estrés oxidativo que, producen especies reactivas tales como los radicales
hidroxilo y los aniones superóxido.
14
De esta forma el mecanismo de daño por la peroxidación de los
fosfolípidos integrantes de la membrana representa una explicación viable ante
la lesión por APAP. La peroxidación lipídica puede ser iniciada por un
metabolito del compuesto original (como en el caso del CC14) o por especies
de oxígeno activado formadas durante el metabolismo de la toxina (Figura 3),
potenciándose esta última por el debilitamiento de las defensas antioxidantes
(Gibson y cols., 1996).
TRATAMIENTO CONTRA LA HEPATOTOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN.
El tratamiento efectivo contra la intoxicación por APAP solo llegó a ser
posible con el descubrimiento de la bioactivación del APAP a NAPQI por el
CYP450, y del papel esencial que juega el tripéptido glutatión (Mitchell y cols.,
1973a y b).
El grado de conversión de APAP al metabolito tóxico se refleja en la
fracción de la dosis recuperada en la orina como conjugados de cisteína y
ácido mercaptúrico, de manera que las especies más susceptibles excretan
una mayor concentración de compuestos conjugados que las especies más
resistentes; en el hombre, el daño hepático después de una sobredosis de
APAP se asocia con un aumento en la excreción urinaria de conjugados
(Prescott y Critchley, 1983).
La hepatotoxicidad por APAP se modifica en forma importante por todos
aquellos factores que alteran la actividad enzimática microsomal y el nivel de
GSH. Mitchell y cols., (1973a) mostraron que el daño hepático por APAP
aumenta al estimular el sistema enzimático microsomal con agentes inductores
tales como fenobarbital, o puede ser disminuido por inhibición con cloruro de
cobalto o piperonil butóxido. En forma similar, la necrosis hepática aumenta si
las reservas de GSH son saturadas por la previa administración de dietilmalato.
La reducción de las reservas de GSH producida por el ayuno o por dietas bajas
en proteínas también acentúan la hepatotoxicidad experimental por APAP. Por
el contrario, al proporcionar precursores de GSH como a
l cisteína, el daño
disminuye (Prescott y Critchley, 1983).
15
A) Inhibición de la activación metabólica.
La inhibición selectiva de la oxidación por CYP450, la ruta del
metabolismo de APAP que genera el metabolito tóxico, representa una
atractiva opción para la prevención del daño hepático. En estudios
desarrollados en animales de experimentación se ha mostrado que la toxicidad
aguda del APAP se reduce en forma significativa con la administración aguda
de etanol (Prescott y Critchley, 1983). En este caso, la protección se atribuye a
la inhibición competitiva de la activación metabólica de APAP ya que el etanol
es oxidado por el mismo sistema CYP450-2E1 (Gebhardt, 1992).
En las ratas, el etanol reduce en forma importante la excreción del
conjugado de APAP con ácido mercaptúrico; en el hombre, una carga aguda de
etanol (1.72 g/Kg cada 8 horas) reduce en forma marcada la fracción excretada
de una dosis oral de APAP (20 mg/Kg) en forma de cisteína y conjugados de
ácido mercaptúrico (Prescott y Critchley, 1983).
El efecto protector del etanol sólo se presenta en tratamientos agudos.
El consumo crónico aumenta considerablemente la hepatotoxicidad inducida
con APAP e incrementa la excreción urinaria del conjugado de ácido
mercaptúrico como resultado de la inducción de la biosíntesis de las enzimas
microsomales (Chanda y Mehendale, 1996a y b; Prescott y Critchley, 1983).
B) Estimulación de la conjugación con sulfato.
Debido a que la disponibilidad de sulfato inorgánico es limitada y a que
el sistema se satura fácilmente con sobredosis de APAP, se ha propuesto que
la estimulación de la sulfatación a través de la administración de sulfato
inorgánico representa un mecanismo eficiente que debería favorecer la
eliminación del APAP después de una sobredosis. Esta hipótesis se probó
administrando sulfato de sodio en ratas; aunque la conjugación y la velocidad
de eliminación de APAP con sulfato aumentó, el efecto protector obtenido por
esta manipulación fue mínimo por lo que no ha tenido relevancia en la clínica
(Prescott y Critchley, 1983).
16
C) Compuestos sulfhidrilo.
En su estado reducido, el glutatión (GSH) se considera como el antídoto
ideal contra la intoxicación por APAP. La concentración intracelular del
tripéptido en su forma reducida es de 0.5 mM, sin embargo, en algunos casos
puede llegar hasta 10 mM (Kaplowitz y cols., 1985; Meister, 1989). La relación
intracelular de las formas reducida y oxidada del glutatión (GSSG), que es de
100:1 se mantiene por la actividad de las enzimas reductasa del glutatión (GR),
per-oxidasa de glutatión (GPx), transhidrogenasas y por la acción de los
radicales libres. La GR es una enzima dependiente del NADPH que regenera el
GSH que ha sido convertido a GSSG por oxidación y por reacciones de
transferencia del grupo tiol. La enzima GPx dependiente de selenio reduce el
peróxido de hidrógeno a agua y otros peróxidos (Figura 4) (Kaplowitz y cols.,
1985; Meister, 1988; Meister, 1989; Meister y Anderson, 1989; Pal Yu, 1994).
Se ha obtenido una baja eficiencia al administrar dosis elevadas de GSH
como tratamiento para la toxicidad del APAP, por lo que se ha empleado como
alternativa la estimulación de la biosíntesis del tripéptido por compuestos tales
como cisteína, N-acetil-cisteína, metionina, cisteamina y otros compuestos que
contienen grupos sulfhidrilo, Estos compuestos son efectivos en la prevención
de la hepatotoxicidad experimental por APAP ya que impiden el agotamiento de
las reservas de GSH (Prescott y Critchley, 1983).
17
COOH
(CH 2) 2
CHNH2
COOH
Acido Glutámico
CH2SH
ATP
H2NCH2COOH
?
Cisteína
-glutamil cisteína sintetasa
ADP + Pi
CH2SH
CO-NH-CH-COOH
(CH 2) 2
CHNH2
COOH
-glutamil cisteína
ATP
?
H2NCH2COOH
Glicina
Sintetasa de glutatión
ADP + Pi
CH2SH
CO-NH-CH-CO-NHC H2COOH
(CH 2) 2
CHNH2
?
COOH
-glutamil-cisteinil-glicina
GLUTATIÓN; GSH
Nucleófilo
intracelular
Antioxidante
FIGURA 4. GLUTATION: Biosíntesis y función. EI glutatión se encuentra en las
células animales y también en muchas plantas y bacterias. En los mamíferos, el
hígado es el principal órgano involucrado en la biosíntesis del tripéptido, la cual es
catalizada por la acción sucesiva de las enzimas ?-glutamil-cisteína sintetasa y
sintetasa de glutatión. La concentración en hígado y otros tejidos de gamma-glutamilcisteína es muy baja ya que no solo es sustrato para la sintetasa de glutatión, sino que
también puede ser utilizada por la ?-glutamil-transpeptidasa y la ?-glutamilciclotransferasa. Normalmente la actividad de la ?-glutamil-cisteína sintetasa es inferior
al máximo ya que es inhibida por retroalimentación por el glutatión. El glutatión
sintetizado intracelularmente es transportado a través de las membranas celulares
donde participa como a) fuente del glutatión plasmático (en sus formas reducida y
oxidada, GSH y GSSG) b) coenzima en la reacción de la glioxalasa en la que el metilglioxal es convertido a c L-la tato c) nucleófilo intracelular en la destoxificación de
metabolitos electrofílicos y d) antioxidante (Meister, 1988).
18
FARMACOS
UTILIZADOS
EN
EL
ENVENENAMIENTO
POR
ACETAMINOFÉN.
La caracterización química y toxicológica de la naturaleza electrofílica
del metabolito reactivo del APAP ha permitido la producción de antídotos
eficaces, tales como la metionina, la cisteamina, la N-acetil-cisteína (Prescott y
Critchley, 1983) y la L-2-oxotiazolidina-4-carboxilato (Kretzschmar, 1996).
Tanto la administración de N-acetilcisteína, como de L-Z-oxotiazolidina-4carboxilato, metionina o cisteamina, protegen a los pacientes de la aparición de
hepatotoxicidad fulminante y de la muerte (Bowman y Rand, 1984; Prescott y
Critchley, 1983).
El tratamiento a base de N-acetil-cisteína se considera actualmente
como el tratamiento de elección contra el envenenamiento por APAP. Si se
administra dentro de las 10 primeras horas en una dosis de 300 mg/kg,
previene el daño hepático, la falla renal, e incluso la muerte en pacientes con
envenenamiento severo con el fármaco. Al igual que los otros agentes
estudiados en el hombre, el efecto protector de N-acetilcisteína disminuye
drásticamente si el tratamiento se retarda más allá de 8-10 horas, y es
inefectivo si se administra después de 15 a 16 horas (Prescott y Critchley,
1983).
Mecanismos de protección.
La protección contra la hepatotoxicidad inducida por APAP puede
explicarse por varios mecanismos:
1) Los fármacos tales como la cisteína, la N-acetil-cisteína y la metionina que
contienen al aminoácido cisteína estimulan la síntesis del GSH (Figura 4),
facilitando su conjugación con APAP. Otros agentes como la cisteamina y el
dimetilsulfóxido (DMSO) antagonizan la depleción inducida por APAP, e
indirectamente estimulan la síntesis de GSH. La cisteamina también puede
actuar inhibiendo la activación metabólica de APAP.
19
2)
Cisteamina,
cisteína,
N-acetil-cìsteina
y
alfa -mercaptopropionilglicina
reaccionan directamente con el metabolito tóxico de APAP, formando los
conjugados correspondientes; sin embargo, la conjugación con glutatión
catalizada por la glutatión-S-transferasa es una reacción de mayor afinidad.
3) Bajo ciertas condiciones el APAP puede ser regenerado a partir del NAPQI
por agentes reductores tales como la cisteína y el ácido ascórbico. El ácido
ascórbico puede inhibir la unión covalente in vitro del APAP a los microsomas
hepáticos reduciendo la letalidad por APAP en ratones (Prescott y Critchley,
1983).
20
ANTECEDENTES.
La utilización del APAP como analgésico-antipirético en la clínica con
humanos ha aumentado en los últimos años. A dosis terapéuticas su
biotransformación se realiza por el hígado y da como resultado la formación de
conjugados APAP-sulfato y APAP-glucurónido que resulta n inocuos para el
organismo; del APAP ingerido, solo el 5-10% es metabolizado por el sistema de
oxidasas del CYP450, produciendo los derivados oxidados 3-hidroxi, 3 -metoxi y
la iminoquinona N-acetil p-amino benzoquinona imina (NAPQI) (Chanda y
Mehendale, 1996a).
La intoxicación puede ser resultado de:
1) Administración de dosis terapéuticas en pacientes con deficiencia hepática
crónica.
2) Utilización de altas dosis de APAP como citotóxico diferencial de células
tumorales en pacientes con cáncer.
3) Administración de dosis terapéuticas en pacientes con deficiencias
nutricionales.
4) Administración de dosis terapéuticas sin un control médico (particularmente
en niños).
5) La ingestión voluntaria de sobredosis.
En estados de intoxicación las rutas de conjugación con glucurónido y
sulfato se saturan, de manera que la biotransformación mediada por el sistema
del CYP450 se vuelve cuantitativamente más importante. Actualmente se
reconoce que la acumulación de los metabolitos oxidativos del APAP
representa la causa de la hepatotoxicidad del APAP, que puede concluir en una
necrosis centrilobular fulminante.
Los mecanismos de hepatotoxìcidad asociados a la intoxicación por APAP
todavía se encuentran en debate. Hasta la fecha se han propuesto dos teorías:
la primera propone que el metabolito NAPQI altera la función celular por unirse
de manera covalente a macromoléculas de membrana, específicamente a
proteínas; esta unión se favorece por las características electrofílicas del
metabolito y las propiedades nucleofílicas de los grupos tiol presentes en las
proteínas. La segunda teoría sostiene que el metabolito NAPQI se comporta
21
como un agente oxidante con posibilidades de iniciar un daño oxidativo; en
estos casos, la oxidación de los grupos amino de las proteínas de membrana
sería el principal mecanismo del daño celular (Gibson y cols., 1996).
Algunos autores han propuesto que si bien la causa de la muerte celular
es el estrés oxidativo, éste se produce de manera indirecta por la generación
de aniones superóxido y peróxido de hidrógeno durante la biotransformación
del APAP a NAPQI (Figura 3). Esta propuesta ha sido reforzada con estudios in
vitro, en los que se ha mostrado que el APAP reduce de manera importante la
actividad de diferentes enzimas del sistema antioxidante endógeno. Kyle y
cols., (1987) y Adamson y Harman (1993) propusieron que los metabolitos
derivados del oxígeno, particularmente el radical hidroxilo, desempeñan un
papel importantes en la citotoxicidad del APAP in vitro. Estos investigadores
probaron que al agregar- las enzimas superóxido dismutasa, catalasa, o
deferoxamina (un quelador del ión férrico) al tejido hepático incubado con 1,3bis-(2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU; un inhibidor de la reductasa del GSH) se
previene la muerte celular, apoyando la participación de los procesos oxidativos
en esta toxicidad (Adamson y Harman, 1993; Blazka y cols., 1996; Gibson y
cols., 1996; Martin y McLean, 1995).
Debido a que en los sistemas de cultivo de hepatocitos sometidos a
condiciones de toxicidad por APAP los radicales hidroxilo altamente tóxicos y
reactivos no pueden ser eficientemente destoxificados por los sistemas
enzimáticos intracelulares ni por el GSH (ya que se encuentra saturado), se ha
propuesto que la utilización de aquellos agentes que protegen contra el estrés
oxidativo (antioxidantes) representan alternativas viables en el tratamiento de la
toxicidad inducida por APAP (Arnaiz y cols., 1995; Chen y Lin, 1996; Gibson y
cols., 1996). Bajo estas condiciones, las únicas defensas endógenas contra el
estrés oxidativo y el daño inducido por intermediarios electrofílicos son los
antioxidantes de bajo peso molecular tales como la melatonina, la cual actúa
como una defensa antioxidante primaria no enzimática contra la acción del
radical hidroxilo que es extremadamente reactivo (García y Peraza, 1995;
Löffler, 1996; Reiter, 1994a y b).
La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) representa el principal
producto hormonal de la glándula pineal, producido a partir del aminoácido
esencial triptofano. Recientemente se ha propuesto a la melatonina como un
22
potente depurador de radicales hidroxilo y peroxilo in vitro La capacidad
depuradora de radicales peroxilo in vitro mostrada por melatonina resultó más
eficiente no solo a la capacidad del GSH y del ácido ascórbico, sino que
además es dos veces más eficiente que la vitamina E (Reiter, 1994b; Reiter,
1995). In vivo se ha mostrado que la melatonina protege contra la toxicidad del
herbicida
tóxico
paraquat
(Melchiorri
y
cols.,
1996),
y
contra
los
lipopolisacáridos endotóxicos (LPS) (Sewerynek y cols., 1995b; Takeyama y
cols., 1996).
El mecanismo propuesto para la acción depuradora de radicales libres
por melatonina se muestra en la figura 5. La hormona melatonina no solo es
capaz de atrapar aniones superóxido, sino que también representa un eficiente
depurador de radicales hidroxilo. La depuración de radicales hidroxilo por
melatonina se demostró en experimentos desarrollados por Tan y cols. (1993),
quienes utilizaron el reactivo 5,5-dimetilpirrolina N-óxido (DMPO) y la fotólisis
del peróxido de hidrógeno con luz ultravioleta (UV) para la generación de
radicales hidroxilo. Estos radicales hidroxilo sustraen un electrón del grupo
amino presente en el anillo pirrólico para dar un radical indolil, el cual atrapa a
los aniones superóxido. Esta capacidad de la melatonina para depurar
radicales libres no solo se debe a la alta afinidad química que presenta por el
radical hidroxilo, sino también a la capacidad del radical indolil para reaccionar,
directamente, sin requerir otro catalizador, con los aniones superóxido
(Hardeland y cols., 1993).
23
FIGURA 5. MECANISMO PROPUESTO PARA LA ACCION DEPURADORA DE
RADICALES HIDROXILO POR LA HORMONA MELATONINA. La indolamina
melatonina destoxifica in vitro en una forma selectiva y eficiente agentes oxidantes
reactivos tales como los radicales hidroxilo (OH. ), otros radicales libres (. R) e iones
férricos, gracias a las características nucleofílicas que le confiere el anillo indólico.
Esta acción destoxificadora la realiza por donación de uno de sus electrones a estos
compuestos electrofílicos, que conduce a la formación de un radical indolil y a la
oxidación parcial de la indolamina. Este radical transitorio rápidamente es convertido al
metabolito kinuramina por la acción de los aniones superóxido (O2. ). El ataque de este
anión al radical indolil se efectúa casi exclusivamente en los carbonos 2 y 3 (C-2 y C3); sin embargo, debido a la mayor estabilidad del catión que se forma por el ataque
en C-3, que deslocaliza con mayor facilidad la carga positiva sin implicación de la parte
bencénica de la molécula, el intermediario formado por el ataque en esta posición es el
más probable. La apertura del anillo pirrólico por la acción de los aniones superóxido
refleja la facilidad de oxidación de los indoles (Modificado de Tan y cols., 1993;
Gilchrist, 1995; Paquette, 1937).
24
A nivel del sistema nervioso, la protección de las neuronas contra el
estrés oxidativo y el daño por especies reactivas del oxígeno tales como el
peróxido de hidrógeno se realiza por la enzima peroxidasa de GSH (GPx). Un
aumento en la actividad de la GPx puede atenuar el desarrollo de
enfermedades neurodegenerativas (Barlow-Walden y cols., 1995; Reiter,
1994b). De acuerdo con Barlow-Walden y cols., (1995) la función de esta
enzima puede aumentarse por activación con melatonina (Figura 6). En este
estudio, la administración de una dosis intraperitoneal de melatonina (500 µg/kg
de peso) en ratas hembras de 12 semanas aumentó la actividad de la GPx. La
melatonina no solo incrementa la velocidad de eliminación de los radicales
hidroxilo por captación directa, sino que además disminuye la generación y
formación de radicales hidroxilo a través de la inducción de la peroxidasa del
glutatión (Barlow-Walden y cols., 1995).
MELATONINA
Peroxidasa
de GSH
H2O2 + GSH
GSSG + H2O
FIGURA 6. ACTIVACION DE LA ENZIMA PEROXIDASA DE GLUTATION POR
MELATONINA. El peróxido de hidrógeno es reducido a agua por una reacción
catalizada por la enzima peroxidasa de glutatión en la que el tripéptido participa como
sustrato. H2O2= peróxido de hidrógeno; GSH= glutatión reducido; GSSG= glutatión
oxidado; GPx = peroxidasa de glutatión (Modificado de Barlow-Walden y cols., 1995).
Considerando que a) uno de los mecanismos por los cuales el APAP produce
hepatotoxicidad es la generación de estados de estrés oxidativo, y que la
melatonina tiene una función antioxidante y depuradora de radicales libres, y b)
que la melatonina regula el nivel del GSH, tripéptido necesario para la
eliminación del metabolito citotóxico del APAP, consideramos importante
estudiar experimentalmente la posibilidad de que esta hormona reduzca el
daño hepatotóxico producido por APAP.
25
OBJETIVOS
1) Evaluar la toxicidad del acetami nofén in vivo, utilizando como indicadores de
daño las actividades enzimáticas de la lactato deshidrogenasa (LDH), y de las
aminotransferasas de aspartarto (AST) y alanina (ALT).
2) Comparar el efecto de la melato nina sobre la toxicidad del acetaminofén con
el efecto de la N-acetil-cisteína y la cisteamina, fármacos utilizados en el
tratamiento de la intoxicación con acetaminofén en humanos.
3) Evaluar los cambios histológicos, a nivel hepático, producidos por la
intoxicación con APAP, y bajo el tratamiento con N-acetil-cisteína y melatonina.
4) Implementar el sistema de cultivo de hepatocitos como modelo para estudiar
in vitro el mecanismo de acción de fármacos hepatotóxicos.
26
METODOS
PROCEDIMIENTO IN VIVO
I. SOLUCIONES.
1) Acetaminofén (APAP).
Las concentraciones de APAP que se han utilizado para la generación
de un daño hepático severo no mortal en rata varían desde los 500 hasta los
1000 mg por Kg de peso corporal (Beales y McLean, 1995; Mitchell y cols.,
1973a). Debido a que no es recomendable administrar grandes volúmenes de
líquido por vía intraperitoneal (i.p.) en ratas, la dosificación del APAP se realizó
empleando soluciones sobresaturadas del fármaco en solución salina isotónica
(SSI) [0.2 g/mL de solución].
Considerando la limitada solub lilidad del APAP en agua (1 g/70 mL a
25°C o 1 g/20 mL a 100°C en el presente estudio fue necesario utilizar las
propiedades químicas del fármaco para preparar soluciones sobresaturadas.
Connors y cols. (1979) reportaron que una solución saturada de APAP
presenta un valor de pH de aproximadamente 6.0, y un pKa de 9.51; es decir,
el valor de pH en el cual las formas disociada y no disociada del fármaco se
encuentran en equilibrio es un pH alcalino. La solubilización del APAP se logró
utilizando una solución salina isotónica con un valor de pH próximo al valor de
pKa reportado para el fármaco. A este pH (~10.0 -10.5) el APAP presentó
buena solubilidad y estabilidad (Connors y cols., 1979; Mitchell y cols., 1973a).
De acuerdo con los estudios de estabilidad desarrollados por Koshy y
Lanch (1961) la hidrólisis es la ruta principal de degradación que contribuye a la
inestabilidad del fármaco; la hidrólisis del APAP produce ácido acético y paminofenol. Macroscópicamente, esta degradación por oxidación del fármaco
resulta evidente por un cambio instantáneo en la coloración de las soluciones
del APAP (Connors y cols. 1979), por lo que el criterio de estabilidad para las
soluciones del fármaco se basó en la coloración de las mismas, las cuales
debían permanecer incoloras por un tiempo mayor de 5 minutos.
27
2) Melatonina.
La melatonina presenta una alta solubilidad en solventes polares (Costa
y cols., 1995), por esta razón, el vehículo empleado para la preparación de una
solución de almacenamiento fue una mezcla de SSI y etanol en Ias siguientes
proporciones: 20 mg de melatonina se disuelven en 200 a 300 µl de etanol, y
se lleva a un volumen de 5 mL con SSI.
3) Cisteamina y N-acetil-cisteína (NAC).
La disolución de cisteamina y de N-acetil-cisteína (NAC) se hizo en SSI
en una proporción de 20 mg/mL de solución. Tanto la cisteamina como la NAC
presentan una buena solubilidad en agua.
II. SUJETOS EXPERIMENTALES.
Se utilizaron ratas adultas macho de la cepa Wistar de ~60 días de edad
con un peso corporal de 200 a 250 gramos. Todas las ratas se mantuvieron en
cajas de plástico (4 a 6 ratas por caja), a temperatura ambiental y con un ciclo
luz-oscuridad natural. Hasta el día del experimento y durante éste las ratas
tuvieron libre acceso al agua y al alimento, el cual fue a base de croquetas.
Todos los experimentos se realizaron durante la fase de luz, haciendo la
primera administración a la misma hora (07:00 A.M.).
III. GRUPOS EXPERIMENTALES.
El día del experimento las ratas se dividieron en cuatro grupos,
aplicándoles uno de los siguientes protocolos experimentales (Figura 7):
28
FIGURA 7. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EL ESTUDIO DE LA ACCION
PROTECTORA Y/O DE ANTIDOTO DE LA MELATONINA SOBRE LA TOXICIDAD
INDUCIDA POR ACETAMINOFÉN EN RATA.
29
Grupo 1: Daño hepático por acetaminofén.
La capacidad hepatotóxica del acetaminofén se evaluó administrando las
dosis de 500, 600, 800 ó 1000 mg/kg del fármaco. Las características
evaluadas para la cuantificación del daño fueron el porcentaje de letalidad, la
latencia
de
muerte,
el
comportamiento,
las
características
hepáticas
macroscópicas y microscópicas, la medición de la actividad de las enzimas
lactato deshidrogenasa (LDH), aminotransferasa de aspartato (AST) y
aminotransferasa de alanina (ALT). De acuerdo con los resultados obtenidos
en esta evaluación se seleccionó la dosis de 500 mg/kg ya que se adaptó a las
necesidades de nuestro protocolo, tanto en tiempo de vida de las ratas
administradas con esta dosis así como en magnitud y significancia del daño
obtenido, comparado con las condiciones basales.
Grupo 2: Curva dosis respuesta (Acción preventiva).
El estudio de la acción preventiva de Melatonina (MEL) y N-acetilcisteína contra el daño hepático inducido por APAP se evaluó administrando en
primer término una dosis única (0.1, 1.0, 10.0 ó 30.0 mg/kg) de alguno de los
dos fármacos y tres horas después una sola dosis de 500 mg/kg de APAP.
Grupo 3: Grupo control.
La evaluación de los cambios o alteraciones generados por los fármacos
empleados en este estudio se realizó administrando dosis únicas de cada uno
de ellos. A partir de los resultados obtenidos en la curva dosis-respuesta se
administraron las dosis de MEL y NAC que ofrecieron la mayor protección
contra la toxicidad del APAP; la dosis tóxica de APAP seleccionada y el
vehículo utilizado para la disolución del APAP. Los grupos experimentales se
dividieron de la siguiente manera:
a) Solución salina isotónica (pH= 10.5)
b) Acetaminofén (500 mg/kg)
c) N-acetil-cisteína (10 mg/kg)
d) Cisteamina (10 mg/kg)
e) Melatonina (10 mg/kg)
30
4) Actividad como antídoto.
Administración de una dosis de 500 mg/kg de APAP, seguida por una
dosis única de a) Melatonina ó b) N-acetil-cisteína tres horas después de la
administración del APAP. Las dosis de melatonina o N-acetil-cisteína
corresponden a las dosis que permitan una mayor protección contra el daño
hepático generado por APAP, de acuerdo con los resultados obtenidos con el
grupo 2.
Vía de administración: La vía de administración para cada uno de los
compuestos estudiados fue la intraperitoneal (i.p.), utilizando como volumen
máximo de dosificación de 0.5 mL.
IV) ANESTESIA.
8 horas después de la administración del acetaminofén o de cada uno de
los otros fármacos (grupo control) las ratas se anestesiaron con pentobarbital
sódico (*Anestesal) a una dosis de 45 mg/kg de peso corporal por vía i.p.
V. PRUEBAS ENZIMATICAS Y ANALISIS MACRO Y MICROSCOPICO.
1) Toma de muestras sanguíneas.
Con la ayuda de una jeringa para insulina sin anticoagulante se extrajo
una muestra de aproximadamente 0.6 mL de sangre de la vena yugular. Una
vez coagulada, se centrifugó a 2500 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante 5
minutos para la separación del paquete celular y el suero.
2) Pruebas enzimáticas.
Las muestras séricas obtenidas se emplearon para la cuantificación de
la actividad de las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH), arninotransferasa de
aspartato (AST) y aminotransferasa de alanina (ALT). Los principios en los que
se basan estas determinaciones son los siguientes (Figura 6):
31
i) Lactato deshidrogenasa (LDH).
La medición de LDH se desarrolló mediante un método colorimétrico
basado en la reducción reversible de piruvato a lactato, catalizada por la LDH,
la cual representa el último paso de la glicólisis anaerobia.
LDH
Ácido pirúvico + NADH <======> Ácido láctico + NAD
En el equilibrio, la reacción favorece fuertemente la reducción de
piruvato a lactato a una velocidad proporcional a la cantidad de LDH. La
cantidad de piruvato remanente después de la incubación es inversamente
proporcional a la cantidad de LDH activa en la muestra. La cuantificación
realizada por este método se refiere a la lactato deshidrogenasa total presente
en el suero, es decir, a la suma de todas las isoenzimas (Lynch, M.J. y cols.,
1977).
ii) Aminotransferasas.
Los mamíferos realizan la degradación de los aminoácidos en el hígado
principalmente por acción de las enzimas denominadas aminotransferasas (o
transaminasas). Las aminotransferasas catalizan la transferencia de un grupo
? -amino desde un ? -aminoácido a un ? -cetoácido. Los ? -aminoácidos pueden
ser el aspartato o la alanina, por lo que se les denomina como
aminotransferasa de aspartato (AST) y aminotransferasa de alanina (ALT),
mientras que el cetoácido es el ? -cetoglutarato (Lynch y cols., 1977).
Bajo condiciones normales los niveles séricos de estas enzimas son muy
bajos; sin embargo, cuando hay daño tisular hay un aumento en la actividad
enzimática. En las lesiones agudas de la célula hepática, los niveles séricos de
la ALT se encuentran considerablemente aumentados teniendo un incremento
incluso mayor que el de la AST; lo anterior da lugar a la idea de que las
mediciones de ALT son más específicas de alteraciones agudas del hígado que
las mediciones de AST; sin embargo, la experiencia no confirma esta opinión
ya que las cifras séricas de AST también aumentan considerablemente en las
lesiones agudas del hepatocito (Lynch y cols., 1977).
32
Análisis Estadístico: Los resultados obtenidos en la cuantificación de las
actividades enzimáticas de la LDH, AST y ALT se evaluaron utilizando la
prueba de t de Student y el análisis de varianza (ANOVA) (Wackerly y cols.,
1996; Wallenstein y cols., 1980).
3) Análisis macroscópico y microscópico.
El análisis macroscópico del daño generado por altas dosis de APAP se
realizó observando en todos los órganos abdominales, dando atención especial
al hígado y al riñón, órganos blancos para la actividad citotóxica del APAP. Las
características morfológicas observadas para la evaluación del daño fueron
coloración, consistencia, dilatación de vasos sanguíneos y presencia de
trombos.
El análisis microscópico del daño por APAP se evaluó mediante cortes
histológicos de hígado fijados por inmersión en una solución de formaldehído al
10%. Los hígados fijados fueron incluidos en parafina, cortados en láminas de
3-4 µm de espesor, y teñidos por la técnica de hematoxilina y eosina. Las
características que se consideraron como indicadores del daño celular fueron:
la aparición de vacuolas y de agregados basófilos en el núcleo de los
hepatocitos perivenosos, principalmente, y la presencia de un citoplasma más
esosinófilo que lo usual.
33
PROCEDIMIENTO IN VITRO
CULTIVO DE HEPATOCITOS AISLADOS
Un punto clave en el desarrollo de los métodos para la preparación de
hepatocitos aislados intactos vino de la demostración del valor de la
colagenasa como una herramienta para la separación de las células hepáticas.
Dos años después, Berry y Friend (1969) introdujeron la técnica de perfusión
del hígado con colagenasa como un medio para aumentar el rendimiento (Berry
y cols., 1991).
Los
dos
requerimientos
esenciales
para
cualquier
método
de
preparación de hepatocitos aislados por perfusión con colagenasa son 1) la
exposición de las células a una concentración muy baja de calcio, para permitir
el rompimiento de las uniones desmosomales y 2) la utilización de calcio para
lograr la activación de la colagenasa. Este conflicto se ha resuelto utilizando
procedimientos en dos etapas (Berry y cols., 1991).
En el presente estudio, el cultivo de hepatocitos intactos se realizó
modificando el protocolo propuesto por Seglen (1973) mediante la aplicación de
un procedimiento de perfusión del hígado en dos etapas a través de la vena
porta hepática. En el primer paso, el hígado se perfundió con una solución
amortiguadora libre de calcio (puede también utilizarse un quelante como el
EGTA) para separar los contactos desmosomales y provocar la disociación
completa del parénquima; después, la perfusión se continuó con una solución
que contenía colagenasa y calcio (un activador obligatorio de la enzima) para
disolver la matriz extracelular (Celis, 1994).
I. SOLUCIONES
1) DMEM (GIBCO Cat. No. 31600-026). Este es un medio de cultivo con Lglutamina, 110 mg/L de piruvato sódico y sin bicarbonato de sodio.
Para preparar 1 litro de solución se midieron 900 mL de agua
desionizada y se adicionó a este volumen el medio contenido en un sobre
(realizarlo a temperatura ambiente, 15-30°C) con agitación suave. Se
agregaron 10 mL de una solución HEPESNa 1 M para obtener una
concentración final amortiguada de 10 mM. Se ajustó el pH a un valor de 7.4
34
esterilizando por filtración con presión negativa usando un filtro Nalgene
(diámetro del poro 0.2 µm).
MEDIO DMEM COMPLETO: Se agregó al medio DMEM 10% de suero de
ternera y 0.1% de antibiótico que contenía 100 µg/mL de sulfato de
estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G sódica y 25 µg/mL de anfotericina B.
2) SOLUCION DE TYRODE.
mM
NaCl
KCI
HEPES-Na+
154.2
5.4
10.0
CaCl2
1.8
MgCl2
1.0
A esta solución se agregaron glucosa (1 mg/mL), albúmina (1 mg/mL) y
colagenasa tipo IV (2 mg/mL).
3) SOLUCION TYRODE SIN CALCIO.
A la solución tyrode sin calcio se agregó 0.1% de antibiótico.
4) SOLUCION DE LAVADO.
A la solución Tyrode sin calcio se le agregó 1 mg/mL de albúmina y 0.1%
de antibiótico.
5) HEPARINA
Se disolvieron 10 mg de heparina por mililitro de solución salina isotónica
estéril para obtener una concentración de 1000 UI/mL.
35
6) COLAGENA COMO SUSTRATO PARA CULTIVO
A. EXTRACCIÓ N: Se preparó una solución de colágena a partir de fibras
aisladas de cola de rata; el procedimiento fue el siguiente:
a) Se sacrificó una rata y se quitó la piel que cubría a la cola.
b) Con la ayuda de unas pinzas de disección se extrajeron las fibras de
colágena y se depositaron en una solución de ácido acético glacial al 80%.
c) Se agitó durante 24 horas a una temperatura de 0 a 4°C.
B. APLICACIÓ N DE LA COLAGENA A LAS CAMARAS DE CULTIVO
Se tomaron unos cuantos mililitros de solución en un vaso de
precipitados de 20 mL inmerso en hielo, y se trasladaron a la campana de flujo
laminar. Se extendió una película delgada de colágena en el fondo de las cajas
de cultivo, utilizando un hisopo de algodón. Posteriormente se colocaron las
cajas en una cámara de luz ultravioleta durante 30 a 60 minutos para secar y
esterilizar la colágena.
Antes de colocar el medio de cultivo en que se van a sembrar las
células, es muy importante lavar las cajas con agua destilada estéril para evitar
la acidez que provocaría cualquier residuo del ácido acético.
ll. SUJETOS EXPERIMENTALES Y EXTRACCION DEL HIGADO.
Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar con un peso corporal de 200
a 250 gramos las cuales se anestesiaron con pentobarbital sódico (45 mg/kg,
i.p.). Una vez inconscientes, las ratas se colocaron sobre una mesa de
disección y se aplicó una dosis de 1000 UI de heparina por la vena femoral.
La perfusión del hígado se realizó de la siguiente manera (Figura 8):
1) Con un corte largo y transverso se abrió el abdomen de la rata, previamente
desinfectado con alcohol etílico al 70%, extrayendo los intestinos para exponer
el área de las venas porta hepática y cava posterior. Utilizando unas pinzas
finas de disección se rompió el tejido conectivo que cubre la región iliolumbar y
se colocó una ligadura “floja” alrededor de la vena porta utilizando hilo de seda.
Se alineó la cánula portal a lo largo de la vena ajustando esta posición para
36
asegurar que la punta de la cánula portal permaneciera justo dentro de la
ligadura. Para eliminar las burbujas de aire de la cánula, el sistema de
perfusión se “purga” inicialmente pasando un poco de la solución Tyrode sin
calcio.
2) Con tijeras finas se hace un corte profundo en la vena portahepática
canulando inmediatamente e iniciando la perfusión con solución Tyrode libre de
calcio caliente (37°C) (1er. Paso). Casi al mismo tiempo se hace un corte en la
vena cava posterior, para permitir el eflujo, perfundiendo un volumen total de 40
ml de la solución libre de calcio.
3) Se incrementa gradualmente el flujo de la perfusión para lavar la sangre del
hígado y, cuando el hígado está completamente decolorado y adquiere un
ligero color tostado, la vena cava superior se cortó justo abajo del diafragma y
se incrementó el flujo de la perfusión a 50 ml/min, perfundiendo un volumen
total de 20 ml.
4) Por un momento se suspendió el flujo de la perfusión y se inició la perfusión
de una solución de Tyrode con calcio que conte nía colagenasa tipo IV. La
perfusión del hígado se realiza inicialmente a una baja velocidad, mientras se
permite que la solución Tyrode libre de calcio se consuma, incrementando la
velocidad de perfusión a 50 ml/min.
5) Una vez terminada la perfusión del Tyrode con calcio y colagenasa, el
hígado se diseca cortando la vena cava en sus dos extremos así como la vena
porta y el ducto biliar (distal a la ligadura portal). Se cortan todos los ligamentos
delgados que conectan al hígado con los intestinos y la pared abdominal;
finalmente el hígado se extrae y se sumerge en la solución de lavado sin calcio,
contenida en una caja de Petri.
37
FIGURA 8. DISECCION Y PERFUSION DEL HIGADO PARA LA PREPARACION DE
HEPATOCITOS AISLADOS.
III. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE HEPATOCITOS.
1) Con la ayuda de unas pinzas finas, se sujeta firmemente el hígado a través
de la vena cava para eliminar la cápsula de Glisson que cubre a este órgano.
Una vez eliminada la cápsula, el hígado se corta en pequeños trozos que son
colocados en un matraz Erlenmeyer que contenga solución Tyrode sin calcio
con albúmina y antibiótico, incubando a 37°C con agitación durante 30 minutos.
2) La suspensión formada se filtra a través de una gasa estéril para la remoción
de los desechos de tejido conectivo y masa celular. Al final, la gasa se presiona
suavemente contra el fondo interno y las paredes de un embudo de plástico, y
se levanta lentamente sobre la suspensión agitando suavemente para evitar la
compresión de las células a través del filtro.
3) La suspensión de hepatocitos se lava por centrifugación (1000 rpm/10
minutos) con resuspensión suave en 40 ml de medio DMEM completo.
Finalmente las células se resuspenden en DMEM completo.
38
IV. VIABILIDAD CELULAR.
La viabilidad celular de la suspensión de hepatocitos obtenida se evaluó
con el método de exclusión del azul tripano.
El azul tripano es una amina orgánica, con una carga neta negativa que
no penetra al interior de los hepatocitos que presentan sus membranas
intactas, mientras que las células dañadas rápidamente lo incorporan al
citoplasma; es probable que la exclusión de la amina sea un proceso de
membrana dependiente de energía (Ferry y cols., 1991).
Después de incubar durante 1-2 minutos una alícuota de la suspensión
de hepatocitos (50 µL) con una solución de azul tripano 0.02%, se colocaron 15
µL de la mezcla en una cámara de Neubauer y se contó el número de células
en un microscopio invertido.
El porcentaje de viabilidad se calcula mediante la siguiente ecuación:
%Viabilidad = Total de células - Células teñidas
Total de células
V.
INCUBACION
DEL
MEDIO
EN
LA
CAMARA
DE
CULTIVO
E
INOCULACION DE LOS HEPATOCITOS.
Se agregó 1 mL del medio DMEM completo a cada uno de los
compartimentos de la cámara de cultivo. Se incubó a 34°C y se sembraron
alícuotas de 300 µL de suspensión de hepatocitos en cada uno de los pozos de
la cámara de cultivo.
Se incubaron las células a 34-36°C en una incubadora y se cambió el
medio 2 horas después para eliminar las células no adheridas, así como los
eritrocitos. El experimento con los fármacos se realizó 24 horas después.
VI. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES.
Después de 24 horas de incubación, los hepatocitos se sometieron a los
siguientes tratamientos:
a) Grupo control: Adición del medio DMEM sin químicos.
39
b) Acetaminofén: Suplementación del DMEM con APAP suficiente para obtener
una concentración 5 mM.
c) Melatonina: Adición de melatonina al medio DMEM para obtener una
concentración, 2mM.
d) Acción Protectora: Pretratamiento de los hepatocitos con melatonina 2 mM.
La hormona se agregó 0, 2, 4 y 6 horas antes de la adición de APAP (5 mM).
e) Acción Antídoto: Adición de melatonina 2 mM 2 ó 4 horas después de la
adición de 5 mM de APAP a los hepatocitos en cultivo.
VII. INDICE DE TOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN EN HEPATOCITOS EN
CULTIVO.
La medición del daño celular se realizó cuantificando los niveles de LDH
liberado al medio de cultivo. A nivel celular, la enzima lacato deshidrogenasa se
encuentra localizada en forma casi exclusiva a nivel del citoplasma, por lo que
su cuantificación en el líquido extracelular se utiliza como un indicador del daño
celular.
La actividad de LDH para cada uno de los grupos experimentales se
expresa en relación a la concentración de proteínas totales en cada cámara en
que se sembraron las células. Las proteínas de la monocapa celular se
cuantificaron por el método de Bradford.
A) Desprendimiento de la monocapa celular.
Una vez retirado el medio DMEM de los compartimentos de la cámara
de cultivo, los hepatocitos se suspendieron, con la ayuda de una espátula, en
una solución amortiguadora hipotónica con la siguiente composición:
mM
NaCl
KCI
HEPES-Na+
120.0
6.0
25.0
MgCl2
1.0
CaCl2
1.2
40
Suplementada con glucosa (10 mg/mL) y 0.01% de azida de sodio. El pH
de la solución se ajustó a 7.4
B) Método de Bradford.
Este método de cuantificación de prote ínas se basa en la unión del Azul
de Coomassie G-250 a proteínas. Esta unión causa un cambio en la
absorbancia del colorante en el rango de longitud de onda de 465 a 595 nm. A
diferencia de otros métodos de cuantificación de proteínas, éste es un ensayo
rápido y reproducible (la unión del colorante a las prote ínas ocurre en forma
total en aproximadamente 2 minutos). A diferencia del procedimiento de Lowry,
el método de Azul de Coomassie no presenta interferencia con cationes tales
como sodio o potasio, ni con carbohidratos como la sacarosa (Bradford, 1976).
Se prepararon soluciones de albúmina para obtener la curva de
calibración. A cada una de las diluciones preparadas se adicionaron 5 mL del
reactivo de Azul de Coomassie y 2 minutos después se leyeron las
absorbancias a una longitud de onda de 595 nm.
La concentración de proteína presente en cada uno de las cámaras se
calculó a partir de la ecuación de regresión lineal obtenida para la curva de
calibración.
41
RESULTADOS.
I. ACCION TOXICA DEL ACETAMINOFÉN.
La administración intraperitoneal de acetaminofén a dosis de 500, 600,
800 y 1000 mg/kg provocó las siguientes alteraciones:
A) Comportamiento.
En todas las ratas a las que se administró una dosis superior a los 800
mg/kg de acetaminofén se presentó un estado de somnolencia y letargo
permanente que inició a los pocos minutos después de administrado el
fármaco.
La administración de las dosis de 500 y 600 mg/kg no alteró el estado de
vigilia de las ratas, presentando un comportamiento y movilidad normal.
B) Porcentaje y latencia de muerte.
Dosis mayores a los 600 mg/kg de APAP producen un incremento en el
porcentaje de letalidad; el 100% de letalidad se obtiene en las ratas tratadas
con 800 ó 1000 mg/kg del hepatotóxico. Con respecto a las dosis de 500 y 600
mg/kg, los porcentajes de letalidad fueron del orden de 0 y 25%,
respectivamente.
El tiempo requerido para obtener el efecto letal por acetaminofén fue de
aproximadamente 3 horas para las ratas tratadas con 800 ó 1000 mg/kg
mientras que para la dosis de 600 mg/kg la letalidad se presentó
aproximadamente a las 6 horas después de administrado el fármaco.
C) Características hepáticas macroscópicas.
A través del análisis macroscópico se observó que los principales
órganos que sufren el efecto tóxico del APAP con dosis mayores a 600 mg/kg
fueron (en orden decreciente): intestino, estómago e hígado, sin indicios
macroscópicos de daño a nivel de riñón o corazón. Las principales alteraciones
fueron inflamación del intestino y dilatación de sus vasos; inflamación del
estómago y formación de zonas necrosadas a nivel de los bordes de los
lóbulos hepáticos, con acumulación de líquido perito neal.
42
En algunas ratas a las que se administraron dosis de 500 mg/kg también
se observó el cuadro descrito anteriormente, sin embargo, la incidencia y el
grado del daño fueron menores.
D) Cortes histológicos.
En la figura 9 se muestran cortes histológicos de hígados de ratas
tratadas con SSI (9a), APAP (500 mg/kg; 9b) y MEL (10 mg/kg; 9c) 3 horas
antes de la dosis tóxica del APAP (500 mg/kg).
En la figura 9a se observa la morfología hepática normal, caracterizada
por una distribución radial de las cadenas de hepatocitos con respecto a la
vena central y espacios sinusoidales de tamaño regular. En la figura 9b, se
observa que la administración de una dosis única de APAP produce las
siguientes alteraciones en la morfología hepática: en la periferia de la vena
central se observan signos de necrosis con un desarreglo de los cordones de
hepatocitos, aumenta el tamaño de los espacios sinusoidales y se presenta
necrosis en algunas áreas de los sinusoides hepáticos, particularmente
aquéllos que se localizan en la periferia del área perivenosa. Algunos
hepatocitos presentan una acumulación no cuantificada de cromatina, que en
algunos casos produce gránulos distribuidos en la región perinuclear; en
algunos hepatocitos se observa la formación de vacuolas y en general, el tejido
hepático presentó una menor afinidad por la eosina. A diferencia de los
hepatocitos perivenosos, los hepaocitos de la zona periportal mostraron, en
general, una morfología preservada.
En la figura 9c se observa que el pretratamiento con MEL preserva en forma
significativa la morfología del tejido hepático, presentándose características
similares a las observadas en los cortes de ratas tratadas con SSI.
43
A
FIGURA 9. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DEL TEJIDO HEPATICO DE
RATAS TRATADAS CON (A) SOLUCION SALINA ISOTONICA (x480), (B) 500 mg/kg
DE ACETAMINOFÉN (x300) y (C) MELATONINA (10 mg/kg) 3 HORAS ANTES DE
APAP (500 mg/kg) (x300). En la figura 9a se observa la morfología típica del tejido
hepático caracterizada por una vena central (VC) alrededor de la cual irradian cadenas
de hepatocitos (H) separados por un espacio sinusoidal (S). Después de la
administración de una dosis tóxica de acetaminofén se observa necrosis hepatocelular
a nivel de la vena central con ensanchamiento de tos espacios sinusoidales y
formación de pequetías vacuolas (V) en el interior de los hepatocitos (Figura 9b). El
pretratamiento con melatonina ayuda a la preservación de la integridad del tejido
hepático; al igual que en las ratas control, se observa una disposición radial de los
hepatocitos con respecto a la vena central y espacios sinusoidales normales (9c).
44
B
C
45
E) Actividad enzimática.
Las actividades enzimáticas de la LDH, AST y ALT presentaron un
aumento significativo (comparado con las actividades enzimáticas del grupo
control) en las ratas tratadas con una dosis de 500 mg/kg de APAP. Las
actividades enzimáticas para las ratas tratadas con 800 ó 1000 mg/kg, no
fueron cuantificadas debido a la acción letal de estas dosis.
En la tabla 1 se muestran las actividades enzimáticas promedio de LDH
obtenidas para las ratas tratadas con SSI (grupo control) y APAP a las dosis de
500 y 600 mg/kg.
DOSIS APAP (mg/kg)
LDH (U/I)
mM
SSI
252.32±95.44
5
500
520.87±59.22
7
600
610.00±54.54
5
Tabla 1. ACTIVIDADES DE LA ENZIMA LDH EN RATAS TRATADAS CON APAP
(500 y 600 mg/kg; i.p.). Los valores representan la actividad promedio ± la desviación
estándar. SSI = grupo tratado con solución salina isotónica (pH= 10-10.5); n= número
de experimentos.
II. CURVA DOSIS-RESPUESTA PARA LA ACCION PREVENTIVA
Los resultados obtenidos en la evaluación de la acción preventiva de
melatonina y N-acetil-cisteína contra el daño hepático inducido por APAP se
muestran en la figura 10. El pretratamiento con MEL o NAC en dosis de 10
mg/kg de peso mantuvo los niveles de LDH en valores que no presentan
diferencia
significativa
al
ser
comparados
estadísticamente
(ANOVA-
Bonferroni) con el grupo control (SSI).
46
FIGURA 10. EVALUACION DE LA ACCION PROTECTORA DE N-ACETIL-CISTEINA
Y MELATONINA CONTRA LA TOXICIDAD INDUCIDA POR APAP EN RATAS. La
acción protectora de N-acetil-cisteina (NAC) y melatonina (MEL) se evaluó dando un
pretratamiento a las ratas con metatonina [0.1, 1.0, 10 y 30 mg/kg, i.p. (n= 4, 4,10 y 4,
respectivamente)] o N-acetil-cisteína [0.1, 1.0, 10 y 30 mg/kg, i.p. (n= 4 para cada, una
de las dosis)] 3 horas antes de la administración de una dosis tóxica de acetaminofén
(500 rng/kg). La administración de dosis de 10 mg/kg de N-acetil-cisteína o melatonina
reduce la actividad da la LDH a valores que no presentan diferencia significativa
(*p<0.05) cuando son comparados estadísticamente, con la prueba de
ANOVABonferroni, con respecto al grupo control (C); sin embargo, a diferencia de la
N-acetilcisteína que a dosis de 1 y 30 mg/kg mantuvo la actividad de la AST en niveles
estadísticamente similares a los del grupo control, ninguna de las dosis administradas
de melatonina redujo en forrna significativa dichos niveles. Las actividades de ALT
obtenidas para las ratas pretratadas con N-acetil-cisteína a las 4 dosis probadas no
presentaron diferencia estadísticamente significativa al aplicar la prueba de
ANOVABonferroni con respecto al grupo control. De las dosis administradas de
melatonina solamente la dosis de 30 mg/kg ofrece una protección significativa con
respecto a las actividades enzimáticas del grupo control. *= diferencia
47
estadísticamente significativa ante la prueba de ANOVA-Bonferroni (p<0.05) con
respecto al grupo control (SSI).
La actividad sérica de la enzima AST se mantiene dentro de los niveles
basales solamente cuando se administraron 1 y 30 mg/kg de N-acetil-císteína,
antes de Ia intoxicación con APAP, mientras que de las dosis administradas de
melatonina ninguna logró mantener los niveles séricos de la AST dentro del
rango de valores normales (ANOVA-Bonferroni; p<0.05).
La administración de N-acetil-cisteína, en el rango de dosis analizadas
(0.1 a 30 mg/kg) logró mantener la actividad sérica de la enzima ALT en niveles
similares a los basales, mientras que de las dosis utilizadas de melatonina
solamente la administración de 30 mg/kg logró un efecto similar. La actividad
de la enzima ALT representa un índice clave de hepatotoxicidad dentro de la
clínica con humanos.
La dosis de N-acetil-cisteína y melatonina seleccionada para los
siguientes protocolos fue de 10 mg/kg para ambos fármacos; esta selección se
hizo considerando que:
1) La administración de una dosis de 10 mg/kg de NAC o de melatonina logra
mantener la actividad enzimática de la LDH en niveles que no presentan
diferencia significativa cuando se comparan con las actividades séricas de la
enzima obtenidas para el grupo control.
2) La N-acetil-cisteína en el rango de dosis de 0.1 a 30 mg/kg mantiene la
actividad de la ALT en niveles similares al basal, protegiendo al tejido hepático
contra la toxicidad por APAP.
3) La melatonina a dosis de 10 mg/kg se ha utilizado como un agente protector
contra la peroxidación lipídica inducida por CCl4 (Daniels y cols., 1995).
III. EFECTO DE LOS FARMACOS
Los efectos producidos sobre las acti vidades enzimáticas por la
administración de dosis únicas de melatonina (10 mg/kg), N-acetil-cisteína (10
mg/kg) ó cisteamina (10 mg/kg) se muestran en la figura 11, donde además se
48
incluyen los resultados obtenidos al administrar la SSI (vehículo del APAP) y
APAP (500 mg/kg).
La administración de dosis únicas de melatonina o cisteamina (10
mg/kg) mantiene los niveles enzimáticos de la LDH, la AST y ALT similares a
los obtenidos para el grupo tratado con SSI, reflejando una buena seguridad
farmacológica y una buena reproducibilidad para ambos fármacos. Por el
contrario, la administración de N-acetil-cisteína produce un incremento
importante en las actividades enzimáticas, tanto de la LDH como de la AST;
además la dispersión de los datos refleja una diferencia en la respuesta entre
individuos. La variabilidad obtenida con N-acetil-cisteína indica que bajo
nuestras condiciones experimentales, no es recomendable la utilización de la
N-acetil-ciste ína como fármaco de referencia para el estudio de compuestos
con propiedades para la prevención del daño hepático. Con respecto al
comportamiento se observó que, a diferencia de las ratas tratadas con NAC,
las ratas tratadas con melatonina presentaron un ligero estado de somnolencia
y una reducción en la movilidad. No se observaron cambios importantes en las
características morfológicas macroscópicas de los órganos abdominales en las
ratas tratadas con N-acetil-cisteina, cisteamina o melatonina.
49
FIGURA 11. EFECTO DE LA ADMINISTRACION DE DOSIS UNICAS DE (C)
SOLUCION SALINA ISOTONICA (n=7), (A) ACETAMINOFÉN (500 mg/kg; n=8), (N)
NACETIL-CISTEINA (10 mg/kg; n=14), (Ci) CISTEAMINA (10 mg/kg; n=4) y (M)
MELATONINA (10 mg/kg; n=4) SOBRE LAS ACTIVIDADES SERICAS DE LAS
ENZIMAS LDH, AST y ALT EN RATAS. La administración de APAP en ratas
ocasiona un aumento significativo en las actividades enzimáticas de LDH, AST y ALT,
con respecto al grupo (C), indicando un daño generado por el fármaco. Cisteamina y
melatonina no alteran los niveles enzimáticos, obteniendo actividades semejantes a
las del grupo control (C). Las actividades enzimáticas en suero de ralas dosificadas
con N-acetil-cisteína presentaron una gran dispersión y un aumento significativo
(*p<0.05) al ser comparadas con las del grupo control (C). El análisis estadístico
empleado fue el de ANOVA-Bonferroni utilizando un nivel de significancia p<0.05.
50
IV. ACTIVIDAD COMO ANTÍDOTO.
En la figura 12 se muestran los valores promedio de las actividades de
LDH obtenidos en la evaluación de la actividad como antídoto de la melatonina,
la cisteamina y la N-acetil-cisteína.
Cuando los fármacos se administraron después de la intoxicación con
APAP se observó un aumento importante en la actividad de la LDH Este
aumento fue similar al obtenido por la administración de APAP solo. De los tres
grupos experimentales, el grupo de ratas tratadas con NAC presentó la mayor
actividad promedio además de una gran dispersión; esto limita la utilización de
este fármaco como antídoto ya que en dosis únicas no ofrece ninguna mejoría
ante la toxicidad inducida por APAP. La administración de cisteamina y de
melatonina después de la intoxicación con APAP tampoco redujo los niveles
enzimáticos de la LDH, presentando actividades promedio similares a las
obtenidas para el grupo tratado solo con APAP.
De acuerdo con lo anterior, y bajo nuestras condiciones experimentales,
puede establecerse que una vez que el mecanismo de toxicidad del APAP se
ha iniciado, la administración de dosis únicas de N-acetil-cisteína, cisteamina o
melatonina no reducen el daño hepático.
51
FIGURA 12. EVALUACION DE LA CAPACIDAD COMO ANTIDOTO ANTE LA
TOXICIDAD POR (A) ACETAMINOFÉN (500 mg/kg; n=8) DE (N) N-ACETILCISTEINA (10 mg/kg; n=8), (Cí) CISTEAMINA (10 mg/kg; n=4), Y (M) MELATONINA
(10 mg/kg; n=4). La administración de dosis únicas de melatonina o cisteamina 3
horas después de la administración del hepatotóxico redujo la toxicidad del mismo, de
acuerdo con la prueba estadística ANOVA-Bonferroni realizada con las actividades
promedio de la LDH para ambos grupos. La administración de N-acetil-cisteína como
antídoto no ofrece mejoría ante la toxicidad por APAP; esto se refleja en los niveles
enzimáticos de LDH que fueron más altos que los obtenidos para el grupo tratado solo
con APAP.
52
V. MODELO DE CITOTOXICIDAD IN VITRO.
Durante la implementación de la técnica para el cultivo de hepatocitos se
realizaron pruebas de viabilidad celular, utilizando la técnica de exclusión de
azul tripano. Los porcentajes de viabilidad obtenidos en nuestras condiciones
experimentales fluctuaron entre un 85 y un 90%.
Los resultados obtenidos en la evaluación de la toxicidad del APAP y del
efecto de la melatonina se muestran en la tabla 2.
TRATAMIENTO
LDH (U/I)/µg de Proteínas
1.0947
Control
1.8225
Acetaminofén (5mM)
0.9529
Melato nina (2 mM)
1.4349
Acetaminofén (5 mM) + Melatonina (2 mM)
ACCIÓN PREVENTIVA
Horas
2
1.5800
4
1.5735
6
1.1641
ACCIÓN DE ANTÍDOTO
Horas
2
0.7055
4
1.0105
TABLA 2. EVALUAClON DE LA ACCION DE LA MELAT ONINA SOBRE LA
TOXICIDAD INDUCIDA POR ACETAMINOFÉN EN HEPATOCITOS EN CULTIVO.
La acción preventiva se evaluó pretratando a los hepatocitos con melatonina 2 mM y
lespués de 2, 4 ó 6 horas se agregó al medio APAP (5 mM). La acción como antídoto
se evaluó administrando melatonina 2 ó 4 horas después del pretratamiento con
APAP 5 (mM).
53
El tratamiento de los hepatocitos con APAP 5 mM produce un aumento
en la actividad de la LDH, el cual indica daño a nivel de la membrana celular.
La adición de melatonina 2 mM al medio de cultivo no altera la actividad
enzimática de la LDH en hepatocitos.
La acción protectora de la melatonina ante la toxicidad del APAP fue
parcial, obteniendo la mayor protección en los hepatocitos pretratados con
melatonina 6 horas antes de la adición del APAP al medio. La actividad
enzimática para este grupo de hepatocitos solo difiere en 0.0694 U/I de LDH/µg
de prote ína con respecto al grupo de hepatocitos control.
La adición de melatonina 2 ó 4 horas después del APAP mantiene la
actividad enzimática de la LDH en los niveles basales (grupo control) reflejando
que la melatonina preserva la integridad de la membrana plasmática de los
hepatocitos.
54
DISCUSION Y CONCLUSIONES
DAÑO HEPÁTICO POR ACETAMINOFÉN: Modelo in vivo.
El hígado es el principal órgano involucrado en el metabolismo y
biotransformación de compuestos químicos y drogas, afectando de forma
significativa
la
disposición
sistémica
de
los
mismos.
Durante
la
biotransformación, el hígado puede dar lugar a la formación de metabolitos
bioactivos, algunos de los cuales son tóxicos. Si dichos metabolitos no son
destoxificados eficientemente, el propio hígado se convierte en el blanco
idóneo de su actividad citotóxica (Hinson y Forkert, 1995; Jover y cols., 1994).
La mayoría de los eventos patológicos en el hígado presentan un patrón
característico en su localización zonal. Las razones de esta distribución
preferencial todavía no son claras, pero se pueden incluir alteraciones en la
macro y microcirculación, diferentes respuestas inmunológicas, así como varios
aspectos de la regionalización del metabolismo hepático. Como resultado de
una intoxicación aguda o crónica por ciertos compuestos químicos, se observa
una toxicidad en una región específica del tejido hepático, la cual se explica por
la zonación de las diferentes reacciones que intervienen durante el
metabolismo de la droga. Uno los fármacos con una toxicidad regioespecífica
es el APAP, el cual tiene en la zona perivenosa el sitio blanco para la acción
tóxica del NAPQI (Jungermann y Katz, 1989; Zieve y cols., 1986).
Los resultados obtenidos en el presente estudio corroboran esta
especificidad en la localización del daño por APAP. Es probable que esta
zonación sea resultado de la heterogeneidad funcional del tejido hepático, que
presenta en la zona perivenosa el mayor contenido de enzimas oxidasas
(CYP450) responsables de la conversión de APAP a NAPQI, así como una
menor actividad del glutatión. Ya sea como resultado de la unión covalente a
macromoléculas de membrana o a los estados de estrés oxidativo generados
por los intermediarios electrofílicos del oxígeno, la zona perivenosa representa
el sitio idóneo para la toxicidad del APAP. La inactivación del metabolito tóxico
por unión a GSH y la subsecuente conversión en ácido mercaptúrico, ocurre a
nivel periportal, la zona con el mayor contenido de GSH. De esta manera, la
especificidad de la toxicidad del APAP parece relacionarse a la mayor
capacidad activadora en la zona perivenosa y al mayor grado de
55
destoxificación en la zona periportal debido a los niveles más altos de GSH. La
muerte celular producida por el APAP es evidente dentro de las primeras 8
horas, y ocurre principalmente en las tres primeras columnas de células que
rodean a las venas centrales (Chanda y Mehendale, 1996b; Jungermann y
Katz, 1989; Mitchell y cols., 1973: Prescott y cols., 1971; Prescott y cols., 1974;
Zieve y cols., 1986).
La cuantificación de la actividad de las enzimas intracelulares lactato
deshidrogenasa (LDH) y las aminotransferasas de aspartato y alanina (ALT y
AST) representa un método indirecto en el diagnóstico y valoración funcional
del hígado que permite distinguir, junto con la cuantificación de las bilirrubinas
(directa, indirecta y total), las diferentes clases de hepatopatías (Lynch y cols.,
1977). El estudio de las actividades de estas enzimas forma parte de las
pruebas de funcionamiento hepático utilizadas en la clínica con humanos, ya
que cuando ocurre algún daño a nivel de este órgano, son liberadas de los
hepatocitos a la circulación sistémica, donde pueden cuantificarse por métodos
calorimétricos o enzimáticos.
En nuestros estudios, la medición de las actividades enzimáticas de la
LDH, la AST y la ALT, se utilizó como un indicador de toxicidad aguda por
APAP. En las ratas tratadas con 500 mg/kg de APAP, las actividades
enzimáticas aumentaron en forma significativa indicando la generación de daño
celular. Puede establecerse que el daño ocurrió no solo a nivel hepático ya que
el aumento en la actividad de la LDH, una enzima que se encuentra distribuida
en todo el organismo, nos indica la presencia de un daño celular a nivel
general.
Por otra parte, las enzimas AST y ALT presentan una distribución más
específica; se encuentran en mayor proporción en tejido cardiaco y hepático,
respectivamente. El aumento en la actividad de la ALT puede considerarse un
parámetro más específico de hepatotoxicidad que el aumento en la actividad de
la LDH; si bien algunos autores consideran que la actividad de la AST es más
apropiada para el diagnóstico de un daño a nivel cardiaco, podemos decir que
el aumento obtenido en la actividad de la AST ratifica la presencia del daño a
nivel hepático, ya que este tejido también contiene una concentración
significativa de la enzima (Lynch y cols., 1977).
56
Aunque en estudios previos (Mitchell y cols., 1973; Price y Jollow, 1986)
se ha reportado la utilización de dosis de hasta 1000 mg/kg de peso para la
obtención de estados de toxicidad aguda en ratas, en nuestros experimentos
se produjo una necrosis macroscópica en hígado con dosis de 800 o 1000
mg/kg, con alteraciones importantes en órganos abdominales como estómago
e intestino. Esta diferencia podría atribuirse a la variabilidad individual o a la
dieta (una de las fuentes para la obtención de los precursores del glutatión) ya
que ambas influyen de manera importante en la susceptibilidad a los químicos
(Chanda y Mehendale, 1996b).
Ante la necesidad de administrar grandes dosis de APAP en volúmenes
pequeños de solución, y considerando que las soluciones de APAP disponibles
en el mercado eran inadecuadas para nuestro proyecto por su baja
concentración (1 mg de APAP por mL de solución) y por la presencia de
metanol (el cual es un inductor del sistema del CYP450) como vehículo, fue
necesaria la utilización de una solución salina alcalina (pH= 10~10.5) para la
preparación de nuestras soluciones. A pesar de la alcalinidad de nuestras
soluciones, éstas resultaron inocuas para las ratas ya que las actividades
enzimáticas de LDH obtenidas para los grupos tratados con solución salina
(pH~6.0) y la solución salina alcalina no fueron estadísticamente diferentes
[247.264 ± 63.5901 U/L (n=4) y 252.3232 ± 95.4404 U/L (n=5)], por lo que la
utilización de soluciones saturadas alcalinas representa una alternativa viable
para la administración de soluciones sobresaturadas del fármaco. Cabe
mencionar que en los estudios previos sobre la toxicidad del APAP, algunos
autores han administrado dosis de 300 a 1500 mg/kg de APAP por vía i.p.,
disolviendo el fármaco en una solución salina con un pH de 11.3 a 25°C
(Mitchell y cols., 1973a).
En muchos estudios de toxicidad por APAP también se utiliza la vía oral
para la dosificación del fármaco; esto permite la administración de volúmenes
mayores de solución pero con el inconveniente de que la biotransformación
ocurre en un periodo de tiempo mayor, a diferencia de la vía i.p. en la que la
dosis y el tiempo requerido para la biotransformación del fármaco y la
obtención de cuadros de intoxicación son menores.
El establecimiento de un tratamiento efectivo contra la toxicidad del
APAP es posible si se toma en cuenta la activación metabólica del fármaco y el
57
papel central del tripéptido GSH. Considerando que bajo condiciones de
toxicidad los niveles de GSH están saturados, y que este tripéptido representa
el antídoto ideal contra la acción tóxica del NAPQI, la utilización de compuestos
que presentaran en su molécula alguno de los aminoácidos precursores del
GSH, específicamente a la cisteína (el aminoácido limitante en la biosíntesis
del GSH), resultó una buena alternativa.
En la actualidad el tratamiento en humanos consiste en la aplicación de
N-acetil-cisteína en una dosis inicial de 140 mg/kg de peso por vía oral y la
aplicación de dosis repetidas en intervalos de 4 horas de 70 mg/kg de peso
hasta un total de 17 dosis o hasta que los niveles enzimáticos de la ALT llegue
a los niveles basales (Harrison, 1995). La recuperación de las actividades
enzimáticas normales sólo es posible cuando el daño hepático no es muy
severo ya que, como un mecanismo de defensa, el hígado responde activando
la regeneración celular y la reparación tisular (Chanda y Mehendale, 1996a);
ambos mecanismos son ineficientes en estados de intoxicación fulminante
debido a la inhibición de la división celular causada por los hepatotóxicos como
el APAP.
En nuestro estudio, la administración de N-acetil-cisteína de manera
individual en dosis de 10 mg/kg, produce un aumento significativo en la prueba
de ANOVA-Bonferroni (con respecto al grupo control) en las actividades
enzimáticas de LDH y AST con una gran variabilidad individual, quedando en
duda su utilidad como un parámetro de comparación confiable en la evaluación
de nuevos fármacos con propiedades de antídoto ante la hepatotoxicidad de
los fármacos. Por el contrario, la administración de melatonina en dosis únicas
de 10 mg/kg, ofrece una gran seguridad farmacológica, obteniendo niveles
enzimáticos semejantes a los de las ratas tratadas solamente con la solución
salina y con una variabilidad individual baja.
La utilización de N-acetil-cisteína (10 mg/kg) como antídotos 3 horas
después de la administración de una dosis tóxica de APAP no ofrece ninguna
mejoría ante las alteraciones inducidas por el fármaco. Incluso al reducir el
intervalo de tiempo entre la intoxicación y el inicio del tratamiento con los
antídotos los niveles de las actividades enzimáticas presentaron un aumento
similar en ratas a las que se administró N-acetil-cisteína a la misma dosis solo
58
una hora después de haber administrado el APAP (datos no mostrados). Es
probable que la utilización de un esquema de aplicaciones repetidas, similar al
empleado en la clínica con humanos, represente una mejor alternativa para la
restauración de la integridad del tejido hepático y de otros órganos que, como
los riñones, también están expuestos a la acción tóxica del APAP.
Al igual que en las ratas a las que se administró N-acetil cisteina o
melatonina
como
antídotos,
el
pretratamiento
3
horas
antes
de
la
administración del APAP (500 mg/kg) con N-acetil cisteina en dosis de 0.1 y 1.0
mg/kg i.p. provocó un aumento en los niveles enzimáticos aún mayor que el
obtenido para APAP solo. Sin embargo, el pretratamiento con dosis de 10
mg/kg i.p. ofrece una buena protección, obteniendo niveles enzimáticos para la
LDH similares a los de las condiciones basales.
Además de la gran variabilidad individual obtenida por la acción de la Nacetil-cisteína por sí misma, los cambios temporales también influyeron de
manera importante en el efecto de los fármacos. Lo anterior se comprobó al
comparar los resultados obtenidos en los grupos de animales tratados durante
los períodos de verano e invierno, ya que a pesar de administrar la misma
dosis de APAP o de los antídotos, la menor variabilidad y mayor protección se
obtuvo en el grupo de ratas tratado durante el período de verano. Estos
cambios en susceptibilidad a los fármacos sugieren una variabilidad de tipo
estacional.
Los niveles enzimáticos de la LDH y la ALT en ratas pretratadas con
melatonina fueron similares a los basales para las dosis de 10 y 30 mg/kg de
peso respectivamente; sin embargo, como resultado de la variabilidad
individual, los cuatro grupos pretratados con melatonina (0.1, 1.0, 10 y 30
mg/kg) presentaron niveles enzimáticos que, entre sí, no presentaron diferencia
significativa al realizar el análisis de t de Student y ANOVA. Es decir, la
protección ante el daño hepático por APAP en el rango de 0.1 a 30 mg/kg de
melatonina no depende de la concentración de la hormona en el intervalo
estudiado.
59
HEPATOTOXICIDAD POR APAP: Modelo in vitro.
Los modelos celulares in vitro tienen una gran utilidad en áreas de la
investigación toxicológica, especialmente en las encargadas de establecer los
mecanismos de acción de los compuestos químicos, ya que en estas
preparaciones el metabolismo de éstos puede estudiarse bajo condiciones
estrictamente controladas.
Una de las ventajas de la utilización de estos modelos celulares es la
reducción importante del uso de animales en la investigación científica, aún
cuando estos modelos no logran reproducir completamente la especial
interacción funcional que se da en el animal íntegro.
A diferencia de los modelos in vivo, los mecanismos de toxicidad y de
defensa en un sistema de cultivo son resultado de las características de un solo
tipo celular y, aunque resultan más específicos no hay que olvidar que la
respuesta final de un organismo es el resultado de la integración de un
conjunto de respuestas que provienen de diferentes órganos y que involucra
diferentes tipos celulares.
La cuantificación del daño en las preparaciones in vitro, al igual que en
las preparaciones in vivo, puede lograrse eficientemente con la medición de las
actividades de la o las enzimas predominantes en cada tipo celular. Uno de los
indicadores utilizados con mayor frecuencia en los estudios de toxicidad es la
medición de la actividad de la enzima citosólica LDH, la cual se encuentra
presente en todos los tipos celulares (Berry y cols., 1991).
A diferencia de los hepatocitos control (inmersos en medio DMEM sin
químicos), los niveles de LDH cuantificados para los hepatocitos tratados con
APAP a una dosis 5 mM, fueron mayores; este aumento en la actividad de LDH
extracelular puede interpretarse como el resultado de la liberación de LDH
debido al rompimiento de la membrana plasmática de los hepatocitos. El
tratamiento de los hepatocitos con melatonina 2 mM no altera los niveles de la
LDH. El comportamiento in vitro observado para la melatonina en cultivo es
similar al obtenido con el grupo de ratas a las que se administró una dosis
única de melatonina, indicando en forma conjunta que la utilización de
melatonina in vivo o in vitro no altera la homeostasis celular ni del organismo,
presentando una gran seguridad farmacológica; sin embargo, es necesario
60
evaluar la variabilidad de los diferentes grupos experimentales in vitro
realizando un mayor numero de experimentos.
A pesar de que la acción de la melatonina como antídoto in vivo fue
prácticamente nula, en nuestra preparación in vitro la utilización del compuesto
2 o 4 horas después del tratamiento con APAP proporcionó un mejor resultado.
En este protocolo las actividades de la LDH fueron aún menores que la del
grupo control. En este caso, la obtención de actividades de LDH inferiores a las
control con melatonina 2 mM, puede ser resultado de una combinación de su
capacidad depuradora de radicales libres y de la capacidad regeneradora de
membranas lipídicas que presenta la melatonina, sin embargo, nuestros
resultados no nos permiten afirmar con certeza esta acción.
Aunque la utilización de melatonina como un agente preventivo de la
toxicidad por APAP en cultivo logra disminuir parcialmente los niveles de LDH,
la magnitud de esta acción es menor a la actividad como antídoto.
Las dosis de APAP utilizadas para la obtención de efectos tóxicos en
cultivo de hepatocitos varían de 0.1 a 10 mM (Martin y McLean, 1995); sin
embargo, es necesario considerar la especie utilizada, y el método de
preparación de las células ya que se han reportado variaciones para diferentes
cepas de rata (Price y Jollow, 1986). Por otro lado, la dosis de melatonina (2
mM) es la dosis que se utiliza normalmente en cultivos de hepatocitos en los
que se ha probado su acción protectora ante la acción de fármacos que se
caracterizan por inducir estados de estrés oxidativo (Sewerynek y cols., 1995a
y c).
Considerando los resultados de la acción protectora y de antídoto
presentada por la melatonina en el estudio de citotoxicidad in vitro puede
proponerse que el mecanismo de toxicidad empleado por el fármaco en el
cultivo de hepatocitos puede ser mediado por intermediarios reactivos del
oxígeno que generan estados de estrés oxidativo. De ser así, algunas de las
características representativas de esta condición de estrés oxidativo sería un
aumento en la relación [GSH]:(GSSG], a favor de la forma oxidada, un
incremento en la actividad de las enzimas que oxidan el GSH (peroxidasa de
GSH), así como la presencia de peroxidación lipídica.
61
Aunque nuestros resultados in vitro apoyan fuertemente el mecanismo
del estrés oxidativo para la generación del daño por APAP, éstos no son
apropiados para proponer la exclusión del mecanismo de fijación covalente en
esta toxicidad. Sin embargo, en años recientes se ha establecido la función
antioxidante tanto de la N-acetil-ciste ína (Kröger y cols., 1997) como de la
cisteamina (Pal Yu, 1994), lo cual apoya en forma importante la validez de la
toxicidad del acetaminofén por un mecanismo de estrés oxidativo.
A diferencia del organismo integro, una de las desventajas de los
cultivos de hepatocitos es que el procedimiento de dispersión celular puede
alterar las características metabólicas del parénquima hepático; sin embargo,
actualmente se han desarrollado técnicas de cultivo que permiten conservar la
expresión de enzimas esenciales para la biotransformación.
La ventaja más importante del cultivo hepático es la posibilidad de
controlar el ambiente fisicoquímico de las células (pH, temperatura, presión
osmótica, presiones de oxígeno y dióxido de carbono, entre otras); esta
condición no podría lograrse con facilidad en un sistema in vivo (Freshney,
1994).
El desarrollo de las condiciones correctas para la perfusión hepática in
situ con colagenasa representa una de las herramientas más útiles para la
obtención de suspensiones de células parenquimales viables que pueden ser
cultivadas con alta pureza y con la posibilidad de permitir la propagación de
cultivos celulares (Berry ycols., 1991; Freshney, 1994).
El procedimiento de perfusión básico en dos pasos implementado en
nuestro laboratorio se basó en el protocolo propuesto por Seglen en 1975, y
permite la obtención de hepatocitos viables no solo de ratas, sino también de
otras especies (entre las que se incluyen ratones, conejos, y cobayos),
modificando únicamente el volumen y la velocidad de perfusión de las
soluciones de acuerdo con el tamaño del hígado. Consideramos que este
diseño será útil para realizar estudios acerca del mecanismo de acción de
diferentes fármacos. Cabe mencionar que aún es posible incluir algunas
modificaciones para optimizar el protocolo de forma que las características
funcionales hepáticas puedan ser mantenidas y expresadas al máximo.
62
La técnica original de Seglen ya ha sido adaptada por otros autores para
el cultivo de hepatocitos de humano, obteniendo buenos resultados a partir de
la perfusión de una porción ó de biopsias del tejido hepático (Freshney, 1994).
63
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