PROGRAMA DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGßA

7gjXZLVaaVXZ
FHE=H7C7:;BB78EH7JEH?E
:;8?EJ;9DEBE=ß7
<j†VeVgVZaZhijY^VciZ
*iV#ZY^X^‹c
Prefacio
Prefacio
La importancia de la ciencia que están por aplicar a veces se da
por sentada ya que los protocolos se han estudiado y se han
vuelto a estudiar una y otra vez, de modo que exista una
alta probabilidad de que tengan éxito y obtengan el producto
molecular deseado. El trabajo que están a punto de realizar se
basa en una ciencia desarrollada por científicos galardonados
con el Premio Nobel. Werner Arbor, Daniel Nathans y Hamilton
Smith recibieron este premio por su trabajo con enzimas de
restricción. Stanley Cohen, Paul Berg y Herb Boyer lo recibieron
por obtener la primera molécula de ADN recombinante. La
molécula de ADN recombinante que ustedes utilizarán va
más allá de su trabajo porque emplea el gen de un organismo
eucariota, en lugar de uno procariota. Hace apenas unos
años, en 1993, Kary Mullis recibió el Premio Nobel por el
descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa, una
suerte de química elegante que utilizarán en el Laboratorio 8.
De modo que la ciencia que aprenderán durante las próximas
semanas es muy importante y continuará teniendo un papel
importante en el desarrollo de la biotecnología y la medicina.
Su profesor merece buena parte del crédito por hacer que
esta experiencia de laboratorio sea posible. Si bien Amgen
provee los equipos y suministros necesarios para implementar
los laboratorios, para que fuera posible utilizarlos, su profesor
ha aportado muchas horas de preparación, a menudo durante
las noches y los fines de semana. Si han disfrutado de esta
experiencia de laboratorio, recuerden agradecerle a su profesor
por haberla hecho realidad.
Este programa de extensión educativa es en gran medida
el resultado del esfuerzo del Dr. Bruce Wallace, científico
de Amgen, que creía fervientemente que la industria de
la biotecnología tenía la responsabilidad de contribuir a
la educación científica de nuestra sociedad. Antes de su
fallecimiento, el Dr. Wallace logró ver su programa de
extensión educativa crecer y evolucionar hacia la aventura del
descubrimiento que usted está a punto de iniciar.
Estamos en condiciones de traer este programa a su
establecimiento gracias a varias sociedades importantes: la
Fundación Amgen, la Fundación de Pierce College, el Centro de
Biotecnología del Condado de Orange/Los Angeles, el Instituto
Bio-Bridge (biobridge.ucsd.edu/a1), New England Biolabs,
Fotodyne, Invitrogen, Rainin Pipettes, VWR y Bio-Rad.
Si tienen alguna pregunta sobre estas prácticas de laboratorio,
no duden en enviarme un correo electrónico a la dirección que se
indica a continuación.
Martin Ikkanda
Profesor de Biología
Los Angeles Pierce College
[email protected]
Tabla de Contenidos
9^hZŠdYZabVcjVaYZaVWdgVidg^dedgAjXnGZVY^c\
>ajhigVX^‹cYZaViVeV!XdgiZh†VYZ@Zc:lVgY
Tabla de Contenidos
Tabla de
Contenidos
DæC;HE:;
B78EH7JEH?E
DEC8H;:;BB 78EH 7JEH?E
FÜ=?D7I
Introducción a los
microvolúmenes y el pipeteado
1.1 – 1.6
Análisis de restricción de
pARA y pKAN-R
2.1 – 2.3
Digestión de restricción de pARA-R
Introducción a los plásmidos y
las enzimas de restricción
2a.1–2a.4
Ligación de fragmentos de
restricción de pARA y pKAN-R
Producción de un plásmido
recombinante: pARA-R
3.1–3.3
Confirmación de la restricción y
la ligación utilizando
electroforesis en gel de agarosa
4.1–4.4
Confirmación de la digestión de
restricción de pARA-R
4a.1–4a.4
Transformación de la
Escherichia coli con un
plásmido recombinante
5.1–5.6
+W
Transformación de la
Escherichia coli
con pARA-R
5a.1–5a.4
,
Preparación de un cultivo
“overnight” de la Escherichia coli
6.1 – 6.2
-
Purificación de mFP a partir de
un cultivo “overnight”
7.1 – 7.6
.
Extracción del ADN genómico de
células epiteliales bucales
8.1 – 8.5
'
(
(W
)
*
*W
+
Laboratorio 1
Introducción a los
microvolúmenes y el pipeteado
El propósito de esta práctica de laboratorio
es ofrecerles experiencia en el uso de algunas de las
herramientas y las técnicas importantes más comunes
en la biología molecular y presentarles algunas de las
mediciones volumétricas de uso más frecuente en este
campo de la ciencia. Se les brindará la oportunidad de
practicar algunas de las destrezas que necesitarán para
construir una molécula de ADN recombinante. Los
instrumentos y suministros que utilizarán durante las
próximas semanas son idénticos a los que se utilizan en los
laboratorios de investigación.
Si bien los fundamentos teóricos sobre los que se han
construido la biotecnología y las ciencias de ADN se
remontan a principios de 1900, la mayoría de las técnicas
de laboratorio empleadas son relativamente recientes.
Y, aunque las técnicas que irán aprendiendo en las
próximas semanas se han vuelto de rutina en los modernos
laboratorios de investigación, son pocos los estudiantes
secundarios y universitarios que tienen la oportunidad
de experimentar la biología molecular con tal grado de
sofisticación.
Cada vez que asistan a una clase de química, una de las
cosas que notarán rápidamente será las diferencias en las
cantidades de reactivos y productos químicos que emplean. En un laboratorio de química típico, los volúmenes
se miden en grandes cilindros graduados. Por lo general,
las soluciones se miden en volúmenes de 50, 100 ó 200
mililitros (ml). Generalmente, el peso de los elementos
1.1
sólidos se expresa en gramos (g). En el laboratorio de
biología molecular, por lo general los volúmenes se miden
en microlitros (µl); donde 1 µl equivale a 0.001 ml. El peso
a menudo se expresa en términos de microgramos (µg) o
nanogramos (ng), donde 1 µg equivale a 0.000001 gramo
y 1 ng equivale a 0.000000001 gramo.
Quizás se estén preguntando por qué los biólogos
moleculares emplean volúmenes y cantidades de material
tan pequeños. El motivo se relaciona con el costo de estos
materiales y lo difícil que resulta obtenerlos. Por ejemplo,
en el próximo laboratorio recibirán algunos plásmidos
diseñados especialmente (ADN). Si este ADN se vendiera
“por libra”, ésta costaría unos 360 millones de dólares.
De modo que no se sorprendan si sólo les entregamos una
cantidad diminuta de moléculas de ADN. La razón por la
que estos productos químicos son tan costosos se relaciona
con la dificultad para prepararlos en forma pura. Muchos
de estos productos químicos se producen en organismos
vivos, como las bacterias, y deben purificarse y separarse
de las otras miles de sustancias presentes en la célula. Sin
embargo, la biología molecular realmente requiere este
nivel de pureza y precisión. A medida que realicen este
trabajo de laboratorio, recuerden que están realizando
biología molecular como en el mundo real.
Laboratorio 1
Materiales
H;79J?LE
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Solución 1
Solución 2
Solución 3
H 2O destilada (dH 2O)
Gel de agarosa al 0.8%
(preparado con anterioridad)
1 x NaB (o TBE 0.5x)
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Micropipeta P-20 (2-20 µl)
Puntas para pipeta desechables
Marcador indeleble
Equipo de electroforesis
Suministro eléctrico
Gradilla plástica para tubos de
microfuga
Métodos
La micropipeta digital
Los protocolos de biología molecular exigen la utilización
de micropipetas ajustables. Las micropipetas se emplean
para verter diferentes volúmenes de líquidos. Si bien los
investigadores tienen varios tipos de micropipetas en su mesa
de trabajo, estos laboratorios han sido diseñados para utilizar
una P-20. Esta pipeta está fabricada para verter entre 2 y 20
µl. Se trata de un instrumento de precisión de alta calidad y es
fundamental que aprendan a usarlo correctamente.
Les pedimos que lean y sigan estas precauciones:
■
■
■
■
Botón del émbolo
No definan el ajuste por debajo de 2 µl ni por encima
de 20 µl, a menos que su profesor se los indique.
No usen la micropipeta sin la punta desechable
adecuada firmemente ajustada al cilindro. Si no
utilizan una punta para pipeta contaminarán el
cilindro de la pipeta.
Eyector de
la punta
Ventana del visor
No dejen la micropipeta con líquido en la punta ni
la sostengan con la punta hacia arriba. Si la punta
desechable no está bien ajustada al cilindro, el líquido
puede caer nuevamente dentro de la pipeta.
Eviten que el émbolo haga un “chasquido” al retirar o
eyectar líquido; con el tiempo esto destruirá el pistón.
Cilindro
1.2
Laboratorio 1
■
■
■
■
■
1.3
Al aspirar (succionar) una solución, presionen
el émbolo hacia la primera marca y bajen la
punta de la pipeta por debajo del nivel de la
solución de la que están
tomando una muestra.
Deben sostener el tubo
que contiene la solución
en la mano a la altura de
los ojos. Es importante
ver que la solución entre
realmente en la punta de
la pipeta.
Lentamente suelten el émbolo y
dejen que el líquido ingrese a la
punta de la pipeta. Asegúrense
de no aspirar aire en la punta.
Al verter (vaciar) el líquido,
coloquen la punta de la pipeta en
el tubo que recibirá la solución.
Ubiquen la punta de manera que toque la
pared interior del tubo y se acerque al fondo.
Lentamente empujen el émbolo hacia la
primera marca y luego hacia la segunda.
Mantengan el pulgar en
el émbolo y retiren la
punta del tubo en el que
están vertiendo el líquido.
Esto evitará que vuelvan
a aspirar el líquido en
la punta de la pipeta.
Asegúrense de ver que la
solución salga de la punta.
Retiren la punta: para ello
utilicen el botón eyector de la
pipeta y arrójenla a un recipiente
de residuos. Si vierten el mismo
reactivo en tubos separados y no
hay peligro de contaminación
cruzada, pueden utilizar la misma
punta varias veces. Para evitar la
contaminación, es bueno depositar
cada reactivo sobre la pared lateral
cerca del fondo del tubo de microfuga sin tocar
ninguno de los demás reactivos. Esta técnica
les permite utilizar la misma punta para verter
el reactivo en varios tubos que contengan un
reactivo diferente.
Al verter un nuevo reactivo, utilicen siempre
una punta nueva para evitar la contaminación.
Ejercicio de pipeteado Nº 1
'
(
Busquen la pantalla en el mango de la micropipeta y observen su
configuración. Giren la perilla estriada del mango en el sentido
de las agujas del reloj para disminuir el volumen, o en sentido
contrario a las agujas del reloj para aumentar el volumen. Al girar
esta perilla, cambia la distancia que viaja el émbolo. Las cifras a
continuación representan algunas de las configuraciones de la
pipeta y los volúmenes de líquido vertido.
2
0
1
2
0
5
0
2
0
4
5
0
20.0 L
12.4 L
5.5 L
2.0 L
Coloquen una punta desechable en el extremo del cilindro de la
pipeta. En un movimiento de torsión con el dedo pulgar e índice,
verifiquen que la punta esté firmemente ajustada al cilindro.
Eviten tocar el extremo de la punta porque pueden contaminarla.
Recuerden que la punta debe estar en su lugar al utilizar
la pipeta.
)
Coloquen el pulgar sobre el botón que activa el émbolo. Presionen
el botón y observen que tiene una marca de “detención”. Si
ejercen un poco más de presión con el pulgar, pueden presionar
el botón del émbolo hasta llegar a una segunda marca. En esta
marca se introduce un pequeño volumen de aire en la punta para
eyectar la solución.
Laboratorio 1
Ejercicio de pipeteado Nº 2
'
Utilicen un marcador indeleble para rotular los tres tubos de reacción: A, B y C.
(
En la tabla de la página 1.4 se resumen los contenidos de cada tubo, pero sigan
las instrucciones que comienzan en el paso 3 para preparar las muestras.
Tubo
A
B
C
dH20
2 µL
2 µL
2 µL
Solución 1 Solución 2 Solución 3 Volumen total
4 µL
–
4 µL
10 µL
–
8 µL
–
10 µL
–
–
8 µL
10 µL
)
Coloquen la micropipeta P-20 en 2 µl y viertan dH2O en los tubos
A, B y C.
*
Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y
reemplácenla por una nueva.
+
Coloquen 4 µl de la solución 1 en el tubo A.
,
Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y
reemplácenla por una nueva.
-
Utilicen una punta nueva y viertan 4 µl de la solución 3 en el tubo A.
.
Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 2 en el tubo B.
/
Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 3 en el tubo C.
'& Guarden los tres tubos para la próxima parte de la experiencia.
Comprobación de la precisión y la consistencia del pipeteado
'
Los tubos A, B y C deben contener 10 µl de solución.
(
Preparen su micropipeta P-20 en 10 µl y coloquen una punta
nueva en el cilindro.
)
Verifiquen con cuidado el volumen de cada tubo de microfuga.
Debe haber 10 µl en cada uno de ellos.
*
Guarden los tubos A, B y C para la próxima parte de la
experiencia.
1.4
Pipette tip
TBE buffer
Laboratorio 1
Well
Agarose gel
Fig. 1.3
Utilización de la electroforesis en gel para separar moléculas
La electroforesis en gel
es un método en el que se
utiliza corriente eléctrica y una
matriz de gel (red) para separar
moléculas como el ADN y las
proteínas. Las moléculas que se
separan tienen carga negativa
o se cargan negativamente.
Con la corriente eléctrica, las
moléculas cargadas son atraídas
y atraviesan una red del material
que separará las moléculas de
acuerdo con su tamaño, aunque
la forma molecular y el grado de
electronegatividad influirán en
el movimiento al atravesar el gel.
Debido a que las moléculas tienen
carga negativa, se trasladarán por
el gel hacia el electrodo positivo
(rojo). A mayor carga negativa,
mayor velocidad en la migración de
la molécula.
En este laboratorio, su profesor
ha preparado un gel compuesto
por agarosa, un polisacárido
(azúcar compuesto). La agarosa
se mezcla con una solución
electrolítica llamada borato de
sodio (NaB). Esta solución contiene
iones que son átomos cargados
eléctricamente. Estos iones ayudan
a conducir la corriente eléctrica a
través del gel. Como las moléculas
son atraídas hacia el electrodo
positivo, las más pequeñas
pueden moverse en esta red de
agarosa mucho más rápido que
las moléculas más grandes. Por
lo tanto, en toda la extensión del
gel, las moléculas se separan por
tamaño.
1.5
'
Su profesor ya ha preparado un gel de agarosa, pero deberán cubrir el gel de agarosa
con la cantidad adecuada de la solución reguladora de NaB para que el gel actúe
adecuadamente. Dos grupos compartirán un gel. Lleven la cubeta hacia el suministro
eléctrico que utilizarán para activar el gel.
Add comb
(
Controlen que el gel esté ubicado en la cubeta de modo que los “orificios” estén ubicados
Agarose y se
hacia el electrodo negativo (negro). Los colorantes están cargados negativamente
dissolved in
moverán hacia el electrodo positivo (rojo).
elecrophoresis buffer
)
Rellenen la cubeta con solución reguladora de NaB 1x (hay varios envases plásticos que contienen
esta solución reguladora en el laboratorio) hasta un nivel que cubra toda la superficie del gel a una
profundidad entre 1 y 2 mm. Controlen que el gel esté cubierto con la solución reguladora y que no
aparezcan “hoyuelos” en los orificios; agreguen más solución reguladora si es necesario.
*
Preparen la micropipeta en 10 µl y carguen cada muestra en un orificio separado como lo
indica su profesor. Usen una punta nueva para cada muestra. Recuerden que su grupo
compartirá este gel. Un grupo cargará sus muestras en tres separaciones a la izquierda
mientras que el otro utilizará las tres separaciones a la derecha. Es recomendable que
tomen nota de la solución que colocan en cada separación.
+
Al cargar cada muestra, coloquen la punta de la pipeta en el centro
y suavemente bajen el émbolo de la pipeta para expulsar lentamente
la muestra. Utilicen ambas manos para sostener la pipeta
para evitar que se mueva. Dado que sus densidades son mayores que la
solución reguladora de NaB, los colorantes se hundirán en los orificios.
Punta para pipeta
Solución reguladora de NaB
Gel de agarosa
Orificio
,
Cierren la tapa con firmeza sobre la cámara de electroforesis. Conecten los cables
eléctricos al suministro de energía. Asegúrense de que ambos cables estén conectados
al mismo canal con el cátodo (–) al cátodo (negro con negro) y ánodo (+) al ánodo (rojo
con rojo).
-
Enciendan el suministro eléctrico y establezcan el voltaje en 130–135 v.
.
Luego de dos o tres minutos, observen los colorantes para asegurarse de que se estén
moviendo hacia el electrodo positivo (rojo). Comenzarán a ver que el colorante púrpura
(llamado azul de bromofenol) comienza a separarse del colorante azul (xilenocianol).
/
En aproximadamente 10 minutos, o cuando puedan distinguir los tres colorantes, apaguen
el interruptor de energía y desconecten los electrodos del suministro eléctrico. Háganlo
tomando el enchufe del suministro eléctrico, no jalando el cable con fuerza. Retiren con
cuidado la tapa de la cubeta de gel para que puedan ver mejor los colorantes en el gel.
'&
En un papel, registren las bandas o esquema de colores en cada una de las franjas que
contienen sus muestras. Utilicen esta información para responder las preguntas en la
sección “Conclusiones”.
''
Dejen los geles en la cubeta de gel.
Laboratorio 1
Conclusiones
'W Los colorantes que separaron utilizando la electroforesis en gel fueron:
naranja G (amarillo), azul de bromofenol (púrpura) y xilenocianol (azul).
¿Qué carga eléctrica transportaron estos colorantes?
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
'X ¿Qué evidencia les permitió arribar a esta conclusión?
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
(W El tamaño molecular puede cumplir un rol importante en la separación ya que las moléculas
pequeñas se mueven por la matriz del gel con mayor rapidez que las moléculas más grandes.
El peso formular o molecular de estos colorantes son: naranja G (452.38), azul de bromofenol
(669.98) y xilenocianol (538.62). Según sus resultados, ¿les parece que estas moléculas se
separaron claramente por el tamaño?
.......................................................................................................................................
(X ¿Qué otros factores pueden haber jugado un rol importante en la separación de estos colorantes?
.......................................................................................................................................
(Y ¿Qué tubo contenía un solo colorante? ¿El A, B o C?
.......................................................................................................................................
(Z Nombren este colorante.
.......................................................................................................................................
)
Al aspirar una solución, ¿por qué es importante ver que realmente la solución ingresa
a la punta de la pipeta?
.......................................................................................................................................
*W Luego de cargar el gel, ¿permanece alguna solución en los tubos A, B o C?
.......................................................................................................................................
*X ¿Cómo se puede explicar que la solución quede en estos tubos?
.......................................................................................................................................
1.6
Laboratorio 2
1
Análisis de restricción de
pARA y pKAN-R
Los plásmidos son piezas circulares de ADN que
se encuentran naturalmente en las células bacteriales. Los
plásmidos utilizados en la biología molecular han sido
modificados a través de la ingeniería genética para facilitar
la clonación de genes y la producción de proteínas (expresión
del gen) en bacterias. Los genes resistentes a los antibióticos
han sido diseñados en estos plásmidos y funcionan como
marcadores seleccionables; es decir, estos genes nos permiten
seleccionar las bacterias que albergan los plásmidos de aquéllas
que no lo hacen. Si una bacteria contiene un plásmido con
un gen resistente a los antibióticos, la bacteria podrá crecer y
reproducirse en presencia de ese antibiótico; aquellas bacterias
sin el plásmido no podrán crecer. Por lo tanto, se pueden
utilizar antibióticos para seleccionar las bacterias que son
resistentes y que probablemente tienen un plásmido con el gen
resistente de aquellas bacterias que no portan el plásmido. En
este laboratorio se utilizarán dos plásmidos: el pARA contiene un
gen de resistencia a la ampicilina, ampr, y el pKAN-R contiene un
gen con resistencia a la kanamicina, kanr.
El plásmido pKAN-R porta el gen resistente a la
kanamicina, kanr, que codifica una fosfotransferasa,
enzima que transfiere un grupo de fosfato a la molécula
de kanamicina destruyendo sus efectos antibióticos. La
kanamicina es un antibiótico que mata a las bacterias
evitando que se hagan proteínas. Si una célula no puede
sintetizar proteínas, morirá. El gen kanr le otorga resistencia
a la kanamicina a las bacterias que absorbió este gen.
Además de kanr, el plásmido tiene el gen para la proteína
fluorescente mutada, mFP, llamada proteína fluorescente
roja “rfp”. El plásmido pKAN-R tiene aproximadamente
5,408 pb de tamaño.
pKAN-R
5408 bp
Ba m H
r fp
r
Ka n
El objetivo de este laboratorio tiene tres aspectos: 1)
presentar un método comúnmente utilizado para analizar
los elementos genéticos del plásmido de ADN; 2) analizar
el papel y la naturaleza de las enzimas de restricción; y 3)
realizar los primeros pasos para producir una molécula de
ADN recombinante.
ubicación específica en este plásmido. La región del pARA
rotulada como pBAD, en el mapa del plásmido, indica el
lugar donde la ARN polimerasa necesita unirse para iniciar
la transcripción. Los sitios rotulados como “BamH I” y
“Hind III” representan los lugares de restricción de estas
dos enzimas de restricción. Analicen el mapa del plásmido a
continuación y ubiquen estos componentes del plásmido.
Ba
Hi n m H I
dI
II
2.1
II
P BA D
r
a mp
pARA
4058 bp
C
dI
ara
Hi n
El plásmido pARA tiene 4058 pares de base (pb) de
tamaño. Un “par de base” sería la adenina:timina o
guanina:citosina y es el método más común que se utiliza
para expresar el tamaño de las moléculas de ADN. El
plásmido tiene el gen ampr, que codifica la proteína
betalactamasa, una enzima que destruye el antibiótico de la
ampicilina. Así, la betalactamasa le permite a las bacterias
reproducirse en presencia de la ampicilina. Además, el
pARA porta un gen para la proteína AraC, una proteína
que ayuda a la bacteria a hacer proteínas codificadas por
genes insertados en este plásmido. Un gen, incluso uno
extraño, se puede expresar (producir) si está dentro de una
I
rfp
702 bp
El gen de la proteína fluorescente originalmente fue
aislado del Discosoma sp, una anémona de mar encontrada
en el océano Indo-Pacífico. El gen en estado natural ha sido
mutado mediante un proceso llamado evolución dirigida, de
modo que produzca colores que son mucho más brillantes
que las proteínas en estado natural. El término “en estado
natural” se refiere al gen original, el que encontraría en la
naturaleza. El gen rfp ha sido transformado en un plásmido
pKAN-R. Observen que el gen rfp de la mFP tiene ambos
sitios de restricción: BamH I y Hind III en cada lado. Un
“sitio de restricción” marca la ubicación específica donde la
enzima cortará al plásmido de ADN. Si pKAN-R se digiere
con BamH I y Hind III, el gen rfp se cortará físicamente
del plásmido. Durante este laboratorio, sacarán el gen rfp
del pKAN-R y sacarán el pequeño fragmento de 40 pb del
plásmido pARA utilizando las mismas enzimas. Durante
el próximo laboratorio, insertarán el gen rfp en el pARA
generando una molécula de ADN recombinante.
Laboratorio 2
1
Materiales
H;79J?LE
pARA (80 ng/µl)
pKAN-R (80 ng/ µL)
Enzimas de restricción
(BamH I + Hind III)
Solución reguladora de
restricción 2.5x
Agua destilada, dH 2O
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Minicentrifugador
Baño María a 37 °C
Marcador indeleble
Métodos
Preparación de la digestión de restricción de pARA-R
En este protocolo de laboratorio se utilizan las enzimas de restricción BamH I
y Hind III para digerir los plásmidos pARA y pKAN-R. Este es el primer paso para
fabricar una molécula recombinante de ADN.
' Consigan los siguientes cuatro tubos de microfuga: pARA, pKAN-R,
BamH I y Hind III (mezcla de enzimas) y solución reguladora 2.5x.
( Tomen cuatro tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen
un marcador para rotularlos de la siguiente manera:
A + = pARA + BamH I y Hind III
A - = pARA no digerido (pARA sin enzima)
K+ = pKAN-R+ BamH I y Hind III
K- = pKAN-R no digerido (pKAN-R sin enzima)
A + = pARA
+ enzimas
+ solución
reguladora
) La matriz de reacción resume los reactivos utilizados en la digestión de restricción.
Para preparar la solución de digestión, sigan las instrucciones específicas a partir del paso 4.
Solución
reguladora 2.5x
dH20
pARA
pKAN-R
Enzimas
Volumen Total
A+
4µL
–
4µL
–
2µL
10µL
A-
4µL
2µL
4µL
–
–
10µL
K+
4µL
–
–
4µL
2µL
10µL
K-
4µL
2µL
–
4µL
–
10µL
Tubo
* Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de solución reguladora de restricción 2.5x en
todos los tubos.
+ Agreguen 2µl de dH2O a los tubos rotulados A- y K -.
¿Cuál es el objetivo de este paso?
, Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pARA a los tubos rotulados con A+ y A-.
- Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pKAN-R a los tubos rotulados con K + y K -.
. Agreguen 2µl de la mezcla de enzimas que contiene BamH I y Hind III, a los tubos A+ y K +.
Agreguen las enzimas directamente a la solución en el fondo del tubo de microfuga.
Asegúrense de utilizar una punta nueva para cada tubo para evitar la contaminación.
Luego de agregar las enzimas, bombeen suavemente la solución hacia adentro y hacia
afuera con la pipeta para que se mezclen los reactivos y tapen los tubos.
/ Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurándose de
que los tubos estén en una configuración equilibrada y centrifuguen los tubos durante
cuatro segundos. Este breve giro combinará todos los reactivos en el fondo de cada tubo.
'& Coloquen los cuatro tubos a baño María a 37 °C e incuben durante por lo menos 60 minutos.
Luego de los 60 minutos de incubación, la solución de digestión se puede
mantener congelada, a –20 °C, hasta que sea el momento de la electroforesis.
2.2
Laboratorio 2
1
Conclusiones
Analicen los mapas de restricciones de los plásmidos pARA y pKAN-R. Dado que BamH I y Hind
III son endonucleasas de restricción específica, cortarán de manera consistente el ADN cuando éste
se encuentre con las secuencias de reconocimiento de base seis como se indica a continuación. La
ubicación exacta donde se corta se llama sitio de restricción. La molécula de ADN consta de dos cadenas de componentes básicos de nucleótidos. Estos componentes básicos están orientados en dirección
opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la molécula de ADN
son “antiparalelas”. Para comodidad, podemos decir que una cadena está orientada en dirección de
5’ (“5 primo”) a 3’ (“tres primo”), mientras que la otra cadena está orientada de 3’ a 5’. Un cuidadoso
análisis de las secuencias de restricción revelará que la secuencia de los nucleótidos es un palíndromo,
es decir, dice lo mismo en ambas cadenas cuando se lee en dirección 5’ 3’.
BamH I
,
,
5 .......................G G A T C C.......................3
,
,
3 .......................C C T A G G.......................5
Hind III
,
,
5 .......................A A G C T T.......................3
,
,
3 ......................T T C G A A.......................5
Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortará la hélice de ADN entre
las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un “extremo cohesivo”.
,
,
5 .......................A
3
,
,
3 .......................T T C G A 5
Extremo cohesivo
Extremo cohesivo
,
,
5 A G C T T......................3
,
,
3
A .................... 5
'W ¿Cuál es la secuencia de reconocimiento del BamH I?
'X En una dirección de 5’
3’, ¿qué secuencia de bases representa los “extremos cohesivos de cada uno”?
Analicen los mapas de plásmidos pARA y pKAN-R y completen lo siguiente:
(W la digestión pARA producirá
(X la digestión pKAN-R producirá
)
2.3
fragmentos y tendrá
fragmentos y tendrá
pares de base de largo.
pb y
pb de largo.
Supongan que reciben un cultivo de bacterias que tiene uno o ambos plásmidos.
Diseñen un experimento simple que puedan usar para determinar cuál de estos plásmidos,
pARA o pKAN-R, portaba las bacterias del cultivo.
Laboratorio 2
1
Laboratorio 2a
1
Digestión de restricción de pARA-R
Introducción a los plásmidos y las enzimas de restricción
Dos herramientas poderosas pero fundamentales
que se utilizan en la biotecnología son las enzimas de
restricción y los plásmidos bacteriales. Las enzimas de
restricción les permiten a los biólogos moleculares cortar las
moléculas de ADN de diferentes organismos y recombinar
las piezas moleculares para producir moléculas de ADN
recombinantes. Los plásmidos son piezas circulares de ADN
que se encuentran naturalmente en las bacterias. Mediante
la tecnología del ADN recombinante y las enzimas de
restricción, los plásmidos de ADN recombinante se
pueden diseñar para que clonen genes o expresen proteínas
codificadas por genes.
Las enzimas de restricción fueron observadas por
primera vez por Werner Arbor en 1962. Arbor descubrió
que, al parecer, algunas bacterias utilizaban un sistema
inmunológico primitivo que no dejaba que el ADN
viral se duplicara dentro de la célula huésped infectada.
Algunos años más tarde, se descubrió que este mecanismo
inmunológico involucraba una clase de proteínas ahora
conocidas como enzimas de restricción. El nombre deriva
de la capacidad de las enzimas de restringir el crecimiento
de los virus en las células bacteriales. Las enzimas de
restricción logran esto al romper un enlace en la cadena
fosfato-azúcar del ADN viral; las enzimas cortan el ADN
viral en pequeños fragmentos.
Las enzimas de restricción que se identificaron en primer
lugar, al parecer, realizaron la digestión de la molécula de
ADN al azar. Posteriormente, se encontraron y purificaron
las enzimas de restricción que cortaban la cadena de fosfatoazúcar en un lugar específico o dentro de una secuencia
de nucleótidos específica, por lo general, de cuatro a seis
nucleótidos de largo. En la Tabla 1 se identifican algunas
de estas enzimas de restricción específicas, su origen y las
secuencias de nucleótidos que cada una reconoce. En 1978,
Daniel Nathans (Universidad Johns Hopkins), Hamilton
Smith (Universidad Johns Hopkins) y Werner Arbor
recibieron el Premio Nobel de Medicina por su trabajo con
las enzimas de restricción.
encia de
ocimiento
,
A T C C 3,
AGG5
,
T T C 3,
AAG 5
,
CTT 3,
GAA 5
Secuencia de
reconocimiento
,
,
5, G G A T C C 3,
3 CCTAGG5
Origen
Enzima de restricción
Bacillus
amyloliquefaciens
BamH I
Escherichia coli
EcoR I
,
,
5, G A A T T C 3,
3 CTTAAG 5
Haemophilus
influenzae
Hind III
,
,
5, A A G C T T 3 ,
3 TTCGAA 5
Tabla 1. Enzimas de restricción utilizadas en este laboratorio.
indica los sitios donde se corta o se separa la
cadena fosfato-azúcar.
2a.1
Cuando las enzimas de restricción cortan o digieren el
ADN, los fragmentos que se obtienen, llamados fragmentos
de restricción, poseen varias bases no apareadas que se
extienden desde los extremos de corte. Estos son llamados
“extremos cohesivos”. Si las moléculas de ADN de origen
diferente se digieren utilizando la misma enzima de
restricción, las bases no apareadas de cada pieza deben
poder unirse (o recocerse), dado que las bases no apareadas
en los extremos cohesivos serán complementarias, A:T y G:
C. Este es el único atributo de las enzimas de restricción que
les permite a los ingenieros genéticos combinar fragmentos
de ADN de diferentes organismos para producir moléculas
de ADN recombinante.
(a)
(b)
Figura 1. (a) molécula de ADN con sitios de restricción
BamH I y Hind III (en negritas). Las flechas
indican los sitios donde las enzimas cortarán
la cadena fosfato-azúcar de la molécula de
ADN. (b) La molécula de ADN inferior indica
la ubicación de los “extremos cohesivos”
(negritas).
Los plásmidos bacteriales son piezas circulares
relativamente pequeñas de ADN que las bacterias pueden
portar además de su ADN genómico (cromosoma único).
En la naturaleza, el plásmido de ADN por lo general
lleva de uno a varios genes que ayudan a que la bacteria
sobreviva, tal vez brindándole resistencia a un antibiótico.
Las bacterias pueden pasar a lo largo de los plásmidos
durante la conjugación (apareamiento). Las bacterias
que utilizamos en el laboratorio han sido mutadas, de
manera que no pueden intercambiar plásmidos durante la
reproducción sexual.
Los plásmidos producidos en forma natural han sido
modificados de modo que realicen funciones específicas:
por lo general, la clonación y la expresión de genes. En
este laboratorio se examina el pARA-R, un plásmido de
ADN recombinante que ha sido modificado para que
exprese el gen rfp a fin producir una proteína fluorescente
roja mutante (mFP). El plásmido contiene varios elementos
de control que le permiten a una bacteria portar este
Laboratorio 2a
1
plásmido para expresar un gen extraño. El gen se obtuvo
originalmente del genoma del Discosoma sp., una anémona
de mar encontrada en el océano Indo-Pacífico. En el mapa
de plásmido a continuación se indican algunas de las
regiones de control más importantes, araC and PBAD, y
la ubicación del gen rfp. Además, se indica la ubicación de
los dos sitios de restricción: uno para Hind III y otro para
BamH I. ¿Cómo podrían proceder en el corte del gen rfp?
ara
C
P BA D
pARA-R
4720 bp
a mp
r fp
r
Ba m H
I
rfp
702 bp
Hi n
II
dI
También tengan en cuenta que el plásmido posee un gen de
resistencia a los antibióticos: ampr. Este gen le permitirá a
la bacteria que porta el plásmido vivir en un ambiente que
contenga el antibiótico ampicilina.
Materiales
H;79J?LE
pARA (70 ng/µl)
Enzimas de restricción (Bamh I + Hind III)
Solución reguladora de restricción 2.5x
Agua destilada (dH2O)
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Minicentrifugador
Baño María a 37 °C
2a.2
Laboratorio 2a
1
Métodos
Digestión de restricción de pARA-R
El objetivo de este laboratorio tiene dos aspectos:
1) analizar el rol de las enzimas de restricción y su
importancia en la ingeniería genética; y 2) analizar un
plásmido bacterial y cómo se utiliza en la biotecnología.
En este protocolo de laboratorio se utilizan las
enzimas de restricción BamHI y Hind III para digerir
el plásmido recombinante pARA-R. La digestión de
restricción aislará del pARA el gen rfp de un fragmento
más grande del plásmido que contiene ampr, araC y
PBAD. En el protocolo se utiliza un pARA-R de control
no digerido, junto con un marcador de tamaño o escala
de ADN que lo ayudará a identificar y confirmar el
tamaño de los fragmentos de restricción.
Preparación de la digestión de restricción de pARA-R
'
Soliciten a su profesor los siguientes tres tubos de microfuga de 1.5 ml:
pARA-R, mezcla de enzimas y solución reguladora de restricción 2.5x .
(
Coloquen dos tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen un marcador para rotular
los tubos de la siguiente manera: “A+” y “A-”. Incluyan su número de grupo y horario de
clase en cada tubo de manera que puedan ubicarlos en la próxima clase de laboratorio.
)
La matriz de reacción resume los reactivos utilizados en la digestión de restricción. Para
preparar la solución de digestión, sigan las instrucciones específicas a partir del paso 4.
Tubo
Solución
reguladora 2.5x
H2O
pARA-R
Mezcla
de enzimas
Volumen total
A+
4µL
–
4µL
2µL
10µL
A-
4µL
2µL
4µL
–
10µL
*
Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de solución reguladora de restricción 2.5x para
ambos tubos.
+
Agreguen 2µl de dH2O al tubo rotulado A-.
¿Cuál es el objetivo de este paso?
,
Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pARA-R a los tubos rotulados A+ y A-.
-
Lleven el tubo A+ a su profesor, quien verterá la mezcla de enzimas en el tubo o, si
se les proporcionó esta mezcla de enzimas, agreguen con cuidado 2 µl de la mezcla
de enzimas directamente en la solución del tubo A+ que contiene el plásmido y la
solución reguladora. Luego de agregar las enzimas, cubran el tubo y den golpecitos
suaves en la parte inferior de cada tubo para mezclar los contenidos.
.
Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurándose de
que los tubos estén en una configuración equilibrada y centrifuguen los tubos durante
cuatro segundos. Este breve giro combinará todos los reactivos en el fondo de cada tubo.
/
Coloquen ambos tubos a baño María a 37 °C e incuben durante por lo menos 60 minutos.
'& Luego de la incubación de 60 minutos, su profesor puede colocar los tubos en el
congelador hasta que estén listos para la electroforesis (Laboratorio 4a).
Los plásmidos digeridos se pueden
conservar a -20 °C de manera indefinida.
2a.3
Laboratorio 2a
1
Conclusiones
Analicen el mapa de restricción del plásmido pARA-R. BamH I y Hind III son enzimas de restricción específicas y
cortarán consistentemente el ADN bicatenario cuando se encuentren con su respectiva secuencia de reconocimiento
de base seis que se muestra en la tabla de la página 2a.1. Estas ubicaciones de corte se llaman sitios de restricción.
La molécula de ADN consta de dos cadenas de componentes básicos de nucleótidos. Estos componentes básicos
están orientados en dirección opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la
molécula de ADN son “antiparalelas”. Por convención, podemos decir que una cadena está orientada en dirección
de 5’ (“5 primo”) a 3’ (“tres primo”), mientras que la otra cadena está orientada de 3’ a 5’. Un cuidadoso análisis de
las secuencias de restricción BamH I y Hind III revelará que las secuencias de nucleótidos son palíndromos; es decir,
dicen lo mismo en ambas cadenas cuando se leen en sentido 5’ 3’
,
,
5 .......................A A G C T T.......................3
,
,
3 .......................T T C G A A.......................5
Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortará la hélice de ADN entre
las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un “extremo cohesivo”.
,
,
Extremo cohesivo
5 .......................A
3
,
,
Extremo cohesivo
3 .......................T T C G A 5
,
,
5 A G C T T......................3
,
,
3
A .................... 5
'W ¿Cuáles son las secuencias de reconocimiento de Hind III y BamH I?
...........................................................................................................................................
'X En una dirección de 5’
3’, ¿qué secuencia de bases representa los “extremos cohesivos”?
...........................................................................................................................................
(W Analicen el mapa del plásmido pARA-R y completen lo siguiente:
¿Cuántos fragmentos de restricción resultarán de la digestión de pARA
con BamH I y Hind III?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
(X ¿Cuáles serán las longitudes aproximadas, en pares de base, de estos fragmentos de restricción?
...........................................................................................................................................
(Y
¿Qué fragmento de restricción llevará el gen ampr?
...........................................................................................................................................
(Z ¿Qué fragmento de restricción llevará el gen rfp?
...........................................................................................................................................
)
Supongan que su profesor les entrega un cultivo de bacterias. El cultivo puede contener
bacterias que portan el plásmido pARA-R o un cultivo que contenga bacterias sin el
plásmido. Diseñen un experimento simple que puedan usar para determinar cuál de los
dos cultivos les entregó.
...........................................................................................................................................
2a.4
Laboratorio 3
Ligación de fragmentos de restricción pARA/pKAN-R que
producen un plásmido recombinante pARA-R
producidos durante el Laboratorio 2 se ligarán o se unirán,
utilizando ADN ligasa, formando nuevos plásmidos
recombinantes. Estos plásmidos recientemente formados
representarán moléculas de ADN recombinante porque los
cuatro fragmentos de restricción han sido recombinados de
diferentes maneras para producir nuevas construcciones. Por
ejemplo, suponga que los cuatro fragmentos de plásmidos
se representaron con las letras A, A’, K y R, en los que A y A’
representan los fragmentos pARA, y K y R representan los
dos fragmentos que resultan de la digestión de pKAN-R. Los
plásmidos se pueden representar con cualquier combinación
de dos letras, como AK o A’R, y cualquier combinación
incluso de fragmentos numerados, como por ejemplo AKA’R
o ARAAKK y así sucesivamente. Como pueden ver, hay
muchos tipos de moléculas recombinantes que pueden resultar
de mezclar estos fragmentos de restricción.
BamH
I
rfp
702 pb
dI
II
,
5 GATCC
,
3G
4706 pb
,
5’ A G C T T
G3
702
pb
3’ A
C C T A G 5’
La ligación del fragmento de 702 pb pKAN-R colocará
al gen rfp del plásmido en un lugar que le permitirá a
la bacteria sintetizar (expresar) la proteína fluorescente
mutante, mFP.
r
amp
4018 pb
,
A3
,
TTCGA 5
BamH
rfp
702 pb
Hin
dI
II
3.1
pARA
4720 pb
r
recordar que el fragmento de restricción más grande porta el
gen ampr, el gen que suministra la resistencia a la ampicilina.
C
amp
,
5’ A G C T T
G3
40
pb
3’ A
C C T A G 5’
ara
rfp
Ba
Hin mH I
dI
II
P BAD
,
5 GATCC
,
3G
,
A3
,
TTCGA 5
Inicialmente, los fragmentos de restricción se mantienen
juntos por el enlace de hidrógeno entre las bases de los
P BAD
pARA
4058 pb
C
pKAN-R
5408 pb
Hin
ara
Con la ligación se unirá cualquiera de los dos extremos
cohesivos BamH I con cualquiera de los dos extremos
cohesivos Hind III. Deberían poder observar que son
posibles combinaciones diferentes de fragmentos.
La combinación que nos interesa es la del fragmento
recombinado de 4018 pb pARA (que contiene el gen
ampr) con el fragmento de 702 pb pKAN-R (gen rfp). La
combinación de estos dos fragmentos proporcionará un
plásmido recombinante que llamaremos pARA-R .
r
Dado que pARA tiene un sitio de restricción BamH I y otro
Hind III, la digestión dejará dos fragmentos. A continuación
se representan los fragmentos de restricción. Es importante
El plásmido pKAN-R tiene un sitio de restricción BamH I y
otro Hind III que flanquea el gen rfp. La digestión de pKAN-R
dejará dos fragmentos, uno será de 4706 pb y el otro, de 702 pb.
Kan
Como recordarán, las enzimas de restricción que estamos
utilizando son BamH I y Hind III. Al cortar los plásmidos en
los sitios de restricción BamH I y Hind III se dejan “extremos
cohesivos”. Los extremos cohesivos del ADN cortado pueden
ligarse a cualquier otro fragmento de ADN que tenga un
extremo cohesivo adicional. Analicen el mapa del plásmido
pARA a continuación para ver las ubicaciones de los sitios
de restricción de BamH I y Hind III y los extremos cohesivos
que se forman en los extremos de 5’ de su fragmento de
restricción.
El fragmento más pequeño no porta ningún gen.
rfp
En este laboratorio los fragmentos de restricción
I
Laboratorio 3
ADN ligasa
+ ATP
,
3
5
5
A
T
T
A
T
C
G
C
A
T
A
G
,
3
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5
ADN ligasa
+ ATP
,
3
,
3
Materiales
H;79J?LE
pARA digerido (A+ del laboratorio 2)
pKAN-R digerido (K+ del laboratorio 2)
Solución reguladora de ligación 5x con ATP
ADN ligasa T4 en el tubo rotulado “Lig”
Agua destilada
5
nucleótidos que forman los extremos cohesivos. Cabe
recordar que la adenina y la timina comparten dos
enlaces de hidrógeno mientras que la citosina y la guanina
comparten tres. Esto asegura que solamente coincidirán
los extremos cohesivos complementarios.
Los enlaces de hidrógeno son enlaces químicos débiles y
no son adecuados para mantener los extremos cohesivos
juntos de manera permanente. La enzima ADN ligasa,
con la energía suministrada por ATP, formará enlaces
covalentes entre el azúcar y los grupos de fosfato del
esqueleto del ADN. En el diagrama a continuación
pueden ver las ubicaciones de estos enlaces en cada lado
de la molécula de ADN. Cuando se forman los enlaces
covalentes, estos completan la unión fosfodiéster entre
los dos azúcares y el grupo de fosfato de cada cadena.
Los enlaces químicos que resultan constituyen un enlace
relativamente fuerte.
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Baño María a 70 °C
Gradilla plástica para tubos
de microfuga
Marcador indeleble
Métodos
' Tomen los tubos A+ y K+ de la gradilla que se encuentra en el
frente de la clase. Coloquen los dos tubos a baño María a 70 °C
durante 30 minutos. Esta exposición al calor desnaturalizará
(inactivará) cualquier BamH I y Hind III que pudiera estar activo.
¿Por qué es importante esto?
( Mientras sus tubos se encuentren a baño María, solicítenle a su
profesor la solución reguladora 5x y un tubo de ligasa. El tubo de
ligasa contiene 2 µl de ADN ligasa. Rotulen este tubo con sus iniciales.
) Luego de 30 minutos, duración del paso de incubación a
70 °C, agreguen 4 µl de A+ directamente en la ligasa de ADN en
el fondo del tubo de Ligasa.
* Utilizando una punta nueva, agreguen 4 µl de K+ a la solución
en el tubo de Ligasa.
+ Utilizando una punta nueva, agreguen 3 µl de solución
reguladora de ligación 5x directamente en la solución en el fondo
del tubo Ligasa. Desechen el tubo de la solución reguladora.
, Agreguen 2 µl de dH2O al tubo de Ligasa, utilizando una punta
limpia. Suave y lentamente muevan el émbolo hacia adentro y
hacia afuera para mezclar los reactivos. Realicen este paso sin
salpicar la solución en los laterales del tubo de microfuga. En la tabla
a continuación se resumen los contenidos del tubo de Ligasa.
A+
K+
Solución reguladora
de ligación 5x
4µL
4µL
3µL
dH2O Ligasa Volumen total
2µL
2µL
15µL
- Si hay gotitas de líquido en los laterales del tubo, centrifuguen
brevemente el tubo para combinar los reactivos.
. Coloquen sus tubos de ligasa, A+ y K+ en las gradillas en el frente
de la clase. Su tubo de ligasa permanecerá durante la noche a
temperatura ambiente.
3.2
Laboratorio 3
Conclusiones
'W
¿Por qué es importante colocar los tubos A+ y K+ a baño María a 70 °C antes de preparar
la reacción de ligación?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
'X
¿Qué creen que podría pasar si se omitiera este paso?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
(
Realicen un diagrama para mostrar cómo se unieron los siguientes extremos cohesivos.
(: = enlace de hidrógeno) Consulten la página 3.2 para ver el ejemplo de apareamiento de bases.
..A..
TTCGA
)
A G C T. .T
..
A
Si bien son muchos los plásmidos recombinantes, dibujen tres plásmidos recombinantes
posibles. Incluyan dentro de esos tres, la combinación en la que estamos más interesados,
la que combina pARA con el fragmento pKAN-R que porta el gen rfp.
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
*
¿Pueden dos fragmentos rfp unirse y circular en el tubo de ligasa?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
+
En la molécula de ADN, hay dos tipos de enlaces químicos: enlaces químicos
covalentes y enlaces de hidrógeno. Describan brevemente cómo difieren estos enlaces
en cuanto a qué tan fuertes son y en qué parte de la molécula de ADN los encontrará.
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
,W
Durante la ligación, ¿cuáles de estos enlaces (hidrógeno o covalente) se forma primero?
¿Dónde se forman?
¿Qué enlaces se forman después y dónde?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
,X
¿Para formar qué enlaces se necesita ADN ligasa?
...........................................................................................................................................
3.3
Laboratorio 3
Laboratorio 1
4
Confirmación de la restricción y la ligación
Uso de electroforesis en gel de agarosa
Es importante en esta etapa de nuestro procedimiento
experimental que confirmemos que el BamH I y Hind III
han digerido los plásmidos pKAN-R y pARA originales,
y que los fragmentos de restricción han sido ligados por
el ADN ligasa. En este laboratorio se demostrará que
tenemos moléculas de ADN recombinantes.
La electroforesis en gel es un procedimiento comúnmente
utilizado para separar fragmentos de ADN según su
tamaño molecular. Como los colorantes que separaron en
el Laboratorio 1, los fragmentos de ADN migrarán por el
laberinto de la agarosa. El ADN, debido a los grupos de
fosfato, tiene carga negativa y se moverá hacia el electrodo
positivo (rojo). Dado que es más fácil que las moléculas
pequeñas se muevan por la matriz de agarosa, éstas
migrarán más rápido que los fragmentos más grandes.
Imagínense un grupo de corredores de campo traviesa
cruzando una espesa selva tropical. Con todos los demás
factores iguales, los corredores de menos altura podrán
circular por la espesura de enredaderas que cuelgan y el
denso follaje más rápido que los corredores más altos.
De manera que los fragmentos más pequeños de ADN se
moverán más rápido por la espesura de las moléculas de
agarosa que los fragmentos más grandes.
Tomaremos todas las muestras de plásmidos: digeridos,
no digeridos y ligados, y utilizaremos la electroforesis para
separar estas piezas. Tal vez predijeron que sus plásmidos
sin cortar producirían solamente una banda de ADN;
no hay motivo para pensar lo contrario. Sin embargo,
es posible que aparezcan dos o tres líneas en las franjas
de plásmidos no digeridos. El motivo de esto es que los
plásmidos aislados de las células existen de diversas formas.
Una de las formas del plásmido se llama “superenrollada”.
Es posible visualizar esta forma pensando en una pieza
circular de tubería plástica retorcida. La torcedura o
enrollamiento tiene como resultado una molécula muy
compacta, que se moverá por el gel rápidamente debido
a su tamaño.
Una segunda forma de plásmido
es llamada “círculo mellado” o
“círculo abierto”. Con frecuencia,
un plásmido experimentará el
rompimiento de uno de los enlaces
covalentes ubicados en la cadena de
fosfato-azúcar a lo largo de una de
las dos cadenas de nucleótidos. El
congelamiento y descongelamiento
repetido del plásmido u otro tratamiento severo puede
causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensión
acumulada en el plásmido superenrollado se libera a medida
que el plásmido enrollado se desenrolla. Esta forma de
plásmido circular no se moverá tan fácilmente por el gel
de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene
el mismo tamaño, en términos de pares de base, estará
ubicado más cerca del orificio que la forma superenrollada.
La última forma del plásmido que podemos ver se
llama “multímero”.
Cuando las bacterias
duplican los plásmidos,
éstos por lo general se
duplican tan rápido
que terminan unidos
como los eslabones de
una cadena. Si los dos
plásmidos se unen, el
multímero será dos
veces más grande que un solo plásmido y migrará muy
lentamente por el gel. De hecho, se moverá más lentamente
que el círculo mellado. Sus muestras de pKAN-R – y
pARA –, luego, pueden tener tres bandas que aparecen
en el gel. Comenzando muy cerca del orificio, pueden
observar que el multímero se desplaza primero, seguido de
una banda con forma circular mellada y finalmente una
banda superenrollada.
Utilizaremos una técnica de tinción especial que
nos permite ver los fragmentos incrustados en el gel;
luego realizaremos un registro fotográfico del gel para
documentar este importante paso.
4.1
Laboratorio 1
4
Materiales
H;79J?LE
Muestras de plásmidos:
K-, K+
A-, A+
Plásmido ligado (tubo “LIG”)
Gel de agarosa al 0.8%
Colorante de carga 5x
NaB 1x (o TBE 0.5x)
Marcador de tamaño del ADN
(25 ng/µl)
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Aparato de electroforesis
Suministro eléctrico
Lapicera para marcar
Gradilla plástica para tubos de
microfuga
Métodos
' Reúnan las cinco muestras de plásmidos y el marcador de ADN que su profesor les
brindará y colóquenlos en la gradilla plástica para tubos. Deben tener seis tubos.
( Consigan cinco tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y rotúlenlos de la siguiente manera:
A-, A+, K-, K+, y L. El tubo de microfuga con el marcador ya debe estar rotulado.
) En la siguiente tabla se resume la preparación de la muestra de plásmidos para la
electroforesis.
Vean los “Consejos” antes de preparar estos tubos.
Tubo
dH20
Colorante
de carga
K+
K-
A-
A+
LIG
A+
4L
2L
–
–
–
4L
–
10L
A–
2L
2L
–
–
–
4L
4L
–
–
–
–
–
10L
K–
4L
4L
K+
4L
2L
4L
–
–
–
–
10L
L
3L
2L
–
–
–
–
5L
10L
Volumen
total
10L
Consejos:
■ Por ejemplo, al tubo rotulado con “A-”, agréguenle 4 µl de pARA-, 4 µl de dH2O
y 2 µl de colorante de carga. El colorante de carga debe ubicarse en la gradilla
plástica para tubos de microfuga al lado del tubo de dH2O.
■ Si estudian esta tabla, verán que pueden agregar agua a los cinco tubos, luego
agregar el colorante de carga a todos los tubos sin cambiar la punta. Luego, viertan
la muestra de plásmido en cada tubo, cambiando la punta cada vez para evitar
la contaminación.
■
■
Guarden el tubo “LIG” que contiene su plásmido ligado; debe haber alrededor de
10µl restante en este tubo.
Importante: regresen el tubo “LIG” a la gradilla con los tubos, en el frente del
salón, porque lo necesitarán para el próximo laboratorio.
Centrifuguen todas las muestras para combinar los reactivos en el fondo de cada
tubo. Asegúrense de que los tubos estén ubicados en una configuración equilibrada.
* Preparen el gel y la cubeta de electroforesis para recibir las muestras de plásmidos.
■
■
Asegúrense de que los orificios de gel estén orientados hacia el electrodo
negativo (negro).
Viertan la solución reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) sobre el gel hasta que no haya
“hoyuelos” que rompan la superficie de la solución reguladora sobre los orificios. Es
importante que el gel esté completamente por debajo de la solución reguladora de
NaB. No obstante, es recomendable que no utilicen demasiada solución en la cubeta
para permitir que la corriente eléctrica vaya por la solución reguladora y no por el gel.
+ Coloquen sus muestras de plásmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas.
Continúa en la página siguiente...
4.2
. 1.3
Laboratorio 1
4
Continuación desde la página anterior...
,
Add comb
Compartirán este gel con otro grupo.
A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras conAgarose
un esquema
dissolved in
diferente, carguen sus muestras como se indica a continuación. Sigan
las buffer
elecrophoresis
instrucciones de carga que comienzan en el paso siete. Si cargan su muestra en
diferente orden, asegúrense de registrarlo en su cuaderno para tomarlo como
referencia más tarde.
marcador K+
-
K-
A+
A-
L
Utilizando un punta limpia, preparen su micropipeta P-20 a 10 µl. Aspiren 10 µl de su
“marcador de tamaño de ADN” y lentamente viértanlo en el orificio.
■
A medida que hacen esto, bajen suavemente la punta
de la pipeta por debajo de la superficie de la solución
reguladora directamente sobre, pero no dentro, del orificio.
Si colocan la punta dentro del mismo pueden dañar la pared
del orificio o perforar el fondo del mismo.
Esto no es aconsejable.
Punta para pipeta
Solución reguladora de NaB
Gel de agarosa
■
■
Orificio
Utilicen ambas manos para estabilizar la pipeta. Lentamente viertan la
muestra empujando hasta la primera marca de detención de la pipeta. Debido
al colorante de carga, la muestra tendrá una densidad superior a la solución
reguladora de electroforesis. Esto le permitirá a la muestra hundirse en el
orificio.
Importante: Mientras sostienen el botón en la primera marca, retiren lentamente la punta de la pipeta de la cubeta de gel. Si han cargado su muestra correctamente, el orificio se llenará de una solución de color azul.
.
Realicen este mismo procedimiento con las muestras de plásmidos, siguiendo el orden indicado en la página 4.3. Para cada muestra cambien la punta. Si eligen cargar sus muestras
en un orden diferente, asegúrense de registrar el orden de las muestras en su cuaderno.
/
Cierren la tapa de la cubeta de gel con firmeza sobre la cámara de electroforesis.
Conecten los cables eléctricos al suministro de energía. Asegúrense de que ambos
cables estén conectados al mismo canal (mismo lado), el negativo (negro) con el
negativo (negro) y el positivo (rojo) con el positivo (rojo).
'& En el suministro eléctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.
'' Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegúrense de que el colorante púrpura
(azul de bromofenol) se mueva hacia el electrodo positivo. Si se mueve en otra
dirección, hacia el electrodo negativo (negro), verifiquen los cables eléctricos para ver
que estén conectados al suministro eléctrico correctamente.
'( Asegúrense de regresar su tubo “LIG” al frente de la clase. Este tubo debe contener los
plásmidos recombinantes que utilizarán en el próximo laboratorio.
') Su profesor explicará qué hacer con los geles: escuchen con atención. Si el tiempo
de laboratorio es breve, no les alcanzará para completar la electroforesis. El colorante
amarillo deberá llegar justo hasta el final del gel, en alrededor de 40 ó 50 minutos.
4.3
Laboratorio 1
4
Conclusiones
Respondan a estas preguntas después de que tengan la
oportunidad de analizar la fotografía del gel.
'
¿Cómo comparan sus resultados reales con sus predicciones sobre el gel?
.............................................................................................................
.............................................................................................................
(W ¿Aparecen algunas bandas en la fotografía del gel que no
esperaban?
.............................................................................................................
.............................................................................................................
(X ¿Cómo pueden explicar el origen de estas bandas inesperadas?
.............................................................................................................
.............................................................................................................
)W ¿Observan evidencia de las tres formas de plásmidos en las franjas
sin cortes?
.............................................................................................................
.............................................................................................................
)X ¿Hay pruebas de que hay más de una forma de multímero?
.............................................................................................................
.............................................................................................................
*
¿Por qué los plásmidos ligados están tan cerca del orificio?
.............................................................................................................
.............................................................................................................
+
Dos de los fragmentos pKAN-R de 702 pb, los fragmentos del gen
rfp, pueden formar un fragmento circular porque cada extremo de
los fragmentos termina en un extremo cohesivo de BamH I y Hind
III. ¿Hay pruebas de que haya un fragmento circular de 1404 pb en
la franja ligada?
.............................................................................................................
4.4
Laboratorio 4a
1
Confirmacion de
la digestión de restricción de pARA-R
El objetivo de este protocolo es revisar los fragmentos de
restricción que resultan de la doble digestión de pARA-R
por BamH I y Hind III (Laboratorio 2a). La electroforesis
en gel es un procedimiento comúnmente utilizado para
separar fragmentos de ADN según el tamaño molecular
de los fragmentos de restricción o el número de pares de
base. Como los colorantes que separaron en el Laboratorio
1, los fragmentos de ADN migrarán por el laberinto de
la agarosa. El ADN, debido a los grupos de fosfato,
tiene carga negativa y migrará hacia el electrodo positivo
(rojo). Dado que es más fácil que las moléculas pequeñas
se muevan por la matriz de agarosa, éstas migrarán más
rápido que los fragmentos más grandes. Imagínense un
grupo de corredores de campo traviesa cruzando una espesa
selva tropical. Con todos los demás factores iguales, los
corredores de menos altura podrían circular por la espesura
de enredaderas que cuelgan y el denso follaje más rápido
que los corredores más altos. De manera que los fragmentos
más pequeños de ADN se moverán más rápido por la
espesura de las moléculas de agarosa que los fragmentos
más grandes.
Tomaremos ambas muestras de plásmido, digerido y
no digerido, y utilizaremos la electroforesis para separar
estos fragmentos de restricción. Tal vez predijeron que
sus plásmidos sin cortar producirían solamente una sola
banda de ADN: no hay motivo para pensar lo contrario.
Sin embargo, es posible que aparezcan dos o tres líneas
en la franja de plásmidos no digeridos (control). Este
es el motivo: los plásmidos aislados de las células tienen
varias formas. Una de las formas del plásmido se llama
“superenrollada”. Es posible visualizar esta forma
pensando en una pieza circular de tubería plástica torcida.
La torcedura o enrollamiento del plásmido tiene como
resultado una molécula muy compacta, que se moverá por el
gel rápidamente debido a su tamaño.
Una segunda forma de plásmido
es llamada “círculo mellado” o
“círculo relajado”. Con frecuencia,
un plásmido experimentará el
rompimiento de uno de los enlaces
covalentes ubicados en la cadena de
fosfato-azúcar a lo largo de una de
las dos cadenas de nucleótidos. El
congelamiento y descongelamiento
repetido del plásmido u otro tratamiento severo puede
causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensión
acumulada en el plásmido superenrollado se libera a medida
que el plásmido enrollado se desenrolla. Esta forma de
plásmido circular no se moverá tan fácilmente por el gel
de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene
el mismo tamaño, en términos de pares de base, estará
ubicado más cerca del orificio que la forma superenrollada.
La última forma
de plásmido que
pueden observar se
llama “multímero”.
Cuando las bacterias
duplican plásmidos,
estos por lo general se
duplican tan rápido que
terminan unidos como
los eslabones de una
cadena. Si los dos plásmidos se unen, el multímero será dos
veces más grande que un solo plásmido y migrará
muy lentamente por el gel. De hecho, se moverá más
lentamente que el círculo mellado. La muestra de plásmido
no digerido, pARA-R, puede tener tres bandas que aparecen
en el gel. Comenzando muy cerca del orificio, pueden
observar que el multímero se desplaza primero, seguido de
una banda con forma circular mellada y finalmente una
banda superenrollada.
Utilizaremos una técnica de tinción especial que nos
permite visualizar los fragmentos incrustados en el gel;
luego realizaremos un registro fotográfico del gel para
documentar este importante paso.
4a.1
Laboratorio 4a
1
Materiales
H;79J?LE
Muestras de plásmidos:
A– y A+ (del laboratorio 2a)
Gel de agarosa al 0.8%
Colorante de carga 5x
NaB 1x (o TBE 0.5x)
Marcador de tamaño del
ADN (25 ng/µl)
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Aparato de electroforesis
Suministro eléctrico
Gradilla plástica para tubos de
microfuga
Lapicera para marcar
Métodos
'
Reúnan ambas muestras de plásmidos y el marcador de ADN que su profesor les
brindará y colóquenlos en la gradilla plástica para tubos. Deben tener tres tubos.
(
Agreguen 2 µl de colorante de carga a los tubos A+ y A-. Tengan cuidado de no contaminar las
muestras de plásmido. El colorante de carga aumentará la densidad de cada muestra para
que el ADN se hunda en el orificio del gel. El colorante de carga también contiene colorantes
visibles para que podamos seguir el progreso de las muestras durante la electroforesis. El
marcador de tamaño del ADN ya contiene colorante de carga. Sin hacer burbujas, bombeen
suavemente la pipeta varias veces para mezclar el colorante de carga con las muestras de
plásmido. Asegúrense de utilizar una punta nueva por cada muestra de plásmido para
evitar la contaminación.
)
Preparen el gel y la cámara de electroforesis para recibir las muestras de plásmidos.
■
■
Asegúrense de que los orificios de gel estén orientados hacia el electrodo
negativo (negro).
Viertan la solución reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) dentro de la cubeta de
electroforesis hasta que no haya “hoyuelos” que rompan la superficie de la
solución reguladora sobre los orificios en el gel. Es importante que el gel esté
completamente sumergido debajo de la solución reguladora, pero es recomendable
que no haya demasiada solución reguladora en la cubeta, dado que la electricidad
corre solamente a través de la solución reguladora y no a través del gel.
*
Coloquen sus muestras de plásmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas.
Pueden compartir este gel con otro grupo.
+
A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras con un esquema diferente,
carguen sus muestras como se indica a continuación. Sigan las instrucciones de carga
que comienzan en el paso seis. Si cargan su muestra en diferente orden, asegúrense de
registrarlo en su cuaderno para tomarlo como referencia más tarde.
marcador
A–
A+
Continúa en la página siguiente...
4a.2
Laboratorio 4a
1
Continuación desde la página anterior...
,
Utilizando una punta limpia, preparen su micropipeta
P-20 a 10 µl.
Aspiren 10 µl de su “marcador de tamaño de ADN” y
lentamente viértanlo en el orificio.
Punta para pipeta
Solución reguladora de NaB
Gel de agarosa
■
■
■
Orificio
A medida que hacen esto, bajen lentamente la punta de la pipeta
por debajo de la solución reguladora directamente sobre, no dentro,
del orificio. Si colocan la punta dentro del orificio pueden dañar la
pared o perforar el fondo del mismo.
Utilicen ambas manos para estabilizar la pipeta. Lentamente
viertan la muestra empujando hasta la primera marca de detención
de la pipeta. Debido al colorante de carga, la muestra tendrá una
densidad superior a la solución reguladora de NaB o TBE. Esto le
permitirá a la muestra hundirse en el orificio.
Importante: mientras sostienen el botón en la primera marca,
retiren lentamente la punta de la pipeta de la cubeta de gel. Si
han cargado su muestra correctamente, el orificio se llenará de
una solución de color azul que contiene la muestra.
-
Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 µl de la muestra A- en
el próximo orificio.
.
Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 µl de la muestra A+ en
el próximo orificio.
/
Cierren la tapa de la cubeta de gel con firmeza sobre la cámara de
electroforesis. Conecten los cables eléctricos al suministro de energía.
Asegúrense de que ambos cables estén conectados al mismo canal
(mismo lado), el negativo (negro) con el negativo (negro) y el positivo
(rojo) con el positivo (rojo).
'& En el suministro eléctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.
'' Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegúrense de que el
colorante púrpura (azul de bromofenol) se mueva hacia el electrodo
positivo. Si se mueve en otra dirección, hacia el electrodo negativo
(negro), verifiquen los cables eléctricos para ver que estén conectados al
suministro eléctrico correctamente.
'( Su profesor explicará qué hacer con los geles, escuchen con atención.
Si el tiempo de laboratorio es corto, no les alcanzará para completar la
electroforesis. El colorante amarillo deberá llegar justo hasta el final del
gel, en alrededor de 30 ó 40 minutos.
4a.3
Laboratorio 4a
1
Conclusiones
Las preguntas 1 y 2 deben responderse antes o durante la electroforesis.
'
Además de utilizarla para separar fragmentos de ADN, la electroforesis puede utilizarse para
calcular su tamaño real. Por ejemplo, podríamos estar buscando un gen y sospechamos que tiene
determinado tamaño. La electroforesis se puede utilizar para ubicar fragmentos dentro de ese rango
de tamaño. Para hacerlo, necesitaríamos utilizar un gel con una mezcla de fragmentos de ADN de
tamaños conocidos. La mezcla, llamada “marcador” o “escala”, funciona como control o estándar
con el que podemos comparar las ubicaciones de otras bandas de ADN en el mismo gel.
En el diagrama a continuación, la franja “marcador” contiene 10 bandas de ADN de
tamaños conocidos. El tamaño de los fragmentos se brinda a continuación. Utilizando esta
información y el mapa del plásmido de pARA-R, pronostiquen las ubicaciones de las bandas
de ADN producidas en A- y A+. Es aconsejable revisar las diferentes formas de plásmidos
descritas en la página 4a.1 y el mapa del plásmido pARA-R descrito en la página 2a.3.
marcador AA+
Fragmentos marcadores
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10.0 par de kilobase
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0 (banda ancha)
2.0
1.5
1.0
0.5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Preguntas respondidas luego de la documentación de la electroforesis.
(
Comparen la fotografía de gel con su predicción. ¿Ven alguna banda de ADN inesperada?
....................................................................................................................................................
)
En relación con la escala de ADN, ¿entre qué dos bandas está ubicado el gen rfp?
¿Aquí es dónde predijeron que estaría ubicado?
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
*
En la franja A-, ¿ven algún indicio de que haya formas de plásmidos diferentes?
¿Qué forma de conformación de plásmido migra más rápido? ¿Cuál es la más lenta?
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
+
La franja A+, ¿indica una digestión completa? Expliquen su respuesta.
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
,
¿Qué fragmento de ADN contiene el gen ampr?
¿Cuál es el tamaño de este fragmento de restricción de ADN?
....................................................................................................................................................
4a.4
Laboratorio 1
5
Transformación de Escherichia coli
con un plásmido recombinante
Hasta aquí, han producido plásmidos recombinantes
ligados. Con suerte, algunos de estos ADN recombinantes
tendrán fragmentos de pKAN-R de 702 pb, el gen rfp,
ligados a un fragmento de restricción pARA más grande.
A este plásmido se le conoce como pARA-R. Ahora,
queremos que estos plásmidos recombinantes pasen a las
células bacteriales para que podamos obtener las células
que expresen el gen rfp y generar la proteína fluorescente
mutante.
El proceso de incluir partes extrañas de ADN, como
un plásmido, en una célula bacterial se denomina
transformación. La transformación es un proceso que
ocurre en la naturaleza, aunque probablemente es algo
poco frecuente. El médico británico Frederick Griffith fue
el primero en estudiar el proceso en 1928. Por lo general,
las bacterias transfieren un exceso de material genético
cromosomático, como los plásmidos, durante la conjugación
(sexo bacterial) en lugar de dejarse libradas a su suerte.
Pero incluir plásmidos puede suministrar a las bacterias
determinados genes que confieren una ventaja selectiva, por
ejemplo, la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, bajo
condiciones experimentales, es posible preparar células de
modo que alrededor de una célula en mil tome un plásmido
del medio circundante.
Existen diversos factores que determinan la eficiencia
de la transformación. Dos factores están relacionados
directamente con el plásmido utilizado para la
transformación. Cuanto más grande sea éste, menos
probabilidades habrá de que ingrese a la bacteria. Recuerden
que para que la bacteria tome ADN extraño, el plásmido
debe pasar por la membrana plasmática y la pared celular
de las bacterias.
Por lo tanto, los plásmidos pequeños tienen más
posibilidades de pasar por las membranas plasmáticas de
la bacteria (E. coli tiene dos) y la pared celular que los
plásmidos grandes.
Membranas
plasmáticas
Pared
celular Plásmidos
Plásmido
ADN genómico
5.1
Los plásmidos pueden tener diferentes formas. La forma
superenrollada entra con mayor facilidad a la célula,
en tanto las formas de círculo mellado o multímero,
es decir, dos o más plásmidos unidos, tienen mayor
dificultad para hacerlo. El tubo de ligación que contiene
los plásmidos recombinantes que prepararon, no contiene
ningún plásmido superenrollado. El superenrollado de
un plásmido requiere una enzima que se encuentra en la
célula bacterial; ésta no estaba incluida dentro de su tubo
de ligación. Los plásmidos recombinantes que prepararon
son principalmente de círculo mellado, pero hay una gran
variedad en el tamaño.
En la naturaleza, la transformación es relativamente
poco frecuente. Para aumentar las posibilidades de que
plásmidos recombinantes ingresen a las células bacteriales,
utilizaremos células “competentes”. Esto significa que
las células están preparadas para recibir plásmidos. En
su mayor parte, no se encuentran células competentes
en la naturaleza; éstas deben hacerse competentes en el
laboratorio. Una forma común de hacerlo es embebiendo las
células en cloruro de calcio.
Recuerden que el ADN tiene carga negativa. ¿Recuerdan
por qué? Las membranas plasmáticas que rodean la célula
bacterial también contienen grupos de fosfato y poseen
carga negativa. El problema que se presenta al intentar
pasar ADN con carga negativa por una membrana con
carga negativa es que las cargas eléctricas iguales tienden
a rechazarse. Cuando las células se vuelven competentes,
se suspenden en una solución de cloruro de calcio porque
los iones del calcio (átomos de calcio con carga positiva,
Ca 2+) ayudan a neutralizar las cargas eléctricas negativas
de la membrana plasmática y el plásmido. Neutralizando
las cargas repulsivas mediante iones de calcio, el ADN
plasmídico pasa con mayor facilidad por la membrana
plasmática de la célula bacterial. Las células ya fueron
hechas competentes y su profesor les entregará una alícuota.
No obstante, deberán realizar el siguiente paso.
Ahora que hemos neutralizado las cargas negativas del
ADN y de las membranas plasmáticas, necesitamos crear
una diferencia de presión entre la parte interna y externa de
la célula bacterial. Esto se logra, en primer lugar, enfriando
las bacterias y luego sumergiéndolas rápidamente en agua
tibia. Esto se denomina “choque térmico” y crea una
situación en la que la presión externa de la célula es apenas
mayor que la presión interna de la misma. Este gradiente
de presión ayudará a trasladar el ADN plasmídico desde
el exterior hasta el interior de la célula bacterial. Luego de
este duro tratamiento, tendremos que alimentar a nuestras
bacterias y dejarlas recuperarse durante algunos minutos
antes de diseminarlas en placas de agar.
Una vez que las células se han recuperado, se tomarán
muestras de estas células y se dispondrán en una serie
Laboratorio 1
5
de placas de agar esterilizadas. Una de estas placas contendrá
solamente alimentos bacteriales; la placa no contiene
antibióticos. Rotulen esta placa como “LB”. La segunda, debe
contener LB y ampicilina y deben rotularla como “amp”. La
tercera placa debe contener LB, ampicilina y un monosacárido
llamado arabinosa, y deben rotularla como “ara”.
La ampicilina es un antibiótico que evita que las bacterias
formen completamente su pared celular. Las células que no
resisten la ampicilina no pueden crecer en su presencia, las
células nuevas simplemente se rompen o se lisan. Si una célula
recibe un gen resistente a la ampicilina, ampr, producirá una
proteína que destruirá químicamente la ampicilina y, de esa
forma, podrá crecer con ampicilina en su medio.
La bacteria necesita arabinosa, un monosacárido, para
expresar el gen rfp. Si una bacteria incluye pARA-R, la arabinosa
ayuda a la enzima ARN polimerasa, necesaria para transcribir
el gen rfp, para que se alinee correctamente en el plásmido. Esta
relación se tratará en el próximo laboratorio.
Aunque la cepa de E. coli que se utiliza en estos laboratorios
es relativamente benigna, es importante que utilicen técnicas
adecuadas al momento de manipularlas.
Materiales
H;79J?LEO9KBJ?LE
Tubo LIG (plásmidos recombinantes)
100 µl de células competentes (LMG)
350 µl de caldo de LB (esterilizado)
Hielo molido (en una taza de
poliestireno)
Placas de agar, esterilizadas
1 LB, 1 LB/Amp, 1 Lb/amp/ara
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Micropipeta P-200 y puntas
Baño María a 42 °C
1 paquete de esparcidores de
células (compartido)
Gradilla plástica para tubos de
microfuga
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Lapicera para marcar
5.2
Laboratorio 1
5
Métodos
Para que este laboratorio funcione sin dificultades, es importante que sepan qué tareas se les asignaron a cada miembro del grupo
antes de comenzar. Un miembro debe preparar el hielo y conseguir las células competentes, otro puede recuperar los plásmidos
ligados y otro puede conseguir las placas de agar, el caldo de LB y los tubos de microfuga limpios.
'
(
)
/ Rotulen las bases de las tres placas que contienen agar con
Tomen dos tubos de microfuga limpios.
Rotulen uno “P+” y el otro “P-”.
P+
Tomen una taza de poliestireno con
hielo molido y coloquen un tubo que
contenga 100 µl de células competentes
dentro del hielo. Es importante que las
células permanezcan a 0 °C. Además, coloquen
los tubos P+ y P- en el hielo.
P-
Tomen los plásmidos ligados de la gradilla para tubos de
microfuga rotulada “tubos LIG”. Su tubo “LIG” deberá estar
rotulado con su número de grupo y horario de clase.
*
Preparen la pipeta P-200 en 50 µl (configurada en “0-50”) y coloquen una punta limpia en su cilindro. Con mucho
cuidado, vuelvan a suspender las células moviéndolas
suavemente hacia adentro y hacia fuera dos veces.
Sostengan el tubo por el borde superior para evitar
calentar las células con los dedos.
+
Repartan una alícuota de 50 µl de las células suspendidas
en los tubos de microfuga P+ y P- previamente enfriados.
Inmediatamente regresen las células al refrigerante.
Sostengan los tubos por el borde superior para evitar
calentar las células con los dedos.
,
.
5.3
Utilizando la pipeta P-20, agreguen 10 µl del plásmido
ligado al tubo rotulado “P+”. Mezclen suavemente el
plásmido con la suspensión de células bombeando
la suspensión de células dos veces. Regresen
inmediatamente el tubo P+ al hielo. No agreguen
plásmido al tubo P– . Las células de este tubo servirán
para el “control de plásmidos”.
Mantengan las células en el hielo durante 15 minutos.
Mientras las células incuban en el hielo, consigan lo
siguiente:
Cada una de estas placas de agar:
LB, LB/amp (LB + ampicilina)
y
LB/amp/ara (LB + amp + arabinosa)
su número de grupo y horario de la clase. Escriban con letra
pequeña y en el borde de la placa. Luego tracen dos líneas en
las placas LB y amp por la mitad. Rotulen una de las mitades
de cada placa “P+” y la otra mitad “P-”. Vean el diagrama a
continuación. No dividan la placa ara.
P- P+
Placa LB
P- P+
Placa LB/amp
P+
LB/amp/ara
'& Luego de la incubación de 15 minutos en hielo, lleven la taza
de hielo que contiene las células a baño María a 42 °C. Retiren
los tubos del hielo y sométanlos a baño María durante 45
segundos. Luego de un choque de calor de 45 segundos,
colóquenlos otra vez en el refrigerante de inmediato durante
por lo menos un minuto.
'' Luego de un minuto, utilicen la pipeta P-200 para agregar 150
µl (configurada en “1-5-0”) de caldo de LB al tubo P-. Tapen el
tubo y den golpecitos suaves en la parte inferior del tubo dos o
tres veces para mezclar.
'( Utilicen una nueva punta y transfieran 150 µl de caldo de LB al tubo
P+. Cierren la tapa y den golpecitos suaves en el tubo para mezclar.
') Soliciten a su profesor un paquete de esparcidores de células
esterilizados. Trabajarán con el paquete cada dos grupos.
'* Ahora están listos para esparcir sus células bacteriales
en las placas de agar esterilizadas.
W Utilizando una pipeta P–200 (configurada
en “0-5-0”), muevan suavemente la
pipeta dos o tres veces para volver a
suspender las células; luego aspiren 50 µl
de células del tubo P-. Abran la tapa de la
placa LB como una “almeja”. Viertan estas
células en la mitad de la placa marcada
“P-”. Cierren la tapa.
Laboratorio 1
5
X
Vuelvan a suspender las células bombeando suavemente
con la pipeta, luego aspiren una segunda alícuota de 50
µl para la placa LB/amp. Recuerden que deben depositar
las células P– en la mitad de la placa rotulada “P-”.
Tapen la placa.
]
'+ Ahora están listos para sembrar la placa LB/amp/ara.
W
50 µL P- 50 µL
P- P+
Placa LB
Y
Z
[
\
P- P+
Abran la tapa de la placa LB
Mango
como una almeja y, suavemente,
con un leve desplazamiento,
diseminen las células por la
superficie del agar, manteniendo
las células en el lado P– de la
placa. Intenten esparcirlas de
forma pareja y a los lados de la placa.
Utilizando la pipeta P-200
(configurada en “1-0-0”), transfieran
100 µl del cultivo P+ a la superficie
de la placa LB/amp/ara. Coloquen
100 µl de células en varias áreas
de la superficie del agar en vez de
depositarlas en un solo lugar.
X
Levanten la tapa como una almeja y
diseminen las células uniformemente
sobre la superficie de la placa.
Y
Giren suavemente la placa por debajo
del esparcidor P+ de manera que las
células se puedan diseminar por toda
la superficie de esta placa. Intenten
diseminar las células uniformemente
también a lo largo de la pared de la
placa.
Placa LB/amp
Abran el paquete de esparcidores de células esterilizados
en la terminación más cercana a los mangos del
esparcidor. Compartirán este paquete con otro
grupo. Retiren sólo un esparcidor y mantengan los
demás esterilizados. Sostengan el esparcidor por
el mango y no permitan que la terminación doblada
toque ninguna superficie, ya que podría contaminar el
esparcidor. Cierren el paquete para evitar que los demás
esparcidores se contaminen.
Repitan los pasos 14-a hasta 14-e para sembrar las
placas LB y LB/amp con el cultivo P+. Asegúrense de
utilizar la pipeta “+” y un nuevo esparcidor para evitar
la contaminación.
Z
P+
100 µL de células
P+
Placa LB/amp/ara
Cuando terminen, tapen la placa.
', Coloquen las tres placas del lado derecho hacia arriba
Superficie
donde se
esparcen
Con cuidado, diseminen las células P- en la placa LB/
amp utilizando el mismo esparcidor y la misma técnica.
Coloquen el esparcidor usado en la bolsa para riesgos
biológicos.
durante cinco minutos.
'- Utilizando una cinta adhesiva de color, aseguren las
placas y colóquenlas en la incubadora, con el gel boca
arriba . Asegúrense de haber rotulado claramente las
placas con su número de grupo y el horario de clase.
Pueden marcar la cinta adhesiva para encontrarlas
rápidamente el próximo laboratorio.
'. Desechen el desecho celular contaminado: esparcidores,
tubos de células y puntas para pipetas, colocándolas en
la bolsa para desechos celulares contaminados que su
profesor les entregará.
5.4
Laboratorio 1
5
Conclusiones
Respondan a las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la transformación.
'
Anticipen el crecimiento, si ocurre, en las siguientes placas. Recuerden que las células del
cultivo P+ recibieron los plásmidos recombinantes, mientras que las del cultivo P– no. Utilicen
un “+” si anticipan el crecimiento y un “–” si anticipan que no crecerán.
P- P+
Placa LB
P- P+
Placa LB/amp
P+
LB/amp/ara
(W ¿Qué tienen en común todas las células que crecen en las placas LB/amp y LB/amp/ara?
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
(X ¿Qué fragmento de restricción deben tener todas para crecer en las placas con ampicilina?
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
)W ¿Esperan que todas las células que crezcan en la placa LB/amp/ara se transformen con el
mismo plásmido? Expliquen por qué.
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
)X ¿Cómo podrían determinar qué células de la placa LB/amp/ara contienen pARA-R, el plásmido
recombinante que han creado ligando el gen rfp con el fragmento de restricción pARA?
.................................................................................................................................................
5.5
Laboratorio 1
5
Respondan a estas preguntas después de ver los resultados de la transformación.
*W Utilicen la siguiente tabla para comparar el resultado de la transformación real con los
resultados previstos. Vean los resultados “pronosticados” en la página 5.5.
Placa
Resultados pronosticados
Resultados reales
LB
LB/Amp
LB/Amp/Ara
*X Si sus resultados reales resultaron diferentes de lo esperado, propongan razones que
expliquen estas diferencias.
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
+W ¿Cuántas colonias rojas estuvieron presentes en la placa LB/amp/ara?
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
+X ¿Por qué las colonias rojas sólo aparecen en esta placa y no en la placa LB/amp?
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
+Y ¿Esperaban que algunas de las bacterias de la placa LB/amp se transformaran con pARA-R?
Describan brevemente cómo podrían probar su respuesta.
....................................................................................................................................................
5.6
Laboratorio 5a
1
Transformación de Escherichia coli
con pARA-R
El proceso de incluir partes extrañas de ADN, como
un plásmido, en una célula bacterial se denomina
transformación. La transformación es un proceso que
ocurre en la naturaleza, aunque probablemente es algo
poco frecuente. El médico británico Frederick Griffith fue
el primero en estudiar el proceso en 1928. Por lo general,
las bacterias transfieren un exceso de material genético
cromosomático, como plásmidos, durante la conjugación
(sexo bacterial) en lugar de dejarse libradas a su suerte.
Pero incluir plásmidos puede suministrar a las bacterias
determinados genes que confieren una ventaja selectiva, por
ejemplo, la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, bajo
condiciones experimentales, es posible preparar células de
modo que alrededor de una célula en mil tome un plásmido
del medio circundante.
Existen diversos factores que determinan la eficiencia
de la transformación. Dos factores están relacionados
directamente con el plásmido utilizado para la
transformación. Cuanto más grande sea éste, menos
probabilidades habrá de que ingrese a la bacteria. Recuerden
que para que la bacteria tome ADN extraño, el plásmido
debe pasar por la membrana plasmática y la pared celular
de las bacterias. Por lo tanto, los plásmidos pequeños tienen
más posibilidades de pasar por las membranas plasmáticas
de la bacteria (E. coli tiene dos) y la pared celular que los
plásmidos grandes.
Membranas
plasmáticas
Pared
celular Plásmidos
Plásmido
ADN genómico
Los plásmidos pueden tener diferentes formas. La forma
superenrollada entra con mayor facilidad a la célula, en
tanto las formas de círculo mellado o multímero, es decir,
dos o más plásmidos unidos, tienen mayor dificultad para
hacerlo.
En la naturaleza, la transformación es relativamente
poco frecuente. Para aumentar las posibilidades de que
plásmidos recombinantes ingresen a las células bacteriales,
utilizaremos células “competentes”. Esto significa que
las células están preparadas para recibir plásmidos. En
su mayor parte, no se encuentran células competentes
en la naturaleza; éstas deben hacerse competentes en el
laboratorio. Una forma común de hacerlo es embebiendo
las células en cloruro de calcio.
5a.1
Recuerden que el ADN tiene carga negativa. ¿Recuerdan
por qué? Las membranas plasmáticas que rodean la célula
bacterial también contienen grupos de fosfato y poseen
carga negativa. El problema que se presenta al intentar
pasar ADN con carga negativa por una membrana con
carga negativa es que las cargas eléctricas iguales tienden
a rechazarse. Cuando las células se vuelven competentes,
se suspenden en una solución de cloruro de calcio porque
los iones del calcio (átomos de calcio con carga positiva,
Ca 2+) ayudan a neutralizar las cargas eléctricas negativas
de la membrana plasmática y el plásmido. Neutralizando
las cargas repulsivas mediante iones de calcio, el ADN
plasmídico pasa con mayor facilidad por la membrana
plasmática de la célula bacterial.
Ahora que hemos neutralizado las cargas negativas del
ADN y de las membranas plasmáticas, necesitamos crear
una diferencia de presión entre la parte interna y externa de
la célula bacterial. Esto se logra, en primer lugar, enfriando
las bacterias y luego sumergiéndolas rápidamente en agua
tibia. Esto se denomina “choque térmico” y crea una
situación en la que la presión externa de la célula es apenas
mayor que la presión interna de la misma. Este gradiente
de presión ayudará a trasladar el ADN plasmídico desde el
exterior hasta el interior de la célula bacterial.
Una vez que las células se han recuperado, se tomarán
muestras de estas células y se dispondrán en una serie de
placas de agar esterilizadas. Una de las placas contendrá
sólo el alimento bacterial. Esta placa no debe contener
antibióticos. Rotulen esta placa como “LB”. La segunda,
debe contener LB y ampicilina, y deben rotularla como
“amp”. La tercera placa debe contener LB, ampicilina y
un monosacárido llamado arabinosa, y deben rotularla
como “ara”.
La ampicilina es un antibiótico que evita que las
bacterias formen completamente su pared celular. Las
células que no resisten la ampicilina no pueden crecer en su
presencia, las células nuevas simplemente se rompen o se
lisan. Si una célula recibe un gen resistente a la ampicilina,
ampr, producirá una proteína que destruirá químicamente
la ampicilina y, de esa forma, podrá crecer con ampicilina
en su medio.
La bacteria necesita arabinosa, un monosacárido, para
expresar el gen rfp. Si una bacteria incluye pARA-R, la
arabinosa ayuda a la enzima ARN polimerasa, necesaria
para transcribir el gen rfp, para que se alinee correctamente
en el plásmido. Esta relación se tratará en el próximo
laboratorio.
Aunque la cepa de E. coli que se utiliza en estos
laboratorios es relativamente benigna, es importante que
utilicen técnicas adecuadas al momento de manipularlas.
Laboratorio 5a
1
Materiales
H;79J?LEO9KBJ?LE
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Placa con E. coli (LMG)
Hielo triturado
10 µl de pARA-R (10 ng/µl)
1 ml 50 mm de CaCl2
1 placa con LB
1 placa con LB y amp
1 placa con LB y amp y ara
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Asa de siembra esterilizada
Esparcidores desechables de células (2)
Gradilla para tubos de microfuga
Marcador indeleble
Micropipeta y puntas P-20
Micropipeta y puntas P-200
Vaso de precipitados con desinfectante
Baño María a 42 °C
Métodos
Preparación de células competentes para la transformación.
' La transformación bacterial exige técnicas estériles. Es
fundamental que sigan las instrucciones con precisión.
( Utilicen el marcador para rotular como P+ uno de los
tubos de microfuga esterilizados de 1.5 ml y el otro tubo
como P-. El ADN plasmídico se agregará sólo al tubo P+.
El tubo P- representará un control plasmídico negativo.
) Tomen el tubo que contiene CaCl2. Utilicen la pipeta P-
200 y una punta limpia para transferir 250 µl de CaCl2 a
los tubos P+ y P-. Indicación: preparen la pipeta P-200 en
125 µl y transfieran dos alícuotas a cada tubo rotulado.
La pipeta debe indicar “1-2-5” en la pantalla.
* El instructor entregará a la clase un plato Petri con
colonias de células de E. coli. Utilicen un asa de siembra
esterilizada para raspar suavemente dos o tres colonias
grandes de bacterias del plato Petri y transferirlas al
tubo P+. Den un golpecito con el asa contra la pared del
tubo para quitar las colonias del asa. Tapen el tubo y
muévanlo enérgicamente por la superficie de la gradilla
para tubos de microfuga para suspender las células en
CaCl2. Continúen haciendo esto hasta que no se vean
aglomeraciones visibles de bacterias. Coloquen este tubo
en el hielo triturado.
P- P+
Placa LB
P- P+
Placa LB/amp
+ Repitan este procedimiento usando la misma asa de
siembra, pero transfieran la colonia y suspendan las células
en el tubo P-. Coloquen este tubo en el hielo triturado.
Coloquen el asa de siembra en desinfectante o en una bolsa
de desechos celulares para su correcta eliminación.
, Transfieran 10 µl de plásmido (pARA-R) directamente en
la suspensión celular del tubo P+. Agiten brevemente
la mezcla dando golpecitos suaves en la base del tubo de
microfuga con el dedo índice. Eviten salpicar la mezcla en
la superficie lateral del tubo de transformación. Regresen
el tubo P+ al hielo triturado.
- Incuben ambos tubos en hielo triturado durante
15 minutos. Asegúrense de que los tubos estén en
contacto con el hielo. Es importante que las células
se enfríen bien.
. Tomen una de cada una de las siguientes placas: LB,
LB/amp y LB/amp/ara.
/ Usando el marcador y una regla, dibujen una línea en el
medio de las placas LB y LB/amp, pero no en la placa
LB/amp/ara. Realicen esta división en la base de gel
de ambas placas. Rotulen con una “P-” y una “P+” las
mitades de las bases de las placas LB y LB/amp y con
un “+” la base de la placa LB/amp/ara.
P+
LB/amp/ara
5a.2
Laboratorio 5a
1
Transformación de E. coli con pARA-R
'
Después del enfriamiento en hielo de 15 minutos, realicen un choque térmico en las
células de ambos tubos mediante los siguientes procedimientos:
■
■
■
(
Trasladen el contenedor de hielo con los tubos de transformación P+ y P- del paso 7
a baño María a 42 °C. Es importante que las bacterias experimenten un cambio bien
abrupto de temperatura.
Mantengan ambos tubos a baño María durante 45 segundos exactamente.
Devuelvan ambos tubos al hielo triturado de forma inmediata durante al menos un minuto.
Después del enfriamiento de un minuto, vuelvan a colocar los dos tubos en la gradilla de tubos
de ensayo y manténganlos a temperatura ambiente.
Esparcimiento de las células transformadas en placas de agar
'
Coloquen las tres placas en el siguiente
orden: LB, LB/amp, LB/amp/ara.
+
Utilizando el mismo esparcidor, repitan el procedimiento de
esparcimiento en la placa LB/amp.
(
Preparen la pipeta P-200 en 50µl. La
pipeta indicará “0-5-0”.
Sostengan las células P- (control)
entre el dedo pulgar e índice. Den
,
Después de utilizarlo en la placa LB/amp, desechen el esparcidor
de células en desinfectante o en una bolsa de desechos celulares.
)
-
golpecitos suaves en la base del
tubo para volver a suspender las
células. Depositen 50 µl de estas células en la mitad “-” de
las placas LB y LB/amp. No depositen estas células en la
placa LB/amp/ara.
Una vez que hayan vuelto a suspender las células en el
tubo “P+”, utilicen una punta nueva y depositen 50 µl de
células en el lado “+” de las placas LB y LB/amp; luego
depositen 150 µl de las células en la placa LB/amp/ara.
.
Abran el paquete de
esparcidores esterilizados
de células en la terminación
Utilizando un esparcidor de células nuevo, repitan los pasos
4 y 5 esparciendo las células en el lado “+” de las placas LB y
LB/amp y sobre toda la superficie de la placa LB/amp/ara.
/
Desechen este esparcidor de células en desinfectante o en
una bolsa de desechos celulares.
Mango
Superficie
donde se
esparcen
más cercana a los mangos
del esparcidor. Compartirán
este paquete con otro grupo.
Retiren sólo un esparcidor
y mantengan los demás esterilizados. Sostengan el
esparcidor por el mango y no permitan que la terminación
doblada toque ninguna superficie, ya que podrían
contaminar el esparcidor. Cierren el paquete para evitar
que los demás esparcidores se contaminen.
*
Abran la tapa de la placa LB como una almeja y, con
movimientos suaves y deslizantes, esparzan las células por la
superficie del agar, manteniendo las células sólo en el lado “–”
de la placa. Intenten esparcirlas de forma pareja y a los lados
de la placa.
5a.3
Utilicen cinta adhesiva para unir las placas. Escriban su
'& nombre en la cinta para poder reconocer las placas más
adelante. Coloquen las placas boca abajo en una incubadora
a 37 °C.
'' Incuben las placas entre 24 y 36 horas a 37 °C.
Laboratorio 5a
1
Conclusiones
Respondan las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la transformación.
'
Anticipen el crecimiento, si ocurre, en las siguientes placas. Recuerden que las células
del cultivo P+ recibieron el plásmido, mientras que las del cultivo P– no. Utilicen un
“+” si anticipan el crecimiento y un “–” si anticipan que no crecerán.
P- P+
P- P+
Placa LB
Placa LB/amp
P+
LB/amp/ara
(W ¿Qué tienen en común todas las células que crecen en las placas LB/amp y
LB/amp/ara?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
(X ¿Qué fragmento del plásmido pARA-R permite que estas células crezcan en
estas placas?
.....................................................................................................................................
(Y ¿Qué tamaño tiene este fragmento en bases apareadas?
.....................................................................................................................................
)
¿En qué placa/s anticiparían que las células expresarán el gen rfp?
.....................................................................................................................................
Respondan estas preguntas después de ver los resultados de la transformación.
*W Utilicen la siguiente tabla para comparar el resultado de la transformación real con
los resultados previstos.
Placa
Resultados pronosticados
Resultados reales
LB
LB/Amp
LB/Amp/Ara
*X Si sus resultados reales resultaron diferentes de lo esperado, propongan razones que
expliquen estas diferencias.
.....................................................................................................................................
+W ¿Cuántas colonias “rojas” estuvieron presentes en la placa LB/amp/ara?
.....................................................................................................................................
+X ¿Por qué las colonias rojas sólo aparecen en esta placa y no en la placa LB/amp?
.....................................................................................................................................
5a.4
Laboratorio 6
1
Preparación de
Preparación de un cultivo “overnight” de Escherichia coli
El propósito de este laboratorio es iniciar un
cultivo de bacterias que produzca una cantidad suficiente
de proteína fluorescente mutante que les permita aislar y
purificar la proteína. El profesor seleccionará una de las
colonias rojas de la placa LB/amp/ara transformadas con
el plásmido pARA-R y la usará para sembrar un cultivo
“overnight”.
El gen para mFP fue aislado originalmente de una
anémona de mar. La mFP se usa con mucha frecuencia
en investigaciones porque la proteína se puede fusionar
con otras proteínas y luego se puede hacer un seguimiento
usando un microscopio fluorescente. El gen original de la
proteína fluorescente se mutó para producir una molécula
que tiene un brillo fluorescente muchas veces mayor. El
plásmido pARA-R fue diseñado luego para la expresión del
gen.
En el siguiente diagrama se ilustra la región de pARAR que contiene los principales elementos de control
requeridos para expresar el gen rfp. Es fundamental que
tengan en cuenta que sólo una pequeña parte del plásmido
pARA-R está representada en este diagrama y que el ADN
está ilustrado como una línea recta en lugar de un círculo.
El diagrama identifica tres regiones importantes: 1) el gen
araC; 2) la región promotora (PBAD); y 3) la ubicación del
gen rfp en relación con los demás elementos de control en
el plásmido.
gen
araC
Promotor
el ADN se encuentra en esta configuración, la transcripción
del ARNm no puede ocurrir porque evita que la ARN
polimerasa se una al sitio promotor. Sin el ARNm, la
bacteria no puede producir mFP.
Promotor
gen
araC
gen
rfp
La proteína AraC evita la transcripción
del rfp causando la formación de un
bucle en la región del gen rfp
Cuando la arabinosa está presente en el medio de la
bacteria, la arabinosa se une a la proteína AraC, formando
un complejo. Esto evita que se forme el bucle de ADN.
La unión de la arabinosa también origina un cambio en
la conformación de la proteína (forma), que resulta en la
formación de un pequeño bolsillo que ayudará a una tercera
molécula, la ARN polimerasa, a unirse al complejo.
Este complejo de tres moléculas se une al sitio promotor,
y la ARN polimerasa se alinea en la molécula de ADN de
manera que pueda transcribir el gen rfp. Esta transcripción
produce el ARNm, que se traduce como mFP. Por lo tanto,
la proteína AraC tiene una función doble: puede inhibir la
síntesis de mFP al permitir que el ADN forme un bucle y al
evitar que la ARN polimerasa se una a la región promotora,
y puede activar la transcripción del gen rfp y, por lo tanto,
la producción de mFP, si se une a la arabinosa.
arabinosa
rfp
Transcripción
proteína araC
mRNA
ARN polimerasa
Traducción
arabinosa – Complejo de proteína araC
Proteína AraC
El gen araC representa una proteína reguladora conocida
como “proteína AraC”. La proteína AraC participa en la
activación y desactivación del gen rfp. En el diagrama
anterior se resume la relación entre el gen AraC, la
transcripción, el ARN mensajero, el desplazamiento y la
proteína araC.
El sitio promotor es la parte de ADN donde ocurre la
regulación de la expresión del rfp. Cuando no hay arabinosa
en el medio donde se encuentra la bacteria, la proteína AraC
se une físicamente con dos regiones del plásmido, el sitio
promotor y una región cercana al gen araC. Esto hace que
la molécula de ADN se doble, formando un bucle. Cuando
6.1
gen
araC
Promotor
rfp
Transcripción
mRNA
El complejo de proteína AraC-arabinosa evita la
formación de bucles en el ADN y ayuda a alinear
la ARN polimerasa en el sitio promotor
mFP
Laboratorio 6
1
Membranas
plasmáticas
Métodos
pARA-R
Pared celular
Citoplasma
Dado que trabajará con bacterias, es importante
que lo haga rápido para evitar la contaminación.
' El instructor utilizará un palillo de dientes limpio para trans-
ferir algunas células desde una colonia que exprese el mFP
(rojo) a un frasco que contenga caldo LB/amp/ara.
Moléculas de mFP
de los cuerpos
de inclusión
ADN genómico
(
Otras proteínas
Cuando la bacteria expresa el gen rfp y produce la
proteína fluorescente mutante, la célula toma estas
moléculas de mFP y las concentra en cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión son gránulos concentrados
de moléculas de mFP y no están unidos mediante una
membrana.
Materials
H;79J?LE
Placa LB/amp/ara (del laboratorio 5 ó 5a)
Frasco esterilizado con caldo LB/amp/ara
El frasco se ubicará en un agitador y se agitará durante
toda la noche para provocar la división de células y la expresión del gen rfp.
Conclusiones
'
Aunque el instructor haya trabajado rápidamente para
transferir una muestra de bacterias que expresan el
gen rfp, hay probabilidad de que también se hayan
transferido algunas bacterias que no expresan este gen.
¿Qué evitaría el crecimiento de estas bacterias en el
caldo LB/amp/ara?
(
El objetivo de este cultivo overnight es clonar las
bacterias que expresan el gen rfp y lograr que éstas
produzcan suficiente mFP para purificar la proteína
de las demás proteínas de la célula. Como las células
son cultivadas, ¿esperaría encontrar el mFP dentro de
las células bacteriales o en el caldo de nutrientes que
rodea a las células?
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Agitador
palillo de dientes limpio
6.2
Laboratorio 1
7
Purificación de mFP
a partir de un cultivo “overnight”
Cuando los científicos de una compañía
terapéutica , como Amgen, identifican exitosamente una
Membranas
plasmáticas
proteína terapéutica promisoria, se presentan dos objetivos:
ubicar y aislar el gen que codifica la proteína. Una vez
aislado, el gen se inserta en un plásmido para que se pueda
clonar, ya que se necesitarán copias adicionales del gen para
los continuos estudios. El gen rfp se clonó en un plásmido
llamado pKAN-R. El pKAN-R es un vector de clonación,
un plásmido que ha sido diseñado para reproducirse en
grandes cantidades dentro de la célula bacterial.
Luego, los genes clonados se insertan en plásmidos que
han sido diseñados específicamente para la expresión de la
proteína en las bacterias u otros organismos propicios. Estos
plásmidos se conocen como vectores de expresión, como
el pARA-R que porta el gen rfp clonado en una ubicación
específica del plásmido, lo que permite a la célula bacterial
producir la proteína fluorescente mutante.
Las células transformadas pueden expresar la proteína
en un cultivo “overnight” y luego lisarse (partirse) para
liberar la proteína recientemente sintetizada de la célula. La
proteína se aísla de las demás proteínas citoplasmáticas, se
purifica y se evalúa su actividad.
Ya han completado gran parte
del trabajo que se asemeja a la
situación real del descubrimiento
de drogas. Las células bacteriales
que se han producido en el
caldo LB/amp/ara han estado
expresando la mFP y ahora
están listas para ser lisadas
(día uno del Laboratorio 7) y
la mFP purificada (día dos del
Laboratorio 7) usando una
cromatografía en columna.
La proteína fluorescente
mutante es una molécula cuyo
tamaño es de aproximadamente
238 aminoácidos. La proteína nativa (como existe en
el Discosoma) tiene forma de cilindro con una región
fluorescente, denominada fluoróforo, ubicada en el centro
del cilindro.
Para purificar una molécula de otras proteínas presentes
en la célula, debemos observar cómo difieren los grupos
de moléculas entre sí y cómo se pueden utilizar estas
diferencias para realizar la separación.
7.1
pARA-R
Pared celular
Citoplasma
Moléculas de
mFP de los
cuerpos de inclusión
ADN genómico
Otras proteínas
Una propiedad de la molécula usada comúnmente en la
purificación es la hidrofobicidad de la proteína. El término
hidrofobicidad se relaciona con el comportamiento de una
molécula en el agua. Si una molécula es hidrófoba, rechaza
el agua; en tanto, si es hidrófila, tiene afinidad por el agua.
Por ejemplo, los aceites, las ceras y las grasas son hidrófobas
porque no se disuelven en agua. El azúcar de mesa y la sal
de mesa son hidrófilas y se disuelven rápidamente en agua.
Es común que las moléculas grandes, como las proteínas,
tengan regiones hidrófobas y otras regiones hidrófilas. Si
estas proteínas se colocan en agua, las regiones hidrófobas
tienden a “alejarse” del agua, mientras que sus regiones
hidrófilas intentan acercarse al agua. En gran medida, la
curvatura de la cadena de aminoácidos de la proteína es
responsable de su conformación general o forma molecular,
donde las regiones hidrófobas se
“esconden” en el interior de la
molécula y las regiones que tienen
afinidad por el agua se ubican en la
parte externa.
Es importante saber que una célula
bacterial contiene diversos tipos de
proteínas. El siguiente diagrama está
muy simplificado dado que indica
sólo algunos tipos. Sin embargo,
el problema es cómo separar una
proteína simple, como la mFP,
de todas las demás. Una bacteria
típica contiene más de 1000 tipos
diferentes de proteínas. El uso del
vector de expresión recombinante,
pARA-R, facilitará el aislamiento
de la mFP: las células de E. coli que
han cultivado fueron desarrolladas
para producir una concentración
desproporcionadamente alta de mFP.
Solución reguladora
Columna
mFP
Resina hidrófoba
Llave
Otras
proteínas
Laboratorio 1
7
La purificación de proteínas puede utilizar la
hidrofobicidad para separar y purificar las moléculas
proteicas. Un procedimiento de purificación común que
utiliza las diferencias de hidrofobicidad para separar las
proteínas se denomina cromatografía en columna. En la
cromatografía en columna se utiliza un cilindro de plástico
o vidrio donde se coloca un medio separador conocido como
“resina”. El tipo específico de resina utilizado puede variar
dependiendo del tipo de proteína que se desea purificar. En
este laboratorio, utilizaremos una cama de resina que consta
de pequeñas cuentas hidrófobas. La proteína fluorescente
mutante es altamente hidrófoba y cuando la mFP se coloca
en una solución de alta concentración salina, la molécula de
mFP se distorsiona haciendo que las regiones hidrófobas de
la molécula se adhieran a la resina hidrófoba de la columna
de cromatografía. Las proteínas hidrófilas originadas por
la célula continúan bajando por la columna a través de la
resina sin adherirse a la cama de resina y luego se eliminan.
solución reguladora de lavado para la columna tendrá
una concentración relativamente menor de sal que la
solución utilizada para unir la mFP con la resina, pero la
salinidad será lo suficientemente alta para lavar la mFP de
la resina. Finalmente, podemos usar una solución con una
concentración muy baja de sal para extraer o liberar la mFP
de las cuentas de resina. Bajo una concentración salina baja,
las regiones hidrófobas de la molécula de mFP apuntan al
interior de la molécula, liberando de esa forma la mFP de la
resina hidrófoba de la columna.
La purificación industrial de proteínas es mucho más
compleja que este protocolo de purificación de la mFP,
pero los principios aplicados por la industria son similares.
La muestra de mFP que obtuvieron de esta purificación
contiene otras proteínas. No obstante, el procedimiento
ha retirado muchas de las demás proteínas presentes en el
citoplasma de la bacteria.
Una vez que la mFP queda atrapada en la cama de
resina, la columna se puede lavar con una solución con
menor concentración salina para extraer (lavar) las
moléculas moderadamente hidrófobas de la columna. Esta
Materiales
H;79J?LE
2 ml de Cultivo LB/amp/ara de E. coli (laboratorio 6)
Lisozima (10 mg/ml)
Solución reguladora de unión, 4 M (NH4)2SO4
Solución reguladora de equilibrio de columna, 2 M
(NH4)2SO4
Solución reguladora de lavado de columna, 1.3 M
(NH4)2SO4
Solución reguladora de extracción, 10 mM TE
Etanol al 20%
10% de blanqueador u otro desinfectante
TE (igual al amortiguador de extracción)
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Pipeta y puntas P-200
Pipeta y puntas P-1000
Columna de cromatografía
Gradilla para tubos de microfuga
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Marcador indeleble
Tubo de recolección de residuos de 6 ml
Bolsa para desechos celulares contaminados
7.2
Laboratorio 1
7
Métodos
Preparación del lisado celular a
partir del cultivo “overnight” líquido
'
Soliciten al profesor 1 ml del cultivo LB/amp/ara.
(
Analicen este cultivo. ¿De qué color es?
)
Coloquen este tubo en el centrifugador.
Importante: ustedes o el profesor deberán asegurarse de que
los tubos hayan sido colocados en el rotor en una configuración
equilibrada antes de encender el centrifugador. Centrifuguen los
tubos de microfuga durante 5 minutos.
*
Una vez que el rotor se haya detenido, retiren con cuidado el tubo para
no dañar el sedimento celular.
+
Determinen la ubicación de la mFP. ¿Está en el sedimento de la célula
bacterial o en el sobrenadante (el líquido sobre el sedimento celular)?
,
Una vez que hayan determinado la ubicación de la mFP, decanten
cuidadosamente (extraigan) el sobrenadante en el vaso de
precipitados con desinfectante. Realicen esto sin dañar el sedimento
celular.
-
Obtengan una segunda medida de 1 ml del cultivo “overnight” y
repitan los pasos del 3 al 6.
.
Pidan al profesor un tubo con “solución reguladora de extracción” y
“lisozima”.
/
7.3
que sea posible del tubo de microfuga sin tocar el sedimento
celular. Desechen el papel utilizado en la bolsa para desechos
celulares contaminados.
'& Usando la pipeta P-1000 (preparada en “0-2-5”) y una punta
limpia, transfieran 250 µl de solución reguladora de extracción al
sedimento celular. Cierren y ajusten bien la tapa.
'' Vuelvan a suspender las células moviendo enérgicamente el tubo
de microfuga bien cerrado por la superficie de la gradilla para
tubos de microfuga. Es posible que deban realizar esto varias
veces para volver a suspender las células. Examinen el tubo
cuidadosamente para asegurarse de que no haya aglomeraciones
visibles de células.
'( Usando la pipeta P-200 (preparada en “0-4-0”), transfieran 40 µl
Inviertan el tubo de microfuga que contiene el sedimento celular y,
usando papel secante, intenten eliminar la mayor cantidad de líquido
de lisozima a las células en suspensión. La lisozima es una enzima
que digiere la pared celular bacterial. Esta digestión enzimática
de la pared celular debilita en gran medida a la célula, y las células
comienzan a lisarse (se parten). Agiten o muevan el tubo de
microfuga por la superficie de la gradilla para tubos para mezclar
bien. Si el tiempo lo permite, incuben muestras a 50 °C durante
30 a 60 minutos.
') Asegúrense de haber rotulado este tubo con su número de grupo y
el horario de clase. Entreguen el tubo al profesor. Estas células se
colocarán en el congelador después de la incubación.
Las células se pueden conservar congeladas a –20 °C,
hasta el siguiente laboratorio.
Laboratorio 1
7
Purificación de la proteína fluorescente
mutante a partir del lisado celular
Obtención de materiales
'
■
■
■
Persona A deberá verificar que los siguientes reactivos estén
en el lugar de trabajo. Estos reactivos se compartirán con
otro grupo.
Solución reguladora de unión
Solución reguladora de equilibrio
Solución reguladora de lavado
Etanol al 20% (si su grupo es el último en usar
la columna)
Persona B deberá pedir al profesor las células lisadas;
estas células estuvieron congeladas durante la noche.
Esta persona deberá llevar las células al centrifugador para
sedimentar los restos celulares.
Persona C deberá reunir los siguientes suministros:
2• tubos de microfuga de 1.5 ml. Rotulen un tubo como
“mFP” y
otro como “sobrenadante”.
1• tubo de recolección de residuos de 6 ml (es probable
que ya esté en la gradilla plástica para tubos).
Preparación de la columna
(
Ubiquen la columna de cromatografía según las indicaciones del
profesor, tengan cuidado de no desplazar la llave de paso de la
parte inferior del tubo.
)
Coloquen el tubo de recolección de residuos en la gradilla plástica
para tubos de microfuga. Abran cuidadosamente la columna
girando la válvula de la llave de paso y permitan que el fluido
comience a drenar desde la columna. Dejen aproximadamente
1 mm de este líquido sobre la cama de resina para evitar que la
columna se seque.
*
+
,
Dividan el grupo para realizar diversas tareas.
Usando la pipeta P-1000 (preparada en “1-0-0”) y una punta limpia,
agreguen 3000 µl (=3 ml) de solución reguladora de equilibrio
a la columna de cromatografía. Agreguen la solución reguladora
lentamente por el costado de la columna para que no desestabilice
la superficie de la cama de resina. Dejen que la solución reguladora
fluya lentamente por el costado de la columna.
Ahora la columna de cromatografía está lista para la muestra de mFP.
Mientras esperan la muestra de mFP, asegúrense de que el fluido
no esté drenando desde la columna. Si el tubo de recolección de
residuos está lleno, es momento de vaciar el líquido en el fregadero.
Preparación de la muestra de mFP
-
Centrifuguen el lisado celular durante cinco minutos para
sedimentar los restos celulares. Ustedes o el profesor deberán
asegurarse de que el rotor esté equilibrado antes de cerrar la tapa
y centrifugar. Es muy importante equilibrar estos tubos antes
del centrifugado.
.
Después del centrifugado, tomen el tubo de microfuga. Examínenlo.
¿Dónde está la mFP? ¿en el sobrenadante o en el sedimento celular?
/
Sin dañar el sedimento de restos celulares, retiren
cuidadosamente 200 µl de sobrenadante usando la pipeta
P-200 (preparada en “2-0-0”) y una punta limpia. Realicen esto
sin arrastrar ningún resto celular. Si desplazan el sedimento,
deberán centrifugar el tubo nuevamente. Viertan los 200 µl de
sobrenadante limpio y sin restos en un tubo de microfuga de 1.5 ml
con el rótulo “sobrenadante” (uno de los miembros del grupo rotuló
este tubo).
'& Reemplacen la punta de la pipeta P-200 y agreguen 200 µl de
solución reguladora de unión al sobrenadante que vertieron en
el tubo correspondiente. Mezclen la solución reguladora de unión
con el sobrenadante bombeando suavemente las soluciones hacia
afuera y adentro usando la pipeta.
'' Usando la pipeta P-1000 (preparada en “0-4-0”) y una punta limpia,
agreguen 400 µl de esta solución, sobrenadante de mFP y solución
reguladora de unión, a la columna preparada usando la misma
pipeta que utilizaron para mezclar las soluciones. Realicen esto sin
dañar la superficie de la cama de resina, vertiendo la solución por el
costado de la columna.
'( Sin dejar secar la columna, abran la llave de paso y dejen que
la solución de la columna drene hacia el tubo de recolección
de residuos. Dejen aproximadamente 1 ó 2 mm de solución
reguladora sobre la cama de resina.
Permitan que la solución reguladora de equilibrio drene desde
la columna hacia el tubo de recolección de residuos, pero dejen
aproximadamente 1 ó 2 milímetros de solución reguladora
sobre la cama de resina para evitar que se seque.
Continúa en la página siguiente...
7.4
Laboratorio 1
7
Continúa desde la página anterior...
') Examinen la columna y coloquen la mFP. ¿La mFP está esparcida
por toda la cama de resina o parece haber quedado limitada a una
sola banda?
'* Usando la pipeta P-1000 (preparada en “1-0-0”), agreguen con
cuidado 1000 µl (= 1ml) de solución reguladora de lavado por el
costado de la columna. Sin dejar secar la columna, permitan que la
solución reguladora drene desde la columna, dejando 1 ó 2 mm de
solución reguladora sobre la cama de resina.
'+ Examinen la columna y coloquen la mFP. ¿Ha cambiado la
ubicación de la mFP en la cama de resina? La solución reguladora
de lavado extraerá algunas de las proteínas menos hidrófobas de
la columna. La concentración salina de la solución reguladora de
lavado es menor que la de la solución reguladora de unión, pero lo
suficientemente alta para hacer que la mFP se libere de la resina.
', Usando la pipeta P-1000 (preparada en “1-0-0”) y una punta
limpia, agreguen con cuidado 1000 µl dos veces (= 2ml en total)
de solución reguladora de extracción por el costado de la columna.
A medida que la mFP comience a gotear desde la punta de la llave
de paso, recojan la proteína en el tubo con el rótulo “mFP”. En este
tubo, recojan sólo el eluato rojo. Cuando hayan recogido toda la mFP,
tapen el tubo.
'- Después de haber recogido toda la mFP, agreguen 2000 µl (= 2 ml)
de solución reguladora de equilibrio a la columna usando la pipeta
P-1000 y una punta limpia. Esto ayudará a preparar la columna
para la próxima clase. Si es el último grupo en usar las columnas,
agreguen 4000 µl (= 4 ml) de etanol al 20% a la columna. Drenen
aproximadamente 2 ml de etanol desde la columna hacia el tubo de
recolección de residuos.
'. Tapen y ajusten bien la columna.
'/ La solución del tubo de recolección de residuos se puede desechar
en el fregadero.
(& Todos los tubos de microfuga, excepto el que contiene la mFP, se
deben desechar en la bolsa para desechos celulares contaminados.
(' Comparen su tubo con los tubos con mFP de los demás grupos.
¿Existe alguna diferencia de intensidad de color entre las muestras?
7.5
Laboratorio 1
7
Conclusiones
'
¿Qué característica de la mFP se utiliza como base para la separación mediante
la cromatografía en columna?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
(
Después del centrifugado del lisado celular, ¿la mFP se ubicó en el sobrenadante
o en el sedimento de restos celulares?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
)
¿Cuándo se habrían extraído las proteínas hidrófilas de la columna?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
*W ¿El eluato que contiene la mFP parece más o menos brillante que en el lisado
celular después del centrifugado?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
*X Si existe una diferencia notable en la intensidad del color rojo, ¿cuál sería la
razón de la diferencia?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
+
¿Cómo se podría ajustar o modificar la columna para aumentar la pureza de la
muestra de mFP?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
,
Aunque este laboratorio trató sobre la expresión de un gen de la anémona de
mar, citen algunos ejemplos de proteínas humanas que se podrían expresar y
purificar potencialmente usando métodos similares.
.....................................................................................................................................
7.6
Laboratorio 1
8
Extracción de ADN genómico
de células epiteliales bucales
El propósito de este laboratorio es recoger una
muestra de ADN de las células que recubren la parte
interna de la boca y utilizar esta muestra para explorar
una de las técnicas más poderosas de la biología molecular:
la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Aunque la
RCP tiene muchas aplicaciones, se utiliza comúnmente
para producir numerosas copias de un segmento
seleccionado del gen o locus de ADN. Por ejemplo, en la
ciencia forense criminal, la RCP se utiliza para amplificar
la evidencia de ADN de muestras pequeñas que podrían
haber quedado en la escena del crimen. Un técnico experto
hasta puede obtener una muestra de ADN de la saliva que
quedó en la parte posterior de una estampilla postal que
se utilizó para enviar una carta. Las muestras de ADN
obtenidas de esta forma se han utilizado para la RCP en
diversos casos criminales de alto perfil.
Para obtener la muestra de ADN, deberán usar un palillo
de dientes y recoger células epiteliales bucales. Las células
se transferirán a una solución con cuentas de Chelex. Las
cuentas de Chelex ligarán los iones de magnesio bivalentes
(Mg2+). Estos iones sirven a menudo como cofactores para
las nucleasas que degradarán la muestra de ADN y podrían
interferir con la enzima (polimerasa Taq) utilizada en la
reacción. Retirando los iones de magnesio, se reduce la
degradación del ADN genómico que realizan las nucleasas.
Esta mezcla se colocará en agua hirviendo para lisar las
células y liberar el ADN.
8.1
Luego se centrifugan la mezcla de ADN genómico, los
restos celulares y las cuentas de Chelex para que sedimenten
los restos celulares y el Chelex, mientras se mantiene el
ADN genómico en el sobrenadante. Esta es una forma
rápida y sencilla de separar el ADN genómico de los restos
celulares. Sin embargo, la muestra de ADN no es pura, ya
que contiene proteínas y ácidos nucleicos de los organismos
que estaban en la boca al momento de tomar la muestra
(mayormente bacterias y alimentos). Por lo general, estos
contaminantes no inhiben la RCP porque el proceso utiliza
cebadores específicos, es decir, segmentos cortos de ADN
de aproximadamente 25 nucleótidos de largo que pueden
seleccionar sólo el ADN genómico humano. Por lo tanto, si
el sobrenadante porta ADN extraño, no debería interferir en
la selección de los cebadores específicamente humanos. Más
adelante, en este laboratorio se brindará una descripción
más detallada de la RCP y de la función de los cebadores.
Aunque estamos utilizando epitelio bucal como fuente
de ADN, también se pueden usar otros tejidos. Aquí
presentamos la producción de ADN de otros tejidos
humanos: la sangre produce 40 µg/ml; la raíz del cabello
aproximadamente 250 ng/ml; el músculo aproximadamente
3 µg/ml; y el esperma 3.3 pg/célula.
La segunda parte de este laboratorio trata sobre la RCP
real. Utilizarán la muestra de ADN genómico que han
recogido como objetivo para la reacción RCP.
Laboratorio 1
8
Materiales
H;79J?LE
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
0.5 ml de solución de Chelex al 10% Baño María hirviendo
Microcentrifugador
Mezclas maestras I y II
Ciclador térmico
Tubo de microfuga
Marcador indeleble
Palillos de dientes
esterilizados
Métodos
Preparación de la muestra...
'
Tomen un tubo con Chelex. Tengan en cuenta que este tubo está identificado con
un número y una letra. Registren este número y esta letra en sus cuadernos. Sólo
ustedes conocerán este código anónimo.
(
Para recoger células epiteliales bucales, utilicen palillos de dientes esterilizados o
una punta de pipeta amarilla para raspar suavemente la parte interna de ambas
mejillas. Este procedimiento no debe ser invasivo, de manera que no se debe
extraer sangre.
)
Transfieran las células que han recogido del palillo de dientes al tubo con Chelex.
Hagan girar enérgicamente el palillo de dientes en la resina Chelex para quitar
las células.
Es importante que retiren la mayor cantidad de células posible del palillo de
dientes y las coloquen en el tubo con Chelex.
*
Cierren y ajusten bien el tubo con Chelex. Llévenlo a baño María hirviendo o a un
bloque caliente a 100 °C. Hiervan o calienten las células durante 10 minutos. Este
calentamiento lisará las células y ayudará a destruir algunas de las nucleasas que
degradan el ADN.
+
Utilicen el centrifugador a alta velocidad para centrifugar el Chelex y los
restos celulares.
,
Usando la pipeta P-20 y una punta de pipeta limpia, retiren cuidadosamente 20
µl de sobrenadante y colóquenlo en un tubo de microfuga limpio de 1.5 ml. Eviten
aspirar las cuentas de Chelex, ya que aspirarlas inhibiría el proceso de RCP de
salida. Rotulen este tubo con su código personal y anónimo (número).
-
Si no van a utilizar la muestra inmediatamente, déjenla en el frente del salón sobre la
gradilla con el rótulo “Muestras de ADN genómico”. Estas muestras se colocarán
en el refrigerador durante la noche y las tendrán en el siguiente laboratorio.
Las muestras de ADN genómico se pueden conservar en el refrigerador
a 4 °C o en el congelador a –20 °C hasta que estén listas para
ejecutar la reacción RCP.
8.2
Laboratorio 1
8
Amplificación del locus tPA utilizando
la reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa, RCP, es una
técnica de la biología molecular que fue descubierta por
Kary Mullis a comienzos de la década de 1980. La técnica
utiliza una suerte de química elegante y un ciclado termal
exacto de reactivos para dirigir y amplificar una ubicación
específica (locus) a lo largo de la molécula de ADN. Desde
un ADN objetivo único, la RCP puede producir más de
mil millones de copias del objetivo en aproximadamente
una hora y media. Se comprobó que esta poderosa química
es tan importante que Mullis recibió el Premio Nobel de
Química en 1993. Hoy en día, la RCP es considerada un
protocolo estándar en la biología molecular y todos los años
se publican cientos de documentos científicos que utilizan
esta técnica.
el locus, encontramos que puede o no portar un elemento
Alu. En la figura a continuación se indica el intrón que
seleccionaremos para la RCP.
Los elementos Alu son fragmentos cortos, de alrededor de
300 pb de ADN que se distribuyen a lo largo de nuestro
genoma. Se estima que podemos portar más de 1,000,000
de copias de este fragmento. Al parecer, el elemento Alu
forma parte de la codificación de ADN de una molécula
ARN que ayuda a la secreción de polipéptidos recientemente
formados de la célula. A menos que se inserte en un exón o
región de codificación, tiene poco o ningún efecto sobre la
función de la proteína.
La amplificación de ADN por la RPC depende de los
El locus que amplificaremos está ubicado en el gen
cebadores que se dirigen a algunos loci específicos. Los dos
Activador Plasminógeno del tejido (tPA). Este gen se
cebadores que utilizaremos poseen secuencias de nucleótidos
encuentra en el cromosoma 8; el gen representa una proteína únicas que se complementan con sólo un locus en el genoma
que participa de la disolución de coágulos de sangre. El
humano. Las secuencias de los cebadores son:
tPA es una proteína administrada a las víctimas de ataques
Cebador sentido: 5’ G T A A G A G T T C C G T A A C G G A C A G C T 3’
cardíacos para reducir la incidencia de los ataques. No
obstante, la región que amplificaremos está ubicada en un
Cebador antisentido: 5’ C C C C A C C C T A G G A G A A C T T C T C T T 3’
intrón (región no traducida) del gen tPA.
Cromosoma 8
,
3,
5
Exón
Intrón
e
i
gen tPA
e
i
e
i
e
,
5,
3
300bp
Cebador
elemento Alu
Cebador
Alu+ Alelo
400bp
Cebador
Cebador
Alu- Alelo
100bp
El intrón que seleccionaremos para la amplificación es
dimorfo, lo que significa que el locus tiene dos formas.
Una de las formas porta un fragmento de ADN de 300 pb
conocido como el elemento Alu y la segunda forma del locus
no porta este fragmento. Por lo tanto, cuando examinamos
8.3
Laboratorio 1
8
Métodos
'
Tomen la muestra de ADN genómico con su número y el tubo
de RCP rotulado con su código numérico anónimo.
(
El tubo de RCP ya contiene la mezcla
maestra I. Ésta contiene los dos cebadores
que se dirigirán al locus tPA, los dNTP
(trifosfatos desoxinucleótidos: ATP, TTP,
CTP y GTP), la solución reguladora de la
RCP, el agua de grado molecular (muy pura)
y la polimerasa Taq.
Código
numérico
)
Utilizando una punta de pipeta limpia, agreguen 5 µl del ADN
genómico a este tubo de RCP. Añadan con cuidado la muestra
de ADN directamente a la mezcla maestra I de 10µl. Realicen
esto sin crear burbujas.
*
Tapen cuidadosamente el tubo de RCP. Éste es un tubo
con paredes muy delgadas, así que eviten romperlo, pero
asegúrense de que la tapa esté bien colocada sobre la
apertura del tubo.
+
Coloquen el tubo de RCP en la cubeta con hielo mediante el
ciclador térmico.
,
Antes de colocar las muestras en el ciclador térmico, el instructor
agregará 10µl de la mezcla maestra II que contiene MgCl2. La
polimerasa Taq, una enzima de la bacteria Thermus aquaticus,
requiere iones de Mg2+ como cofactores para activarla.
-
Desechen la muestra de ADN genómico.
.
El instructor realizará la reacción RCP en otro momento.
/
Después de realizar la RCP, se cargarán 15 µl del producto
de la RCP en un gel de agarosa al 2%. El gel se teñirá y se
documentará mediante fotografías. Estos pasos los realizará
el instructor.
8.4
Laboratorio 1
8
Conclusiones
Respondan estas preguntas después de ver los resultados de la RCP.
'
¿Cuál es su genotipo con respecto al gen tPA?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
(
¿Cuántos genotipos son posibles con respecto al gen tPA?
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
)
Completen la siguiente tabla usando la información de la clase.
Comiencen determinando la cantidad de cada genotipo presente en la clase.
Genotipos
Alu+ alelos*
Alu– alelos
Total Alu+ alelos
Total Alu– alelos
Alu+ Alu+
Alu+ Alu–
Alu– Alu–
* El término “alelos” se refiere a las formas de un gen o una secuencia de ADN
*
Calculen la frecuencia (porcentaje) de cada genotipo presente.
.....................................................................................................................................
+
Calculen la frecuencia de cada alelo presente en la clase.
.....................................................................................................................................
,
Comparen sus resultados con otras clases.
¿Existe alguna diferencia en la frecuencia relativa de los genotipos y los alelos?
.....................................................................................................................................
8.5
Laboratorio 1
8
Glosario
Glosario
a
Ampicilina: antibiótico usado comúnmente que
pertenece a la familia de la penicilina. La ampicilina
impide que el material nuevo de la pared celular
se una adecuadamente en la bacteria. Esta pared
celular debilitada impedirá el crecimiento de nuevas
bacterias.
Ácido nucleico: molécula grande que consta de
subunidades ligadas al núcleo; polímero de nucleótidos.
Ver también: ADN, nucleótido, polímero, ARN.
Adenina: base que contiene nitrógeno, miembro
del par de bases AT (adenina-timina). La adenina se
encuentra tanto en el ADN como en el ARN.
Amplificación: aumento en la cantidad de copias de un
fragmento específico de ADN.
Ver también: clonación, reacción en cadena de la
polimerasa.
ADN (ácido desoxirribonucleico): molécula que
codifica la información genética. El ADN es una
molécula bicatenaria unida mediante enlaces de
hidrógeno entre los pares de bases de los nucleótidos.
Es el material hereditario.
Ver también: enlaces de hidrógeno, pares de base,
nucleótido.
Ampr: símbolo utilizado para denominar al gen
resistente a la ampicilina. Este símbolo se ubica en el
plásmido pARA.
Ver también: pARA, plásmido.
Antibiótico: sustancia que mata o impide la producción
de células.
Ver también: ampicilina, kanamicina.
ADN ligasa: enzima que une las cadenas de ADN
formando enlaces químicos covalentes en la cadena
de azúcar-fosfato.
Ver también: enlace químico covalente.
ARN mensajero (ARNm): molécula de ácido nucleico
que transporta información genética desde los genes
hacia el resto de la célula para la síntesis de proteínas.
ADN polimerasa: enzima utilizada para reproducir
moléculas de ADN. La RCP utiliza la ADN
polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus que se
denomina polimerasa Taq.
Ver también: reproducción de ADN, reacción en
cadena de la polimerasa.
Agarosa: polisacárido altamente purificado
(carbohidrato complejo) que se usa comúnmente en
la electroforesis en gel.
Ver también: electroforesis.
Alelo: forma alternativa de un locus genético; se hereda
un alelo simple por cada locus de cada padre (por
ej: en un locus para el color de una flor, el resultado
podría ser pétalos púrpura o blancos).
Ver también: locus.
Alícuota: muestra de una parte de un todo
(Por ej.: una muestra de un plásmido o una muestra
de células).
Aminoácido: cualquiera de más de 20 moléculas que
se combinan para formar proteínas. La secuencia
de aminoácidos de una proteína y por lo tanto, la
función de la misma son determinadas por el código
genético.
Glosario A - B
Aspirar: extraer o tomar.
Autosoma: cromosoma que aparece en pares homólogos
tanto en machos como hembras y no porta los genes
que determinan el sexo.
b
ß-lactamasa: enzima codificada por el gen ampr
que destruye la ampicilina.
Base: una de las moléculas que contienen nitrógeno
que distingue un nucleótido de otro. En el ADN,
las bases son la adenina, la guanina, la citosina y la
timina.
Ver también: nucleótido, par de bases,
secuencia base.
Base que contiene nitrógeno: componente
molecular de los nucleótidos del ADN y el ARN. En
el ADN existen cuatro bases que contienen nitrógeno:
A (adenina), G (guanina), T (timina), C (citosina).
Biotecnología: conjunto de técnicas biológicas
desarrolladas a través de investigaciones básicas
y aplicadas actualmente en el desarrollo de
investigaciones y productos. Particularmente,
Glosario
la biotecnología se refiere al uso industrial del
ADN recombinante, la fusión celular y las nuevas
técnicas de bioprocesamiento.
de proteínas.
Ver también: codones, ARNm.
Codón: grupo de tres bases de ARNm que codifica un
aminoácido simple.
Ver también: aminoácido, ARNm.
c
Cáncer: enfermedad en la que células anormales se
Columna de cromatografía: instrumento que se
Cancerígeno: causante del cáncer que origina cambios
Competentes: células capaces de incluir ADN
utiliza para separar una mezcla de moléculas.
dividen y crecen sin control.
de plásmido.
Ver también: transformación.
en el ADN de una célula.
Cebador: cadena corta y preexistente de
polinucleótidos a la cual se pueden agregar nuevos
nucleótidos mediante la ADN polimerasa. Se utilizan
dos cebadores diferentes para dirigir el locus tPA
amplificado mediante la RCP.
Cromosoma: en las células eucariotas, una cadena
lineal compuesta de ADN y proteína, ubicada en
el núcleo de la célula que contiene los genes; en las
células procariotas, una cadena circular compuesta
únicamente de ADN. En los humanos, existen 23
pares de cromosomas en las células del cuerpo.
Célula: unidad básica de cualquier organismo viviente
que porta los procesos bioquímicos de la vida.
Células somáticas: células que conforman el cuerpo
Cromosomas homólogos: cromosoma que contiene
la misma secuencia genética lineal que otra, cada
una derivada de un padre. Aunque la secuencia
genética es (generalmente) la misma, los alelos
precisos pueden diferir entre cromosomas.
Ver también: alelo, cromosoma, gen.
y no son células sexuales o gametos. Estas células
generalmente son diploides y tienen dos conjuntos de
cromosomas.
Ver también: gametos
Ciencia forense: ciencia especializada en la aplicación
de conocimientos científicos en asuntos legales. El
ADN se utiliza con frecuencia como evidencia en
cuestiones legales.
Citosina: una de las bases que contienen nitrógeno
y se encuentra en el ADN y el ARN. Se
complementa con la guanina.
Ver también: par de bases, nucleótido.
Clonación: utilización de tecnología especializada de
ADN para producir varias copias exactas de un solo
gen u otro segmento de ADN. Un segundo tipo de
clonación utiliza el proceso natural de división celular
para realizar muchas copias de una célula entera.
La composición genética de estas células clonadas,
denominada línea celular, es idéntica a la célula
original. Un tercer tipo de clonación produce animales
y plantas completa y genéticamente idénticos.
Ver también: vector de clonación.
Código genético: secuencia de nucleótidos codificados
en tríos (codones) junto con el ARNm, que
determina la secuencia de aminoácidos en la síntesis
d
Degradar: disminuir la calidad; convertir en un
componente más simple; descomponer.
Desnaturalización: fundición del ADN a altas
temperaturas en cadenas de nucleótidos simples;
cambiar la forma tridimensional de una molécula
de proteína.
Desoxirribosa: tipo de azúcar de cinco carbonos
que se encuentra en ADN.
Ver también: ADN.
Doble hélice: estructura en la cual dos cadenas de
ADN están torcidas en espiral alrededor una de la otra.
e
Electroforesis: movimiento de las moléculas cargadas
hacia un electrodo de carga opuesta; se utiliza para
separar ácidos nucleicos y proteínas. Cuando se utiliza
para separar fragmentos de ADN, la electroforesis
Glosario C - E
Glosario
separa los fragmentos por tamaño, ya que los
fragmentos más pequeños se mueven más rápido que
los más grandes.
Elemento Alu: pieza de 300 pares de bases de ADN
que ha sido insertada de forma aleatoria en todo
el genoma. Ya no parece tener ninguna función en
el genoma humano. Este fragmento específico de
ADN se denomina elemento “Alu” porque porta
una secuencia de reconocimiento de la enzima de
restricción Alu.
Ver también: genoma, secuencia de reconocimiento,
enzima de restricción.
numerosas mutaciones aleatorias. Esas mutaciones
luego se examinan o analizan en cuanto a sus
propiedades.
Expresar: crear una proteína.
Ver también: vector de expresión
Expresión génica: proceso mediante el cual la
información codificada del gen se convierte en
las estructuras presentes y operativas de la célula.
Los genes expresados incluyen aquellos que se
transcriben en el ARNm y luego se traducen como
proteínas.
Ver también: ARNm.
Eluato: solución que lava (por ej: soluciones
que gotean desde la columna de cromatografía)
Ver también: columna de cromatografía.
Extremos cohesivos: extremos de una molécula de
ADN cortada con determinadas enzimas de restricción.
Estos extremos tienen bases no apareadas.
Enlace de hidrógeno: fuerza débil que resulta de la
atracción de un átomo de hidrógeno positivo hacia
las regiones con carga negativa de otros átomos.
Ésta es la fuerza que mantiene unidas las dos
cadenas de nucleótidos en la molécula de ADN.
Los pares de base GC forman tres enlaces de H, en
tanto los pares AT forman dos.
Enlace químico covalente: una de las fuerzas que
mantiene unidos a los átomos de una molécula. Se
considera un enlace fuerte y se forma al compartir
los electrones entre dos átomos.
Enzima: proteína que actúa para acelerar las
Exón: segmento de un gen que codifica las regiones
de una proteína.
Ver también: intrón.
f
Fago: virus cuyo huésped natural es una célula
bacterial.
Fenotipo: característica que se debe a la expresión
de nuestros genes; generalmente se refiere a las
propiedades visibles, pero se puede referir a las
características reveladas mediante exámenes de
laboratorio.
reacciones químicas.
Enzima de restricción: enzima que une y corta
el ADN en una secuencia base específica(por ej:
Bam H I y Hind III).
Ver también: secuencia de reconocimiento
Fragmento de restricción: pieza de ADN que se
origina cuando la molécula de ADN se corta con una
enzima de restricción. Los fragmentos a menudo se
separan en un gel mediante la electroforesis.
Escala de kilobase: Conjunto de fragmentos de
ADN estándar con longitudes que difieren en un
kilobase; se utiliza como tamaño estándar en la
electroforesis.
Ver también: electroforesis.
Fluorescencia: producción de luz de una molécula
(por ej: la proteína fluorescente roja libera luz
roja cuando se expone a la luz ultravioleta). La
proteína utilizada en los Laboratorios Amgen se
puede ver con luz ambiente.
Esherichia coli: bacteria común utilizada en
numerosos protocolos de biología molecular. La
cepa de E. coli utilizada en los protocolos de Amgen
es relativamente inofensiva y no se reproduce con
facilidad fuera del medio del laboratorio.
g
Gameto: célula reproductora masculina o femenina
madura.
Estado natural: la producción original o natural de
un gen o una proteína.
Eucariota: organismo que alberga sus genes dentro
de un núcleo y cuenta con numerosos cromosomas
lineales.
Evolución dirigida: procedimiento experimental
que utiliza la RCP que causa la producción de
Glosario E - G
Gen: unidad física y funcional fundamental de la
herencia; secuencia ordenada de nucleótidos ubicada
en un locus que codifica un producto funcional
específico.
Ver también: expresión génica.
Genética: estudio de la herencia.
Genoma: todo el material genético de los cromosomas
Glosario
de un organismo en particular; su tamaño se
expresa generalmente mediante su cantidad total de
pares de base.
Genotipo: combinación de alelos que porta un individuo
para un rasgo específico.
Ver también: alelo, fenotipo.
Guanina: una de las bases que contiene nitrógeno
que se encuentra en el ADN y el ARN. Se
complementa con la citosina.
Ver también: par de bases, nucleótido.
Kilobase (kb): unidad de longitud de los fragmentos
de ADN igual a 1000 pares de nucleótidos.
l
Ligasa: enzima requerida para unir covalentemente
dos fragmentos de ADN.
Ligación: reacción que une químicamente dos
fragmentos de ADN dando como resultado una
molécula de ADN recombinante.
h
Lisis: abrirse.
Haploide: conjunto simple de cromosomas presente
Locus: lugar o ubicación en un cromosoma, puede ser
en los gametos de las plantas y los animales. El
número haploide en los humanos es de 23.
Ver también: diploide.
Heterócigo: las dos copias diferentes, o alelos, del
mismo gen.
Ver también: alelo, gen, homócigo.
Hidrófilo: que tiene afinidad por el agua; se disuelve
en agua; polar.
Algunos ejemplos incluyen el azúcar y la sal.
Hidrófobo: que rechaza el agua; no se disuelve en
un gen o simplemente cualquier sitio con variaciones
mensurables. (por ej: Alu+, Alu- en el intrón tPA).
m
Mapa de restricción: diagrama de ADN, como un
plásmido, que indica los sitios de restricción para las
enzimas de restricción.
Marcador: Ver: escala de kilobase.
Molécula de ADN recombinante: combinación de
moléculas de ADN de diferente origen que se unen
mediante técnicas de recombinación de ADN.
Ver también: ligación.
agua; no polar. Algunos ejemplos incluyen aceite,
cera y proteína fluorescente mutante.
Homócigo: que tiene dos copias idénticas, o un alelo
del mismo gen.
Ver también: alelo, gen, heterócigo.
Mutágeno: agente que puede causar mutaciones.
Ver también: cancerígeno
n
l
Ingeniería genética: alteración del material genético
de las células u organismos para permitirles crear
sustancias nuevas o desempeñar nuevas funciones.
Intrón: segmento de un gen que no codifica una
proteína. Los intrones se transcriben en el ARNm
pero se eliminan antes de ser traducidos como
proteínas.
Ver también: exones, ARNm, transcripción,
traducción.
Nucleasa: familia de enzimas que degradan los ácidos
nucleicos.
Ver también: degradar, enzima
Nucleótido: subunidad o monómero del ADN y el
ARN. Cada nucleótido consta de una base con
nitrógeno, un azúcar de cinco carbonos y un grupo
de fosfato.
o
k
Kanamicina: antibiótico que mata las células no
Operón: aglomeración de genes transcriptos para dar
una sola molécula de ARNm. El operón arabinosa
se utiliza en el vector de expresión pARA para
transcribir el gen rfp.
resistentes inhibiendo la síntesis de proteínas.
kan r : símbolo del gen resistente a la kanamicina que
se encuentra en el pKAN plasmídico; codifica una
enzima llamada fosfotransferasa que desactiva la
kanamicina.
p
Pared celular: estructura que brinda a las células
apoyo físico; rodea las células bacteriales.
Glosario H - P
Glosario
transformadas con pARA-R.
Par de bases: dos bases de nitrógeno (adenina y
timina o guanina y citosina) unidas por enlaces
de hidrógeno. Dos cadenas de ADN están unidas
en forma de doble hélice por los enlaces entre los
pares de base. La suma de los pares de base en una
molécula de ADN se utiliza frecuentemente para
expresar el tamaño de la molécula.
Par de bases complementarias: bases que
contienen nitrógeno y que se encuentran enfrentadas
entre sí en una molécula de ADN bicatenaria. La
complementariedad es el resultado del tamaño
(una base grande debe estar enfrentada a una base
pequeña) y la cantidad de enlaces de hidrógeno
entre las bases adyacentes del par (A y T forman
dos enlaces de hidrógeno, G y C forman tres). La
adenina se complementa con la timina y la guanina
se complementa con la citosina.
Proteína fluorescente verde: proteína producida por
la medusa marina, Aequoria victoria; proteína
codificada por el gen gfp.
q
Quimera: animal mítico formado por numerosos
animales diferentes. En la biología molecular, se usa
frecuentemente para describir una molécula de ADN
recombinante.
r
Reacción en cadena de la polimerasa (RCP):
procedimiento químico utilizado para amplificar
una secuencia de ADN mediante ciclos repetidos de
reproducción y desnaturalización.
Plásmido: molécula circular de ADN que se reproduce
independientemente del ADN genómico del huésped
(por ej: pKAN, pARA).
Polimerasa Taq: enzima con estabilidad térmica
comúnmente utilizada en la RCP; la polimerasa que
se encuentra en la bacteria Thermus aquaticus.
Ver también: reacción en cadena de la polimerasa.
Polímero: molécula grande formada por subunidades
similares o idénticas unidas entre sí (por ej: ADN,
ARN, proteínas).
Polimorfismo: diferencia en la secuencia de ADN en
un locus genético particular. Las diferencias pueden
resultar o no en un fenotipo distinto.
Ver también: locus, fenotipo.
Polimorfismo genético: diferencia en la secuencia de
ADN entre individuos, grupos o poblaciones (por ej:
alelos para el locus tPA amplificados por la RCP, o la
altura en las plantas de guisantes, altas o bajas).
Portador: individuo que posee un alelo
no expresado y recesivo.
Procariota: célula u organismo con un solo
cromosoma y sin membrana nuclear; bacterias.
Promotor: región del ADN al frente de un gen que
une la ARN polimerasa y promueve de esta forma
la expresión génica; en el operón ara, la región
de pARA que une el complejo de proteína AraCarabinosa y la ARN polimerasa antes de la expresión
del gen rfp.
Proteina: polímero grande de aminoácidos. Algunos
ejemplos incluyen: enzimas, proteína fluorescente
mutante y algunas hormonas.
Proteína AraC: proteína necesaria para la expresión
de la proteína fluorescente mutante en las células
Glosario P - T
Reproducción de ADN: uso del ADN existente como
plantilla para la síntesis de cadenas nuevas de ADN.
Ribosa: azúcar de cinco carbonos que se encuentra en
los nucleótidos del ARN.
Ribosoma: sitio dentro de la célula que reúne los
aminoácidos en moléculas de proteína.
s
Secuencia base: orden de las bases de nucleótidos
en una molécula de ADN; determina la estructura
de las proteínas codificadas por dicho ADN.
Secuencia de reconocimiento (sitio de
reconocimiento): secuencia base específica de
nucleótidos reconocida por una enzima de restricción.
La enzima corta el ADN dentro de esta secuencia de
nucleótidos.
Solución reguladora: solución utilizada para
mantener un óptimo medio fisicoquímico para que
se produzca una reacción química. Las soluciones
reguladoras se utilizan en las digestiones de
restricción, las ligaciones y para la RCP.
Solución reguladora de NaB: solución de borato de
sodio utilizada como reguladora en la electroforesis.
Es una solución que conduce una corriente eléctrica
y mantiene un pH relativamente constante.
Ver también: TBE
Superenrollada: mayor nivel de contorsión del ADN
que se encuentra a menudo en los plásmidos.
Glosario
t
TBE (ácido tris-borato-EDTA): solución utilizada para
la electroforesis en gel y en la preparación de geles de
agarosa. La solución ayuda a conducir la corriente
eléctrica mientras que mantiene un pH constante.
Timina: una de las bases que se encuentran en el ADN;
la base que se complementa con la adenina.
Traducción: proceso químico que convierte una
secuencia de nucleótidos de ARNm en una secuencia
de aminoácidos; el sitio de esta reacción es el
ribosoma.
Transcripción: proceso químico que convierte una
secuencia de nucleótidos de ADN en una secuencia
de nucleótidos de ARNm; proceso que utiliza
ARN polimerasa para convertir una plantilla de
ADN en una cadena de ARNm.
Transformación: proceso que coloca ADN extraño,
como un plásmido, dentro de una célula.
v
Vector: Ver: vector de clonación, vector de expresión.
Vector de clonación: molécula de ADN que se origina
a partir de un virus, un plásmido o la célula de un
organismo superior, en el que otro fragmento de ADN
de tamaño adecuado se puede integrar sin perder la
capacidad del vector de autorreproducirse; los vectores
son diseñados para introducir ADN extraño a las
células huésped, donde el ADN se puede reproducir
en grandes cantidades. En los laboratorios Amgen, se
utiliza el pKAN para clonar varias copias del gen rfp.
Ver también: vector de expresión, plásmido.
Vector de expresión: plásmido diseñado
genéticamente para expresar de forma específica los
genes (por ej: pARA).
Ver también: vector de clonación, plásmido.
Glosario T - V