produccion de muteinas recombinantes de factor de coagulacion

19
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 254 403
51 Int. Cl. : C12N 15/12, C07K 14/745
7
C07K 14/755, C12N 15/57
C12N 9/64, A61K 38/36
A61K 38/37, A61K 38/43
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 01927769 .8
86 Fecha de presentación : 21.03.2001
87 Número de publicación de la solicitud: 1266006
87 Fecha de publicación de la solicitud: 18.12.2002
54 Título: Producción de muteínas recombinantes de factor de coagulación sanguínea VIII en líneas de células
humanas.
30 Prioridad: 22.03.2000 EP 00106225
08.05.2000 US 203249 P
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.06.2006
73 Titular/es: Octagene GmbH
Am Klopferspitz 19
82152 Martinsried, DE
72 Inventor/es: Hauser, Charlotte;
Hörster, Andrea;
Schröder, Carola y
Lehnerer, Michael
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Carpintero López, Francisco
ES 2 254 403 T3
16.06.2006
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
ES 2 254 403 T3
DESCRIPCIÓN
Producción de muteínas recombinantes de factor de coagulación sanguínea VIII en líneas de células humanas.
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La presente invención se refiere a muteínas mejoradas del factor VIII, un procedimiento para la producción de tales
muteínas del factor VIII, composiciones farmacéuticas que comprenden tales muteínas del factor VIII y el uso de tales
muteínas del factor VIII para preparar un medicamento para tratar la hemofilia.
Sumario de la técnica relacionada
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Los hemofílicos están sufriendo de morbilidad hemorrágica provocada por la función alterada de componentes
proteicos de la cascada de coagulación de la sangre. Dependiendo del factor de coagulación afectado se pueden distinguir dos tipos de hemofilia. Ambos tienen en común la conversión inhibida de fibrinógeno soluble a un coágulo
de fibrina insoluble. Son enfermedades genéticas recesivas unidas al cromosoma X que afectan principalmente a la
población masculina.
La hemofilia A afecta 1-2 individuos por 10.000 varones. Está provocada por la deficiencia o ausencia del factor
VIII, una glicoproteína muy grande (de aproximadamente 330 kDa (Furie B., Furie B. C., Cell (1988) 53, 505-518)),
que representa un elemento importante de la cascada de coagulación de la sangre. La secuencia de polipéptidos se
puede subdividir en tres regiones, una región N-terminal que está constituida por los llamados dominios A1 y A2, una
región central del dominio B y una región C-terminal compuesta por los dominios A3, C1 y C2 (M. L. Liu y col.,
British J. Haematol. 103: 1051-1060 (1998)). En la coagulación de la sangre el factor VIII el factor VIII se presenta
como un precursor inactivo. Está unido estrechamente y no covalentemente al factor de von Willebrand (vWf), que
actúa como una proteína vehículo estabilizante. La escisión proteolítica del factor VIII mediante la trombina en tres
posiciones específicas (740, 372, 1689) conduce a su disociación de vWf y libera la función procoagulante dentro de
la cascada. En su forma activa el factor VIII funciona como un cofactor para el factor IXa, acelerando por lo tanto la
activación proteolítica del factor X en varios ordenes de magnitud.
La Hemofilia B se presenta en aproximadamente 1 de 25.000 varones. Está caracterizada por la deficiencia del
factor IX de la serina proteasa (factor Christmas). Este polipéptido de 415 aminoácidos se sintetiza en el hígado como
una glicoproteína de 56 kDa. Con el fin de alcanzar su función apropiada se requiere una etapa de carboxilación
postraduccional que solamente aparece en presencia de la vitamina K.
El tratamiento de ambos tipos de trastorno de sangrado tradicionalmente implica infusiones de concentrados de
proteína derivados de plasma humano del factor VIII o factor IX. Aunque este procedimiento representa una terapia
eficaz para hemofílicos lleva el riesgo de transmisión de diversos agentes infecciosos, tales como virus que provocan
hepatitis o SIDA, o factores tromboembólicos. Como alternativa se han descrito diversas técnicas de ADN recombinantes para la producción de factores de coagulación. Para este propósito los ADNc correspondientes del factor VIII
y factor IX de tipo salvaje se han usado y clonado en vectores de expresión adecuados (documentos EP-A-160457;
WO-A-86/01961; patentes de Estados Unidos números 4.770.999. 5.521.070 y 5.521.070).
En el caso del factor VIII se conoce en la técnica la expresión de subunidades para la producción de complejos que muestran actividad coagulante (por ejemplo, a partir de los documentos EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A0500734, WO-91/074490, WO-95/13300, las patentes de Estados Unidos 5.045.455 y 5.789.203). Además, se ha descrito la expresión de versiones de ADNc parcial o completamente carecen de la secuencia que codifica el dominio B
altamente glucosilado (por ejemplo, en los documentos WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381,
WO-94/29471, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, las patentes de Estados Unidos números 4.868.112 y
4.980.456, documentos EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 y WO-91/09122). Más recientemente se han introducido una diversidad de mutaciones puntuales seleccionadas para inhibir la inactivación proteolítica del factor
VIII por la proteína activada C o para reducir la inmunogenicidad que da como resultado la formación de anticuerpos inhibidores por lo pacientes tratados (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.859.204, 5.422.260 y
5.451.521, los documentos WO-97/49725, WO-99/298848.
Los factores de coagulación recombinantes se aislaron usualmente a partir de líneas celulares eucarióticas y preferiblemente de mamíferos. Sin embargo, era práctica general emplear líneas celulares no humanas en los procedimientos
de producción descritos en las referencias mencionadas en esta memoria descriptiva antes con el fin de excluir el riesgo
de copurificar algunos agentes infecciosos que pueden estar albergados y expresados por células humanas.
Sin embargo, especialmente para el factor VIII, el uso de líneas celulares no humanas encontró ciertas desventajas.
Por ejemplo se han reseñado niveles de secreción insatisfactorios de al proteína expresada en el medio. Esto se puede
deber a ligeras diferencias dentro de diferentes tipos de células de mamíferos concernientes a rutas intracelulares para
la traducción y modificación de proteínas, que también pudiera tener efecto en al actividad biológica del polipéptido
expresado. Aparte de esto, había preocupación en que las proteínas purificadas de sistemas de expresión no humanas
estén contaminados con componentes celulares que pueden dar lugar a reacciones antigénicas en los pacientes.
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Además, las proteínas expresadas por sistemas de expresión no humanos pueden tener patrones de glucosilación
no humanos que dan lugar a reacciones antigénicas en el paciente. Sin embargo, la estabilidad y eficacia biológica
de los factores de coagulación está sustancialmente influenciada por su patrón de N-glucosilación. Especialmente
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monosacáridos periféricos y terminales son importantes, debido a que están detectados por receptores específicos
de células que son responsables de su degradación. Los factores de coagulación llevan como monosacáridos siálicos
residuos de ácido siálico. La modificación en la composición de ácidos siálicos en los salientes de glucoproteínas como
por ejemplo los factores de coagulación pueden dar como resultado patrones de glucosilación heterogéneos. De este
modo, la estabilidad y eficacia biológica está implicada crucialmente cuando se produce modificación. Por lo tanto, es
una importante consideración en la producción de factores de coagulación recombinantes para evaluar la influencia de
glucosialción de líneas celulares de producción no humanas frente a líneas celulares humanas. Hablando en términos
generales, parece plausible que las líneas celulares humanas están más cualificadas para la producción de factores de
coagulación recombinantes que no humanas. La razón de esta suposición es que probablemente ningún oligosacárido
extraño se incorporará en el resto oligosacárido durante la síntesis de factores recombinantes.
Por otra parte, los procedimientos generales para el alto nivel de expresión de proteínas de un gen deseado que
comprende líneas celulares de mamíferos de células de mamíferos inmortalizadas, establemente transfectadas que
expresan proteínas activadoras de transcripción viral se han hecho disponibles durante algún tiempo (por ejemplo, la
patente de Estados Unidos Nº 5.712.119). Adicionalmente estas líneas celulares se transforman con una construcción
de vector en la que un promotor de transcripción viral adecuado está operativamente asociado a una secuencia de
ADN que define un gen de interés, las proteínas activadoras de transcripción activan el promotor de transcripción viral
y por lo tanto inician la expresión del gen de interés. De nuevo, había preocupación en que las proteínas activadoras
de transcripción expresadas por estas líneas celulares puedan dar lugar a contaminaciones en al proteína terapéutica
diana.
En vista de lo anterior existe todavía una necesidad de un procedimiento de producción eficaz para factores de
coagulación de sangre humana.
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Sorprendentemente, se encontró que un factor de coagulación de sangre no contaminada se puede obtener con las
líneas celulares humanas inmortalizadas mencionadas anteriormente. En particular, las líneas celulares inmortalizadas
-si llevan un vector que tiene un promotor unido funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica el factor de
coagulación de sangre y a pesar de que el hecho de que el promotor no es un promotor viral está estimulado por dichas
proteínas activadoras de transcripción- son capaces de expresar el factor de coagulación de sangre. En combinación
con la purificación de proteínas adecuada y protocolos de inactivación de virus este procedimiento proporciona un
sistema eficaz para producir factores de coagulación de sangre de sangre recombinantes altamente activos para aplicaciones terapéuticas en seres humanos. Además, las muteínas del factor VIII particulares se encontraron que son
excepcionalmente estables contra la inactivación proteolítica y de este modo están sometidas a protocolos vigorosos
de inactivación de virus.
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Sumario de la invención
La presente invención proporciona
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(1) una muteína del factor VIII en al que el dominio B entre las posiciones Arg 740 y Glu 1649 se han reemplazado por un péptido de engarce rico en Arg que tiene al menos 3 residuos Arg y que comprende 10 a 25
restos de aminoácidos, en los que la numeración de dicho factor VIII está en relación con la secuencia del
factor VIII de tipo salvaje maduro mostrada en la SEQ ID Nº 2.
45
(2) Una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII como se ha definido en (1) anteriormente;
(3) Un vector que comprende el ADN como se ha definido en (2) anteriormente;
(4) Un vector como se ha definido en (3) antes que es un vector de transferencia de gen;
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(5) una célula hospedadora que se transforma con un vector como se ha definido en (3) antes y/o que comprende
una secuencia de ADN como se ha definido en (2) antes;
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(6) Un procedimiento para la producción de la muteína del factor VIII como se ha definido en (1) antes que
comprende
(a) cultivar una célula hospedadora transformada como se ha definido en (5) antes, y
(b) aislar la muteína del factor VIII a partir del caldo de cultivo;
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(7) Una composición farmacéutica que comprende al muteína del factor VIII como se ha definido en (1) antes
o un vector de transferencia de genes como se ha definido en (4) antes;
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(8) el uso de la muteína del factor VIII como se ha definido en (1) antes o un vector de transferencia de genes
como se ha definido en (4) antes para preparar un medicamento para tratar hemofilia;
(9) una realización preferida del procedimiento de (6) anterior, que comprende
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(a) cultivar una línea celular humana inmortalizada que expresa establemente el antígeno T del virus de
Simio y que lleva un vector que lleva un vector que tiene un promotor de CMV unido funcionalmente
a una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII; y
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(10) una línea celular humana inmortalizada que lleva un vector que codifica una muteína del factor VIII como
se ha definido en el procedimiento de (9) antes.
Descripción de las figuras
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La figura 1 muestra los fragmentos utilizados para la construcción del factor VIII con un dominio B suprimido
(ejemplo 1).
La figura 2 muestra el vector pTGF8-1, de ADN circular de 8720 pares de bases, la secuencia exacta de ADN del
mismo se proporciona en la SEQ ID Nº 3 (para la proteína del factor VIII codificada por dicha secuencia de ADN
véase la SEQ ID Nº 4).
La figura 3 muestra una secuencia de engarce preferida de la presente invención (SEQ ID Nº 9).
La figura 3 B muestra el tiempo de coagulación de hFVIII como se determina en el ejemplo 6.
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La figura 4 muestra la estructura molecular común de pTGF8-2-hyg-s y pTGF8-3, de AD circular de 10698 pares
de bases, las secuencias de ADN exacta de los mismos se proporcionan en las SQ ID números 12 y 14 (para la proteína
del factor VIII codificada por dichas secuencias de ADN véase las SEQ ID números 13 y 15).
25
La figura 5 A muestra la curva de calibración de ELISA de FVIII como se describe en el ejemplo 4.
La figura 5 B muestra los resultados de la determinación de las concentraciones de FVIII recombinante en los
diferentes filtrados de cultivos como se describe en la figura 4.
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La figura 6 muestra los resultados de un ensayo de inmunofluorescencia específico del factor VIII como se describe
en el ejemplo 8. Fila superior: células 293 T transfectadas de manera estable con pTGF8-3, clon 49/19. Fila inferior:
control, negativo: células 293T no transfectadas. A y C: luz blanca, sin filtro; B y D: detección del factor VIII mediante
fluorescencia, filtro 550 nm.
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Descripción detallada de la invención
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“Unido funcionalmente” se refiere a las configuraciones del vector en las que el promotor está localizado dentro del
vector de tal manera que puede estimular la transcripción de la secuencia de ADN que codifica el factor de coagulación
de sangre humano. “Unido no funcionalmente” se refiere a una configuración en la que el promotor está así localizado
de manera remota a partir de la secuencia de genes expresada del factor de coagulación de sangre que no puede
estimular su transcripción.
“Gen” se refiere a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que incluye opcionalmente secuencias guía
y de remolque e intrones y exones.
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“Vector” se refiere a cualquier construcción genética, tal como plásmido, fago, cósmico, etc., que es capaz de
replicación cuando se asocia con los elementos de control apropiados. El término incluye vehículos de clonación y
expresión. “Que lleva un vector” incluye tanto la incorporación estable como transitoria de un segmento de ADN
funcional en la célula hospedadora. Si embargo se prefiere a incorporación estable.
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“Vector de transferencia de genes” de acuerdo con la presente invención incluye un vector adecuado para terapia
génica. Tal vector comprende secuencias funcionales para los propósitos deseados como se conoce en la técnica.
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El término “madura” se refiere a la estructura molecular de una proteína dada directamente después de su secreción
celular (es decir, que carece de su polipéptido de señal de exportación N-terminal).
“Promotor” se refiere a una región de secuencias de ADN regulador para la transcripción de un gen al que se une
la ARN polimerasas.
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“Dosis terapéuticamente eficaz” de la composición farmacéutica de al invención se refiere a una dosis eficaz para el tratamiento de profilaxis, por ejemplo, una dosis que produce tratamiento o reducción eficaz de los síntomas
de hemofilia. La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está dentro del alcance de los expertos en la
técnica.
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“Codifica” o “que codifica” se refiere a una propiedad de la secuencia de ácidos nucleicos que se transcribe (en el
caso de ADN) o se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control
de una secuencia reguladora apropiada.
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Para el propósito de esta solicitud “expresa”, “que expresa” o “expresión” se refiere a la transcripción y traducción
de un gen que codifica una proteína.
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La presente invención como se ha descrito en (1) a (10) anteriormente se describe en esta memoria descriptiva
posteriormente en más detalle. De acuerdo con la realización (9) de al invención de la presente solicitud el promotor
de CMV unido funcionalmente a la secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII no se estimula por el
antígeno T del virus de simio expresado por la línea celular humana inmortalizada.
La línea celular humana inmortalizada preferiblemente es una célula de riñón, vejiga, hígado, pulmón, músculo
cardíaco, músculo liso, ovario o gastrointestinal. Más preferiblemente la línea celular humana inmortalizada se deriva
de una célula de riñón humano y lo más preferiblemente es una línea celular 293 T (ECACC: tsa201, ref. 96121229;
DSM ACC494).
La línea celular inmortalizada - además del antígeno T del virus de Simio expresa adicionalmente proteínas activadoras tal como proteínas E1A o E1B de adenovirus, una proteína codificada por la secuencia de ADN de la región del
virus de papelona bovino y las proteínas IE del virus herpes. Preferiblemente la célula inmortalizada expresa al menos
dos proteínas activadoras de transcripción, por ejemplo, un antígeno SV40 T sensible a la temperatura y una proteína
E1A de adenovirus (tal como la línea celular 293 T anterior).
De acuerdo con la invención el vector utilizado en la realización (9) de la invención puede llevar promotores virales
adicionales que se estimulan mediante dichas proteínas activadoras de transcripción, pero que no están funcionalmente
unidas al factor de coagulación de sangre. Tales promotores virales se seleccionan entre los promotores derivados de
adenovirus, virus de sarcoma de Rous y citomegalovirus. El vector puede además comprender una o más de las
secuencias funcionales: marcadores de selección, secuencias reguladoras (por ejemplo, PRE), etc.
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La realización (1) de la invención se refiere particularmente a una muteína del factor VIII. Como se ha expuesto
anteriormente, varias construcciones de expresión del factor VIII modificado se han diseñado para la expresión recombinante. Considerando al estructura del dominio de los sitios funcionales de interacción importantes de los polipéptidos
del factor VIII con vWF se localizan en el dominio A3 (aminoácido 1680-1689) y el dominio C2 (Kaufman y Pipe,
Haemophilia (1998) 4, 370-379). La escisión después de 1689 se propuso liberar el factor VIII de vWF y permitir
que el factor VIII interactúe con fosfolípidos cargados. Las construcciones recombinantes del factor VIII que carecen
del sitio de unión a vWF se mostró que eran extremadamente propensos a digestión proteolítica cuando se inyectan
en ratones deficientes en el factor VIII. La expresión recombinante de las construcciones del factor VIII truncadas en
cultivos de células de mamíferos demostraron que al supresión completa del dominio B no alteraba la actividad biológica de la proteína de tipo factor VIII correspondiente (Eaton y col., Biochemistry (1986) 25, 8343-8347). Además
de las velocidades de expresión observadas de las construcciones suprimidas del dominio B eran significativamente
mayores comparadas con el factor VIII de tipo salvaje debido a un incremento del nivel de ARNm en las células
(Pittman y col., Blood (1993) 81, 2925-2935). Cuatro productos recombinantes del factor VIII (Recombinate® Baxter
HealthCare; Kogenate® y Kogenate FS® Bayer Corporation y Refacto® Wyeth, Genetics Institute) están actualmente
en el mercado.
En la realización (1) de la invención, la muteína del factor VIII puede tener al menos una de las siguientes mutaciones adicionales (a) a (c):
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(a) Val en la posición 162 se ha reemplazado por un resto aminoácido neutro seleccionado entre Gly, Ala, Leu,
Ile, Met y Pro;
(b) Ser en la posición 2011 se ha reemplazado por un resto aminoácido hidrófilo seleccionado entre Asn, Thr
y Gln; y
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(c) Val en la posición 2233 se ha reemplazado por un resto aminoácido ácido seleccionado entre Glu y Asp;
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en la que dicha numeración del factor VIII es con relación a la secuencia de aminoácidos del factor VIII de tipo
salvaje mostrada en la SEQ ID Nº 2 (estando la secuencia de aminoácidos del péptido maduro no incluyendo el péptido
señal de 19 aminoácidos, pero incluyendo el dominio B entero (documento WO 99/29848)).
Como se ha expuesto anteriormente, Val en la posición 162 se puede reemplazar con un resto aminoácido seleccionado entre Gly, Ala, Leu, Ile, Met y Pro. El resto aminoácido neutro preferido es Ala. Además, Ser en la posición
2011 se puede reemplazar con un aminoácido hidrófilo seleccionado entre Asn, Thr y Gln. El resto aminoácido hidrófilo preferido es Asn. Finalmente, Val en al posición 2223 se puede reemplazar con un resto aminoácido ácido
seleccionado entre Glu y Asp. El resto aminoácido ácido preferido es Glu.
Entre las muteínas del factor VIII de la realización (1) se prefiere que la muteína del factor VIII tiene al menos una
de las mutaciones (a), (b) y (c), más preferiblemente al menos una de las mutaciones (a) y (b), y más preferiblemente
las tres mutaciones (a) a (c) como se ha definido anteriormente. Se prefiere particularmente que al muteína comprenda
las tres mutaciones V162A, S2011N y V2223E.
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Sobre el mismo indicio, la secuencia de ADN comprendida por el vector de la realización (2) de la invención tiene
las mutaciones T485C, G6032A y T6668A con relación a la secuencia de ADN del factor VIII de tipo salvaje maduro
en al SEC ID Nº 1. En una relación preferida la secuencia de ADN también contiene la mutación completa T6816C
(de nuevo dicha numeración estando con relación a la secuencia de ADN del factor VIII de tipo salvaje maduro).
5
Entre las muteínas del factor VIII de la realización (1) se prefiere alternativamente que la muteína del factor VIII
tiene la mutación (d) como se ha definido anteriormente.
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De acuerdo con la realización (1) de al invención la muteína del factor VIII es una muteína en al que el dominio B
entre la posición R740 y E1649 se reemplaza mediante un espaciador de aminoácido rico en Arg característico. “Rico
en Arg” de acuerdo con la presente invención significa que dicho espaciador comprende al menos 3, preferiblemente al
menos 4 restos Arg. En una relación más preferida dicho espaciador consta de ocho aminoácidos del dominio de tipo
salvaje seguido de ocho aminoácidos de un dominio variable (véase la figura 3 A, SEQ ID Nº 9). En tal muteína del
factor VIII que tiene las modificaciones del dominio B descritas en esta memoria descriptiva antes del sitio de unión a
vWF propuesto permanece sin cambiar para evitar una digestión proteolítica inmediata del factor VIII secretado en el
medio de cultivo celular o más tarde en los pacientes tratados. Solamente después de la activación específica mediante
el factor VIII de escisión de trombina se liberará a partir de vWF. El ADNc para la muteína del factor VIII se construyó
mediante ensamblaje de cuatro fragmentos de ADN, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 1.
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La proteína de la realización (1) de al invención puede comprender secuencias adicionales N- o C-terminales
incluyendo, pero no limitadas a, el péptido señal de exportación natural (correspondiente a Leo restos aminoácidos
-19 a -1 de las proteínas mostradas en las SEQ ID números 4, 13 y 15) o un fragmento o análogo de las mismas,
péptidos artificiales (por ejemplo, oligo-His-Tag para purificación de alta afinidad) y similares.
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El vector más preferido para la expresión del factor VIII es el vector pTGF8-1 mostrado en la figura 2. La secuencia
de ADN de dicho vector se muestra en la SEQ ID Nº 3, y abarca las cinco mutaciones dirigidas en esta memoria
dirigida antes (las muteínas T485C, G6032A, T6668A y T6816C (aquí: T1217C, G4088A, T4724A, y T4872C) y una
secuencia de ADN que codifica el engarce del dominio B de la SEQ ID Nº 9) y codifica la muteína del factor VIII
mostrada en la SEQ ID Nº 4.
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Los vectores más preferidos adicionalmente son pTGF8-2-hyg-s y pTGF8-3, la estructura molecular común de la
cual se muestra en al figura 4. Los pTGF8-2hyg-s mostrados en la SEQ ID Nº 12 contiene la mutación silenciosa T
T6816C solamente, dando como resultado una muteína del factor VIII que tiene la sustitución del dominio B mediante
la SEQ ID Nº 9 del péptido engarce, pero sin cambio adicional en la estructura de la proteína primaria que se refiere a
la secuencia de tipo salvaje SEQ ID Nº 2.
pTGF8-3 mostrado en la SEQ ID Nº 14 contiene las mutaciones T485C, T6668A y T6816C, que dan como resultado una muteína del factor VIII que muestra las sustituciones de aminoácidos V162A y V2223S que se refieren a las
SEQ ID Nº 2 además de la sustitución del dominio B como se ha descrito anteriormente.
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En el caso de la producción del factor VIII el cultivo se realza en presencia del factor de von Willebrand. El factor
de von Willebrand se usa preferiblemente en una cantidad de 10 a 100, más preferiblemente 50 a 60 moles de vWF por
mol del factor VIII (en el caldo de cultivo y/o en la solución del factor VIII durante el procedimiento de purificación
(véase más adelante).
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El procedimiento de acuerdo a la realización (9) de la invención que comprende además las etapas de
(c) purificar el factor de coagulación de sangre aislado en la etapa (b) y/o
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(d) someter el factor de coagulación de sangre aislado en la etapa (b) o purificado en al etapa (c) a un tratamiento
de inactivación de virus.
Las etapas de purificación adecuadas incluyen procedimientos que se conocían en la técnica para maximizar el
rendimiento de un producto puro, estable y altamente activo y se seleccionan entre cromatografía por inmunoafinidad, cromatografía de intercambio aniónica, cromatografía de exclusión por tamaño, etc., y las combinaciones de los
mismos. En particular, los protocolos de purificación detallados para los factores de coagulación de plasma de sangre
humana son, por ejemplo, descritos en los documentos WO 93/15105, EP0813597, WO 96/40883 y WO 96/15140/50.
Se pueden adaptar fácilmente a los requerimientos específicos necesarios para aislar el factor VIII recombinante. La
cantidad y actividad de la proteína purificada y después el procedimiento de purificación se puede controlar mediante
ELISA y ensayos de coagulación.
Para superar los problemas de las combinaciones posibles infecciosas en las muestras de proteínas purificadas o en
el producto directamente obtenido a partir del sobrenadante de cultivo de las celular que contienen la proteína recombinante secretada de elección, las muestras y/o el sobrenadante del cultivo se podría tratar con procedimientos para
la inactivación de virus incluyendo tratamiento pos calor (estado sólido o líquido, con o sin la adición de sustancias
químicas que incluyen inhibidores de proteasas). Después de la inactivación de virus puede ser necesario una etapa
de purificación adicional para retirar las sustancias químicas. En particular, se describió para el factor VIII aislado de
plasma sanguíneo la recuperación de una proteína inactivada por virus de alta pureza mediante cromatografía de inter6
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cambio aniónico (documento WO 93/15105). Además se han reseñado varios procedimientos para la producción de
factores de coagulación de alta pureza, no infecciosos de plasma sanguíneo u otras fuentes biológicas. Virus revestidos
de lípidos se inactivan de manera eficaz tratando el material potencial infeccioso con una fase hidrófoba que forma un
sistema de dos fases, a partir del que la parte insoluble se retira posteriormente.. Una ventaja adicional se ha probado
que complemente el tratamiento de fase hidrófoba de manera simultánea o secuencial con un tratamiento con detergentes biocompatibles no iónicos y fosfatos de dialquilo o trialquilo. Los documentos WO 9636369, EP0131740, US
6.007.979). Los virus revestidos de no lípidos requieren la inactivación de protocolos que consisten en el tratamiento
con detergentes no iónicos seguido de una etapa de calentamiento (60-65ºC) durante varias horas (documento WO
94/17834).
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En vista de los resultados anteriores se cree que al combinación de un sistema de expresión de proteínas eficaz
basado en una línea celular humana junto con los procedimientos aprobados para la inactivación de agentes infecciosos potencialmente peligrosos que sirven como un sistema de uso seguro y fácil para la producción de factores de
coagulación recombinantes.
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Además, de acuerdo con la realización (1) de la invención se proporciona un mutante del factor VIII superior.
Dicho mutante del factor VIII puede ser parte de composiciones farmacéuticas, y se puede usar para preparar medicamentos para tratar hemofilia (realizaciones (7) y (8) de al invención). Las composiciones farmacéuticas anteriores
y los medicamentos anteriores pueden comprender el factor VIII en una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo,
entre 50 y 500 µg (con 200 ng de factor VIII correspondiente a una subunidad internacional (IU)). Dependiendo del
tipo de hemofilia, un paciente recibe una dosis anual del factor VIII de hasta 200.000 IU, que se administra usualmente
en dosis semanales o dos veces semanalmente.
Las composiciones farmacéuticas y medicamentos de las realizaciones (7) y (8) contienen una dosis terapéuticamente eficaz de la muteína del factor VIII de la realización (1) o el vector de transferencia de genes de la realización
(4). En el caso de lo anterior, puede adicionalmente comprender aditivos farmacéuticamente aceptables que incluyen
albúmina sérica bovina (HSA; preferiblemente solución aproximadamente 1 mg/ml); sales inorgánicas tales como
CaCl2 (preferiblemente 2 a 5 mM), aminoácidos tales como glicina, lisina, e histidina (preferiblemente 0,1 a 1 M por
aminoácido); disacáridos tales como sacarosa y/o trehalosa (preferiblemente 0,4 a 1 M); sales orgánicas tales como citrato de sodio (preferiblemente hasta 50 mM); etc. Las preparaciones pueden ser acuosas o no acuosas. En este último
caso e componente principal es glicerol y/o polietilenglicol (por ejemplo., PEG-300) La preparación también puede
estar en la forma seca (a disolver en el disolvente deseado antes de la administración).
Como se ha expuesto anteriormente, el vector de transferencia de genes de acuerdo con la realización (4) de
al invención también puede ser parte de composiciones farmacéuticas y se puede usar para preparar medicamentos
para tratar hemofilia (realizaciones (7) y (8) de la invención). Dichas composiciones farmacéuticas y medicamentos
pueden adicionalmente comprender formulaciones de matriz adecuadas, por ejemplo, lípidos u hormonas como se ha
descrito en el documento WO 00/49147. La composición farmacéutica o medicamento que comprende el vector de
transferencia de genes o el vector de transferencia de genes de al presente invención se puede administrar por vía
oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, a través de la mucosa (incluyendo bucal, pulverización nasal)
o mediante una pistola de genes. Se prefiere la administración oral (por ejemplo, en una dispersión de hormonas
micronizada).
La muteína del factor VIII de la realización (1) de la invención se puede preparar adicionalmente mediante técnicas
recombinantes convencionales (realización (6) de al invención), por ejemplo, un procedimiento que comprende
(a) cultivar una células hospedadora transformada con el vector de la realización (3) y/o que comprende el
ADN de la realización (2) (que también incluye el cultivo de una línea celular humana inmortalizada que
expresa establemente el antígeno T del virus Simio y que leva un vector que tiene un promotor de CMV
unido funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII (realización (9) de
la invención); y
(b) aislar la muteína del factor VIII a partir del caldo de cultivo. Las líneas celulares humanas inmortalizadas son las que se han mencionado en esta memoria descriptiva anteriormente. La línea celular humana
inmortalizada utilizada en dicho procedimiento preferiblemente expresa dos proteínas activadoras de transcripción viral, lo más preferiblemente antígeno T de SV40 sensible a la temperatura y proteína E1A de
adenovirus. El procedimiento puede adicionalmente comprender las etapas de purificación e inactivación
de virus (c) y (d) descritas en esta memoria descriptiva anteriormente.
La línea celular 293 T disponible comercialmente (ECACC: tsa201, ref. 96121229) se depositó con la DMSZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig,
Alemania) el 20 de febrero de 2001 bajo el número de depositario DSM ACC2494.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
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Ejemplos
Ejemplo 1
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Clonación del factor VIII
La secuencia para el factor VIII recombinante se obtuvo mediante transcripción inversa a partir de una combinación de ARN hepatocelular humano completo. Después cuatro fragmentos (1/1, 3/4, 5/6, 7/8) se amplificaron mediante
PCR convencional usando cebadores diseñados para que contenga sitios de restricción. Para ajustar juntos los fragmentos 3/4 Y 5/6 el fragmento SmaI/SalI del plásmido pBSFVIII3/4 se insertó ciego en el sitio SalI de pBSFVIII5/6 para
obtener pBSFVIII3/6. A continuación, el fragmento 3/6 se obtuvo digiriendo pBSFVIII3/6 con XhoI/BspHI y parcialmente con Alw4I. Este fragmento y el fragmento PstI/Alw441 de pBSFVIII1/2 se ligaron en una etapa en al estructura
central del vector de pBSFVIII1/2 digerido con PstI y XhoI obteniendo por estos medios pBSFVIII1/6. El fragmento
7/8 se obtuvo digiriendo pBSFVIII7/8 con SmaI y parcialmente con Mva1269I y se ligó en pBSFVIII1/6 cortado con
XhoI y Mva1269I dando lugar a pBSFVIII1/8. Finalmente el fragmento SmaI/XhoI de pBSFVIII1/8 se insertó ciego
en el sitio SalI del vector Octagene pTGFG67 (describiéndose la producción de dicho vector en PCT/EP00/01368)
que da como resultado el vector de expresión eucariótico del factor VIII humano VIII pTGF8-1(véase las figuras 1 y
2). El vector resultante codifica una muteína del factor VIII que tiene las mutaciones V162A, S2011N y V2223E.
Ejemplo 2
Línea celular humana para la expresión de proteínas
25
30
35
Una línea celular preferida es tsA201 (ECACC Ref.: 96121229) que es una línea celular humana fetal transformada
(293, ECACC número 8512602) que expresa establemente un antígeno T sensible a la temperatura de SV40 (J. Membrana Biol. 1996; 152:39; Gene 1995; 156:235; PNAS USA 1994; 91:12785; Pflügers Arch. 1994; 427:136; J. Gen.
Physiol. 1994; 104:507; Biotechniques 1993; 15:906). Otros nombres para esta línea celular incluyen 293tsA1609neo
(Mol. Cell. Biol., 1987, 7:379) y 293T. Esta línea celular de tipo epitelial se ha usado en una diversidad de ensayos
de expresión funcional y se he reseñado que produce altos niveles de proteínas recombinantes. Se puede cultivar en
DMEM suplementado con glutamina 2 mM y FCS al 10%.
Para simplificar la purificación de un polipéptido expresado, las células se pueden cultivar en medio sin suero
o sin proteína que contiene suplementos adecuados. Por razones de estabilidad el factor VIII secretado requiere la
presencia de vWF en el medio (US5198349). También se ha reseñado la adición de lipoproteínas, fosfolípidos, poliglicoles, metales en pequeñas cantidades, heparina, tensioactivos no iónicos o ciclodextrina (documentos EP0254076,
US5679549, US5198349, US250421, US5576194, EP0872487, WO94/11525, US5378612).
Ejemplo 3
40
45
Transfección por fosfato de calcio de células 293T para la producción transitoria del factor VIII
Las células 293T confluentes de sembraron a baja densidad en placas de 10 cm en 6 ml de DMEM/10% FCS el día
antes de la transfección. La transfección se realizó en bruto de acuerdo con Chen y Okayama (Mol. Cell. Biol., 7:2745
(1987)). 12 µg del plásmido pTGF8-1 se transfectaron para la producción del factor VIII. Seis horas después de la
transfección el medio se reemplazó por uno reciente y el sobrenadante se recogió tres días después de la transfección
y o bien se purificó adicionalmente o se analizó con purificación adicional mediante ELISA o coagulometría (véanse
los ejemplos 4 y 5).
Ejemplo 4
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Determinación de la concentración del FVIII mediante ELISA
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65
Los niveles del factor VIII recombinante humano en filtrado de cultivo de células 293T transfectadas se determinaron por ELISA usando una preparación de anti FVIII:C de oveja policlonal purificada por afinidad (F8C-EIAC, Affinity Biologicals) como anticuerpo de captura. El revestimiento de realizó durante dos horas en una cámara
húmeda a 22ºC. Las placas (Dynex, Immulon-4) se revistieron con 100 µl de una dilución de anticuerpo 100 veces en
tampón de revestimiento (carbonato sódico 50 mM pH 9,6). El lavado de la placa cuatro veces (Encore 2000, Merck)
con PBS-Tween® (0,1%, v/v) era suficiente para bloquear las interacciones no específicas.
Después de cada etapa adicional, se requiere lavado para eliminar proteínas no unidas. 100 µl de cada uno de las
muestras de filtrado de cultivo recogidas de diferentes clones de 293T transfectados de manera estable con pTGF8-3
después de 48 h se añadieron a cada pocillo. Se hicieron diluciones del patrón de FVIII (patrón doméstico, Octapharma) en tampón de dilución (HBS-BSA-EDTA-Tween®) y se incubaron a 100 µl por pocillo. Para detección, se incubó
una dilución fácil de usar de anti-FVIII policlonal marcado con peroxidasa (F8C-EIA-D, Affinity Biologicals) durante
60 minutos a 100 µl por pocillo. Para la reacción colorimétrica, un comprimido de 5 mg de O-fenilendiamina (P-6912,
Sigma) se disolvió en 12 ml de tampón de sustrato inmediatamente antes de uso y se completó con 12 µl de H2 O2 al
30%. 150 µl de esta solución de sustrato se añadió a cada pocillo y se realizó el registro colorimétrico en un lector MRX
(Dynex) a 490 nm después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad y deteniendo al reac8
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ción mediante adición de 50 µl de H2 SO4 2,5 M a cada pocillo. Los resultados se calcularon mediante regresión lineal
de concentraciones convencionales frente a absorbancias convencionales (figura 5A) y se resumen en la figura 5 B.
Ejemplo 5
5
Detección de actividad del factor VIII de coagulación humano
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15
La actividad de coagulación del factor VIII recombinante humano en sobrenadantes de las células 293T de cultivo
celular (transfectadas mediante precipitación con fosfato de calcio con pTGF8-1 como se describe en el ejemplo 8) se
determinó como sigue:
La actividad de coagulación se ensayó basándose en un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial usando activación de Cefalina (fosfatidil etanolamina) con un instrumento de coagulación manual (ML-2, Instrumentation Laboratories). Para el estudio, 100 µl de sobrenadante no diluido de células 293 T transfectadas, 100 µl de plasma deficiente
(Progen) y 100 µl de Cefalina (Instrumentation Laboratories) se incubaron durante 5 minutos a 37ºC. La coagulación
se comenzó mediante al adición de 100 µl de CaCl2 . El tiempo de coagulación se comparó con plasma normal. Los
resultados se resumen en al figura 3 B. Como se puede observar en al figura 3 B, el sobrenadante de células de células
transfectadas con pTGF8-1 muestra una activación de coagulación comparable con plasma normal mientras células no
transfectadas proporcionan un valor equivalente al plasma que carece del factor VIII.
20
Ejemplo 6
Inactivación viral
25
La inactivación viral se realizó de acuerdo con el procedimiento de la patente de Estados Unidos Nº 6.007.979.
A saber, a una solución de proteínas potencialmente infecciosas se añadieron los siguientes compuestos se añadieron
posteriormente, con agitación:
1. 0,2 ml de Tween® 80 y 0,06 ml de TNBP se añadieron a 19,74 ml de la solución o
30
2. 0,2 ml de Triton® X-100 y 0,2 ml de TNBP se añadieron a 19,6 ml de la solución.
1 ml de aceite de ricino de añadió a las preparaciones 1 y 2 que después se extrajeron intensamente a temperatura
ambiente durante una hora.
35
La centrifugación se realizó en cada caso para al separación de fases. Para el control de infección, se tomaron
repetidamente 1 ml de cada una a partir de la solución acuosa.
Ejemplo 7
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Establecimiento de líneas celulares que expresan establemente el factor VIII
45
El vector preferido pTGF8-1 comprende construcciones para la expresión transitoria del factor VIII en células de
mamíferos. Para permitir un procedimiento de selección para un clon de células transfectadas de manera estable, un
módulo para la higromicin-B-fosfotransferasa (fragmento HindIII-Mva 1260I de TK-Hyg, Clontech) se subclonó en
el sitio SmaI que está presente en el vector. Las construcciones resultantes (pTGF8-1-hyg) entonces comprenden en
cis los módulos de expresión para el factor VIII humano con un promotor de CMV y una señal de poliadenilación de
SV40 y un módulo de expresión de higromicin-B-fosfotransferasa con el promotor de timidina quinasa de HSV y la
señal de poliadenilación de timidina quinasa de HSV.
50
Los vectores pTGF8-2hyg-s y pTGF8-3 (figura 6, SEQ ID números 12 y 14) son derivados de pTGF8-1hyg, en esas
mutaciones puntuales V162A, S2011N y V2223E (pTGF8-2hyg-s) y S2011N (pTGF8-3) se revirtieron a la secuencia
de tipo salvaje mediante un procedimiento dependiente de PCR usando el protocolo QuickChange® (Stratagene).
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Las construcciones anteriormente permiten el establecimiento de la expresión de manera estable de líneas celulares
mediante transfección por fosfato de calcio y posterior selección de resistencia a higromicina. Adicionalmente los
plásmidos contiene un elemento sensible a progesterona (PRE).
Primero la concentración crítica de antibióticos para una selección eficaz de células 293T transfectadas de manera
estable se tenía que establecer. Para este propósito las células se sembraron a baja dilución y se desarrollaron en
presencia de 10 a 800 µg/ml de higromicina B. Después de 2 semanas a 200 µg/ml o más alto no se desarrollaron más
células, así esta concentración se eligió para la selección de células trasnfectadas de manera estable.
Una transfección típica se realizó en placas de 10 cm con células 293T divididas el día antes a una relación de 1:15.
Usando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio (Biotechniques 1988 6:7 632-638) 12 µg de plásmido
por placa se transfectaron y dos días más tarde el medio se reemplazó con uno reciente que contenía 200 µg/ml de
higromicina B. Después de 2-3 semanas de selección el medio se ensayó mediante ELISA (véase el ejemplo 4) para
evaluar la presencia del factor VIII.
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Los clones positivos se aislaron y se transfirieron a una placa de 24 pocillos. Después de seleccionar mediante
ELISA y la determinación de actividad los clones positivos se sometieron a dos rondas adicionales de subclonación
después se expandieron y se congelaron alícuotas de ellos para uso y caracterización.
5
Ejemplo 8
Prueba de uniformidad fenotípica de células transfectadas de manera estable mediante detección inmunofluorescente
in situ de la expresión del factor VIII
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Cada vez, 5 x 107 células 293T transfectadas de manera estable con pTGF8-3 (clon 49/19) y células 293T no
transfectadas (control negativo) de cultivos de adhesión en DMEM + FBS al 9,1% se separaron de las placas de
cultivo mediante tripsinización, se lavaron varias veces y se resuspendieron en 5 ml de tampón PBS.
2 µl de estas suspensiones de células se transfirieron a portaobjetos de vidrio de microscopio estéril y se incubaron
a temperatura ambiente hasta que se evaporó el líquido. Las células se fijaron en etanol al 70% durante 10 minutos y se
secaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquearon contra la detección no específica
mediante incubación en una dilución al 10% de FBS en tampón PBS. Los anticuerpos primarios (sh antiFVIII:C
F8C-EIA-C, Affinity Biologicals) se diluyeron 100 veces con tampón PBS que contenía FBS al 10% y saponina al
0,1% y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente en una cámara de incubación húmeda. Después de
lavado intenso con PBS, se preparó una dilución 100 veces del anticuerpo secundario (conjugado rb anti sh CY3 313165-003, Jackson ImmunoResearch) y se incubó de al manera descrita anteriormente. Posteriormente, la preparación
microscópica se lavó intensamente y se cubrió mediante una capa de glicerol al 50% y un cubre objetos de vidrio. Las
células se visualizaron mediante microscopia de luz blanca y de fluorescencia (emisión a 570 nm).
Los resultados se muestran en la figura 6.
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REIVINDICACIONES
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1. Una muteína del factor VIII en la que el dominio B entre las posiciones Arg 740 y Glu 1649 de han reemplazado
por un péptido de engarce rico en Arg que tiene al menos 3 restos Arg y que comprende 10 a 25 restos de aminoácidos,
en los que dicha numeración del factor VIII es con relación a la secuencia del factor VIII de tipo salvaje madura
mostrada en la SEQ ID Nº 2.
2. La muteína del factor VIII de la reivindicación 1, en la que la muteína del factor VIII tiene al menos una de las
siguientes mutaciones adicionales (a), (b) y (c):
(a) Val en la posición 162 se ha reemplazado por un resto aminoácido neutro seleccionado entre Gly, Ala Leu,
Ile, Met y Pro;
15
(b) Ser en la posición 2011 se ha reemplazado por un resto aminoácido hidrófilo seleccionado entre Asn, Thr
y Gln; y
(c) Val en la posición 2223 se ha reemplazado por un resto aminoácido ácido seleccionado entre Glu y Asp.
20
3. La muteína del factor VIII de la reivindicación 2 que tiene al menos una de las mutaciones (a) y (b).
4. La muteína del factor VIII de la reivindicación 2, que tiene al menos tres mutaciones (a), (b) y (c).
25
5. La muteína del factor VIII de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que en la mutación
(a) Val en la posición 162 se ha reemplazado por Ala, en la mutación (b) Ser en al posición 2011 se ha reemplazado
por Asn, y/o en la mutación (c) Val en la posición 2223 se ha reemplazado por Glu.
6. La muteína del factor VIII de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el péptido de
engarce rico en Arg tiene 14 a 20 restos aminoácidos.
30
7. La muteína del factor VIII de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el engarce
comprende:
la secuencia de aminoácidos SFSQNSRH, y/o
35
la secuencia de aminoácidos QAYRYRRG.
8. La muteína del factor VIII de la reivindicación 7, en la que el engarce tiene la secuencia SFSQNSRHQAY
RYRRG.
40
45
9. La muteína del factor VIII de la reivindicación 1, que comprende los aminoácidos 1 a 1440 de la SEQ ID Nº 4,
13 ó 15.
10. Una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
11. La secuencia de ADN de la reivindicación 10, que tiene al menos una de las mutaciones T485C, G6032A y
T6668A con relación a la secuencia de ADN del factor VIII de tipo salvaje maduro mostrado en la SEQ ID nº 1,
preferiblemente la secuencia de ADN comprende las tres de dichas mutaciones.
50
12. Un vector que comprende el ADN como se ha definido en la reivindicación 10 u 11.
13. El vector de la reivindicación 12 que es pTGF8-1, pTGF8-2hyg-s o pTGF8-3 como se muestra en las SEQ ID
números 3, 12 y 14 respectivamente.
55
14. El vector de la reivindicación 12 que es un vector de transferencia de genes.
15. Una célula hospedadora aislada que se transforma con un vector como se ha definido en la reivindicación 12
y/o que comprende una secuencia de ADN como se ha definido en la reivindicación 10.
60
16. Un procedimiento para la producción de la muteína del factor VIII como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 que comprende
(a) cultivar una célula hospedadora transformada como se ha definido en la reivindicación 15, y
65
(b) aislar la muteína del factor VIII a partir del caldo de cultivo.
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17. Una composición farmacéutica que comprende la muteína del factor VIII como se define en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 o un vector de transferencia de genes como se ha definido en la reivindicación 14.
5
10
18. Uso de la muteína del factor VIII como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un
vector de transferencia de genes como se ha definido en la reivindicación 14 para preparar un medicamento para tratar
hemofilia, preferiblemente para tratar hemofilia A.
19. El procedimiento de la reivindicación 16 en el que la etapa (a) comprende cultivar una línea celular humana
inmortalizada que expresa de manera estable el antígeno T del virus de Simio y que lleva un vector que tiene un
promotor de CMV unido funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la línea celular humana inmortalizada es una célula inmortalizada de riñón, vejiga, hígado, pulmón, músculo cardíaco, músculo liso, ovario o gastrointestinal.
15
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la línea celular human inmortalizada se deriva de una célula
de riñón humano y preferiblemente es la línea celular 293 T (DSM ACC2494).
22. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que el vector comprende
un marcador de selección y/o secuencias reguladoras.
20
23. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la célula hospedadora es una célula inmortalizada de riñón,
vejiga, hígado, pulmón, músculo cardíaco, músculo liso, ovario o gastrointestinal, preferiblemente se deriva de una
célula de riñón humano.
25
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la línea celular inmortalizada expresa al menos una proteína
activadora de transcripción viral, tal como proteínas activadoras seleccionadas entre proteínas E1A o E1B de adenovirus, una proteína codificada por la secuencia de ADN de la región temprana de virus de papiloma bovino y proteínas
IE de virus herpes.
30
25. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que el cultivo se realiza
en la presencia del factor de von Willebrand (vWF).
26. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 y 19 a 25 que comprende adicionalmente
35
(c) purificar el factor de coagulación de sangre aislado en la etapa (b), y/o
(d) someter el factor de coagulación de sangre aislado en la etapa (b) o purificado en la etapa (c) a un tratamiento de inactivación de virus.
40
27. Una línea celular humana inmortalizada, como se ha definido en uno cualquiera de los procedimientos de las
reivindicaciones 19 a 21, que expresa de manera estable al menos una proteína activadora de transcripción viral, y que
lleva un vector que codifica una muteína del factor VIII, como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 9.
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Octogene GmbH
5
<120> Producción de factores de coagulación sanguínea recombinantes en lineas celulares humanas
<130> 010613wo/JH/ml
10
<140>
<141>
<160> 17
15
<170> PatentIn Ver. 2.1
20
<210> 1
<211> 6996
<212> ADN
<213> Homo sapiens
25
<220>
<221> CDS
<222> (1) ..(6996)
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<400> 1
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<210> 2
<211> 2332
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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