MICROALGA Phaeodactylum

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
AREA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINA
ii
t
g
o
K
REACTIVOS DE ALTO VALOR AGREGADO EN CULTIVOS
ALTERNATIVOS DE LA MICROALGA Phaeodactylum
Ir˝cornutum
BO H L˝ N sACIL ARIOPHYCEA
BACILLARIOPHYTA
TESIS QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER
EL TITULO DE
BIOLOGO MARINO
PRESENTA
Tania Ledesma
la Paz
Verdejo
Baja California Sur MØxico Octubre del 2000
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UNIVERSIDAD
AUT NOMA
DE
BAJA CALIFORNIA SUR
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Trabajo
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1
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T sis qu
Este
trabajo esta
dedicado
a
LEONARDO
Mi mÆs
cuando se
cuando estÆ contento y de tristeza
encuentra enfermo triste o ausente Al motor de mi vida que me
impulsa
vivirla ya
a
grande motivo
ser tan
de
alegr a
feliz por quiØn he aprendido y aprenderØ para
Øl
MamÆ
ella
QuiØn gracias a ella estoy aqu en este escenario de la vida
me cuid
y aliment
quiØn me ha dado su apoyo cuando mÆs
donde
lo he
necesitado
PapÆ
QuiØn siempre me dio sus consejos
mi hØroe cada
vez
que
me met
a
en
y
su mano para
ir a la escuela A
apuros pero sobre todo
a
mi mejor
amigo
Hermanas
A Lizbeth por darme todo su apoyo y ejemplo para seguir adelante
que al igual que Karen formo parte de su felicidad y tristeza yes ellas a
quienes les debo mucho de lo que pude hacer aqu A Samara esperando
algo de esto le sirva para formar parte del camino que emprenda
Ese
ser
inimaginable
que me da la fortaleza interior para levantarme cada
que me hace sentir capaz de realizar todo cuanto quiera a
logra sentir
en m
amor
a
Ti
quien quiera que seas
vez
ese
que tropiezo
Ser que
IMISNTOS
A RA SC
M
La
por
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Rev soves cteL
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C
f
CONTENIDO
a
GLOSARIO
LISTA DE
b
FIGURAS
LISTA DE
c
TABLAS
RESUMEN
d
ABSTRACT
f
INTRODUCCI N
1 0
1 1
Generalidades osbre el cultivo de
1 2
Prevenci n y control de enfermedades
PolisacÆridos sulfatados
1 3
Super xido
4
1
Aspectos
Dismutasa SOO
econ micos
2 0
2 1
microalgas
6
ANTECEDENTES
Cultivo de
microalgas
TØcnicas de cultivo
ParÆmetros de cultivo
Selecci n del medio de cultivo
Caracterizaci n diagn stica de la
2 2
PolisacÆridos sulfatados
2 3
Super xido
microalga Phaeodactylum tricornutum
Dismutasa SOD
3 0
16
JUSTIFiCACi N
4 0
OBJ
4 1
4 2
s O
18
ETIVOS
General
Objetivo
Objetivos
Particulares
M ETODOLOG
5 1
19
A de cultivo
Condiciones
para la microalga Phaeodactylum tricornutum
Acondicionamiento de la
Cultivos masivos de la
microalga Phaeodactylum tricornutum
microalga Phaeodactylum tricornutum en
Evalœaci n del crecimiento
Cuenta celular
ParÆmetros de crecimiento
AnÆlisis estad sticos
15 1
Crecimiento de la
microalga Phaeodactylum
tricornutum
con
respecto
al medio fl2
Reactivos de alto valor
5 2
5 3
4
5
Cuantificaci n de
agregado
pol sacÆrido sulfatados
Determinaci n de la actividad SOD
Evaluaci n de los costos de los medios de crecimiento
6 0
23
RESULTADOS
6 1
Crecimiento de la
microalga Phaeodactylum
tricornutum
en
bolsas de 15 11
AnÆlisis estad stico
ParÆmetros de crecimiento
6 2
Cuantificaci n de PolisacÆridos sulfatados
6 3
Determinaci n de la actividad SOD
Evaluaci n econ mica de los medios considerados
4
6
7 0
DISCUSION
7 1
33
Crecimiento de la
microalga Phaeodactylum tricornutum
en
bolsas
de 151
Selecci n del medio de cultivo
ParÆmetros f sico
qu micos
ParÆmetros de crecimiento
7 2
7 3
4
7
Cuantificaci n de polisacÆridos sulfatados
Determinaci n de la actividad SOD
Evaluaci n econ mica de los medios analizados
8 0
CONCLUSIONES
42
9 0
RECOM ENDACIONES
44
10 0
BIBLIOGRAF A
11 0
ANEXOS
45
52
Glosario
GLOSARIO
ACTIVIDAD
ENZIM`TICA
Capacidad
AISLAMIENTO
Obtenci n de cultivos
de
una
enzima para transformar
a
monoalgales
un
substrato
de una muestra
partir
agua
ANTIBi TICO
Compuesto de bajo peso molecular que tiene la capacidad
inhibir o suprimir el desarrollo o multiplicaci n bacteriana
ANTICU ERPO
Prote na
producida
a
ANT GENO
de la introducci n de
causa
que tiene la capacidad
estimul
su producci n
Sustancia que reacciona
de combinarse
con
anticuerpos
el
con
o
de
ant geno y
ant geno que
un
receptores de cØlulas
T
ASIMILACi N
Proceso
fisiol gico
al
empleando
CADENA
TR FICA
CARRAGENINA
el cuÆl
en
como el
ox geno
se
metabolizan
aceptor
Sucesi n
de
organismos
constituye
una
continuaci n del flujo de
organismo
a otro
PolisacÆrido
sulfatado
en
aislado
los nutrientes
final de los electrones
ecol gica
comunidad
una
de algas
que
alimenticia de
energ a
rojas
y
que
un
tiene la
propiedad de formar geles
CEPA
Cultivo puro de
COLONIZACi N
Capacidad que tiene
huØsped susceptible
CULTIVO MASIVO
Aquellos cultivos de microalgas realizados
un
organismo
un
de
una
determinada especie
microorganismo
para establecerse en un
en
volœmenes mayores
de 10 litros
DEXTR`N
SULFATO
Derivado
poliani nico
de dextrÆn
que
cadenas lineares de residuos de D
molecular
ENZIMAS
aproximado
Prote nas
es
polisacÆrido
un
glucopiranosa
y con
un
con
peso
de 500 000 Da
especializadas
en
la
catÆlisis
de
las
reacciones
biol gicas
ESTER IL1ZACI
N
Destrucci n
total
de todos
los
organismos
que viven
en
un
volumen de agua
FOTOAUT TROFO
capaz de sintetizar su propio alimento a partir de
sustancias inorgÆnicas usando la luz como fuente de energ a
Organismo
Glosario
FOTos NTESIS
Proceso de s ntesis
de carbohidratos
partir de bi xido
a
carbono yagua utilizando energ a
clorofila en las cØlulas vegetales
radiante de la luz
FUCOIDAN
PolisacÆrido sulfatado aislado de
algas
H I POCOLESTEREM ICO
Niveles
INOCULAR
Procedimiento de transferencia de
bajos
captada
de
por la
cafØs
de colesterol
microalgas
en
los diferentes
niveles de cultivo
METABOLISMO
Transformaciones
que
de
un
por parte
energ a
permiten
ser
la utilizaci n
METBOLlTO
Producto intermedio del metabolismo
M ET `ST ASIS
Desarrollo
excesivo
dØcadas
MOL M
equivalente
sus
resultado de
est mago
proceso inflamatorio
infecci
n
con
Helicobacter pylori
por
asociado
a
un
un
compuesto qu mico
cuya
a su
peso molecular la
suma de
Cantidad de
de
del
noeplÆsmico
de la materia y
vivo
Ætomos constituyentes
v
un
daæo tisular
prolongado
masa en
por
es
gramos
los pesos at micos
N 14 g 0 16g
3
gr NaN03
NaN03 85 G
NUTRIENTE
TØrmino
genØrico para cualquier sustancia que pueda utilizarse
los procesos meta b licos de un ser vivo
en
POTENCIAL
DE
HIDR GENO pH
Logaritmo negativo
virtud de la cuÆl
de la concentraci n
se expresa el
grado
del ion
hidr geno
por
de acidez o alcalinidad de un
l quido
RADICAL LIBRE
`tomos
SOLUCi N
Soluci n que mantiene el medio de
su fÆcil manejo
STOCK
molØculas cuya œltima capa electr nica
apareada en su totalidad
o
STOCK DE CULTIVO
Cultivo madre inicial de
SU BSTRATO
Sustancias nutritivas presentes
un
no se encuentra
cultivo concentrado para
microalgas
en
el medio
SULFATO DE
HEPARINA
Proteoglicano
con
sulfatado formado por
de polisacÆridos
ramificaciones
repetitivas
LCERA G`STRICA
Degeneraci n
de la mucosa
gÆstrica
una cadena
polipept dica
y
compuestas de unidades
Glosario
LCERA P PTICA
Perforaciones
de Æcidos
debida
debido
a
a
en
en
Æreas de la
Æreas
infecciones
otros
mucosa
debilitadas del
producidas
agentes
inflamatorias incluyendo
como
gÆstrica causada por daæos
est mago por inflamaci n
por Helicobacter py ori
drogas no estero deas
o
o
bien
anti
aspirinas
UNIDADES DE
ACTIVI DAD
ENZIM`TICA
Cantidad de enzima que
10
6
origina
la transformaci n de 1 0
de substrato por minuto a 250C
mol
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura
1
Curva representativa del crecimiento de
estÆtico de microalgas
Figura
2
Phaeodactylum tricornutum microalga
a la Clase Bacillariophyceae
Figura
3
Esquema
de acondicionamiento de la
tricornutum
Figura
4
en
Figura
Figura
5
6
7
Curva de crecimiento de la
8
9
perteneciente
13
microalga Phaeodactylum
con
20
microalga Phaeodactylum
el medio fl2 de
23
Guillard
24
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylum
tricornutum cultivada con medios alternativos segundo grupo
25
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylum
con
medios alternativos tercer grupo
26
Contenido de polisacÆridos sulfatados durante el crecimiento de
Phaeodactylum
Figura
marina
8
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylum
tricornutum cultivada con medios alternativos primer grupo
tricornutum cultivada
Figura
cultivo
los medios alternativos
tricornutum cultivada
Figura
un
tricornutum
en
Phaeodactylum
28
experimentales
Determinaci n de la actividad
de
los medios
especifica
de la SOD durante el crecimiento
tricornutumen los medios
experimentales
29
Lista de tablas
LISTA DE TABLAS
Tabla 11I
ParÆmetros de crecimiento de la microalga Phaeodactylum
tricomutum obtenidos de los medios
experimentales
Tabla IV
Evaluaci n de costos de los medios de
Tabla V
Reseæa que muestra los costos de los medios de crecimiento
al d a de mayor actividad de la SOD
Tabla VI
27
crecimiento
30
37
Tabla que muestra la probabilidad de obtener polisacÆridos
sulfatados al d a de mayor actividad de la SOD y el porcentaje
de costo en relaci n a los medios formulados
38
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I
ANEXO 11
Tabla 1 Formulaci n de medios de crecimieto para el cultivo de
Ph tricomutum y Tabla 11 Medio 16 f 2 de Guillard y Ryther
Estad sticos
de
Ph tricomutum
para el crecimiento de
15 litros homocedasticidad de Barlett
prueba empleados
en
t de student
ANEXO IV
ANEXO V
TØcnica para determinar la actividad
Xi2
y
51
TØcnica para la determinaci n de sulfatos
por el mØtodo azul AlciÆn
por NBT
49
en
polisacÆridos
espec fica
53
de la SOD
54
RESUMEN
presente trabajo
En el
medios de cultivo
en
la
evalu
se
microalga Phaeodactylum
crecimiento y de reactivos de alto valor
como
testigo
realiz
se
y los medios restantes
con
Urea nitrato de amonio y sulfato de amonio
foliar El
tiempo
cinØtica
de crecimiento de la
cuales s lo
se
y la actividad
polisacÆridos
en
microalga
calcularon los
super xido
de crecimiento
crecimiento
formulado
en
forma
k
cultivos
con
crecimiento
y 7
total
sulfatados
se
los medios
en
en
polisacÆridos
algunos
encontr
fue el que
resultando
sulfatados al
ser
igual
uno
con
cultivos estÆticos
agr colas
fertilizante
Se evalu
la
de los
con
todos los
los medios 2 5 8 9 10 Y 15 En cuanto los
resultados de
duplicaci n
td
se
el
observaron
el cuÆl
13 2 44
que
ml
lg
a
lo
en
el mayor costo
El
la
completos
en
que el medio 6 aœn mÆs barato
n
tasa de
el
medio 13
encontrarse
contenido
mayor a
de
de los
de la cinØtica
de
de la actividad fueron
85 U mg
representado
contenido de enzima tuvo
de los mÆs
en
largo
promedio
en
result
medio f 2
Los mÆximos valores
alcanzando
neta
producci n
manteniØndose
con
Ryther
de crecimiento el contenido de
alrededor de los 80
el medio
menor
en
parÆmetros
en
los medios 4 y 11
ser
el medio f 2 de Guillard y
fueron adicionados
del
super xido
volœmenes de 15 I durante 12 d as
tricomutum
los medios 3 4 6 9 Y 11
embargo
costo del 22
por Ph
sulfatados y
la combinaci n de fertilizantes
ultrafos y N P K
experimentales
Sin duda el f 2 result
sin
y tasa de
r
asimilable
excepto
encontrados
mejores
nitrato de amonio
mejor
polisacÆridos
los
rendimiento
con
con
optimizaci n
dismutasa Al analizar el crecimiento
medios existieron diferencias significativas
parÆmetros
tricomutum para la
de acondicionamiento fue de 14 d as
de 9 medios
el costo y el efecto de 16
agregado polisacÆridos
dismutasa La formulaci n de los medios
utilizado
nivel de laboratorio
a
con
el 8
los d as 6
con un
El medio 1
cuanto
en
a
55
representa
del
un
la actividad y
del costo total
ABSTRAeT
In the
culture
present work to
and the SOD
polysaccharides
ammonium sulfate
toliar fertilizer
growing
taeked
to Guillard
medias altemat ves
fertilizer
The
kinetics
evaluate in
2
f
the
15166 k
a
conditions in time
teehnique Significant
0 11 Y td
ot protein and the sulfated
activity SOD
poliysaccharides
80 Ilg ml However for the obtention of
is recommendable to
use
the
14
during
days
12
differences
growth
maxim
was
enriehment with
in batch eultures
T he
were
aleian blue assay and the
found in the kinetie
microalgal growth
was
content
were
were
with 3
were
days Diary samples
polysaccharides by
and the minimal
2 8 The
Some
urea
was
studied in 15 I volume cultures
pn 18
the content of sulfated
grow ng
with culture medias 2 5 8 9 1 O and 15 The maximun
the media 13 with
the cost and the effect of 16
The formulations of the medias
to determine the content of sulfathed
SOD activity by NBT
on
ammonium nitrate and
microalgae
was
activity
laboratory conditions
was
for f 2 media with
growth
obtained in
a
pn
5
r
found in the media 3 with 95 U Ilg
was
similar in all cultures medias with
polysaccharides and aetivity SOD
media culture 6 the which is
cheaper
at the
same
than f 2 media
time
J
1
lNTRODUC I N
0
1 1 Generalidades sobre el cultivo de
La acuacultura
agua
tendiente
considera
se
racionalizar la
a
microalgas
como una
explotaci n de los
proporcionando alimento reactivos biol gicos
industria
es
las que
se
y
seguirÆ siendo limitada por las
y
principales alcances
sus
actividad
cuenta
se
dirigida
a
en
trabajo La contribuci n de la acuacultura
naturales
reservas
el
acuÆticos y comercializarlos
recursos
encuentran a el conocimiento de la
b resolver los
producir organismos
problemas de la alimentaci n
de
estudiar y
la
que dentro de
manera
biolog a de las especies
c
a
con
conocer nuevas
sustancias de interØs comercial y d obtener el control del ambiente acuÆtico
JuÆrez
1987
Garc a y Cabrera 1985
Entre los
localizan
el medio marino
en
existiendo
organismos mÆs cultivados
en
dulceacu cola
formas tanto unicelulares
capacidad de realizar fotos ntesis
con
primprios
de la
en
y
como
y
encuentran las
se
parte de
tales
como
al constituir la base de las cadenas tr ficas
son
Brown el al
Se estima que existen
1997
organismos microsc picos
considerados
como
productores
produciendo material orgÆnico
energ a solar bi xido de carbono yagua Raymont
a
partir
Maxey 1994 Beneman 1992
y
aproximadamente 30 mil especies distintas de
microalgas consideradas responsables de la producci n de materia orgÆnica encontrada
los ecosistemas acuÆticos
1985
Poseen clorofila
mayor diferencia
que
a
y casi del 60
caracter stica
de la fotos ntesis
total del
comparten
varias
que
podemos mencionar
reproducci n
En
algas unicelulares
siendo as
las
plantas superiores donde
ello
en
AdemÆs
tanto
plantas
como
se
los ecosistemas terrestres
Son
multicelulares
las cuÆles
microalgas
la cØlula
es
entre
en su
con
planeta Bold
una
microalgas requieren de
estructura
planta
una
totalidad funciona
necesaria
Wynne
y
plantas sin embargo
microalga y
una
como
en
es
gameto
la
su
no
especializada para
nutrientes para
su
crecimiento
Dawes 1981
Desde los aæos cincuentas las
1953 para
ser
incorporadas
como
microalgas fueron consideradas por Jorgensen
parte de
la dieta humana
el desarrollo de manufacturas de los extractos obtenidos
industria alimenticia
obteniØndose
resultados
no
se
un
anÆlisis econ mico del cultivo de
microalgas
se
puede considerar rentable lo que
ha
permitido
lo que di
con
distintas
muy alentadores
consecuencia
aplicaciones
Por otra
puede hacer evidente
y alentado
como
y Convit
parte
en
la
al hacer
que dicha actividad
significativamente
la
producci n
2
de
microalgas
los aæos recientes
en
llegÆndose
Chlorella bajo condiciones de cultivo
comercializada tanto para biomasa
alto valor
a
el cultivo de
esto
cultivo fÆcil asimilaci n y
la obtenci n de materia
como
producci n que
es
productos secundarios de
un
la
para
orgÆnica
1980
As
colorantes
inhibidores
poliinsaturados Ahern et al
ventajas sobre
de tal forma que
tipos de
se
han ido
y comercializaci n para
producci n
en su
otros
partir de la energ a luminosa Se han desarrollado cultivos
de
1983
de
compuestos
una
Canell
Cohen et al
mucilaginosos compuestos metab licos
con
y c1arificantes Aronson et
variedad de compuestos
proteasas
et
1988
enzimas
prote nas
tomo
agentes saborizantes
pueden obtener
se
los
incremento
un
comercial
explotaci n
mismo
como
a
ofrece ciertas
alta tasa de crecimiento
permiten
carbohidratos Æcidos grasas
activos
forraje as
para
microalgas
digesti n
desarrollando tØcnicas que
al
Ben Amotz et aJ 1982
campo
como
tener hasta 100 toneladas por hectÆrea de
agregado
Aunado
algales
en
a
al
farmacol gicamente
Æcidos
1988
Lee et al
actividad antibacteriana
1988
grasas
polisacÆridos
FÆbregas el al
1991
Prevenci n y control de enfermedades
Las enfermedades infecciosas
sistemas de cultivos
en
consideraci n los altos ndices
de mortalidad que
alto desarrollo de la industria
del salm n
anguila
realizado estudios sobre la naturaleza de los
ya desde la dØcada de los ochenta
bacterianas cutÆneas
parasitarias
avanzado
externas
en
subtropicales
profilÆcticas
como en
y
lo
en
dif cil
la
internas de
referente
lo que
se
a
presentan
y trucha
dramÆticas si
en
estos
en zonas
se
toma
en
organismos En el
templadas
se
han
agentes causales de dichas enfermedades
y
hac a
menci n
como
treinta enfermedades virales y mÆs de cien
a
las mÆs de veinte enfermedades
especies de interØs comercial
enfermedades de
ha convertido
terapeœticas para
en
un
marinos
peces
verdadero
sin
embargo poco
de
zonas
reto el contar
contrarrestar infecciones m crobianas
con
tanto
en
se
tropicales
ha
y
alternativas
acuacultura
medicina veterinaria y humana
El costo para la
es
as
y sistØmicas
e
se
se
son
prevenci n
de estimar sin
producci n debido
del 10 al 15
embargo
a
sobre el 30
y control de enfermedades infecciosas
se
en
cultivo de peces
puede predecir el impacto econ mico de la disminuci n
procesos infecciosos las
del costo total
pØrdidas pueden fluctuar
JimØnez et al
1987
en un
rango
3
Dado que
cultivo de
el
en
agua
ocasiones resulta dif cil determinar los factores que alteran la calidad de
en
organismos marinos
mecanismos de control de infecciones
Sin
la
embargo
quimioterapia
en
regulaciones sanitarias sobre el
uso
se
la
acuacultura
la
aunque
existen
el
en
mercado
algunas
desarrollar procesos de rutina
estos
1994
en
gran
en
gran nœmero de fÆrmacos
la
vacunas
del
como
el
medida
Østas
comerciales
De
de inmunoestimulantes
uso
lo que
profilaxis
las
que Østos
profilÆctica
estÆn
aqu
que
se
y
dirigidas
se
que
nos
han
permitan
provocar a el desplazamiento paulatino
en
la cadena tr fica
Heltnes y Roberts
empleo de inmunoestimulantes naturales representa
atractiva para controlar y
en
de
y por lo tanto la disminuci n de los efectos adversos que
compuestos pueden generar al incorporarse
Por estÆ raz n
medida
por lo que recientemente
problemas infecciosos de peces de agua dulce
a
orientado estudios al conocimiento
un
antibi ticos
posibilidad de establecer esquemas de vacunaci n
principalmente
de
dependerÆ
de antibi ticos La raz n de ello estriba
a
como
de la familia Vibronaceae
producidas por especies
organismos desarrollan rÆpidamente resistencia
explora
emplean terapias de antibi ticos
prevenir infecciones
en
organismos
una
alternativa
marinos cultivables
1 2 PolisacÆridos sulfatados
Se entiende por monosacÆrido
un
polisacÆrido
1990
los
En
compuestos antibi ticos
que toman
molØculas
humano y
se
en
que
en su
estructura
sesentas
aæos
en
los
importancia
nuevas
algas marinas
en
Quatrano 1988
la
tengan
una
pared celular
estÆn asociados
adhesi n celular as
como
Dietrich 1977 Hook et al
presenta
Sierburth
la
1984
tambiØn
en
algas
actividades
regulaci n
cadena de carbonos
mÆs
de
la
no es
a
Pangburn
et al
1991
As
COS03
producci n
la necesidad de encontrar
el tratamiento de enfermedades
polisacÆridos
marinas
biol gicas
de
hasta los aæos setentas
como
Larsen et al
como es
en
el
el fucoidan que
1966
Kloareg y
el reconocimiento y la
receptores de comunicaci n celular Cassaro y
se
han estudiado
compuestos
relacionados
el sulfato de dextrÆn que tiene actividad anti adhesiva y anti inflamatoria
1976
monosacÆridos
radical alfa ester sulfato
1961
describe que
de ciertas
a
de 30
marinos debido
aplicaci n
se
un
una
existieron reportes sobre
productos naturales
veterinaria De esta forma
encuentran
carbohidrato formado por
el anhidro resultante de la reacci n
es
polisacÆrido sulfatado porque
Morrison
un
pues considerando la variedad de
usos
Raepple
como
et al
biomØdicos que
se
4
han
descrito sobre
confirmar la
en
sulfatados
polisacÆridos
estos
importancia de
enfermedades
Las
los
el humano y
compuestos
macroalgas
alto valor
agregado
atractivas
son
el
en
de
uso
como
como
de
de
podemos
variedad de
una
1979
microalgas para la obtenci n de reactivos
alternativa al
para
algas marinas
tratamiento
veterinaria Ehresmann et al
en
ventajas que representar a el
biol gicos de
aislados
uso
productos provenientes de
desarrollo
el
en
pensar
de
de
industria
una
biotecnol gica
1 3
Super xido Dismutasa
Segœn Ram rez
obtienen
travØs de la
a
contienen
organismos aer b os
oxidaci n de los
respiraci n
durante este proceso
molecular
reducido
los
1998
a
uno o
reactividad
super xido
dando
agua
lugar
mÆs electrones
del Ætomo
qu mica
02
de
5
molØcula
o
los cuales
per xido de hidr geno
tal
H202
el
es
e
la
energ a
son
molØculas
de los
caso
hidroxilo
consumido
ox geno
apareados que generalmente afectan
no
su
compuestos orgÆnicos por el ox geno
aproximadamente el
radicales libres
a
la mayor parte de
OH
en
o
no
es
Ætomos que
mayor
radicales
grado la
libres
tipo
cuyas reactividades
son
variables
La forma
propagar
la
protonada del radical super xido
perox daci n
I pidos
de
dando
radical
como
perhidroxilo
resultado el
puede dar inicio
estrØs
oxidativo
y
Para
contrarrestar el efecto de los radicales libres existen enzimas que secuestran catal ticamente
los
intermediarios de la reducci n
eliminado por la enzima
hidr geno
mÆs
convirtiØndolo
agua mÆs
a
reductores celulares
O2
02
O2
H202
2
H202
ox geno
seguida
e 2H
e
02
En
2 H20
RH2
y por
02
SOD
hidr geno
e
2H20
2H20
el radical
quiØn lo convierte
su vez
peroxidasas quienes
H
H202
a
como
es
HO
02
02
R
e H
H20
lo reducen
2H20
Super xido dismutasa
Catalasa
Peroxidasa
super xido
a
es
per xido de
removido por la catalasa
muestran tales reacciones
se
H202
2H
de
per xido
Es as
ox geno
super xido dismutasa
El
ox geno
del
a
agua mediante
5
Existen 4
tipos de enzimas super xido dismutasa dependiendo del grupo prostØtico
CuZnSOO
en
citoplasma de plantas y eucariotas Extracelularmente
en
flu dos
corporales de mam feros
Mn2 500
FeSOO
NiSOO
1 4
matriz mitocondrial y
en
en
citoplasma
de bacterias y
algas
espacio periplÆsmico de procariotes
citoplasma de levadura marina
en
Aspectos econ micos
Debido
a
que
generalmente hacen falta
recursos
econÆmicos para dar mÆs auge
investigaci n para la acuacultura la contribuci n de biotecnolog as
encaminados
corto
plazo
permitir a
control de la
en
la obtenci n de biomasa
y econ micos
la vinculaci n
Mohn 1978
la
a
En el
caso
podr an
ser
con los centros
del cultivo de
producci n masiva tiene
mÆs atractivos para el sector
investigaci n
costos
se
encuentra el
buenos resultados
costos muy altos
su
manejo
a
y
Shelef et al
1978
de luz
el
control de
factores que elevan
producci n masiva por lo que dentro del objeto de reducir
aspecto
respecto
ser
a
productivo lo que
precio muy elevado el suministro
temperatura el aire el bombeo de agua y los nutrientes resultan
gran medida los costos de
tecnol gicos
microalgas segœn Buitrago y colaboradores 1989
un
la
incluyan aspectos
que
tØcnicas de cosecha y procesos
institucionales de
a
de evaluar medios de crecimiento
los
a
econ micos que ofrezcan
los medios convencionales que ademÆ9
preparaci n
son
complejos
de
representar
6
2 0 ANTECEDENTES
2 1 Cultivo de
Desde
Microalgas
la dØcada
caracter sticas
de los sesentas
fisiol gicas
rendimientos de los
la obtenci n de
a
partir de Dunaliela salina para la obtenci n de mayores
productos de interØs y
composici n qu mica
de
varios estudios
microalgas
Newmark
microalgas
con
se
detectan los cambios
membrana
nitr geno
microalgas marinas
en
la
como
fuente de alimento y
entre otros
pigmentos y glicerol
trabajaron
con
nitr geno para estudiar
nitritos y
prote nas
microalgas que responden
a
no
el
tradicionales
masiva de
se
de carbohidratos y
tipo
llevan
a
cabo
el grosor de la
bajo diferentes concentraciones
1989
encuentra
microalgas
1993
Existen tambiØn estudios
diferentes fuentes de
con
composici n bioqu mica
ubicada
entre ellas
de
Fidalgo y colaboradores
agr colas segœn GonzÆlez
1993 cultivaron cuatro
y Voltolina
producci n
y colaboradores
conversi n de nutrientes y
fertilizantes
el fin de reducir
1984 realizaron cultivos de
Phaeodactylum tricornutum
microalga Phaeodactylum tricornutum
con
medio alterno para la
FrÆbregas et al
crecimiento
su
examina el crecimiento y
estandarizan el cultivo de seis cepas de
medios
urea
el cultivo de
se
y Maestrini
L pez El as
con
las
los cuales
marina Dunaiella tertiolecta
microalga
nitratos
en
como
1989
colaboradores
y
cuatro medios de cultivo
el cultivo de tres
El as
en
mejorar la producci n GonzÆlez Rodr guez
biomasa
La
como
como
diferentes medios de cultivo
en
microalgas utilizando fertilizantes agr colas
1995
aprovechamiento
1982
Se han realizado tambiØn
donde
su
productos de alto valor agregado
Ben Amotz et al
costos y
modulando las
implementaron tecnolog as
se
dentro del grupo
y Maestrini
1984
de
L pez
Phaeodactylum utilizando
los medios f 2 de Guillard y
Ryther
75 y 15
y el medio de cultivo los resultados demostraron que la calidad
segœn la especie
de la biomasa fue
cultivaron cuatro
galbana
1
y
independiente
especies
de
y
un
del medio
su
As
mismo
biomasa y
con
FÆbregas
microalgas Tetraselmis suecica
Phaedoctylum tricornutum en
para obtener
fertilizante para c tricos
tasas de diluci n entre
y colaboradores
Dunalie
la
tertiolecta
diferentes medios de cultivo Walne ES
constituyentes qu micos
como
prote nas
1989
Isocrysis
F 2 Y
Algal
carbohidratos y
7
l pidos
con
partir de Østos obteniendo diferencias significativas
a
cada
factorial
de los
uno
FÆbregas y colaboradores 1996
medios
de
l pidos
Para
experimentales
1
y
fico
una
tasa de renovaci n del 10
como reservas
energØticas
en
es
necesario realizar
el laboratorio y definir las condiciones
ptimas de cultivo
ventajas que el
las
cultivo de
tiempo de duplicaci n cada 24 horas 2 elevada
3
elevado contenido
condiciones de cultivo
cultivos
experimento
un
mejores rendimientos de biomasa y por lo tanto de metabolitos secundarios
particular Para ello
prote na
a utotr
especies y
densidad mÆxima de
una
lograr la producci n comercial del producto de interØs
obteniendo as
de interØs
6 mmol de N por litro
y carbohidratos fueron almacenados
escalamientos
a
de las
realizaron
Phaeodactylum tricomutum obteniendo
85x106cØlulas ml obteniendo 8 y
1996
una
compuesto de seis tipos de nutrientes y seis rangos de renovaci n para optimizar el
cultivo semicont nuo
donde
cada
en
5
proteico
escalamiento
heterotr fico mixotr fico
agr colas
microalgas ofrece
Juvera
tasa de transformaci n de nitratos
composici n bioqu mica dependiente de las
4
6
de cultivo hasta nivel industrial
y 7
son
producci n de 20
veces
crecimiento
mÆs biomasa que
en
los
convencionales
TØcnicas de Cultivo
La forma
de la
especie
a
en
la cuÆl las
microalgas
cultivar sino tambiØn del
objeto del
Se han desarrollado diversas tØcnicas de
En cuanto al
A
espacio donde
Cultivos Exteriores
En cuanto
a
la continuidad del cultivo
medio de cultivo
a
se
las
de estos cultivos
mayores
es
se
le
se
clasifican
s lo
depende
asigne al cultivo
de los
requerimientos
como
la
intemperie
segœn Orebes
a
1972
partir de
un
estos
pueden
in culo viable
ser
se
proporciona el
y œnica ocasi n
multiplicaci n celular por tiempo limitado presentando cambios
y la intensidad de luz dentro del cultivo El desarrollo del cultivo
realiza hasta la fase de crecimiento
uso
a
microalgas por primera
composici n del medio
que
no
bajo condiciones controladas
caracterizan porque
Este sistema soporta la
la
realiza el cultivo
cultivos realizados
Cultivos EstÆticos
uso
ampliamente
producci n dependiendo
cultivos realizados
Cultivos Interiores
B
se
cultivadas var a
son
exponencial
para fines de
y
se
bioensayo
o
en
se
utiliza el volumen total del mismo El
bien de transferencia
a
volœmenes
8
Estacionaria
t
Lento
crecimiento
del
Lag
Muerte
I
nœmero de
cØlulas
Oecimiento
exponendal
Adaptaci n
J
I
I
1
Figura
Curva
Modificado de
En la
microalga
representativa del crecimiento de
Fogg
se
la cuÆl
la
Fase de
no se
de 1
Fase
en
3 d as
etapa
siguientes
o
durar hasta cuatro d as
microalgas
de crecimiento de
etapas bien definidas
de mayor densidad de las
es
decir
cualquier especie de
la transferencia
curva
un
en
la cuÆl indica
volumen mayor de
1990
Al inocular
a un
medio
el nœmero de cØlulas Esta fase
en
travØs de
de crecimiento
microalgas
a
a
a
menudo
puede
retardar
nuevo
se
del tamaæo y del estado del in culo
Es cuando al
o
de
cultivo estÆtico
propias cØlulas La
retraso del crecimiento
dependiendo
geomØtrica
y las
Berbnabe
crecimiento inmediato
un
exponencial
forma
las
adaptaci n
registra
a
son
curva
consta de cuatro
composici n del medio
el momento adecuado para cosechar
medio las fases
la
pueden apreciar
registro para identificar
es un
un
1987
cultivo estÆtico
las cuales cambia la
s
y Thake
figura 1
en un
Edad del cultivo
adaptarse las microalgas
exponencial Se presenta del segundo
mÆs
dependiendo
al medio
empiezan
al tercer d a
a
aumentar
de in culo y
puede
del tamaæo del in culo y de la cantidad del medio
de cultivo
Fase de declinamiento
decremento
en
desfavorables
alanza
su
Dura
la velocidad
en
el cultivo
densidad mÆxima
aproximadamente dos d as
de
reproducci n
generadas por
de las
y
cØlulas
se
empieza
debido
a
a
manifestar
un
las condiciones
la fase anterior Al finalizar esta fase
el cultivo
9
Fase de muerte Se incrementa el nœmero de cØlulas muertas y
presenta la divisi n
El nœmero celular decae
factores adversos
el medio
Cultivos
en
Semi continuos
Son
concentraci n de biomasa
la
propia diluci n
fase
una
menor
Cultivos
grandes
Continuos
El
la
permaneciendo
con un
fase
es
recoge para
La
reemplazada
utilizaci n al final de la
su
con
medio de cultivo fresco
A travØs de Øl
pueden
se
producci n de microalgas durante varias
suplemento de
misma
cantidad
de
nutrientes
medio
frescos
la
que
volumen constante por lo que la
per odos de tiempo Las condiciones de cultivo
en
conjunci n de
intervalos frecuentes
a
mantener
implica
semanas e
este cultivo
es
la tasa
la que
a
son
se
da
se
cantidad
poblaci n
exponencial densidad del cultivo alta controlada
crecimiento
la
a
cultivos masivos
o
adicion ndose
en su
retira
se
se
de obra que el discontinuo
mano
sistemas interiores para la
volœmenes
diluyen
se
que
parte de cultivo
exponencial y la cantidad que
Requiere
exponencialmente debido
no se
monitoreada para estimar la frecuencia exacta de diluci n y
es
decir
es
cultivos
prÆcticamente ya
continuamente
de cultivo
es
retirada
mantenida tambiØn
y constante
durante
largos
controladas y el factor que controla el
aæade al medio fresco
ParÆmetros de Cultivo
Existen diversos factores que de forma individual
manera
A
importante
Luz
luminosa
Las
en
el desarrollo de cultivos de
microalgas
energ a
en
B
se
La
biomasa
microalgas
composici n de
microalgas
cÆmaras de
C
se
sitœa entre
la
de onda y el
longitud
un
no
hidr geno
a
estÆn
Debido
necesariamente
a
ptima
220C por lo que los cultivos
1986
temperatura
de
son
un
cultivo de
realizados
en
1995
que la concentraci n de ones
bien
la
a
en
requerimientos nutricionales
Se considera que la temperatura
rango de 150
pH
metabolismo
la radiaci n
Richmond
fotoper odo
energ a
y deben tomarse
microalgal responde continuamente
temperatura controladas Abalde el al
Potencial de
extracelular
la biomasa
de convertir la
espectro de luz visible
ambiental Este factor afecta reacciones celulares
y
influyen de
por medio del proceso de la fotos ntesis
encuentra dentro del
la intensidad
Temperatura
interactuando entre s
organismos fotoaut trofos encargados
metab lica
utilizada para realizarla
cuenta 3 factores
son
o
equilibrados
existe
de
un
H2 u OH intra
gradiente
y
de
10
concentraci n de
D
el mÆs adecuado estÆ entre 7 y 8
segœn la especie
lo que ocasiona
a
las cØlulas
evita la sedimentaci n y
y los nutrientes dentro
asegurando que permanezcan fotosintØticamente activas
previene la estratificaci n tØrmica
La concentraci n
Salinidad
crecimiento de las
de sales
microalgas
Richmond op cit
disueltas
inorgÆnicas
en
funci n de
puede potencialmente
actividad osm tica
su
ptimos de salinidad dependerÆ de cada especie ya que respecto
salinidad las
F
algas pueden dividirse
Nutrientes
cultivar
halotolerantes y halof ticas
en
La suministraci n del medio de cultivo debe
este deberÆ
ptimo
orecimiento
a
LEntre
constituye el 50
ser
los nutr entes
de
la biomasa
formulado de acuerdo
importantes
generalmente mezclado
aire
con
orgÆnica de las cØlulas algales
nitritos y amonio
aunque
El f sforo
crecer
La fuente de
es
la
urea
utiliza
estÆ involucrado
la
en
inorgÆnico
Algunos
nutrientes
espec ficos debido
estos por las
Kaplan
a
que
microalgas
Existen otros
tipos
miligramos por litro del
como
los
el mayor
cual
microalgas
y
se
suministra
y
en
este
caso
el
compuesto
op cit
primordiales que requiere
de f sforo
silicatos
para
son
componente de
su
se
la
microalga para poder
como
transferencia de
utiliza fundamentalmente
se
a
los cuales
requieren
medio de cultivo
en
se
las
diatomeas
pared celular
realiza durante la divisi n celular
de nutrientes
mezcla de compuestos que
el
op cit
son
se
carbono
especie
importante que conforma la materia
nitr geno orgÆnico
energ a y s ntesis de Æcidos nucleicos Como fuente
fosfato
de la
un
la fuente de carbono
es
de los procesos celulares
mayor a
lograr
nitr geno utilizada suele ser inorgÆnica nitratos
Kaplan
otro de los nutrientes
es
requerimientos
de las
la
a
1986
el elemento mÆs
es
a veces se
mÆs comœnmente utilizado
et al
adaptaci n
su
adecuada para
ser
los
Los niveles
Abalde op cit
de carbono
fico caracter stico
Kaplan
nitr geno despuØs del carbono
a
a
pueden mencionar el
se
microlagal El bi xido
celular durante el crecimiento fotoautotr
El
gran
dejÆndolos disponibles para el mejor aprovechamiento La agitaci n mejora la
distribuci n de la luz
afectar al
una
Richmond 1986
Agitaci n Se encarga de la distribuci n homogØnea de las cØlulas
del cultivo
E
travØs de las membranas
a
algas respecto al pH del medio de cultivo respondiendo de diferente
la
dependencia de
manera
hidrogeniones
La
requerimientos
incorporaci n
de
Kaplan op cit
les denomina micronutrientes
bajas concentraciones
en
son una
el rango de micro
La efectividad de la mezcla de estos
a
compuestos
11
requiere de
agente quelante
un
el EDTA
como
Entre los micronutrientes necesarios
se
encuentran
1
Hierro
necesario para todas
metabolismo del
2 Azufre
especies de microalgas
nitr geno fotos ntesis y s ntesis
utiliza
se
las
como su
fato
inorgÆnico
3
Calcio la cantidad de este nutriente var a
el
tipo de pared celular
4 Sodio
primeros
potasio
y cloro
son
imprescindible para
el
Kaplan op cit
fundamental para la divisi n celular
mucho entre las
universalmente
activadores enzimÆticos
como
de citocromos
es
y
Es
especies
y estÆ relacionado
con
requeridos por las microalgas actuando los dos
mientras que el
cloro
es
fundamental para
la
fotos ntesis
5
Magnesia forma parte de la molØcula
de clorofila y determina la
agregaci n de ribosomas
Kaplan op cit
6
Manganeso
y cobre forman
la cadena de
parte de
transporte electr nico
y
son
cofactores
de muchas enzimas
7
Molibdeno
8
Cobalto
sintetizan
9
en
en
necesario para la asimilaci n de
necesario
en
nitr geno
la vitamina
aquellas microalgas que sintetizan
812 las que
no
lo
necesitan cobalto pero si la vitamina
no
Tiamina y biotina
requeridas
en
bajas concentraciones
Selecci n del Medio de Cultivo
Dentro de los
medio de cultivo
a
desarrollo de las
aspectos
utilizar
Stein
modificaciones
satisfechos
con
1973
emp ricas
Sin
de cultivo
principal de nitr geno f sforo
vitaminas
considerar
El agua de
microalgas
enriquecerla Los medios
a
y
embargo
son
una
Es comœn
producciones
a
en
grandes
La selecci n
escalas
se
considerada
microalgas
como un
es
la selecci n del
medio ideal para el
hace necesario adicionar nutrientes para
muy diversos aunque todos coinciden
mezcla de metales traza
que
hasta que los
el laboratorio
el cultivo de
mar es
El medio de cultivo conocido
gran Øxito tanto
en
a
partir
de
un
requerimientos de
como
como en
se
la
microalga
es
en
fuente
quelantes
se
y
realicen
cuesti n
sean
el utilizado comœnmente
granjas de cultivo donde
Treece y Fax 1993 Juvera
del medio de cultivo
soluciones
medio formulado
f 2 de Guillard
las
con
en una
se
requieren
1996
basa inicialmente
en
los
requerimientos de
la
12
especie de microalga
punto de vista de
componentes
sus
utilizar fertilizantes de
Mart nez
cultivos
cultivar Anteriormente
a
bajo
costo pero
medio
Conway
en
en
1984
el desarrollo de 16
similar a la del medio
a
formulaciones
diferencias
1987
que la
la
la
en
simplificadas
a
existiendo
ocurre
encuentra formado
en una
solamente
en
un
por
son comunes
de
aparentemente
es
muy
EPA
amplia
y
se
El as
esta
la
a
pertenece
de 24 1 y
fue
alga cultivada
no se
encuentran
y colaboradores
1993
divisi n
en
Rangel 1985
triradial fusiforme y oval
dependiendo
de la forma
las extremidades anterior y
la valva sil cea
manosa
en
C20 5
s lo
la cuÆl
orgÆnica
crecen
Clase
Bacillariophyta
especie pertenecen organismos unicelulares
y bent nica
xylosa
cuando
el cultivo de
composici n bioqu mica de las microalgas cultivadas
medio
un
galactosa
como
se
importante de
la
estructura
lado y el otro
se
se
encuentran
Las formas fusiformes y
y las formas ovales
biol gicas
y
o
posterior En la
encuentra de
con
La valva sil cea
ha sido examinada y
l quido
y del Æcido
ha aislado de
se
fucosa y
Presenta diferentes actividades
eicosapentanoico
distribuci n
y vitaminas
formas ovaladas y ocupa el volumen mÆs
valva
jard n
Rhyter
de 3 formas
planct nica
compuestas de pol meros
medio de agar
de fertilizantes para
y el crecimiento del
el
Por otro lado
proporcionada por el medio f 2
la
con
microalga Phaeodactylum tricornutum Bohlin
tricornutum
detallada de la cØlula fusiforme
Æcido
a
base de fertilizantes
la
diagn sticas de
presentÆndose ampliamente
trirdiales
la formulaci n de los
nitr geno adicionando micronutrientes
de Guillard y
respuesta
consideran litoral marina
cØlula
la necesidad de
comparando los resultados
agr colas
probaron la combinaci n
Bacillariophyceae Orden Pennales A
naviculoide
experimentos basando
composici n bioqu mica
testigo f 2
Phaeodactyllum
plÆstido
en
aseguren altas concentraciones de
vez
significativas segœn lo mencionado por L pez
Caracter sticas
un
pone Ønfasis
se
complejos desde el
especies de microalgas marinas
ajustando la raz n de N P
evaluaci n demostr
con
medios
Karydis 1990 probaron cinco fertilizantes comerciales para
retrase mis suecica
En cuanto
la
a
realizaron
extractos de suelo como fuentes de
su
que
la utilizaci n de fertilizantes
FÆbregas y colaboradores
Corsini y
la actualidad
en
1988
GonzÆlez y Maestrini
medios de cultivo
en
basaban
se
la mayor
decosahexaenoico
crecen
en
productividad
DHA C 22
6
el
de
Su
Inglaterra Francia Finlandia Estados Unidos
y
13
principalmente de Espaæa
en
R ao
de Arosa Sus dimensiones
de 24
son
29 Lm
x
4 5 Lm
Round 1971
o
OL
2
Figura
Clase
marina
Microalga
Phaeodactylum
tricornutum
Divisi n
Bac llariophyta
Bacillariophyceae Orden Pennales Material torgado por Laboratorio
de
Zoolog a
Facultad de ciencias Universidad de Bretaæa Occidental Francia
2 3 PolisacÆridos Sulfatados
Los
polisacÆridos sulfatados
metÆstasis tumural
et al
1989
La
pepsina teniendo
Renn
1975
case na
incluyendo el fucoidan
Parish et al 1987 Commbe el aJ
Se ha
aplicaci n
in vilro
con
la subsecuente
polisacÆrido sulfatado que
Springer el aJ 1957
se
Larsenn el al 1966
de la enzima
anticoagulante
carragen na
la actividad
el tratamiento de œlceras
digesti n entØrica
encuentra
rep icaci n in vitro del virus HIV 1 por la
actividad
con
reportado tambiØn que la carragenina prolonga
sin interferir
la inhibici n
en
la
en
la
la
pared celular
pØpticas
de ciertas
1974 Y
una
mismo
se
Noda
de la
Stancioff y
digesti n gÆstrica
es
El fucoidan
de
un
algas marinas
capaz de inhibir la
de la formaci n de cØlulas
trascriptasa Baba el aJ 1990 as
Abdel F attahh el al
proteol tica
Stanley 1982
Kloareg y Quatrano 1988
supresi n
inhiben la
1987 Parish y Snowden 1988
carragenina interfiere directamente
una
y
gigantes
o
por
ha descrito que tiene
actividad antitromb tica directa
14
por la trombina 111
la misma forma
o en
mayor
manera
por el cofactor 11 de
han estudiado compuestos relacionados
se
tiene actividad anti adhesiva y antiinflamatoria
tienen dichos
1976
compuestos para interferir
Pangburnn et al
Percival
y
heparina Colliee et al 1991
como
esta œltima
el sulfato de dextrÆn que
mediada por la habilidad que
el sistema de
con
De
Raepple et al
complemento
1991
1978
Foyle
han
caracterizado
determinado
y
el
contenido
de
los
polisacÆridos de las macroalgas Porphyridium cruentum y Porphyridium aerugineum por
importancia
sometidas
la medicina
en
Otha y colaboradores
ciclo de luz noche d a
a un
de
gran
descubrieron que
algas inhibieron la destrucci n celular
la infecci n de
encontraron que
especies
estas
presentan una producci n sustancial de Æcidos grasos
poliinsaturados Ehresman y Hatc 1979
extra dos
1992
su
en
propiedades de polisacÆridos
mam feros causada
Herpesvirus y Rhinovirus proponiendo
a
los
principalmente por
polisacÆridos
como
agentes de
importancia en quimioterapias antivirales
Se ha descubierto que las
farmacØuticos y
microalgas representan
compuestos biol gicamente
activos
una
fuente
como son
los
explotable de
recursos
polisacÆridos sulfatados
Borowitzka 1995
La
heprina
glucosaminoglucanos
mediadores
en
mam feros
las que
conocida
como
el mecanismo de adhesi n de
incluyen
Helicobacter pylori
Recientemente
inhiben
en
En el modelo
111
de adhesi n
aislados
se
se
determin
bacteriana
medida
Yersina
de adhesi n
GuzmÆn
sp y
en
como
tejidos
de
Neisseria sp
1999
en
como
cØlulas
el sulfato dextrÆn
epiteliales de piel
e
atofasciatus GuzmÆn et al 2000
de He ycobacter pylori
1997
Una
terapia
a
base de
a
l neas
celulares Hela
en
pat geno huØsped estÆ mediado
polisacÆridos sulfatados
Phaeodactylum tricomutum bloquear an
el proceso inicial de colonizaci n del
profilÆctica
presentes
pathogenic
polisacÆridos sulfatados
macu
funcionan
polisacÆridos sulfatados bloquean efectivamente el proceso
que
Helycobacter pylori evitando
sulfatados
bacterias
de Aeromonas veronni
Paralabrax
experimental
de Tetrasselmis
como una
Duensing et al
ha encontrado que
arenera
numerosas
Staphy ococcus sp
gran medida la adhesi n
intestino de la cabrilla
53 y kato
a
polisacÆridos
y
la adhesi n
de
huØsped considerado
esto
infecciones microbianas donde el proceso de citoadhesi n
por
polisacÆridos Daytoc
y Love 1993
15
2 4
Oismutasa
Super xido
500
Con los descubrimientos de la
han
super xido dismutasa por McCord
explorado los mecanismos fisiol gicos
super xido
y los daæos que estos ocasionan
desnaturalizaci n
todo ello
como
las molØculas
enzimÆtica
por
a
los cuales
son
y Fridoich
1969
los
generados
se
iones
los sistemas vivos entre los que destacan la
de
despolimerizaci n
polisacÆridos
mutaciones
resultado de la oxidaci n del Æcido desoxirribonucleico y la
lip dicas que las hace mÆs susceptibles
a
la
genØticas
peroxidaci n de
desintegraci n de las membranas
Halliwel et al 1982 Lunec et al 1984
En la medicina
ha usado
de diversos
patol gicos
Fridovich
cerebro
se
1975
rganos
a
la SOD
como
el
tratamiento para varios de los desordenes
como
Fostermann et al
h gado
Las enzimas SOD cobre zinc
controlar las enfermedades inflamatorias y reumÆticas
tambiØn
Oyanagui
se
1991
la
piel y
han utilizado
el
para
1981
Las fuentes mÆs utilizadas para la extracci n de este reactivo han sido eritrocitos
cerebro
h gado
Con el fin de
de
coraz n de humano bovino cerdo
conocer
mÆs fuentes de extracci n
Investigaciones Biol gicas del Noroeste
dismutasa
tipo cobre zinc de
Saavedra 1997
la
levadura
se
en
pollo
rata bacterias
el Ærea de
marina
a
Debaryomices hansenii
chthonoplastes Ram rez op cit
y levaduras
Patolog a Marina
ha aislado y caracterizado
ademÆs de realizar estudios sobre la actividad
cianobacteria Microcoleus
algas
la
del Centro
super xido
HernÆndez
super x do dismutasa
en
la
16
3 0
JUSTIFICACi N
Dado que el cultivo de la
producci n
s lo de alimento para
no
medios de crecimiento que
parte
se
preferentemente
cabo
a
observado que las
vulnificus
es
importante determinar
permita utilizar el
recurso a
encuentran asociadas
1994
con un
Teniendo
se
peces
cabrilla
en
de antibi ticos
expuestos
considera
determinaciones para
con
un
en
mayor efecto de
y
tegumento
la
orgÆnica Estudios
se
ha
V
o
maculatofasciatus
lesiones focales cr nicas
y
se
Hjeltness
y
superficie celular de los tejidos epiteliales de la
polisacÆridos sulfatados
en
incluir
a
generaci n
estudios anteriores
la eficiencia de
de cepas
se
en
de la cabrilla
polisacÆiridos sulfatados
la adherencia de
arenera
parte
ser
aislados de
de la
resistentes
en
Ph
terapia
ello tambiØn el
con
han realizado
microalgas resulatando
inhibici n
como
proceso infeccioso y reducir
un
subsecuente
por la cuÆl
conocer
Paralabrax
arenera
estrategia importante
grupo de 3 cepas de
branquias sangre
mar
patogØnesis microbiana del departamento de
que la utilizaci n de
ser una
y evitar la
Raz n
a
del
que estas bacterias tienen afinidad por residuos de
cuenta
anti adhesiva durante el tratamiento de
bacteriana
salinidad
alto contenido de materia
septicemias bacterianas
microalgas marinas podr an
compuestos
cualquier
a
siendo
Investigaciones Biol gicas del Noroeste CIBNOR
para
con
carbohidratos sulfatados
en
Vibrio y Aeromonas
especies Vibrio alginolyticus V anguillarum V ordaiii V salmonicida y
pat genas
son
encuentran
se
que
el laboratorio de
en
marina del Centro de
patolog a
especie
nos
producidas por los gØneros
son
aguas estuarinas
en
recientes llevados
uso
principalmente de moluscos
agregado
bajo condiciones de laboratorio
microorganismos cosmopolitas
mucosa
cultivo
ha observado que las infecciones bacterianas de mayor incidencia
organismos marinos
Roberts
en
alternativa para la
ser una
costo
Por otra
en
organismos
sino tambiØn de reactivos de alto valor
Rangel op cit
un menor
microalga Ph tricornutum puede
una
a
estos
serie de
la anti adhesi n
tricornutum
una
algunas bacterias sobre
Paralabrax maculatofasciatus GuzmÆn
op cit
Tomando
en
cuenta la
super xido dismutasa SOD
importancia farmacol gica
como
parte
de
sus
y
cosmetol gica que
productos
es
tiene
necesario contar
con
la enzima
fuentes
a
17
partir de las cuales
se
pueda aislar
esta enzima
El
especies potenciales al manejo para la obtenci n de
rentabilidad
manipulaci n abundancia y econom a
para la determinaci n
posible
nueva
del contenido de la SOD
fuente de obtenci n
principal interØs radica
este reactivo
en
lo que
en
se
encontrar
refiere
a
la
lo que hace atractivo abordar el estudio
en
los cultivos de
microalgas
como una
18
4 0 OBJETIVOS
4 1
Objetivo general
Determinar el contenido de reactivos de alto valor
y enzima
super xido dismutasa SO O
en
agregado polisacÆridos sulfatados
Phaeodactylum tricornutum durante
su
cultivo
con
medios alternativos
4 2
Objetivos Particulares
4 2 1
Evaluar medios alternativos de crecimiento para
de fertilizantes
4 2 2
Evaluar la
4
2
base
agr colas y los parÆmetros de crecimiento
a
lo
largo de las fases de crecimiento cultivada
Determinar el contenido de
super xido dismutasa SOD
los cultivos de Phaeodactylum tricornutum
4
a
producci n de polisacÆridos sulfatados extracelulares de Phaeodactylum
tricornutum
2 3
4
Phaeodactylum tricornutum
con
agregado
a
los medios alternativos
travØs de
su
actividad
en
medios alternativos
Evaluar los costos de los medios de crecimiento y
la obtenci n de reactivos de alto valor
en
sugerir los mÆs convenientes para
19
METODOLOG A
5 0
presente trabajo
El
se
realiz
en
Biol gicas del Noroeste CIBNOR
como
el
equipo bÆsico Se cont
ya que
as
mismo
Biolog a Experimental donde
Div de
partir de
un
cultivo
las instalaciones del Centro de
se
Se tuvo tambiØn la vinculaci n
se
la infraestructura necesaria
a un
as
microalgas de la
Phaepdactylum tricornotum
la cepa de
pas
el laboratorio
con
con
el apoyo del laboratorio de
con
proporcion
gel y posteriormente
en
cuenta
se
Investigaciones
medio
l quido
en
a
tubo de ensaye
experimental de acuacultura de la Unidad
Pichilingue UABCS para el escalamiento de los cultivos algales
de
Medios de Cultivo
La
microalga considerada
medios de interØs
fertilizantes
anexo
preparados
Antes de iniciar
en
con
presente trabajo fue cultivada
luz sistema de
con
en
los
tricornutum
los cultivos masivos
la
segœn
sus
microalga
se
someti
a
cultivo estÆtico
t 20C
20
constante
requerimientos de preparaci n
El proceso de acondicionamiento de la
A
el medio f 2 y
las diferentes combinaciones y concentraciones de
lÆmparas cool and white de 40 watts y temperatura
medio f 2 de Guillard
medios fue el
en
1
Condiciones de Cultivo de Ph
con
el
en
tricornutum
microalga Ph
a
los diferentes
siguiente
partir del cultivo flstock
f 2 de Guillard y
se
del laboratorio
inocularon por
en
se
mantuvieron
en
utiliz
se
matraces de 125 mi de
duplicado
volumen de 75 mi del mismo medio Estos
dos tubos de ensayo
el medio
capacidad
con un
condiciones de cultivo por 7
d as
De los matraces de 125 mi considerados
250 mi
con
Guillard
150 mi de cada
uno
en
cada
stock
de los medios alternativos y
Se mantuvieron creciendo
microalgas obtenidas
como
uno
en
se
inocularon 15 matraces de
como
testigo
estos medios durante 7 d as
de los medios
se
volvieron
a
se
emple
el f 2 de
Posteriormente las
inocular
en
matraces de 1
20
litro
con
como se
500 mi de medio alternativo y
observa
en
la
figura
No
su
mantuvieron por otros 7 d as
se
3
Tubo de
Temperatura
constante
testigo las cuales
CuItM
StocK
ensayo
CambIo de medio fresco cada 2
semanas Medio f
2de Guillard
i
20C
t2
luz indirecta
Matraz
Erlenmeyer
125 ml
Con 75 ml de medio de
2 de Guillard
QJltNo f
Tlempo
7
dras
Jl Jl
iI
Tiempo
g
recta conn
dtas
7
Matraces de bola
fondo
mi
plano
con
con
de 1000
500 mi de
medio de OJItNo
alternativo
uz
2O2OC
continua y
directa
Matraces
Fembacn 28OOm1
con
1 500 mi de
mediO de cultNo
alternativo
20
20
luz
continua
directa
3
Figura
Esquema del acondicionamiento de la microalga Phaeodacty
Tomado de Mart nez
A
cada
partir de
uno
los cultivos estÆticos
microalga
se
tricornutun
con
15 litros de
1998
de los medios de cultivo
cultivos de la
um
a
se
inocularon
evaluar y
mantuvieron
en
como
bolsas de
medio
polietileno
testigo el f 2
de Guillard
estas condiciones durante 12 d as
Los
21
Evaluaci n del crecimiento
Cuenta Celular
Para hacer la evaluaci n del crecimiento de la
bolsas de 15 litros
muestras diarias de cada
tratamientos durante 12 d as las cuales
el cÆlculo de la densidad
se
cÆlculo del nœmero de cØlulas
No de cØlulas mi
x
se
se
uno
fijaron 1 mi
realizaron conteos
por mi
microalga estudiada
realiz
de los cultivos
con
en una
2
se
tomaron de las
con
los diferentes
gotas de soluci n fijadOra
cÆmara de Newbauer
de acuerdo
a
la
ra
mejorado el
siguiente f rmula
1X104
F O
Donde
X
promedio del
conteo de
cada
uno
de los cuadros
5
de cada
una
de las
rejillas
F O
1 x1
Los
es
el factor de diluci n utilizado para la muestra
04 constante para convertir el conteo obtenido
al
equivalente del
conteo
en
1 mI
parÆmetros empleados para evaluar el crecimiento de la microalga fueron
Guillard 1973
Per odo
de
crecimiento
mÆximo
pcm
nœmero
de d as
requeridos para alcanzar la
mÆxima densidad celular
Producci n neta pn
Rendimiento
diferencia entra la densidad alcanzada y la densidad inicial
diferencia entre la
poblaci n final
y
la
poblaci n inicial dividida
entre el
nœmero de d as transcurridos desde la siembra
Tasa de crecimiento
k
3 322
t2
t1
nœmero de cØlulas
k
logN2 N1
en
Tiempo de duplicaci n
2N durante la fase
medici n de las divisiones por d a
el
td
donde N2
es
a
partir de la ecuaci n
el nœmero de cØlulas
en
el
tiempo t2
y
N2
es
el
tiempo t1
tiempo necesario d as
para que N cØlulas
exponencial de crecimiento Se calcula mediante
la
se
transformen
expresi n
jf
td
J
en
In 2 k
c
v ßø
r
22
AnÆlisis EstÆdistico
Crecimiento de la
microalga Ph tricomutum
A los datos de crecimiento
que
nos
se
les
el crecimiento entre los tratamientos
Rohlf 1981
represent
se
t de student
aplic
como
estad sticos
de
en
prueba
Anexo 11
Reactivos de alto valor
Se
prueba de Homocedasticidad de Barlett lo
emplear estad stica paramØtrica Para determinar diferencias significativas
indic
Sokal
la
aplic
agregado
grÆficamente la desviaci n estÆndar para cada
de los ensayos
uno
realizados
5 2
Cuantificaci n del Contenido de 5ulfatos
Para
5 3
su
determinaci n
se uso
por la SOO
PolisacÆridos
el mØtodo del azul alciÆn
Determinaci n de la Actividad
La tØcnica
en
como
a
dato
lprograma
Anexo IV
Super xido Dismutasa 500
basa
en
la reducci n del cloruro de azul p nitrotetrazolio
reacci n que
es
seguida por
se
una
determinaci n
Posteriormente fue necesario determinar el contenido de
muestras
Ramus 1977
analizar por medio del reactivo de Bradford
indispensable para
de
espectrofotomØtrica
prote na
Bradford
el cÆlculo de la actividad enzimÆtica
computaci n desarrollado para
este fin
NBT
de cada
1976
ejercida
560
a
una
lo que
se
nm
de las
utiliz
espec fica mediante
VÆsquez JuÆrez et al
1993
un
Anexo
V
5 4
Evaluaci n econ mica de los medios de crecimiento
Se realiz
en
funci n al costo por gramo de fertilizante
formulaciones utilizadas
con
en
los cultivos de 15 I Y lo
el costo del f 2 evaluado por Mart nez
1998
en
empleado para
lo que saldr a
1
cada
m3 Øste
una
se
de las
compar
23
6 0 RESULTADOS
6 1 Crecimiento de la
En la
microalga Phaeodactylum tricornutum
figura No 4
microalga cultivada
Se observ
en
se
el medio f 2 que
que el
exponencial inici
presenta grÆficamente el comportamiento de crecimiento de la
desde el
cultivo
no
en
este
experimento
present
primer d a y termin
una
fase
el d a 10
a
consider
se
de
como
adaptaci n
partir del cuÆl
o
se
testigo
la fase
lag
inici
la fase de
muerte del cultivo
CinØtica de crecimiento de Ph œicornutum
en
7 00E 05
E
6 00E
medio f
2 de Guillard
l
05
I
G
5 00E 05
CJ
I
IV
ºæ
ªi
4 00E 05
1
3 OOE 05
J
2 00E 05
J
1 00E 05
e O OOE OO
I
123
4
5
6
Figura 4 Curva de crecimiento poblacional de
con
de 12 d as
Las
el medio de cultivo f 2 de Guillard
microalgas
cultivo estÆtico y
se
en
cultivo
con
agruparon de la
figura No
tratamientos 1
observar
9
10
11
12
la
microalga Phaeodactylum tricornutum
testigo
en
bolsas de 15 litros por
un
tiempo
evaluando la densidad celular
comportamiento segœn la presencia de
La
8
Tiempo d as
medio f 2
cultivada
7
una
6 7
5
nos
11 Y 12
proliferaci n
los medios alternativos
las faces de crecimiento
respecto la
tres formas de
t pica del
curva
siguiente forma
muestra
el
crecimiento
comparÆndolos
celular
presentaron
superior a
con
la que
de
el medio
se
la
microalga cultivada
testigo
present
en
En la
grÆfica
el medio f 2 As
con
se
los
puede
mismo el
24
desarrollo de las cØlulas
en
estos 5 medios
nos
mostr
un
comportamiento
en
el cual
se
pueden diferenciar todas las fases de crecimiento
CinØtica de crecimiento de Ph tricornutum
en
medios
alternativos
9 00E 05
8 00E
05
7 00E 05
6 00E 05
u
a
5 00E 05
4 00E 05
1i
3 00E
05
2 00E
05
c
CI
e
1 00E 05
O OOE
OO
2
3
4
5
6
o
Tie
1 d as
medio1
5 Curva
en
medio
de crecimiento poblacional
medios
alternativos 1
de amonio urea
y
ultrafos yP K Evaluando
d as
7 medio
6medio
N K P 11
de la
sulfato
sulfato
8
7
10
11
12
1
11 medio
microalga
9
Figura
2
12 mediof
Phaeodactylum tricornutum cultivada
de amonio urea
de amonio urea
la densidad celular en
bolsas
y ultrafos
6 urea
yN
P 12
61 12
N
sulfato
de 15 litros por un
tiempo
K P7
sulfato
de ramonio
de 112
25
Por otro lado
Y 14
f2
la
nos muestra un
sin
grÆfica No 6 del cultivo de la microalga
crecimiento inferior
excepto el medio 13
embargo el perfil de desarrollo
similar ya
es
en
los medios 2 3 4 8 9 13
en
comparaci n
no
que
con el
medio
presentan las fases de
crecimiento bien diferenciadas
CinØtica de creciniento de Ph tricornutum
en
medios
alternativ os
9 00805
8 00805
7 00805
¸
K
6 00805
J
T
1
6
7
5 00805
C
4 00805
1
3 00805
e
2 00805
1 00805
OO
OOE
2
3
4
5
Tiempo
medio 2
13
medio 3
medio 14
lIlmedio
Figura 6
cultivada
Curva de crecimiento
en
ultrafos 4
8
de la
urea
y N P
8
en
bolsas de 15 litros por
un
12
medio 8
il
n
medo 9
urea
y ultrafos 3 sulfato de amonio y
sulfato de amonio ultrafos y N P K 9
N P K 13 nitrato de amonio ultrafos y N P K 14
densidad celular
11
microalga Phaeodactylum tricomutum
medios alternativos 2 sulfato de amonio
sulfato de amonio
10
dias
medio 4
medio f 2
poblacional
9
n
O
urea
nitrato de calcio y N F
tiempo de 12 d as
urea
y
Evaluando la
26
En la
grÆfica de
microalga
en
la
figura
No 7
puede observar que al comparar el desarrollo de la
se
los medios alternativos 5
desarrollo de la
y por lo tanto
microalga
C nØtica
10 Y 15
no
con
el
medio f 2
se
aprecia
un
bajo
demuestran las fases de crecimiento
de crecimiento de Ph tricomutom
en
medio
s
alternativos
8 OOE 05
7 OOE 05
6 OOE 05
J
E
5 00E 05
4 OOE 05
O
g
il
e
3 00E
05
2 00E
05
L
1 OOE 05 j
6
I
1
O OOE OO
i1
1
1 OOE 05
2
3
4
5
6
7
8
9
11
10
12
Tiempo
1
Curva de crecimiento
Figura 7
cultivada
medio 5
en
en
medo 15
medio
U21
poblacional de la microalga Phaeodactylum tricornutum
medios alternativos 5
la densidad celular
medio 10
N K P 10
bolsas de 15 litros por
N K P 15
un
urea
N KP y
proroot Evaluando
tiempo de 12 d as
AnÆlisis estad stico
En
base al
ignificativa
cuales
se
en
estad stico
de
el crecimiento
con
observa
a
prueba utilizado
los medios 2
5
se
8
9
encontr
que
10 Y 15
simple vista que los medios experimentados
existe diferencia
respecto al f 2
muestran
un
en
los
crecimiento
inferior
Dada la deficiencia
emplearon los medios
contenidas
en
aplicar anÆlisis
en
este
con
los medios 2 5 8 10 Y 15
restantes para el anÆlisis de datos
el medio 14
en
el crecimiento
se encontraron
tipo de circunstancias
œnicamente
se
Cabe mencionar que las cØlulas
aglomeradas por lo que
no
fue recomendable
27
Par metros de crecimiento
los resultados obtenidos
Segœn
en
la tabla 111
producci n neta mÆs alta del 18
alcanza la
mÆximo rendimiento de 58791 cel ml y la
se
tiene que el cultivo
sobre los demÆs cultivos
segunda mayor
largo de la cinØtica de crecimiento durante los doce d as
contrario
el
cultivo
con
5
parÆmetros pn
el f 2 de Guillard obtuvo
respecto
a
los demÆs cultivos
15166 y k
bajos
0 11
ademÆs la tasa de
duplicaci n requiere de 2 8 d as para que las cØlulas
2n contra 1 3 d as
para el cultivo
una
en
producci n
muy buena tasa de
la
segunda mÆs alta de
Tabla 11I
ParÆmetros
medios formulados
t
medio 13 El cultivo
neta del 13
los cultivos
con
de crecimiento
D nde pcm
pcm d as
respecto
r
Y por el
los
todos
n se
transformen
en
presenta tambiØn
los demÆs cultivos que
a
lo
se
ubica
los medios alternativos
producci n
pn celml
en
a
respectivamente
el medio 1
con
presentados por Ph
tasa de crecimiento y td
rendimiento K
Medio
con
de 0 53
las bolsas de 15 1
los valores mÆs
r
y por lo tanto el
tasa de crecimiento
en
el medio 13
con
tricornutum cultivada
lular mÆxima
tasa de
pn
producci n
con
neta
los
r
duplicaci n
cel mld a
k divId a
td d as
1
8
486500
40541
0 30
3
10
261334
21777
45
0
4
1
4
9
367180
30598
49
0
4
1
6
9
241500
20125
0 17
4
2
7
8
428000
35666
0 19
2 3
9
9
269000
22416
20
0
2 2
11
8
549500
45791
1 3
1 2
12
9
396500
33041
0 38
1 6
13
9
705500
58791
0 53
1 3
F 2
10
182000
15166
0 11
2 8
1 8
6 2 Cuantificaci n de Polisacªridos Sulfatados
Referente
a
la
producci n de polisacÆridos sulfatados
microalga Ph tricornutum
i analizados
conservando
metabolito tuvo
en
la
figura 8
un
no se
un
observ
lo
largo del crecimiento de la
gran diferencia entre los distintos medios de cultivo
contenido alrededor de 80
comportamiento
a
con asensos
g ml Se
puede decir que
y desensos continuos
como se
este
puede
ver
28
Polisac ridos sulfatadoscontenidos durante el cultivo de
Ph
tricornutum
en medios alternativos
120
100
Œ
80
al
6O
o
40
e
Q
20
e
o
O
O
20
2
3
4
5
7
6
8
9
10
11
12
40
Tiempo
I
melo
d
iI
1
d as
medio 4
medio 3
medio 6
medio
71
Polisac ridos sulfatados contenidos durante el cultivo de
Ph tricornutum
en
medios alternativos
150
E
100
i
v
o
2
50
L
c
Q
º
O
o
o
2
4
5
6
7
8
9
10
11
12
50
Tiempo d as
medio 9
medio 13
Figura
Jhaeodactylum
8
Concentraci n
tricornutum
a
de
lo
medio 11
medio 12
mediofl2
polisac ridos
largo de
su
sulfatados
desarrollo
en
producidos por la microalga
los medios de cultivo estudiados
29
6 3 Determinaci n de la actividad
Si tomamos
presenta
seguida
partir
como
el d a 4
en
cuenta los d as
40 U mg de
con
super xido dismutasa
con
mayor actividad
a
observa que el medio 7 la
con
60 U mg de
prote na respectivamente considerados
Y por œltimo tenemos al medio 1 y f 2 los cuÆles
partir del d a 8 de cultivo
Actividad de la SOD
prote na
a lo
presentan
fig 9
con
medios altenativos
120
J
100
T
80
60
J
I
j
40
ii
r
20
f
t
o
2
3
5
4
6
7
8
9
Tiempo d as
14
O
i
EjMØd 04
Activ idad de la SOD
a
lo
Ph tricornutum
largo
El Medio6 E3
t
cl
de la cinØtica de crecimiemto de
cultivada
en
medios alternativos
I
I
1
o
1
o
3
4
5
tiempo
Figura
9
Actividad
espec fica
del crecimiento de la
micoalga
de la
6
7
con
9
d as
super xido dismutasa SO O obtenida
Ph tricomutum
8
medios alternativos
a
lo
a
estos
largo de la cinØtica de crecimiento de
Ph tricomotum
U mg
en
quinto d a presenta 85 U mg Los medios 3 4 6 y 11
100 90 95 y 90 U mg de
los valores mÆs altos
se
el medio 12 el d a 3
prote na
tenemos al medio 9 donde al
del d a 6
de mayor actividad
500
largo
su
30
6 4 Evaluaci n econ mica de los medios de crecimiento
Tabla IV Evaluaci n de costos de los medios de crecimiento formulados para
un
de 15 I durante doce d as
Medio
Fertilizante
Concentraci n gil
Costo por
Costo por m3 de agua de mar
TOTAL
1151
gramo
1
Sulfato de amonio
Urea
Ultrafos
3
Sulfato de amonio
Ultrafos
4
Sulfato de Amonio
2
F
0 032
08
03
0 00176
0 528
O es
0 032
1 6
0 191
0 013
O rol56
0 124
0 013
0 0147
0 191
N P K 20 20 20
0 03
0 0128
0 384
Sulfato de amonio
0 15
0 00176
P 12 00
Urea
0 0147
0 0736
N P K 20 310
0 028
42
0
Urea
0 1
0 0147
47
1
0 01
O 128
0 1
0 001 6
Sulfato de amonio
O
264
0
015
0
ro
0 176
0
O cm5
0 143
03
0 00176
0 528
Ultrafos
O es
0 032
1 6
P K 32 53
0 01
0 0036
0 036
0 1
0 00265
26
0
Ultrafos
O ro
0 032
0 16
N P K 13 2 44
0 015
0 0072
0 100
Sulfato de amonio
Nitrato de Amonio
0
1
1710 017
2 1281 032
0 491 00735
0 575110 0086
0
1
0 011
757
023
59810
128
0 015
P 12 61
01
0
0 0147
N
13
0 025
0 176
Urea
12
0 1106
001472
N P K 12 43 12
11
0 01472
0 00176
Urea
9
0 CXl75
0 1
N
7
0 264
0 013
Urea
6
0 15
0 00176
0 461 0069
147
2
0 032
164
0 5210 0078
20 12510 30
volumen
31
DISCUSi N
7 0
7 1 Crecimiento de la
microalga Ph tricornutum
en
volœmenes de 151
Selecci n del medio de cultivo
Las
microalgas
son
de combinaci n tanto
de la
orgÆnica
especie observado
ayudaron
a una
tricornutum
con
capaces de asimilar del medio el
en un
incremento de la
proliferaci n mayor que el f 2
como una
fertilizantes
inorgÆnica y la forma
como
esto
lo que concuerda
con
formas
ptima de asimilaci n dependerÆ
dado que hubo medios que
masa
en
distintas
en sus
puede considerar
se
especie capaz de desarrollarse
agr colas
Nitr geno
la
a
Ph
microalga
medios de crecimiento formulados
GonzÆlez
Rodr guez
y Maestrini
1984
quienes mencionan que seis especies de microalgas requieren s lo de nitr geno y f sforo
su
para
crecimiento
es
el
favoreciendo el costo de
es
cuenta que el valor nutricional de las cØlulas
y de la fase de crecimiento
lograr la utilizaci n
agr colas
es
que
se
en
adecuada
requiere de
Dado el hecho de que las
los med os
formulados
observa los cultivos
med o
AdemÆs
un
prÆctico
encuentra
una
1967
factores que
gran
m nimo para
su
quiere decir que todas
diferente
nuevo
pseudonana
en
el agua marina
hay que
pero
Asu
exponen
tener
en
algales dependen de las condiciones del medio
una
se
deben considerar para
ventaja que ofrecen
los fertilizantes
preparaci n
se
comportaron de igual forma
medio Mart nez
esta variarÆ
mencionan que las
por
su
op cit
el
cual
el medio Por otra
microalgas presentan
independientemente del medio de cultivo empleado
con
aun no se
explica que al cambiar una microalga
patr n de crecimiento
en
como se
ejemplo los cultivos
larga fase de adaptaci n lo cual indica que
composici n qu mica que provoquen los nutrientes
Thake
y eficaz
Ph
microalgas de algunos cultivos asimilaron los nutrientes de
presentaron
adaptaban del todo al
un
se
que
muy
avicularis
Fidalgo y colaboradores 1995
presentan diferentes fases de crecimiento
los medio 1 2 3 Y 6
a
no
promueven el crecimiento
cualquier combinaci n
de fertilizantes comerciales
uso
Nitzchia
Tetraselmis streata y Thalassiosira
agr colas
exponen que los fertilizantes
que el
de Dunaliella tertiolecta
caso
Skeletonema costatum
tricomutum
vez
tal
un
dependerÆ de la
parte segœn Fogg y
patr n similar de crecimiento
la diferencia que
presentan
se
ve
32
reflejada
con
en
la duraci n de cada
los medios 1
6 7 Y 11
crecimiento coincidiendo
as
medios
mismo
determina similitud
una
de las
etapas de crecimiento En
presentaron comportamiento similares
con
la adici n de
urea como
en
este
cuanto
nitr geno
fuente de
a
los cultivos
caso
a
las fases de
cada
uno
Fidalgo y colaboradores ap cit mencionan que el crecimiento
en
de los
con urea
las fases de crecimiento pero el contenido de materia celular
puede
llegar ser diferente
La
vez
no
por
embargo
del cultivo
curva
testigo f 2
haber sido sometido
un
mayor crecimiento
a una
con
rÆpidamente
la cØlulas asimilaron
no
las fases de crecimiento tan marcadas tal
present
diferencia
el mismo
la
composici n qu mica del medio Sin
comportamiento lo presenta el medio 11 el cuÆl
los nutrientes
explicado dado el grado de disponibilidad
en
en
pesar de
a
que
diferentes lo que
ser
podr a
encuentran ademÆs de la adici n
se
ser
con
el
fertilizante foliar ultrafos
Los
medios
5
10
y
se
formularon
œnicamente
concentraciones reiterando que forzosamente las
N P K
con
en
muy
bajas
microalgas requieren del enriquecimiento
del medio lo que demuestra que Østas cantidades de nutrientes
no
fueron las suficientes por
encontrarse asimiladas
La
esta
presencia de
especie
construidas
en
los medios 1
4 6 7
pertenecer al grupo de las diatomeas
por
composici n de
la fase de muerte
su
pared celular compuesto que
las cuales declinan
rÆpidamente
se
la
con
11
12 Y f 2
debe
se
requiere de s lice
vuelve limitante
en
las
presencia de ciclos muy
a
que
para
la
poblaciones
cortos Brown
et al 1997
ParÆmetros
f siccoos
qumi
La influencia de los diversos factores f sico
depende de la microalga
a
cultivar siendo los
qu micos
de 40 watts
equivalentes
cØlulas por mi
5 000
a
Fogg 1975
a
experimento
3020 lux lo que afect
ya que para cultivos masivos
10 000 lux Por otra
procesos
En este
qu micos que
se
en
en
de 10 I
parte la longitud de
llevan acabo
cultivo de
fitoplancton
requerimientos de iluminaci n los que var an
ampliamente segœn la especie ademÆs de que influye
densidad del cultivo
en un
onda
en
se
gran medida
utilizaron
la densidad
en
es
adelante
en
el volumen y la
lÆmparas Cool
White
esperada millones de
se
requiere
contar
con
la que afecta marcadamente los
el cultivo dado que esta fue la misma para todos
33
los medios de crecimiento
los resultados
no
en este
estuvieron directamente afectados
aspecto
Segœn Goldman 1977
en
este
cuÆl
Ph tricomutum
caso
puede encontrar
se
hace pensar que
que
otras
a
tasa de
su
especies
aumente
20
a
2oC ya
especie aislada de R o
op cil
de Arosa
en
Galicia
Espaæa la
temperatura m nima de 120C y mÆxima de 21oC lo que
al l mite
se acerca
sea
baja k
muy
tolerable para esta
1 3
Nannoc oris sp que por
como
la tasa de crecimiento
en
ser
la mÆxima
nos
especie ocasionando
experimental comparada
con
tropical alcanza hasta 3 divisiones por d a
Probablemente la tasa de crecimiento para nuestra diatomea
temperaturas de 16 y 17 oC
a
El
temperatura influye directamente
es una
a una
crecimiento
Mart nei
37 oC
la
pH observado durante los cultivos permaneci
considerado
esto por
Goldman y colaboradores
dentro del
1982
intervalo
7 1 9 8
como
adecuado para cultivos
entre
los que
masivos
Par metros de crecimiento
A
primera vista
resultados
menores
debido
puede considerar al medio 6
se
densidad celular sin
en cuanto
embargo junto
porcentajes de producci n neta pn
en
parte
gran
medio 6 comienza
a
con un
alto nœmero
la
en
de cØlulas y
muerte por lo tanto resulta muy poca la diferencia
La diferencia
principalmente
relaci n que
o
menor
en
el
indique
cuanto
en
al
una
mayor
concentraci n
de
nitr geno
baja
se
con
El medio 13 alcanza la
en menor
la
en
en
con
un
contraste
producci n
neta
mas
un
de
no
sin
present
alta
con
Por
embargo
de las
el
de la
existe
a un
mas
una
mayor
o
su
ejemplo La mayor
se
encuentra
en
la
bajas concentraciones
mejor crecimiento
el 18
del total
crecimiento constante y
el medio 1 alcanzando el 13
esta dada
de los nutrientes
buen crecimiento
con una
el medio 13 el cuÆl
es
la que el
grado la fase
poblaci n inicial
la combinaci n
al medio 3
poblaci n inicial muy bajo pero
tenemos el cultivo
presentar
en
esto
los 12 d as
a
es
indica
nos
suministr
el 7
nitr geno suministradas para
nœmero de
respectivamente
poblaci n inicial y la final
de cØlulas
simplemente
independiente la que
de
7 Y 5
mejores
representan los
concentraci n de nutrientes de acuerdo
o menor
concentraci n
mas
el medio 9 y f 2
grado de disponibilidad de los nutrientes generalmente
grado de asimilaci n
producci n neta
nœmero
6
con un
la diferencia que existe
con
dieron
producci n
presentando
rÆpido
en
un
seguida
neta el cual tambiØn
34
poblaci n inicial muy baja recuperÆndose mÆs tarde
una
presenta
asimilando tal
vez
recurso
buena calidad y
organismos
es en
en
present
los
N Pk 13
44
2
0 53 divs d a
lo que concuerda
el
en
experimento y
tasa
una
fertilizantes
Estos
con una
pn
5
con
7 2 Cuantificaci n de
reserva
manera
de carb n
que cuando
se
mas
partir
de las mÆs altas tasas de
tiempo de duplicaci n de 1 3 d as
Herrero y colaboradores
esta
en
se ven
especie de 0 9 para T
y medio f 2
la
los valores de
present
una
k
0 11 divs d a y
como
con
en
testigo Newmark et
mejor tasa de crecimiento
comparaci n
una
Chlorella sp
con
1 3
los demÆs medios
en
influenciados por el crecimiento celular
muchas diatomeas
sulfatados ya que
de
en
el d a
en
esto tal
Segœn Leninger 1975
vez
debido al
la bios ntesis
simples conduce
a
representan la
y
FÆbregas et l 1989 Fidalgo et al
nitr geno las microalgas
ser
observado
en
el
se ven
1995
ocurre
un
comportamiento
gran decremento
trabajo biosintØtico llevado
es un
proceso
a
de
en
seguido de
a
de
forzadas
el que comienza el crecimiento y el d a
alcanza la mayor densidad celular 3 y 7
de cØlulas muy
1991
galvana experimentadas bajo medios
present
rÆpida
baja la disponibilidad
recuperaci n inmediata
cØlulas
una
000 celmld a
producir carboh dratos para sobrevivir Esto puede
pol sacÆridos
en
ultrafos y
polisacÆridos sulfatados
Los carbohidratos
mayor
la
como
a
nitrato de s dio
con
el medio f 2 el cual
una r
15
Cabe destacar que el medio 11
la
el medio 13
bajos resultados del medio f 2 los mencionan para
considerado esto
divs d a
emplear
en
los medios alternativos
1991
experimentaci n comparando fertilizantes agr colas
1989
para la utilizaci n
microalga de
con un
y de 0 8 para l
Lo que contrasta
agr colas
parÆmetros mÆs bajos
a
cuenta
la
optima de duplicaci n de 1 2 para
de 1 5 para D tert olecta
td 3 d as
en
observada
FÆbregas y colaboradores
con
quienes mencionan
que
en
puede lograr
Ph tricornutum
concentraci n asimilable
como
recomienda
se
mejores resultados el cual fue formulado
crecimiento K
suess ca
cultivo ya que
esta circunstancia como se
En cuanto al rendimiento de
los
importante tomar
es
tanto para la extracci n de metabolitos secundarios
alimentaci n de otros
al
rÆpida
exponencial y el d a de mayor densidad celular alcanzada ya que para la utilizaci n
la fase
con
de forma
el fertilizante foliar
Independientemente de la producci n neta alcanzada
del
y
el
su
cabo por las
genØticamente programado que
la estructura misma de la cØlula viva
en una
JL
35
jerarqu a
de
en
no
de las cØlulas
qu micos caracter sticos
ensamblaje
creciente
complejidad
estructuras tales
incluye s lo la formaci n
a
como
de los
partir de precursores simples si
sistemas membranosos
componentes
no
tambiØn
su
elementos contrÆctiles
mitocondrias nœcleos y ribosomas
Precursores
MolØculas de unidad
simples
estructural
MacromolØculas
C02
Aminoacidos
ONA
NH3
Nucleotiodos
RNA
H20
Monosacarido
Prote
Acidos grasos
POLlSAC`RlDOS
Casi toda la
energ a metab lica
na
de las cØlulas
Membranoso
Nucleo
Sistematico
Mitocondria
Enzimatico
Reticulo
Ribosomas
endoplasmico
C oroplastos
microalgales
se
emplean para producir
trabajo biosintØtico Como las microalgas ejercen poco control sobre el medio
encuentran y del cual no
pueden evadirse
capacita para sobrevivir Es
experimentan
Las
un
como
su
habilidad para
muchos de los
en
el que
se
las
multiplicarse rÆpidamente
componentes qu micos de las cØlulas vivas
continuo recambio dinÆmico
prote nas
I pidos
polisacÆridos
otros
y
componentes
son
construidos
y
descompuestos continuamente de tal modo que la velocidad de s ntesis iguala la velocidad
de
descomposici n y
los descensos y
esta var a
ascensos
de
un
continuos
componente qu mico
en
el
una
1988
cuando
todas las enzimas metab licas
medios 3 6 Y 13 donde
densidad celular
se
observa
adaptaci n
tendencia
la Iinearidad llevados
disminuye la reproducci n celular baja
en
en
un
es
en
este
decremento de la actividad
los d as
la cinØtica
4 y 5
Debaryomyces hansenii
la
a
cabo
producci n de
experimento que
acompaæado de
de crecimiento
el efecto del
lo que
se
en
una
En el medio 9 la mayor actividad
composici n qu mica que el medio provoque Por ejemplo
levadura marina
a
Super xido Dismutasa
incluyendo la SOO y
principalmente
durante la fase de
explica
Ramus op cit
7 3 Determinaci n de la actividad de la enzima
Segœn Ram rez
otro Por esta raz n se
comportamiento de los polisacÆridos ademÆs que
experimentos anteriormente realizados indican
por el mØtodo de azul alciÆn
a
pH del medio
en
baja
ocurre
quizÆ pueda deberse
ha visto que
los
a
la
el cultivo de la
de cultivo sobre la
36
actividad de la enzima SOD estimula
7 Y
6
valores de
a
valores inferiores
el medio
en
cultivo
8
pH
a
5
90
con un
nos
presentaron valores de pH
ellos las
en
se
da
aumento
un
urea
a
la acidez
en
9 6 8 5 Y
contraste
en
gran medida al
contenida
con
en
5
igual que
a
mayor concentraci n
desde el comienzo del
provoc
los medios 7 12 Y f 2 los cuales
4 durante la cinØtica de crecimiento observÆndose
8
cierto que tambiØn la actividad de la enzima aumenta cuando
es
favorecido el crecimiento
7
hace pensar que la
pH ligeramente Æcidos
actividades
menores
Si bien
valores de
sobre las demÆs formulaciones
mayor tendencia
una
a
superiores la actividad disminuye
o
Esto
producci n
su
en
se
puede observar
en
se ve
los medios 1 3 4 11 Y 13 alrededor del d a
la actividad ya que al existir mayor nœmero celular la demanda de
O2 incrementa y por ende la producci n de radicales libres
Los mÆximos valores de la actividad fueron encontrados
alcanzando
en
tricomutum
podr a
comparables
a
Deb hansenii
74
promedio 85 U mg de prote na
considerarse
una
los d as
los medios 3 4 6 9 Y 11
6 y 7
Dado este hecho Ph
especie que presenta rendimientos satisfactorios
los valores encontrados
en
en
en
en
levaduras convencionales y la levadura marina
condiciones normales
Evaluaci n econ mica de los medios de crecimiento considerados
El
empleo de fertilizantes agr colas
producci n
son
y
de gran
inferir la fuente de
practicidad por
disminuye
su
en
rÆpida formulaci n
nitr geno que emplean para
su
fabricaci n
los costos
medida
gran
a
pesar de ello
y por lo cual
es
en
resultados
no se
las cØlulas
algales depende de las condiciones del medio y de la fase de crecimiento
se
encuentra
Østa representa
urea
como recurso
La tabla IV
de cultivo
actividad
dif cil
cuanto
en
que
Stein 1973
de cultivo fue la
nitr geno
de
pueden esperar siempre los mismos ademÆs de que el valor nutricional de
Entre los nutrientes que ofrecieron
d as
y
en
nos
uno
de los costos mÆs
para el crecimiento ideal
en
al adicionarse
cultivos masivos
costo de
de la actividad de la SOD
se
de tal forma que si
producci n Como
encontraron
en
se
en
los medios
bajos para la obtenci n de
muestra que la mÆxima actividad de la SOO
casi todos los medios
diminuye el
mejores rendimientos
se
Fidalgo op cit
ocurre
antes de los 12
cosecha el d a de mayor
pudo observar los mÆs altos valores
el medio 3
con
100 U mg al
sØptimo d a
lo que
37
el costo de
reducir a
2 128
0 032 si llevÆramos el cultivo
a
15 litros Se formularon medios que
los cuales
menores
de
Pn
o
de
s lo
AMA
PAM
CPAM
U
d as
1
1
15 1
mayor actividad
con
actividades
CT
Celiml
iS
0 78
0 0117
8000
1 17
3
7
100
7
0 032
0 018
400000
2 128
4
9
90
7
0 0073
0 004
400000
0 49
6
6
95
8
0 38
0 0057
600 000
0 57
7
11
40
4
0 011
0 0036
400000
0 75
9
7
85
S
0 6625
0 009
200 000
1 59
11
14
90
7
0 0069
0 004
590 000
0 46
12
10
55
4
0 032
0 010
400000
2 16
13
18
70
7
0 008
0 0046
600 000
0 52
f2
5
65
12
0 31
0 03
200 000
20 1
producci n
parte
si
3 y 7
se
se
ya que
5 d as
0 009 para 15 I y
es
justo
a
en
d as
esos
esto
para alcanzar el
0 066
es
excesivamente alto
53
tanto
enzimas
para 1
son
en este
del total
donde
el contenido de
recomendable el
como
no ocurra
polisacÆridos
empleo del medio 9 ya que
per odo de actividad mÆxima sin salir afectada
uno
de los
m3 Si ademÆs
es
los recomendados
al octavo d a de cultivo y de
Cabe mencionar que
actMdad mÆxima alcanzada PAMA
pcm AMA
a los doce d as
costototal
debe escoger el medio que el d a de mayor actividad
densidad celular los medios 1 y 6
respectivamente
costo al
Cl
requiere obtener del mismo cultivo
gran medida debido
requiere de
neta CPCM
densidad al poma
costo de poma DPAMA
producci n de polisacÆridos incluso representa
con
CPAMA DPAMA
S
rn
8
mÆximo crecimiento Pn
en
m
80
polisacÆridos sulfatados
disminuye
bolsas de
producci n neta alcanzada y el costo del medio
la mÆxima actividad de la SOD
13
otra
los d as
a
1
de ama CPAMA
Por
en
su
en
nos muestra la
Reseæa que
MEDIO
per odo
0 05 al d a de
mÆs de
0 018
56 U mg
decrecimiento
per odo
y
presentaron valores de 80 y 90 U mg excepto el medio 7 12 y f2
Tabla IV
PCM
no costaron
1m3
a
0 78 y
experimento
comparado
menores
ocupando el 2
necesario contar
con un
costo de
0 0117 para 1
el medio f 2
con
costos
la
con una
0 08 y
mayor
0 0057
m3
ademÆs de tener
un
el de los medios alternativos
precio
no
tuvo
38
muy notables
resultados
metabolitos
embargo s
los suficientes
buscados La elecci n del medio
considerando este trabajo
alto valor
sin
como
a
los doce d as
para obtener los
dependerÆ de los objetivos del investigador
primera aproximaci n para la obtenci n de reactivos de
la
agregado
Tabla VI Tabla que muestra la probabilidad de obtener mayor densidad celular y polisacÆridos
sulfatados al d a de mayor actividad de la SOD y el porcentaje de costo en relaci n a los medios
formulados
Medio
Densidad cel
Activ
SOD
Polisac
Sulf
e asta al d ade
aet
J
1
r
Dios de cultivo
1
22
8
3
X
X
6
7
4
X
X
1
7
6
i
6
8
7
J
2
4
9
X
2
5
11
X
X
1
7
12
J
J
6
4
13
J
X
1
7
f 2
X
53
12
X
X
X
J
39
8 0 CONCLUSIONES
1
La
de las formulaciones
mayor a
crecimiento resultaron
2
En cuanto
La
los
a
El
pH influy
observaron
cuÆl
4
result
en
el
Ph
agr colas
medios de
como
tricornutum
parÆmetros f sico qu micos
registrado
En cuanto los
base de fertilizantes
asimilables para el desarrollo de
temperatura influy
mÆs alto
3
ser
a
en
en
la tasa de crecimiento
el medio 11
la actividad enzimÆtica
en
a
parÆmetros de crecimiento
medio 13 formulado
encontrarse
El contenido de
en
forma
con
con
los
acidez
actividad
mejores resultados
nitrato de amonio
k
de pn
r
y td
se
44
2
el
13
ultrafos y N P K
mejor asimilable por Ph tricornutum que el medio f 2
polisacÆridos sulfatados
mayor a de los cultivos
provocando bajos valores k 1 3 el
los medios
se
encontr
alrededor de los 80 J g ml
experimentales
manteniØndose
lo
a
en
la
largo de la
cinØtica de crecimiento
5
Los mÆximos
encontrados
los d as
valores
de la actividad enzimÆtica de la
los medios 3 4
en
6 9 Y 11 alcanzando
Dado este hecho Ph
6 y 7
presenta rendimiento satisfactorios
y
tricornutum
comparables
en
super xido dismutasa fueron
promedio 85 U mg de prote na
podr a considerarse
a
una
en
especie la cual
los valores encontrados
en
levaduras
convencionales y la levadura marina Deb Hansenii
6
Sin duda el f 2 result
los demÆs
un
sin
en
el medio
embargo fue el que
costo del 22
completos
ser
al d a
cuanto
aœn mÆs barato
con
a
con
menor
representado
con un
contenido de enzima tuvo El medio 1
de mayor actividad de la SOO
actividad de la SOO y
el 8
el mayor costo
resultando
ser uno
sobre
representa
de los mÆs
polisacÆridos sulfatados al igual que
del costo total al d a de mayor actividad enzimÆtica
55
el medio 6
40
7
La elecci n del medio
trabajo
como
la
de los
dependerÆ
objetivos del investigador considerando este
primera aproximaci n para la obtenci n de reactivos de alto valor agregado
9 0 RECOMENDACIONES
Estudiar mÆs afondo la
biolog a
taxon mica de acuerdo al
Inferir si las formas
factores ambientales y
Efectuar
experimento
diferencias
en
el
encuentra Ph
se
del aæo diferente
los medios que
con
encontrar si existe diferenciaci n
tricomutum
posible efecto qu mico que ejercen
Øpoca
en una
especie para
tipo de forma
las que
en
de la
en
la que
se
en
son
cambiantes
a causa
de
el momento
realiz
el cultivo
un
segundo
mejor dieron resultados para encontrar si existen
comportamiento y la calidad celular debido
a
la variaci n
en
la
calidad
del agua
Profundizar sobre
requerimientos nutricionales
agotan mÆs rÆpido y cuales fueron los l mites
los que permanece el
nutrientes
alga sin disminuir
su
con
el fin de
conocer
de crecimiento
poblaci n
se
los elementos que
Conociendo los
puede proceder
a
per odos
se
en
suministrar los
requeridos y prolongar su fase de crecimiento
Experimentar durante el cultivo de la microalga condiciones f sico
inducci n de
ox geno
la actividad enzimÆtica
cambios de
temperatura
y
qu micas
como
la
pH para observar el comportamiento de
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El as
L pez
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Voltolina
con un
medio
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no
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G
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medios
de cuatro
semicontinous
19 2
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C
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C2
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phase C1 bound
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or
C4
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3
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239
to calculate
extracts Jour Miccobiol Methods 17 224
49
ANEXO I
Tabla 1 Formulaci n de medios para el cultivo de
MEDIO
1
3
5
7
9
FERTILIZANtE
Phaeodactylum tricomutum
mgn
MEDIO
Sulfato de amonio
150
2
Urea
75
Urea
6
Ultrafos 16 60
25
Ultrafos
15
Sulfato de amonio
300
Sulfato de amonio
100
Ultrafos
50
N Pk 19 19 19
Su fato de amonio
14
150
4
FERTIUZANTE
Suulfato de amonio
Urea
6
8
rng
100
13
N P 12 60
13
Urea
13
N P K 20 20 20
30
Sulfato de amonio
300
Urea
5
Ultratos
50
N P K 20 30 10
15
N P K 20 330
14
Urea
100
10
N Pk 13 2
44
20
N P K 12 43 12
10
12
Sulfato de amonio
300
15
11
13
15
Sulfato de amonio
100
Urea
10
Ultrafos
50
N P 12 61
15
N P 32 53
10
Nitrato de amonio
100
14
Urea
75
Ultrafos
5
Nitrato de calcio
150
N P K
15
N F 11 52
10
Urea
5
N P K 20 30 10
15
Proroot
50
50
Medio 16 F 2 Guillard and
Agua de
mar
Ryther 1962
1000ml
Metales traza
NaN03 75 mg
Agua destilada 1000 mi
Na2HP04 7H20 5 mg
Na2 EDTA 4 36 9
NaSi03 9H20 30 mg
FeCI3 6H20 3 15 9
Tiamina
HCI
100 9
4H20
MnC12
Biotina
0 5 9
Metales
CuS04 5H20 10 mg
0 5 9
Cobalamina
ZnS04 7H20 22 mg
traza
1 0 mI
CoC12 6H20 10 mg
pH del medio 7 5
Esterilizar
enfriar
NaMo04 2H20 6 mg
en
Mantener
vitaminas y los
fosfatos y silicatos
autoclave
en
refrigeraci n
a
15 Ib in2
frasco Æmbar
y
en
1
1Kg cm2
1200C durante 15 minutos
refrigeraci n
Por
metales traza En 1000 mi de agua de
Se esterilizan
esterilizan por filtraci n
en
180 mg
en
en
autoclave
a
15 Iblln2
separado
mar se
preparan
las
disuelven los nitratos
excepto las
membrana de fibra de vidrio GF C
se
Dejar
vitaminas que
se
previamente estØril Mantener
51
ANEXO 11
1
Pruebas estad sticas
empleadas para el experimento
en
bolsas de 15 I de la
microalga
Ph tricornutum
1 1
Prueba Homocedasticidad de Barlett
B
495
1
Decisi n
Por medio de la distribuci n
de que los datos
provienen de
una
Xi2
al nivel de
poblaci n
con
significancia 0 05 15 g 1
varianzas
homogØneas
1 2 Pruebea t de student
MEDIO
t calc
t crit
p
f2 1
0 33
2 07
05
f2 2
3 16
2 07
05
f2 3
0 5
2 09
05
f
4
2
1 14
2 12
05
f2 5
8 92
2 20
05
23
0
2 07
05
2 08
05
f
6
2
f 2 7
4
1
f 2
8
3 3
2 1
05
f2 9
2 4
2 07
05
f 2 10
8 1
2 20
05
f 2 11
0 35
2 2
05
f 2 12
0 58
2 02
05
f 2 13
1 16
2 08
05
f 2 14
1 6
2 07
05
f 2 15
6 0
2 13
05
se
acepta ra Ha
53
ANEXO IV
DETERMINACi N
DEL CONTENIDO DE SULFATOS EN
mØtodo del azul alci n
Se coloc
de
microalgas
en
se
mg ml
de
Se
ley
en
se
centrifugaron los tubos
Se hizo la
nm
JlI de Æcido acØtico 0 5 M pH 2 5 Y
JlI del colorante Azul AlciÆn
Æcido acØtico 0 5 M
610
JlI del medio extracelular procedente de los diferentes cultivos
les aæadieron 400
precipitaci n completa
a
pH 2 5 Y
dej
a
en
3000
se
agit
agitaci n
rp m
estÆndar
con
Æcido
preparado
nuevamente
en
a
se
una
el Vortex
agita en Vortex
concentraci n de 1
Para
alg nico
una
reacci n
tres horas
durante 30 min y el sobrenadante
La diferencia entre el blanco
curva
Por el
Ramus 1977
tubos 100
Se agregaron 50
EXPOPOLlSAC`RIDOS
es
proporcional
a
se
separ
la concentraci n del
para la cuantificaci n
y
se
poliani n
54
ANEXO V
RUPTURA CELULAR Y
DETERMINACi N
La enzima fue extra da
500
mezclando 250 j
Jg de biomasa
IJI de buffer de fosfatos 50 mM pH 7 8
15 min descansando cada 30
y
se
Realizaci n de
tom
curva
en un
se
estÆndar para cada
Mezcla
250 j
Jg de
contar
con un
ml
Buffer
Muestra I d
fJl
100
O
2
2
90
10
3
2
75
25
4
2
50
50
5
2
25
75
expusieron
a
la luz los tubos y
en
se
condiciones de obscuridad
leyeron
en
deteniendo la reacci n hasta que el tubo 1 di
Se calcul
la actividad enzimÆtica
absorbancias obtenidas y la cantidad
el
espectro
una
en
a una
lectura entre
por medio de
un
los tubos
programa de
computadora
Se prepararon los reactivos necesarios para obtener la soluci n Bradford
B
50 mi de Etanol 95
e
100 mg de Æcido fosf rico al 85
Q
850 mi de agua destilada
wv
se
nm
2 y 0 25
0
Cuantificaci n Proteica
A 100 mg de azul de Coomassie G 250
posteriormente
longitud de onda de 560
proteica de Østas
Reactivos
microcentrifuga
de las muestras
2
se adicion
mezcla
el vortex por
baæo de hielo para
en una
1
La
en
vidrio y
cuantificaci n
su
una
perlas de
eppendorf Se rompi
centrifugaron por 7 segundos
el sobrenadante para
Tubo
tubo
segundos Fue necesario
dejarlos reposar Posteriormente
Beckman
DE LA ACTIVIDAD 500
con
las
55
Procedimiento
Disolver el azul de Coomassie
en
el Etanol
Agregar el Æcido fosf rico
Aforar
a
1 litro
con
el agua destilada
La concentraci n final obtenida
en
wN y Æcido fosf rico 8 5
w v
4 7
la mezcla fue azul de Coomassie 0 01
w v
etanol
Fundamento
El azul de coomassie existe
cambiarÆ
prote na
su
color de
complejo tintura prote na tiene
medici n de la
estable
595
prote na
en
rojo
una
forma de 2 colores
a
azul El
aproximadamente
1 hora
complejo tintura prote na
alta absorci n
La uni n de la tintura
Su
a
rojo y azul Si la tinta
la
lo cual
prote na
permite
es
una
muy
se une a una
tiende al azul El
gran sensibilidad
rÆpida aprox 2 min
espectro mÆximo de absorci n
se
Curva de calibraci n
curva
que
se
utiliz
es una
la
yes
define entre los 465
nm
La
en
variaci n de la descrita por Bradford 1976