titulación por tesis angélica herrera sepúlveda

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
DETERMINACIÓN DE ENTEROPARÁSITOS Giardia lamblia Y
Cryptosporidium parvum EN AGUA RESIDUAL TRATADA DE
PLANTA DE TRATAMIENTO SUR, CANAL PRINCIPAL BAJO Y
SUS MEZCLAS
TITULACIÓN POR TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERA BIOTECNÓLOGA
PRESENTA
ANGÉLICA HERRERA SEPÚLVEDA
CD. OBREGÓN, SONORA
JULIO DE 2006
AGRADECIMIENTOS
Al laboratorio de Biotecnología ambiental por brindarme la oportunidad de
incorporarme a un excelente equipo de trabajo.
A mi tutor M. C Luciano Castro Espinoza, por dirigir el rumbo de mi proyecto,
por su ayuda, paciencia y comprensión.
A mis revisores Dra Hermelinda Herrera, M. C Lorenia Reyes y Norma P. Silva
por sus observaciones y correcciones que enriquecieron mi trabajo.
Luis, Ciria, Trinidad, Carlos, Rosario y Alma por su valiosa ayuda en el
desarrollo experimental y por hacer amenas las horas de trabajo.
DEDICATORIAS
A mis padres, por su incondicional apoyo, cariño, comprensión y ayuda durante
el trayecto de mi carrera.
A mis hermanos por ser un ejemplo de superación a seguir, y por fin poder
compartir con orgullo el ser “Ingenieros”.
A mi tía Mely por sus atinados consejos y recomendaciones que me ayudaron
a no temer al momento de adentrarme en el mundo de la ciencia.
Y a todas aquellas personas que creyeron en mí.
Gracias
ÍNDICE
páginas
AGRADECIMIENTOS
i
DEDICATORIA
ii
ÍNDICE
iii
Lista de tablas
v
Lista de figuras
vi
RESUMEN
vii
I INTRODUCCIÓN
1
1.1 Introducción
1
1.2 Antecedentes
2
1.3Planteamiento del problema
4
1.4 Justificación
5
1.5 Objetivo
7
1.5.1 Objetivo general
7
1.5.2 Objetivos específicos
7
1.6 Hipótesis
8
II REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Enfermedades transmitidas vía hídrica
2.2. Protozoarios
2.2.1. Giardia Lamblia
2.2.1.1 Clasificación Taxonómica de Giardia
9
9
13
13
14
lamblia
2.2.1.2 Ciclo de vida
15
2.2.1.3 Sintomatología
17
2.2.2 Cryptosporidium parvum
17
2.2.2.1Taxonomia de Cryptosporidium parvum
18
2.2.2.2 Ciclo de vida
18
2.2.2.3 sintomatología
20
iv
2.3 Técnicas empleadas para la detección de Giardia
22
lamblia y Cryptosporidium parvum
2.3.1 Técnicas inmunológicas.
22
2.3.1.2 Inmunofluorescencia
24
III MATERIALES Y MÉTODOS
25
3.1 Descripción de la zona de muestreo
25
3.2 Preparación de reactivos
26
3.3 Prueba de recuperación
28
3.3.1Determinación de la concentración del control
28
positivo.
3.3.2 Evaluación de elución del filtro
29
3.4 Análisis de la muestra
29
3.4.1 Recolección de la muestra
30
3.4.2 Elución del filtro
31
3.4.3 Flotación y purificación del sedimento
32
3.4.4 Prueba de inmunoflorescencia
33
IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN
36
4.1 Eficiencia de técnica inmunofluorescencia
4.2 Concentración de quistes y ooquistes
36
de Giardia
36
lamblia y Cryptosporidium parvum, en el periodo
enero-abril 2006
4.3 Fuentes de variación durante el muestreo y
41
procesamiento de la muestra
VI CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES
42
VII BIBLIOGRAFÍA
43
INDICE DE TABLAS
Tabla
Descripción
Página
No.
1
Principales enfermedades de transmisión hídrica y 10
agentes responsables
2
Proporción utilizada para la preparación de las series de 27
etanol - glicerol.
3
Monitoreo sin involucrar mezcla de agua residual
4
Monitoreo involucrando mezcla de agua residual tratada 35
con agua de canal principal bajo
34
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Descripción
Página
No.
1
Probabilidad de infección por ingestión de diferentes
13
células patógenas en diferentes dosis de respuesta
2
Imagen
de
Giardia
lamblia
vista
en
microscopio
14
electrónico
3
Ciclo de vida Giardia Lamblia
15
4
Vista al microscopio de Cryptosporidium parvum saliendo de su ooquiste
18
5
Ciclo de vida Cryptosporidium parvum
19
6
Ubicación de los puntos de muestreo en el recorrido del
25
canal principal bajo
7
Equipo necesario para la toma de muestra
30
8
Elución de filtro
31
9
Flotación y purificación del sedimento
33
10
Prueba de inmunofluorescencia
34
11
Quistes de G. lamblia y Ooquistes de C. parvum visto a
38
través de microscopio de epifluorescencia.
RESUMEN
Los entero parásitos Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum son reconocidos
entre los principales causantes de enfermedades emergentes transmitidas por el
agua, siendo los niños y pacientes inmunocomprometidos los mas vulnerables.
Debido a que estos parásitos poseen la característica de enquistar y les permite
prevalecer a pesar de condiciones climatológicas y procesos
habituales de
tratamiento de agua.
Por esta razón durante el periodo enero – abril 2006 se realizó monitoreo para
determinar la concentración
de quistes de Giardia lamblia y ooquistes de
Cryptosporidium parvum en el efluente de la planta de tratamiento sur, canal
principal bajo y sus mezclas; utilizando la técnica de inmunofluorescencia.
Además se realizó una prueba de eficiencia de
recuperación de la técnica
utilizando el kit A 100 FL AquaGlo GIC.
El porcentaje de recuperación de la técnica fue de 36% para quistes de giardia y
33% para ooquistes de Cryptosporidium. Se detectaron quistes de giardia en un
100% y un 76 % para ooquistes de criptosporidium dentro de las 17 muestras
analizadas.
Los resultados obtenidos permitirán establecer bases para estimar el riesgo de
reutilizar las aguas residuales tratadas como alternativa para el riego de la región
del valle del Yaqui.
I INTRODUCCIÓN
1.1 Introducción
La demanda creciente de agua para la agricultura, el consumo doméstico
(municipal) y la industria están imponiendo una dura competencia por la
distribución de los recursos
hídricos. Una de las principales actividades
económicas que demanda un mayor suministro de agua es la agricultura, ya que
esta actividad utiliza casi el 70% del agua extraída en todo el mundo. Una
alternativa para lograr una plena satisfacción de este recurso en torno a la
agricultura, es la utilización de agua residual tratada. Sin embargo, es de vital
importancia que el agua a emplearse cumpla con los parámetros de calidad
necesarios para su reutilización.
Dentro de estos parámetros se encuentran químicos, físicos y microbiológicos.
Los parámetros químicos involucran oxígeno disuelto, demanda química de
oxígeno (DQO), demanda bioquímica de oxígeno (DBO), los físicos olor turbiedad
y sólidos. En los parámetros microbiológicos destacan las determinaciones de
huevos de helminto, coliformes totales y coliformes fecales. A este grupo de
microorganismos se les conoce como indicadores microbiológicos.
Los microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento
similar a los patógenos (concentración y reacción frente a factores ambientales y
barreras artificiales), pero son más fáciles de identificar, a costos más bajos y a
2
menor tiempo. Una vez que se ha evidenciado la presencia de grupos
indicadores, se puede inferir que los patógenos se encuentran presentes en la
misma concentración y que su comportamiento frente a diferentes factores como
pH, temperatura, presencia de nutrientes, tiempo de retención hidráulica o
sistemas de desinfección es similar a la del indicador (Campos, 1999).
Es importante anotar que además de los patógenos que tradicionalmente se
encuentran en el agua, también están presentes aquellos que son causantes de
enfermedades emergentes. Este tipo de enfermedades comprende aquellas cuya
incidencia en los seres humanos ha aumentado en las dos últimas décadas
(Salvatella y Hortal 1998).
El aumento de este tipo de microorganismos esta relacionado con cambios
dramáticos en el ambiente y en la población. Frente a este fenómeno, surge la
necesidad de incluir nuevos indicadores microbiológicos debido a que se ha
encontrado que algunos microorganismos patógenos pueden ser más resistentes
a cloracion y otros factores de estrés ambiental. Algunos de estos son los
siguientes: virus entericos, quistes de Giardia, ooquistes de Criptosporidium, y
esporas de Clostridium perfringens.
En México, los enteroparásitos Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum, afectan
aproximadamente a 9 millones de personas. Se considera que la población infantil
es la más vulnerable. Específicamente en el estado de Sonora, diversos estudios
han informado de la presencia de infecciones por Giardia, tanto en población
urbana como rural (Díaz et al., 2003).
1.2 Antecedentes
3
En las últimas décadas, G. lamblia y C. parvum
se ha reconocido como agente
causal de parasitosis intestinal en el hombre, con intervalos de prevalencia entre 1
y 5 % en países desarrollados y mayores a 10 % en países en vías de desarrollo;
se estima que en México 2.3 % de los niños mayores de tres años sufren
criptosporidiosis (Casemore 1990).). Ambos organismos pueden causar severas
gastroenteritis, tanto para el hombre como para los animales si son ingeridos
(Paulino, et al., 2001,). La ingestión de estos parásitos puede ocurrir vía fecal oral,
ya que una de las características que presentan es que poseen la capacidad de
formar quistes u ooquistes los cuales son eliminados en las heces fecales del
hospedero.
G. lamblia fue el primero de estos organismos en ser ampliamente asociado con
enfermedades en los humanos, y han habido varios casos documentados de
Giardiasis transmitida por el agua desde 1970 (Rose et al., 1989). C. parvum emergió como una amenaza de las reservas de agua en 1980,
particularmente en Estados Unidos y en el Reino Unido, y desde entonces otros
países han reconocido brotes de crisporidiosis transmitidos por el agua. C.
parvum
causó
probablemente
el
brote
documentado
mas
grande
de
enfermedades gastrointestinales en un país desarrollado, ocurrido en Milwaukee,
Wisconsin, USA, en 1993 y en el que se estimaron alrededor de 403,000 casos de
la enfermedad, de los cuales 70 resultaron fatales. Este brote fue el resultado de
una contaminación del suministro de agua (Lecheveliar 1994). Sin embargo la
transmisión de C. parvum se encuentra asociada frecuentemente a guarderías y
alimentos.
En el Instituto Tecnológico de Sonora se han realizado diversas investigaciones al
agua municipal tratada, al agua residual sin tratar y al agua para irrigación de
cultivos. Además, se realizaron estudios del impacto microbiológico que
presentaron los vegetales al irrigarse con las aguas mencionadas anteriormente.
En un estudio realizado por Gortárez et al., (2003), se analizó la calidad
4
microbiológica y fisicoquímica del efluente de la planta tratadora Sur, encontraron
que el nivel de C. parvum (18 ooquistes / 100 ml) y G. lamblia (1200 quistes / 100
ml) es ligeramente superior a la dosis infectiva.
A partir de 1999, en el Instituto Tecnológico de Sonora, se llevan a cabo
monitoreos para determinar la prevalencia de los enteroparásitos Giardia lamblia y
Cryptosporidium parvum en el agua del canal principal bajo. El procedimiento
empleado para hacer este tipo de análisis es mediante la técnica de
inmunofluorescencia. Sin embargo, aun no ha sido determinado el porcentaje de
recuperación que presenta la técnica, por lo cual se requiere conocer el factor de
conversión para lograr determinar el número exacto de quistes de Giardia lamblia
y ooquistes de Cryptosporidium parvum. Así como minimizar las interferencias
presentadas durante el procesamiento y análisis de la muestra.
En este aspecto, se han realizado investigaciones alrededor del mundo para
determinar la sensibilidad que presenta estas técnicas en comparación con las
demás. Estos ensayos se han realizado inoculando una cantidad conocida de
quistes de G. lamblia y ooquiste de C. parvum en un volumen determinado de
agua, se les ha dado el mismo tratamiento que a una muestra ambiental y se ha
determinado el porcentaje de recuperación (Rose et al., 1990).
1.3 Planteamiento del problema
El agua es el principal recurso para lograr el desarrollo de la agricultura en la
región del Valle del Yaqui; sin embargo existe una gran problemática debido a la
escasez provocada por la falta de lluvias. Es de primordial importancia que el
abastecimiento sea lo mas eficiente posible. En lugar de propiciar el antagonismo
entre las diferentes actividades, es necesario generar información para el reuso
del agua en ciertas actividades, después de un uso primario. Cualquiera que sea
5
la actividad en la que se plantee el reuso, el agua deberá contar con la calidad
adecuada. En los estudios previos se ha detectado la presencia de las formas
resistentes de los parásitos (quistes, ooquistes, etc.) por lo que con este trabajo
pretendemos contestar la pregunta ¿Cuáles son las concentraciones de quistes
de Giardia lamblia y ooquistes de Cryptosporidium parvum en el agua residual
tratada de la planta de tratamiento sur de Cd. Obregón y el canal principal bajo?.
Con estos datos se podrá hacer una mejor estimación del riesgo de reutilizar las
aguas residuales tratadas.
1.4 Justificación
En gran parte del mundo, el agua contaminada, la disposición inadecuada de
desechos y la deficiente ordenación de las aguas, causan serios problemas de
salud pública. Enfermedades relacionadas con el agua afectan a más de dos mil
millones de personas en el mundo. La Organización Mundial de la Salud (OMS)
estima que más de 2 millones de niños mueren cada año por enfermedades
relacionadas con la ingesta de agua que no reúne condiciones adecuadas de
higiene.
En el agua residual de las ciudades potencialmente más de 100 diferentes tipos
de virus patógenos, bacterias y parásitos pueden estar presentes y causar
enfermedades como diarrea, meningitis, miocarditis y hepatitis, estas aguas
generalmente son tratadas en plantas de tratamiento municipal. En América
Latina según estimaciones del Third World Center for Water Management, solo
6% de las aguas residuales son tratadas y depuradas. (Aguiar et al., s.f.)
Con el crecimiento de la población mundial y el aumento del uso de agua por
persona, es necesario conservar el agua, regular su suministro, reducir el uso y
6
reutilizar el agua. Para lograr que se lleve a cabo la reutilización del agua, se
requiere que ésta cumpla con los requerimientos específicos para la minimización
de los riesgos para la salud humana.
La Norma Oficial Mexicana NOM 001 SEMARNAT 1996 establece los límites
máximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales en
aguas y bienes nacionales, incluye en uno de sus apartados la posibilidad de su
reuso, en caso de que sea agrícola esta no involucra parámetros microbiológicos.
No obstante, La Norma Oficial Mexicana NOM–003–SEMARNAT 1997 establece
los límites máximos permisibles de contaminantes para las aguas residuales
tratadas que se reusen en servicios al público y, adicionalmente los
microorganismos tales como coliformes fecales y huevos de helminto, han sido
los principales indicadores para determinar la calidad microbiológica del agua
(SEMARNAT 2006). Sin embargo existen microorganismos como Giardia lamblia
y
Cryptosporidium
parvum,
que
pueden
formar
parte
del
grupo
de
microorganismos indicadores, debido a que han sido reconocidos por tener un
alto potencial como
causantes de enfermedades trasmitidas por el agua y
comida.
En este trabajo, se monitoreó el efluente de la planta de tratamientos Sur de
Ciudad obregón Son (punto 1), así como del Punto 2 y 7, ubicado en el Canal
principal bajo, block 1610 Valle del Yaqui aproximadamente 4 kilómetros rumbo a
Quetchehueca, en el
periodo enero-abril del año 2006. Gracias a esta
información será posible estimar la concentración de quistes Giardia lamblia y
ooquistes de Cryptosporidium parvum;
adicionalmente, se
llevaron a cabo
pruebas para determinar el porcentaje de recuperación de esta técnica generando
así, generando así información que permitirá establecer bases para sustentar la
factibilidad de emplear el agua residual tratada como alternativa para el riego de
la región del Valle del Yaqui.
7
El presente trabajo formó parte del proyecto “Determinación del posible reuso con
fines agrícolas de aguas residuales municipales tratadas” con clave SON-2003CO1-008 , financiado en el año 2006 por fondos mixtos de CONACYT y el
gobierno del Estado de Sonora, a quien se agradece el apoyo económico y las
facilidades otorgadas para la realización del mismo. El trabajo experimental que
aquí se reporta se realizó en el Laboratorio de Ecodesarrollo, adscrito a la
Dirección Académica de Recursos Naturales del Instituto Tecnológico de Sonora y
fue dirigido por el M. C Luciano Castro Espinoza.
1.5 Objetivos
1.5.1Objetivo general
•
Cuantificar la presencia de quistes de Giardia lamblia y ooquistes de
Cryptosporidium parvum en agua residual tratada de planta de tratamiento
sur, canal principal bajo y las mezclas derivadas; por medio de pruebas de
inmunofluorescencia para contribuir al establecimiento de un modelo de
riesgo del reuso de agua residual tratada.
1.5.2 Objetivos específicos
•
Determinar eficiencia de la técnica de inmunofluorescencia empleada para
detección de quistes de Giardia lamblia y Ooquistes de Cryptosporidium
parvum en agua residual tratada y canal principal bajo, por medio de
ensayo de rendimiento, para su correcta cuantificación.
8
•
Determinar la concentración de quistes de Giardia lamblia y ooquistes
Cryptosporidium parvum, mediante monitoreo ambiental en el periodo
enero-abril 2006.
•
Establecer fuentes de variación durante el muestreo y procesamiento de la
muestra, como herramienta para la eliminación de los principales factores
que dificultan el procesamiento de la misma.
1.6 Hipótesis
Los enteroparásitos Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum poseen la
capacidad de enquistar; dicha característica
les confiere la propiedad de
prevalecer a pesar de las adversidades climatológicas así como los procesos de
desinfección en plantas de tratamiento convencionales. Por esta razón estos
enteroparásitos estarán presentes en el agua de la planta de tratamientos sur y
agua de canal principal bajo, en cantidades que representan un riesgo para su
uso.
II REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Enfermedades transmitidas vía hídrica. El agua es uno de los elementos esenciales para la vida, pero puede ser vehículo
de enfermedades cuando no reúne las condiciones de calidad necesarias que
aseguren su inocuidad.
Las enfermedades de transmisión hídrica son las que se transmiten por la
ingestión de agua que ha sido contaminada por microorganismos patógenos,
principalmente a través de heces humana. La ingestión puede ser directa, por
agua potable, o indirecta, con alimentos o bebida que han sido preparados con
agua contaminada; también puede ser accidental y producirse durante la natación
u otras actividades recreativas. En la tabla 1 se puede observar las principales
enfermedades transmitidas por el agua así como el agente patógeno responsable.
10
Tabla 1. Principales enfermedades de transmisión hídrica y agentes
responsables
Enfermedad
Agentes
Origen bacteriano
Salmonella typhi, Salmonella
Fiebres tifoideas y paratifoideas,
Disentería bacilar,Cólera,Gastroenteritis
aguda y diarrea
paratyphi A y B,Shigella sp,
Escherichia coli enterotoxi-génica,
Campylobacter, Yersinia
enterocolítica, Salmonella sp, Shigella
Origen vírico
Hepatitis A y E, Poliomielitis,
Virus de la Hepatitis A y E , Virus de la
Gastroenteritis aguda y diarrea
polio. Rotavirus, Enterovirus,
Adenovirus, etc.
Origen parasitario
Disentería amebiana, Gastroenteritis
Entamoeba histolítica , Giardia lamblia
Cryptosporidium
Fuente: Red Iberoamericana de Potabilización y Depuración del Agua (2003)
El control de enfermedades bacterianas y parasitarias transmitidas por el agua es
prioritario. Se calcula que: a) el 80% de las enfermedades y más de un tercio de
las deficiencias de los países en desarrollo están asociadas con el agua; b) el
35% de los casos de diarrea que ocurren en el mundo se asocian a la ingesta de
agua, aun cuando se haya ingerido agua tratada y controlada biológicamente.
(Vilanova 2003)
Las enfermedades relacionadas con las aguas contaminadas son uno de los
problemas más graves de salud pública de gran parte de la población mundial. La
Organización Mundial de la Salud (OMS), por ejemplo, calcula que 1100 millones
de persona actualmente no tienen acceso a fuentes de abasto de agua segura,
más de 2400 millones carecen de saneamiento adecuado; las enfermedades
11
diarreicas matan a unos dos millones de personas al año, de las cuales la
mayoría son niños menores de cinco años de edad (OMS citado por Vilanova.
2003).
Desde 1980, se han incrementado las enfermedades transmitidas por el agua
destacando
aquellas
causadas
por
los
parásitos
Giardia
lamblia
y
Cryptosporidium parvum. Ambos microorganismos pueden causar gastroenteritis
severas si son ingeridos. Su capacidad para generar este tipo de brotes se asocia
con su resistencia a los procesos habituales de tratamiento de las aguas (Santos
et al., 2004).
En los sistemas habituales de tratamiento de agua residual, después de una
filtración, el agua se trata con un desinfectante. Este paso suele consistir en
cloración. La desinfección con cloro ha sido el método más común. Cuando se
emplea la cloración, las dosis de cloro deben de ser lo suficientemente elevada
para que quede cloro libre residual, en una concentración de 0.2 a 2.0 mg/Litro.
La depuración anteriormente descrita elimina o inactiva eficazmente las bacterias
patógenas y organismos indicadores (coliformes). Sin embargo, a menudo no
elimina de forma constante y segura los quistes de Giardia lamblia y ooquistes de
Cryptosporidium parvum ya que pueden permanecer viables en el agua durante
largos periodos de tiempo (Prescott et al., 2000). Estos requieren como mínimo
una concentración mayor de 80 mg/L de cloro libre para su
destrucción
(Lechevallier et al., 1991), esta concentración es 400 veces la máxima permitida
en agua para consumo humano.
Estos organismos son altamente infecciosos, una ingestión de 10 quistes (Adam,
1991) y 30 ooquistes (DuPont, 1995) pueden resultar una infección en el ser
humano. Sin embargo un modelo exponencial de dosis de respuesta ha sido
desarrollado (Ottoson 2005). Este modelo describe la probabilidad de infección de
acuerdo a la exposición. Y se describe en términos de probabilidad de infección
(Pi):
12
El valor r representa la fracción de ooquistes ingeridos, los cuales pueden
sobrevivir y causar infección y N la exposición diaria asumiendo un consumo de 2
litros de agua respectivamente. Para G. lamblia el valor de r =0.0198 mientras que
para C. parvum se ha establecido un valor de r =0.0047 (Haas, 1994, Rose et all.,
1991).
Con estos datos se ha construido la siguiente gráfica que se muestra en la figura
1, esta esquematiza la probabilidad de infección por ingestión de células
patógenas.
Probabilidad
de ingestión
Número de células ingeridas
*a Giardia lamblia, b Cryptosporidium parvum
Figura. 1 Probabilidad de infección por ingestión de diferentes células patógenas
en diferentes dosis de respuesta.
13
2.2 Protozoarios
Se puede definir a un protozoario como un protista unicelular eucariota
habitualmente móvil. Los Protozoarios se encuentran tanto en hábitat de aguas
dulces como marinas; un gran número de ellos son parásitos del hombre y otros
animales y otros son saprofitos en otros hábitats como el suelo, el aire o la
superficie de los árboles. Los protozoarios se dividen en 4 grandes grupos
basados en su forma de locomoción: Rizópodos (Rhizopoda), Ciliados
(Ciliophora), Flagelados (Mastigophora) y Esporozoos (Sporozoa). Los cuatro
grupos pueden habitar en el tracto intestinal, por lo cual varios son zoonóticos, es
decir, estos pueden transmitirse directamente de un animal al humano. Este es el
caso de G. lamblia y C. parvum.
Muchos protozoarios son capaces de enquistarse. Evolucionan a una etapa
llamada quiste, forma de reposo característico por la presencia de una pared y por
una actividad metabólica muy reducida. Los quistes tienen tres funciones
principales: 1) protegen frente a las alteraciones adversas del medio, 2) son
lugares para reorganización nuclear y la división celular; y sirven como medio de
transferencia de un huésped a otro en las especies parásitas (Prescott et al.,
2000).
2.2.1 Giardia lamblia.
Es uno de los parásitos patógenos intestinales causantes de diarrea endémica y
epidémica, y el de mayor prevalencia en la mayoría de los países industrializados;
su distribución es endémica a nivel mundial con una mayor incidencia en niños de
menor edad.
14
Giardia lamblia es un protozoario intestinal, flagelado, que coloniza el intestino
delgado, donde puede ocasionar infección aguda o crónica. Es considerado como
el parasito intestinal más común a nivel mundial (Marshall et al., 1997). De
acuerdo al Centro de Control de Enfermedades (CDC) Giardia lamblia es el
parasito intestinal mas comúnmente diagnosticado y causa aproximadamente dos
millones de casos de diarrea en EEUU por año (CDC, 2000).
2.2.1.1 Clasificación taxonómica de Giardia lamblia
Phylum: Protozoa
Subphylum: Sarcomastigospora
Superclase: Mastigospora
Clase: Zoomastigospora
Orden: Diplomonadida
Familia: Hexamitidae
Figura 2. Imagen de Giardia lamblia vista en microscopio electrónico
Fuente: Cavalier y Smith (2003)
15
2.2.1.2 Ciclo de vida. El ciclo de vida está compuesto por dos fases un trofozoíto
activo y un quiste resistente, este se puede apreciar en la figura 3.
Figura. 3. Ciclo de vida de Giardia lamblia
Fuente: DPDx 2003
16
El trofozoito. Este tiene forma de pera, posee dos núcleos y cuatro pares de
flagelos, un disco suctorio cóncavo oval (órgano de fijación) en la mitad anterior
de la superficie ventral. Es la forma patógena. Con una longitud de de 9–21 Am y
un ancho de 5–15 Am. Los trofozoitos originados se fijan a la mucosa del
duodeno o del yeyuno proximal, probablemente vía de la contracción del disco
ventral del protozoario. Los trofozoitos normalmente se fijan a la superficie del
intestino delgado, en donde se cree se alimentan de las secreciones de la
mucosa. Es durante el estado de trofozoito en el cual los síntomas clínicos se
presentan, como resultado del daño de la mucosa. Después de la separación, el
trofozoito binuclear forma el quiste a nivel del colon (enquista) y se divide dentro
del quiste.
El quiste tiene un largo de 10-12 µm y de 5-8 µm de ancho, con una forma oval y
una alta resistencia en este estado, por lo cual su ciclo de vida es muy alargado,
ya que puede sobrevivir y mantenerse infeccioso por varios meses. Un quiste
ingerido pasa a través del duodeno en donde el desenquistamiento ocurre,
liberando así dos trofozoitos, después se multiplicarán rápidamente vía asexual y
colonizan el intestino delgado. Los quistes de Giardia lamblia pueden sobrevivir
mas de 77 días en agua de grifo a 8° C (Robertson et all., 1995).
Los quistes pueden ser desechados en las heces, así como los trofozoitos, sin
embargo no son infectivos. La dosis infectiva para Giardia lamblia es entre 10 y
100 quistes (Rentdorff, 1954). Los quistes sobreviven en los alimentos y en el
agua; cuando se ingieren, los quistes pasan a través del estómago, donde el
ambiente ácido ocasiona un fenómeno de desenquistamiento, el cual finaliza
generalmente a nivel del duodeno. El periodo de prepatente (tiempo entre la
ingestión de los quistes y la excreción de los nuevos quistes) para Giardiasis es
de 6–16 días. 17
2.2.1.3 Sintomatología. La manifestación de giardiasis en humanos puede ser
variable; debido a que puede ser tanto asintomático como diarreas crónicas. En
su mayoría esto dependerá del estado inmunológico del hospedero.
El periodo de incubación en humanos es generalmente alrededor de 5 a 15 días
semanas; el inicio de las manifestaciones clínicas generalmente es con molestias
abdominales vagas seguidas por estado nauseoso y anorexia, fiebre de baja
intensidad en niños, seguidos de fuertes diarreas; las deposiciones son acuosas,
con moco y en raras ocasiones con sangre, que pueden prolongarse durante
semanas o años. En niños la giardiasis puede ser causa de diarrea crónica, con
afección del estado nutricional, (Marshall et al., 1997).
2.2.2 Cryptosporidium parvum
Son protozoarios que invaden y se replican en el interior de las vellosidades que
recubren el tubo digestivo y respiratorio de los animales vertebrados.
Cryptosporidium es dividido en 24 especies, de las cuales se ha demostrado que
4 son capaces de infectar al humano. Sin embargo únicamente C. parvum y C.
hominis se han relacionado significativamente con problemas de la salud humana
(Dawson et al., 2004).
Cryptosporidium parvum se reconoció por primera vez como un patógeno
potencial para el humano en 1976. Subsecuentemente, la enfermedad llego a ser
mejor conocida en individuos inminosuprimidos presentando síntomas ahora
referidos al síndrome de inmuno deficiencia adquirida o SIDA.
18
2.2.2.1. Clasificación taxonómica de Cryptosporidium parvum
Phylum: Apicomplexa
Clase: Esporozoasida
Subclase: Coccodiasina,
Orden: Eucoccidiorida
Suborden: Eimeriorina
Familia: Cryptosporidiidae
Figura 4: Vista al microscopio de Cryptosporidium parvum saliendo de su
ooquiste
Fuente: Cavalier y Smith (2003)
El reconocimiento de C. parvum como un patógeno humano, a incrementado
investigaciones en lo que se refiere al ciclo del vida del parasito y así como su
vinculación como posible vector de transmisión.
2.2.2.2 Ciclo de vida. El ciclo de vida de Criptosporidium es completo en un solo
hospedero y culmina con la eliminación de ooquistes maduros en las heces
(Santos et al., 2004) los cuales inmediatamente son infectivos en otro hospedero
susceptible. Dentro del organismo hospedero, los esporozitos son liberados por el
ooquiste en las células epiteliales del tracto gastrointestinal u otros tejidos como el
tracto respiratorio; posteriormente los parásitos sufren multiplicación asexual y
sexual produciendo microgametos varón y hembra. Posteriormente se produce la
fertilización, produciendo un zigoto que desarrollan esporulación en el hospedero
19
infectado (Dawson 2004). Se producen dos tipos diferentes de ooquistes uno de
membrana gruesa (varón) que normalmente se excreta por el hospedero y el
ooquiste de membrana delgada (hembra) que esta automáticamente envuelto en
autoinfección. Finalmente los ooquistes infectivos son excretados y permiten
transmisión fecal-oral directa e inmediata. El ciclo de vida de C. parvum puede
observarse en la figura 5.
Figura 5: ciclo de vida Cryptosporidium parvum
Fuente: DPDx 2003
20
Como un patógeno de enfermedades transmitidas por el agua, la etapa más
importante del ciclo de vida de Cryptosporidium es el ooquiste, este tiene una
forma esférica, con un diámetro 4.5 - 6 µm, el ooquiste esporulado contiene 4
esporocitos.
Los ooquistes de C. parvum frecuentemente se encuentran en la superficie del
agua. Debido a la característica que les confiere la forma de ooquiste, tienen la
capacidad de sobrevivir al estrés sometido por el medio ambiente así como una
tolerancia a altas dosis de desinfectantes.
Se estudió la sobrevivencia de dos aislados de C. parvum en contenedores
semipermeables en diferentes ambientes (agua de río y heces de vaca,) y se
encontró viabilidad de ambos ooquistes después de un periodo de 6 meses En
solución acuosa, el ooquiste permanece infeccioso por encima de 6 meses y
permanece viable durante 9 meses (Robertson et al., 1992).
La transmisión de Cryptosporidium parvum ocurre principalmente a través del
contacto con agua contaminada y en algunas ocasiones de las fuentes de los
alimentos. La transmisión zoonótica de C. parvum ocurre a través de la exposición
a animales infectados o exposición a agua contaminada por excremento de
animales infectados.
2.2.2.3 Sintomatología. C. parvum puede causar síntomas severos y suaves
dependiendo de la dosis de ooquistes ingeridos, la virulencia de la cadena de C.
parvum, y la immunocompetencia del individuo afectado. La inmunocompetencia
es la capacidad de las células linfoides para producir una respuesta inmune
humoral o celular cuando son estimuladas por antígeno esta se puede dividir en 3
categorías: (1) inmunocompetentes son aquellos individuos con una clara
21
infección en 7–14 días, (2) pacientes con SIDA o alguna otra alteración del
sistema inmune (i.e., individuos con conteo celular CD4 <180 cel/mm) quienes
en la mayoría de los casos nunca completan una clara
infección(3) y los
individuos inmunosuprimidos este grupo comprende a individuos que recibieron
tratamiento de quimioterapia así como enfermedades como varicela o
malnutrición; en este caso la infección usualmente es clara dentro de 10–15 días
tiempo en el cual el sistema inmune vuelve a la normalidad, sin embargo se han
reportado casos de niños en donde la infección persiste por mas de 30 días.
Los síntomas más frecuentes en niños inmunocompetentes son gastroenteritis
autolimitadas, con deposiciones acuosas, dolor abdominal, y a veces nauseas,
vómitos y fiebre. Las heces no suelen tener leucocitos ni hematíes,
correlacionándose síntomas, estado inmunológico y carga parasitaria.
En personas inmunodeprimidos, suele consistir en hepatitis, colecistitis, artritis
reactivas y síntomas respiratorios. La clínica oscila entre la de los casos de SIDA,
con diarrea acuosa, prolongada, y persistente excreción de quistes, llegando a
producir la muerte tras semanas o meses de malnutrición, infecciones
oportunistas o neoplasias, y la que presentan pacientes inmunocompetentes con
diarrea acuosa con espasmos, náuseas y febrícula, autolimitada de 2 semanas de
duración.
Los síntomas reportados de brotes ocasionados por transmisión vía hídrica son
diarrea, calambres abdominales, nausea, vomito, fiebre, dolor de cabeza, y dolor
muscular (Santos et al., 2004).
22
2.3
Técnicas
empleadas
para
detección
de
Giardia
lamblia
y
Cryptosporidium parvum.
Para detectar a este tipo de parásitos, se han desarrollado técnicas
inmunológicas, en las cuales se pueden presentar variaciones para la
concentración de la muestra por medio de floculación con carbonato de calcio,
disolución de filtros de membrana; otra técnica empleada es técnicas moleculares, como es la reacción en cadena de la polimerasa, mejor conocidas por sus siglas
en ingles como PCR (Mahbubani et al., 1992)
2.3.1 Técnicas inmunológicas
La inmunología es el estudio de la estructura y función del sistema inmunológico
en relación a la respuesta del sistema hacia las enfermedades.
Los métodos inmunológicos son métodos usados para la detección o
cuantificación de la interacción antígeno-anticuerpo, varios análisis inmunológicos
son utilizados en microbiología ambiental como la inmunofluorecencia, ELISA,
separación magnética, inmunoprecipitación, inmunoafinidad cromatográfica.
A) Inmunofluoresencia: Es una técnica utilizada para la detección de un
anticuerpo ó un antígeno en células, tejidos y microorganismos mediante la
utilización de compuestos fluorescentes.
B) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un
antígeno determinado (toxina producida por una bacteria patógena) y su posterior
detección por anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido.
23
C) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un
soporte sólido, se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se
detecta mediante una actividad marcadora (peroxidasa) unida al anticuerpo en
cuestión o a un segundo anticuerpo de revelado.
D) Separación magnética: La inmunoseparación magnética es una técnica que
utiliza un anticuerpo conjugado con una partícula magnética para unir al antígeno
y después se extraen mediante un imán las partículas magnéticas junto con la
interacción antígeno-anticuerpo.
E) Inmunoafinidad cromatográfica: La afinidad cromatográfica es un poderoso
método para concentrar y purificar antígenos, el anticuerpo es químicamente
unido a una columna cromatográfica, la muestra que contiene el antígeno es
eluida a través de la columna y el antígeno es selectivamente retenido en la
columna.
F) Inmunoprecipitación: Es normalmente una serie de tubos los cuales poseen
una concentración constante de anticuerpos. El antígeno se agrega entonces en
una concentración creciente de los tubos consecutivos. En los tubos iniciales
donde la concentración más baja de antígeno se ha agregado, no hay ninguna
precipitación obvia. Cuando la concentración del antígeno se aumenta, se
comienza a observar la formación de complejos de antígeno-anticuerpo.
Por ser inmunofluorescencia la técnica empleada para realizar este estudio se
ampliará más sobre el mismo
24
2.3.1.2 Inmunofluorescencia. El método de la American Society for Testing and
Materials (ASTM) involucra, filtrar 100L (o más) de agua a través de un filtro de
cartucho de fibras polipropileno con un poro de 1.0µm, extrayendo las partículas
del cartucho cortando en partes y lavando las fibras y concentrando las partículas
extritas por centrifugación. Estas partículas son procesadas para concentrar
selectivamente los quistes y ooquistes por medio de filtración en tubos cónicos de
50 mL con un gradiente de percoll-sacarosa. Las partículas son recuperadas de la
interfase del gradiente de percoll-sacarosa. Estas posteriormente son marcadas
con anticuerpos fluorescentes en filtros de celulosa acetato con un diámetro de
25 mm. y un poro de 0.2 mm. Después de montar el filtro en el portaobjetos, este
es explorado en un microscopio de epifluorescencia UV en búsqueda del tamaño,
forma y fluorescencia característica de quistes de G. lamblia y ooquistes de C.
parvum.
Las ventajas que presenta esta técnica es su habilidad para confirmar quistes y
ooquistes presuntos. Este método es considerado esencial para el análisis de
muestras ambientales.
Dentro de las limitaciones que presenta se encuentran: una pobre recuperación
de quistes y ooquistes ya que se ve influenciada por la calidad del agua,
problemática para exploración del filtro debido a interferencia con partículas de
arcilla y algas, inhabilidad de identificar la viabilidad, y el alto tiempo requerido
para realizar el análisis (Rose et al.,1989).
III MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Descripción de la zona de muestreo
La selección de los puntos de muestreo fueron determinados en base a
investigaciones anteriores realizadas por Ortega y Airola (2005). De estos se
seleccionó el punto número 1 correspondiente a la planta tratadora de agua
residual, punto 2 al primer punto de muestreo del canal principal bajo y el
punto número 7 que se encuentra al final de la zona delimitada. En la figura 6
se muestran los lugares seleccionados.
Figura 6. Ubicación de los puntos de muestreo en el recorrido del canal
principal bajo
Fuente: Ortega y Airola (2005).
26
3.2 Preparación de reactivos
Para la técnica se requirió preparar una serie de soluciones que se
mencionan a continuación:
•
Solución buffer de Formalina al 10%. Se disolvieron 0.762 g. de fosfato
dibásico de sodio (Na2HP04), 0.019 g. de fosfato monobásico de sodio
(Na2HP04)en 100 ml. de la solución de formalina en agua a un volumen
final de 1 litro.
•
Buffer salino de fosfatos (PBS). Se preparó una solución patrón a una
concentración de 10X, disolviendo 80 g. de NaCI, 2 g. de fosfato
dibásico de potasio (KH2P04), 29 g. de fosfato monobásico de sodio
duodecahidratado (Na2HP04.12 H20) y 2 g. de cloruro de potasio (KCI)
en agua y aforo a un volumen final de 1L. La solución de 10X se utilizó
para preparar PBS de concentración 1X, diluyendo 1 volumen de la
solución de 10X con 9 volúmenes de agua y ajustando el pH a 7.4 ±
0.2.
•
Solución Patrón de dodecil sulfato de sodio al 1 % (SDS). Para la
solución patrón se requirió disolver 1 g. de dodecil sulfato de sodio en
agua a un volumen final de 100 mL.
•
Solución Patrón de Tween 80 al 1 %. Para la solución de Tween se
mezcló 1 mL de monoelato de polioxietilensorbitan 80 (Tween 80) con
99 mL de agua destilada.
27
•
Solución de elusión (Solución buffer detergente). La solución se
preparó mezclando 100 mL de SOS aI 1%, 100 mL de Tween 80, 100
mL de PBS10X y 1 mL de antiespumante con 500 mL de agua
destilada. Se ajustó el pH a 7.4 ± 0.2.usando un potenciómetro, la
solución se aforo a un volumen final de 1 litro.
•
Solución de flotación Percoll - sacarosa. Con una densidad de 1.1 ±
0.2 Q. Se mezclaron 45 mL de Percoll (densidad 1.13) en 45 mL de
agua y 10 mL de solución de sacarosa al 2.5 M.
•
Serie de etanol- glicerol. Las series de etanol - glicerol se prepararon
de acuerdo a la tabla 2.
Tabla 2. Proporción utilizada para la preparación de las series de etanol glicerol.
SERIES DE ETANOL- GLlCEROL
95%
etanol
Glicerol
Agua
Volumen
% final
destilada
final
de
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
Etanol
10
5
80
95
10%
20
5
70
95
20%
40
5
50
95
40%
80
5
10
95
80%
95
5
0
100
90.2%
Fuente Shay et al., 1990
•
Kit A 100 FL AquaGlo GIC para la detección simultanea de
inmunoflorescencia
de
quistes
de
Giardia
y
ooquistes
de
Cryptosporidium en muestras de agua. La muestra se colocó a una
28
concentración de 1X, ya que normalmente viene a una concentración
de 20X. El kit se almacenó de 2 - 8° C y este se guardaba después de
su uso.
3.3 Prueba de recuperación
Esta prueba consta de 3 etapas, determinación de la concentración de quistes y
ooquistes de G. lamblia y C. parvum del control positivo, evaluación de porcentaje
de recuperación que se obtiene después de la elución del filtro y la evaluación de
la concentración de quistes y ooquistes en influentes y efluentes. Estas pruebas
se realizaron por triplicado.
3.3.1 Determinación de la concentración del control positivo.
Para determinar la concentración del control positivo fue necesario tomar 3
controles positivos adquiridos en diferente fecha y se hizo una mezcla compuesta
tomando 10 µL de cada uno de los controles hasta obtener un volumen 30 µL.
Este fue aforado con PBS 1 X hasta un volumen final de 1 mL. Después se
procedió a realizar la prueba de inmunofluorescencia descrita en el ICR Microbial
Laboratory Manual.
El filtro fue analizado en microscopio de epifluorescencia haciendo un barrido
completo para determinar la concentración de quistes de Giardia lamblia y
ooquistes de Cryptosporidium parvum. El resultado obtenido se tomó como patrón
para realizar las pruebas de recuperación después de haber procesado el filtro
29
3.3.2 Evaluación de elución del filtro.
En
una
hielera
previamente
lavada,
se
llenó
hasta
un
volumen
de
aproximadamente 112.666 L de agua de grifo, eliminando el cloro por medio de
adición de tiosulfato de sodio Na2S2O3, este se dejo actuar por un tiempo
aproximado de 15 minutos. Después de este paso el agua fue inoculada con 1.36
mL de control positivo del kit de inmunoflorescencia.
Una vez preparada la muestra de agua inoculada, esta fue procesada de acuerdo
con el procedimiento de anticuerpos fluorescentes descrita en el ICR Microbial
Laboratory Manual (Shay et al., 1990). Se tomaron de 3 litros del efluente, 1 litro
del influente y 3 litros del sobrenadante obtenido después de la etapa de
concentración de la muestra. A estas muestras se les da el mismo tratamiento.
Este procedimiento se llevó a cabo por triplicado
3.4 Análisis de la muestra
Las muestras fueron procesadas de acuerdo con el procedimiento de anticuerpos
fluorescentes descrita en el ICR Microbial Laboratory Manual (Shay et al., 1990).
Esta metodología consta de 4 fases: recolección de la muestra, elución de filtro,
flotación y purificación del sedimento, prueba de inmunofluorescencia.
30
3.4.1 Recolección de la muestra
Para la recolección de muestras de agua que no presenten señales evidentes de
contaminación (por ejemplo: agua potable, lago, laguna, río, canal, entre otras)
fue necesario concentrar (filtrar) un volumen considerable de agua, según sea el
caso, este puede ser entre 100 y 500 litros. Para este fin fue necesario emplear
un equipo de bombeo que consta de mangueras, conectores, portafiltro, medidor
de agua y una bomba. Además de un filtro especial para parásitos. En la figura 7
se observa el equipo empleado para la toma de muestra.
Figura 7. Equipo necesario para la toma de muestra
El procedimiento a seguir fue el siguiente: Se conectó el equipo de bombeo, se
colocó el filtro para parásitos en el portafiltros y revisó el medidor de agua, se
encendió
la bomba y se filtraron entre 100 y 121 litros de agua. Una vez
terminada la etapa de filtrado se desconectó el equipo de bombeo y se abrió el
portafiltro, asépticamente se remueve el filtro y transfiere a una bolsa Ziploc
(incluida el agua que quedó en el portafiltro). Se etiqueta la bolsa con la fecha,
lugar y volumen de agua filtrado, se refrigeró a una temperatura entre los 2 y 5
ºC. El filtro se eluyó antes de 96 horas después de la recolección de la muestra.
Es importante que durante este procedimiento se utilice bata y guantes de látex
31
Para la recolección de muestras de agua que presenten signos de contaminación
evidente (por ejemplo: aguas residuales, aguas residuales tratadas, y de dren,
entre otras) no
fue
necesario concentrar o filtrar la muestra. Se tomó una
cantidad de 1litro en un recipiente estéril y se enjuagó por fuera con agua potable,
se etiquetó con la fecha lugar y el volumen muestreado, se refrigeró a una
temperatura entre los 2 y 5 º C y se analizó en las primeras 8 horas después de
su recolección.
3.4.2 Elución del filtro
El procedimiento que se siguió para eluir, o lavar, el filtro es el siguiente: se
extrajo asépticamente el filtro de la bolsa ziploc y fue colocado en una charola de
plástico limpia (se incluyó el agua que haya quedado en la bolsa y los residuos
que hayan podido quedar el ella se enjuagaron con solución de elusión). Se le
realizó un corte longitudinal con la ayuda de una navaja y se separaron las hebras
en tres partes iguales, separando de acuerdo a su limpieza. Esta etapa se
observa en la figura numero 8
Figura 8. Elución de filtro
32
Se tomaron 4 litros de solución de elución y se dividieron en tres recipientes de 4
litros. Se lavó a mano y se tallaron las hebras del filtro haciéndolas pasar por cada
uno de los tres recipientes que contienen solución de elución (durar 5 min. en
cada uno) hasta que las hebras estén totalmente limpias. Iniciando a lavar las
fibras que estén menos sucias y terminar con las que estén más sucias. Se
depositan de nuevo las fibras, una vez limpias, en la bolsa Ziploc y se
descartaron. La charola en la cual se corta el filtro se lavó con solución de elución
y se incorporó al líquido de los lavados.
El líquido de lavado se centrifugó en recipientes de 750 mL a 3500 rpm durante
10 minutos. Fue absorbido y descartado el sobrenadante, para combinar los
sedimentos y posteriormente concentrarlos en un tubo de centrífuga limpio de 50
mL, usando para esto solución de elución. Se tomó nota del volumen de
sedimento (pellet) y se resuspendió en un volumen igual con solución de
formalina al 10% anotando el nuevo del pellet.
En caso de ser una muestra directa se le da el mismo tratamiento omitiendo la
etapa de corte y lavado del filtro.
3.4.3 Flotación y purificación del sedimento
El pellet obtenido, se sometió a la flotación, se recomienda que este no deberá
exceder de 0.5 mL /1mL formalina 10%.El procedimiento a seguir es el siguiente:
Resuspender el pellet y transferirlo a un tubo de centrifuga limpio de 50 mL
usando para ello 5 mL de solución de elución. Se adicionó solución de elución
hasta un volumen final de 20 mL y agitar en vortex por 1 minuto. A la mezcla se le
agregaron
30 ml de percoll – sacarosa (sp. gr. 1.10) esta solución deberá
depositarse en el fondo del tubo con una pipeta de 50 mL previamente enjuagada
con solución de elución. Después de agregarle la solución se
centrifugó la
33
muestra a 2800 rpm por 10 min. Se colectaron los primeros 20 mL de la parte
superior del tubo y 5 mL de la interfase con una pipeta previamente enjuagada
con solución de elución. La muestra se colocó en un tubo de centrifuga limpio de
50 mL y ajustar hasta la marca de 50 mL con solución de elución. Nuevamente es
centrifugado a 2800 rpm por 10 minutos, se aspiró el sobrenadante hasta dejar 5
mL de solución por encima del nuevo pellet y por último se etiquetó la muestra
anotando el volumen del
nuevo pellet y volumen
final en el que fue
resuspendido. En la figura 9 se observa el producto de la flotación y purificación
del sedimento. La muestra se conserva en refrigeración a una temperatura entre
los 2 y 5º C. Fue necesario llevar a cabo la prueba de inmunofluorescencia dentro
de los siguientes 5 días después de la flotación.
Figura 9. Flotación y purificación del sedimento
3.4.4 Prueba de inmunoflorescencia
Antes de iniciar con esta prueba es necesario poner los reactivos a temperatura
ambiente (PBS 1X, BSA 1%, Kit de inmunoflorescencia, DABCO-glicerol y las
series de etanol-glicerol). Se desinfectaron con cloro al 10% los soportes y los
pesos del manifold y se trataron posteriormente con una solución diluida de
tiosulfato de sodio Na2S2O3, se enjuagaron con agua destilada y se secaron.
34
Se conectó el manifold a la bomba de vacío y fue necesario enjuagar cada
depósito con 2 mL de PBS 1X y se colocaron los filtros en los depósitos,
posteriormente poner los pesos sobre los filtros. Fue necesario ajustar la presión
de vacío, evitando que excediera de 2-4 In Hg., cada membrana se lavo con 2
mL de PBS 1X
drenando y seguido de
2 mL de BSA 1% y se drenó. Se
homogenizaron las muestras flotadas (en vortex) y fueron filtradas de 30 a 40 µL
sobre las membranas. Control positivo = 1mL PBS 1X y 100 µL del control
positivo del kit. Control negativo = 1mL PBS 1 X. Se Lavó cada membrana con 2
mL de BSA 1% y se drenó.
Las llaves de paso del manifold se cerraron y la bomba de vacío se apago. Se
adicionaron 0.5 mL del anticuerpo a cada muestra y estas se cubrieron y pusieron
a incubar por 25 min. Se puso 1 gota de DABCO-glicerol sobre un portaobjetos y
se e incubaron por 20 minutos a 37º C.
Una vez pasado el tiempo de incubación se drenó el exceso de anticuerpo y se
lavo cada membrana con 10 mL de PBS 1 X. Posteriormente se enjuagaron con 1
mL. de las series de etanol-glicerol. Empezando con la de 10% y terminando con
la de 95% de etanol teniendo cuidado de drenar el etanol completamente entre
diluciones. Esta etapa se observa en la figura 10.
Figura 10. Prueba de inmunofluorescencia
35
Se removieron manualmente los pesos y fueron colocados los filtros sobre los
portaobjetos correspondientes previamente etiquetados e incubados usando para
esto diferentes pinzas estériles. Una vez colocado el filtro sobre el portaobjeto se
adicionó 1 gota de DABCO-glicerol sobre las membranas. Una vez que las
membranas se observaron claras se cubren con un cubreobjetos limpio y se
sellan por las orillas con esmalte para uñas, de preferencia transparente. Las
muestras se colocaron en refrigeración y se leyó en el microscopio de
epifluorescencia dentro de los siguientes 5 días.
IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Eficiencia de la técnica de inmunofluorescencia
La eficiencia obtenida de la técnica de inmunofluorescencia fue de 36% de
recuperación para quistes de Giardia lamblia y 32% para ooquistes de
Cryptosporidium parvum. Los cuales resultaron ser más elevados que las
reportadas comparadas con las reportadas por Hansen y Ongerth (1991) con
eficiencia de 26.2 %, y los encontrados por Rose et al. (1991) fueron de 29 a 58 %
y fueron iguales que los porcentajes de recuperación presentados por Hutton et
al. (1995) que señalan una eficiencia promedio de 33%.
Mientras que para
quistes de Giardia lamblia este valor fue mas bajo que el presentado por
LeChevallier (1991) el cual obtuvo un 68.6% de recuperación. Este porcentaje de
eficiencia no se tomó en cuenta en el análisis de los resultados y se utilizaron los
datos obtenidos sólo como una referencia.
4.2 Concentración de quistes y ooquistes
de Giardia lamblia y
Cryptosporidium parvum, en el periodo enero-abril 2006.
A continuación se presentan los resultados de los monitoreos realizados durante
el periodo enero mayo 2006,
correspondientes a
Punto 1, 2, 3 y 7
respectivamente, la ubicación de estos puntos ha sido señalados en la figura No.
6.
37
La tabla 4 corresponde a los resultados obtenidos durante el monitoreo en los
cuales no se involucró mezcla de agua, y la tabla 5 corresponde aquellos en los
cuales se involucró la mezcla de agua residual tratada con agua del canal
principal bajo. En la figura número 10 se observan los quistes de G. lamblia y
ooquistes de C. parvum visto a traes de microscopio de epifluorescencia
Tabla 4. Monitoreo sin mezcla de agua residual tratada
PUNTO 1
Fecha
[ ] quistes Considerando
[ ] Ooquistes C. Considerando
muestreo
G. lamblia/l
parvum/l
recuperación
de 36%
recuperación
de 33%
11-Ene-06
8586
23849
239
724
25-Ene-06
621
1725
71
215
PUNTO 2
Fecha
[ ] quistes Considerando
[ ] Ooquistes de
Considerando
muestreo
G lamblia /l recuperación
C. parvum /l
recuperación
de 36%
de 33%
11 Ene 06
287
797
72
218
13Feb 06
22,875
63542
1125
3409
28 Feb 06
174
483
70
212
PUNTO 7
Fecha
[ ] Quistes Considerando
[ ]Ooquistes de
Considerando
muestreo
G lamblia/ l recuperación
C parvum / l
recuperación
de 36%
de 33%
25 Ene 06
49
139
<2500
<7576
13 Feb 06
188
522
113
342
28 Feb 06
192
533
48
145
38
Tabla 5. Monitoreo mezcla agua residual tratada con agua de canal principal bajo
PUNTO 1
Fecha
[ ] Quistes Considerando
[ ] Ooquistes
Considerando
muestreo
G lamblia/ l
C parvum / l
recuperación
recuperación
de 36%
de 33%
14 mar 06
12,500
12,500
<1389
<1389
29 mar 06
12, 500
12,500
6,250
6250
18 abril 06
26,666
74072
4444
4444
PUNTO 3
Fecha
[ ] Quistes Considerando
[ ]Ooquistes de
Considerando
muestreo
G lamblia/ l
C parvum / l
recuperación
recuperación
de 36%
de 33%
14 mar 06
122
339
17
52
29 mar 06
88
244
<22
<67
18 abril 06
28
78
6
18
PUNTO 7
Fecha
[ ] Quistes Considerando
[ ]Ooquistes de
Considerando
muestreo
G lamblia/ l
C parvum / l
recuperación de
recuperación
de 36%
33%
14 mar 06
117
325
<39
<118
29 mar 06
25
69
8
24
a
b
Figura 11. A) Quistes de G. lamblia y B) Ooquistes de C. parvum visto a través de
microscopio de epifluorescencia.
Fuente: Río Grande Basin Initiative (2005)
39
En los tratamientos tradicionales de agua residual, en la etapa de desinfección
un medio eficiente para la prevención de enfermedades transmitidas vía hídrica es
el cloro, este es
el agente más
utilizado, presentando eficiencia para la
inactivación de organismos coliformes, sin embargo no lo es para los parásitos
protozoarios Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum. Aunado a esto, se
presentan la dificultad de remoción por filtración de estos parásitos, ya que los
ooquistes de Criptosporidium poseen la habilidad de cambiar de forma y pueden
pasar a través de poros más pequeños que su tamaño (5µm). Esta propiedad
también es atribuida a quistes de Giardia (Mayer 1996). Una instalación de
tratamiento de agua adecuadamente operada debería de ser capaz de
remocionar e inactivación del 99.9% de quistes y
99.99 % de ooquistes
(Enviroment Protection Agency (EPA) 2002).
En los resultados obtenidos se puede constatar que el efluente de la planta de
tratamientos (punto 1) presenta concentraciones de aproximadamente de
1.2175E+03
quistes
de
giardia/100
Criptosporidium/100 mL, estos datos
mL
y
2.908E+02
ooquistes
de
concuerdan con los expresados según
Gortares et al. (2003) en donde la concentración para quistes de giardia es de
1.2E+03/100 mL y 3.9E+01.
Los resultados obtenidos en los muestreos en donde no se involucró la mezcla de
agua, la media para punto 2 fue de 2.3E+01/100 mL para quistes de G. lamblia
7.1/100 mL para Ooquistes de C. parvum. Para el punto 7 fue de 1.43E+01 para
quistes de giardia y de 8.1/100 mL para ooquistes de criptosporidium. Por otra
parte aquellos resultados en donde se involucra la mezcla de agua en el punto 3
los resultados fueron 7.9/100 mL para quistes de G. lamlia y 1.2/100 ml para
ooquistes de C. parvum, 8.1/100 ml para quistes de giardia y 0.8/100 ml para
ooquistes de criptosporidium, estos últimos corresponden al punto 7.
Estos
resultados reflejan que la concentración tanto para quistes de giardia y ooquistes
de criptosporodium no aumentó al involucrarse la mezcla de agua residual con
agua del canal principal bajo.
40
En la tabla 4 y 5 los resultados correspondientes a las fechas 13 de febrero 2006
punto 2 y 29 de marzo 2006 punto 7, presentaron variación tanto en forma como
tamaño, así como una deficiente tinción del anticuerpo, por lo cual se la prueba
inmunológica se realizó por duplicado, sin embargo los resultados obtenidos
fueron los mismos. Estos datos no se tomaron en cuenta para determinar las
medias tanto quistes como para ooquistes. Este problema se considera que fue
causado por interferencia con partículas como son: arcilla, arena, algas y restos
de microorganismos, algunos de estos objetos exhiben una fluorescencia verde
similar a la fluorescencia para G. lamblia y C. parvum después de ser marcadas
por los reactivos de la prueba de inmunofluorescencia. En estudios realizados por
Rodgers et al. (1995) se analizaron 54 especies de algas, y se encontró que 24
de ellas exhiben fluorescencia verde no específica.
Los protozoarios Giardia y Criptosporidium son de preocupación específica en la
reutilización de las aguas residuales, ya que el riesgo de la infección puede ser 10
a 1000 mayor que para las bacterias en un nivel similar de la exposición (Rose et
al., 1991). Estos organismos son altamente infecciosos, una ingestión de 10
quistes de Giardia (Adam 1991) y 30 ooquistes de Criptosporidium (DuPont 1995)
pueden resultar una infección en el ser humano. Las concentraciones
anteriormente mencionadas sobrepasan esta dosis infectiva. No obstante, es
necesario hacer énfasis en que para que la infección se lleve a cabo, es necesario
que los quistes y ooquistes ingeridos sean viables, es decir se encuentren en un
estado infeccioso. En las pruebas realizadas únicamente se determinó la
presencia de estos microorganismos. Por lo que no se puede dictaminar cual es
el riesgo de infección que estos parásitos presentan.
41
4.3 Fuentes de variación durante el muestro y procesamiento de la muestra
La fuentes de variación que se presentaron durante el análisis fue la elevada
turbidez del agua; esta tiene una repercusión que se ve reflejada directamente en
el tiempo empleado para la elución del filtro así como en el volumen total del pellet
obtenido. Debido a que se recomienda que el volumen del pellet no exceda de 0.5
mL, sin embargo, los volúmenes obtenidos fluctuaron entre los 5 – 20 mL, por lo
cual fue necesario dividir el volumen del pellet en varias muestras para facilitar la
flotación. Otro problema que se presentó fue la dificultad de leer estas muestras
bajo el microscopio de epifluoresencia, debido a la interferencia ocasionada por
las partículas algas, arcilla, arena, etc.
Por lo tanto, durante la prueba de
inmunofluorescencia, fue necesario distribuir homogéneamente la muestra en el
filtro de nitrocelulosa. Para aquellas muestras en donde la turbidez del pellet
obtenido era elevada, en la etapa de los lavados con la serie de etanol glicerol, se
optó por disgregar las partículas succionando parte del la solución y volviéndola a
depositar aplicando una mayor fuerza de expulsión. Esto dio como resultado
muestras homogéneas eliminando así dificultad para la lectura del filtro.
VI CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES
•
Se detectaron quistes de giardia en un 100%
de las 17 muestras
analizadas y un 76 % para ooquistes de Cryptosporidium parvum.
•
El porcentaje de recuperación de la técnica fue de 36% para quistes de
Giardia lamblia y 33% para ooquistes de Cryptosporidium parvum.
•
Las
fuentes
de
variaciones
presentadas
durante
el
muestreo
y
procesamiento de la muestra son atribuidas a la turbidez que presentaron
las muestras de agua, lo cual dificultó el análisis de las mismas.
•
En base a los resultados obtenidos no se puede hacer una afirmación
sobre el reuso del agua residual tratada para riego agrícola, ya que solo se
aportaron datos para establecer un modelo que mida el riesgo que implica
su reutilización.
•
Se recomiendan estudios posteriores en donde se determine la viabilidad
de quistes de G. lamblia y ooquistes de C. parvum.
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