PRÁCTICA I. Microscopio óptico: descripción y manejo Objetivo

PRÁCTICA I. Microscopio óptico: descripción y manejo
Objetivo
Comprender el funcionamento del microscopio óptico y visualizar preparaciones de agua de charca.
Introducción
La célula es la unidad morfológica y funcional del ser vivo. Su observación es muy limitada, debido al
pequeño tamaño (10 m) y al hecho de ser traslúcida.
Para la observación se han utilizado muchos instrumentos ópticos que aumentan el poder resolutivo.
Poder resoultivo: es la capacidad que tiene un instrumento para dar imágenes distintas de dos puntos que se
encuentran muy cerca uno del otro.
Limite de resolución: es la distancia mínima que tiene que existir entre dos puntos para ser identificados como
independentes.
Microscopio Óptico Simple (MOS): o lupa, sólo tiene un sistema óptico que aumenta unas 10 veces.
El Microscopio Óptico Compuesto (MOC): está constituido por:
• Sistema óptico:
• Sistema ocular: 2 oculares con la misma ampliación que pueden estar separados en algunos microscopios
para mejor adaptación.
• Sistema objetivo (se llama asi pues es el que está más próximo al objeto). Está normalmente constituido por
cuatro objetivos.
• Sistema de iluminación:
• Fuente de luz en el pie
• Diafragma para regular la intensidad
• Condensador
• Sistema Mecánico (soporte de las piezas):
• Pie: base de sustentación
• Brazo: en forma de L. Contiene el sistema de tornillo:
• Tornillo de enfoque macrométrico, para un primer enfoque
• Tornillo de enfoque micrométrico, para ajustes y exploración de la profundidad de campo.
• Platina: Pinza y tornillos de desplazamiento (horizontal y vertical)
• Revólver: es donde se encuentra ubicado uno de los sistemas ópticos: el objetivo. Posee 4 objetivos con
distintos aumentos.
• Tubo ocular: contiene sistema ocular, que aumenta unas 10 veces el objeto.
En cualquier preparación están presentes siempre dos elementos:
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• Portaobjetos por encima del cual se pone el objeto a observar.
• Cubreobjetos para cubrir la preparación.
Manejo del microscopio
1. Se agarra la muesstra con la pinza y se conecta la fuente de iluminación.
2. Se coloca el objetivo mas pequeño (4x) y se mira por los dos oculares.
3. Se manipula el macrométrico hasta ver la muestra nítida.
4. Se afina el enfonque con el micrométrico.
5. Se cambia al siguiente aumento (10x).
6. A partir de aquí solo se manipula con el micrométrico.
7. Se continúa con los siguientes aumentos (a medida que subimos los aumentos hay que dar mas intensidad
de luz).
PRÁCTICA II. Obtención y observación de extensiones citológicas
Objetivo
Saber qué es una extensión y conocer las diferentes tinciones.
Introducción
Extensiones citológicas: preparaciones de material biológico, ya sean de tejidos blandos, tejidos líquidos o
semilíquidos. Las extensiones als vamos a obetener mediante:
− Exudados: secreciones (vaginal, esputo, mama, rapado de alguna superficie...)
− Punción−aspiración: pinchar en una cavidad para obtener células (líquidos pleurales, tumores sólidos
huecos...)
Vamos a ver las células que forman parte del tejido pero no vamos a poder ver la arquitectura en la que se
disponen en dicho tejido. Estos elementos no pueden ser observados directamente, necesitan de una
preparación a priori, es decir, tienen que ser procesados.
Procesamiento General
• Extensión: En el portaobjetos se extiende el material a observar (después de homogenizar si es
preciso).
• Fijación: Se hace dejando la preparación secar al aire, o bien utilizando laca.
• Tinción: Se hace a través del método de Papanicolau (utilizado para tinciones de células de un
raspado de mucosa vaginal, donde las células vivas se tiñen en azul y las muertas en rosa) o a través
del método Panóptico (utilizado generalmente para tinciones hematológicas), método que se divide
en una serie de pasos:
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♦ 5 pases de 1 segundos cada uno en una diluición metilica.
♦ 5 pases de 1 segundos en una solución de xanteno.
♦ 5 pases de 1 segundos en una solución de tiazina.
♦ Lavar en agua
♦ Dejar secar al aire
Antes de la observación se procede al montaje en bálsamo de la muestra.
Al microscopio observamos lo siguiente:
Célula
Neutrófilos
Eosinófilos
Basófilos
Linfócitos
Monócitos
Color del núcleo
Azul oscuro
Azul
Azul
Violeta
Laxo violeta
Color del citoplasma
Rosado con granulaciones rojo violeta
Con gránulos rojo o rojo anaranjado
Con gránulos púrpura casi negros
Azul celeste
Azul celeste
Además de las células mencionadas en la tabla anterior se van a identificar otras estruturas anucleadas que son
los eritrocitos o glóbulos rojos, que tienen un color rosa pálido o intenso, y también plaquetas que tienen
color violeta pálido o púrpura.
La citología vaginal sirve para detectar cambios hormonales o tumores. En ella encontramos células
escamosas (céulas epiteliales), que son grandes y se tiñen algunas de azul y otras de rosa. Las células que se
tiñen de rosa con un núcleo pequeño y definido tiene muy poca actividad metabólica, estaban casi muertas
cuando se tomó la muestra. Mientras que las azuladas con un núcleo más laxo y grande tenían gran actividad
celular, es decir, estaban más cerca de la base del epitelio.
PRÁCTICA III. Obtención y observación de preparaciones histológicas
Objetivo
Observación de cortes histológicos.
Introducción
El material ultilizado serán cortes de riñón de rata e intestino delgado.
Procesamiento de preparaciones histológicas
1. Fijación: se coloca la muestra en un medio fijador (formol) para que mantenga la misma estrutura que en el
organismo vivo.
2. Inclusión: se incluye la muestra en parafina, consiguiendo una pieza dura que se pueda cortar con el
microtomo. Antes de la inclusión la muestra debe ser deshidratada introduciéndola en soluciones de alcohol
cada vez más concentrado.
3. Corte: con un microtomo para que el corte sea muy fino y translúcido (5 m).
4. Tinción: en este caso se ha utilizado hematoxilina−eosina
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♦ Hematoxilina−eosina: colorante básico. Tiene afinidad por los ácidos nucleares. 60 segundos
de tinción, agitación suave.
♦ AGUA
♦ Carbonato de Litio: sumergir brevemente, 1 pase.
♦ AGUA
♦ Eosina: tiñe el citoplasma, 30 segundos, agitación suave.
5. Deshidratación
• Alcoholes decrecientes en agua, para deshidratar la preparación, 30 segundos en cada alcohol.
• Xilol: varias veces hasta que el porta no llore.
6. Montaje de la preparación (resina + cubre).
La otra muestra del intestino la teñiremos con la técnica del PAS, que tiñe la mucina. También se tiñen los
núcleos con hematoxilina, pero no utilizaremos eosina por tanto no se verán los citoplasmas al microscopios.
PRÁCTICA IV. Microscopía electrónica: identificación e interpretación
Objetivo
Conocer la utilización del microscopio electrónico y distinguir y observar varias estructuras celulares en
fotografías de ME.
Introducción
El primer microscopio electrónico de transmisión fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ruska y sus
colaboradores. La óptica básica de ese primer microscopio electrónico se mantiene hasta nuestros días; los
cambios en los microscopios modernos consisten en adicionar más lentes para incrementar el ámbito de
aumentos y darle mayor versatilidad. El primer MET comercial lo construyó la Siemens en 1939.
Existen dos tipos de microscopios electrónicos bien definidos: el Microscopio Electrónico de Transmisión
(MET) y el Microscopio Electrónico de Barrido (MEB), también existe el Microscopio Electrónico de Barrido
y Transmisión (STEM), el cual es una combinación de ambos tipos de microscopios.
Las fotos/imágenes obtenidas en microscopía electrónica son siempre en blanco y negro, y producen
aumentos significativos de la estruturas que se pretenden observar. En microscopía electrónica no se define
una ampliación, sino una escala. Por ejemplo, cada centimetro, puede corresponder a 0.1 .
Microscopio electrónico de transmisión
Un microscopio electrónico de transmisión es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar
un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de
onda de la luz visible. Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz
pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. Las partes principales de un microscopio electrónico son:
• Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra la muestra, creando una imagen
aumentada.
• Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes
convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones.
• Sistema de vacío, es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los
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electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el
interior de un microscopio de estas características.
• Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la
imagen aumentada.
• Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una
computadora.
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea
aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando
una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la
muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de
transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Microscopio electrónico de barrido
El microscopio electrónico de barrido permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos,
metálicos y orgánicos, de más grosor que con el microscopio anterior, ya que los electrones son reflejados por
la muestra y captados por el microscopio.
Tratamiento de muestras para observar al microscopio electrónico:
• Deshidratación: se introduce la muestra en etanol a diferentes concentraciones, xilol o tetróxido de
osmio.
• Inclusión en parafina: Se introduce la muestra en un molde en el que se vierte parafina a 56°C.
• Fijación: se incluye la muestra en resina Epon, que se polimeriza a 60°C.
• Corte: con el ultramicrotomo se obtienen finas láminas que caen a una pequeña cubeta de agua.
• Tinción: se colocan los cortes en rejillas de cobre y se tiñen con acetato de vinilo y citrato de plomo
(proteínas y algunos orgánulos). También se puede utilizar la técnica de tinción por flotación (la
muestra se coloca sobre una gota de un tinte determinado y se mantiene unos 10 minutos). Después de
teñida, la muestra se aclara con agua destilada y se posa sobre un papel de filtro para que se seque.
FOTOS (estructuras más señaladas de cada fotografía)
• Virus 11. Polisomas
• Bacterias 12. Aparato de Golgi
• Célula, núcleo (heterocromatina 13. Lisosomas
y eucromatina) 14. Mitocondria
• Uniones entre células 15. Centriolo
• Células vegetales (plasmodesmos) 16. Cilios (corte transversal)
• Células secretoras 17. Cilios (cuerpo basal)
• Mitocondrias, microvellosidades 18. Células secretoras
RE liso, núcleo 19. Epitelio pulmonar y célula ciliada
• Núcleo, nucleolo, envoltura nuclear 20. Tejido muscular estriado
• Cromosoma metafásico 21. Hematés y células
• RE rugoso polimorfonucleadas
PRÁCTICA VI. División celular y de cromosoma metafásico
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Objetivo
Observación de células en división y cromosomas metafásicos.
Introducción
El estudio de lo cromosomas metafásicos es importante porque es en esta etapa en la que el material genéteico
está más condensado y además son más fácilmente visibles debido a que se disponen a lo ancho de todo el
huso mitótico.
División celular
Aunque existen dos tipos de divisiones celulares, nos fijaremos solo en la mitosis, fenómeno que
observaremos en el microscopio óptico. La mitosis es el proceso de división celular por el cual se conserva la
información genética contenida en sus cromosomas, que pasa de esta manera a las sucesivas células a que la
mitosis va a dar origen. La mitosis es igualmente un verdadero proceso de multiplicación celular que participa
en el desarrollo, el crecimiento y la regeneración del organismo.
El proceso tiene lugar por medio de una serie de operaciones sucesivas que se desarrollan de una manera
continua, y que para facilitar su estudio han sido separadas en varias etapas.
• Profase: en ella se hacen patentes un cierto número de filamentos dobles: los cromosomas.Cada
cromosoma constituído por dos cromátidas, que se mantienen unidas por un estrangulamiento que es el
centrómero. Cada cromátida corresponde a una larga cadena de ADN. Al final de la profase ha
desaparecido la membrana nuclear y el nucléolo. muy condensada
• Metafase: se inicia con la aparición del huso, dónde se insertan los cromosomas y se van desplazando hasta
situarse en el ecuador del huso, formando la placa metafásica o ecuatorial (cromosomas metafásicos).
• Anafase: en ella el centrómero se divide y cada cromosoma se separa en sus dos cromátidas. Los
centrómeros emigran a lo largo de las fibras del huso en direcciones opuestas, arrastrando cada uno en su
desplazamiento a una cromátida. La anafase constituye la fase crucial de la mitosis, porque en ella se
realiza la distribución de las dos copias de la información genética original.
• Telofase: los dos grupos de cromátidas, comienzan a descondensarse, se reconstruye la membrana nuclear,
alrededor de cada conjunto cromosómico, lo cual definirá los nuevos núcleos hijos. A continuación tiene
lugar la división del citoplasma (citocinesis).
La obtención de células para el estudio es sencilla: se toma una muestra de tejido y por medio enzimáticos y
mecánicos se consiguen romper las uniones entre las células. Se introducen en un tubo Falcon (lleno de
nutrientes para hacer el cultivo). Las células se depositarán en el fondo y adquirirán una forma estrellada. En
el momento en que empiecen la división celular adoptarán una conformación más redondeada y se separarán
de las del fondo, quedando en suspensión. Será entonces de este grupo de células de las que se deben tomar
las muestras.
Estas células se procesan para su posterior estudio: mediante técnicas de rotura celular, se rompe la membrana
plasmática dejando libre el núcleo, cuya membrana también se romperá al montar la muestra en el porta (se
deja caer desde una cierta altura) quedando a la vista la cromatina y los cromosomas. Se tiñe con
hematoxilina−eosina y observamos al microscopio óptico.
PRÁCTICA VII. Embriología
Introducción
Vimos un vídeo acerca de la fecundación y el desarrollo embrionario y fetal del ser humano.
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Observaciones
En todos los animales, antes de darse el coito, hay una serie de instintos naturales que conducen a que éste
tenga lugar. Entre ellos, existen estímulos provocados por unas sustancias químicas denominadas feromonas.
Durante el coito, normalmente el varón eyacula en la vagina de la mujer, y varios millones de
espermatozoides a continuación intentarán atravesar cuello, útero y trompas. Sin embargo, el 40 % de los
espematozoides no sirven para fertilizar. Cuando uno de los espermatozoides que se dispone alrededor de
óvulo penetra en éste, se une la información genética de la madre y del padre formando una nueva célula (el
cigoto), aquella que va a dar origen a un nuevo individuo: se ha producid0 la fecundación.
El cigoto formado va a seguir a lo largo de la trompa de falopio y llega al endometrio, donde se implantará.
Tras la implantación, el cigoto sigue su desarrollo formando tres capas u hojas embrionarias básicas que son
las precursoras de los diferentes tejidos del nuevo ser humano.
Empienzan pues a formarse las células nerviosas primarias del córtex cerebral y las células madre que
formarán otros tejidos completamente distintos como son los tejidos epiteliales y las células precursoras de los
vasos sanguíneos.
En la 5ª semana el embrión tiene ya 8 mm y el flota en una membrana. Se empiezan a diferenciar la nariz y la
boca. A la 6ª semana con 15 mm de longitud se observa la formación de las manos. A la 7ª semana, con 2 cm
de longitud se inicia la elongación de las piernas. A la 9ª semana el feto ya tiene 4 cm de longitud y 12 gramos
de peso.
El aporte de nutrientes se realiza a través de la placenta, lugar donde se produce el intercambio de éstos entre
la sangre materna y la fetal. Sin embargo, el aporte de alimento es siempre prioritario para la madre. Si hay
falta de nutrición será la madre quién recibirá el alimento en primer lugar.
A las 12 semanas los huesos se encuentran formados. Al 3º mes, los primeros pelos aparecen, y los ojos, que
se empezaron a desarrollar a las seis semanas y que eran inicialmente dos agujeros pequeños fuera del lugar
que conocemos, terminan su formación también a los tres meses. Los ojos se mantienen cerrados durante 3
meses.
El oído externo inicia su formación a la 5ª semana y el oído interno unos días más tarde (los primeros sonidos
que el embrión empieza por oir son los latidos del corazón, ruidos gastrointestinales, etc). Se sabe que los
estimulos externos influyen en el desarrollo del cerebro (por ejemplo, se sabe que es capaz de oir música, bien
como las voces de la madre y del padre). Un dato curioso, es que al chupar el dedo, significa que el feto sueña
con comida.
En la 8ª semana se visualiza el desarrollo de los órganos sexuales. En el caso de la niña se encuentran ya
formados dos millones de óvulos. Como se sabe, el par de cromosomas número 23 es el que determina si el
nuevo ser va a ser una niña o un niño. Si el par de cromosomas es XY entonces vamos a tener un niño, pero si
se tiene XX, el resultado será una niña. En el niño se forma una hormona en grandes cantidades, la
testosterona. Si no se forma testosterona, entonces la hormona que predomina es el estrógeno y será niña.
Durante el desarrollo en el interior de la madre el embrión esta envuelto en el liquido amniótico que lo protege
de los choques mecánicos y que sirve también, ya que el bebé beba de este liquido, y así preparar su aparato
digestivo.
Al final de 9 meses, el nuevo individuo siente la necesidad de salir, se acomoda en el útero materno (que se le
ha quedado pequeño) preparándose para el parto y le envía señales a la madre para que sepa que es el
momento de salir. En ese instante la madre comienza a sufrir contracciones y su cuello se dilata. El parto es
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inminente.
Ocular
Brazo
Revólver
Objetivos
Desplazamiento de platina
Platina
Condensador
Macrométrico
Micrométrico
Cabezal
Foco
Base
Extensión ginecológica
(Papanicolau)
Extensión sanguínea
(Panóptico)
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