preparacion estable del factor viii recombinante sin albumina que

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : A61K 38/37
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
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2 144 293
C07K 14/755
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 97110631.5
kFecha de presentación : 30.06.1997
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 818 204
kFecha de publicación de la solicitud: 14.01.1998
T3
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54 Tı́tulo: Preparación estable del factor VIII recombinante sin albúmina que tiene un bajo contenido
de azúcar.
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73 Titular/es: Bayer Corporation
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72 Inventor/es: Nayar, Rajiv
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74 Agente: Carpintero López, Francisco
30 Prioridad: 12.07.1996 US 678492
100 Bayer Road
Pittsburgh, PA 15205-9741, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.06.2000
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 144 293 T3
01.06.2000
Aviso:
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Preparación estable del factor VIII recombinante sin albúmina que tiene un bajo contenido
de azúcar.
Antecedentes de la invención
Campo
Esta solicitud se refiere, en general, a formulaciones farmacéuticas y, en particular, a una formulación liofilizada para rFVIII que se estabiliza
sin albúmina (sin albúmina).
Técnica Anterior
El Factor VIII es una proteı́na plasmática bien
conocida que es esencial para el proceso de coagulación de la sangre. Aunque el Factor VIII
puede obtenerse, y actualmente se obtiene, a partir de plasma humano, en los últimos años se ha
intentado fabricar Factor VIII a partir de fuentes recombinantes (rFVIII) para evitar la contaminación potencial asociada con los productos
sanguı́neos. Además, una fuente recombinante
para el Factor VIII proporciona un suministro
prácticamente ilimitado del factor de coagulación,
evitando de esta forma las limitaciones de suministro asociadas con el uso de plasma sanguı́neo
donado como material original.
Como una de las ventajas de un producto
rFVIII es que no procede de plasma humano y,
por lo tanto, evita la contaminación potencial de
una fuente de plasma humano, ha sido un objetivo
en la fabricación de rFVIII crear una formulación
estable para rFVIII que pueda describirse como
una formulación totalmente exenta de materiales
de partida de origen humano. Sin embargo, desafortunadamente rFVIII es una proteı́na lábil y,
como muchas otras proteı́nas terapéuticas, puede
volverse inestable durante el almacenamiento.
Para solucionar tal inestabilidad, ha sido una
práctica común incluir albúmina de suero humano
en el producto como estabilizante. La albúmina
se ha considerado un buen estabilizante de FVIII
y se usa en numerosos productos comerciales en
el mercado. Sin embargo, mediante el uso de
albúmina humana como estabilizante de rFVIII,
se pierde una de las ventajas de tener un producto
recombinante en primer lugar (es decir, la ventaja
de evitar cualquier material de origen humano).
Recientemente se han descrito algunas formulaciones sin albúmina para el Factor VIII en
medios de baja y alta intensidad iónica usando
cloruro sódico, cloruro cálcico e histidina como
ion tampón. Además, se han usado aminoácidos
básicos tales como lisina y azúcares tales como
manitol, sacarosa o maltosa. Para conseguir estabilidad en una formulación de Factor VIII sin
albúmina al mismo tiempo que se retiene la isotonicidad necesaria para el uso terapéutico, se ha
usado aproximadamente un 10 % de azúcar en tales formulaciones sin alúmina. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.877.608 (formulación de baja intensidad iónica). La patente
europea 0 314 095 describe otra formulación sin
alúmina que tiene una alta intensidad iónica e
histidina como agente tamponante.
La patente 4.877.608 se refiere a una solución
lı́quida y no a un producto liofilizado que tiene
que ser capaz de experimentar ciclos de liofilización necesarios para preparar el producto. La
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patente europea 314 095 incluye una cantidad relativamente elevada de cloruro sódico y se usa
principalmente en una formulación lı́quida.
Otras patentes relacionadas con las formulaciones del Factor VIII incluyen la patente de Estados Unidos 5.399.670, que describe el uso de
arginina en una formulación liofilizada que contiene albúmina. Véanse también los documentos
WO 95/01804, que describe una formulación que
no incluye sacarosa ni glicina, y los documentos
U.S. 4.440.679 y U.S. 4.623.717 (ambos de Fernandes y col.) que muestran el uso de al menos un 30 % en peso de azúcares en combinación
con aminoácidos para estabilizar FVIII en estado
lı́quido en condiciones de pasteurización (60◦C, al
menos 10 horas).
Además de las formulaciones anteriores del
Factor VIII, hay varias patentes distintas relacionadas con la purificación y/o estabilización del
Factor VIII. Éstas incluyen la patente de Estados
Unidos 5.288.853, que trata un procedimiento de
fabricación de múltiples etapas que incluye el uso
de una columna acoplada a heparina, seguido por
la adición de glicina para formar un producto del
Factor VIII purificado.
La patente de Estados Unidos 5.399.670 trata
un procedimiento para producir una preparación
de Factor VIII liofilizada de mejor solubilidad,
que requiere la adición de arginina a la solución
del Factor VIII antes de la liofilización.
La patente de Estados Unidos 5.259.951 trata
un procedimiento de múltiples etapas para purificar el Factor VIII de plasma usando columnas
de intercambio iónico.
La patente de Estados Unidos 4.758.657 trata
un procedimiento de múltiples etapas para separar el Factor VIII:C de plasma, en el que al menos
una de las etapas requiere la adsorción del Factor
VIII:C en una matriz de interacción hidrófoba.
Además de las patentes anteriores, hay una
formulación descrita hace muy poco para el Factor IX (FIX) que parece similar a la formulación
para rFVIII descrita en este documento. Véase
Abstract 244 por L. Bush y col., Hemophilia, Vol.
2, Suplemento 1, p. 64 (Junio, 1996). FIX es una
pro-enzima que se convierte en una enzima proteolı́tica activa. Por otra parte, FVIII sirve como
cofactor junto con otros componentes de la coagulación para realizar la coagulación sanguı́nea.
El peso molecular de FVIII es de aproximadamente 340.000 Daltons, mientras que FIX tiene
un peso molecular de aproximadamente 56.000 a
57.000. FVIII es muy sensible al procesamiento
proteolı́tico con la pérdida concomitante de actividad coagulante. Es bien conocido que el Factor
VIII es inherentemente más inestable que FIX,
y que los concentrados liofilizados de cada factor demuestran diferencias notables en cuanto a
la estabilidad en almacenamiento a diversas temperaturas. A diferencia de FVIII, FIX incluye la
carboxilación gamma única de 12 restos de ácido
glutámico N terminales, proporcionando de esta
forma una base posible para la estabilidad diferencial. Ası́ pues, una formulación para FIX
no necesariamente sugerirı́a una formulación para
FVIII.
En Pharmaceutical Research, Volumen 12,
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No. 6, páginas 831-837, 1995, también se describe una formulación para un antagonista del receptor de la interleucina-1 humana recombinante
estabilizado similar al descrito más adelante.
A pesar de los esfuerzos pasados y recientes
para crear una preparación estable de rFVIII que
pueda liofilizarse satisfactoriamente y posteriormente reconstituirse rápidamente en agua, hasta
la fecha ha sido difı́cil proporcionar una formulación que no sólo evite el uso de productos humanos tales como albúmina, sino que también satisfaga los requisitos de una liofilización apropiada y
la rápida reconstitución e isotonicidad, mientras
que al mismo tiempo proporciona un rFVIII con
estabilidad a largo plazo y con una vida media
farmacéuticamente aceptable.
Para nuestra sorpresa, ahora se ha descubierto
que tal preparación es posible. Durante el desarrollo de esta formulación, se ha descubierto
que la histidina, que se ha enseñado y usado
en la técnica anterior como agente tamponante,
realmente tenı́a un efecto desestabilizador sobre
formulaciones sin albúmina liofilizadas. Sin embargo, se ha descubierto que los efectos desestabilizadores de la histidina pueden solucionarse eficazmente mediante una nueva formulación de sales, glicina y sacarosa, combinación de la que se
descubrió que tenı́a un efecto beneficioso en la estabilización de rFVIII. Esta mezcla también protege al rFVIII a lo largo de los múltiples ciclos
de congelación-descongelación durante el proceso
de liofilización, y proporciona la rápida reconstitución del producto liofilizado con agua. La formulación incluye componentes tanto cristalinos
como amorfos, a diferencia de la mayorı́a de las
formulaciones de la técnica anterior que son esencialmente amorfas. La formulación de la presente
invención permanece estable en el estado lı́quido
durante al menos veinticuatro horas a temperatura ambiente. A continuación se describen detalles de la presente formulación y su uso.
Resumen de la invención
La formulación de rFVIII mejorada es un producto liofilizado sin albúmina farmacéuticamente
aceptable que puede reconstituirse rápidamente
en agua (en 30 segundos) y que es adecuado para
el tratamiento de la hemofilia. La preparación
liofilizada comprende una nueva mezcla de sales,
aminoácidos y sacarosa. El producto es estable a
temperatura ambiente y, a diferencia de las formulaciones de la técnica anterior, comprende un
nivel relativamente bajo de azúcar.
La formulación comprende, cuando se reconstituye con agua, los siguientes ingredientes:
CaCl2 hasta aproximadamente 5 mM, preferiblemente de 0,1 a 5 mM, muy preferiblemente
2,5 mM, y
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glicina aproximadamente de 65 a 400 mM, preferiblemente 290 mM,
histidina hasta aproximadamente 50 mM, preferiblemente de 1 mM a 50 mM, muy preferiblemente 20 mM,
60
sacarosa de aproximadamente 15 a 60 mM, preferiblemente 30 mM,
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NaCl hasta aproximadamente 50 mM, preferiblemente de 1 mM a 50 mM, muy preferiblemente 30 mM,
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rFVIII aproximadamente de 50 a 1500 UI/ml.
En una formulación liofilizada preferida, la
cantidad de agua residual debe ser de aproximadamente un 1 a un 3 % en peso, preferiblemente
de aproximadamente un 1 % en peso.
Breve descripción de la figura
La figura es un gráfico que compara la potencia a lo largo del tiempo, a 40◦C, de la formulación de esta descripción que tiene un contenido
de azúcar relativamente bajo (curva superior) con
una formulación enseñada por la técnica anterior
que tiene un contenido de azúcar relativamente
alto (curva inferior).
Descripción detallada de la invención
El objetivo que condujo a esta invención fue
identificar una formulación sin albúmina que ofreciera estabilidad a rFVIII (una pérdida de potencia mı́nima o menor de aproximadamente un
20 %) a lo largo de diversas etapas de procesamiento tales como ultrafiltración/diafiltración, almacenamiento del material a granel congelado,
efectos de congelación-descongelación y liofilización. Además, se deseaba un producto de disolución rápida con estabilidad en el estado lı́quido
reconstituido. Finalmente, se deseaba un producto liofilizado farmacéuticamente aceptable con
una vida media apropiada, que pudiera liofilizarse
con un corto ciclo de liofilizado.
Las proteı́nas no cristalizan durante la liofilización. El objetivo de un procedimiento de secado
debe ser convertir la solución acuosa de proteı́nas
en una fase amorfa para proteger a las proteı́nas
de la inestabilidad quı́mica y/o conformacional
causada por un medio cristalino (o con ausencia
total de agua). Ası́ pues, es común incluir cantidades significativas de albúmina (de hasta un 1 %)
para proporcionar una fase amorfa (componente)
para estabilizar las proteı́nas.
Basándose en los objetivos globales, se creó
una formulación con un componente cristalino
para permitir la rápida liofilización y un componente amorfo para estabilizar el rFVIII. Como
se usa en este documento, la expresión cristalino
con un componente amorfo significa que la formulación comprende dos o más fases distintas de las
que al menos una es cristalina y otra es amorfa.
Los sólidos pueden existir en forma cristalina o
amorfa. Los materiales cristalinos se caracterizan por tener una estructura, composiciones estequiométricas y puntos de fusión definidos. Por el
contrario, los materiales amorfos no tienen una estructura molecular claramente definida y pueden
describirse como lı́quidos super-enfriados con una
viscosidad extremadamente alta, tal como una
“goma” viscoelástica o un cristal frágil más rı́gido.
Se cree que pueden incluirse otros azúcares tales
como maltosa, trehalosa y maltotriosa para contribuir al componente amorfo. El manitol puede
incluirse para contribuir al componente cristalino
de la formulación.
La estrategia empleada para identificar una formulación sin albúmina farmacéuticamente aceptable de rFVIII fue la siguiente:
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(a) El material de partida era rFVIII muy purificado, que se purificó usando cromatografı́as ortogonales. Éstas se definen como procesos cromatográficos que funcionan bajo
modos y principios distintos y tı́picamente se usan en sucesión. Como resultado, la
proteı́na puede purificarse rápidamente mediante la aplicación de procedimientos de
purificación diferentes más eficaces. Esto
dio como resultado el Factor VIII, que tenı́a
una pureza de al menos el 90 % (por electroforesis en gel) con actividades especı́ficas
mayores de 2000 UI/mg de proteı́na. La
pureza teórica de rFVIII ha sido objeto de
controversia, pero se cree que es de aproximadamente 3500-5000 UI/mg de proteı́na.
(b) La proteı́na se formuló mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) y se investigó con respecto a la recuperación a través
de UF/DF, susceptibilidad a congelacióndescongelación y estabilidad del lı́quido en
diferentes temperaturas de incubación.
(c) Las formulaciones potenciales se caracterizaron adicionalmente con respecto a su
comportamiento térmico mediante DSC
(calorimetrı́a de exploración diferencial). Se
determinaron la temperatura de transición
vı́trea (Tg’), la temperatura de desvitrificación (Td’) y la temperatura de fusión eutéctica (Te’). Esta información se usó para
identificar formulaciones que podı́an liofilizarse rápidamente y éstas fueron el objeto
de otras investigaciones.
(d) Las formulaciones principales se liofilizaron
usando un ciclo de liofilización rápido, y se
realizaron análisis de estabilidad a temperaturas de almacenamiento convencionales
y aceleradas.
(e) Las formulaciones estables se identificaron
rápidamente a partir de muestras almacenadas a 40◦ C para diversos puntos de tiempo.
Para analizar los resultados de numerosos estudios que condujeron a la formulación de esta
invención, se usaron una estrategia y un programa de diseño experimental de múltiples variables para seleccionar una serie de ingredientes que comprendı́an mezclas de aminoácidos,
sales y azúcares. Los resultados se analizaron
usando un programa sofisticado para resolver
cualquier interacción entre los ingredientes, y se
generó un análisis de los datos de respuesta superficial de múltiples variables. Para nuestra
sorpresa, se descubrió que la histidina (usada
comúnmente en la técnica anterior) realmente
tenı́a un efecto desestabilizador sobre las formu-
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laciones de rFVIII. Esto condujo a la necesidad
de examinar crı́ticamente los criterios para los diversos ingredientes de la formulación que se consideraron finalmente aceptables.
Ejemplo 1
El efecto sobre la estabilidad del rFVIII liofilizado se investigó concentrando diversas cantidades de histidina en una mezcla de rFVIII que
comprende NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM y manitol 165 mM. Los resultados se muestran a continuación.
TABLA
Porcentaje de potencia inicial después de dos
semanas/40◦ C de almacenamiento en presencia
de histidina.
Histidina (mM)
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% de Actividad Inicial a 2
Semanas/40◦C
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Como puede verse por los datos anteriores,
mayores cantidades de histidina dieron como resultado una menor potencia de rFVIII liofilizado
reconstituido de una forma dependiente de la dosis. Este resultado sugiere que la histidina no
juega un papel en la estabilización de FVIII en
estado liofilizado.
Ejemplo 2
Estabilidad de rFVIII en formulaciones con alto
y bajo contenido de azúcar
Se preparó Factor VIII Recombinante en dos
formulaciones. La inestabilidad se investigó en condiciones de almacenamiento aceleradas de 40◦C.
La formulación con alto contenido de azúcar,
similar a la de la técnica anterior, era una formulación amorfa que contenı́a, tras la reconstitución
con agua, 50 mM de cloruro sódico, 2,5 mM de
cloruro cálcico, 5 mM de histidina y 10 % en peso
de maltosa.
La formulación con bajo contenido de azúcar
de esta descripción era cristalina con un componente amorfo de sacarosa al 1 % (sacarosa 30 mM)
para estabilizar la proteı́na. Esta formulación,
tras la reconstitución con WFI, contenı́a 30 mM
de cloruro sódico, 2,5 mM de cloruro cálcico, 20
mM de histidina, 290 mM de glicina y aproximadamente 200 UI/ml de rFVIII. Esta formulación
se compara con la formulación de la técnica anterior en la figura, en la que puede verse que la formulación de rFVIII de bajo contenido de azúcar
de esta descripción es considerablemente más estable a lo largo del tiempo que el producto estabilizado con alto contenido de azúcar de la técnica
anterior.
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reconstituye en agua,
REIVINDICACIONES
1. Una preparación de rFVIII estable, sin
albúmina, liofilizada, que comprende, cuando se
reconstituye en agua,
glicina 290 mM,
5
histidina 20 mM,
glicina de 65 a 400 mM,
sacarosa 30 mM,
histidina hasta 50 mM,
NaCl 30 mM,
sacarosa de 15 a 60 mM,
10
CaCl2 2,5 mM y
rFVIII de 50 a 1500 UI/ml.
NaCl hasta 50 mM,
CaCl2 hasta 5 mM y
rFVIII de 50 a 1500 UI/ml.
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2. Una preparación de rFVIII estable, sin
albúmina, liofilizada, que comprende, cuando se
3. La preparación liofilizada de la reivindicación 1, en la que el contenido de agua residual
es del 1 al 3 % en peso.
4. La preparación liofilizada de la reivindicación 2, en la que el contenido de agua residual
es del 1 % en peso.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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