UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR AREA DE CONOCIMIENTO AGROPECUARIO DEPARTAMENTO ACADEMICO DE ZOOTECNIA TESIS “PREVALENCIA DE CASOS SOSPECHOSOS DE RICKETTSIA ENFOCADO EN LA FIEBRES MACULOSA DE LAS MONTAÑAS ROCALLOSAS Y EHRLICHIOSIS EN PERROS CON PROCEDENCIA CALLEJERA EN EL MUNICIPIO DE TIJUANA” PATA OBTENER EL TITULO DE: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: JOSE MANUEL GOMEZ GOMEZ DIRECTOR: Dr. MVZ RAFAEL RAMIREZ ORDUÑA La Paz B.C.S 2 DE OCTUBRE DEL 2015 ii Dedicatoria A mi padre: Carlos Agustín Gómez Rodríguez. Gracias a tu ejemplo de rectitud y honradez, marcaste mi conducta ante la vida y mi formación profesional. A mi madre: María de los Ángeles Gómez Ramos. A quien con esfuerzo y dedicación debo mi formación humana y profesional. A mis hermanos: Karla Gómez Gómez, Juan Pablo Marín Gómez y Luis Ángel Marín Gómez. Por su cariño y ejemplo. A mi abuela: Maria Emilia Rodríguez Jaime Por su apoyo y ser una excelente persona y ejemplo de la vida. A mis tíos: Jesús Jorge Gómez Rodríguez y Ana Josefina Gómez Ochoa Por su apoyo y cariño. Al profesor: Juan Alejandro Casillas Montes. Por su valiosa intervención en la valoración de este presente trabajo. A mi novia: Liliana Ocaña Benítez e hijos. Gracias a su apoyo, cariño e inteligencia. Te amo. A mis familiares y amigos. iii Agradecimientos A las 2 asociaciones: Sociedad Humanitaria Por amor a Toby. Por haber permitido la realización de los estudios en los perros que han rescatado de la calle y puestos en hogares temporales. A las 3 veterinarias: Veterinaria Sociedad Humanitaria. Veterinaria EMEVET. Veterinaria Dog. Por haberme permitido utilizar sus instalaciones para la toma de las muestras de los perros a muestrear. A mi asesor: Dr. MVZ Rafael Ramírez Orduña. Por ser un excelente maestro, pero mejor amigo. Mi más sincero agradecimiento. Al maestro: Dr. MVZ José Ángel Armenta Quintana. Por ser un excelente maestro y colaborador directo en la revisión de la tesis. A mis sinodales: Dr. MVZ Rafael Ramírez Orduña. Dr. MVZ José Ángel Armenta Quintana. Dr. MVZ Juan Manuel Ramírez Orduña. Por su valiosa sugerencias en la revisión del presente trabajo. iv Al MVZ Sergio Jaime Valdez Manrique Por haberme presentado con las autoridades sanitarias de nuestra entidad. Al MVZ Luis Tinoco García Por haber colaborado proporcionándome los estudios recientes sobre Rickettsiosis de la UABC Campus Mexicali Baja California. A la Universidad Autónoma de Baja California Sur, por brindarme la oportunidad de estudiar la carrera de Médico Veterinario Zootecnista. v CUADRO DE CONTENIDO Dedicatoria ............................................................................................................. vii Agadesimientos ..................................................................................................... ivii Contenido de gráficas ............................................................................................ vi Cuadro de contenido ............................................................................................. vii Resumen………………………………………………………………………………….viii Introducción ............................................................................................................. 1 Hipótesis.................................................................................................................. 2 Objetivo ................................................................................................................... 2 Antecedentes ....................................................................................................... 3-9 Marco teórico……………………………………………………………………..…..10-20 Rickettsia…………………………………………………………………………….……10 Fiebre de las Montañas Rocosas…………...…………………………...……………..15 Ehrlichiosis………………………………………………………...……………………...17 Ciclo de las garrapatas…………………………………………………………………..19 Diseño de la investigacion ................................................………………………….22 Resultados .......................................................................................................... 244 Análisis y discusión de los resultados .................................................................. 25 Conclusión........................................................................................................... 266 Problemas pendientes…………………………………………………………………..26 Literatura citada................................................................................................... 277 Anexo .................................................................................................................. 299 Gráficas………………………...................................................................................29 Tablas de datos……...…………………………………………………………………...31 vi Contenido de gráficas Gráfica 1.- Casos confirmados de la enfermedad ((Field-Cortazares & Moreno, 2011)………………………………………………………………………………….........5 Figura 1.- Casos sospechosos en Baja California (Field-Cortazares & Moreno, 2011)…..……………………………………………………………………………………7 Figura 2.- Rickettsiales (Mutz, 2009 ……………………………………………………12 Figura 3.- Ciclo de vida de la garrapata (Mountain & Fever, 2010)………………… 21 Grafica 2.- Perros muestreados con trombocitopenia por delegación……………. 29 Grafica 3.- Porcentaje de perros muestreados en azul con trombocitopenia y en naranja positivos a E. canis…………………………….………………...……………..29 Grafica 4.- Perros positivos a E. canis por delegación………………………………. 30 Grafica 5.- Porcentaje de perros con trombocitopenia en azul y positivos a R. rickettsia en naranja…………………………………………………………….………..30 vii RESUMEN “PREVALENCIA DE CASOS SOSPECHOSOS DE RICKETTSIA ENFOCADO EN LA FIEBRES MACULOSA DE LAS MONTAÑAS ROCALLOSAS Y EHRLICHIOSIS EN PERROS CON PROCEDENCIA CALLEJERA EN EL MUNICIPIO DE TIJUANA” Por: JOSE MANUEL GÓMEZ GÓMEZ Desde 1930 se tienen registros de la presencia clínica de la enfermedad en humanos en México. Pero en los últimos años se ha observado el aumento progresivo de la población de garrapatas en los estados del norte del país, principalmente en el estado de Baja California, especialmente en el municipio de Mexicali, ya que cuenta con la mayor cantidad de casos sospechosos. En la actualidad los pacientes humanos con síntomas relacionados a una Rickettsii son asociados a perros que padecen la enfermedad clínica o subclínica; que al ser picados por garrapatas (vectores) son la fuente de infección. Y la respuesta por parte de las unidades de salud tanto humanas como veterinarias ha sido compleja, dado que se ha tenido que ir descartando diversas patologías asociadas con cuadros exantemáticos y febriles, lo cual en algunos casos ha retrasado el diagnostico e inicio del tratamiento específico. En este trabajo se presentará un estudio recopilativo de los libros y artículos que se han publicado en los últimos años. Sobre el problema que se ha manifestado en los estados fronterizos del norte del país, sobre las enfermedades rickettsiales y se llevó a cabo un estudio para determinar la prevalencia existente de las bacterias del viii genero Rickettsii de las especies R. rickettsii y E. canis en pruebas de campo realizadas a 36 perros de la calle en las 9 delegaciones del municipio de Tijuana. Mediante los estudios de laboratorio (biometría hemática, Cox-19 y ELISA) para la detección de R. rickettsii y E. canis. Obteniendo como resultado 20/36 (55.5%) perros callejeros muestreados con trombocitopenia. Lo cual nos lleva a sospechar que el 55.5% de los perros son sospechosos de padecer Rickettsiosis. En base al 55.5% de casos sospechosos, se decidió a comprobar los casos mediante la prueba específica para E. canis (ELISA) obteniendo como resultado 6/20 (30%) perros que padecen la enfermedad. El último estudio se realizó para la detección del agente R. rickettsii a la totalidad de los perros muestreados, obteniendo como resultado 0/36 (0%) perros. ix INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha observado el aumento progresivo de la población de garrapatas en los estado del norte del país, principalmente en el estado de Baja California, en los municipios de Mexicali, Tijuana, Ensenada, Rosarito y Tecate (Field-cortazares & Moreno, 2011). Representan una gran amenaza, ya que estos ectoparásitos son vectores de bacterias del genero Rickettsii, algunas de estas bacterias son zoonóticas por lo cual utilizan a la población canina y humana como huéspedes, provocando cuadros patológicos severos que pueden llevar hasta la muerte del huésped. La distribución de las enfermedades rickettsiales es mundial, con cierta delimitación geográfica por el tipo de reservorios y vectores involucrados. En algunas regiones surgen como enfermedades proliferantes estrechamente relacionadas con alteraciones del medio ambiente. Actualmente los pacientes humanos con síntomas relacionados a una Rickettsii son asociados a perros que padecen la enfermedad clínica que al ser picados por el parasito (vectores), que son la fuente de infección hacía la población humana mediante las garrapatas que los ectoparásitan. Y la respuesta por parte de las unidades de salud tanto humanas como veterinarias que atendieron a estos enfermos ha sido compleja, dado que se ha tenido que ir descartando diversas patologías asociadas con cuadros exantemáticos y febriles, lo cual en algunos casos ha retrasado el diagnostico confirmativo e inicio del tratamiento específico. Los antecedentes literarios mencionan que en el municipio de Mexicali B.C, el Laboratorio de Salud Pública del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias de la Universidad Autónoma de Baja California. Han realizado investigaciones para la detección de perros enfermos con Rickettsia sp, utilizando 1 la técnica de laboratorio PCR y ELISA en los años 2005 al 20014.(ELISA).(Gracia, 2015). En este trabajo se presentará un estudio recopilativo de los libros y artículos que se han publicado en los últimos años. Sobre el problema que se ha manifestado en los estados fronterizos del norte del país, sobre las enfermedades rickettsiales y se llevó a cabo un estudio para determinar la prevalencia existente de las bacterias del genero Rickettsii de las especies R. rickettsii y E. canis en pruebas de campo realizadas a 36 perros de la calle en las 9 delegaciones del municipio de Tijuana Baja California. Al dar resultados positivos, de las 2 enfermedades Rickettsiales a estudiar. Permitirá alertar a los médicos veterinarios y a profesionales del sector de salud, a tomar las medidas pertinentes. Tales como llevar a cabo actividades preventivas mediante el control químico en hogares y la ectodesparasitación de los animales de compañía. HIPÓTESIS La relación entre ciudades tan cercanas como lo que es Mexicali con Tijuana a una distancia de 148 km. Los resultados que se han presentado en Mexicali no deben de ser tan lejanos a lo que probablemente se está presentando en la ciudad de Tijuana B. C. por el movimiento de ganado, mascotas y personas. Por lo que se comprobará que R. rickettsii y E. canis se encuentran con una prevalencia muy semejante, como en la ciudad de Mexicali B. C. OBJETIVO Se realizarán muestreos sanguíneos para la detección de 2 enfermedades causadas por el orden Rickettsia: R. rickettsi ¨zoonotica¨ y E. canis. En 36 perros del municipio de Tijuana los cuales se tomarán 4 perros por delegaciones que comprende: Centro, Otay Centenario, Playas de Tijuana, La Mesa, San Antonio de los Buenos, Sánchez Taboada, Cerro Colorado, La Presa y La Presa Rural. 2 ANTECEDENTES Fiebre de las Montañas Rocosas En abril de 1906 Howard Taylor Ricketts (1871-1910) viajó a Biterroot Valley para estudiar una enfermedad que se manifestaba con cierta frecuencia en la zona noroeste de los Estados Unidos, la fiebre maculosa o manchada de las Montañas Rocosas, por iniciativa del McCormick Memorial Institute, en el estado de Montana, la Universidad y la American Medical Association. Howard Taylor Ricketts pasó cuatro años alternando entre laboratorios y el trabajo de campo. Con su ayudante J. Moore logró reproducir experimentalmente la enfermedad en monos y cobayos. Demostrando su transmisión por la picadura de garrapata del Pacífico o Dermancentor occidentalis. También probó la inmunidad que adquiere el animal después de un ataque y que la infección en artrópodos se transmitía trans-ovárica a su progenie. (Microbiol & Uribe, 2010). En 1909 anunció el descubrimiento de dos diminutos cuerpos de aspecto lanceolado como causante de la enfermedad. (Microbiol & Uribe, 2010). Ehrlichiosis Se descubrió por primera vez en Argelia en 1935 por Donatein y Lestoquard, pero fue a partir de la década de 1960 debido a la epizootia que afectó a los perros procedentes de U.S.A. y utilizados con fines militares en la guerra de Vietnam. Por lo cual se retomó su estudio. Debido a la alta morbilidad y mortalidad hizo que se llamara durante algún tiempo Pancitopenia Tropical Canina, pero se comprobó que era el mismo agente que el descrito por Donatein en 1935, solo que en presencia de una cepa más virulenta. En 1945 fue renombrada como Ehrlichia canis, en honor al bacteriólogo alemán Paul Ehrlich. (Callés, n.d.) 3 Antecedentes en humanos en México Desde 1930 se tienen registros de la presencia clínica de la enfermedad en humanos en México y actualmente la enfermedad se distribuye, con mayor prevalencia, en los estados del norte del país con climas cálidos y áridos. En los pacientes no tratados el desenlace puede ser fatal, la tasa de mortalidad puede ser hasta del 35%. Los datos más recientes 2007-2009 muestran que solo 11 estados de la República Mexicana se han reportado casos confirmados de la enfermedad (Cuadro 1), resaltando el brote en Mexicali, Baja California (2009; 278 casos) (FieldCortazares & Moreno, 2011). 4 Cuadro 1.- Casos confirmados de la enfermedad (Field-Cortazares & Moreno, 2011). 5 Estudios previos en humanos en Baja California (2008-2010) A partir del mes de septiembre del 2008, se han podido cuantificar un total de 1453 pacientes que cubrían los requisitos para considerarlos como sospechosos (Figura 1). (Field-Cortazares & Moreno, 2011). A partir del 24 de marzo del 2009 a febrero del 2010 se han detectado un total de 278 pacientes donde se confirmó el diagnóstico de rickettsiosis, todos estos confirmados practicando el método de Weil Felix como tamizaje y Eliza como confirmatorio (Field-Cortazares & Moreno, 2011). En 275 casos el agente causal fue por Rickettsia rickettsii y en 3 casos por Rickettsia prowazekii presentando un total de 264 casos positivos en la ciudad de Mexicali y 11 casos positivos entre las ciudades de Tijuana, Rosarito y Ensenada (FieldCortazares & Moreno, 2011). Las defunciones en una zona marginada de la ciudad de Mexicali conocida como Los Santorales fueron un total de 132 y el resto en distintos puntos de la misma ciudad. (Field-Cortazares & Moreno, 2011). 6 Figura 1.- Casos sospechosos en Baja California (Field-cortazares & Moreno, 2011). 7 Detección de Rickettsia sp por PCR en humanos atendidos por el sector salud de Mexicali, Baja California, México. El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Salud Pública del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias de la Universidad Autónoma de Baja California. Se analizaron 120 muestras de sangre de pacientes colectadas por el sector salud, que comprende el Hospital General de Mexicali y del IMSS delegación Baja California. Los criterios para la selección de muestras se basaron en personas con signos compatibles a la enfermedad, edad y sexo indistintos.(Gracia, 2015). El análisis molecular se realiza con la técnica de PCR para la detección de Rickettsia rickettsii. Obteniendo de los 120 pacientes muestreados mediante la técnica de laboratorio PCR, se obtuvo un total de 30 (25%) casos positivos. (Gracia, 2015). Estudios previos de Rickettsia rickettsii en perros en la zona urbana de Mexicali B.C. 2005 al 2009. El presente trabajo se llevó a cabo en la ciudad de Mexicali B. C. realizando muestreos sanguíneos de 384 perros atendidos en 39 clínicas veterinarias, realizados desde febrero de 2005 a diciembre de 2006. Y otro estudio incluyó el análisis serológico de muestras sanguíneas de 384 perros distribuidos en grados de marginada, alta, mediana y baja de la cuidad, colectadas en el mes de junio del 2009. Utilizando como método de diagnóstico (ELISA).(Gracia, 2015). Obteniendo como resultado (284/384) 64.4% en los perros que fueron atendidos en clínicas veterinarias. Los resultados obtenidos en perros capturados por el personal del Centro Municipal de Control Animal fue de (218/384) 59.54%. Todas las garrapatas colectadas de perros fueron R. sanguineus (Gracia, 2015). 8 Presencia de Rickettsia sp. en garrapatas Rhipicephalus sanguineus de perros en Mexicali, B. C, México 2009 al 2013. Este proyecto consta del diagnóstico molecular de Rickettsia sp. por PCR en garrapatas Rhipicephalus sanguineus analizadas en el Laboratorio de Salud Pública Veterinaria del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias de la Universidad Autónoma de Baja California desde febrero de 2009 a diciembre de 2013. El proyecto fue realizado mediante el análisis de muestras de ADN de 188 garrapatas colectadas de perros de la zona urbana de Mexicali.(Gracia, 2015). Obteniendo el resultado de las 188 muestras de ADN de garrapatas colectadas de perros de la zona urbana de Mexicali BC, 58 (30.8%) resultaron positivas a R. rickettsii (Gracia, 2015). Detección de Ehrlichia por PCR en perros en Mexicali, Baja California, México. El trabajo fue realizado en la ciudad de Mexicali, el 18 de febrero del 2013 al 26 de mayo del 2014, en 184 perros colectadas en 2005-2009, buscando las bacterias E. canis. Estas fueron analizadas en el Laboratorio de Salud Publica Veterinaria (Gracia, 2015). Los resultaron obtenidos fueron 99/184 (53.8%) muestras resultaron positivos (Gracia, 2015). 9 MARCO TEÓRICO Rickettsia Generalidades Las rickettsias son un género de bacterias intracelulares obligadas transmitidas por artrópodos hematófagos como las garrapatas, piojos y ácaros. (Venzal & Nava, 2011). Dentro de la clase alfa-proteo bacterias, se encuentra el orden Rickettsiales, en el cual se incluyen a su vez la familia Rickettsiaceae y Anaplasmataceae (Figura 2). La familia Rickettsiaceae incluye dos géneros. El ya mencionado Rickettsia y el género Orientia. El género Rickettsia está compuesto por los grupos Tifus (TG), el grupo de las Fiebres Manchadas (SFG), el grupo Transicional (TRG) y el grupo Ancestral (AG). TG solo tiene 2 miembros, R. prowazekii y R. typhi, ambos patógenos para los seres humanos. En el SFG existen 20 especies: R. rickettsii (Rocky Mountain spotted fever), R. conorri subsp. conorii (Mediterranean spotted fever), R. conorii subsp. israelensis (Israeli spotted fever) R. conorii subsp. caspia (Astrakhan fever), R. conorii subsp. indica (Indian Tick Typhus), R. sibirica subsp. sibirica (Siberian tick typhus or North Asian tick typhus), R. sibirica subsp. mongolitimonae, R. australis (Queensland tick typhus), R. japonica (Japanese or Oriental spotted fever), R. africae (African tick bite fever), R. honei (Flinders Island spotted fever), R. slovaca, R. heilongjiangensis, R. aeschlimannii, R. parkeri, R. massiliae, R. marmionii, R. amblyommii, R. texiana y R. helvética. Todas las rickettsias de éste grupo son potencialmente patógenas para el hombre, siendo R. rickettsii la más patógena. (Mutz, 2009). En el grupo ancestral se encuentran R. belli y R. canadensis. Por último en el grupo transicional están R. akari y R. felis. Y por último, en la familia Anaplasmatacea 10 encontramos en la actualidad los géneros Ehrlichia spp y Anaplasma spp. (Mutz, 2009). 11 Figura 2.- Rickettsiales (Mutz, 2009) 12 Patogenia Las rickettsias patógenas sobreviven en una relación comensal con un insecto vector, los cuales sirven como un reservorio primario. Los humanos son hospedadores accidentales. Los reservorios de esta zoonosis, de los cuales los humanos típicamente adquieren la infección por los perros y ratones salvajes. Por lo general, la picadura es indolora y pasa inadvertida. La enfermedad se transmite durante la alimentación hemática, cuando las secreciones provienen de las glándulas salivales de la garrapata y se ponen en contacto en el interior de los vasos sanguíneos dérmicos. Después de la introducción a través de la piel, los microorganismos alcanzan el torrente sanguíneo a través de los vasos de pequeño calibre y linfáticos. (“Boletín epidemiológico periódico,” 2006). Se ha demostrado que pocos microorganismos vivos son necesarios para ocasionar infección clínica aparente. La diseminación a través del torrente circulatorio se continúa con el ataque al endotelio vascular. Las rickettsias utilizan a las células endoteliales de vasos de pequeño calibre como el blanco primario en las infecciones in vivo, causando incremento en la permeabilidad capilar, así como lesiones febriles en hospederos mamíferos. La patogenia es muy similar en todas ellas y consiste en una vasculitis de pequeños vasos por infección directa de las células endoteliales. (“Boletín epidemiológico periódico,” 2006). Cuando las rickettsias se ponen en contacto con las células endoteliales, inducen su propia fagocitosis, y una vez dentro del citosol, escapan del fagosoma y proliferan por fisión binaria simple, siendo finalmente expulsadas por exocitosis para seguir infectando células contiguas. (“Boletín epidemiológico periódico,” 2006). Manifestaciones clínicas La sintomatología clínica, comienza 6–10 días después de producirse la picadura de la garrapata, e incluye fiebre, mialgia, linfadenopatía local y la característica 13 pústula en el lugar de la picadura de la garrapata. (“Dermacentor occidentalis.,” 1995). Estos signos clínicos principales varían dependiendo de la especie de rickettsia implicada. Entre los hallazgos hematológicos y bioquímicos no específicos se incluyen trombocitopenia, recuentos leucocitarios anormales. La enfermedad puede ser aguda o crónica. (“Dermacentor occidentalis.,” 1995). Diagnóstico El diagnóstico de la infección se basa empíricamente en el examen físico del paciente y datos epidemiológicos. Sin embargo, el diagnóstico clínico es difícil, debido a que los signos y síntomas iniciales generalmente son inespecíficos. (“Boletín epidemiológico periódico,” 2006) Las pruebas serológicas como Weil-Felix el ensayo serológico más antiguo, tienen un valor limitado ya que los anticuerpos contra el patógeno no son detectables hasta los 7 a 10 días después de la lesión inicial y da una sensibilidad global tan bajo como 33% y una especificidad de 46%. (Febriles, n.d.) Otras pruebas serológicas es la de ELISA indirecta IgM que presenta una sensibilidad de 78% y una especificidad de 80% y la prueba de anticuerpos fluorescentes indirecto (IFI) es considerada como el estándar de oro para este patógeno, ya que presenta una sensibilidad de 82% y una especificidad de 90.9%pero no permite distinguir entre infección con R. rickettsii de otras rickettsias. (Roberto & Evia, 2009)(“Serodiagnóstico de rickettsiosis por prueba elisa e inmunofluorescencia ifi igm,” 2007). El uso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), está limitado debido a su baja sensibilidad para detectar ADN en especímenes sanguíneos. Ya que el número de este patógeno circulante en sangre es bajo, particularmente en ausencia de enfermedad avanzada o infección fulminante. (Roberto & Evia, 2009). 14 Tratamiento El tratamiento debe administrarse sobre la base de la sospecha clínica, sin esperar los resultados de las pruebas serológicas, porque el retraso en la administración de antibióticos puede dar lugar a tasas más altas de desenlace grave o mortalidad. Se debe administrar doxiciclina a una dosis de 5 a 10 mg/kg, VO o IV, 1v/d durante 10 a 21 días. También es eficaz administrar 22 mg/kg de tetraciclina VO 3 v/d durante 28 días y dipropionato de imidocarb a una dosis de 5 mg/kg 1 vez cada 2 a 3 semanas. Puede ser necesario introducir una terapia de apoyo. Debe instaurarse ciertas precauciones para la eliminación y el control seguro de garrapatas. (“Boletín epidemiológico periódico,” 2006) (Mutz, 2009). Fiebre Maculosa de las Montañas Rocosas Clasificación taxonómica Reino: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase Alpha Proteobacteria Orden: Rickettsiales Familia: Rickettsiaceae Género: Rickettsia Especie: R. rickettsii (Roberto & Evia, 2009) 15 Etiología Es una enfermedad de seres humanos y perros que son causada por Rickettsia rickettsii y miembros relacionados estrechamente del grupo de las rickettsias de la fiebre maculosa, son consideradas endémicos en la mayor parte de América del Norte, del Sur y Centro. Estos patógenos se transmiten principalmente por la picadura de garrapatas infectadas. (Roberto & Evia, 2009). Cuadro clínico Los pacientes que presentan la infección desarrollan diversos rangos de manifestaciones sistémicas, cutánea, cardiacas, pulmonares, gastrointestinales, renales, neurológicas y musculo esqueléticas. (Mountain & Fever, 2010). Manifestaciones sistémicas: Las manifestación inicial usualmente consisten en fiebre. Se observa en 100% de los casos y es mayor a 40 °C. (Roberto & Evia, 2009). Manifestación cutánea: Edema e hiperemia de las mucosas, prepucio peniano. (Roberto & Evia, 2009). Manifestaciones cardiacas y circulatorias: una minoría de los casos presenta miocarditis Típicamente, la forma inicial de la lesión comienza con pequeñas petequias en membranas mucosas oculares, orales y genitales, también ‘presentan anorexia . (Roberto & Evia, 2009). Manifestación pulmonar: Se debe a la permeabilidad vascular de la microcirculación pulmonar. Se presenta tos en una tercera parte de los pacientes. (Roberto & Evia, 2009) (Mountain & Fever, 2010). Manifestaciones gastrointestinales: durante los primeros días de infección, los pacientes generalmente desarrollan náuseas y melena. (Roberto & Evia, 2009). 16 Manifestaciones renales: en los casos severos pueden desarrollarse insuficiencia renal aguda y hematuria. (Roberto & Evia, 2009) (Mountain & Fever, 2010). Manifestaciones neurológicas: Los pacientes pueden desarrollar letargo, cefalea y meningitis. Pueden progresar las manifestaciones neurológicas hasta ataxia. (Roberto & Evia, 2009) (Rocosas & Basica, 2011). Manifestaciones musculo esqueléticas: Se presentan con frecuencia las mialgias. (Roberto & Evia, 2009). Ehrlichiosis Clasificación taxonómica Dominio: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Alpha Proteobacteria Orden: Rickettsiales Familia: Anaplasmataceae Género: Ehrlichia Especie: Ehrlichia canis (Veterinaria, 2006) Etiología La ehrlichiosis monocítica clásica canina está causada por Ehrlichia canis, que infecta las células sanguíneas (monocitos, plaquetas y granulocitos) de los perros. (Veterinaria, 2006) 17 Epidemiologia Estos agentes se transmiten mediante la garrapata del perro, Rhipicephalus sanguineus. La garrapata Rhipicephalus se infecta con E.canis al alimentarse en perros infectados y transmiten la infección a otros perros durante las tomas de sangre en las fases vitales sucesivas. También pueden transmitir el patógeno las transfusiones de sangre. (Veterinaria, 2006) (Silva-molano, Sánchez-ucrós, & Loaiza-echeverri, 2008). Cuadro clínicos Los signos normalmente progresan desde agudo a crónico, según la cepa del microorganismo y del estado inmune del hospedador. (Silva-molano et al., 2008). Los signos de la fase aguda de la enfermedad generalmente se desarrollan de 1 – 3 semanas posteriores a la mordida de la garrapata infectada, y generalmente dura de 2 – 4 semanas. En esta fase el hemograma puede mostrar una trombocitopenia (Veterinaria, 2006) (Silva-molano et al., 2008). Seguida de la fase aguda los animales pueden entrar en estado subclínico, durante la cual la persistencia del antígeno en las células infectadas obra como estímulos para el sistema inmune. Esta fase aparece de 6 – 9 semanas después de la infección inicial y su duración suele ser de 1 a 4 meses. Hay ausencia de signos clínicos pero persisten los cambios hematológicos consisten con trombocitopenia, anemia arregenerativa y respuestas celulares variables leucopenia a linfocitosis y monocitosis. Los perros que no eliminan la infección progresan a la fase crónica. (López, Abarca, Mundaca, & Caballero, n.d.). Esta fase generalmente se desarrolla de 1 a 4 meses luego de la mordida de la garrapata y puede ser, ya sea leve o severa. (López et al., n.d.). 18 Manifestaciones sistémicas: Los signos más comunes en la enfermedad son debilidad, anemia, depresión, anorexia, pérdida de peso, letargia, palidez de mucosas, petequias, tos, disnea, fiebre y edema periférico, especialmente en miembros posteriores. De todos los signos hemorrágicos observados en la fase crónica: petequias, hematuria, melena, hemorragias oculares y epistaxis es más frecuente. (Silva-Molano et al., 2008), (Craing E. Greene. 2008). Los signos oculares: Los hallazgos e incluyen uveítis anterior, opacidad corneal, hifema, tortuosidad de vasos retínales. Puede haber desprendimiento de retina y ceguera debido a hemorragias. (Silva-molano et al., 2008), (Craing E. Greene. 2008). Manifestaciones neuromusculares: Son el resultado de meningitis por inflamación o hemorragia, o ambas. Se han observado convulsiones, estupor y ataxia. Ocasionalmente aparecen signos locomotores como marcha envarada (Craing E. Greene. 2008). CICLO NATURAL DE LAS GARRAPATAS Dependiendo del área geográfica se conocen varias especies de garrapatas que sirven como vectores del microorganismo. Las garrapatas Dermancentor andersoni (garrapata de la madera de las Montañas Rocosas) y Dermancentor variabilis (garrapata estadounidense del perro), son los principales vectores de la infección en los Estados Unidos y Amblyomma cajennense (garrapata Cayena) es el vector más importante en Centro América y Sudamérica. Amblyomma aureolatum (garrapata dorada del perro) y Rhipicephalus sanguineus (garrapata café del perro) también son vectores reconocidos en Sudamérica. (Mountain & Fever, 2010). El ciclo de vida de estas garrapatas consiste en tres etapas: las larvas que salen de los huevos, las ninfas que se desarrollan a partir de las larvas y los adultos (Figura 3). Cada una de estas formas permanece unida al huésped, alimentándose de su 19 sangre por unos pocos días. R. rickettsii puede estar en cualquiera de las tres etapas del ciclo de vida de las garrapatas, incluso en los huevos. (Microbiol & Uribe, 2010). 20 Figura 3.- Ciclo de vida de la garrapata. (Mountain & Fever, 2010) 21 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN 36 perros 36 jeringas de 10 ml 36 tubos con EDTA 36 tubos con SST Rasuradora con navaja del número 10 Isipós 1 pinza hemostática 1 Liga Snap para E. canis con su respectivo diluyente Jeringas de 1 ml Tubos con EDTA Tubos capilares desechable En el presente trabajo se realizó a partir del mes de agosto del 2014 - agosto del 2015 mediante estudios epidemiológicos para la valoración de dos enfermedades de transcendencia sanitaria a nivel mundial. La cual comprende la Fiebre de las Montañas Rocallosas y Ehrlichiosis en 36 perros de procedencia callejera, edad, sexo y raza indistinto, pero que haya o estén ectoparásitos con garrapatas. Los cuales se localizan en el municipio de Tijuana Baja California, que comprende 9 22 delegaciones: Centro, Otay Centenario, Playas de Tijuana, La Mesa, San Antonio de los Buenos, Sánchez Taboada, Cerro Colorado, La Presa, La Presa Rural. Se seleccionaron 4 perros al azar de cada una de las 9 delegaciones, prosiguiendo a citarlos en las veterinarias más cercanas a su localidad o en su mismo domicilio para la realización del llenado del formato epidemiológico y la extracción de las muestras sanguíneas que consiste en extraer 9 ml de sangre, de la yugular (previamente rasurada la piel y desinfectada) y colocar 3 ml de la sangre en un tubo de EDTA (tapón morado) para la Biometría Hemática, para valorar la serie plaquetaria y 5 ml en el tubo con SST para el estudio COX-19, para valorar los casos positivos a R. rickettsia. El ml sobrante se colocó en otro tubo con EDTA y se almacenó en refrigeración 4-8 °C. Con los tubos previamente identificados de la Biometría Hemática y COX-19 se prosiguió a mandarlos al laboratorio Klein para la realización de los análisis, los cuales reportaron sus resultados a las 8 horas a partir de la recepción de las muestras. En los resultados obtenidos de la biometría hemática fueron considerados los pacientes que presentaran trombocitopenia como sospechosos a Ehrlichiosis, los cuales fueron candidatos para la realización del 3 estudio ELISA, el cual es específico para E. canis. El estudio consiste en recolectar 10 ul de sangre del tuvo con EDTA (previamente almacenada) y depositarlo en la ventana del dispositivo y posteriormente, agregué 2 gotas de diluyente en la ventana del dispositivo y para finalizar esperar 20 min para valorar la interpretación. El análisis estadístico de la información se realizó de manera descriptiva por delegación. 23 RESULTADOS Los resultados obtenidos de las muestras sanguíneas de perros 36 callejeros que fueron realizadas mediante los estudios de laboratorio (biometría hemática, Cox-19 y ELISA) para la detección de R. rickettsii y E. canis. En el municipio de Tijuana B. C. México, en sus respectivas delegaciones: Centro, Otay Centenario, Playas de Tijuana, La Mesa, San Antonio de los Buenos, Sánchez Taboada, Cerro Colorado, La Presa y La Presa Rural. Mostrados en la (Tabla de datos). Se obtuvo como resultado 20/36 (55.5%) (Grafica 3) perros callejeros muestreados con trombocitopenia, localizados en las delegaciones: 4 Centro, 4 Otay Centenario, 4 Playas de Tijuana, 4 La Mesa, 3 San Antonio de los Buenos y 1 en La Presa Rural (Grafica 2). Lo cual nos lleva a sospechar que el 55.5% de los perros son sospechosos de padecer Rickettsiosis. En base al 55.5% de casos sospechosos se decidió a comprobar los casos mediante la prueba específica para E. canis (ELISA) obteniendo como resultado 6/20 (30%) (Grafica 3) perros que padecen la enfermedad. Los cuales se encuentran distribuidos en las delegaciones: Centro 4, Otay Centenario 1 y en La Presa Rural se confirmó 1 caso (Grafica 4). Se realizaron dos estudios de ELISA a dos perros que manifestaron antecedentes sistémicos no específicos de haber presentado Rickettsiosis. Uno de ellos en estudios fuera de este proyecto, mostró trombocitopenia, signos gastrointestinales y respiratorios y como tratamiento se manejó doxiciclina por 20 días y el paciente se dió de alta al finalizar el tratamiento. Por ese motivo se integró al proyecto realizándole una biometría la cual no presentó trombocitopenia y ELISA, la cual fue negativa. El segundo caso fue de un perro que presentaba convulsiones por motivo inespecífico, se le realizó una biometría hemática y salió negativo a trombocitopenia, se prosiguió a realizar ELISA y el resultado fue positivo, los paciente provenían de la delegación La Presa Rural. 24 El tercer y último estudio se realizó para la detección del agente R. rickettsii a la totalidad de los perros muestreados por el motivo de confirmar el agente ya que es una enfermedad zoonótica y con alta incidencia en nuestra vecina ciudad de Mexicali. Obteniendo como resultado 0/36 (0%) perros muestreados (Grafica 5). ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS Tinoco - García et al., (2015) realizaron estudios serológico (ELISA) (sensibilidad de 78% y una especificidad de 80%) en perros para la detección del agente etiológico Rickettsia rickettsii en la zona urbana de la ciudad de Mexicali B.C. (Clima desértico 3°C a 45 °C y 28% de humedad) realizaron muestreos sanguíneos para la detección de 768 perros (384 veterinarias y 384 en la perrera municipal) en los cuales se obtuvo como resultado 284 (64.4%) veterinarias y 218(59.54%) perrera; El presente trabajo se realizó en la ciudad de Tijuana B.C. (mediterráneo seco 7°C a 33°C y 80%) mediante otro tipo de estudio de laboratorio por ser inaccesible la prueba serológico (ELISA) para este tipo agente etiológico en nuestro país. Por lo cual se elaboró el proceso de diagnóstico mediante el estudio Weil-Felix con una sensibilidad 33% y una especificidad de 46%. Por lo cual nos basamos en los títulos de Proteus OX-19, para detectar casos positivos. Obteniendo como resultados, que en los 36 perros muestreados en la ciudad de Tijuana no se encontró ningún perro infectado con este agente etiológico. Tinoco - García et al., (2015) realizaron estudios para la detección de E. canis utilizando como método de diagnóstico molecular (PCR). En 184 perros de la perrera municipal en la ciudad de Mexicali, en la cual se dió como resultado que 99 (53.8%) perros estaban infectados con este agente etiológico. En contraparte en este estudio mediante la técnica de laboratorio (ELISA) Obteniendo como resultados, que en los 20 perros muestreados en la ciudad de Tijuana se encontró 6 (30%) perros infectado con este agente etiológico. 25 Las causas de que en el estudio para Rickettsia rickettsii hayan salido los resultados negativos. Se debió al proceso de diagnóstico elaborado en este estudio ya que es de baja sensibilidad y especificidad o por la cantidad de muestras analizas comparados con los elaborados en la ciudad de Mexicali por la Universidad Autónoma de Baja California. CONCLUSIÓN Los resultados obtenidos en este estudio a partir del mes de agosto del 2014 a agosto del 2015. Se demostraron casos positivos en 6/20 (30%) perros por E. canis comparado con 99/184 (53.8%) obtenidos en la ciudad de Mexicali y en el estudio para R. rickettsii se demostró 0 casos positivos en perros, comparados con 502/768 (65.3%) casos positivos en perros de la ciudad de Mexicali en el presente año. Por lo que mi hipótesis no se cumplió. PROBLEMAS PENDIENTES Considerando el alto riesgo zoonótica de R. rickettsii y la rápida diseminación de las 2 enfermedades abarcadas en este trabajo y teniendo pruebas moleculares de que estas pueden alojarse en la garrapata café del perro, se hace de suma importancia implementar estudios epidemiológicos para la detección de estos patógenos en los artrópodos y sumar pruebas moleculares en perros en la ciudad de Tijuana. 26 LITERATURA CITADA Callés, A. (n.d.). EhrlicWosis canina. Dermacentor occidentalis. (1995). Febriles, R. (n.d.). Reacciones febriles, 1–6. Field-cortazares, J., & Moreno, J. L. S. (2011). 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Roberto, J., & Evia, B. (2009). Fiebre manchada de las Montañas Rocosas, 56, 193– 208. 27 Rocosas, M., & Basica, I. (2011). Fiebre maculosa de las montañas rocosas, 2011. Serodiagnóstico de rickettsiosis por prueba elisa e inmunofluorescencia ifi igm. (2007). Silva-Molano, R. F., Sánchez-Ucrós, N., & Loaiza-Echeverri, A. M. (2008). sanguíneas de caninos en la ciudad de Cali , Colombia Recurrence report of Ehrlichia canis in dog blood samples in Cali , Colombia, 2(1), 27–31. Venzal, D. J. M., & Nava, S. (2011). El género Rickettsia como agente de zoonosis en el Cono Sur de Sudamérica, 98–106. Veterinaria, E. A. P. D. E. M. (2006). Estudio retrospectivo de caso control de ehrlichiosis canina en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Mayor de San Marcos : periodo 2002-2005. Serodiagnóstico de rickettsiosis por prueba elisa e inmunofluorescencia ifi igm. (2007). 28 ANEXO Graficas Delegaciones con Trombocitopenia 36 33 30 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0 4 4 4 4 3 1 Delegaciones Grafica 2., Perros muestreados con trombocitopenia por delegación. TROMBOCITOPENIA Y E. CANIS 20 20 18 16 Muesreados 14 12 10 55.5% 8 6 6 30% 4 2 0 trombocitopenia E. canis Grafica 3., Porcentaje de perros muestreados en azul con trombocitopenia y en naranja positivos a E. canis 29 Delegaciones con E. canis 36 33 30 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0 4 1 0 0 0 0 0 0 1 Delegaciones Grafica 4., Perros positivos a E. canis por delegación. Perros muestreados R. rickettsii 36 33 30 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0 20 55.5% 0 Sospechosos R. rickettsia Grafica 5., Porcentaje de perros con trombocitopenia en azul y positivos con R. rickettsii en naranja 30 Tabla de datos Número de folio: 1 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 10 marzo del 2015 Centro Vieja. Pastor Alemán. Hembra. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: positivo. Fotografía del perro valorado Número de folio: 2 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 14 de enero del 2015 Centro Bob. Mixto. Macho. Por amor a Toby. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: positivo. Fotografía del perro valorado 31 Número de folio 3 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 20 de febrero del 2015 Centro Chiquito. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: positivo. Fotografía del perro valorado Número de folio 4 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 14 de enero del 2015 Centro Keto. Mixto. Macho. Por amor a Toby Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: positivo. Fotografía del perro valorado 32 Número de folio 5 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 23 de diciembre del 2014 Otay centenario Flaquito. Mixto. Macho. Sociedad humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: positivo. Fotografía del perro valorado Número de folio 6 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 30 de diciembre del 2014 Otay centenario Camila. Mixto. Hembra. Sociedad humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 33 Número de folio 7 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 17 de marzo del 2015 Otay centenario Chispita. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 8 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 6 de enero del 2015 Otay centenario Manchas. Mixto. Macho. Por amor a Toby. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 34 Número de folio 9 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 6 de enero del 2015 Playas de Tijuana Clos. Mixto. Macho. Por amor a Toby. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 10 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 30 de diciembre 2014 Playas de Tijuana Beto Mixto Macho Sociedad Humanitaria Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 35 Número de folio 11 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 18 febrero del 2015 Playas de Tijuana Maya. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 12 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 21 marzo 2015 Playas de Tijuana X. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 36 Número de folio 13 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 25 de febrero del 2015 La Mesa Negra. Mixto. Hembra. Sociedad humanitaria: Trombocitopenia. Ox – 19: negativo E. canis: negativo Fotografía del perro valorado Número de folio 14 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 18 febrero del 2015 La Mesa Elioth. Mixto. Macho. Sociedad humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 37 Número de folio 15 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización. Resultados de los estudios: 6 de enero del 2015 La Mesa Yeni. Mixto. Hembra. Por amor a Toby. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 16 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 10 de marzo del 2015 La Mesa Sensor. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 38 Número de folio 17 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 21 de marzo del 2015 San Antonio de los Buenos Teleke. Schnauzer. Macho. Por amor a Toby. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 18 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 25 febrero del 2015 San Antonio de los Buenos Tomasa. Mixto. Hembra. Sociedad humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado 39 Número de folio 19 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 30 de diciembre del 2014 San Antonio de los Buenos Ades. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 20 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 21 marzo del 2015 San Antonio de los Buenos Molly. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado 40 Número de folio 21 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 17 de marzo del 2015 Sánchez Taboada Chio. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 22 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 17 de marzo del 2015 Sánchez Taboada Colitas. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Ox- 19: negativo. Fotografía del perro valorado 41 Número de folio 23 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 12 febrero del 2015 Sánchez Taboada Puca. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 24 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 6 de enero del 2015 Sánchez Taboada Celia. Mixto. Hembra. Por amor a Toby. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado 42 Número de folio 25 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 20 de marzo del 2015 Cerro Colorado Loba. Mixto. Hembra. Por amor a Toby. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 26 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 10 de marzo del 2015 Cerro Colorado. Peque. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado 43 Número de folio 27 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 17 de marzo del 2015 Cerro Colorado Sofía. Mixto. Hembra. Sociedad humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 28 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 18 febrero del 2015 Cerro Colorado Chocolata. Mixto. Hembra. Por amor a Toby. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado 44 Número de folio 29 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 18 febrero del 2015 La Presa Angelito. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 30 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 18 de febrero del 2015 La Presa Toreta. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado 45 Número de folio 31 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: Fotografía del perro valorado 23 de diciembre del 2014 La Presa Julia. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. Número de folio 32 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 23 de diciembre del 2014 La Presa Blanquita. Mixto. Hembra. Sociedad Humanitaria. Ox- 19: negativo. Fotografía del perro valorado 46 Número de folio 33 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 4 de enero del 2015 La Presa Rural Capulín. Mixto. Macho. Por amor a Toby. Ox – 19: negativo. E. canis: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 34 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 14 de enero del 2015 La Presa Rural Negro. Mixto. Macho. Por amor a Toby. Ox – 19: negativo. Fotografía del perro valorado 47 Número de folio 35 Fecha: Delegación: Nombre: Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 23 de diciembre del 2014 La Presa Rural. Tigrito. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Trombocitopenia. Ox – 19: negativo. E. cania: negativo. Fotografía del perro valorado Número de folio 36 Fecha: Delegación: Nombre Raza: Sexo: Organización: Resultados de los estudios: 2 de mayo del 2015 La Presa Rural. Peluche. Mixto. Macho. Sociedad Humanitaria. Ox – 19: negativo. E. cania: positivo. Fotografía del perro valorado 48