bases tecnológicas de los microarrays de proteínas

BASES TECNOLÓGICAS DE LOS
MICROARRAYS DE PROTEÍNAS
CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A
DISTANCIA 2009-2010
ACTUALIZACIONES EN EL
LABORATORIO CLÍNICO
Nº 5
I.S.S.N.- 1988-7477
Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Maquetación: AEBM
Fecha de Distribución: Marzo de 2010
Bases Tecnológicas de los Microarrays de
Proteínas. Aplicaciones Clínicas
Dr. Antonio Suárez Sanz.- Doctor en Ciencias Biológicas.
Dr. José A. Suárez Redondo.- Ingeniero de Telecomunicación
Introducción
Los microarrays han emergido como una de las tecnologías más notables e
innovadoras entre las que se dispone actualmente para el análisis de alto rendimiento
de moléculas biológicas, ello se debe a que en su diseño aparecen reunidas diversas
características ventajosas, como la miniaturización, la uniformidad en el tratamiento
de las muestras o la posibilidad de automatización. En los últimos años se ha
conseguido la inmovilización estable, sobre soportes planos (tipo porta de
microscopía), de diversas biomoléculas como ácidos nucleicos (1), proteínas (2),
péptidos (3), hidratos de carbono (4) o moléculas de pequeño tamaño (5), lo que ha
supuesto un paso decisivo para el análisis de estos compuestos mediante arrays.
Los microarrays de proteínas han surgido teniendo como modelo los de ADN,
en estos la afinidad entre moléculas es la que se deriva de la complementariedad
entre cadenas de ácidos nucleicos, lo que le confiere carácter predecible a las
interacciones moleculares; otra de las ventajas que ofrece este tipo de plataforma es
la posibilidad de incrementar la masa de los ácidos nucleicos mediante PCR. Las
proteínas carecen de tales ventajas, no obstante los microarrays, diseñados
específicamente para ellas, aportan ventajas que no se pueden conseguir con los de
ADN, como: a) determinar la expresión proteica de forma directa, pues se ha
observado que la deducida a partir de los niveles de ARNm no es concordante con
ella; b) detectar la existencia de modificaciones postraduccionales de las proteínas,
que frecuentemente están relacionadas con procesos biológicos vitales para la célula,
como sucede con las fosforilaciones, o c) poder aplicarlos al análisis de plasma/suero,
que son muestras fáciles de obtener y ricas en proteínas y que, por el contrario,
tienen un bajo contenido de ácidos nucleicos.
Las características de las proteínas hacen que sea más complejo su análisis
pues: 1) suelen presentarse en las muestras biológicas en un abanico de
concentraciones muy amplio (rango dinámico elevado); 2) poseen características
fisicoquímicas muy variadas, de modo que es difícil optimizar las condiciones
experimentales de ensayo simultáneamente para todos los componentes de una
muestra; 3) el marcaje químico de las proteínas para su análisis pueden provocar
modificaciones que alteren la afinidad de los epítopos en las interacciones antígenoanticuerpo.
En un experimento con microarrays de proteínas se dan varias fases, (Fig. 1).
Inicialmente se depositan las denominadas moléculas de captura (ej. anticuerpos)
sobre un porta de microscopia, formando manchas circulares uniformes, de un
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diámetro que puede variar entre 50 y 750 µm en función del tipo de experimento,
dispuestas en filas y columnas mediante un dispositivo robotizado llamado arrayer.
Fig 1. Estructura y funcionamiento de un array de proteínas. Curr Opin Chem Biol, (2001), 6: 76-80
Las muestras conteniendo los analitos o moléculas diana se incuban después de
ponerlas en contacto con el microarray. Se eliminan por lavado las moléculas que no
han reaccionado, y posteriormente se permite que interaccionen con una mezcla de
anticuerpos de detección marcados con fluoróforos, que van a reconocer a las
moléculas diana capturadas uniéndose a ellas a través de epítopos diferentes. La
detección de la señal del complejo formado se realiza después de eliminar por lavado
los anticuerpos de detección que no han reaccionado. La imagen de la superficie del
microarray se obtiene por escaneado digital, él proceso consiste en barrer la superficie
del microarray con una emisión de luz láser mientras que un detector capta la luz
emitida por los fluoróforos, como respuesta a la excitación del láser y se traduce a
intensidad píxel. Finalmente se correlacionan las intensidades de la señal con las
cantidades de moléculas diana presentes en la muestra.
Estas plataformas permiten identificar y cuantificar las proteínas de una muestra
(obtención de perfiles de proteínas) con un rendimiento muy superior al de las
técnicas clásicas de inmunoensayo como los Western immunoblotting o los ELISA,
otras variantes de la técnica proporcionan información a cerca de varios aspectos
relacionados con las funciones proteicas tales como su expresión en estado nativo, la
existencia
de
interacciones
proteína-proteína
o
la
de
modificaciones
postraduccionales.
409
1 ELEMENTOS ESTRUCTURALES DE LOS MICROARRAYS
1.1 Moléculas de captura
La disponibilidad de un número elevado de moléculas de captura específicas, y
con una alta afinidad frente a sus respectivas moléculas diana es esencial para el
desarrollo de la técnica de microarrays de proteínas, ya que se fundamenta en la
afinidad entre ambos tipos moleculares.
Como moléculas de captura se pueden emplear otras estructuras diferentes de
las proteicas siempre que presenten en grado suficientemente elevado las
propiedades de especificidad y afinidad entre ligandos.
Las características funcionales y/o estructurales de las moléculas de captura
empleadas van a variar dependiendo de la naturaleza del estudio proteómico a que se
destine. Se diferencian varios grupos (Fig. 2):
Antígenos
Anticuerpos
Proteínas (interacciones específicas proteína-proteína)
Aptámeros
Enzimas
Receptores de membrana
Fig. 2. Tipos de moléculas de captura que pueden formar parte de los microarrays de
proteínas. Para participar en un análisis con microarrays, basado en interacciónes moleculares específicas, se pueden
inmovilizar diferentes tipos moleculares para que actúen como moléculas de captura con diversas funciones: a) interacción
antígeno-anticuerpo; b) actuar en un inmunoensayo con revelado tipo sándwich; c) una interacción específica proteína-proteína.
Se pueden utilizar moléculas de captura de naturaleza química diferente a la proteica, d) moléculas tipo aptámeros; e) substrato
enzimático: un substrato S se inmoviliza y se fosforila por la acción de una quinasa empleando ATP; f) moléculas de peso
molecular bajo en una interacción receptor-ligando. TRENDS Biotechnol, 2002, 20: 160-166.
410
1.1.1 Anticuerpos
Son moléculas de captura muy específicas y por ello herramientas muy valiosas
para construir microarrays con aplicaciones al diagnóstico. El poder disponer de ellas,
manteniendo sus características de especificidad y afinidad constantes
indefinidamente, ha sido posible gracias a la aplicación de tecnología de obtención de
anticuerpos monoclonales, pero con frecuencia el procedimiento es largo y laborioso
y, como consecuencia, caro. Para eludir estos inconvenientes se pueden aplicar otras
tecnologías alternativas de ingeniería genética para la obtención de anticuerpos
específicos y altamente afines, como la phage-antibody display que ha demostrado
ser una herramienta muy eficaz para este fin. La técnica (6) se fundamenta en la
preparación de fagos híbridos que expresan fragmentos de anticuerpos en la
superficie de su cápsida, y en posibilitar su selección en función de la afinidad frente a
un número muy elevado de antígenos (posibles moléculas diana) en el tiempo
relativamente corto de algunas semanas. Muchos de los anticuerpos así obtenidos
pueden alcanzar valores de constantes de afinidad (KD) del orden pM.
1.1.2 Aptámeros
Otra opción es la preparación un tipo de moléculas de captura alternativo,
conocidas como aptámeros. Se trata de oligonucleotidos cuya secuencia les confiere
capacidad virtual para reconocer cualquier molécula diana, con elevada afinidad y
especificidad.
La especificidad y afinidad de unión de estas moléculas con proteínas u otros
ligandos se optimiza seleccionando las secuencias de bases por ciclos de evolución in
vitro, siguiendo la técnica llamada systematic evolution of ligands by exponential
enrichment (SELEX) (7-8). Estas moléculas se diseñaron inicialmente como agentes
bloqueantes de proteínas participantes en diferentes estados patológicos,
posteriormente se comprobó que inmovilizados en una estructura de microarray
podían aplicarse al diagnóstico.
El término aptámero se ha aplicado también a péptidos obtenidos mediante
tecnología de mRNA display (9), presentan elevada afinidad por proteínas diana
específicas, de modo que se consiguen valores de constantes de afinidad de orden
nM, similares a las que presentan los complejos antígeno-anticuerpo monoclonales.
1.1.3 Affibodies
Existe un tipo de proteínas microbianas llamadas receptinas, relacionadas con
las interacciones huésped-parásito y con la virulencia del agente microbiano que las
produce, que ofrecen como característica común presentar especificidad de unión con
algunas proteínas de mamíferos. Los affibodies son moléculas de captura
seleccionadas a partir de librerías combinatoriales construidas a partir de la secuencia
del dominio receptor α-helice de la proteína A de Staphylococcus aureus que es una
receptiva (10). Las componentes de las librerías de affibodies pueden someterse a
procesos de maduración y multimerización para conseguir afinidades elevadas.
411
1.2 Tipos de soportes
La elección del soporte debe ser el primer paso a dar en el diseño de un
microarray de proteínas, ya que este componente va a condicionar diversos aspectos
de la técnica como el formato o el tipo de detección que se habrán de emplear. Con
respecto a las moléculas de captura se ha de conseguir que mantengan la
funcionalidad después de su unión al substrato y que este no interfiera en el acceso a
las moléculas diana.
Las propiedades de un soporte han de ser:
Su estabilidad química
Que proporcione una buena morfología de las manchas
Ausencia de uniones inespecíficas
Baja señal de fondo
Permitir la mayor relación superficie/volumen en las manchas
Compatibilidad con los sistemas de detección
Autofluorescencia baja
Como soportes se pueden emplear membranas, que ofrecen gran capacidad de
unión pero presentan problemas de autofluorescencia y uniones inespecíficas, otro
tipo frecuente son los portas de vidrio que presentan superficies muy lisas y una
fluorescencia reducida, pero poseen escasa capacidad de unión por lo que necesitan
una modificación previa de su superficie que facilite la unión de proteínas.
1.3 Fijación de las moléculas de captura
Las proteínas pueden inmovilizarse a través de interacciones no covalentes
con la superficie del soporte, ya sea de tipo hidrofóbico (nitrocelulosa, poliestireno) o
iónico (polilisina, aminosilano). Las uniones no covalentes de las moléculas de captura
pueden ser demasiado débiles para impedir su pérdida durante el análisis, por este
motivo la utilización de uniones covalentes tiende a generalizarse. La formación de los
enlaces se consigue al reaccionar las moléculas de captura con grupos funcionales de
diferente naturaleza presentes en la superficie del soporte (ej. aldehído, epoxi, esteres
activos) mediante su tratamiento químico previo. También se han empleado, para
inmovilizar las moléculas de captura, interacciones bimoleculares específicas del tipo
estreptavidina-biotina, o la formación de complejos estables entre las moléculas de
captura marcadas con ácido fenilborónico y la superficie del soporte modificada con
ácido salicilhidroxámico. Para favorecer la inmovilización de las proteínas de captura
es frecuente recurrir a moléculas adaptadoras, que suelen ser fundamentalmente
proteínas o poliaminoácidos. Una estructura más compleja que la anterior, está
formada por una molécula de afinidad anclada a la superficie del soporte, que a su
vez mantienen unida la proteína de captura a través de una segunda molécula
adaptadora (Fig. 3).
412
Fig. 3. Unión indirecta de una molécula de captura al soporte. El anticuerpo de captura se une al
soporte a través dos moléculas una de afinidad y otra adaptadora; mediante esta estructura se optimiza la interacción con la
molécula diana. Pharmacogenomics (2002), 3: 1-10.
1.4 Dispositivos para construir microarrays: arrayers
La ordenación de arrays de proteínas en la superficie de los soportes se
consigue mediante arrayers. Los aparatos que imprimen por contacto están dotados
de agujas que aplican las moléculas de captura sobre la superficie del soporte, como
lo hace el arrayer robotizado GMS 417 (Affymetrix) (Fig. 4). Hay otros tipos
alternativos de arrayers (capilares, ink-jet), que no realizan la aplicación por contacto,
sino que proyectan gotitas de la disolución de moléculas de captura, sobre la
superficie del soporte, pertenece a este tipo el arrayer TopSpot (HSG-IMIT). También
existen actualmente numerosas casas comerciales productoras de microarrays de
proteínas ya formados y preparados para el uso, con aplicaciones en el campo del
diagnostico o la investigación biomédica preferentemente (11).
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Fig. 4. Construcción de un array de proteínas de fase reversa. Se utiliza un arrayer de contacto
robotizado (GMS 417, Affymetrix, CA, USA). Se muestra en la imagen el array de configuración plana sobre porta de vidrio.
Inserción: el cabezal del arrayer con cuatro agujas imprimiendo manchas de 750 nm de diámetro, de lisados celulares
conteniendo proteínas sobre un porta de vidrio plano recubierto de nitrocelulosa. J Pathol. (2006), 208: 595-606.
1.5 Formatos de arrays de proteínas
1.5.1 Formato plano. Posiblemente sea el formato de microarrays de proteínas más
extendido (Fig. 1), en él las manchas que contienen las moléculas de captura se
disponen sobre superficies reactivas de un soporte de vidrio similar a un portaobjetos
de los empleados en microscopia. Existen variantes de este formato, cuyas
modificaciones tienen como objetivo principal disminuir las cantidades de muestra y
reactivos empleados por medio de la miniaturización (11).
1.5.2 Formato de arrays en suspensión o de microesferas (suspensión array
technology, SAT).
En este formato el análisis se realiza aplicando citometría de flujo. Se utilizan
micropartículas de polímeros codificadas ópticamente, (Fig. 5). Las manchas del
formato plano tiene en este, su equivalente en una subpoblación de partículas con
diferentes propiedades ópticas que porta diferentes moléculas de captura. Se puede
aplicar al análisis de otras biomoléculas, además de las proteínas (12-13). Este
sistema presenta la ventaja de que cada población de microesferas puede
cuantificarse de forma optimizada al separarse de las demás, y el que se pueda
adecuar el número de poblaciones de microesferas y sus proporciones a las
características de la muestra a analizar. El procedimiento, que se ha adaptado al
414
análisis rápido de series de muestras, se perfila como una plataforma de aplicación
general en la investigación y la clínica.
Fig. 5. Formato de microarrays basado en la utilización de microesferas y separación por
citometría de flujo. a) se dispone de diferentes poblaciones de microesferas codificadas por la proporción de fluoróforos
rojo y naranja que forma parte de su composición; b) cada tipo de molécula de captura se inmoviliza sobre un tipo de
microesferas diferente y se mezclan en proporciones adecuadas; c) las moléculas diana se ponen en contacto con sus
anticuerpos de detección, que portan un fluoróforo, para que interaccionen; d) se unen las microesferas portando las moléculas
de captura con los complejos anteriores y se produce la formación de inmunocomplejos tipo sándwich unidos a sus
correspondientes microesferas; e) los análisis cuantitativo y cualitativo se realizan en un citómetro de flujo dotado de dos láseres
que puede medir en cada esfera la cantidad de molécula diana captada a través de la fluorescencia emitida por el complejo tipo
sándwich y separarla e identificarla a través del código de fluoróforos rojo y naranja de la microesfera y la molécula de captura
que porta. Curr Opin Chem Biol. (2001), 6: 76-80.
2 DETECCIÓN DE LA SEÑAL EN MICROARRAYS DE PROTEÍNAS
Una vez que han interaccionado las moléculas diana con las de captura, se ha
de cuantificar el complejo formado, para ello se etiquetan previamente las moléculas
diana o los anticuerpos de detección con marcadores de diferentes propiedades
fisicoquímicas que condicionan las técnicas de detección a emplear.
2.1 Tipos de detección
2.1.1 Detección cromogénica: Se emplea para la detección de substancias
coloreadas que se generan por la acción de determinadas enzimas sobre substratos
denominados cromógenos. La detección cromogénica produce señales permanentes y
415
fáciles de visualizar para su análisis. Los cromógenos empleados con mayor frecuencia
en microarrays son substratos de la fosfatasa alcalina (p-Nitrofenilfosfato), y de
peroxidasa (ABTS: ácido 2,2’-azo-bis,3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico; OPD: ofenilendiamina y TMB: 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina).
2.1.2 Detección de quimioluminiscencia: La emisión de luz se produce por la
acción de la luciferasa sobre la D-luciferina. Es una técnica muy difundida por su
sensibilidad y por crear un registro permanente de la señal.
2.1.3 Detección de fluorescencia: Se utiliza para los fluoróforos que son moléculas
que absorben fotones de una fuente externa de luz, generalmente un láser
monocromático, lo que provoca excitación de los electrones de la molécula y una
posterior emisión de luz de una longitud de onda mayor que el incidente. Esta técnica
presenta incompatibilidad con los soportes que presentan autoflorescencia, ya que es
difícil discriminar la señal producida por la muestra y la debida al ruido de fondo. Son
fluoróforos frecuentemente empleados fluoresceína, rodamina, ficobiliproteínas,
acridinas y especialmente las cianinas ( Cy2, Cy3, Cy5).
Como detectores se emplean frecuentemente las cámaras denominadas charge
coupled device (CCD) o escáneres láser con óptica confocal de detección.
2.2 Aspectos teóricos de la detección de la señal. Miniaturización de los
arrays
La elevada sensibilidad, característica de esta técnica, se basa en la
miniaturización del procedimiento (14), lo que se consigue reuniendo las moléculas de
captura en un área muy pequeña (mancha), de manera que al formarse el complejo
molécula de captura-molécula diana, el número absoluto de moléculas aunque sea
reducido estará concentrado, y, al mismo tiempo, la concentración de moléculas diana
de la muestra no cambia prácticamente, incluso cuando sea baja; estas condiciones
se cumplen cuando el número total de moléculas de captura en la mancha es
< 0.1/KD (KD: constante de afinidad). Cuando se dan estas condiciones, el número de
moléculas diana capturadas guarda relación lineal con su concentración en el medio.
La sensibilidad que se consigue es alta porque: 1) la unión de ligandos se produce a
la concentración mayor posible de moléculas diana y 2) el complejo molécula de
captura-molécula diana se concentra en un área muy pequeña dando lugar a una
señal de gran densidad. (Fig. 6). Otra consecuencia de la reducción del tamaño de las
manchas, es que las propiedades del complejo formado pueden conocerse empleando
volúmenes de muestra pequeños, y por ello de una menor necesidad de muestra
biológica, aspecto esencial en el tratamiento de determinados grupos de pacientes.
416
Fig. 6. Señal y densidad de señal en las manchas de los microarrays.
La densidad de señal (log
(señal/área); escala logarítmica) (barras rojas) y la señal (intensidad total; escala logarítmica) (barras blancas) emitidas por las
moléculas diana captadas (unidas a un fluoróforo) en las manchas se han representado frente a las diferentes concentraciones
de moléculas de captura. Las moléculas de captura inmovilizadas tienen la misma densidad de superficie en todas las manchas.
La señal total incrementa con el número de moléculas de captura al incrementar la superficie de la mancha. Cuando la mayoría
de las moléculas diana posibles han sido secuestradas de la solución la señal alcanza su máximo. Por el contrario, la densidad de
señal (señal/área) incrementa al disminuir la cantidad de moléculas de captura (por disminución del tamaño de la mancha),
alcanzando un valor prácticamente constante mientras es < 0.1/K (siendo K la constante de asociación). En estas condiciones
ambientales de las moléculas diana, su concentración en la solución se modifica mínimamente por unión a las moléculas de
captura de la mancha. TRENDS Biotechnol. (2002), 20: 160-166.
2.3 Amplificación de la señal
Existen factores que pueden reducir las posibilidades de aplicación de los
microarrays de anticuerpos al análisis proteómico: a) la disponibilidad limitada de
anticuerpos (moléculas de captura) con afinidad y especificidad elevadas; b) la
variabilidad de la afinidad antígeno-anticuerpo (Ag-Ab) para los diferentes
componentes de un microarray y c) el elevado rango dinámico (concentración del
analito mayoritario/concentración del analito más diluido) de las muestras biológicas,
especialmente del plasma/suero. Los resultados de un análisis múltiple han de ser
independientes de la variabilidad que puede derivarse de estos factores (15). El
recurso más generalizado para conseguir que en un análisis con microarrays la señal
producida por cada complejo Ag-Ab formado, entre en el rango de detección y
cuantificación consiste en poner en el microarray una serie gradual de
concentraciones de molécula de captura que incremente la probabilidad de que
alguna concentración esté dentro del rango de medida (measurable concentration
range: MCR)
417
Pero existen otros medios para eliminar estas limitaciones, de forma total o parcial,
mediante:
a) Técnicas de amplificación de la señal.
b) Sistemas competitivos de detección.
2.4. Técnicas de amplificación
La amplificación tiene como consecuencia ampliar el MCR hacia
concentraciones menores de proteína de la curva de unión antígeno-anticuerpo (Fig.
7), la amplificación de la señal es, pues, una ventaja, pero se ha de tener en cuenta
que si es necesario elevar el número de pasos de la técnica, se incrementará el
tiempo de realización y las posibilidades de error.
Fig. 7. Curva de unión antígeno-anticuerpo. La señal emitida por el complejo antígeno-anticuerpo formado se
estabiliza a partir de la cantidad de proteína adicionada con la que se ha rebasado la capacidad de unión del anticuerpo y ya no
refleja la cantidad de proteína añadida; por otro lado las concentraciones bajas no pueden detectarse por debajo del umbral de
sensibilidad de detección, de modo que el rango de concentraciones de proteína en que es posible detectarla y medirla es
limitado. Proteomics. (2003), 4: 3717-3726.
2.4.1 Sistema de amplificación tipo sándwich
Se trata de una técnica muy generalizada, característica del método ELISA (Fig.
8). Se diferencian varias fases en el proceso de aplicación: a) formación del complejo
Ag-Ab por unión de las molécula diana (Ag) a las de captura (Ab) inmovilizadas; b)
un anticuerpo de detección, que lleva conjugada una molécula de biotina, se une por
un segundo epítopo a la molécula diana, creando así un sándwich de anticuerpos; c)
se procede a la visualización del complejo utilizando estreptavidina conjugada con una
molécula fluorescente Cy3 o horse radish peroxidase (HRP) que puede actuar sobre
múltiples moléculas de cromógeno.
418
Fig. 8. Protocolo general del método sándwich de ELISA. Se ha de disponer de dos anticuerpos diferentes
frente a la misma molécula diana, uno actuará como molécula de captura que se ha de fijar al pocillo de reacción y el otro como
anticuerpo de detección, que se ha de marcar. La muestra conteniendo la molécula diana se adiciona al pocillo y se incuba; las
moléculas que no han reaccionado se eliminan mediante lavados; al complejo formado se adiciona el anticuerpo de detección
que puede tener unido un fluoróforo y se puede leer directamente la señal emitida o bien una enzima que incrementará la señal
al actuar sobre un sustrato que genere un producto coloreado. http://64.202.120.86/upload/image/articles/2006/biopen/biopenelisa-schematic.jpg
El procedimiento posee ventajas notables: 1) se trata de una técnica bien
conocida y aplicada frecuentemente en protocolos de revelado; 2) las muestras no se
han de derivatizar, lo que evita el enmascaramiento de epítopos; 3) los analitos de
baja concentración se pueden detectar con varios ciclos de amplificación; 4) el uso de
dos anticuerpos incrementa la especificidad de la prueba. También presenta algunos
inconvenientes; a) son necesarios dos anticuerpos para cada proteína ensayada (de
captura y detección); b) el anticuerpo de detección se ha de conjugar con la biotina y
en este paso se puede afectar su afinidad por el antígeno.
2.4.2 Amplificación por rolling circle amplification (RCA)
Es un método que incorpora a la detección de proteínas las posibilidades de
amplificación de la PCR (Fig. 9) (16), para ello, se une covalentemente al anticuerpo
de detección un oligonucleotido, en presencia de ADN circular y de un sistema PCR
que produce un ADNc formado por numerosas copias de la secuencia del ADN
circular, que permanece unido al anticuerpo.
Posteriormente se hace interaccionar con un oligonucleotido decorador
complementario que porta un fluoróforo.
Con esta técnica se consiguen amplificaciones de la señal varios órdenes de magnitud
mayores que la proporcionada por la amplificación tipo sándwich.
419
Fig. 9. Esquema de la amplificación de la señal por circulo rodante aplicada a microarrays.
Se compone de varios elementos que actúan de forma coordinada; a) anticuerpos de captura inmovilizados sobre el soporte del
microarray; b) un anticuerpo de detección biotinilado; c) unión de un anticuerpo antibiotina que porta un oligonucleotido primer
complementado con polinucleotido cíclico; d) replicación del polinucleotido circular empleando PCR, lo que dará ADNc de una sola
hebra que se híbrida con un oligonucleotido decorador. J Biomed Biotechnol. (2003), 5: 299-307.
2.2.3 Nanocristales (Quantum dots: Qdots)
No se trata de una técnica de amplificación propiamente dicha, sino de
nanoestructuras aplicables a sistemas de amplificación como sondas fluorescentes,
que poseen características que aventajan en gran medida a las de los fluoróforos
clásicos. En su estructura (Fig. 10) existe un núcleo formado por algunos centenares
de átomos de semiconductores: Cd+Se, rodeado por una corteza del también
semiconductor sulfáto de zinc y finalmente una cubierta de moléculas anfífilas que
relacionan la partícula con el medio biológico.
Su tamaño total se acerca al de las proteínas (10-20 nm), y presenta como
propiedades, a) tener una intensidad de fluorescencia varias veces mayor que la de
los fluoróforos orgánicos; b) una elevada fotoestabilidad (la fluorescencia persiste
durante mucho tiempo) y c) tener como propiedad la “tuneability”, es decir que se
puede modificar la longitud de onda de emisión en respuesta a una misma longitud de
onda, modificando el tamaño de las nanopartículas.
Estas características hacen que los nanocristales sean idóneos para marcar
moléculas de proteínas, células y tejidos.
420
Fig. 10. Estructura de un nanocristal Qdot. En el esquema se representan los diferentes elementos
estructurales a escala aproximada de tamaños. Qdot® nanocrystal technology. Invitrogen. www.invitrogen.com
2.5 Sistemas de detección competitivos
El carácter competitivo de los procedimientos de detección elimina las diferencias
derivadas de la heterogeneidad de los anticuerpos, que es una de las limitaciones
mayores de los ensayos comparativos basados en la afinidad. Este tipo de análisis no
mide concentraciones de proteínas, sino que proporciona una medida relativa de la
abundancia de cada proteína en las muestras comparadas.
2.5.1 Detección de un marcaje doble
Los anticuerpos, inmovilizados por unión covalente, se usan para capturar los
antígenos marcados con un fluoróforo. Las dos muestras a comparar se marcan con
fluoróforos diferentes y compiten por unirse a los mismos anticuerpos (Fig. 11). Esta
técnica presenta algunos inconvenientes: a) la reacción con los marcadores de
fluorescencia, a través de los grupos laterales de las proteínas, puede afectar su
afinidad por la molécula de captura; b) al ser distintos los fluoróforos que reaccionan
con cada muestra, pueden presentar diferencias en el rendimiento de la reacción y
dar lugar a resultados sesgados; c) se marcan todas las proteínas de la muestra y se
genera un fondo inespecífico.
Una forma de eliminar los errores derivados de las diferencias de reactividad de
los fluoróforos se basa en la repetición del marcaje intercambiando los marcadores
destinados a cada muestra.
2.5.2 Detección de un solo color y desplazamiento competitivo
Para aplicar este procedimiento se necesita una muestra de referencia (R),
marcada con un fluoróforo, que puede tener una composición idéntica a las
experimentales o puede ser una mezcla de proteínas, péptidos, aptámeros, polímeros
sin actividad biológica, etc, siempre que estos componentes presenten afinidad por los
421
anticuerpos fijos y puedan ser desplazados por las proteínas presentes en las
muestras experimentales que no están marcadas. Se ha de hacer un ensayo de
desplazamiento para cada muestra.
Fig. 11. Perfil cuantitativo de proteínas usando microarrays. (A) Detección de dos colores aplicada a
microarrays de anticuerpos. Para compensar las diferencias que han podido producirse al marcar cada muestra con un fluoróforo
diferente, cada una de las dos muestras a comparar se derivatiza por separado con cada fluoróforo (en gris y negro). Son pues
necesarias cuatro reacciones de derivatización y dos ensayos de unión para comparar las dos muestras experimentales. (B)
Protocolo de desplazamiento competitivo usando un único color. Se requiere una única muestra de referencia marcada, las
muestras experimentales no se marcan. La muestra de referencia marcada puede ser idéntica a las experimentales o solamente
similar siempre que muestren afinidad por los anticuerpos,(puede ser una mezcla de protínas, aptámeros, polímeros sin función
biológica etc) y puedan ser desplazados por las proteínas presentes en la muestra experimental. En el ensayo se comparan las
posibilidades de desplazamiento de las muestras experimentales no marcadas frente a los anticuerpos. Proteomics. (2003), 4:
3717-3726.
Los ensayos permiten comparar las respectivas capacidades de desplazamiento de las
muestras en su interacción con los anticuerpos (Fig. 11). Este método presenta
ventajas notables; a) al no ser necesaria la derivatización de las muestras, se eliminan
las alteraciones de afinidad de los antígenos y el background provocado por el
marcaje; b) el carácter comparativo de la técnica reduce las exigencias sobre
especificidad y afinidad de los anticuerpos de captura.
422
2.6 Escáneres de microarrays
Existen una amplia gama de escáneres láser para microarrays como ScanArrayTM
GM de Perkin-Elmer, DNA Microarray Scanner from Agilent Technologies. Los de la
casa Tecan y GenePixR ofrecen modelos aplicables al escaneado de microarrays de
proteínas.
3 TIPOS DE MICROARRAYS APLICADOS AL ANÁLISIS PROTEÓMICO
Las características de las moléculas de captura inmovilizadas permiten clasificar
los arrays de proteínas en diferentes grupos (17), siendo los más usuales:
Microarrays de proteínas, también llamados de anticuerpos o de fase directa
forward phase arrays (FPA).
De fase inversa o reverse phase arrays (RPA).
De tejidos o tissue microarrays (TMA).
3.1 Microarrays de proteínas o de anticuerpos (forward phase arrays: FPAs)
Las moléculas de captura son fundamentalmente proteínas con función de
anticuerpos, de ahí su nombre, pero también pueden serlo otro tipo de moléculas
como aptámeros o affibodies.
Las moléculas de captura se fijan por uniones no covalentes o covalentes sobre
diferentes tipos de superficies tales como vidrio modificado o membranas (Fig. 12).
Para la detección y cuantificación de este tipo de microarrays se suelen emplear
alguna de las siguientes estratégias: a) ensayos tipo sándwich; b) marcaje previo de
las moléculas diana; c) el sistema de doble marcaje y d) diferentes sistemas de
amplificación en función de la cuantía de la muestra.
La información que aporta el análisis con este tipo de microarrays permite
identificar y obtener las proporciones relativas de un número elevado de proteínas
pertenecientes a una misma muestra, es lo que se conoce como búsqueda de
biomarcadores, procedimiento de aplicación frecuente en la investigación sobre el
cáncer. También se puede aplicar al estudio de modificaciones postraduccionales; por
ejemplo para conocer el grado de fosforilación de la muestra, en este caso realizando
un revelado tipo sándwich se pueden seleccionar los anticuerpos de detección de
modo que solo interaccionen con proteínas fosforiladas, aportando así información
exclusiva sobre el fosfoproteóma. Otra aplicación de especial interés la tienen en los
análisis de citoquinas, cuyas interrelaciones juegan un papel relevante en el desarrollo
de numerosas enfermedades autoinmunes (18), y en los que las bajas
concentraciones de estos compuestos hacen necesario aplicar los sistemas de
amplificación más eficaces para su detección.
Al tratarse de una técnica de alto rendimiento, su utilidad no se deriva
meramente de la información aportada por la suma de datos obtenidos de los
biomarcadores investigados, sino que además aporta el conocimiento de las
interrelaciones existentes entre ellos, es decir que el conjunto de datos obtenidos
simultáneamente aporta más información que la suma de estos datos obtenidos por
separado.
423
La construcción de este tipo de microarrays necesita disponer de anticuerpos
con suficiente especificidad y afinidad, y cuando su revelado se hace por un sistema
tipo sándwich se ha de disponer de dos por cada componente de la muestra que se
analice. También se ha de tener en cuenta que la unión de marcadores a las
moléculas de proteína que han de interaccionar en el proceso de revelado (dianas o
anticuerpos de revelado) puede modificar su afinidad y que el marcaje de las
proteínas, en muestras con un rango lineal de concentraciones elevado, como ocurre
en el suero/plasma, redunda en el incremento de fondo en el revelado.
3.2 Microarrays de Fase Inversa (reverse phase arrays: RPAs) o de Lisados
de Tejidos
En este tipo de array son las muestras las que se inmovilizan, posteriormente se
hacen interaccionar con anticuerpos específicos de los componentes de interés de la
muestra, disueltos (Fig. 12).
Fig. 12. Clases de microarrays de proteínas.
En los microarrays de fase directa se inmoviliza una molécula de
captura, frecuentemente un anticuerpo, diseñada para captar proteínas específicas (moléculas diana) que forman parte de una
muestra de naturaleza proteica. Las moléculas diana se detectan generando una señal, mediante un sistema de revelado tipo
sándwich o por marcaje directo. En los microarrays de fase reversa se inmovilizan, sobre el soporte, las proteínas presentes en
una muestra, frecuentemente un lisado de células o tejidos. Un anticuerpo en solución, específico para una proteína fijada, se
aplica al microarray. Los anticuerpos fijados se detectan por marcaje y amplificación de la señal. Moll Cell Proteomics.
(2005), 4: 346-355.
424
Frecuentemente las muestras son lisados de tejidos o celulares que se imprimen
directamente sobre la superficie del soporte mediante arrayer.
La superficie puede corresponder a membranas de nitrocelulosa sobre soporte
de vidrio. La nitrocelulosa tiene una capacidad elevada de unión de proteínas a través
de interacciones que no alteran la estructura de estas, y el fondo fluorescente que
genera es relativamente bajo y compatible con la detección fluorimétrica. Las
manchas se suelen disponer en series de dilución creciente para facilitar su
cuantificación precisa (Fig. 13).
Los RPAs se caracterizan por que a) cada mancha contiene el proteoma
completo de la muestra de que procede; b) los microarrays están formados por
numerosas muestras diferentes; c) es necesario utilizar un porta para cada proteína
que se quiera analizar.
En el proceso de detección y cuantificación es esencial que se utilicen técnicas
de amplificación, pues los componentes de las muestras experimentales pueden
presentar rangos dinámicos elevados.
Fig. 13. Array de fase reversa. a) El array está impreso sobre un porta de vidrio cubierto de acetato de celulosa de
un tamaño similar a los empleados en histopatologia clínica. Se ha teñido de forma automatizada empleando un sistema de
amplificación de la señal por acción de una enzima unida por biotina. b) Mancha de 750 µm de diámetro. c) Manchas
pertenecientes a un mismo lisado, impresas por duplicado, formando una curva de dilución desde la original del lisado hasta 1:16
a la derecha. d) El array porta cuatro controles, entre ellos una mezcla de todas las muestras en estudio, y un lisado de línea
celular, con objeto de que permitan correlacionar todos los arrays utilizados en el estudio. J Pathol. (2006), 208: 595-606.
425
Para eludir la interferencia de la autoflorescencia de los soporte de nitrocelulosa, se
ha descrito el uso de nanocristales quantum dots (Qdot) como el Qdot 655 Sav
conjugado con estreptavidina que comparado con las técnicas clásicas ha
incrementado el rango dinámico de concentración de las proteínas sobre las que
puede actuar (19), mostrando sensibilidad por debajo de 50 fg/µl, y con una
reproducibilidad intra- e interarray que se manifiesta como valores de CV<10%.
Este tipo de microarrays presenta ventajas notables: 1) el análisis simultáneo de
muchas muestras incrementa el rendimiento y facilita la comparación cuantitativa
entre ellas. 2) las muestras inmovilizadas no se han de derivatizar para incorporarles
marcadores, evitando así su posible desnaturalización; 3) al ser una técnica robusta y
al mismo tiempo sensible, se puede utilizar en combinación con técnicas de
aislamiento celular del tipo laser capture microdissection (LCM), pudiendo obtenerse
información a partir de muestras tan reducidas como las formadas solo por 10 células.
La aplicación de este tipo de microarrays está especialmente indicada para el
estudio de rutas de señalización (20), por ejemplo para la obtención del perfiles de
fosforilación de proteínas de señalización celular, esta aplicación se ha visto favorecida
por la obtención de anticuerpos frente a proteínas fosforiladas muy específicos y con
elevada afinidad, y por la posibilidad de analizar muestras reducidas procedentes de
biopsias o cultivos celulares. También tienen múltiples aplicaciones en Inmunología,
pues en los estados autoinmunes, los circuitos de transmisión de señales se
encuentran frecuentemente alterados y ello conduce a respuestas inadecuadas. Otro
campo de aplicación es el dirigido a explorar la progresión tumoral (21).
Existen también algunos problemas técnicos de cuya resolución depende
obtener la máxima eficacia en el empleo de este tipo de arrays: a) disponer de
anticuerpos con especificidad y afinidad altas; b) conseguir una estandarización
experimental, que permita comparar los diferentes ensayos dentro de un mismo
experimento, de distintos experimentos entre si, y los realizados en centros
diferentes, mediante la utilización de patrones internos y controles de referencia.
3.3 Microarrays de tejidos (TMAs).
Los microarrays de tejidos son estructuras ordenadas de cientos de cortes de
tejidos procedentes de bloques de inclusión. Se diferencian por ello de los anteriores,
en que las moléculas de captura fijas a la superficie del soporte han sido substituidas
por cortes histológicos (22).
Este método permite analizar simultáneamente numerosas muestras de tejido
mediante sistemas de detección de proteínas, de forma similar a como ocurre con los
arrays de fase inversa.
La construcción de los TMAs (Fig 14) se basa en la obtención de cilindros de
tejido de 600 µm de diámetro a partir de piezas de tejido previamente fijadas, las
denominadas formalin-fixated paraffin-embedded (FFPE). Los cilindros se incluyen
ordenadamente en un bloque de parafina del que se hacen cortes histológicos para su
análisis, la posterior tinción se hace mediante técnica inmunohistoquímica. La
preparación de un TMA aparece en la Fig. 14.
426
Fig. 14. Manufactura de un TMA. a) Se extraen núcleos cilíndricos de tejido (normalmente de 0.6 mm de diámetro)
de una pieza parafinada (donadora) empleando un microarrayer de tejido; b) Se introducen en huecos hechos previamente en un
bloque de parafina vacio (receptor); c) Se pueden usar microtomos convencionales para cortar secciones de microarrays de
tejidos; d) Se puede usar una película adhesiva facilita la transferencia de secciones de microarrays de tejido TMA al porta y evita
la pérdida de tejidos, incrementado así el número de secciones que pueden obtenerse de cada bloque de TMA; e) Estructura de
una de las secciones obtenidas teñida con hematoxilina-eosina. Nat Rev Drug Discov. (2003), 2: 962-972.
Este tipo de microarrays presenta como características más destacadas que:
a) la información molecular se obtiene in situ, dentro de la arquitectura del tejido y la
morfología celular; b) la información obtenida de las preparaciones, está sujeta a la
estimación del observador, de modo que los resultados que son de tipo cualitativo o
semicuantitativo.
Estos arrays presentan ventajas claras frente a las técnicas
inmunohistoquímicas clásicas: a) menos tiempo de preparación y de costo por
muestra; b) las condiciones experimentales son las mismas para todas las muestras,
lo que facilita la comparación y mejora la estadística de los resultados; c) reducen la
cantidad de muestra utilizada, permitiendo obtener un mayor rendimiento de las
piezas de tejido disponibles; d) se pueden utilizar las muestras FFPE existentes en
bancos de tumores. A pesar de estas ventajas la plataforma presenta algunas
limitaciones: 1) la dudosa representatividad de una muestra de 600 µm de diámetro
procedente de un tumor potencialmente heterogéneo, especialmente si se compara
con la obtenida a partir de un corte convencional de mayor extensión; 2) la
subjetividad y falta de reproducibilidad de la valoración visual; 3) posible variabilidad
de los resultados debida a cambios en la especificidad y afinidad de los anticuerpos
utilizados en los métodos de IHC y a la falta de estandarización de los protocolos.
Es un formato muy utilizado en Oncología con diversas aplicaciones: 1) el
seguimiento de la progresión de tumores; 2) la obtención de perfiles proteicos
asociados a fenotipos tumorales; 3) la detección de marcadores tumorales para
fundamentar el diagnóstico.
427
4 ANALISIS COMPUTACIONAL DE LOS DATOS DE MICROARRAYS
El desarrollo de las técnicas analíticas de alto rendimiento como los microarrays,
ha hecho necesaria la incorporación de tratamientos bioinformáticos avanzados para
manejar los abundantes datos que generan. En términos generales se puede
considerar que este tratamiento informático/estadístico se aplica en dos fases del
proceso completo de análisis de la información procedente de los microarrays:
i)
En primer lugar se ha de realizar un preprocesado de la información obtenida en
la lectura de los microarrays para eliminar las alteraciones y sesgos derivados de
defectos de la tecnología, mediante operaciones como la corrección de background, la
normalización de la intensidad, o la normalización espacial.
ii) Posteriormente se han de obtener los resultados evaluando la significación
estadística y biomédica de los datos normalizados, con la ayuda de algoritmos
matemáticos.
4.1 TRATAMIENTO PREVIO DE LOS DATOS. NORMALIZACIÓN
4.1.2 Obtención informatizada de los datos
Los microarrays de anticuerpos presentan una estructura y un
funcionamiento muy similares a los de DNA, pues estos han servido como modelo
para su desarrollo. Dada la similitud de ambas plataformas, se puede utilizar los
mismos escáneres y software para ambas, también los ficheros de datos sin tratar que
proporcionan son técnicamente muy similares, esto supone una ventaja pues algunos
protocolos de computación y los interfaces desarrollados para los microarrays de DNA
se transfieren frecuentemente al análisis de microarrays de anticuerpos.
El resultado del escaneado de un microarray que ha interaccionado con una
muestra marcada con un único fluoróforo, es una imagen digital monocromática
(típicamente guardada como un fichero TIFF) de la superficie del microarray. Los
puntos más intensos de la imagen corresponden a manchas en las que se ha
producido hibridación de ácidos nucléicos. Si dos muestras diferentes se han marcado
con dos fluoróforos distintos, y se han hibridado con el mismo microarray, se
obtendrán como resultado del escaneado dos imágenes digitales, una para cada
longitud de onda de lectura.
Las imágenes de los microarrays generadas por un escaneado láser deben
procesarse con un software de análisis de imagen. En primer lugar para identificar las
manchas dentro de la imagen, es decir distinguir entre los píxeles que forman parte
de manchas y los que pertenecen a zonas de fondo; este proceso recibe el nombre de
segmentación. Después, se ha de realizar la alineación de gradillas, que es el
proceso que permite identificar las manchas. El software para la alineación de
gradillas suele venir incluido al adquirir el equipo, aunque los hay de libre disposición
como el TIGR Spotfinder (23) o el ScanAlyze (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm).
Para la mayoría de los arrays, la gradilla ha de ser definida por el usuario, bien
manualmente o semi-manualmente, mientras que para los microarrays de alta
densidad, como los Affymetrix, la alineación de la imagen del microarray con la
gradilla se hace automáticamente a través del software. Esta automatización se hace
posible reservando algunas manchas del microarray exclusivamente para la alineación
de gradillas.
428
Después de alinear la gradilla el software del análisis de imagen proporciona
cierto número de datos estadísticos para cada mancha identificada, que suelen incluir
la media y la mediana de la intensidad en pixeles de cada mancha, su desviación
estándar, y a veces también otro tipo de información, como las relaciones de
intensidad cuando se trata de un experimento con dos canales (dos longitudes de
onda). El área de cada mancha (en número de píxeles) también se suministra con
frecuencia. Es importante que si el software considera una mancha determinada
aberrante -por ejemplo que es de forma irregular o que su intensidad es inferior que
la del fondo de su entorno- la mancha pueda ser considerada como irregular. Las
manchas irregulares normalmente se excluyen de los análisis estadísticos posteriores.
El resultado final es un fichero de texto plano que contiene los datos sin tratar de
cada mancha dispuestos en una fila. Este formato es muy accesible para el posterior
análisis de arrays importándolo al paquete de software del tipo ExpressYourself (24)
o MIDAS (23) o desde luego en el propio flujo de análisis de microarrays.
4.1.3 Normalización de los datos de los microarrays.
Una vez que se han obtenido los datos, el paso siguiente es su normalización,
dado que a través de los procesos técnicos de un experimento de microarrays pueden
producirse sesgos y artefactos que influyan en el valor de los datos que se obtienen,
de modo que en un experimento de doble marcaje los valores de fluorescencia
pueden estar influidos por una gran diferencia de entre la cuantía de las muestras,
pueden influir también las diferencias de reactividad de los fluoróforos empleados (ej
Cy3 y Cy5), o incluso la localización de una mancha dentro del array.
Necesidad de la Normalización
La mayoría de los estudios con microarrays examinan la relación entre dos
muestras biológicas comparando sus niveles relativos de expresión. La idea por la que
se rigen los experimentos con dos colores se basa en que dos muestras, una marcada
con Cy3 y la otra con Cy5, se hibridan simultáneamente en un único microarray, sus
abundancias relativas se obtienen a partir de las relaciones de fluorescencia en cada
una de las manchas del microarray.
Para una mancha dada i, la concentración relativa entre las dos muestras λi
se expresa como el logaritmo de la relación de las fluorescencias:
λi = log ( Ri / Gi )
(1)
donde Ri y Gi son las intensidades (medias o medianas de las intensidades en
píxeles) cuando se escanean con láseres rojo y verde respectivamente. Un valor de
λi = 0 indica que Ri y Gi son iguales. En una serie de valores expresados así los
próximos a 0 indican la igualdad de contenido de ese componente de las muestras,
mientras que los valores que se desvían de 0 hacia arriba o hacia abajo son
indicadores de desigualdad.
Una relación logarítmica de este tipo entre dos muestras para una proteína es ya
una técnica de normalización. La manufactura de los microarrays no está libre de
errores. Una mancha puede imprimirse con un área reducida en un microarray y en
el siguiente de forma correcta. Si se emplea este tipo de normalización ambas
manchas darán valores relativos comparables independientemente de su tamaño. Esta
clase de normalización no ha lugar en los experimentos con un solo fluoróforo.
429
Existen algunas estrategias comunes de normalización entre las que se
encuentran
Corrección de fondos
Normalización por intensidad total
Normalización por Gene Set
Normalización mediante controles internos
Corrección de desviaciones debidas a la posición en el array
Corrección de Fondos
En muchos tipos de microarrays, se proporciona una medida del fondo local
además del valor total de la mancha. Esta medida es, como norma general, la media
o mediana de los pixeles correspondientes a las zonas periféricas de las manchas. Se
asume que cualquier medida de la intensidad de una mancha también lleva
incorporada la intensidad del fondo correspondiente. La fluorescencia de fondo se
debe, en general, a la fluorescencia del vidrio y a moléculas libres del marcador
fluorescente. La intensidad de fondo no tiene un significado biológico, de modo que
han de eliminarse los valores de fluorescencia a él debidos antes de procesar los
datos. La forma más sencilla es restar a la lectura de cada canal la media (o mediana)
del fondo a la correspondiente longitud de onda antes de calcular la relación.
^
λi = log( Ri − ρ i / Gi − γ i )
(2)
De forma natural en esta ecuación se asume que ρ i < Ri y que γ i < Gi , dado que
cualquier mancha que no cumpla estas condiciones se considerará una mancha
irregular y se excluye del cálculo, pues con la interpretación del fondo que hemos
comentado, carece de sentido que éste tenga un valor mayor que el asociado a una
mancha.
Normalización por intensidad total
Después de la substracción del fondo, se deben normalizar las intensidades de
las muestras de modo que la distribución de intensidades tenga propiedades
deseables. Una propiedad deseable en experimentos de dos muestras es tener una
distribución de logaritmos centrados en torno a 0. Esto es razonable ya que en la
mayoría de los experimentos no se espera que este centrado se produzca en torno a
ningún otro valor.
En un experimento de expresión diferencial, los microarrays hibridarían un
número similar de moléculas marcadas procedentes de cada muestra, de modo que
las señales de hibridación totales fuese la misma para ambos canales. Asumiendo este
supuesto, se puede calcular un factor de escalado Ctotal, que pueda usarse para
corregir cualquier desviación que se observe sobre este supuesto.
Si M es el número total de manchas en un microarray, tenemos que:
C total =log(
M
∑ Ri
i =1
M
∑G
i =1
i
)
(3)
Se puede expresar el logaritmo de la relación normalizada como:
^
λi = λi − C total
(4)
El resultado es una distribución de logaritmos de relaciones que se centran en algún
punto cercano a cero. Este método funciona bien en la mayoría de los experimentos
estándar de microarrays con un número suficientemente grande de manchas (>
430
20000) ya que en estas condiciones los valores de señales outliers hacen una
contribución despreciable a las intensidades totales.
Una aproximación similar a la ecuación 3 puede emplearse para normalizar
intensidades entre los componentes de un grupo de microarrays de un solo canal. En
esta aplicación, cada intensidad obtenida en un canal se divide por la suma de
intensidades ( ej.
M
∑G
i =1
i
) de las manchas de un mismo microarray. De esta manera,
las intensidades normalizadas pueden usarse para comparar muestras hibridadas en
diferentes microarrays. Esta situación es la característica de los Affymetrix GeneChip,
y se da con mucha frecuencia en los microarrays de proteínas.
Normalización por Gen Set
El procedimiento anterior funciona bien para los experimentos con microarrays
estándar en los que el número de manchas es elevado y en general las diferencias de
expresión entre las dos muestras estudiadas no es excesiva. Sin embargo, el método
debe aplicarse con precaución pues puede conducir al error de concluir que siempre
es similar el número de genes superexpresados y subexpresados, lo que no es cierto
en muchas circunstancias.
En el gen set method se asume la existencia de un conjunto de genes que no se
expresan diferencialmente en las muestras estudiadas, se trata del conjunto de los
genes housekeeping. El procedimiento seguido es el mismo que en la ecuación 4, con
la única diferencia de que las intensidades que se suman son sólo las
correspondientes a los genes housekeeping y no a todas las manchas, a este valor se
llama Cgeneset .
Normalización mediante controles internos
Una forma de mejorar el proceso de normalización consiste en incorporar a las
muestras cantidades conocidas de controles externos antes del marcaje fluorescente.
La normalización se basa en balancear las intensidades de señal empleando las
moléculas de RNA que se han añadido como patrón externo.
Esta técnica tiene algunas ventajas como el control que se ejerce sobre la
cantidad de patrón externo que es la misma para todas las muestras, otra ventaja es
la de poder adaptar las cantidades de los patrones externos a los niveles de expresión
de los componentes de las muestras. Presenta también algunos inconvenientes
derivados de que los patrones se incorporan en una fase avanzada del experimento, o
la existencia de posibles interacciones cruzadas
con diferentes manchas del
microarray.
Corrección de desviaciones debidas a la posición en el array
Se ha comprobado que existen desviaciones espaciales debidas a condiciones de
hibridación inadecuadas en determinadas zonas de la superficie de un microarray. Si
no se corrige este efecto, puede alterar los resultados, por ejemplo deducir una
coexpresión de genes cuando lo que sucede es que están en una zona con diferente
intensidad de color.
Una de las formas de normalización consiste en dividir el microarray en
subzonas definidas por el procedimiento de impresión del arrayer y aplicar por
separado un procedimiento de normalización como el expresado en la fórmula 4.
431
Una medida que debe tomarse al construir los arrays es la de no colocar juntas
manchas que responden a modificaciones de expresión conjunta sino disponerlas al
azar.
Los microarrays de funcionalidad de proteínas precisan de este tipo de
normalización ya que se estudia la posible interacción de cada proteína con un
conjunto de ellas.
4.2 ANALISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS DE MICROARRAYS DE
PROTEINAS. OBTENCIÓN DE RESULTADOS.
A medida que incrementa la complejidad de los microarrays de proteínas, se
genera un volumen de datos lo suficientemente elevado como para que no pueda
deducirse su significado sin un tratamiento bioestadístico previo. Existen numerosos
métodos disponibles para el análisis de los datos, que permiten extraer la información
esencial e identificar las correlaciones que pueden establecerse con los parámetros
clínicos y biológicos.
Los métodos de análisis computacional de los datos procedentes de los
microarrays pueden dividirse en dos grupos: Supervised y Unsupervised methods.
Las técnicas supervised
requieren algún conocimiento previo sobre las
proteínas, por ejemplo, cuales proceden de controles y cuales de enfermos; en este
grupo se incluyen métodos estadísticos clásicos como ANOVA, t-test, Wilcoxon rank
score, el análisis discriminante y el Mann-Whitney U-text (25). Por el contrario en los
unsupervised methods se desconoce cualquier dato a cerca de las proteínas, las
cuales se clasifican exclusivamente por su comportamiento en la expresión. Se
incluyen en este grupo el Hierarchical clustering, K-means clustering, self-organizing
maps, el principal component analisys, o las redes bayesianas que proporcionan
resultados especialmente útiles para la generación de hipótesis
A continuación se describen algunos de los métodos unsupervised que han
demostrado su utilidad en la interpretación de los datos procedentes de microarrays
de ácidos nucleicos inicialmente y que también han probado su eficacia al aplicarse a
los datos procedentes de los microarrays de proteínas.
4.2.1 Análisis de clusters o conglomerados
En general, este método analítico tiene por objeto reunir elementos en grupos
homogéneos en función de las similitudes. Existen diferentes algoritmos para
determinar la relación de los datos basados en el cálculo de una métrica entre
variables similares.
Hierarchical Clustering
Uno de los métodos empleados más frecuentemente es el hierarchical clustering. Esta
familia de algoritmos proporciona una herramienta exploratoria para identificar
agrupaciones o clases no evidentes de forma inmediata dentro de un grupo de datos.
La idea básica consiste en ir dividiendo el conjunto inicial de todos los datos en clases
cuyos elementos presenten una mayor similitud, de acuerdo a una distancia o
métrica. Posteriormente se repite esta forma de actuación sobre las clases
resultantes. Una de las ventajas de esta técnica consiste en la posibilidad de elegir el
punto de corte en la iteración de tal forma que las clases resultantes tengan un
sentido biológico fácilmente identificable.
432
El resultado final se puede mostrar como un dendrograma o árbol, en el que la
longitud de las ramas refleja el grado de similitud entre variables. De forma adicional,
a partir de un hierarchical clustering puede generarse también un heat map (Fig. 15)
que proporciona una representación visual del rango de niveles presentados por las
variables (ej.: proteínas) y la naturaleza de la relación calculada entre ellas.
Este método analítico es una herramienta robusta para la generación de
hipótesis a partir de los datos de microarrays. Además de su aplicación al análisis de
los perfiles de expresión génica, y al análisis de datos inmunohistoquímicos, se ha
demostrado que el hierarchical clustering es una herramienta útil para obtener perfiles
proteómicos.
Usando un algoritmo de tipo two-way clustering, se ha logrado diferenciar el
carcinoma hepatocelular de la enfermedad hepática crónica, y en un estudio posterior,
utilizando datos procedentes de microarrays RPA, se ha conseguido la segregación de
los casos de cáncer colorectal primario de los de enfermedad metastásica del hígado
mediante un algoritmo similar.
Fig. 15.Heat map. Un heat map generado por un hierarchical clustering está constituido por un reticulado con las
cuadrículas coloreadas, cada color representa un valor de expresión de proteínas. En este ejemplo, las muestras del paciente se
localizan en el eje vertical y consiste en 49 casos de linfoma folicular (FL) y 15 casos de hiperplasia folicular (Reactive). Las
proteínas de interés se localizan en el eje horizontal y son: Bcl-2, fosfo-Akt (Ser473), fosfo-Bcl-2 (Ser 70), XIAP, fragmento de
433
PARP, y Bcl-xL. El color rojo corresponde a una expresión elevada, el negro a una intermedia, y el verde a baja con respecto a un
estandar común de referencia. A la derecha se representa un dendrograma asociado. En este ejemplo, por el procedimiento de
clustering han separado los casos en dos perfiles uno constituido por 38 casos de FL y 2 Reactives (escritos en verde), y el otro
compuesto por 11 casos FL y 13 casos Reactive. En términos generales los casos FL presentan unos niveles de expresión mas
altos para las proteínas, lo que queda indicado por el predominio de colores rojo y negro. J Pathol. (2006), 208: 595-606.
Una de las limitaciones del hierarchical clustering analysis es que no siempre
proporciona una medida de la probabilidad de la significación de la diferencia entre
clusters, dejando los resultados a una interpretación subjetiva y por tanto variable.
Por otra parte puede resultar no evidente identificar el verdadero número de clusters
fiables, ya que incluso datos no relacionados pueden dar lugar a algún cluster. De ahí
que esta herramienta sea más adecuada para la generación de hipótesis, que puedan
probarse después por otros procedimientos.
Clustering no Jerárquico
Otras técnicas de clustering, no jerárquicas, se utilizan para analizar los signalling
pathways de las interacciones de proteínas: entre ellas se encuentran el k-means
clustering y los self-organizing maps. El clustering de k-medias es un método
alternativo especialmente adecuado si se tiene conocimiento previo del número de
clústeres esperados, así como el reparto de los datos entre un número fijo de grupos
relacionados. Sin embargo, cuando se aplica el clustering a conjuntos de datos de
gran tamaño, de genes o proteínas, puede ser difícil o inadecuado elegir a priori un
número definido de clústeres.
Redes Neuronales Artificiales
Las redes neuronales son algoritmos generales de análisis de datos basados en un
uso intensivo del ordenador, que simulan el comportamiento neuronal biológico en la
resolución de problemas de clasificación.
Las redes neuronales artificiales se pueden emplear en la clasificación de
comportamientos complejos. Estos métodos se han empleado para discriminar,
mediante perfiles proteicos de suero, los pacientes de cáncer frente a individuos sin
cáncer.
Entre las redes neuronales los self-organising maps son ampliamente utilizados
problemas de clasificación no supervisados. Este algoritmo se diferencia de otras
redes neuronales por estar orientado a facilitar la identificación de clusters adyacentes
a uno dado, lo que resulta especialmente valioso para describir las relaciones entre
clusters.
4.2.2 Análisis por Componentes Principales (Principal component analisys,
PCA)
Es una herramienta estadística útil para reducir el número de variables en
un conjunto de datos identificando un subconjunto de éstas que sea el responsable de
la mayoría de las diferencias observadas. El PCA puede indicar qué variables en un
conjunto son importantes y cuales son de escasa significación. Esta técnica se ha
aplicado a los datos procedentes de los arrays de proteínas, logrando separar
claramente los linfomas foliculares de la hiperplasia folicular.
434
El PCA es una herramienta especialmente eficaz cuando se combina con otros
algoritmos de clustering, como por ejemplo el k-means clustering o el análisis
discriminante lineal (Linear discriminant analysis LDA).
4.2.3 Redes Bayesianas
Se utilizan para el análisis de las interacciones proteína-proteína. El método PCA
y el hierarchical clustering identifican o separan muestras (o pacientes) basado en los
criterios de similitud/desigualdad en la expresión de proteínas, en diferentes subclases
funcionalmente asociadas. Sin embargo, para identificar pautas de expresión de
proteínas a lo largo de una ruta de regulación, deben utilizarse aproximaciones
alternativas. Se ha empleado el análisis computacional de redes Bayesianas en la
identificación de las rutas proteicas de señalización para deducir relaciones
reguladoras entre rutas diferentes, o para descubrir la existencia de interacciones
moleculares. La identificación de relaciones de dependencia probabilística es
particularmente importante en el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas,
especialmente en el conjunto del fosfoproteóma, en el que la inhibición de un
producto final puede tener consecuencias significativas sobre otras rutas. Los modelos
de redes Bayesianas demuestran cualitativamente las relaciones causales directas e
indirectas de unos componentes de las rutas sobre otros en forma de grafo dirigido
compuesto por nodos y arcos. Los nodos representan las variables medidas y los
arcos de interconexión representan relaciones estadísticamente significativas entre
ellos, tanto en una forma lineal como no-lineal. Esta metodología es más apropiada
para detectar interacciones entre variables, y podría ser una técnica valiosa para
deducir los puntos de intervención farmacológica en las complejas rutas de
fosforilación de proteínas seguidas mediante microarrays de proteínas.
5 APLICACIÓNES CLÍNICAS DE LOS MICROARRAYS
El análisis proteómico basado en diferentes tipos de microarrays, ha
incidido positivamente sobre diversos aspectos de la clínica de enfermedades
multifactoriales como el cáncer o las autoinmunes, al abordar la variabilidad y
complejidad de estas con nuevas herramientas moleculares, que facilitan su
diagnóstico, pronóstico, y el seguimiento de la enfermedad, y, ya en el campo
farmacológico, permiten el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas.
5.1 Cáncer
5.1.1 Cáncer de mama. Aplicaciones de TMAs
El cáncer de mama es uno de los de mayor incidencia en el mundo y de los que
causan mayor mortalidad. Se trata de una enfermedad compleja en la que la
acumulación de numerosas alteraciones moleculares, de origen frecuentemente
desconocido, provoca proliferación celular, inestabilidad genética y la adquisición de
un fenotipo progresivamente más invasivo y resistente (26).
La heterogeneidad de las células malignas junto con la variabilidad de los
pacientes da lugar a diversos subgrupos de tumores que se caracterizan por sus
435
fenotipos y manifestaciones clínicas diferenciales, pero utilizando criterios clínicos y
patológicos la heterogeneidad se capta solo parcialmente y esto limita las
posibilidades de adoptar protocolos y estrategias terapéuticas nuevas más
personalizadas y por tanto mas eficaces.
5.1.2 Aplicaciones al diagnóstico
Los TMAs se han utilizado ampliamente en la caracterización del cáncer de
mama. La mayor parte de los estudios se ha basado en la identificación del perfil
proteico que se asocia a un fenotipo dado. Las proteínas que son objeto de estudio se
eligen con los siguientes criterios: 1) que jueguen un papel claro en la carcinogénesis
de la mama; 2) que muestren posibilidades de actuar como discriminadores en la
división en clases de los cánceres de mama; y 3) su idoneidad para identificar
distintas formas de diferenciación. Las proteínas que responden a estas características
tienen funciones diversas en la célula, por ejemplo, puede tratarse de receptores
hormonales luminales o basales, de miembros de la familia de los epitelial grow
factors receptors (EGFR), estar asociadas a genes supresores de tumores, ser
moléculas de adhesión celular como las mucinas, o participar en la diferenciación
apocrina, y neuroendocrina.
Se han realizado numerosos estudios en los que cohortes de pacientes con
cáncer de mama se han subdividido en clusteres utilizando en paralelo los criterios
clínicos y/o genéticos y los moleculares obteniéndose resultados muy similares o
incluso los criterios proteómicos han mostrado una mayor eficacia en la diferenciación
de los subgrupos inflammatory breast cancer IBC y non inflamatory breast cancer
NBC, frente a los criterios clínicos o patológicos, menos resolutivos para estos
caracteres.
5.1.3 Aplicaciones al pronóstico
El uso de criterios de pronóstico basados en la patología resulta insuficiente, y
por lo que se hace necesario realizar una diferenciación más precisa de los pacientes
basada en la respuesta a los agentes terapéuticos (26).
Estudios de pronóstico en cáncer de mama, basados en TMAs, han
probado que la expresión elevada de determinadas proteínas está relacionada con
una evolución desfavorable del tumor, como es el caso de la COX2, la subunidad
catalítica de la telomerasa (TERT), la molécula epitelial de adhesión celular (EpCAM/TACSTD1), o el factor de crecimiento placentario similar a insulina, en cuanto a
la expresión de la proteina KIT, que es una diana en la terapia con imatinib, no se ha
podido asociar con incremento en la supervivencia. Por el contrario se ha identificado
un buen pronóstico con la expresión elevada de STAT5 fosforilada en tirosina o de
BCL2
Los TMAs se han utilizado también para validar pronósticos basados en datos
obtenidos con microarrays de ADN, incrementándose su eficacia al aplicar los
algoritmos matemáticos de análisis de tipo supervised cuando se complementan con
datos cualitativos derivados de la aplicación de metodología de tinción por métodos
inmunohistoquímicos. La variación de los niveles de un conjunto de proteínas ha
permitido dividir los tumores en dos grupos de pronóstico: a) bueno (90% de
metastasis-free survival (MFS) a los 5 años) y b) malo (61% de MFS a los 5 años),
436
siendo valida la predicción independientemente del status del estrogen receptor (ER),
lo que pone de manifiesto que la predicción mediante un perfil de proteínas es más
eficaz que la basada en un solo factor.
5.1.4 Cáncer de ovario. Aplicaciones de RPAs
Es un tipo de cáncer que presenta especiales dificultades para el diagnóstico y
tratamiento; entre los cánceres ginecológicos es el de peor pronostico pues se
manifiesta clínicamente en estadios muy avanzados, en los que el tratamiento
citorreductor y la quimioterapia suelen ser escasamente eficaces, de ahí la
importancia que tiene la detección de nuevos biomarcadores para el diagnóstico
precoz, así como disponer de indicadores de la respuesta a la terapia, y de nuevas
opciones de tratamiento para pacientes con la enfermedad avanzada o refractarios al
tratamiento (17).
Los procesos de crecimiento, invasión y migración de las células neoplásicas
están controlados a través de rutas de señalización moleculares interconectadas que
se pueden estudiar empleando lisados de células aisladas a partir de biopsias
mediante LCM y analizándolas con RPAs, ello permite evaluar el estado de activación
de las rutas de señalización en diferentes fases de desarrollo de la enfermedad (21).
El grado de fosforilación de las quinasas, que forman parte de cascadas de
señalización, es más elevado en fases avanzadas del tumor y en aquellos que
presentan morfología endometrioide, mientras que los niveles de expresión tienden a
ser más específicos del paciente que de la fase de desarrollo del tumor. Este hecho
pone de relieve la necesidad de disponer de la información necesaria para diseñar
terapias ajustadas al paciente que bloqueen la progresión neoplásica (27).
Un estudio realizado con RPA empleando diferentes anticuerpos fosfoespecíficos
de proteínas reguladoras de la mitogénesis, transductoras de señales y factores
nucleares de transcripción, ha revelado un sorprendente grado de heterogeneidad
entre los pacientes con respecto a la activación de las cascadas de señalización. El
análisis de los datos mediante un unsupervised hierarchical clustering ha puesto de
relieve la existencia de dos grandes grupos de pacientes caracterizados por el estado
de activación de los end points de las rutas de regulación. Además se han extraído
otras conclusiones: a) el proteoma del carcinoma peritoneal primario no presenta
diferencias significativas con respecto al del tumor primario; b) la comparación entre
las rutas de señalización de un grupo primario y otro metastásico presentó variaciones
considerables respecto a la activación de las rutas de señalización; y c) los perfiles
procedentes de las metástasis eran claramente diferentes de los de su
correspondiente tejido tumoral primario, es decir que el comportamiento proteómico
del tumor evoluciona de forma diferente cuando se extiende a una localización
secundaria
Respecto al tratamiento se observa que los protocolos terapéuticos
aplicados pueden ser eficaces solamente en determinadas subpoblaciones de
pacientes, por ello se hace necesario definir un fingerprint carcinogénico para cada
paciente de forma que se pueda aplicar un tratamiento personalizado, usando nuevos
agentes terapéuticos solos o en combinación con otros preestablecidos.
Está claro que en el estudio de los casos antes mencionados, la tecnología de
los RPAs puede proporcionar datos de interés considerable pero es necesaria la
circunspección antes de extrapolar los resultados de la investigación a la práctica
437
clínica, pues se han de resolver previamente diversos problemas de reproducibilidad,
estandarización y validación clínica.
5.2 Inmunología
5.2.1 Enfermedades autoinmunes. Aplicaciones de FPAs
La disfunción que conduce a la respuesta autoinmune es desconocida en gran
medida a pesar de los avances realizados en este campo. En estudios hechos con
gemelos monocigóticos se han observado bajas tasas de concordancia para la mayoría
de las enfermedades autoinmunes, lo que parece indicar que están inducidas por
factores medioambientales y existir solo una leve predisposición genética. Otra de las
dificultades de su estudio se deriva de la variabilidad de los autoantígenos, así en el
síndrome de Sjögren y en el systemic lupus eritematosus (SLE) se han identificado
múltiples autoantígenos cuyas funciones específicas en la iniciación, perpetuación y
patofisiología de la enfermedad se conocen escasamente. En otras enfermedades
autoinmunes, como la artritis reumatoide (AR) y la psoriasis, los autoantígenos
principales siguen sin identificarse, a pesar del intenso esfuerzo experimental
realizado para ello. La disfunción de las células-B en las enfermedades autoinmunes,
parece tener su origen en la presencia de niveles altos de la proteína antiapoptótica
Bcl-2, por lo que no experimentan apoptosis y son capaces de producir
autoanticuerpos frente a determinadas proteínas que son especialmente abundantes,
altamente conservativas, y/o modificadas y pueden formar grandes complejos
asociados a menudo con ARN y localizados en los blebs apoptóticos.
Los microarrays de proteínas junto con otras técnicas de análisis proteómico de
alto rendimiento representan herramientas robustas para el estudio
de la
patofisiología y la especificidad de la respuesta inmune. Mediante ellos se puede
abordar la identificación de la huella antigénica de cada paciente. Esto puede ser un
paso crucial para identificar el antígeno patogénico principal, sin olvidar que muchas
proteínas o péptidos modificados por factores medioambientales pueden inducir
determinadas enfermedades autoinmunes actuando conjuntamente con la base
genética individual (22).
5.2.2 Microrrays de citoquinas
La aplicación de los FPAs es especialmente prometedora en el estudio clínico de
las concentraciones de citoquinas, pues las terapias dirigidas a incrementar o
disminuir los niveles de estas proteínas han demostrado ser especialmente útiles en el
tratamiento enfermedades autoinmunes, basta mencionar los beneficios derivados de
las terapias inhibidoras de IL-1, IL-6, IL-15, y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α),
en el tratamiento de la AR.
En el análisis de las citoquinas es necesaria una alta sensibilidad de detección
dadas las bajas concentraciones en que aparecen en los medios biológicos. Se ha
aplicado con éxito el método de detección RCA que proporciona un medio excelente
de amplificación lineal de la señal, esto ha permitido la detección simultánea de 75
citoquinas, en rango femtomolar de concentraciones, en un time-course de secreción
de citoquinas por células dendríticas que confirmaron y aun ampliaron resultados
previamente descritos (28). Aunque el RCA es un método ligeramente más elaborado
438
que otros métodos de detección, ha permitido medir más de 180 citoquinas mediante
este procedimiento (16).
Además de servir de guía en el diseño de nuevas estrategias farmacológicas, la
determinación de los niveles de citoquinas mejora el conocimiento de la patogénesis
de la enfermedad y ayuda a la identificación de sus marcadores. Por ejemplo, en el
SLE, se ha determinado el perfil de los distintos tipos de interferón, y se ha podido
comprobar el incremento de los interferones tipo I, en esta patología el papel de las
citoquinas es más complejo, se puede mencionar como ejemplo el carácter
controvertido del TNF-α como citoquina inflamatoria o inmunomoduladora. En
determinadas situaciones fisiológicas en que la función de las citoquinas aparece
ambigua, su análisis múltiple puede proporcionar una mejor comprensión de la
compleja biología de estos compuestos aplicando a los datos obtenidos técnicas
bioinformáticas.
439
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