Cinética enzimática: Efecto de la concentración de sustrato sobre una enzima

Cinética enzimática: Efecto de la concentración de sustrato
sobre una enzima
Objetivo: demostrar mediante la realización de una reacción enzimática clásica,
el efecto que tiene la concentración de sustrato sobre la velocidad de la
reacción.
Además, comprobar que la reacción enzimática a realizar concuerda con los
postulados de Michaelis y Menten. Para ello, el estudiante deberá comprender y
determinar valores de Km y Vmax.
Fundamento
Las enzimas son moléculas orgánicas capaces de catalizar reacciones
bioquímicas mediante la disminución de la energía de activación que se
requiere
para que la reacción se lleve a cabo. Sin las enzimas, los procesos metabólicos
que
se llevan a cabo dentro de las células tardarían mucho tiempo y por lo tanto los
períodos de respuesta de adaptación al medio extracelular serían muy largos y
tal
vez incluso incompatibles con la vida. Muchas enzimas obedecen la teoría de la
cinética enzimática propuesta en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten. En
ella se establece que durante una reacción catalizada por una enzima, ésta
reacciona reversiblemente con el sustrato para formar un complejo
enzimasustrato.
Posteriormente este complejo participa en una reacción como reactante
para dar origen a un producto y a la enzima libre y activa, lista para participar
en
una nueva reacción. Uno de los factores más importantes que afecta la
velocidad
de una reacción enzimática es precisamente la concentración de sustrato. Sin
embargo, estudiar este efecto en el laboratorio se torna difícil dado que la
concentración de sustrato varía durante el curso de la reacción. Un método que
simplifica la realización de experimentos de cinética es medir la velocidad inicial
o
V0 donde la concentración de sustrato es mucho mayor que la concentración de
la
enzima. Bajo estas condiciones, cambios en la concentración del sustrato son
ínfimos y por lo tanto se considera que la concentración de sustrato se
mantiene
constante. Cuando la concentración de enzima se mantiene constante, el efecto
que tiene una concentración variable de sustrato sobre V0 se ilustra en la figura
1.
Figura 1. Gráfico que demuestra el efecto de la concentración del sustrato
sobre
la velocidad inicial de una reacción enzimática. Vmax: velocidad máxima, Km:
concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la Vmax.
A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad de la
reacción aumenta en forma proporcional a la concentración de sustrato,
obteniéndose una relación de tipo lineal. Sin embargo, a concentraciones más
altas
de sustrato, la relación proporcional no se cumple ya que al aumentar la
concentración de sustrato, la velocidad no aumenta considerablemente. Es
entonces cuando la velocidad de reacción alcanza un valor máximo Vmax, en el
cual aunque se aumente la concentración de sustrato, la velocidad de la
reacción
no varía.
En la práctica del día de hoy, observaremos este efecto en la reacción de la
glucosa oxidasa y la glucosa. El principio de esta reacción fue revisado en la
práctica 2. La glucosa oxidasa reconoce específicamente a una de las formas
anoméricas de la D-glucosa, la forma beta glucopiranosa. Esta enzima, en
presencia de glucosa, oxígeno y un amortiguador de pH, genera gluconolactona
y
peróxido de hidrógeno.
El peróxido de hidrógeno es a su vez sustrato de otra enzima, la peroxidasa, la
cual en presencia de fenol y una amina aromática (en nuestro caso, la amino-4antipirina) genera un compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, cuando
el
reactivo vira de incoloro a rosado, se demuestra la presencia de glucosa en la
muestra. La cantidad de color medido a 492nm es proporcional a la cantidad de
glucosa en la muestra.
Materiales y reactivos
Sustrato: soluciones de glucosa a diferentes concentraciones
Enzima: glucosa oxidasa
1 gradilla con 8 tubos de ensayo pequeños
9 pipetas de 1ml
Agua destilada
Pera para las pipetas
HCl concentrado
Pipeta Pasteur
Guantes
Anteojos de seguridad
Micropipeta 200ul con sus respectivos tips
2 placas de microtítulo
Procedimiento
Preparar la siguiente serie de tubos:
Tubo #
Solución
glucosa
(ml)
Agua
(ml)
Reactivo
glucosa
oxidasa
(ml)
Volumen
final
(ml)
Concentración
final glucosa
(es necesario
calcularla)
1 0 0.1 0.9 1
2 0.1 soln 1
mM 0 0.9 1
3 0.1 soln
2.5 mM 0 0.9 1
4 0.1 soln
5.0 mM 0 0.9 1
5 0.1 soln 10
mM 0 0.9 1
6 0.1 soln 25
mM 0 0.9 1
7 0.1 soln 50
mM 0 0.9 1
8 0.1 soln 100
mM 0 0.9 1
Agitar, incubar 30 min a temperatura ambiente. Al finalizar la incubación, el
instructor agregará 3 gotas de HCl concentrado. Agitar levemente.
Pasar 200ul de cada reacción a una placa de microtítulo y medir la absorbancia
a
492 nm.
Resultados
Elabore un cuadro que contenga la siguiente información: número de tubo,
concentración final de glucosa en cada tubo y absorbancia obtenida para cada
reacción. Con estos datos, elabore un gráfico donde la concentración final de
glucosa en cada tubo esté representada en las abscisas y la absorbancia en las
ordenadas.
Calcule según su método de preferencia los valores de 1/V y 1/S. A partir de
estos
valores calcule según el método de su preferencia, el valor de Vmax y Km.
Recuerde: restar el valor del blanco reactivo a los valores obtenidos si el
aparato
usado no lo hace automáticamente. Además, no olvide mostrar todos los
cálculos
realizados y rotular debidamente el gráfico a presentar.
Cuadro 1. Valores de absorbancia obtenidos para las reacciones de glucosa
oxidasa
en presencia de diferentes concentraciones de glucosa
Tubo Absorbancia
obtenida
Absorbancia luego de
restar el blanco
reactivo
Concentración
final de
glucosa
1
2
3
4
5
6
7
8
Bibliografía
-Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioquímica. Bioquímica y
Biología
Molecular. Objetivos del curso y manual de prácticas de laboratorio. Mc GrawHill
Interamericana Editores, México, 2000.
-ELITECH Diagnostics. Instrucciones de uso del reactivo Glucosa PAP, versión
12/2002
- Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman
and
Company, NY. Cuarta edición, 2005.