EFECTO DE LA ADICION DE N-2-Hidroxietilpiperazina-N`

EFECTO DE LA ADICION DE N-2-Hidroxietilpiperazina-N’-2 ácido
etanosulfónico (HEPES) COMO AMORTIGUADOR DEL pH, A LOS MEDIOS
DE MADURACION, FERTILIZACION Y CULIVO, SOBRE LA PRODUCCION IN
VITRO DE EMBRIONES BOVINOS.
Edgar Fidel Curiel Pulido Medicina Veterinaria Y Zootecnia De La
Universidad Autónoma De Nayarit, [email protected] ASESOR José
Fernando De La Torre Sánchez Centro Nacional De Recursos Genéticos
[email protected]
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la producción in vitro de embriones, el mantenimiento del pH en rangos
fisiológicos (7.2 a 7.4) en los periodos de incubación para maduración de ovocitos,
fertilización in vitro y cultivo de embriones, es de vital importancia para el
adecuado desarrollo de los embriones y se logra a través de mantener un sistema
de amortiguamiento del pH basado en el intercambio del CO2 presente al 5-6 % en
la atmósfera de cultivo y el HCO3- derivado de la disociación del Bicarbonato de
Sodio que se agrega al medio de cultivo en una concentración de 20 mM. Este
sistema produce ácido carbónico que ayuda a mantener el pH en niveles
fisiológicos. Teniendo las concentraciones de CO2 y HCO3- en las concentraciones
indicadas, se genera un sistema en equilibrio en la incubadora que permite lograr
el objetivo de mantener el pH en el rango fisiológico deseado en los medios que
rodean a gametos y embriones en cultivo. Esta situación, sin embargo, se altera
cuando es necesario sacar las cajas de cultivo de la incubadora y someter a
gametos y embriones a diferentes manejos como son: establecimiento del cocultivo de fertilización, retiro de células cumulares y espermatozoides de cigotos,
cambios de medio, retiro de células no divididas o embriones retrasados o
degenerados, evaluación de embriones, entre otros. Bajo estas circunstancias, el
pH de los medios se eleva, poniendo en riesgo la sobrevivencia de los embriones.
Para solventar esta situación, se ha implementado el uso de medios para uso
exclusivo fuera de la incubadora, a los que se les reduce la concentración de
bicarbonato de sodio de 20 a 5 mM y se sustituye esta cantidad por una sustancia
con capacidades buferínicas (pKa de 7.55 a 20ºC), el N-2-Hidroxietilpiperazina-N’2 ácido etanosulfónico (HEPES). De esta forma, los medios mantienen el pH en el
rango de 7.2 a 7.4 por periodos de tiempo suficiente para realizar los manejos. El
problema persiste, sin embargo, cuando los gametos o embriones son sacados de
la incubadora para evaluación o para transferirlos a medio de manejo, sobre todo
cuando son manipulados por operadores inexpertos, que usualmente toman
demasiado tiempo para hacer estas manipulaciones, resultando en alteración del
pH en el medio, aun y cuando las gotas de medio son cubiertas con una capa de
aceite mineral que retrasa el intercambio gaseoso con el aire. Para solucionar esto
último, algunos laboratorios agregan a los medios de cultivo que se usan dentro de
la incubadora, 15 mM de HEPES, pero respetando la concentración de
Bicarbonato de Sodio de 20 mM, lo que obliga a reducir la concentración de NaCl
en el medio en 15 mM. Lo anterior al mismo tiempo que ofrece el beneficio de
amortiguamento del pH, puede tener efectos adversos por reducir la concentración
del Osmolito NaCl y por el posible efecto detrimental del HEPES durante largos
periodos de cultivo.
Por lo anterior, en el presente ensayo se pretende evaluar el efecto de la adición
de 15 mM de HEPES en sustitución de 15 mM de NaCl en los medios de
Maduración, fertilización y cultivo, sobre la producción y calidad de embriones
bovinos en un sistema de producción in vitrode embriones. Adicionalmente, se
evaluará el efecto de habilidad del operador, usando medios con y sin HEPES.
METODOLOGIA
El ensayo se realizará en los meses de junio a agosto del año en curso, en el
Laboratorio de Recursos Genéticos Acuáticos y Pecuarios del Centro Nacional de
Recursos Genéticos del INIFAP, en el Municipio de Tepatitlán, Jalisco
Los procedimientos de obtención de ovarios, aspiración de ovocitos, maduración,
fertilización y cultivo de embriones in vitro, se realizarán conforme a los
procedimientos establecidos en el CNRG-INIFAP.
Se realizarán seis repeticiones usando 200 ovocitos por repetición; a partir de que
los ovocitos sean aspirados y seleccionados, se distribuirán aleatoriamente en
cuatro grupos de 50 ovocitos, asignandolos a dos tipos de medio (con HEPES y
sin HEPES) y a dos operadores (experto y principiante) en arreglo factorial 2 x 2.
Se evaluarán las siguientes variables de respuesta:
Porcentaje de fertilización (registrada en base a óvulos que alcanzaron la primera
división)
Porcentaje de embriones que llegaron al estadío de 6-8 células
Porcentaje y calidad (escala 1 a 4) de Blastocistos a 7 días de cultivo
(considerando día 0 el día de la fertilización)
Porcentaje y calidad de blastocistos a 8 días de cultivo
Los datos se analizarán por el procedimiento GLM de SAS; se harán pruebas de
homogeneidad de varianzas y si es necesario se aplicará trasformación arcoseno
raíz cuadrada de la proporción a los datos para obtener normalidad en los mismos.