modelado matemático e implementación práctica de sistema de

Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
MODELADO MATEMÁTICO E
IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE SISTEMA
DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA
MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIEROS DE SEVILLA
INGENIERÍA DE TELECOMUNICACIÓN
AUTOR: JAVIER RIVERO GONZÁLEZ
TUTOR: RAMÓN RISCO DELGADO
DEPARTAMENTO DE
FÍSICA APLICADA III
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UNIVERSIDAD DE SEVILLA
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIEROS
INGENIERÍA DE TELECOMUNICACIÓN
DEPARTAMENTO DE FÍSICA APLICADA III
PROYECTO FIN DE CARRERA
MODELADO MATEMÁTICO E IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE
SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA MEDIANTE
RADIACIÓN LÁSER
AUTOR: JAVIER RIVERO GONZÁLEZ
TUTOR: RAMÓN RISCO DELGADO
JULIO 2012
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Proyecto fin de carrera:
MODELADO MATEMÁTICO E IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN
ULTRA-RÁPIDA MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER
Autor: Javier Rivero González
Tutor: Ramón Risco Delgado
El tribunal nombrado para juzgar el proyecto fin de carrera mencionado, compuesto por:
Presidente:
Vocal:
Vocal secretario:
Acuerda otorgarle la calificación de:
Sevilla, a de JULIO de 2012
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A mis padres Sagrario y José Luis y a mi hermano Luis Miguel, por animarme a empezar.
A mi mujer Carmen, por animarme a terminar.
A mi profesor Ramón por tanta paciencia.
A mi hija Sara, por cada minuto de su vida.
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INDICE
CAPÍTULO I. GENERALIDADES DE LA CRIOPRESERVACIÓN
1.
INTRODUCCIÓN A LA CRIOBIOLOGÍA .................................................................................. 8
2.
FUNDAMENTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN ....................................................................... 9
3.
2.1.
EL AGUA Y EL HIELO EN LA CÉLULA ............................................................................. 9
2.2.
PRINCIPIOS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA PRESERVACIÓN EN FRÍO ................................... 11
2.3.
AGENTES CRIOPROTECTORES (ACP) .......................................................................... 14
2.4.
AGENTE CRIOGÉNICO ............................................................................................... 17
2.5.
MECANISMOS DE DAÑO BIOLÓGICO ......................................................................... 19
PROTOCOLOS CONVECIONALES DE CRIOPRESERVACIÓN .................................................. 22
3.1.
ENFRIAMIENTO LENTO O “SLOW FREEZING”............................................................. 22
3.2.
VITRIFICACIÓN .......................................................................................................... 23
CAPÍTULO II. MODELADO MATEMÁTICO DEL SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO
1.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 31
2.
ECUACIÓN DE TRANSFERENCIA DEL CALOR ...................................................................... 32
3.
MODELOS SISTEMA VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA .......................................................... 39
3.1.
MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER UNIFORME .................................................... 39
3.2.
MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER CUARÁTICO ................................................... 59
3.3.
MODELO MATEMÁTICO PERFIL LASER GAUSSIANO ................................................... 74
3.4.
RESULTADOS NUMÉRICOS ........................................................................................ 74
CAPÍTULO III. IMPLEMENTACIÓN DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO MEDIANTE
RADIACIÓN LÁSER
1.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 87
2.
MÉTODO PROPUESTO DE VITRIFICACIÓN ULTRARRÁPIDA ................................................ 87
3.
MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA ...................................................................................... 89
3.1.
UTILIZACIÓN DE RODAMINA B .................................................................................. 89
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3.2.
EMPLEO DE TERMOPARES ........................................................................................ 91
3.3.
ESPECTROSCOPÍA RAMAN ........................................................................................ 93
4.
CALENTAMIENTO DE LA MUESTRA MEDIANTE LÁSER ......................................................103
5.
ESQUEMA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN REALIZADO.....................................................107
6.
CONCLUSIONES ........................................................................................................... 10710
CAPÍTULO 4. BIBLIOGRAFÍA
APÉNDICES
APENDICE I. CONSTANTES FÍSICAS
APENDICE II. MEMORIA DE SOLICITUD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
APENDICE III. RESOLUCIÓN FAVORABLE DE INSTITUTO DE SALUD CARLOS III
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CAPÍTULO I
GENERALIDADES DE LA CRIOPRESERVACIÓN
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1. INTRODUCCIÓN A LA CRIOBIOLOGÍA
La Criobiología es la parte de la Biología que estudia los efectos producidos por las bajas
temperaturas en células, tejidos, órganos y organismos vivos. En 1940 comenzó la era moderna
de la Criobiología con la publicación de la obra de Luyent “Vida y muerte a bajas
temperaturas”.
El frío tiene el poder de preservar así como el poder de destruir. Gracias a los avances
científicos, se han podido extraer proteínas de mamuts con más de doce mil años de
antigüedad [Prager et al., 1980] y su ADN [Jonson et al., 1985], tras más de cincuenta mil años
de almacenamiento a bajas temperaturas. Estos hallazgos suponemos que posibilitarán en un
futuro (cuestiones éticas aparte) la clonación y/o recuperación de numerosas especies extintas
o en peligro de extinción. Hay que tener en cuenta, no obstante, que probablemente fue ese
mismo frío la causa de su muerte.
Un problema aún sin solventar y de vital importancia en biología y todas las disciplinas que
se basan en el uso de material biológico es su almacenamiento, jugando un papel
especialmente relevante dentro de muchas parcelas de la actividad humana: agricultura
(semillas) y ganadería (semen), trasplantes, etc. Dicho almacenamiento a largo plazo requiere
de la utilización de muy bajas temperaturas, típicamente de entre -140ºC y -180ºC.
Está demostrado que existe una relación directa entre la temperatura de almacenamiento
y el tiempo durante el que la muestra sigue siendo viable tras su criopreservación. Fue el
premio nobel sueco Svante August Arrhenius quien en 1898 desarrolló la ecuación que
establece la influencia del descenso de la temperatura en la evolución de las reacciones
químicas.
A temperaturas inferiores a -140 grados centígrados, la actividad metabólica se detiene,
pudiendo hablar entonces de preservación efectiva. Sin embargo, el enfriamiento tradicional
de material biológico hasta estas temperaturas provoca indefectiblemente la formación de
cristales de hielo, letales salvo en raras excepciones.
Desde que se iniciaran hace 50 años los primeros experimentos de preservación en frío se
ha avanzado notablemente en el conocimiento de los procesos que tienen lugar cuando se
enfría una muestra biológica consistente en un conjunto de células aisladas en suspensión (ni
tejidos ni órganos), sobre todo en células reproductoras. En este caso, estas estrategias están
basadas en la incorporación de agentes protectores frente al frío así como en la optimización
de las velocidades de enfriamiento y recalentamiento, de tal forma que se eviten los diferentes
fenómenos físicos y biológicos que puedan acarrear la muerte de la muestra.
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El problema de la preservación de material biológico de mayores dimensiones, tales como
tejidos u órganos, aún no ha podido ser resuelto satisfactoriamente mediante la utilización de
agentes crioprotectores. El motivo principal son las concentraciones requeridas para una
preservación efectiva, en torno a 8 molar (8 moles de agente crioprotector por cada litro de
disolución). Dichas concentraciones resultan con bastante frecuencia tóxicas para los
organismos a criopreservar. Existen además otros muchos problemas asociados a la
criopreservación, tales como:
Elección de la velocidad óptima de enfriamiento.
Elección del tipo de crioprotector adecuado.
Conductividad térmica finita del medio.
Diversidad citológica, en el caso de organismos complejos.
Lenta perfusión del crioprotector.
Proceso de desvitrificación (formación de hielo durante el retorno a temperatura
ambiente).
2. FUNDAMENTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN
2.1. EL AGUA Y EL HIELO EN LA CÉLULA
“Es el agua con sus preciosas y raras características y no el ADN, la molécula fundamental
de la vida” [Muldrew et al., 1997]. En células animales constituye alrededor del 80% de su
volumen, en vegetales como la lechuga, el 95% mientras que en el otro extremo de la escala
nos encontramos algunos tipos de esporas con un 5%; por debajo de este porcentaje los
organismos se encuentran en un estado inanimado en el cual se detienen sus procesos
bioquímicos.
Una célula es básicamente un pequeño saco que encierra una disolución de agua y sales. A
este saco le rodea una membrana semipermeable, un tejido especial que solo permite el paso
de agua a través de él peo no así las sales que tiene disueltas. Por ello, cuando a través de los
diferentes procesos que veremos más adelante el agua entra o sale de la célula, la
concentración de las sales disueltas aumenta o disminuye.
En los diferentes modelos y experimentos contemplados en este proyecto la muestra
considerada siempre se modelará como si de agua pura se tratase, desde el punto de vista de
sus constantes físicas, tales como conductividad térmica, difusividad, etc.
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La molécula de agua está compuesta por dos átomos de hidrógeno y uno de oxígeno,
unidos por dos enlaces covalentes dispuestos de tal forma que el átomo de oxígeno se rodea
de ocho electrones de valencia, la cual constituye una configuración más estable. Este hecho
provoca que dicho átomo disponga de una carga neta negativa, mientras que los átomos de
hidrógeno una carga neta positiva.
Como consecuencia de esta disposición atómica las moléculas de agua se atraen entre sí,
con un enlace intermolecular conocido como puente de hidrógeno; dicho enlace se considera
débil pero otorga al agua unas propiedades muy particulares, que juegan un papel esencial en
el desarrollo de la vida orgánica.
Figura 1. A la izquierda se muestra una representación de la disposición atómica de la molécula de agua. La derecha
puentes de hidrógeno formando una estructura tetraédrica.
El agua pura se cógela a presión atmosférica a 0 grados centígrados. Sus moléculas
estructuradas de forma tetraédrica debido a los puentes de hidrógeno, se agrupan de manera
compacta, por lo que la densidad de hielo será menor que la del agua.
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2.2. PRINCIPIOS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA PRESERVACIÓN EN FRÍO
Bastan dos principios físicos para explicar lo que tiene lugar en la célula mientras se
produce el proceso de enfriamiento: el principio de descenso crioscópico y el principio de
ósmosis.
DESCENSO CRIOSCÓPICO
El descenso crioscópico es una propiedad coligativa, es decir, depende únicamente de la
concentración de soluto, y no de la naturaleza del mismo y establece que si se tiene agua pura
y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelará a 0ºC, sino por debajo de esta
temperatura, tanto más baja cuanto mayor es la cantidad de sal que se haya disuelto en ella.
Consiste pues, en la disminución del punto de fusión de la disolución con respecto al del
disolvente puro, y es consecuencia directa de la disminución de la presión de vapor por parte
del disolvente al agregarle un soluto. Esta propiedad explica la razón por la cual el agua disuelta
con sales, en fase líquida, a temperaturas inferiores a 0 grados centígrados sigue
encontrándose en una fase estable. El descenso crioscópico es directamente proporcional a la
molalidad (número de moles de soluto por kg de disolvente) y para una solución ideal y diluida,
dicho descenso en la temperatura de congelación se puede expresar como:
∆ ∆
Donde ∆T es el descenso crioscópico, Tf es la temperatura de fusión, ∆H la entalpía de
fusión y xB la fracción molar del soluto presente.
En la figura siguiente se muestra el efecto del descenso crioscópico, ∆ , de tal forma que
para una misma presión la temperatura del punto de fusión para una solución acuosa es menor
que para el agua pura.
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Figura 2. Diagrama P-T del agua. Descenso crioscópico
PRINCIPIO DE ÓSMOSIS
El principio de ósmosis establece que cuando se tiene una célula semipermeable sumergida
en una disolución salina, entonces el agua empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar
las concentraciones de las disoluciones. Es decir, si se sumerge la célula en una disolución de
sales más concentrada que el interior celular, entonces el agua (y sólo el agua) sale de la célula,
a consecuencia de lo cual ésta se encoge y reduce su volumen. Si por el contrario, se sumerge
la célula en una disolución más diluida que el interior celular, entonces empezará a entrar agua
dentro de la célula intentando diluir la disolución salina de su interior; a consecuencia de esto
la célula se hincha.
La ósmosis, en resumen, es una difusión pasiva a través de una membrana semipermeable,
en la cual, las partículas de soluto se dirigen desde la solución más concentrada a la menos
concentrada, con una determinada tasa, hasta alcanzar el equilibrio.
La presión osmótica es la diferencia de presiones que sufre una membrana semipermeable
que separa dos sistemas con distintas concentraciones de soluto.
Las membranas biológicas se comportan como membranas semipermeables. La ósmosis se
debe a que la membrana semipermeable impide el paso de soluto, del medio más concentrado
al menos concentrado, por lo que en el caso de la célula, al introducirla en un medio con una
concentración de sales superior al interior celular, medio hipertónico, la célula expulsará agua,
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por lo que se encoge y consecuentemente se reduce su volumen. Por otra parte, en el interior
de la célula, la concentración de sales será mayor, por lo que desciende el punto de
congelación.
La figura siguiente muestra las variaciones de volumen que experimentan los glóbulos rojos
debido al principio de ósmosis anteriormente descrito. Cuando se sumerge en un medio
hipotónico, es decir, con una menor concentración de soluto extracelular, la célula incrementa
su volumen al absorber disolvente procedente del medio exterior. En cambio, si la solución
extracelular es hipertónica, la célula experimentará una retracción. En el caso de medio
isotónico, no se produce difusión, puesto que se encuentra en equilibrio.
Figura 3. Consecuencia de la ósmosis en los glóbulos rojos
FUENTE: [Osmosis and redblood cells –www.NDP teachers.org]
Basándonos en estos dos principios la cadena de eventos que tiene lugar durante la
criopreservación es la que se describe a continuación.
Cuando se tiene un conjunto de células que se quiere conservar en frío inicialmente las
células se tienen sumergidas en el interior de un recipiente que contiene una solución salina
isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior celular. Basándonos en estos los
principios de descenso crioscópico y de ósmosis la cadena de eventos que tiene lugar durante
el proceso de criopreservación es por tanto la que se refiere a continuación.
Cuando se empieza a enfriar el preparado celular, el frío alcanza antes la solución exterior
que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el medio
extracelular cuando no se ha formado aún hielo dentro de la célula. A medida que se forma el
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hielo extracelular el agua líquida va desapareciendo. Al disminuir la cantidad de agua exterior,
en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a salir agua de la célula para
compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares.
Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a estar más
concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua se expulsa; es aquí cuando interviene el
principio de descenso crioscópico dado que a pesar de estar más concentrada la disolución
salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el
agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. Así, mientras se enfríe poco a
poco, el proceso continuará indefinidamente: crecerá el hielo extracelular, saldrá agua de la
célula para compensar las concentraciones salidas dentro y fuera, se concentrará la sal dentro
de la célula y descenderá aún más la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro.
Por ello, con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por
completo la formación del dañino hielo intracelular.
No obstante conviene mencionar que la no formación de hielo mediante este
procedimiento no es sinónimo de supervivencia celular dado que aún cuando no llegue a
formarse aparecen dos nuevos factores que pueden perjudicar gravemente a la célula. Por una
parte está el hecho de que en cierto instante la concentración de sales dentro de la célula llega
a ser tan alta que resulta muy tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la célula su volumen
disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales irreversibles. Estos dos
factores son tanto o más perjudiciales si cabe que la formación de hielo intracelular; es por ello
que en los protocolos de preservación de células aisladas hay que enfriar a una velocidad que
sea lo suficientemente lenta como para evitar en lo posible la formación de hielo intracelular,
pero a su vez, lo suficientemente rápida como para no producir una deshidratación excesiva
que conlleve una destrucción irreversible de la estructura celular.
2.3. AGENTES CRIOPROTECTORES (ACP)
Los agentes crioprotectores son sustancias hidrosolubles en agua capaces de modificar las
propiedades fisicoquímicas de las soluciones acuosas presentes en la materia viva. La función
de los crioprotectores variará dependiendo del tipo elegido. No obstante sus funciones
principales son promover una rápida deshidratación celular, y amortiguar el efecto de la alta
concentración de solutos en el interior de la célula u organismo a criopreservar. Tras añadir los
agentes crioprotectores, se produce la cadena de eventos detallada anteriormente.
En resumen, al existir una diferencia de concentración, por el fenómeno de ósmosis, el
agua fluye a través de la membrana semipermeable hasta el exterior celular, aumentando la
concentración de sales en el interior. Como consecuencia, al estar más concentrada la
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disolución salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más
difícil que el agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. El problema reside
en que las altas concentraciones requeridas para criopreservar de forma efectiva pueden
resultar tóxicas para el organismo a criopreservar.
Bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores: los alcoholes, azúcares
y el dimetilsulfóxido (DMSO). No obstante los crioprotectores se catalogan en base a diversos
criterios, especialmente de acuerdo al grado de protección al cristal de agua, a la toxicidad
química que pueden tener sobre las células y a la velocidad para penetrar los tejidos.
El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que
tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalización
dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que
conforman las mezclas congelantes.
Las concentraciones crioprotectoras son lamentablemente tóxicas para el tejido a
temperatura ambiente, por lo cual en el procedimiento de congelado se deben respetar ciertos
tiempos de exposición del material a 4ºC, para que el producto protector penetre el tejido sin
alcanzar los niveles tóxicos referidos, antes del inicio del proceso de congelación propiamente
dicho. En el mismo sentido, cuando se procede a la técnica de descongelado, previamente al
uso del material, se le debe someter a un lavado minucioso con medios nutritivos a
concentraciones decrecientes del crioprotector, para su total eliminación evitando de esta
forma los efectos tóxicos.
A este respecto fue el profesor David Pegg de la Universidad de York, quien descubrió que
los cambios bruscos en la concentración de una solución lleva aparejada una disminución de la
supervivencia de las células suspendidas de tal forma que incluso bajas concentraciones a
temperatura ambiente llegan a ser letales para el material biológico a criopreservar.
La recuperación de dicho material está estrictamente vinculada no sólo con la temperatura,
sino también con el tiempo de exposición al crioprotector. La relación que muestra esta
dependencia es exponencial y fue presentada por Gregory Fahy en 2005, a través de la
expresión siguiente:
100
Donde t es el tiempo y β una constante que depende del crioprotector empleado y de la
temperatura.
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De acuerdo a la permeabilidad celular se pueden considerar dos tipos de crioprotectores:
Crioprotectores no penetrantes
Son sustancias de alto peso molecular, efectivas a velocidades altas de congelación,
caracterizadas por ejercer su acción protectora promoviendo la rápida deshidratación
celular, por lo que suelen utilizarse asociados a los agentes penetrantes.
Los más utilizados son: sacarosa, dextrosa, glucosa, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano
y polietilenglicol.
Crioprotectores penetrantes
Son sustancias de bajo peso molecular que penetran en el interior de la célula y actúan
deshidratando la célula por sustitución del agua intracelular, amortiguando el
incremento de concentración de solutos en el medio extracelular, impidiendo la
formación de cristales en el interior y evitando el estrés osmótico. Los más empleados
son el 1-2 propanodiol, dimetilsúlfóxido (DMSO), etilenglicol y glicerol.
Figura 4. A la izquierda se muestra una representación tridimensional del propanodiol. A la derecha se representa
modelo tridimensional del Dimetilsulfóxido (DMSO).
Los crioprotectores que penetran la célula reemplazan el agua, es decir, entra el agente
crioprotector y sale el agua. El no penetrante, en cambio, evita el arrugamiento excesivo de la
membrana plasmática, que ocurre cuando entra crioprotector y sale agua, ya que las
velocidades son diferentes (sale más rápido el agua). Por lo tanto, en criopreservación, se
utiliza una mezcla de crioprotectores penetrantes y no penetrantes.
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Numerosos estudios ponen de manifiesto la dependencia de la velocidad de enfriamiento
de algunos crioprotectores, como el 1-2 propanodiol, con la concentración de crioprotector,
demostrándose que éste aumenta de forma logarítmica al disminuir la cantidad de
crioprotector. Esto supone que podremos disminuir la cantidad de crioprotector necesaria
hasta unas concentraciones que no resulten tóxicas para el organismo a criopreservar,
aumentando la velocidad de enfriamiento. En la siguiente gráfica podemos observar como
disminuye la cantidad de hielo formado al aumentar la cantidad de crioprotector, en este caso,
dimetilsulfóxido (DMSO). [Fuller et al., 2004].
Figura 5. Cantidad de hielo formado en una solución 0.5M de NaCl con diferentes concentraciones de DMSO.
Fuente: Fuller et al, 2004
2.4. AGENTE CRIOGÉNICO
Tradicionalmente se han empleado como contenedores de muestras a criopreservar
pajuelas de 0.25 ml de capacidad. Para conseguir un descenso rápido de la temperatura, la
técnica más utilizada es la inmersión de dicha pajuela en nitrógeno líquido (-196 ºC). Es un
error pensar que las temperaturas alcanzadas con este procedimiento, son siempre capaces de
vitrificar las muestras [Risco et al, 2007]. La transferencia de calor en las mismas presenta
numerosos problemas, entre ellos el efecto Leidenfrost, que consiste en la formación de una
capa de vapor alrededor de la muestra durante la inmersión en el líquido criogénico desde
temperatura ambiente. Si disminuye este efecto, se reduce la capa de vapor aislante y
conseguimos un incremento en la tasa de enfriamiento.
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Con objeto de solventar este problema durante la ejecución de los experimentos se
plantearon dos opciones:
Emplear como agente criogénico nitrógeno slush es decir nitrógeno líquido subenfriado
(-210ºC) con partículas solidas en él, que es una mezcla bifásica entre sólido y líquido
cuya principal ventaja no solo reside en la diferencia de temperatura con respecto al
nitrógeno líquido sino en la reducción del efecto Leidenfrost.
Figura 6. Efecto Leidenfrost.
Fuente: The modernist cuisine
Utilizar nitrógeno gaseoso como método para actuar sobre la muestra. Para ello se
parte del nitrógeno gaseoso almacenado en condiciones adecuadas de presión y
temperatura en su recipiente contenedor. A través de una unión T en los conductos de
salida, ésta se bifurca ofreciendo dos caminos para el gas, uno de los cuales se hará
pasar por un serpentín inmerso en nitrógeno líquido, logrando un descenso de
temperatura notable del propio gas. Los trayectos seguidos por el gas a diferentes
temperaturas terminan cada uno de ellos en una electroválvula gestionada por el
sistema de control que permite obtener una mezcla a la salida con una temperatura
controlada de forma que se puede implementar una rampa de descenso de
temperatura acorde con el funcionamiento del láser con objeto de lograr una
temperatura estable de 37ºC en la muestra de una forma suave mientras que el
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entorno de la misma puede alcanzar los -150ºC. Este sistema fue el que finalmente se
utilizó dado que ofrece un mayor control del enfriamiento del entorno de la muestra.
Figura 7. Montaje sistema actuación agente criogénico
Fuente: Grupo Cryobiotech.
2.5. MECANISMOS DE DAÑO BIOLÓGICO
Citando al profesor M. Kasai, sobre los daños durante el proceso de criopreservación,
[Kasai et al., 1996]:
“Típicamente podemos encontrarnos seis tipos de daños durante el proceso de
criopreservación:
-
Hielo intracelular
Excesiva toxicidad del crioprotector
Incremento de la presión osmótica
Reducción de la presión osmótica
Daño de fractura
Hielo extracelular
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Durante la vitrificación es fundamental controlar las condiciones de manipulación del
embrión, ya que una leve diferencia en la misma puede suponer una gran disminución de la
tasa de supervivencia obtenida tras la criopreservación, [Kasai et al, 2002]. Además la
concentración de la solución de vitrificación que rodea cada embrión variará dependiendo de la
manipulación al usar los diferentes instrumentos, como por ejemplo la pipeta.
Para encontrar las condiciones óptimas en la criopreservación de un embrión, es
fundamental identificar el mecanismo por el cual se produce el daño en cada protocolo o
procedimiento.
Los embriones corren el riesgo de sufrir varios tipos de daño durante la criopreservación.
Los principales daños son el hielo intracelular y los relativos a un exceso en la concentración de
soluto, dada su elevada toxicidad. La velocidad de enfriamiento, nos determinará a qué tipo de
daño estamos más expuestos. Por ejemplo, si criopreservamos embriones mediante slow
freezing, la principal causa de daño es el hielo intracelular, esto es consecuencia del proceso de
ósmosis y el principio del descenso del punto de congelación, [Wittingham et al, 1972]. Por otra
parte en vitrificación el efecto de la toxicidad en una alta concentración de crioprotector es el
mayor obstáculo [Rall and Fahy, 1985]. Por otro lado, es importante considerar que la
estrategia para disminuir estos daños, es completamente distinta según el tipo de daño.
La introducción del crioprotector en la célula puede producir un tercer tipo de daño, el
aumento de la presión osmótica. Durante el proceso de recalentamiento, en el proceso de
extracción del crioprotector, el agua entra más rápidamente de lo que sale el crioprotector.
Para prevenir esto, empleamos una solución decreciente con sacarosa, junto con soluciones
decrecientes de crioprotector [Kasai et al, 1980; Leibo, 1983]. No obstante una solución con
demasiada sacarosa, puede producir una reducción de la presión osmótica [Pedro et al, 1997].
Además las células corren el riesgo de sufrir hielo extracelular y fractura plana.
El daño de fractura es la disección física de los embriones, el cual se produce por un cambio
no uniforme en el volumen del medio, originado durante un cambio rápido de fase [Kroener and
Luyet, 1996; Rall and Meyer, 1989]. Las células pueden sufrir daños físicos extracelulares, si
durante el proceso de descongelación, existe una parte localizada, que posee una temperatura
muy inferior al resto [Schneider and Mazur, 1987]”.
La formación de hielo comienza en el exterior celular (de -2ºC a -5ºC). Tras este hecho,
dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se producirán distintas consecuencias.
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a) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento, entonces no se forma hielo
intercelular. Si embargo, una excesiva pérdida de agua por parte de la misma puede
resultar letal, ya que da lugar a una reducción de volumen, que en algunos casos
resulta irreversible y a un aumento del hielo extracelular.
b) Si se enfría a una velocidad intermedia entonces sí se produce hielo intracelular y
extracelular, ya que la célula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso
del punto de congelación no llega a ser el necesario para conseguir un resultado
óptimo.
c) Cuando se enfría a velocidades muy altas se produce vitrificación, evitando la
formación de hielo intracelular y disminuyendo el hielo extracelular.
Figura 8. Esquema de los sucesos físicos que ocurren durante el enfriamiento
Fuente: Grupo Cryobiotech.
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
3. PROTOCOLOS CONVECIONALES DE CRIOPRESERVACIÓN
Hay dos enfoques tradicionales para la criopreservación de material biológico: el slow
freezing y la vitrificación siendo esta última la más extendida. Se clasifican según la velocidad
de enfriamiento empleada.
3.1. ENFRIAMIENTO LENTO O “SLOW FREEZING”
Para emplear este método de criopreservación se emplean velocidades de enfriamiento
bajas y consiste en someter al organismo biológico a un descenso de temperatura programado,
controlando las velocidades de enfriamiento, las cuales variarán entre -2ºC/min y -50ºC/min.
De esta forma, se consigue una nucleación controlada formándose hielo extracelular, pero
evitando la formación de hielo intracelular que resulta letal para el organismo.
DAÑOS POR ENFRIAMIENTO LENTO (SLOW FREEZING)
Durante el slow freezing la temperatura disminuye lentamente. El agua intracelular
abandona la célula evitando la formación de hielo intracelular, pero obteniéndose como
consecuencia el aumento del hielo extracelular. La célula se deshidrata, por lo que disminuye
su volumen bruscamente; esto puede provocar deformaciones críticas en la muestra biológica.
Otra consecuencia de la disminución de agua en el medio intracelular, es el aumento de la
concentración de soluto, especialmente de electrolitos Na+, K+, Ca+, Cl+, etc, tóxicos para
nuestro organismo. Lovelock propuso en la década de 1950 que son precisamente estos
electrolitos los responsables de los daños en las células. También expuso que los
crioprotectores al encontrarse disueltos en el interior celular, disminuían la concentración de
los electrolitos, protegiendo al material biológico de la toxicidad de los mismos.
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22
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Figura 9. Deshidratación de un espermatozoide humano a distintas velocidades de enfriamiento. Según la ecuación
de Arrehnius la conductividad decrece con la temperatura, por lo que la deshidratación es mucho menos acusada
con el incremento de la velocidad de enfriamiento [Mazur et al, 1996]
3.2. VITRIFICACIÓN
La vitrificación es la solidificación amorfa debido a un enfriamiento ultrarrápido de la
muestra evitando la formación tanto de hielo intracelular como extracelular. Esta técnica fue
descubierta hace 50 años por C. Polge [Polge et al, 1949] y J. Lovelock [Lovelock, 1953].
La no formación de hielo mediante este procedimiento no es sinónimo de supervivencia
celular, ya que a pesar de no formarse hielo, existen otros factores que perjudican gravemente
la célula. Por una parte está el hecho de que en cierto instante la concentración de sales dentro
de la célula llega ser tan alta que resulta muy tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la
célula su volumen disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales
irreversibles.
Existen diferentes estrategias para lograr la vitrificación, pasando todas ellas por la
utilización de una alta concentración de agentes crioprotectores (etilenglicol (EG),
dimetilsulfóxido (DMSO) o 1,2 propanodiol), hasta 8 M en algunos casos [Kasai et al, 2002].
Además, para conseguir una adecuada vitrificación se necesitan generalmente velocidades de
enfriamiento muy elevadas, del orden de decenas de miles de grados por minuto.
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Generalmente se emplea nitrógeno líquido como solución criogénica. Las modificaciones
en dicha solución también incrementan de forma notable la tasa de enfriamiento. Como
alternativa al nitrógeno líquido, se ha explotado también el uso de propano como solución
criogénica [Steponkus et al, 1990], sin embargo, la permeabilidad de las células a esta molécula
limita su utilización. Otra posibilidad es el uso de mezclas criogénicas como slush (nitrógeno
líquido subenfriado procedente del cambio de fase de nitrógeno líquido) o slurry (mezla de
nitrógeno líquido con diferentes partículas como cobre en polvo o cloruro de sodio,
dependiendo de las características de la muestra a criopreservar). La utilización del nitrógeno
slush reduce el efecto Leidenfrost, es decir disminuye la formación de la capa de vapor que se
forma alrededor de la muestra e impide una transferencia de calor eficiente [Mazur et al,
2004].
La gráfica siguiente muestra la dependencia de la tasa de supervivencia con la velocidad de
enfriamiento. No obstante, la forma de las curvas, el nivel de supervivencia y la velocidad de
enfriamiento para la cual la criopreservación es efectiva depende del tipo celular empleado.
Figura 10. Velocidad de enfriamiento frente a porcentaje de supervivencia
Fuente: Grupo Cryobiotech.
Son tres los parámetros biológicos que tiene especial influencia en la posición y forma de
las curvas de supervivencia: la energía de activación, la permeabilidad del agua y el tamaño de
la célula, o más concretamente la relación volumen/área [Mazur et al, 1996]. Un incremento en
la permeabilidad del agua tiene un efecto comparable a un decremento de la velocidad de
enfriamiento. El efecto que produce el tamaño de la célula es contrario, es decir un incremento
en el ratio volumen-área, reduce la velocidad de enfriamiento requerida para producir hielo
intracelular con la misma probabilidad. Las gráficas siguientes muestran la tasa de
supervivencia de diferentes organismos a distintas velocidades de enfriamiento, observándose
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en ellos un comportamiento en forma de U invertida, característico en este tipo de
representaciones:
Figura 11. Tasa de supervivencia frente a la velocidad de enfriamiento, para óvulos, linfocitos y glóbulos rojos, a 196ºC, en 0.7 a 1 M de Dimetilsulfóxido. [Leibo et al, 1981].
Figura 12. Supervivencia en función de la velocidad de enfriamiento para glóbulos rojos humanos suspendidos en
una solución salina que contiene las concentraciones indicadas de glicerol, enfriadas hasta -196ºC y recalentadas
rápidamente. Datos de Morris y Farrant (1972), Mazur y Miller (1976). Figura modificada de Souzu y Mazur (1978).
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Los mejores resultados se han obtenido mediante el uso de técnicas de vitrificación; no
obstante los mecanismos clásicos de vitrificación requieren del uso de altas concentraciones de
crioprotector, resultando a menudo tóxicas para el organismo a vitrificar.
Existen tipos celulares que no pueden ser criopreservados con facilidad mediante las
técnicas convencionales, como por ejemplo los oocitos humanos, ciertas líneas tumorales, etc.
En estos casos los mejores resultados se han obtenido mediante el uso de técnicas de
vitrificación; no obstante la alta concentración de crioprotector necesaria para vitrificar resulta
frecuentemente tóxica.
Con el presente proyecto se pretende alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del
millón de grados por segundo; esta velocidad de enfriamiento es muy superior a la
convencional alcanzada por la inmersión directa de la muestra en nitrógeno líquido (varios
miles de grados por segundo), y suficiente para vitrificar incluso agua pura.
El método aquí expuesto consistiría en la aplicación de una radiación láser infrarroja sobre
una célula o conjunto de células mediante el objetivo del microscopio de tal forma que se
mantenga la temperatura de la muestra permanentemente a 37ºC, aún cuando todo el medio
extracelular se va enfriando hasta alcanzar -150ºC. Llegados a este punto, se desconecta
súbitamente el láser y la célula vitrifica.
La muestra se sitúa en un capilar de policarbonato (técnica novedosa diseñada por D.
Ramón Risco) que mejoran la transmisión de calor, la velocidad de enfriamiento y reducen la
cantidad de crioprotector necesaria para una vitrificación óptima.
El control de la acción del láser requiere de la medición de la temperatura de la muestra en
cada momento mediante algún procedimiento no invasivo, barajándose el uso de Rodamina B,
el aprovechamiento del efecto Raman y el uso de un termopar.
DAÑOS ASOCIADOS A LA VITRIFICACIÓN
Durante la vitrificación se alcanzan velocidades de enfriamiento muy elevadas. La célula
pierde agua más lentamente, solventándose de esta forma el problema de la alta
concentración de soluto en el interior celular. No obstante, al producirse la congelación del
medio extracelular, se forma una capa de cristales que rodean la célula. Los Aquaporins son
canales proteínicos que permiten la circulación de moléculas de agua. Estos cristales formados
en el exterior de la célula entran a través de los aquaporins generándose hielo intracelular que
puede resultar letal para la muestra. La estructura dendrítica de los mismos rasga y araña los
orgánulos internos e incluso podría llegar a romper la membrana celular. El problema del hielo
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intracelular ha sido analizado en numerosos estudios en el campo de la alimentación, ya que
dichos cristales reducen la calidad de los alimentos, suponiendo importantes pérdidas. En el
caso de óvulos o células madre, estos cristales pueden suponer la muerte celular.
Por otra parte la vitrificación permite mayor flexibilización en su aplicación que el slow
freezing, se efectúa rápidamente, en pocos minutos y elimina la necesidad de mantenimiento
de equipos caros [Liebermann et al, 2004]. Su éxito depende básicamente del tiempo de
exposición al crioprotector, y de la obtención de una técnica depurada y estandarizada, por lo
que se hace imprescindible un personal entrenado adecuadamente.
TIPOS DE CONTENEDORES EMPLEADOS EN LA INMERSIÓN EN NITRÓGENO LÍQUIDO
Para conseguir las velocidades de enfriamiento requeridas para la vitrificación, la técnica
más utilizada es la inmersión de las muestras en nitrógeno líquido. Se han desarrollado diversos
sistemas, la mayoría de ellos busca el diseño de un contendor que consiga una transferencia de
calor óptima.
-
Rejilla de cobre de microscopía electrónica: sobre las que se disponen las gotas de la
suspensión de células. Posteriormente son sumergidas en nitrógeno líquido [Martino et
al, 1996b].
-
“Open Pulled Straws (OPS)” [Vatja et al, 1997] y “Closed Pulled Straws”. Este
contenedor es el más utilizado. Son pajuelas de 0.25 ml de PVC abiertas y cerradas,
respectivamente. Se cargan con la suspensión de material biológico y se sumergen en
nitrógeno líquido. Este método elimina los problemas de contaminación por contacto
directo con el nitrógeno líquido pero reduce la tasa de enfriamiento, dado el gran
volumen de la pajuela. Asimismo las altas concentraciones necesarias para cubrir dicho
volumen pueden resultar tóxicas para el organismo a vitrificar. [Kuwayama et al, 2007].
-
Crioloops, este contenedor se caracteriza por su forma, basada en espirales de nylon
que se impregnan de la solución de vitrificación donde se encuentra la muestra a
criopreservar, en suspensión. Una vez cargado, el anillo se sumerge en nitrógeno
líquido [Lane et al, 1997].
-
“Solid-Surface Vitrification (SSV)”, consiste en lanzar las microgotas de la suspensión
de células sobre una superficie metálica enfriada con nitrógeno líquido. [Dinnyes et al,
2000].
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
-
Cryotop [Hochi et al, 2004; Kuwayama et al, 2005]. Las muestras son cargadas en un
capilar de plástico con un volumen inferior a 0,1 µl y de paredes muy finas. Después se
sumerge en nitrógeno líquido. Con este método se consigue minimizar el volumen de la
muestra y maximizar la velocidad de enfriamiento, permitiendo disminuir la
concentración de crioprotectores.
-
Cryotip [Kuwayama et al, 2005 y 2005b], es una modificación del Cryotop. El capilar se
encentra sellado por ambos extremos para evitar la contaminación por contacto
directo con el nitrógeno líquido. Se ha visto que la probabilidad de contaminación es
baja, por lo que la eficiencia obtenida en ambos casos (Cryotop y Cryotip) es la misma.
-
Cryostage, sistema en el que se coloca la muestra que se desea criopreservar. Dispone
de una ventana transparente a la radiación infrarroja pues como método de
calentamiento de la muestra se utilizaría un láser con longitud de onda de 1440 nm,
con el fin de aprovechar el máximo relativo que la curva de absorción del agua
presenta en esta longitud de onda. El sistema dispone de una serie de entradas y
salidas que se conectarán al sistema de enfriamiento y que internamente se prolonga a
una serie de conductos por los que circulará el refrigerante y proporcionará el entorno
frío que precisa el mecanismo de vitrificación. Esta fue la primera opción que se barajó
como contenedor criogénico y que se propuso en la memoria de solicitud del proyecto
de investigación al instituto de salud “Carlos III” (concedido en 2005).
-
Los capilares de policarbonato (PC), tiene un diámetro exterior de 0.200 mm y un
espesor de 0.016 mm. En la figura siguiente observamos la diferencia de volumen entre
el capilar y un OPS con un diámetro de 0.800 mm y espesor de pared de 0.075 mm. En
el caso del Cryotop, el diámetro es 0.400 mm y 0.100 mm de espesor. La reducción de
volumen que supone el capilar respecto a los otros contenedores, se traduce en una
eficiente transferencia de calor, unas 20 veces [Risco et al, 2007]. Para albergar la
muestra se optó por el uso de este tipo de capilares.
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Figura 13. Comparación entre el capilar de policarbonato y otros contenedores utilizados para criopreservar.
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CAPÍTULO II
MODELADO MATEMÁTICO DEL SISTEMA DE
VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO
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1. INTRODUCCIÓN
Existen tipos celulares que no pueden ser criopreservados con facilidad mediante las
técnicas convencionales tales como el slow freezing. En estos casos los mejores resultados se
han obtenido mediante el uso de técnicas de vitrificación; no obstante la alta concentración de
crioprotector necesaria para vitrificar resulta frecuentemente tóxica.
En el presente apartado se expondrán diversos modelos matemáticos del fenómeno físico
de vitrificación mediante una técnica basada en el uso de radiación láser. Con esta técnica se
pretende alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo,
muy superior a la convencional obtenida por la inmersión directa de la muestra en nitrógeno
líquido (varios miles de grados por segundo), y suficiente para vitrificar incluso agua pura.
Como se ha indicado anteriormente el método aquí expuesto consistiría en la aplicación de
una radiación láser infrarroja sobre una célula o conjunto de células aprovechando el objetivo
del microscopio de tal forma que se mantenga la temperatura de la muestra
permanentemente a 37ºC, aún cuando todo el medio extracelular se va enfriando hasta
alcanzar -150ºC. Llegados a este punto, se desconecta súbitamente el láser y la célula vitrifica.
Es la evolución de la temperatura en diferentes puntos de la muestra a lo largo del tiempo lo
que se modelará a continuación, extrayendo de tales resultados una confirmación numérica de
la alta velocidad de enfriamiento que se alcanza con este procedimiento.
Como hipótesis de partida supondremos que el medio criogénico en que se situará la
muestra se encuentra en estado de reposo de tal forma que el único mecanismo de
transferencia de calor que se contemplará será el de conducción. Así mismo se considerarán
diferentes modelos matemáticos para el perfil de calentamiento de la luz emitida por el láser
en toda su zona de influencia, desde un modelo uniforme hasta un modelo de perfil gaussiano
más cercano a la realidad.
Debido que la célula es básicamente una disolución de agua y sales encerrada por una
membrana semipermeable, y teniendo en cuenta que el primer paso de los experimentos con
esta técnica se desarrollan con agua pura, modelaremos las muestras como si fueran de agua,
al objeto de obtener una estimación de las velocidades de transferencia de datos con la técnica
antes expuesta. A estos efectos la consideraremos como un disco plano.
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31
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2. ECUACIÓN DE TRANSFERENCIA DEL CALOR
La transferencia de calor es aquella ciencia que busca predecir la transferencia de energía
que puede ocurrir entre cuerpos materiales, como resultado de una diferencia de temperatura.
La termodinámica por su parte proporciona un nombre a esta transferencia de energía: calor.
La experiencia ha demostrado que cuando existe un gradiente (una variación) de
temperatura en un cuerpo tiene lugar una transferencia de energía desde la región de mayor a
la de menor temperatura. En esta situación la energía es transferida por conducción y la
rapidez de transferencia de energía por unidad de área resulta proporcional al gradiente
normal de dicha temperatura:
q
∂T
∝
∂x
A
Una vez introducida la constante de proporcionalidad correspondiente, la expresión se
transforma en:
$
%&'
(
(
Donde q es la rapidez de transferencia de calor y ∂T)∂x es el gradiente de temperatura en
la dirección del flujo de calor. A la constante de proporcionalidad positiva k se denomina como
conductividad térmica del material, y el signo menos de la expresión se inserta con objeto de
que se satisfaga el segundo principio de la termodinámica, es decir, el calor deberá fluir hacia
abajo en la escala de temperatura (de temperaturas altas a temperaturas bajas). A la expresión
anteriormente referida se la denomina habitualmente como ley de conducción de Fourier en
honor al físico matemático Joseph Fourier, quien realizó importantes contribuciones en el
tratamiento analítico de la transferencia de calor por conducción.
A partir de la expresión que recoge la ley de Fourier de la transferencia de calor nos
planteamos el problema de determinar la ecuación básica que gobierna la transferencia de
calor en un sólido.
Considérese el sistema unidimensional que aparece reflejado en la figura 1. Si el sistema se
encuentra en un estado estacionario, es decir la temperatura no cambia con el tiempo, la
resolución del problema tan solo exige integrar la ecuación de conducción de Fourier y sustituir
los valores adecuados para resolverla para la cantidad deseada. No obstante si la temperatura
cambia con el tiempo, o si hay fuentes de calor o sumideros dentro del sólido, la situación se
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torna algo más compleja. Consideremos el caso general en el que la temperatura puede estar
cambiando con el tiempo y dentro del cuerpo puede haber fuentes de calor. Para el elemento
de espesor dx se puede realizar el siguiente balance de energía, valorando la cantidad de
energía que entra, la que sale y a que se genera:
Energía conducida en la cara izquierda + calor generado dentro del elemento = cambio en la
energía interna + energía conducida fuera de la cara derecha
Estas cantidades de energía están dadas de la siguiente manera:
Energía en la cara izquierda: $*
%&'
+,
+*
Energía generada dentro del elemento: $- '.
Cambio en la energía interna: / '
+,
+0
.
Energía hacia fuera de la cara derecha:
$*12*
Donde:
%&'
(
|
( *12*
%' 4&
(
(
(
5 6& 7 . 8
(
(
(
$- :refleja la energía generada por unidad de volumen.
c: calor específico del material
/: densidad
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Figura 14. Volumen elemental para el análisis de la conducción de calor unidimensional
La combinación de los elementos expresados antes nos da:
%&'
(
5 $'.
(
/ '
- (
(
(
(
% ' 4&
5 6& 7 . 8
(
(:
(
(
Simplificando la expresión anterior obtenemos:
(
(
6& 7 5 $(
(
/
(
(:
Esta es la ecuación de conducción de calor unidimensional (tengamos en cuenta que solo
se contempla la variación en la dirección x). Con objeto de generalizar dicha expresión a las tres
dimensiones (x, y, z) realizaremos el balance de energía considerando el calor conducido hacia
adentro y hacia afuera de un volumen unitario, en las tres direcciones coordenadas, tal y como
se muestra a continuación:
$* 5 $; 5 $< 5 $=>?
$*12* 5 $;12; 5 $<12< 5 .@
.:
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Figura 15. Volumen elemental para el análisis de la conducción en coordenadas cartesianas
Y las cantidades de energía están expresadas por
$*
%&.A.B
(
(
%&. .A
(
(A
%&. .A
(
(B
$*12*
% 4&
(
(
(
5 6& 7 . 8 .A.B
(
(
(
$;12;
% 4&
(
(
(
5 6& 7 .A8 . .B
(A (A (
$<12<
% 4&
(
(
(
5 6& 7 .B8 . .A
(B (B (B
$;
$<
$=>?
$- . .A.B
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
.@
.:
/ . .A.B
(
(:
De manera que la ecuación general de conducción de calor tridimensional es:
(
(
(
(
(
(
6& 7 5 6& 7 5 6& 7 5 $(
(
(A (A
(B (B
/
(
(:
Suponiendo la conductividad térmica constante, la ecuación anterior se escribe como:
Donde la cantidad C
(
(
5
(
(
$5
5
&
(A
(B
1 (
C (:
&)/ se denomina difusividad térmica del material. Cuanto mayor
sea el valor del citado parámetro, tanto más rápida será la difusión de calor a través del
material. Esto puede observarse examinando los parámetros que conforman C.
Un elevado valor de C puede ser el resultado de un alto valor de conductividad
térmica, que indicará una elevada rapidez de transferencia de energía o de un valor
bajo de la capacidad calorífica / .
Un valor bajo de la capacidad calorífica significará que se absorberá dentro del material
una menor cantidad de la energía en movimiento y será utilizada para aumentar la
temperatura del material; por tanto, habrá más energía disponible de transferencias
ulteriores.
En las expresiones anteriores, la expresión para la derivada en x + dx se ha descrito en la
forma de una expansión en serie de Taylor empleando para el desarrollo tan solo los dos
primeros términos de la serie.
Si bien la expresión de la ecuación de transferencia de calor se ha expresado por defecto en
coordenadas cartesianas, es posible adecuar la expresión de la ecuación a las coordenadas que
mejor se adapten a la geometría del problema a resolver, tal y como podremos comprobar más
adelante, siendo las más habituales la expresión en coordenadas cilíndricas y esféricas.
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36
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
En coordenadas cilíndricas:
Tras aplicar la transformación de coordenadas cartesianas a coordenadas cilíndricas,
mediante la aplicación de las expresiones de equivalencia:
A
Obtenemos como resultado:
(
(
5
B
D
DE
EF
B
1(
1 (
(
$5
5
5
&
(
(E
(B
1 (
C (:
Figura 16. Volumen elemental para el análisis de la conducción en coordenadas cilíndricas
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implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
En coordenadas esféricas:
Tras aplicar la transformación de coordenadas cartesianas a coordenadas cilíndricas,
mediante la aplicación de las expresiones de equivalencia:
A
B
D
DGD E
GD EF
B DE
Obtenemos como resultado:
(
(
5
1(
1(
(
$5
5
5
&
(
(G
(B
1 (
C (:
Figura 17. Volumen elemental para el análisis de la conducción en coordenadas esféricas
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
3. MODELOS SISTEMA VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA
3.1. MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER UNIFORME
Como primer modelo de la situación física que nos ocupa vamos a considerar una situación
bidimensional en la que tendremos un disco circular de radio Rc, que modelará la célula, que se
halla irradiada por un láser, (al que supondremos un radio de influencia R0 algo superior al
tamaño de la muestra para disponer de un margen de seguridad entre la muestra y el entorno)
de forma que supondremos que ha alcanzado una temperatura estacionaria igual a Tint en
todos los puntos de su superficie. El soporte de la muestra es enfriada (supondremos situada
en el interior de una cryostage o dentro de los capilares de policarbonato) con alguna de las
técnicas disponibles, a una temperatura Text. Podemos depreciar efectos de borde y considerar
la situación tal y como se muestra en la ecuación siguiente.
THr, θ, tM
N
O?
>*
D P
D R
Q
Q
De esta forma mantenemos a una temperatura habitable tanto la muestra como una zona
del entorno de la misma, dado que el laser no se puede ajustar con tanta precisión al borde
exacto de la muestra. La ecuación de transferencia del calor será, tal y como se indicó
anteriormente:
S THr, θ, tM
1 ∂THr, θ, tM
∝
∂t
Dada la geometría cilíndrica del problema se representará la dicha ecuación en
coordenadas cilíndricas:
(
H , G, TM 1 ( H , G, TM
1 ( H , G, TM
5 5 (
(
(G
1 ( H , G, TM
C
(T
Donde α es una propiedad física conocida como difusividad térmica, que en el caso del
agua (H2O) tiene un valor de 1,48·10-7 m2/s.
Con objeto de simplificar el cálculo y evitar que los resultados dependan de valores y
unidades concretas de las variables físicas vamos a proceder a adimensionalizar previamente
las mismas, de la siguiente forma:
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Variable
Original
r
G
t
T
Variable
adimensional
Rango
U0, ∞W
R=
U0, 2\W
Ω
U0, ∞W
U0, ∞W
_
:=
Rango
X
U0, 1W
YZ
G
2\
U0, 1W
∝
U0, ∞W
YZ^
% >*
O? % >*
U0, 1W
Tabla 1. Variables adimensionalizadas para resolver el problema
Así pues realizando los cambios de variable propuestos en la tabla anterior obtenemos que:
H
`a,
%
1 ( _
1
5
H `a, %
Q
Q(
1
(_
H `a, % bc, M
C
Q (:
bc, M
bc, M
(_
1
5
H
Q(
Q
`a,
%
bc, M
( _
H2\M (Ω
Simplificando la expresión anterior obtenemos la expresión adimensionalizada de la
ecuación diferencial de transferencia de calor en coordenadas cilíndricas:
( _H , Ω, :M 1 (_H , Ω, :M
1 ( _H , Ω, :M
5 5 (
(
(G
(_H , Ω, :M
(:
Donde las variables H , Ω, :M son adimensionales, e independientes del sistema de
unidades elegido. Dada la simetría cilíndrica del problema, al haber modelado la muestra a
irradiar como un círculo plano, la temperatura adimensional _ resulta independiente de la
variable Ω, por lo que la ecuación diferencial en derivadas parciales se reduce a:
( _H , :M 1 (_H , :M
5 (
(
(_H , :M
(:
Dadas las características de la ecuación diferencial se aplicará el método de la separación
de variables, por lo que la función de temperatura se descompondrá como:
_H , :M
ΓH MeH:M
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40
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Sustituyendo esta expresión en la ecuación diferencial anterior:
( ΓH MeH:M 1 (ΓH MeH:M
5 (
(
(ΓH MeH:M
(:
Sacando factor común y agrupando adecuadamente los términos:
eH:M f
( ΓH M 1 (ΓH M
5 g
(
(
ΓH M
(eH:M
(:
Obtenemos:
1 ( ΓH M 1 (ΓH M
5 f
g
ΓH M (
(
1 (eH:M
eH:M (:
Como puede comprobarse el término de la izquierda de la igualdad anterior depende
exclusivamente de la variable radial (R), mientras que el miembro de la derecha depende
únicamente de la variable temporal (:M, lo cual únicamente puede ser cierto para todo valor de
R y :si ambos miembros son constantes, e iguales a –h.
Dado que el segundo miembro de la ecuación depende únicamente de la variable
temporal, la ecuación diferencial en derivadas parciales se transforma en una ecuación
diferencial lineal ordinaria:
1 .eH:M
eH:M .:
%h
La solución de la ecuación anterior presenta un comportamiento exponencial cuya
expresión es la que se indica a continuación:
eH:M
'
j0
Una vez resuelto el comportamiento del término temporal pasemos a resolver el término
radial. Al igual que ocurría con el otro miembro de la igualdad, tan solo depende de una
variable por lo que la ecuación diferencial en derivadas parciales se reduce a una ecuación
diferencial ordinaria.
( ΓH M 1 (ΓH M
5 (
(
%hΓH M
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41
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Desplazando todos los términos al primer miembro de la igualdad obtenemos:
( ΓH M 1 (ΓH M
5 5 hΓH M
(
(
0
Multiplicando por R2 ambos miembros de la igualdad obtenemos:
( ΓH M
(ΓH M
5 5h
(
(
ΓH M
0
Esta ecuación diferencial corresponde con la denominada como ecuación diferencial de
Bessel, cuya resolución se abordará empleando el método de Frobenius; este método consiste
en considerar que la solución de la ecuación anterior se puede expresar como una serie de
potencias, reduciendo el problema a determinar los coeficientes o términos de dicha serie. La
expresión general de una solución en serie de potencias del tipo Frobenius será:
ΓH M
k
1m
l
?nQ
?
?
Con objeto de sustituir en la ecuación diferencial anterior calculemos previamente la
derivada primera y segunda de la serie de potencias anterior:
d ΓH M
dR
dΓH M
dR
&H& % 1M
5
k
1m
k
&
1m
l
?nQ
l H % 1M
?nQ
k q
?
?
?
1m
l
?nQ
5 &
?
?
?
5
k q
1m
k
l ?nQ
1m
l ?nQ
?
?
? q
? q
5 &
k q
1m
l ?nQ
?
? q
Sustituyendo las expresiones anteriores en la ecuación diferencial de Bessel, obtenemos:
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42
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
r&H& % 1M
1m
k
5
l
?nQ
k
?
1m
5 &
k q
l H % 1M
?nQ
5 h
?
k1
1m
l
?nQ
?
?
?
1m
l ?nQ
?
? q
s 5 r&
?
0
5 &
k q
1m
l
k q
?nQ
1m
l ?nQ
?
?
? q
?
5
?
1m
l
?nQ
?
? q
s
Desarrollando los productos de la expresión anterior obtenemos:
&H& % 1M
k
1m
l
?nQ
?
5
?
5 &
k1
5 h
k1
1m
k1q
1m
l ?nQ
l H % 1M
?nQ
1m
l
?nQ
?
?
? q
?
?
?
0
5 &
5 &
k1q
k
1m
l
1m
l ?nQ
?nQ
?
?
?
5
? q
k1q
1m
l ?nQ
?
? q
A continuación agrupamos los términos:
1m
&H& % 1M l
?nQ
?
?1k
1m
5 2& l 1m
5 h l
?nQ
?
?nQ
?
?1k1
?1k
0
1m
5 l H % 1M
?nQ
?
?1k
1m
5 lH 5 &M
?nQ
?
?1k
En el último término de la expresión anterior, realizamos un cambio de variable m=n-2, con
objeto de que las potencias de la variable R queden todas con el mismo exponente.
1m
&H& % 1M l
?nQ
?
?1k
1m
5 2& l 1m
5 h l
tn
t
?nQ
?
t1k
?1k
0
1m
5 l H % 1M
?nQ
?
?1k
1m
5 lH 5 &M
?nQ
?
?1k
Descompongamos la expresión anterior valorando los sumatorios para n=0 y n= 1;
asimismo en el índice del último miembro de la expresión anterior realizamos el cambio n=m.
así obtenemos:
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43
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
&H& % 1MU
k
Q
5
k1q W
q
5 2&U
1m
5 &H& % 1M l
?n
1m
5 lH 5 &M
?n
k1q W
q
?1k
?
?1k
?
5 U&
Q
1m
k
5 2& l 1m
5 h l
5 H& 5 1M
?n
k1q W
5 l H % 1M
0
?1k
?
?n
?1k
?
q
1m
?n
?
?1k
Desarrollando los productos y agrupando en las diferentes potencias de R, obtenemos:
U
Q &H&
QW
1m
% 1M 5 &
k
5U
q &H&
% 1M 5 2&
5 lUH&H& % 1M 5 2& 5
?n
q
5
5 &M
q H&
?
5 1MW
5 h
?
k1q
W
?1k
0
Simplificando se llega a que la ecuación anterior se reduce a:
&
k
Q
q H&
5
1m
5 2& M
5 2& 5 1M 5 lH& 5 ?n
?
5 h
?
0
Para que la igualdad anterior se cumpla los tres sumandos de la ecuación deben ser nulos,
por lo que se plantean las siguientes igualdades:
H1M&
0; dedonde&
Q
H2MH& 5 2& 5 1M
H3MH& 5 2& 5 1M
q
?
0∀
Q
0; dedonde
5 h
?
0;
q
?
0
5 h
0
?
Desarrollemos la ecuación en diferencias finitas, dando valores a n, con objeto de obtener
una expresión cerrada para los coeficientes an.
2; 4
3; 9
5 h
€
4; 16
5 h
‚
Q
q
5 h
h
% 4
0;
0;
0;
h
% 9
€
‚
%
Q ;
q ; €
h
16
;
%h
0
‚
1 ?1
|2 }
H0 5 1M!
h
4 ƒ 16
Q
h 1 Q1‚
|2}
2! H0 5 2M!
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44
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
5; 25
6; 36
…
†
5 h
5 h
€
‚
0;
0;
%
…
%
†
h
25
€ ; …
h
36
‚ ; †
0
%h
36 ƒ 4 ƒ 16
€
1 Q1†
|2}
%h€ 3! H0 5 3M!
Q
…………………………………………………………………
Del desarrollo anterior se puede concluir que los coeficientes del desarrollo en serie de
Frobenius de la ecuación de transferencia del calor se ajustan a la expresión siguiente:
Š̂
1 Q1?
|2}
?
, D D
H%hM !
!
|
}
|
}
‰̂
2
2
0,
D
D ‹
‡
?
Por lo que la solución de la componente radial de la ecuación diferencial de transferencia
del calor se expresará en series de Frobenius como se indica a continuación:
ΓH M
k
1m
l
?nQ
?
?
k
1m
l
?ΥX
?
?
5
k
1m
l
?OtΥX
?
?
Simplificando obtenemos como solución:
ΓH M
1m
H%1MŽ
1
l
6 √h 7
H•M! H0 5 •M! 2
ŽnQ
Ž 1 Ž
H%hM | }
2
l
2•
2•
ŽnQ | } ! | } !
2
2
1m
?
Ž1Q
Expresión que puede identificarse con el desarrollo en serie de la función de Bessel de
primera especie y orden 0, por lo que la expresión puede reducirse como sigue:
ΓH M
‘Q √h
Así pues la evolución espacio temporal de la temperatura adimensional de la muestra
desde el instante en que desaparece la acción de la luz láser y queda sometida a temperaturas
extremas viene dada por:
_H , :M
'‘Q √h
j0
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45
Modelado matemático e
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Una vez obtenida la solución básica de la ecuación diferencial en derivadas parciales, válida
para todos los valores del parámetro λ, aplicaremos la condición de contorno espacial
consistente en imponer que más allá de los límites de la zona de influencia del láser (R=1), la
temperatura adimensional es nula mientras que en el interior de dicha zona (y por tanto en el
interior de la muestra) se mantiene a valor 1, es decir que se cumple la expresión del perfil de
temperatura adimensionalizada un instante antes de apagar el laser,:
_H , :M
N
1D P 1
0D R 1
Las condiciones de contorno a aplicar quedan como se indica:
_H , 0M|Ynq
'‘Q √h
jQ
|Ynq
0dedonde‘Q √h
|Ynq
0
Para que la función de Bessel de orden cero sea nula es preciso que:
√h |Ynq
•Q,? , ∀ ∈ “
Donde j0,n representa la raíz n-ésima de la función de Bessel de orden 0. Así pues el
parámetro λ queda acotado como se muestra a continuación:
h
•Q,? , ∀ ∈ “
De aquí se puede concluir que la solución de la ecuación de transferencia de calor se puede
expresar como combinación lineal de diferentes términos (tantos como raíces presenta la
función de Bessel. Así pues quedaría:
_H , :M
1m
l '? ‘Q •?,Q
?nq
^
ŽZ,”
0
Una vez obtenida la solución básica de la ecuación diferencial en derivadas parciales, válida
para todo los valores del parámetro λ aplicaremos la condición de contorno restante y que
consiste en imponer que en el instante τ=0, cuando la luz laser que se apaga la temperatura de
la zona de influencia del láser (y con ella la muestra a criopreservar) se encuentra a TINT, o lo
que es equivalente a que la temperatura adimensional sea igual a 1 para dicha zona:
_H , :M|0nQ
1m
1; l '? ‘Q •Q,?
?nq
^ Q
ŽZ,”
1
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46
Modelado matemático e
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Por lo que se reducirá el problema a calcular los coeficientes An tales que satisfagan la
expresión:
1m
l '? ‘Q •Q,?
1
?nq
Para resolver esta presión acudimos al apéndice I, en el que se muestran las propiedades
principales de las funciones de Bessel, entre las que encontramos la que sigue:
1m
1
2' l
Œ
Œ
• ‘
?nq Œ,? Œ1q
•Œ,?
•Q,?
‘Œ 6
7
'
Tomando en la expresión anterior p = 0 y A=1, obtenemos:
1
1m
1
2l
• ‘
?nq Q,? q
•Q,?
‘Q •Q,?
De donde identificando términos con la expresión de nuestro desarrollo nos permite
obtener el valor de los coeficientes An:
'?
2
•Q,? ‘q •Q,?
Por lo que finalmente la expresión de la evolución espacio-temporal de la temperatura
adimensional de la muestra queda como se indica a continuación:
_H , :M
1m
l
2
• ‘
?nq Q,? q
•Q,?
‘Q •?,Q
^
ŽZ,”
0
Con objeto de visualizar la evolución de la temperatura de los diferentes puntos del disco,
una vez que se procede al apagado del láser, y consecuentemente la muestra queda expuesta a
las bajas temperaturas del entorno que lo rodea necesitamos crear utilizando el software
Matlab diferentes funciones auxiliares que nos serán de utilidad.
Dado que la expresión final de la evolución espacio-temporal de la temperatura requiere
evaluar la función de Bessel de primera especie y orden cero en puntos proporcionales a las
raíces de la propia función, el primer paso consiste en la determinación de tales puntos. Para
ello se programa la función raizBesselJ0(N, h).
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47
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
function R = raizBesselJ0(N, h)
%Función que calcula los N primeros ceros de la función J0(x) tomando como paso de
iteración el parámetro h. Devolverá como resultado un vector con los ceros buscados de la
función de Bessel de primera especie y orden 0. El valor típico para h será 0.01
a = 0;
b = 0;
for i=1:1:N
while sign(Bessel(0,a)) * sign(Bessel(0,b)) > -1
b = b + h;
end
x = a:h:b;
R(i) = fzero(inline(‘BesselJ(0,x)’), [a,b]);
A = b;
end
En la expresión anterior indicar que:
Bessel(0,a) es una función propia de Matlab, proporciona el valor de la función de
Bessel de primera especie y orden cero en el punto x = a; esto es J0(a).
raizBesselJ0(N,h) proporciona las N primeras raíces de la función de Bessel de primera
especie y orden cero. Se tomará como valor típico para el parámetro h el valor 0,01.
En la siguiente gráfica se muestra el comportamiento matemático de la función de Bessel
de orden cero en el intervalo [0, 20], observando su comportamiento oscilatorio amortiguado
característico, así como los cortes de la función con el eje de ordenadas.
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48
Modelado matemático e
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Figura 18. Representación de la función de Bessel de primera especie y orden cero en el intervalo [0,20]
A modo de ejemplo, la ejecución de la función raizBesselJ0(6, 0.01) proporciona los
valores:
Orden
Raíz
1º
2º
3º
4º
5º
6º
2.4048
5.5201
8.6537
11.7915
14.9309
18.0711
Tabla 2. Primeras raíces de la función de Bessel de primera especie y orden cero
Una vez disponemos de esta función auxiliar que nos permite calcular las raíces jn0 ya es
posible implementar un código Matlab en el que se simule la función que modela la evolución
de la temperatura en los diferentes puntos del disco que conforma la muestra sometida a la
acción del láser, una vez desaparece el efecto de éste. Para ello se implementa la función [R,T]
= discoRconst(N, h, tfin).
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49
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function [R,T] = discoRconst(N, h, tfin)
%function [R,T] = discoRconst(N, h, tfin) nos va a permitir representar información del
campo de temperaturas resultante de resolver la ecuación de calor para el modelo uniforme
de calentamiento de la muestra por parte del láser. Para simplificar el resultado e
independizarlas del sistema de unidades las variables se van a adimensionalizar.
% N:
Numero de sumandos para el desarrollo en serie
% h:
Precisión e la variable radial
% tfin: Instante de tiempo hasta el que se desea estudiar la evolución temporal
%Obtengamos en primer lugar las N raices de la funcion Jo[x] que nos interesan
j0 = raizBesselJ(N,0.01);
%inicializamos las variables en primer lugar
B=0;i=1;k=1;r=1;
'Calculando....'
for R=0:h:1
for tau=0:0.01:tfin
for n=1:1:N
B = B + (2/(j0(n)*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R)*exp(-1*tau*j0(n)^2);
end
T(r,i) = B;
i=i+1;
B=0;
end
r=r+1;
i=1;
end
R = 0:h:1;
'Modelo generado...'
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50
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
El programa anterior genera una matriz en la que se recoge para cada punto Ri de la zona
de influencia del láser (incluyendo la zona ocupada por la muestra) el valor de la temperatura
_H O , :O M, es decir un campo de temperaturas que evoluciona en el tiempo una vez ha cesado la
influencia del láser como consecuencia de la transferencia de calor hasta zonas más frías del
medio. La precisión del modelo vendrá controlado por los parámetros N (número de sumandos
incluidos en la expresión) y del parámetro h (determina lo densa que será la nube de puntos de
la muestra en que se calcula la temperatura).
A modo de ejemplo determinemos la evolución temporal en cuatro puntos diferentes de la
región; concretamente en R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75. Como puede verse en las gráficas
siguientes, las curvas denotan una rápida evolución desde la temperatura interior (_ = 1) hasta
la temperatura exterior (_ = 0), observándose que la rapidez con que se alcanza esta
temperatura aumenta a medida que nos acercamos al extremo de la zona. Esto puede
comprobarse con mayor facilidad superponiendo las diferentes curvas sobre unos ejes
comunes.
Figura 19. Evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75
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51
Modelado matemático e
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Figura 20. Superposición de las curvas de evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75
Una vez que disponemos del campo de temperaturas de la muestra almacenado para
distintos instantes de tiempo, y hemos observado la tendencia de la misma a alcanzar la
temperatura del medio que la rodea, el siguiente paso es llevar a cabo una estimación de cuán
rápido se alcanza dicha temperatura; este parámetro se conoce como velocidad de
enfriamiento.
Hay muchos tipos de células para los que aún no se han desarrollado protocolos aceptables
de criopreservación dado que la concentración de crioprotector requerido para evitar la
formación de hielo intracelular es demasiado alta para que muchas células los toleren. Entre los
principales tipos de célula para los que aún no se han desarrollado protocolos realizables de
congelación se encuentran los hepatocitos, los óvulos humanos, granulocitos, etc.
Así pues en el presente proyecto tratamos de profundizar en un método alternativo de
criopreservación al uso de crioprotectores que permita evitar la formación de cristales de hielo;
la opción que se plantea es mantener una muestra celular a una temperatura habitable en un
entorno que alcanza una temperatura muy baja (utilizando por ejemplo nitrógeno líquido),
mediante la aplicación de un láser de potencia adecuada (controlada a través de mediciones de
la temperatura de la muestra, tal y como se verá más adelante). En un determinado instante se
procede al apagado del láser y la muestra queda sometida a unas temperaturas muy bajas, de
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52
Modelado matemático e
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tal forma que por transferencia de calor se irá enfriando hasta alcanzar la temperatura del
entorno. Como se va a poner de manifiesto en el presente documento esto tiene lugar a una
velocidad tan elevada que no se llega a producir el fenómeno de cristalización.
Como su propio nombre indica denominamos velocidad o tasa de enfriamiento a la rapidez
con que la temperatura de la muestra varía en el tiempo. Si ésta es suficientemente rápida
logramos evitar la formación de cristales que dañan el material a preservar, supuesta la
temperatura interior de la muestra constante en todos sus puntos como consecuencia del
efecto del láser.
Dada la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura una vez el efecto de
calentamiento del láser ha desaparecido y la temperatura de la muestra tiende a equilibrarse
con el entorno que la rodea:
_H , :M
1m
l
2
• ‘
?nq Q,? q
•Q,?
‘Q •?,Q
^
ŽZ,”
0
La velocidad de enfriamiento se obtendrá derivando la expresión anterior respecto a la
variable temporal:
•H , :M
(_H , :M
(:
1m
%2 l
‘
?nq q
•Q,?
•Q,?
‘Q •?,Q
^
ŽZ,”
0
Expresión que obviamente depende tanto del tiempo como del punto de la muestra que
consideremos.
Dado el comportamiento asintótico de las curvas un procedimiento adecuado para lograr
una estimación promedio de la velocidad de enfriamiento consiste en calcular la pendiente de
la línea recta en la parte central de la curva, en una banda del 60%, concretamente en la zona
de la curva comprendida entre el 20% y el 80% del valor máximo de la temperatura
adimensionalizada.
Para obtener la evolución de este parámetro en toda la zona de influencia del láser (dada
su simetría circular nos centraremos tan solo en una sección radial de la muestra), en primer
lugar implementaremos una función que nos permita calcular el valor más aproximado posible
a un valor dado dentro de la curva de evolución de temporal de temperaturas. Esta función
será x = buscaTemperatura(A, T, t) implementada en Matlab a través del siguiente código:
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53
Modelado matemático e
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function x = buscaTemperatura(A,T,tiempo)
%function x = buscaTemperatura(A,T,tau,tol) buscar el valor A en el vector T, o al menos el
que más se acerque y devolverá el valor del instante de tiempo correspondiente
d=1;
while T(d)>A
d = d + 1;
end
x = tiempo(d);
Utilizando esta función auxiliar e incorporándola a la función de cálculo del modelo de
temperatura, es posible determinar para diferentes puntos a lo largo de la coordenada radial la
velocidad de enfriamiento adimensional como la pendiente de una recta que linealiza el
modelo en una banda del 60% del valor máximo, esto es:
•H , :M
0.8_H O , 0M % 0.2_H O , 0M
: % :q
0.6
_H O , 0M
: % :q
Con objeto de sistematizar la determinación de la velocidad de enfriamiento
implementamos en Matlab el código de la función [R, tasa] = tasaRconst(N, h, tfin).
function [R, tasa] = tasaRconst(N,h, tfin)
%function [R,tasa] = tasaRconst(N, h, tfin) nos va a permitir representar información de la
tasa de enfriamiento adimensionalizada de la muestra a lo largo de un eje radial, empleando
un modelo uniforme de perfil del láser
%
%
%
%
%
R:
tasa:
N:
h:
tfin:
Puntos de la coordenada radial en los que se evalúa la tasa de enfriamiento
Tasa de enfriamiento para cada uno de los puntos del disco
Numero de sumandos para el desarrollo en serie
Precisión en la variable temporal
tiempo adimensional en el que se estudiará la evolución de la temperatura
%Obtengamos en primer lugar las N raíces de la función Jo[x] que nos interesan
j0 = raizBesselJ(N,0.01);
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54
Modelado matemático e
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%Calculemos entonces en el punto R=1, por simplicidad
B=0;i=1;k=1;r=1;
t = [0:0.01:tfin];
'Calculando....'
for R=0:h:1
for tau=0:0.01:tfin
for n=1:1:N
B = B + (2/(j0(n)*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R)*exp(-1*tau*j0(n)^2);
end
T(r,i) = B;
i=i+1;
B=0;
end
tau1 = buscaTemperatura(0.8*T(r,1),T(r,:),t);
tau2 = buscaTemperatura(0.2*T(r,1),T(r,:),t);
tasa(k) = 0.6*T(r,1)/(tau2-tau1);
k=k+1;
r=r+1;
i=1;
end
R = 0:h:1;
'Modelo generado...'
A partir de lo anterior obtenemos las curvas que se muestran a continuación, pudiendo
observar las siguientes peculiaridades:
Permanece prácticamente constante a lo largo de toda la coordenada radial, dado que
todos los puntos de la muestra, con el modelo elegido, se encuentran inicialmente a la
misma temperatura.
En el entorno de R=1 se observa que la velocidad de enfriamiento tiende a infinito. Esto
es debido a la naturaleza del modelo, dado que en R=1 la función no es continua ni
derivable, existiendo una discontinuidad de salto. Debido a esta discontinuidad el
modelo no funciona adecuadamente en su contorno.
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55
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Debido a que la serie se ha truncado a un valor limitado de N el comportamiento
entorno a cero del presente modelo no se ajusta correctamente a menos que el
número de puntos que tomemos sea muy alto.
Figura 21. Evolución de la tasa de enfriamiento en función de la coordenada radial
Como es posible ver en la primera de las dos curvas que se muestran a continuación,
existen una serie de oscilaciones entorno a R=0, debido a que se ha utilizado un número
limitado de puntos N. Podemos observar en la segunda de las curvas que con un número
suficiente de puntos se obtiene una curva mucho más suave:
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56
Modelado matemático e
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Figura 22. Evolución de la tasa de enfriamiento en torno a R = 0. Oscilaciones ocasionadas por el uso de un número
finito de puntos
Figura 23. Evolución de la tasa de enfriamiento en función de la coordenada radial para N=500 puntos
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57
Modelado matemático e
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Con objeto de comprobar la influencia del número de puntos de cálculo elegido para
obtener el modelo matricial del campo de temperaturas de la muestra se observa en la figura
siguiente la aproximación al comportamiento de la temperatura en t=0 (justo tras apagar el
laser) a lo largo de la coordenada radial para N=1, 5, 20 y 100 puntos de cálculo. Podemos
observar como a medida que el parámetro N crece la curva se va aproximando cada vez más a
un valor uniforme, a excepción del entorno cercano de R=1 donde la discontinuidad de salto
origina que el modelo no funcione del todo correctamente.
Figura 24. Temperatura adimensional en función de la coordenada radial para diferente número de puntos de
cálculo (N=1, N=5, N=20 y N=300)
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58
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implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
3.2. MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER CUADRÁTICO
El objeto del presente apartado es alcanzar un modelo más cercano a la realidad,
contemplando para ello que haz laser no calienta por igual a todos los puntos de la muestra,
considerando una distribución de temperaturas en forma de parábola, de forma que el máximo
se produzca en el centro de la muestra (supuesto coincidente con el centro del haz láser),
descendiendo cuadráticamente hasta el borde de la misma, donde se obtiene un valor nulo,
compatible con la temperatura del entorno.
Al igual que sucedía en el modelo lineal, la variable radial se normalizará respecto a la zona
de influencia del láser (R0) de forma que la muestra queda dentro de la misma (Rc) y se define
un cierto margen de seguridad entre la muestra y el entorno.
Para ello, la evolución radial de la temperatura se modelará como se indica en la expresión
siguiente:
ΓH M
Š
‰
‡0,
1 % 6 7 D | | P 1
'
D T
Figura 25. Perfil cuadrático de la radiación láser que incide sobre la muestra
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59
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
La resolución de la ecuación de transferencia de calor en coordenadas polares, modelando
la zona de influencia del láser dentro de la cual se encuentra la muestra a criopreservar como
un círculo de radio R=1 e imponiendo una temperatura adimensional nula en el extremo radial
R = 1 de tal forma que en el intervalo |R|< 1 la muestra se encuentra a una temperatura
adecuada, lejos del frío del entorno, conduce a la siguiente expresión:
_H , :M
1m
l '? ‘Q •?,Q
^ 0
ŽZ,”
?nq
Teniendo en cuenta el perfil cuadrático del laser, reducimos el problema a calcular los
coeficientes An tales que en el instante inicial, permitan que se cumpla:
1m
l '? ‘Q •?,Q
_H , 0M
?nq
1 %
La resolución de esta expresión requiere del desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la
expresión cuadrática. Con objeto de entender el desarrollo realizaremos a continuación una
introducción al significado de las series de Fourier-Bessel.
Definición: Dada una función f(x) se conoce como desarrollo en serie de Fourier-Bessel a un
desarrollo matemático de la forma siguiente:
—H M
1m
l 'X ‘? HCX M
Xnq
Donde αr son las raíces de la función de Bessel de orden n, esto es:
˜CX ∈ ™|‘? HCX M
0š, Cq P C P ⋯
Para realizar el desarrollo de Fourier-Bessel de una función f(x), todo se reduce a elegir n (en
nuestro caso tomaremos n=0) y a realizar el cálculo de los distintos coeficientes Ar, para lo que
nos basaremos en dos propiedades de las funciones de Bessel:
q
H1M œ ‘? HCX M‘? HC• M.
Q
H2M œ
q
Q
‘? HCX M.
0, ∀ ž D
1
HC M
‘
2 ?1q •
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60
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Obtengamos a continuación, basándonos en las propiedades anteriores, el valor de los
coeficientes Ar que constituyen la base del desarrollo de Fourier-Bessel. Partimos de la
expresión genérica de la expresión del desarrollo en serie de una función f(x):
—H M
1m
l 'X ‘? HCX M
Xnq
Multipliquemos ambos miembros de la igualdad por el término xJn(αs), obteniendo:
—H M‘? HC• M
1m
l 'X ‘? HCX M ‘? HC• M
Xnq
Procedamos a integrar ambos miembros de la igualdad en el intervalo [0,1]:
q
œ —H M‘? HC• M.
Q
q 1m
œ l 'X ‘? HCX M ‘? HC• M .
Q Xnq
Aplicando la propiedad de linealidad de la integral definida podemos intercambiar los
operadores integral y suma, de tal forma que la expresión queda como:
q
œ —H M‘? HC• M.
Q
1m
q
l 'X œ ‘? HCX M‘? HC• M .
Xnq
Q
Aprovechando las propiedades (1) y (2), anteriormente mostradas, obtenemos que:
q
œ —H M‘? HC• M.
Q
'• œ
q
Q
‘? HC• M.
1
'• ‘?1q HC• M
2
De donde despejando, obtenemos la expresión que permite calcular los coeficientes del
desarrollo en serie de Fourier-Bessel de una función dada f(x):
'•
q
2
œ —H M‘? HC• M.
‘?1q HC• M Q
Así pues para el caso que nos ocupa deberemos hallar los coeficientes As tales que
permiten calcular el desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la función cuadrática. En definitiva
podemos reducir el problema a calcular los coeficientes As tales que satisfagan:
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61
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
1m
1 %
l '• ‘Q •?,Q
•nq
Donde los coeficientes se calcular a través de:
'•
q
2
œ H1 % ‘q HC• M Q
M‘QHC• M.
La expresión integral anterior puede descomponerse en dos integrales diferentes:
'•
q
q
2
2
œ ‘Q HC• M. % œ
‘q HC• M Q
‘q HC• M Q
€
‘Q HC• M.
Calculemos ambas integrales por separado:
Ÿ. 1M
q
2
œ ‘Q HC• M.
‘q HC• M Q
Realicemos el cambio de variable αsx = z, que permiten transformar la integral anterior (I.1)
en la siguiente:
¡ B
.B
2
œ
‘Q HBM
C•
‘q HC• M Q C•
Aplicando la propiedad integral de la función de Bessel recogida en el anexo B:
œ
Œ1q
‘Œ H M.
Œ1q
‘Œ1q H M
Obtenemos que la integral I.1 quedaría como:
¡
2
1
œ B‘Q HBM.B
‘q HC• M C• Q
2
B‘q HBM|Q ¡
C• ‘q HC• M
2
C• ‘q HC• M
A continuación resolvamos la segunda integral de la expresión (I.2):
Ÿ. 2M
q
2
œ
‘q HC• M Q
€
‘Q HC• M.
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62
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Para resolver esta expresión en primer lugar realizamos el cambio de variable αsx = z, que
permiten transformar la integral anterior (I.2) en la siguiente:
¡
2
B €
.B
œ 6 7 ‘Q HBM
C•
‘q HC• M Q C•
¡
2
œ
B € ‘Q HBM.B
C•‚ ‘q HC• M Q
Integral, esta última, que por su estructura resolveremos mediante la técnica de
integración por partes, para lo que definimos las variables u y v, según la expresión:
œ .¢
.¢
¢ % œ ¢.
B ;.
B‘Q HBM.B; ¢
2B.B
œ B‘Q HBM.B
Por lo que la expresión quedará como:
£ ^
¡ ¤¥ H ¡ M
¡
¦Q B € ‘Q HBM.B
2B ‘ HBM|Q ¡ ¨
£ ^
¡ ¤¥ H ¡ M
£ ^
¡ ¤¥ H ¡ M
§B € ‘qHBM|Q ¡ % 2 ¦Q ¡ B ‘q HBM.B¨
UC•€ ‘q HC• M % 2C• ‘ HC• MW
£ ^
¡ ¤¥ H ¡ M
§C•€ ‘q HC• M %
La relación de recurrencia entre funciones de Bessel de diferentes órdenes establece que:
‘?
qH
M
2
‘? H M % ‘?1q H M
Aplicándolo para el caso en que n=1, obtenemos:
‘Q H M
2
‘q H M % ‘ H M
De donde despejando la expresión de la función de Bessel de orden 2, se tiene que:
‘ H M
2
‘q H M % ‘Q H M
Sustituyendo esta igualdad en la expresión de la integral anterior, y teniendo en cuenta que
αs son las raíces de la función de Bessel de orden cero, esto es J0 (αs) = 0, obtenemos que:
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63
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
2
œ
C•‚ ‘q HC• M Q
¡
B € ‘Q HBM.B
2
C•‚ ‘q HC• M
UC•€ ‘q HC• M % 4C• ‘q HC• MW
Por lo que sumando las expresiones obtenidas para I.1 e I.2 obtenemos que:
'•
q
2
œ H1 % ‘q HC• M Q
M‘Q HC• M.
8
C•€ ‘q HC• M
De esta forma se obtiene la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura
adimensional en el caso de que modelemos el perfil de temperaturas del láser de forma
cuadrática dentro de la zona de influencia del mismo:
_H , :M
1m
l
8
•€ ‘
?nq Q,? q
•Q,?
‘Q •?,Q
^ 0
ŽZ,”
Obtenida la expresión matemática del modelo de evolución espacio-temporal de la
temperatura adimensional desarrollamos un algoritmo en Matlab que permita generarlo,
function [R,T] = discoRcuad(N, h, tfin)
%function [R,T] = discoRcuad(N, h, tfin) nos va a permitir representar información del campo
de temperaturas resultante de resolver la ecuación de calor para el modelo cuadrático de
calentamiento de la muestra por parte del láser. Para simplificar el resultado e
independizarlas del sistema de unidades las variables se van a adimensionalizar
% N:
Numero de sumandos para el desarrollo en serie
% h:
Precisión de la variable radial
% tfin:
Instante de tiempo hasta el que se desea estudiar la evolución temporal
%Obtengamos en primer lugar las N raices de la funcion Jo[x] que nos interesan
j0 = raizBesselJ(N,0.01);
%inicializamos las variables en primer lugar
B=0;i=1;k=1;r=1;
'Calculando....'
for R=0:h:1
for tau=0:0.01:tfin
for n=1:1:N
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64
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B = B + (8/(j0(n)^3*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R/A)*exp(-1*tau*j0(n)^2);
end
T(r,i) = B;
i=i+1;
B=0;
end
r=r+1;
i=1;
end
R = 0:h:1;
'Modelo generado...'
El programa anterior genera una matriz en la que se recoge para cada punto Ri de la
muestra el valor de la temperatura _H O , :O M, es decir un campo de temperaturas que
evoluciona en el tiempo una vez ha cesado la influencia del láser como consecuencia de la
transferencia de calor hasta zonas más frías del medio. La precisión del modelo vendrá
controlado por los parámetros N (número de sumandos incluidos en la expresión) y h
(determina lo densa que será la nube de puntos de la muestra en que se calcula la
temperatura).
A modo de ejemplo determinemos la evolución temporal en cuatro puntos diferentes de la
muestra; concretamente en R=0, R=0.25, R=0.5, R = 0.75. La relación entre del tamaño de la
muestra y la zona calentada por el láser variará dependiendo del tipo de célula que se someta a
la acción de la radiación láser; obviamente se contempla una zona de transición entre la
muestra y su entorno, con objeto de no someter a la membrana de la célula a temperaturas
muy bajas.
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65
Modelado matemático e
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Figura 26. Evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75
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66
Modelado matemático e
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Figura 27. Superposición de las curvas de evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75
Una vez que disponemos del campo de temperaturas de la muestra almacenado para
distintos instantes de tiempo, y hemos observado la tendencia de la misma a alcanzar la
temperatura del medio que la rodea, el siguiente paso es llevar a cabo una estimación de la
velocidad de enfriamiento.
Dada la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura una vez el efecto de
calentamiento del láser ha desaparecido y la temperatura de la muestra tiende a equilibrarse
con el entorno que la rodea:
_H , :M
1m
l
8
•€ ‘
?nq Q,? q
•Q,?
‘Q •?,Q
^
ŽZ,”
0
La velocidad de enfriamiento se obtendrá derivando la expresión anterior respecto a la
variable temporal:
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67
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
•H , :M
(_H , :M
(:
1m
% l
?nq
8
•Q,? ‘q •Q,?
‘Q •?,Q
^ 0
ŽZ,”
Expresión que obviamente depende tanto del tiempo como del punto de la muestra que
consideremos.
Dado el comportamiento asintótico de las curvas un procedimiento adecuado para lograr
una estimación promedio de la velocidad de enfriamiento consiste en calcular la pendiente de
la línea recta en la parte central de la curva, en una banda del 60%, concretamente en la zona
de la curva comprendida entre el 20% y el 80% del valor máximo de la temperatura
adimensionalizada.
Utilizando esta función auxiliar e incorporándola a la función de cálculo del modelo de
temperatura, es posible determinar para diferentes puntos a lo largo de la coordenada radial la
velocidad de enfriamiento adimensional como la pendiente de una recta que linealiza el
modelo en una banda del 60% del valor máximo, esto es:
•H , :M
0.8_H O , 0M % 0.2_H O , 0M
: % :q
0.6
_H O , 0M
: % :q
Con objeto de sistematizar la determinación de la velocidad de enfriamiento
implementamos en Matlab el código de la función [R, tasa] = tasaRcuad(N, h, tfin).
function [R, tasa] = tasaRcuad(N,h, tfin)
%function [R,tasa] = tasaRcuad(N, h, tfin) nos va a permitir representar información de la
tasa de enfriamiento adimensionalizada de la muestra a lo largo de un eje radial, empleando
un modelo cuadrático para el perfil del láser
%
%
%
%
%
R:
tasa:
N:
h:
tfin:
Puntos de la coordenada radial en los que se evalúa la tasa de enfriamiento
Tasa de enfriamiento para cada uno de los puntos del disco
Numero de sumandos para el desarrollo en serie
Precisión en la variable temporal
tiempo adimensional en el que se estudiará la evolución de la temperatura
%Obtengamos en primer lugar las N raices de la funcion Jo[x] que nos interesan
j0 = raizBesselJ(N,0.01);
%Calculemos entonces en el punto R=1, por simplicidad
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68
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
B=0;i=1;k=1;r=1;
t = [0:0.01:tfin];
'Calculando....'
for R=0:h:1
for tau=0:0.01:tfin
for n=1:1:N
B = B + (8/(j0(n)^3*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R)*exp(-1*tau*j0(n)^2);
end
T(r,i) = B;
i=i+1;
B=0;
end
tau1 = buscaTemperatura(0.8*T(r,1),T(r,:),t);
tau2 = buscaTemperatura(0.2*T(r,1),T(r,:),t);
tasa(k) = 0.6*T(r,1)/(tau2-tau1);
k=k+1;
r=r+1;
i=1;
end
R = 0:h:1;
'Modelo generado...'
A partir de lo anterior obtenemos las curvas que se muestran a continuación, pudiendo
observar las siguientes peculiaridades:
La distribución de temperaturas no es constante en toda la zona de influencia del láser
ya desde el instante t=0, dado que el perfil del láser decrece suavemente.
A la luz de las curvas que muestran la evolución temporal de la temperatura con el
tiempo para diferentes puntos de la zona muestran como la pendiente de las mismas
se va haciendo cada vez menor hasta alcanzar el punto extremo de la zona de
influencia del láser, R=1. Evidentemente la velocidad de enfriamiento no será
constante en toda la zona sino que irá decreciendo. Con objeto de evitar que los
puntos de la muestra vitrifiquen a velocidades excesivas resultará conveniente ajustar
la zona de influencia del láser de forma que la influencia del mismo en la zona ocupada
por la muestra sea lo más uniforme posible.
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69
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Entorno a R = 0 la tasa de enfriamiento adquiere valores próximos a los obtenidos para
el modelo uniforme antes estudiado
Figura 28. Evolución de la tasa de enfriamiento en función de la coordenada radial
Con objeto de analizar el efecto del parámetro N (número de términos de la serie) y
comprobar lo bien que se adapta el desarrollo en serie de Fourier – Bessel realizado para la
función cuadrática respecto de la función original, en la siguiente gráfica se muestra el
resultado para diferentes valores de N.
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70
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Figura 29. Influencia del número de términos N en la aproximación al perfil cuadrático de temperaturas en el
instante t=0 en función de la coordenada radial. Se comprueba para N= 1,2,3,4,5 y 200 puntos.
En esta gráfica puede observarse como incluso truncando la solución en un número
reducido de puntos la curva de distribución radial de la temperatura para cada instante se
aproxima notablemente a la curva real, especialmente a medida que nos alejamos de la
coordenada R=0.
A continuación se muestra igualmente la evolución temporal de la temperatura de la
muestra en un punto concreto de la misma en función del parámetro N, observando como el
efecto es exactamente el mismo.
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71
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Figura 30. Influencia del número de términos N en la evolución temporal de la temperatura de la muestra a partir del
instante t=0 para el punto central de la muestra R = 0. Se comprueba para N= 1,2,3,4,5 y 200 puntos.
Como puede observarse en las curvas precedentes la principal diferencia aportada por el
restante número de parámetros de la suma que constituye la solución se encuentra en el
entorno del centro de la muestra y en los instantes iniciales del enfriamiento de la misma,
mientras que en las proximidades al borde de la zona de influencia del láser y a medida que nos
acercamos al régimen permanente el error que se comete tiende a cero.
En la figura siguiente se observa el comportamiento de la temperatura de la muestra en
R=0 en los primeros instantes que transcurren tras el apagado del láser
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72
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Figura 31. Influencia del número de términos N en la evolución temporal de la temperatura de la muestra a partir del
instante t=0 para el punto central de la muestra R = 0. Detalle del entorno t=0, donde se observa la principal
diferencia y como a medida que aumenta el número de puntos se produce una convergencia. Se comprueba para N=
1,2,3,4,5 y 200 puntos.
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73
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
3.3. MODELO MATEMÁTICO PERFIL LASER GAUSSIANO
El objeto del presente apartado es alcanzar un modelo más cercano a la realidad,
contemplando para ello que haz laser no calienta por igual a todos los puntos de la muestra,
considerando una distribución de temperaturas en forma de campana gaussiana, de forma que
la mayor parte del calor se concentra en el entorno del centro y se va reduciendo a medida que
nos alejamos del centro de la muestra.
Para ello, la evolución radial de la temperatura se modelará como se indica en la expresión
siguiente:
ΓH M
N
0,
Y^
D | | P 1
D T
Donde el parámetro β permite modelar la anchura del haz del láser y consecuentemente
de la curva gaussiana.
Figura 32. Perfil gaussiano de la radiación láser que incide sobre la muestra para diferentes valores de beta. Cuanto
mayor es el parámetro más uniforme será el calentamiento de la muestra y por tanto más constante será la
velocidad de enfriamiento en la muestra.
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74
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
La resolución de la ecuación de transferencia de calor en coordenadas polares (modelando
la muestra a criopreservar como un círculo de radio R=1, imponiendo una temperatura
adimensional nula en el extremo radial de la muestra, esto es en R= 1 conduce a la siguiente
expresión:
1m
_H , :M
l '? ‘Q •?,Q
^
ŽZ,”
0
?nq
Teniendo en cuenta el perfil gaussiano del laser, reducimos el problema a calcular los
coeficientes An tales que en el instante inicial, permitan que se cumpla:
_H , 0M
1m
l '? ‘Q •?,Q
?nq
Y^
La resolución de esta expresión requiere del desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la
expresión gaussiana por lo que los coeficientes anteriores se resolverán a través de:
'•
q
2
œ —H M‘? HC• M.
‘?1q HC• M Q
Así pues para el caso que nos ocupa deberemos hallar los coeficientes As tales que
permiten calcular el desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la función gaussiana. En definitiva
podemos plantear el problema como calcular los coeficientes As tales que satisfagan:
*^
1m
l '• ‘Q •?,Q
•nq
Donde los coeficientes se calcularán a través de la expresión integral siguiente:
'•
q
2
œ
‘q HC• M Q
*^
‘Q HC• M.
Para resolver esta expresión en primer lugar realizamos el cambio de variable αsx = z, que
permite transformar la integral anterior en la siguiente:
'•
ª
2
œ B
C© ‘q HC• M Q
<^
^
ª
‘Q HBM.B
Departamento Física Aplicada III | Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla
75
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Dada la complejidad de la integral anterior, que involucra tanto funciones de Bessel como
la función campana de Gauss, procedemos al desarrollo en serie de la función Jo(z). La
expresión general de dicho desarrollo responde a la fórmula siguiente:
‘t H M
m
l
?nQ
H%1M?
| }
! ΓH 5 ‹ 5 1M 2
?1t
ΓH 5 ‹ 5 1M
Hn 5 mM!
Adaptándola al caso que nos interesa, esto es m = 0, obtenemos
m
‘Q HBM
l
knQ
H%1Mk B
| }
&! &! 2
k
Con lo que la integral a resolver quedaría en la siguiente forma:
ª
2
œ B
C© ‘q HC• M Q
'•
<^ m
^
ª
l
knQ
H%1Mk B
| }
&! &! 2
k
.B
Aplicando la propiedad de linealidad de la integral obtenemos que:
'•
m
ª
H%1Mk
2
œ B
l
&! &! Q
C© ‘q HC• M
knQ
¬
^
<
®
¡-
B
2
k
k
.B
Procedamos a realizar el siguiente cambio de variable:
B
; .
C• e
2B.B
, . .
C• e
. .B
C• e.
2B
Por lo que la integral anterior quedará como se muestra a continuación:
'•
m
q
H%1Mk
1
œ
l
&! &! Q
‘q HC• M
knQ
*
H C• eMk
e.
2 k
m
q
H%1Mk C• e
e
l
¬
® œ
&! &!
4
‘q HC• M
Q
knQ
k
* k
. Para resolver el término integral recurrimos a la solución 2.321 recogida en el libro Table of
Integrals, series and Products, de I.S. Gradshteyn and I.M. Ryzhik, donde se establece la
siguiente relación de recurrencia:
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76
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
œ
t •*
t •*
%
‹
œ
t q •*
Si expandimos la relación de recurrencia anterior, de manera sucesiva obtenemos:
%
‹
¯
t
%
‹
t q
œ
5
t •*
‹H‹ % 1M
t •*
%
t
‹H‹ % 1MH‹ % 2M
€
t €
5… ±
Por lo que la integral quedará como:
œ
t •*
•* t
l
ŽnQ
H%1MŽ ‹!
Ž H‹ % •M!
t Ž
Aplicando esta expresión a la fórmula que nos permitirá calcular los coeficientes As
obtenemos:
'•
m
m
q
H%1Mk C• e
e
l
¬
® œ
&! &!
4
‘q HC• M
Q
k
knQ
k k
H%1Mk C• e
%e
l
¬
® l
&! &!
4
‘q HC• M
knQ
ŽnQ
*
* k
. H%1MŽ &!
H%1MŽ H& % •M!
k Ž
q
|Q Simplificando obtenemos:
'•
m
k
H%1Mk C• e
e
l
¬
® ²&! % l
&! &!
4
‘q HC• M
k
knQ
ŽnQ
q
&!
1 k Ž
6 7 ³
H& % •M! e
Sacando factor común k! y simplificando obtenemos:
'•
m
q
m
k
H%1Mk C• e
H%1Mk C•
e
e
eŽ
l
¬
® %
l
¬ ® l
H& % •M!
&!
4
&!
4
‘q HC• M
‘q HC• M
knQ
k
knQ
k
ŽnQ
Expresión que puede descomponerse en dos sumandos, que resolveremos por separado.
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77
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
m
m
H%1Mk C• e
e
l
¬
®
4
&!
‘q HC• M
H%1Mk k
e
' l
&!
‘q HC• M
k
knQ
knQ
Donde se ha seleccionado:
'
Desarrollando la serie obtenemos:
m
H%1Mk k
e
' l
&!
‘q HC• M
C• e
4
e
'
'€
¬1 % ' 5 % 5 … ®
2!
3!
‘q HC• M
knQ
Observamos que puede identificarse con el desarrollo en serie de una exponencial, por lo
que podrá simplificarse como se indica a continuación (para A pequeño):
m
H%1Mk C• e
e
l
¬
®
&!
4
‘q HC• M
knQ
e
‘q HC• M
k
^
6 ¡ 7
‚
A continuación centrémonos en el segundo miembro de la expresión:
q
m
k
H%1Mk C•
e
eŽ
l
¬ ® l
H& % •M!
&!
4
‘q HC• M
k
knQ
ŽnQ
Donde se denominará:
´
C•
Aµk
4
k
l
ŽnQ
eŽ
H& % •M!
Por lo que la expresión anterior quedará como:
q
m
H%1Mk k
e
´ µk
l
&!
‘q HC• M
knQ
Por lo que la expresión más cerrada a la que se llega de los coeficientes corresponde con:
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78
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
'•
e
‘q HC• M
^
6 ¡ 7
‚
q
m
H%1Mk k
e
%
´ µk
l
&!
‘q HC• M
knQ
Sacando factor común llegamos a la expresión:
'•
e
¶
‘q HC• M
·
%
q
m
l
knQ
H%1Mk k
´ µk ¸
&!
De esta forma se obtiene la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura
adimensional en el caso de que modelemos el perfil de temperaturas del láser de forma
cuadrática dentro de la zona de influencia del mismo:
_H , :M
1m
e
l
¶
‘q HC? M
?nq
·
%
q
m
l
knQ
H%1Mk k
´ µk ¸ ‘Q •?,Q
&!
^ 0
ŽZ,”
Expresión analítica que resulta poco práctica por su complejidad a la hora de
implementarla en un algoritmo. En nuestro intento de determinar la evolución de la
temperatura de la muestra de forma analítica sin necesidad de recurrir a la resolución de
métodos numéricos de resolución tales como la técnica de los elementos finitos hemos
obtenido expresiones manejables para el caso de los modelo lineal y cuadrático, no así para el
caso del modelo gaussiano.
Obtenida la expresión matemática del modelo de evolución espacio-temporal de la
temperatura adimensional para el caso de un perfil gaussiano desarrollamos un algoritmo en
Matlab que permita generarlo; para ello se obtiene una serie de funciones auxiliares que
permiten determinar los diferentes coeficientes del modelo:
function C = coeficiente(j,A)
%function C = coeficiente(j,A) es una función que permitirá calcular los coeficientes del
desarrollo de forma que resulte convergente para valores grandes de N, evitando calcular
factoriales muy grandes o potencias elevadas.
C=1;
for i=0:1:j-1
C = C*A/(i+1);
end
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79
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
A partir de los coeficientes anteriormente mostrados y que implementan los factoriales
calculamos los coeficientes Dk del modelo anteriormente calculados
function Dk = coefDk(N,C,D)
%function Dk = coefDk(N,C,D) calculara los coeficientes Dk del desarrollo Fourier Bessel del
perfil gaussiano
D=0;Dk=0;
for k=0:1:N
H = ((-1)^k)*coeficiente(k,D);
Cl=0;
for l=0:1:k
Cl = Cl + coeficiente(l,C);
end
Dk = Dk + H*Cl;
end
A partir de los coeficientes Dk determinamos los coeficientes As.
function [As,alphas] = coefAs(N,beta,a)
%function As = coefAs(N,beta,a) con esta funcion trataremos de calcular los coeficientes del
desarrollo de Fourier-Bessel del perfil gaussiano con el que estamos trabajando para un
determinado numero de puntos, para una beta determinada y en un intervalo [0,a] que
nosotros elijamos arbitrariamente grande.
alphas = raizBesselJ(N,0.1);
alphas = alphas/a;
i=1;
C = (a^2)/beta;
for i=1:1:N
A = (alphas(i)/2)^2;
D = A*beta;
B = beta/(a*besselJ(1,a*alphas(i)))^2;
As(i) = B*(exp(-D) - exp(-C)*coefDk(N,C,D));
end
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80
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Una vez definidas las funciones auxiliares definimos la función discoRgauss que nos permitirá
determinar la evolución temporal de la temperatura en los diferentes puntos de la muestra.
Hemos de tener en cuenta que el modelo obtenido es realmente una simplificación, basada en
la adopción del criterio de que el término
desarrollo en serie de Maclaurin.
¡¹
‚
sea menor que la unidad y así poder aplicar el
function [R,T] = discoRgauss(N, h, beta, tfin)
%function [R,T] = discoRgauss(N, h, tfin,A) nos va a permitir representar información del
campo de temperaturas resultante de resolver la ecuación de calor para el modelo
gaussiano de calentamiento de la muestra por parte del láser. Para simplificar el resultado e
independizarlo del sistema de unidades las variables se van a adimensionalizar
%
%
%
%
N:
h:
beta:
tfin:
Numero de sumandos para el desarrollo en serie
Precisión de la variable radial
Parámetro beta que da forma a la gaussiana
Instante de tiempo hasta el que se desea estudiar la evolución temporal
[As,alphas] = coefAs(N,beta,a);
B=0;i=1;r=1;
for R=0:0.1:1.0
for tau=0:0.01:T
for n=1:1:N
B = B + As(n)*besselJ(0,alphas(n)*R)*exp(-1*tau*alphas(n)^2);
end
f(r,i) = B;
i=i+1;
B=0;
end
r=r+1;
i=1;
end
tau=0:0.01:T;
El programa anterior genera una matriz en la que se recoge para cada punto Ri de la
muestra el valor de la temperatura _H O , :O M, es decir un campo de temperaturas que
evoluciona en el tiempo una vez ha cesado la influencia del láser como consecuencia de la
transferencia de calor hasta zonas más frías del medio. La precisión del modelo vendrá
controlado por los parámetros N (número de sumandos incluidos en la expresión) , h
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81
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
(determina lo densa que será la nube de puntos de la muestra en que se calcula la
temperatura) y β (modelará la curva gaussiana).
Como ya se ha indicado anteriormente la expresión obtenida no es general dado que se
requiere que se cumplan unas condiciones concretas que validen una de las simplificaciones
realizadas. Es por eso que este modelo analítico no es viable con objeto de disponer de una
herramienta precisa y no basada en cálculos numéricos con los que tomar decisiones. Para este
fin resultan más recomendables los modelos líneal y cuadrático antes mencionados.
En cualquier caso en la figura siguiente se muestra la evolución temporal para distintos
puntos de la muestra, haciendo uso de las funciones anteriores, para los parámetros N=30, β=1
y tfin=0.8
Figura 33. Evolución temporal para diferentes puntos de la muestra de la temperatura supuesto un perfil gaussiano
para el laser.
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82
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3.4. RESULTADOS NUMÉRICOS
Una vez desarrollados algunos modelos matemáticos para el sistema de vitrificación
ultrarrápido propuesto, siguiendo como objetivo el obtener resultados analíticos (con objeto
de poder realizar suposiciones e hipótesis que no podrían tomarse en el caso de resolver las
ecuaciones diferenciales haciendo uso de cálculo numérico) hemos obtenido que los modelos
lineal y cuadrático se aproximan bastante bien al comportamiento dela evolución de la
temperatura en la muestra irradiada por un dispositivo láser, a partir del instante en que se
apaga y se deja a la muestra biológico a merced de las bajísimas temperaturas del entorno.
También hemos observado como el modelo gaussiano no resulta sencillo de utilizar por cuanto
que no es posible simplificar todo lo deseable su expresión.
Todos los modelos matemáticos antes desarrollados se han calculado haciendo uso de
variables adimensionales que evitan la dependencia de los resultados obtenidos del sistema de
unidades elegido. Hemos comprobado asimismo que era posible evalúa la velocidad de
enfriamiento de la muestra de forma adimensional; especialmente adecuado para esta
estimación resulta el modelo lineal, donde al modelar la temperatura de la muestra como
uniforme se obtiene una velocidad de enfriamiento también constante en prácticamente toda
la muestra. Como se obtuvo anteriormente la curva de la velocidad de enfriamiento
adimensional se muestra a continuación:
Figura 34. Velocidad de enfriamiento adimensional en función de la coordenada radial.
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83
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Con objeto de obtener una estimación numérica de la velocidad de enfriamiento en
condiciones reales de temperatura interior y exterior, así como para muestras biológicas de
diferentes tamaños, vamos a aplicar las expresiones de normalización a la inversa,
considerando los siguientes valores numéricos:
C
1,47 ƒ 10
»
&
‹
Hµ — D ¢ . .Té ‹
D
C ƒ H
O?
%
>*
M/
Q
. ½ ¾
M
Teniendo en cuenta que la velocidad de enfriamiento adimensionalizada se ha calculado
contemplado como la pendiente de una recta que linealiza el modelo de temperatura en una
banda del 60% del valor máximo, esto es:
•H , :M
∆_
∆:
0.8_H O , 0M % 0.2_H O , 0M
: % :q
0.6
Deshaciendo la normalización de las variables _ y :, obtenemos:
∆_
∆:
∆|
% >*
% >* }
CT
∆6 7
O?
Q
CH
O?
Q
%
>*
_H O , 0M
: % :q
∆
Hº´/DM
M ∆T
De donde despejamos la expresión de la velocidad o tasa de enfriamiento medida en
grados centígrados por segundo como:
∆
Hº´/DM
∆T
CH
O?
%
Q
>*
M ∆_
∆:
Con objeto de comprobar los resultados de la velocidad de enfriamiento consideraremos
dos tipos diferentes de muestras:
Muestras de tamaño reducido (R = 1µm): las muestras celulares del ser humano más
pequeñas que resulta interesante vitrificar son los espermatozoides, lo cual resulta
especialmente interesante en el campo de la reproducción asistida. En la tabla siguiente se
muestran los resultados para diferentes valores de condiciones internas y externas.
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Muestras de gran tamaño (R = 200µm): las muestras celulares del ser humano de mayor
tamaño y cuya criopreservación realmente motiva la búsqueda de diferentes técnicas de
vitrificación son los óvulos. En la tabla siguiente se muestran los resultados para diferentes
valores de condiciones internas y externas.
Temperatura interior
Temperatura
exterior
100ºC
90ºC
37ºC
0ºC
-60ºC
5.88·107
5.51·107
3.565·107
2.205·107
-100ºC
7.35·107
6.98·107
5.035·107
3.675·107
-140ºC
8.82·107
8.45·107
6.50·107
5.147·107
-190ºC
1.07·107
1.029·107
8.34·107
6.983·107
Tabla 3. Velocidad de enfriamiento expresada en ºC/s para muestras con un tamaño aproximado de 1 µm.
Temperatura interior
100ºC
-60ºC
Temperatura
exterior
1470
90ºC
37ºC
0ºC
1378.13
891.188
551.25
-100ºC
1837.5
1745.63
1258.69
918.75
-140ºC
2205
2113.13
1626.19
1286.25
-190ºC
2664.38
2572.5
2085.56
1745.63
Tabla 4. Velocidad de enfriamiento expresada en ºC/s para muestras con un tamaño aproximado de 200 µm.
Podemos observar que desde un punto de vista teórico que para el caso de muestras d
gran tamaño (más difíciles de vitrificar) en condiciones próximas a las que se establecerán en la
configuración experimental se alcanzan velocidades de enfriamiento del orden de 1626.19ºC/s,
es decir 97571.4ºC/min (aprox. 105ºC/s). Estos valores de tasa de enfriamiento se encuentran
dentro de las observaciones realizadas experimentalmente.
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CAPÍTULO III
IMPLEMENTACIÓN DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN
ULTRA-RÁPIDO MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
1. INTRODUCCIÓN
Como ya se ha referido anteriormente existen principalmente dos grupos de técnicas
utilizadas tradicionalmente en la criopreservación de material biológico: el enfriamiento lento o
slow freezing y la vitrificación.
Las técnicas tradicionales en ambos sistemas presentan dificultades. En el caso del
enfriamiento lento se evita la formación de hielo intracelular pero a costa de la formación de la
formación del extracelular lo que origina una deshidratación de la célula que trae como
consecuencia la deformación de la estructura celular. Como solución a esta dificultad se
introducen sustancias crioprotectoras que presentan el enorme inconveniente de ser tóxicos
para muchos tipos de células.
El segundo grupo de técnicas, fundamentadas en la consecución dela vitrificación, se basan
precisamente en someter a la célula a velocidades elevadas de forma que no se genere hielo ni
intracelular ni extracelular. Esta técnica, si bien ha proporcionado muy buenos resultados,
adolece de una importante dificultad dado que al vitrificar sale gran cantidad de agua a través
de la membrana provocando por un lado un aumento tóxico de sales en la célula y una rápida
salida de agua lo que supone una deformación en la estructura de la misma. Para evitar estos
efectos, al igual que en los términos anteriores se requiere del uso de crioprotectores que
reduzcan este flujo de agua, con la evidente problemática anterior: su toxicidad.
Para lograr vitrificación con una reducida cantidad de crioprotector de tal forma que no sea
tóxico para las muestras biológicas se requieren velocidades de enfriamiento muy rápidas, del
orden de decenas de miles de grado por minuto que no se alcanza con el método tradicional de
inmersión directa en nitrógeno líquido (varios miles de grados por segundo).
Teniendo en cuenta el perfil gaussiano del laser, reducimos el problema a calcular los
coeficientes An tales que en el instante inicial, permitan que se cumpla
2. MÉTODO PROPUESTO DE VITRIFICACIÓN ULTRARRÁPIDA
Con el presente proyecto, tal y como se ha desarrollado matemáticamente en los modelos
anteriores se pretende plantear una técnica de vitrificación con la que se pretende alcanzar
velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo.
El método de vitrificación ultra-rápida que se propone consta básicamente de dos etapas.
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87
Modelado matemático e
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En la primera etapa del proceso la radiación procedente de una fuente láser de
potencia regulable, se focaliza sobre la muestra biológica (utilizando para ello uno de
los canales de un microscopio) con objeto de mantener permanentemente la
temperatura de la misma en unos márgenes tolerables (37ºC), cuando todo el medio
situado en el exterior es enfriado hasta los -150ºC, haciendo uso de una mezcla de
nitrógeno gaseoso a diferentes temperaturas cuya proporción es controlada actuando
electrónicamente sobre sendas válvulas. Esta muestra biológica se puede instalar en un
recipiente adecuado para ello. Se barajó en un estadio temprano el uso de un
recipiente tipo cryostage dotado de ventanas transparentes a la radiación empleada y
de una serie de conductos de entrada y salida por donde discurriría fluido refrigerante
que permite generar el entorno frío que se pretende crear para la muestra; no
obstante finalmente se optó para una primera configuración el uso de capilares de
policarbonato anteriormente descritos y que presentan unas adecuadas propiedades
de transferencia del calor.
Lograr que la muestra biológica se mantenga a una temperatura constante de 37ºC
requiere de la implementación de un lazo cerrado de realimentación de tal forma que a
partir de medidas de la temperatura de la muestra se actúe sobre la potencia de
emisión del láser aumentándola o disminuyéndola de acuerdo a una determinada ley
de control. Con objeto de mantener el entorno de la muestra a una temperatura de 150ºC en el permanente e implementar un perfil descendente lineal durante las fases
iniciales del proceso también se requiere de la determinación de la temperatura de
dicho entorno.
En una segunda etapa del procedimiento de vitrificación considerado la fuente de
radiación láser se desconecta súbitamente, accionado por una señal de control (en los
modelos matemáticos anteriormente presentados este hecho se ha considerado en t =
0), de tal forma que la muestra queda totalmente expuesta a las temperaturas
extremas del entorno de la misma de tal forma que como se recoge en los modelos
matemáticos anteriores y se constata en los experimentos realizados se alcanzan
velocidades de enfriamiento del orden de 106 ºC/s, lográndose por tanto una adecuada
vitrificación. Con objeto de minimizar los efectos de la deshidratación y alteración de la
estructura celular ocasionados por los fenómenos crioscópico y osmótico se deben
incorporar pequeñas cantidades de crioprotector aunque sin alcanzar niveles tóxicos.
El método de dos etapas antes descrito requiere no obstante para su aplicación de la
resolución de dos importantes problemas: medir in situ la temperatura de la muestra sin que se
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88
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
produzcan alteraciones en la célula a cusa del propio proceso de medida y calentar la muestra,
en su mayor parte agua, haciendo uso de luz láser a la que es prácticamente transparente.
3. MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA
El sistema de control del láser que calienta la muestra manteniéndola a 37ºC aún cuando el
entorno en que se encuentra inmerso se halla a -150ºC requiere para su correcto
funcionamiento de la determinación constante de datos acerca de la temperatura de la
muestra con objeto de precisar de acuerdo a una determinada ley de control si hay que actuar
sobre el láser aumentando o disminuyendo su potencia.
Evidentemente la técnica de estimación de la temperatura que se implemente debe
minimizar los efectos sobre la propia muestra durante el proceso de medida. A este respecto se
han contemplado tres posibles técnicas de medición de temperatura:
-
Utilización de Rodamina B
Empleo de termopares
Espectroscopía Raman
De las técnicas propuestas se han implementado experimentalmente las dos primeras,
quedando la tercera opción como una propuesta novedosa que conduciría a la implementación
del termómetro Raman, herramienta que podría proporcionar información muy relevante
acerca de la calorimetría de la célula.
3.1. UTILIZACIÓN DE RODAMINA B
La Rodamina B es un compuesto químico empleado como colorante y que pertenece al
grupo de las rodaminas. Se utiliza habitualmente como colorante de seguimiento en un líquido
para rastrear la tasa y dirección de su flujo y transporte. La rodamina posee fluorescencia y
puede detectarse fácilmente a un coste bajo mediante unos instrumentos conocidos como
fluorómetros. Se utilizan especialmente en aplicaciones de biotecnología tales como
microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, espectroscopía de correlación de
fluorescencia, etc.
La Rodamina B presenta además una propiedad especialmente interesante de cara a su
utilización como sensor de temperatura dad o que la intensidad de la fluorescencia que emite
es sensible a la temperatura.
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89
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Figura 35. Fórmula química de la rodamina B
Empleando un segundo láser a 514.5 nm se lleva a cabo la excitación de la fluorescencia de
la rodamina emitiendo a 590 nm con una intensidad tanto mayor cuanto más fría (menor
temperatura) se encuentra la muestra.
Este sistema de adquisición de la temperatura se ha utilizado en el proyecto realizado en la
Harvard Medical School and Massachussets (Center for Engineering in Medicine, Boston, USA)
por D. Ramón Risco y otros investigadores alcanzando un precisión superior al 1º C de
temperatura.
El sistema que se implementó en aquella ocasión consistía en utilizar un fotodetector que
se encargaba de medir la intensidad de la fluorescencia. La señal obtenida es digitalizada y
procesada por un software de control, estableciendo a partir de ella una medida de la
temperatura de la muestra, lo que permite en función de un determinado esquema de control
actuar sobre el dispositivo láser de forma que se mantenga constante la temperatura.
Este sistema de medición de temperatura presenta, no obstante, como principal problema
el propio proceso de formación de hielo extracelular, una vez se apaga el láser dado que la
zona que no contiene hielo concentrará todo el soluto, entre el que se encuentra la rodamina
empleada para medir la temperatura. Dado que se produce un incremento de la concentración
de la rodamina se producirá un aumento en la intensidad de la fluorescencia de la muestra de
tal forma que no es posible diferenciar entre la que porcentaje de la intensidad de la
fluorescencia es debida a la disminución de la temperatura y cual la ocasionada al aumento de
la concentración de la rodamina; a causa de esto se pierde la referencia de intensidad y por
tanto su validez, a partir de ese instante, como sensor de temperatura.
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90
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Figura 36. Agua pura con Rodamina (0.025g/l) a la que se ha aplicado el protocolo de enfriamiento ultrarrápido. Se
muestra una imagen ampliada a 400X de la zona superior izquierda del lugar tratado. En ella se puede observar la
presencia de hielo en la zona no tratada y una estructura opaca que bien pudiera ser agua vitrificada o cristales de
hielo de tamaño muy inferior al presente en la otra región
3.2. EMPLEO DE TERMOPARES
El método más sencillo y económico para determinar la temperatura de una muestra es en
principio el uso de termopares como dispositivos sensores.
Un termopar en definitiva consiste en el aprovechamiento del efecto Seebeck al realizar la
conexión entre dos metales de características diferentes; se produce una caída de tensión que
es función de la diferencia de temperatura entre el extremo común en que se unen ambos
metales (conocido como punto caliente) y el otro extremo conocido como punto frío. La
diferencia de tensión que aparece entre ambos metales cambia directamente con la
temperatura, es decir, al aumentar la temperatura de la muestra aumenta también el voltaje
en una forma proporcional. Dependiendo del tipo de metales que se empleen en la
construcción del termopar pueden medirse diferentes intervalos de temperatura, en particular
cuando se utilizan cobre y constatán (aleación de cobre y niquel), se pueden medir
temperaturas entre -190ºC y 300ºC.
En la tabla siguiente se muestra una clasificación de los principales tipos de termopares que
se pueden emplear en la práctica:
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91
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
Tipo
Alcance Tª (ºC)
Material y aleación (+) vs. (-)
Metal - Base
E
-270 a 1000
Níquel – Cromo vs. Cobre - Níquel
J
-210 a 1200
Hierro vs. Cobre - Níquel
T
-270 a 400
Cobre vs. Cobre – Níquel
K
-270 a 1372
Níquel – Cromo vs. Níquel – Aluminio
M
-270 a 1300
Níquel – Cromo – Silicio vs. Níquel – Silicio - Magnesio
Tabla 5. Clasificación de los diferentes tipos de termopares constituidos por metal -Base.
Tipo
Alcance Tª (ºC)
Material y aleación (+) vs. (-)
Metal - Noble
R
-50 a 1768
Platino – 13% rodio vs. platino
S
-50 a 1768
Platino – 10% rodio vs. platino
B
0 a 1820
Platino – 30% rodio vs. Platino – 6% rodio
Tabla 6. Clasificación de los diferentes tipos de termopares constituidos por metal –Noble.
Por el rango de temperaturas en la que pretendemos trabajar (-150 a 37ºC) y por su
economía el tipo de termopar más apropiado para emplear en este sistema es el tipo T, es decir
el uso de cobre en uno de sus terminales y constatán en el otro.
En la implementación práctica del sistema de vitrificación ultrarrápida, aparte del uso
fallido de la rodamina, se han empleado con éxito termopares de tamaño adecuado (acorde
con el tamaño de los capilares de policarbonato empleados; concretamente en el sistema se
han utilizado dos termopares:
Uno de los termopares se instalará lo más próximo posible a la muestra con objeto de
sensar la temperatura a la que se encuentra la misma. La diferencia de tensión surgida
entre los terminales del sensor son captados por una tarjeta de adquisición de datos a
través de la cual se obtienen en el sistema de control datos en tiempo real de la
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92
Modelado matemático e
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temperatura de la célula generando la señal de control oportuna de actuación sobre el
dispositivo láser, permitiendo en todo momento seguir la referencia de 37ºC.
Un segundo termopar se colocará en contacto con el medio criogénico con objeto de
tener monitorizado en todo momento, pero especialmente en el arranque del sistema,
la temperatura del entorno. Con objeto de permitir que desde el primer instante la
temperatura de la muestra se encuentre dentro de parámetros donde las células
puedan sobrevivir se aplica una señal de referencia a seguir por la temperatura
descendente hasta alcanzar los -150ºC para después mantener constante este valor. La
actuación sobre el fluido criogénico se realiza actuando sobre sendas electroválvulas
que mezclan nitrógeno gaseoso caliente con nitrógeno gaseoso enfriado al pasar a
través de un serpentín por nitrógeno líquido, en una proporción tal que se logre
alcanzar la temperatura de referencia.
Las características más destacadas de estos sensores de temperatura son principalmente:
-
Resultan económicos, frente a otras alternativas.
Intercambiables.
Disponen de conectores estándar.
Capaces de medir un amplio rango de temperaturas.
Pueden fabricarse termopares suficientemente pequeños como para medir
temperaturas de muestras celulares.
Presentan no obstante unas limitaciones en la exactitud; no obstante, para el caso que
nos ocupa en el que se pretenden medir velocidades de enfriamiento del orden de
106ºC/s, pueden resultar irrelevantes.
Si bien esta técnica se ha utilizado en la implementación de la configuración del sistema d
vitrificación, se presenta a continuación una técnica novedosa que permitirá determinar con
exactitud la temperatura aprovechando el análisis espectral de la radiación electromagnética
dispersada (scattering) por la muestra al ser sometida a la acción de una fuente monocromática
(láser): efecto Raman.
3.3. ESPECTROSCOPÍA RAMAN
Como técnica alternativa a las anteriormente mencionadas para la determinación de la
temperatura de la muestra a criopreservar (sin interaccionar de ninguna forma sobre la
muestra de forma que no se alteren el comportamiento de las células por el solo hecho de
realizar la medida), se plantea el uso de las características propias del espectro Raman del
agua.
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93
Modelado matemático e
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sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
ESPECTRO RAMAN
El análisis mediante espectroscopía Raman se basa en hacer incidir un haz de luz
monocromática de frecuencia ÁQ sobre una muestra cuyas características moleculares se
desean determinar, y examinar la luz dispersada por dicha muestra. La mayor parte de la luz
dispersada presenta la misma frecuencia que la luz incidente pero una porción muy pequeña
presenta un cambio de frecuencia como resultado de la interacción de la luz con la materia. La
luz que mantiene la misma frecuencia ÁQ que la luz incidente se conoce como dispersión
Rayleigh y no aporta información alguna sobre la composición de la muestra analizada. La luz
dispersada que por su parte presenta frecuencias distintas a la de la radiación incidente, es la
que proporciona información sobre la composición molecular de la muestra y es la que se
conoce como dispersión Raman. Las nuevas frecuencias 5ÁX y %ÁX son las frecuencias Raman,
características de la naturaleza química y el estado físico de la muestra e independientes de la
radiación incidente.
Figura 37. Emisión de luz dispersa (scattered light) tras incidir luz incidente (incident light) sobre la muestra. Algunas
de las componentes de luz dispersada constituirán el espectro Raman, presentando componentes de frecuencia
diferentes a las de la radiación incidente.
Fuente: Immunome Research 2010
Las variaciones de frecuencia observadas en el fenómeno de dispersión Raman, son
equivalentes a variaciones de energía. Los iones y átomos enlazados químicamente para formar
moléculas y redes cristalinas están sometidos a constantes movimientos vibracionales y
rotacionales; estas oscilaciones se realizan a frecuencias bien determinadas en función de la
masa de las partículas que intervienen y del comportamiento dinámico de los enlaces
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94
Modelado matemático e
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existentes. A cada uno de los movimientos vibracionales y rotacionales de la molécula le
corresponderá un valor determinado de la energía molecular.
Cuando los fotones del haz de luz incidente, con energía hÁQ (donde h es la constante de
Planck) es mucho mayor que la diferencia de energía entre dos niveles vibracionales (o
rotacionales) de la molécula, chocan con ella de tal forma que la mayor parte la atraviesan pero
una pequeña fracción es dispersada (del orden de un foton por cada 1011 incidentes)
pudiéndose interpretar de la siguiente forma: el fotón incidente lleva a la molécula
transitoriamente a un nivel de energía vibracional (o rotacional) superior no permitido, el cual
abandona rápidamente para pasar a uno de los niveles de energía permitidos emitiendo un
fotón; la frecuencia a la cual resulta liberado este fotón dependerá del salto energético
realizado por la molécula, pudiendo distinguirse dos casos:
Si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón dispersado a la misma
frecuencia que el fotón incidente, se dice que el choque es elástico ya que no el fotón
ni la molécula sufren variaciones en su estado energético; la molécula vuelve al mismo
nivel de energía que tenía antes del choque y el fotón dispersado tiene la misma
frecuencia ÁQ que el incidente, dando así lugar a la dispersión Rayleigh.
Si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón dispersado a una frecuencia
diferente de la incidente, se dice que el choque es inelástico (existe transferencia de
energía entre la molécula y el fotón); en este caso pueden darse dos fenómenos:
o
Si el fotón dispersado tiene una frecuencia menor a la del incidente, se produce
una transferencia de energía del fotón a la molécula que, después de saltar al
estado de energía no permitido, vuelve a uno permitido mayor al que tenía
inicialmente; el fotón es dispersado con frecuencia ÁQ % ÁX y se produce la
conocida como dispersión Raman Stokes.
o
Si el fotón tiene una frecuencia superior a la del incidente se produce una
transferencia de energía de la molécula al fotón; esto implica que la molécula,
inicialmente antes del choque no se encontraba en su estado vibracional
fundamental sino en uno de mayor energía y después del choque pasa a este
estado. El fotón es dispersado con frecuencia ÁQ 5 ÁX y se produce la conocida
como dispersión Raman anti-Stokes.
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Figura 38. Clasificación de los diferentes tipos de termopares constituidos por metal -Base.
Cada material tendrá un conjunto de valores ÁX característicos de su estructura poliatómica
y de la naturaleza de los enlaces químicos que la forman.
El espectro Raman recoge estos fenómenos representando la intensidad óptica dispersada
en función del número de onda normalizado Á al que se produce.
APLICACIÓN DEL ESPECTRO RAMAN COMO SENSOR DE TEMPERATURA
La técnica de la espectroscopía Raman está bien definida como un método para medir
concentraciones en gases o líquidos con el fin de investigar la estructura molecular de
sustancias puras y medir temperaturas en llamas o en flujos de gases a alta temperatura.
Hay dos efectos diferentes que se pueden emplear para medir temperaturas de cuerpos
empleando la técnica de la espectroscopía Raman.
El primer efecto se basa en la ratio entre las moléculas de gas que están en un estado
vibracional excitado y las moléculas de dicho gas que por el contrario se encuentran en
un estado de reposo. Esta relación depende de la temperatura a la que se encuentra el
gas de acuerdo con la ley de Boltzman. El efecto requiere que las temperaturas del gas
se encuentren por encima de los 1000 K, dado que en otro caso el número de
moléculas en un estado excitado no será significativo. La aplicación más habitual de la
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espectroscopía Raman es en este sentido el medir la temperatura en una llama. En este
caso la temperatura de las llamas se puede calcular como una relación entre los picos
stokes y antistokes de un cierto componente como el nitrógeno por ejemplo o a través
de la forma de la línea vibracional del nitrógeno por ejemplo (Schrader, 1995).
Un efecto completamente diferente permite medir la temperatura del agua líquida
mediante el uso de la espectroscopía Raman. La forma del espectro Raman del agua
líquida es bastante diferente de la forma de dicho espectro en el caso del agua en
estado de vapor debido a que los enlaces de hidrógenos afectan a la vibración de los
enlaces OH. El número de enlaces de hidrógeno depende de la temperatura y la forma
del espectro Raman del agua líquida cambia por lo tanto también con la temperatura.
Walrafen describió la influencia de los enlaces de hidrógeno en la línea vibracional cercana
a los 3652 cm-1 ya en 1976. Él ya sugirió una dependencia de la temperatura de la forma del
pico Raman en la región entre 3000 y 3800 cm-1. Walfaren y Fujita e Ikawa (1989), más tarde,
utilizaron este efecto para determinar la estructura molecular del agua líquida y determinar la
energía de enlace de los enlaces de hidrógeno mediante el uso de espectroscopía Raman y
espectroscopía infrarroja.
Leonard y alumnos (1979) llevaron a cabo un primer intento de usar este efecto para la
medición de la temperatura del agua en los inicios de la década de los 70. Desarrolló el
esqueleto de un sistema LIDAR para medir la temperatura del gua del océano sobre grandes
áreas del mismo. Midió las temperaturas a 100 metros por debajo del nivel de la superficie del
agua. Dentro de una profundidad de 3 metros consiguió un promedio de ±1 K. Schwaiger
(1992) empleó por su parte el mismo efecto para medir temperaturas de gotas de agua.
J. Karl, M. Ottman y D. Mein en sus trabajos aplicaron la espectroscopía Raman para medir
la distribución de temperatura del agua a lo largo de un haz láser.
ESPECTRO RAMAN DEL AGUA LÍQUIDA
La dispersión Raman es un proceso inelástico de dispersión de la luz. Una molécula puede
dispersar luz de cualquier longitud de onda bien elásticamente (sin desplazamiento de longitud
de onda) o inelásticamente, en cuyo caso la luz dispersada es desplazada a una longitud de
onda diferente. El primer caso se denomina como dispersión Rayleigh y el segundo es conocido
como dispersión Raman. Las dispersiones inelásticas de la luz incidente implican que una cierta
cantidad de energía queda en la molécula. La pérdida de energía de los cuantos de luz
dispersada corresponde con la energía de una cierta vibración de la molécula ocasionada por el
proceso de dispersión.
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Aquellas vibraciones de la molécula como por ejemplo las vibraciones de estiramiento o
rotacionales, son propias y características de la molécula. Esto permite utilizar la
espectroscopía Raman en análisis químico cuantitativo o investigar la estructura de la molécula.
El desplazamiento Raman de una cierta molécula depende de la energía de la vibración de
una molécula, de su estructura, de la distancia atómica y de los correspondientes pesos
atómicos.
Figura 39. Modos vibracionales de las moléculas de agua. (a) vibración de curvatura (b) vibración por estrechamiento
asimétrica (c) vibración por estrechamiento simétrico
Este efecto reduce la energía de vibración asociada a los estrechamientos de los enlaces de
los O-H y reduce el desplazamiento Raman. El pico del agua líquida es mucho más amplio que
el pico del vapor a causa de que el ángulo entre los enlaces OH y el enlace de hidrógeno puede
ser muy diferente. La influencia de los enlaces de hidrógeno en la vibración de estrechamiento
de los enlaces O-H depende del ángulo entre el enlace de hidrógeno y los enlaces OH.
Figura 40. Espectro Raman de una muestra de vapor de agua
Fuente: M. Goldbrunner, J. Karl, D. Hein
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Figura 41. Espectro Raman de una muestra de agua líquida
Fuente: M. Goldbrunner, J. Karl, D. Hein
La forma de los picos agua líquida cambia con la temperatura como se muestra en la figura
42.
Warafen explicó este efecto con una reacción de equilibrio dependiente de la temperatura
entre los hidrógenos enlazados y los hidrógenos no enlazados de los osciladores OH en
estrechamiento y expansión en agua líquida. El número de enlaces de hidrógeno establecidos
decrece a medida que se produce un aumento de la temperatura.
Este efecto puede ser utilizado para medir temperaturas del agua con un error de ±2ºK
utilizando un algoritmo descrito en Karl and Weiss, en 1997.
La figura siguiente muestra la forma del espectro Raman medido para el agua líquida a
temperaturas entre 30 y 100 ºC. Después de la extracción de la línea base se observa que los
picos de la curva del espectro del agua normalizados se cruzan todos en el mismo punto (punto
isosbéstico) tal y como es documentado por Walfaren.
La estructura molecular real del agua líquida es bastante complicada pero en términos
sencillos se puede decir que el pico del agua consta realmente de dos picos con máximos en
577,6 nm y 589,4 nm que representan los hidrógenos enlazados de los enlaces OH y los
hidrógenos no enlazados de los enlaces OH no enlazados.
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Figura 42. Espectro Raman del agua para temperaturas entre 30 y 100ºC
Fuente: M. Goldbrunner, J. Karl, D. Hein
La forma de las diferencias en el espectro entre los dos picos relevantes (577,6 y 589,4 nm)
resultan útiles para obtener la relación entre los picos de intensidad de los hidrógenos
enlazados y los hidrógenos no enlazados de las moléculas.
Asumiendo un equilibrio dependiente de la temperatura entre los osciladores por
estrechamiento de los hidrógenos enlazados y de los hidrógenos no enlazados, este equilibrio
puede ser interpretado además como un equilibrio entre hidrógenos enlazados (polímero) y los
hidrógenos no enlazados (monómeros) de las moléculas de agua.
La relación de concentración de los enlaces establecidos representa la constante de
equilibrio de este equilibrio. Esta constante de equilibrio se puede expresar a través de la
entalpia de los enlaces de hidrógeno ∆H0 y la entropía (Atkins, 1986)
UÂW
½ 6
7
UÃW
UÄ % W?Å>?Æ•<•2Å•
½ 6
7
UÄ % W>?Æ•<•2Å•
∆
Q
5 Ƃ Q
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Asumiendo que los hidrógenos enlazados y lo no enlazados de los enlaces O-H del agua
causan picos en el espectro Raman con una sección cruzada diferencial SM y SP la ecuación
anterior se puede escribir como:
ÇÈ ŸÉ
½ 6
7
ÇÉ ŸÈ
∆
Q
5 Ƃ Q
O bien, estableciendo la relación entre la ratio de las intensidades y la temperatura:
ŸÉ
½ 6 7
ŸÈ
q
1
5
Aplicando aproximación lineal por el método de los mínimos cuadrados a los valores
experimentales midiendo las intensidades para diferentes temperaturas se determina el valor
de los coeficientes c1 y c2. Utilizando el principio de Vant´Hoffs para calcular la entalpía de los
enlaces de hidrógeno ∆H0 obtenemos para c1 un valor de 10.47 103 KJ/kmol que resulta ser una
buena aproximación a las entalpías publicadas.
Si la relación entre las intensidades de los picos del espectro
`Ê
`Ë
se determina a partir de los
datos medidos, la temperatura del agua puede ser calculada a través de:
q
Ÿ
½ | É } %
ŸÈ
1259,66Ì
Ÿ
½ | É } % 3.92
ŸÈ
Así pues si empleando algún procedimiento de evaluación de la temperatura
determinamos el valor de los niveles de sendos picos, en nuestro sistema de control será fácil
calcular el valor de la temperatura estimada para emplearlo como medio para actuar sobre el
láser y conseguir que siga la señal de referencia.
PROCEDIMIENTOS PARA EVALUAR LA TEMPERATURA MEDIANTE ESPECTRO RAMAN
Hay dos métodos principales para obtener la relación de intensidad entre los picos del
espectro Raman. El primer método requiere del uso de un monocromador o un espectrógrafo
tal y como se ha mencionado anteriormente y utiliza toda la información espectral para la
evaluación de la temperatura. El espectrógrafo o monocromador proporciona un espectro
Raman completo permitiendo calcular la relación
la temperatura.
`Ê
`Ë
con bastante precisión, y por tanto estimar
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La principal ventaja de este método es que cualquier señal Rayleigh, Mie o fluorescencia
puede ser separada y eliminada fácilmente.
La extracción de la línea base se puede hacer automáticamente utilizando un
procedimiento de ajuste lineal que separe las señales del espectro. El procedimiento de
procesamiento de imagen presentado por Karl y Weiss en 1997 proporcionan temperaturas
con un error de menos de ± 2ºK dentro del rango de temperaturas de 20ºC y.
El segundo método para obtener las temperaturas del agua utiliza filtros de interferencia
tipo paso banda estrecha. La idea es utilizar dos filtros paso de banda estrecha que transmitan
principalmente las señales Raman de los hidrógenos enlazados y los no enlazados de los
enlaces O-H.
El haz láser puede ser expandido mediante a una lámina de luz. Una cámara CCD muestrea
la luz dispersada con o sin un espectrógrafo. Las dos imágenes de la lámina de agua tomadas
con diferentes filtros de interferencia son necesarias para evaluar la distribución de la
temperatura del agua.
Utilizando dos filtros de interferencia con una longitud de onda central en la longitud de
onda Raman de los hidrógenos enlazados y los no enlazados se hace posible obtener la relación
entre intensidades a partir de dos mediciones separadas con sendos filtros. Utilizando la línea
azul de un laser de argón ion a 488 nm se requiere el uso de dos filtros paso de banda cercana
a 577 nm y 589 nm.
Es evidente que la relación de las intensidades transmitidas a través de filtros depende de
la temperatura del agua. La integración de los espectros proporciona la intensidad total
transmitida a través de los filtros.
Este método, denominado, de dos colores tiene que tratar con tres importantes
problemas:
Los filtros de interferencia paso banda de banda estrecha son habitualmente filtros del
tipo Fabry-Perot que operan con el mismo principio que los interferómetros FabryPerot. La longitud de onda central real del filtro depende del ángulo de incidencia. Es
obvio que este efecto causará errores severos y sólo es válido para calcular valores de
temperatura del agua a partir de la relación de intensidades si el ángulo de incidencia
es muy pequeño.
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El segundo problema del método de los dos colores es causado por la fluorescencia.
Altas tasas de fluorescencia incrementan las intensidades de los picos de 578 nm y 590
nm y por tanto distorsionan la relación entre las intensidades de los picos.
Con agua pura la mayor parte de la señal de fluorescencia se origina de la superficie del
agua. La reflexión y la dispersión de la luz laser sobre la superficie sólida del agua
generan fluorescencia adicional con lo que mejora la tasa de fluorescencia total.
Para cualquier aplicación de la técnica de los dos colores el tercer efecto será el más
importante. Cualquier disolvente o partícula causan fluorescencias adicionales que
podrían ser incluso más intensas que la señal Rayleigh. La suciedad de la ventana del
láser y espejos mejorará la fluorescencia también.
La mejor forma para eliminar el error causado por la fluorescencia es medirla utilizando
un espectrógrafo.
4. CALENTAMIENTO DE LA MUESTRA MEDIANTE LÁSER
Uno de los problemas a resolver en el sistema de vitrificación por laser que se está
proponiendo es precisamente el núcleo del sistema: ¿cómo conseguir que la muestra, en su
mayor parte agua, se caliente por acción del láser?
En la figura siguiente se muestra la absorción del agua para diferentes longitudes de onda
de una radiación electromagnética con objeto de decidir que mecanismo podemos emplear
para lograr un adecuado calentamiento de la muestra empleando radiación láser.
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Figura 43. Curva de absorción de radiación electromagnética del agua
Evidentemente la solución más económica es emplear radiación láser que opere en el
rango del visible, es decir la región del espectro electromagnético que el ojo humano es capaz
de percibir, siendo el rango típico en el que respondería un ojo humano el que se extiende
entre 400 y 700 nm. Con objeto de comprobar si es posible utilizar directamente una fuente
láser en esta banda como medio de calentamiento se muestra a continuación la curva de
absorción para el agua en el espectro visible:
Figura 44. Descomposición del espectro visible.
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Figura 45. Absorción de la radiación electromagnética por parte del agua en espectro visible.
Como puede comprobarse en las curvas anteriores el agua es prácticamente transparente a
la radiación electromagnética en el rango del visible, por lo que para su uso directo se
requeriría de un láser muy potente de tal forma que la mayor parte de su radiación se estaría
desperdiciando. No es por tanto una solución técnicamente eficiente. Se plantean por lo tanto
las siguientes alternativas.
Utilización de laser infrarrojo: a la luz de la forma de la curva de absorción de radiación
electromagnética por parte del agua en el espectro de luz visible se comprueba que es
poco eficiente emplear este tipo de láser para calentar la muestra; no obstante la curva de
absorción electromagnética, en el espectro infrarrojo (situadas inmediatamente a
continuación de la luz roja extendiéndose entre longitudes de oda de 780 nm a 1mm)
presenta sendos máximos interesantes a 1455 nm y 1930.5 nm respectivamente tal y
como se muestra a continuación:
Como puede observarse, el máximo relativo de la curva se alcanza a la longitud de onda de
1930.5 nm donde la absorción es mínima; no obstante debido a lo elevado de la pendiente
en el entorno de dicha longitud de onda se tiene un pico muy estrecho, de tal forma que
es difícil y muy costoso desde el punto de vista del control mantener esta frecuencia
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Figura 46. Absorción de la radiación electromagnética por parte del agua en espectro infrarrojo.
Es por ello que se opta como posible solución para calentar la muestra el uso de
dispositivo láser a frecuencia infrarroja de 1455 nm.
Utilización de laser en el espectro visible: evidentemente si bien el uso de un laser de
radiación infrarroja es una solución plausible el uso de dispositivos láser que operan en el
espectro visible resulta una opción notablemente más simple y económica. Si bien su uso
directo sobre la muestra no es factible debido a lo reducido del coeficiente de absorción
de agua en esta banda es posible lograrlo principalmente de dos formas:
o
Utilizaremos un dispositivo láser que emita en el espectro de la luz visible. Por
ejemplo se ha utilizado para los diferentes experimentos un laser de luz verde.
Con objeto de aumentar la absorción de la radiación electromagnética de la
muestra utilizaremos un colorante no tóxico y que no altere el comportamiento de
las células a criopreservar; si utilizamos un laser verde lo ideal será utilizar un
colorante rojo que permita absorber gran parte de dicha radiación y lograr un
calentamiento de la muestra mucho más rápido y eficiente. Este sistema es
compatible con cualquiera de las técnicas de determinación de la temperatura:
uso de rodamina (puede emplearse esta misma rodamina como colorante y
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seleccionar un laser de luz visible que emita en una frecuencia adecuada en el
espectro visible), empleo de termopar y espectroscopía Raman.
o
Si optamos por emplear como sensor de temperatura para el sistema de
vitrificación mediante radiación láser un elemento termopar, que no es más que
un elemento metálico (punto caliente) al que se conectan dos metales de
propiedades distintas y que generan una diferencia de tensión relacionada con la
temperatura, es posible utilizar este mismo elemento para lograr calentar la
muestra; apuntaremos el laser de luz verde (utilizado durante las experiencias)
directamente sobre el termopar, logrando un doble objetivo: por un lado al
calentarse el termopar, por conducción se transferirá el calor a la muestra
circundante, y por otro permitirá conocer en cada instante la temperatura a la que
se encuentra la muestra tanto durante la fase de acción del láser como cuando
este se apaga y tiene lugar el proceso de vitrificación. Este sistema es el que se ha
utilizado en el set-up montado con objeto de logar la vitrificación; se utiliza para
calentar la muestra un laser verde y como medio indirecto para lograr el
calentamiento de la muestra, el propio termopar que se utiliza para sensar la
temperatura y decidir, en virtud de una determinada ley de control, la acción a
ejercer sobre el propio laser.
5. ESQUEMA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN REALIZADO
Una vez planteadas las opciones para resolver los principales problemas a que debe
enfrentarse la técnica de vitrificación ultrarrápida de muestras biológicas (modeladas como
agua pura desde el punto de vista matemático) mediante el uso de luz láser pasamos a
describir el sistema (set-up) montado inicialmente:
-
Con objeto de lograr un medio externo de muy baja temperatura (-150ºC) se utilizó un
recipiente de nitrógeno gaseoso a cuya salida se le acopla una unión tipo T d forma que
se generan dos caminos para el gas: uno de ellos directo y otro se hace pasar mediante
un serpentín a través de un recipiente conteniendo nitrógeno líquido de forma que por
conducción se consigue que el nitrógeno gaseoso alcance temperaturas muy reducidas.
La clave de este sistema para conseguir de forma controlada un medio de baja
temperatura se encuentra en mezclar el nitrógeno gaseosos que discurre por estos dos
caminos y que se encuentran a diferentes temperaturas. Para ello en el extremo final
de estos trayectos se acoplan sendas electroválvulas cuya apertura y cierre controlado
por ordenador permitirá realizar la mezcla de la forma más adecuada posible. Las
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salidas de sendas electroválvulas se interconectan entre si mediante otra unión tipo T,
alcanzando así la mezcla el capilar de policarbonato en el que se situará la muestra.
Con objeto de sensar en todo momento la temperatura del entorno frío se utilizará un
dispositivo termopar en contacto con el nitrógeno gaseoso y conecta a una tarjeta de
adquisición de datos. La diferencia de tensión que se genera con las diferentes
temperaturas permitirá al sistema de control no solo conocer dicha temperatura sino
actuar sobre las electroválvulas (también conectadas a la tarjeta de adquisición de
datos) para mantener un perfil de temperaturas adecuada; este perfil en los instantes
iniciales del funcionamiento del sistema será una línea recta decreciente hasta alcanzar
la temperatura deseada de -150ºC.
-
La muestra biológica a criopreservar se instala en un capilar de policarbonato (presenta
una adecuada transferencia de calor) y será sometida exteriormente a la acción por
conducción del nitrógeno gaseoso. La transferencia se realizará por conducción y no
por convección ya que si bien esta última es mucho más eficiente, resulta más difícil de
controlar.
-
El elemento fundamental de la técnica de vitrificación ultrarrápida propuesta es sin
duda el elemento láser. Se utiliza, por su mayor economía y facilidad de control un
láser de luz visible de color verde. Este láser se apuntará directamente a un segundo
termopar instalado en el interior del capilar en contacto con la muestra a criopreservar
de forma que será este sensor quien directamente reciba la acción del láser y por
conducción se la traslade al resto de la muestra; de esta forma evitamos la necesidad
de utilizar ningún tipo de colorante y logramos calentar la muestra de forma muy
eficiente.
El guiado de la luz láser desde el dispositivo hasta la muestra se realizará empleando
uno de los canales de un microscopio permitiendo gracias a su objetivo focalizar la
radiación sobre las células.
El termopar utilizado indirectamente para calentar la muestra se encuentra conectado
a una tarjeta de adquisición de datos que permitirá al sistema de control conocer en
todo momento la temperatura de la muestra de tal forma que de acuerdo a una
determinada ley de control se pueda actuar sobre el láser y lograr que se siga una
determinada referencia (temperatura de 37ºC).
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6. CONCLUSIONES
El objeto principal de este proyecto ha sido desarrollar tanto desde el punto de vista
matemático como de su implementación práctica, un sistema que permita la vitrificación de
pequeñas muestras celulares con una velocidad suficientemente elevada como para evitar la
formación de hielo intracelular y extracelular sin necesidad de emplear cantidades relevantes
de sustancias crioprotectoras que pudieran resultar tóxicas.
El sistema que se ha propuesta se basa en el uso de radiación láser para calentar la muestra
en combinación con la acción de nitrógeno gaseoso sobre un capilar de policarbonato que
proporciona un entorno con una temperatura muy baja (entorno a -150ºC) de tal forma que
anulando en un momento determinado el efecto del láser la muestra quede sometida a un
fenómeno de conducción que transporte el calor hacia zonas más frías, con una velocidad de
enfriamiento notablemente elevada. Se ha comprobado tanto teórica como
experimentalmente que pueden alcanzarse tasas de enfriamiento en torno a 106 ºC/s, en
función del tamaño de la muestra.
El interés por desarrollar este sistema radicaba, en su origen en explorar un posible camino
que permitiese la criopreservación de óvulos humanos, algo que hasta hace pocos años era
tarea harto imposible. Si bien esta técnica que aquí se propone resulta viable, el devenir del
tiempo ha permitido el desarrollo de técnicas basadas en el uso de combinaciones apropiadas
de sustancias crioprotectoras, que sin ser tóxicas para dichas células (especialmente sensibles a
la presencia de tales sustancias), evitan la formación de hielo durante el proceso de inmersión
directa en nitrógeno líquido, de tal forma que se logra el objetivo deseado con rapidez y de
modo económico, sin necesidad de someter a las células a radiación electromagnética. Es por
tanto que esta técnica aquí propuesta no será viable comercialmente, aunque pudiera tener
aplicación en algún campo.
El sistema implementado utiliza, tal y como se ha comentado anteriormente, termopares
para llevar a cabo las mediciones de temperatura y a partir de ellas decidir la acción a realizar
sobre el dispositivo láser. Como posible mejora a dicho sistema se propone sustituir tales
sensores por un espectrógrafo Raman, que permita medir los picos característicos del espectro
(con ayuda de una cámara CCD) y de esta forma estimar la temperatura. Esta técnica propuesta
permitirá implementar el sistema de vitrificación sin necesidad de utilizar termopares, de una
forma fiable pero también permitirá, sin alterar la muestra durante el proceso de medida
obtener una calorimetría de la célula que puede proporcionar mucha información acerca de los
procesos que tienen lugar en la misma.
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Figura 47. Imagen de un óvulo humano. Lograr su criopreservación fue un reto durante varios años. El presente
trabajo explora uno d los posibles caminos para lograrlo aunque no la más implementable actualmente, gracias al
desarrollo de técnicas más sencillas basadas en la utilización de adecuadas combinaciones de crioprotectores.
En los apéndices II y III se adjunta la memoria de propuesta de proyecto de investigación
que se elaboró con objeto de solicitar fondos para el desarrollo del sistema aquí mencionado.
En dicha memoria se recogen las experiencias realizadas en este sentido, los modelos
matemáticos de comportamiento de la célula, (tanto bidimensionales como tridimensionales)
así como las ventajas que supone el aprovechamiento de la forma del espectro Raman del agua
para la obtención de la temperatura de la muestra. La investigación que se proponía así como
los resultados y modelos matemáticos aportados fue considerada por la dirección del Instituto
de Salud Carlos III suficientemente interesante y prometedora como para que fueran
concedidos los fondos correspondientes, en el ámbito de la investigación biomédica.
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CAPÍTULO IV
BIBLIOGRAFÍA
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Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
13. Maurizio Becucci, Stefano Cavalieri, Roberto Eramo, Lorenzo Fini and Marzia Materazzi.
Accuracy of remote sensing of water temperature by Raman spectroscopy. APPLIED
OPTICS, vol. 38 Nº 6, 20 Febrero, 1999.
14. M. Necati Özisik. Heat Conduction. Editorial John Wiley & Sons, 1993
15. Paul M. Danehy and David W. Alderfer. Survey of Temperature Measurement
Techniques for studying underwater shock waves. Advanced Sensing and Optical
Measurement Branch. NASA Langley Research Center. Hampton Virginia, US 23681.
16. P. Mazur, The freezing of biological systems. Science, vol. 168, 939 – 949, 1970.
17. P. Mazur, Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physol., vol. 247.
1984.
18. R.E. Pitt, S.P. Myers, D.V. Lynch, P.L. Steponkus, Quantitative analysis of the probability
of ice intracellular formation during freezing of isolated protoplasts. Cryobiology, vol.
26, 472 – 484. 1989.
19. Richard W. Hill, Gordon A. Wyse, Fisiología animal. Editorial Médica Panamericana,
2006
20. Risco R, Elmoazzen H, Doughty M, He X and Toner M, Thermal peformance of quartz
capillaries for vitrification. Cryobiology (2007).
21. R.L. Sutton, Critical cooling rates to avoid ice crystallization in aqueous cryoprotectant
solutions containing polymers. J. Chem. Soc. Faraday Trans., vol 87, 3747 – 3751. 1991
22. Robert J. Milewski, Yuaro Kumagai, Katsumasa Fujita, Daron M. Standley y Nicholas I.
Smith. Automated processing of label-free Raman microscope images of macrophage
cells with standarzad regression for high-throughput analysis. Inmunome Research
2010, 6:11.
23. Yaochun Shen, Zuhong Lu, Stephen Spiers, Hugh A. MacKenzie, Helen S. Ashton, John
Hannigan, Scott S. Freeborn and John Lindberg, Measurement of the optical absorption
coefficient of a liquid by use of a time-resolved photoacustic technique. Applied optics,
Vol. 39, Nº 22. 1 Agosto 2000.
Departamento Física Aplicada III | Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla
113
Modelado matemático e
implementación práctica de
sistema de vitrificación ultrarápida mediante radiación láser
APÉNDICES
Departamento Física Aplicada III | Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla
114
APÉNDICE I. CONSTANTES FÍSICAS
Constante
Velocidad de la luz en el vacío
Permeabilidad del vacío
Permitividad del vacío
Impedancia del vacío
Constante de la gravitación
Constante de Plank
Carga elemental
Magnetón de Bohr
Constante de la estructura fina
Constante de Rydberg
Radio de Bohr
Masa del electrón
Longitud de onda Compton
Radio clásico del electrón
Momento magnético del electrón
Masa del protón
Momento magnético del protón
Masa del neutrón
Momento magnético del neutón
Masa de la partícula alfa
Constante de Avogadro
Constante de los gases
Constante de Boltzmann
Constante de Stefan-Boltzmann
Ley de desplazamiento de Wien
Difusividad térmica del agua
Símbolo
Valor
Unidades
c
(mu)0
(épsilon)0
Z0
G
h
e
(mu)B
(alfa)
Roo
a0
me
(lambda)C
re
(mu)e
mp
(mu)p
mn
(mu)n
m(alfa)
NA
R
k
(sigma)
b
α
299792458
1.2566370614 10-6
8.854187817 10-12
376.730313461
6.673 10-11
6.62606876 10-34
1.602176462 10-19
9.27400899 10-24
7.297352533 10-3
10973731.568549
5.291772083 10-11
9.10938188 10-31
2.426310215 10-12
2.817940285 10-12
-9.28476362 10-24
1.67262158 10-27
1.410606633 10-26
1.674927 10-27
-9.662364 10-27
6.64465598 10-27
6.02214199 1023
8.314472
1.3806503 10-23
5.6704004 10-8
2.8977686 10-3
1.47 10-7
m/s
N A-2
F/m
Ohm
m3/(kg s2)
Js
C
J/T
m-1
m
kg
m
m
J/T
kg
J/T
kg
J/T
kg
mol-1
J m / mol
J/K
W / (m2 K4)
mK
m2/s
Departamento Física Aplicada III | Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla
115
MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
TITULO:
Sistema de enfriamiento ultrarrápido basado en la aplicación de radiación láser y espectrofotometría Raman
del agua para criopreservación celular mediante vitrificación.
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
DURACIÓN:
1 año
2 años
3 años
RESUMEN (Objetivos y metodología del proyecto):
(Máximo 250 palabras)
Objetivo: Existen tipos celulares que no pueden ser criopreservados con facilidad mediante las técnicas
convencionales, como por ejemplo los oocitos humanos, ciertas líneas tumorales, etc. La vitrificación (muy
altas velocidades de enfriamiento) parece ser la única alternativa. Sin embargo, la alta concentración de
crioprotector necesaria para vitrificar resulta frecuentemente tóxica. Con el presente proyecto se pretende
alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo. Esta velocidad de
enfriamiento es muy superior a la convencional mediante inmersión en nitrógeno líquido (varios miles de
grados por segundo), y suficiente para vitrificar incluso agua pura.
Metodología: En una primera etapa, la radiación láser infrarroja focalizada sobre una célula o un conjunto de
células mediante el objetivo del microscopio consigue mantener la temperatura de esta permanentemente a
37º C, aun cuando todo medio extracelular se va enfriando hasta alcanzar -150º C. Llegados a este punto,
en la segunda etapa el láser se desconecta súbitamente y la célula vitrifica. El control permanente de la
temperatura de la célula durante la primera etapa se realiza utilizando la forma del espectro Raman del
agua. La relación de intensidades entre sus dos picos depende de la temperatura de esta, de modo que la
potencia del láser infrarrojo viene controlada por la forma de la señal Raman. Intentos previos del control
mediante la fluorescencia de la rodamina B (pigmento fluorescente dependiente de la temperatura) no son
viables debido a la eyección del soluto cuando aparece hielo, perdiéndose el control por la pérdida de la
calibración de la intensidad de la fluorescencia con la temperatura. La espectrofotometría Raman evita este
handicap.
TITLE:
Ultra-fast laser cooling technique based on laser radiation and Raman spectrophotomentry of water for cell
criopreservation by vitrification.
SUMMARY (Objectives and methodology):
Objectives: Many cellular types that cannot be criopreserved by means of conventional techniques: human
oocytes and certain tumoral lines are two examples. Vitrification (very high cooling rates) seems to be the
only possibility for them. However, the high concentration of cryoprotectant needed to vitrify is frequently
toxic. With the present project we will reach cooling rates of the order of the million of degrees per second.
This cooling rate is very superior to the conventional one by plunging into liquid nitrogen (several thousands
of grades per second), and enough to vitrify even pure water.
Methodology: In a first step, the infrared laser radiation in focalized on a single cell or a group of cells by
means of the objective of the microscope. This allows to keep its temperature permanently at 37º C, even
when all extracellular media goes cooling down until reaching -150º C. When this situation is reached, in the
second step the laser is suddenly disconnected and the cell vitrifies. The control of the temperature of the cell
during the first step is carried out using the form of the Raman spectrum of the water. The relationship of
intensities of its two picks depends on the temperature of the water; so the power of the infrared laser is
controlled by the form of the Raman signal. Previous attempts to the control this temperature by means of the
fluorescence of the rhodamine B (fluorescent dye temperature-dependent) has shown not viable due to the
ejection of the solute when ice appears, getting lost the calibration of the intensity of the fluorescence with the
temperature and therefore the control of the temperature. The Raman spectrophotometry will overcome theis
trouble.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Título y resumen
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Antecedentes y estado actual del tema (Citar las referencias incluidas en el apartado siguiente)
(Máximo 3 páginas)
La criopreservación de material biológico en general y de células aisladas en particular es una imperiosa
necesidad de la biotecnología moderna. Existen dos procedimientos para tal fin:
I)
“Low cooling rate”, con bajas concentraciones de crioprotector y control-optimización de la (baja)
velocidad de enfriamiento, y
II)
“Vitrification”, con altas concentraciones de crioprotector y muy altas velocidades de enfriamiento.
En la técnica “Low cooling rate”, la célula sufre una importante deshidratación, consecuencia de la cual,
entre otras causas, hace que este procedimiento no sea siempre aplicable. En estos casos, la vitrificación se
impone como la única alternativa. La superioridad de la vitrificación reside básicamente en la ausencia (o
importante reducción) de la necesidad de deshidratación, conservando por lo tanto al máximo la estructura
celular o del tejido.
Sin embargo, la vitrificación tampoco esta ausente de problemas, todos ellos provenientes de las altas
concentraciones de crioprotector (que juega el papel de agente vitrificante) necesarias. Estas
concentraciones de crioprotector pueden ser reducidas sensiblemente, o incluso la necesidad misma de
crioprotector puede ser eliminada por completo, si la velocidad de enfriamiento de la muestra fuese varios
órdenes de magnitud por encima de los empleados convencionalmente, y que básicamente son los
alcanzados mediante una rápida inmersión en nitrógeno liquido (-196 C).
En Harvard Medical School & Massachusetts General Hospital (Center for Engineering in Medicine, Boston,
USA) empezamos a implementar una novedosa técnica que contiene a la vez las ventajas de la vitrificación
y las ventajas de usar bajas (no tóxicas) concentraciones de crioprotector. La técnica esta basada en la
posibilidad teórica de un enfriamiento ultrarrápido de las células mediante la aplicación de radiación láser.
Las ventajas que tal sistema tendría serían numerosas, y sus potenciales aplicaciones en el campo de la
medicina irían desde la criopreservacion de óvulos u otras células muy sensibles, hasta el posible
escalamiento para su uso con grandes muestras de tejidos [1].
El proyecto se encuentra en una fase muy avanzada, tanto por el intenso trabajo teórico que otros
investigadores han realizado desde 1999 en el proyecto [2], como por el trabajo experimental que el
solicitante (Ramón Risco), ha realizado durante un año en dicho centro, cofinanciado por el Ministerio de
Educación y por “Center for Engineering in Medicine” (Harvard Medical School).
La idea central del proyecto consiste en alcanzar una situación estacionaria en la que la célula se encuentre
a 37ºC mientras que todo el medio extracelular se encuentre a –150ºC. Para conseguir dicha situación, la
célula se deposita sobre la plataforma de un criomicroscopio y se procede al enfriamiento controlado de
dicha plataforma. Sin embargo, al tiempo, la célula es calentada mediante un haz de luz láser muy
focalizado por el objetivo del microscopio. Cuando la situación es la descrita anteriormente (célula a 37ºC y
plataforma del criomicroscopio a -150ºC), el láser se desconecta, consiguiéndose una velocidad de
enfriamiento de millones de grados por segundo (dado lo pequeño de la muestra caliente en relación al baño
frío exterior). La principal dificultad reside en realizar un correcto control, o sea en depositar la cantidad justa
de radiación sobre la célula, de modo que no sea ni tan baja como para no mantener la celula
permanentemente a 37ºC, ni tan alta como para producir daño por hipertermia. Como sistema sensor de la
temperatura de la célula se usó rhodamina B, un pigmento fluorescente cuya intensidad de emisión es
sensible a la temperatura. Un segundo haz laser a 514.5 nm se encarga de excitar la fluorescencia de la
rhodamina, reemitiendo a 590 nm con una intensidad tanto mayor cuanto mas fría se encuentre la muestra.
Mediante este procediento, el solicitante ha implementado un sistema sensor de temperatura de la célula
con una precisión superior a 1ºC. En la figura 3b (anexo) se puede apreciar la sensibilidad que hemos
obtenido. Un fotodetector se encarga de sensar la intensidad de la fluorescencia; la señal es digitalizada y
procesada por la computadora, que envía una señal de control al láser de calentamiento con la cantidad de
energía que este debe depositar para manterner la temperatura de la célula siempre a 37ºC. El problema
principal de esta forma de realizar el control basado en la dependencia de la fluorescencia de la rhodamina
con la temperatura se presenta cuando aparece hielo extracelular (figura 4c). En ese momento, la zona que
no contiene cristales de hielo concentra (por eyección de la fase sólida) el soluto, en este caso la rhodamina,
de forma que se pierde la referencia de la intensidad de la fluorescencia y por tanto la calibración
fluorescencia/temperatura de la célula. En el presente proyecto deseamos implementar UN NUEVO
SISTEMA SENSOR DE TEMPERATURA mediante espectroscopía Raman. En los apartados de esta
memoria: Hipótesis, Objetivos y Metodología se explica en detalle esta variante.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Antecedentes y estado actual del tema
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
Partes del proyecto desarrolladas hasta ahora:1.Construcción de un criomicroscopio especial que evitase el
uso de materiales fotosensibles. 2.Calibración de la fluorescencia de rhodamina con la temperatura
mediante lector de placas. 3.Calibración de la fluorescencia de rhodamina mediante criomicroscopio.
4.Vitrificacion de agua mediante enfriamiento ultrarapido con láser. 5.Vitrificacion de solucion con agente
vitrificante mediante enfriamiento ultrarrápido con láser. 6.Vitrificación de fibroblastos (3T3-S4).
1.
El criomicroscopio se diseñó y se construyó con el estricto requisito de no-absorción de la luz láser.
Los criomicroscopios comerciales controlan la temperatura mediante un portaobjetos recubierto con “Tin
Oxide” conductor de la corriente eléctrica (700 ohms/cm aprox.), y produciendo calentamiento por efecto
Joule. En nuestro caso, el portaobjetos está constituido por un capilar, en el que se deposita la muestra y en
el que se introduce un microsensor de temperatura basado en un termopar tipo T cuya señal es
acondicionada mediante el amplificador operacional OP741. Dicho capilar es de borosilicato transparente de
seccion rectangular, lo que permite el análisis de la muestra bajo el microscopio. Este capilar va inmerso
dentro de una cámara por la que circula nitrógeno gaseoso en régimen turbulento a la temperatura deseada,
entre 40 C y –150 C. Mediante el sensor de temperatura se cierra el bucle de control, siguiendo el
enfriamiento de la muestra en el criomicroscopio el protocolo establecido en la computadora que realiza el
control sobre las válvulas que regulan el flujo del nitrogeno frío y caliente.
2.
La calibración inicial de la fluorescencia de la rhodamina con la temperatura se realizó con un lector
de microplacas modificado. En uno de los pocillos fue introducido un termopar y así se pudo establecer la
dependencia de la fluorescencia de la rhodamina con la temperatura y la concentración de la misma. La
curva de calibración se muestra en la figura 3a.
3.
Seguidamente se realizó la calibración de la rhodamina con el criomicroscopio, cuyo detalle se ha
resumido en le punto 1. Para ello el microscopio fue dotado de un sensible fotodetector capaz de recoger las
variaciones en la intensidad de la fluorescencia de la rhodamina cuando la temperatura varía un grado
centígrado. La sensibilidad del sistema se muestra en la figura 3b.
4.
Con este sistema de control se abordó la vitrificacion de agua pura con rhodamina. El papel de la
rhodamina es doble: por una lado sirve de sensor de la temperatura de la muestra. Por otro, permite el
calentamiento de la muestra, ya que solamente se usa un láser a 514.5 nm y esta longitud de onda es poco
absorbida por el agua. En el agua pura es difícil mediante procedimientos exclusivamente ópticos distinguir
el estado de sólido amorfo del estado cristalino. Las imágenes que se obtuvieron (figuras 4ba y 4c) en
cualquier caso apuntan a que, si no se alcanzó el estado amorfo, con seguridad si que al menos se llego a
una estructura muy distinta y posiblemente consistente en microcristales (con frecuencia inocuos en la
criopreservación de muestras biológicas).
5.
La adición de 10% de glicerol permitió asegurar la obtencion del estado vítreo tras el protocolo de
enfriamiento ultrarrapido. Para ello una vez que se desconectó el laser, se observó una zona transparente
(estado vítreo) rodeada de una zona opaca (zona cristalina). La transparencia es una garantía, casi
indiscutible, de la existencia del estado amorfo. Para mayor garantia, sin embargo, se observó el
comportamiento de la muestra tras el recalentamiento. Así, la muestra se tornó súbitamente opaca toda ella,
evidencia del preceso se desvitrificación (ver figuras 5a-c).
6.
Por último se aplicó la técnica a la vitrificación de fibroblastos (3T3-S4). En la figura se puede
observar la morfología de los fibroblastos que han seguido el protocolo de enfriamiento ultrarrápido (figura
6a) , comparada con la morfología de los fibroblastos que han seguido el protocolo de enfriamiento impuesto
por el criomicroscopio (figura 6b). En desarrollos posteriores de este proyecto se harán determinaciones (no
sólo morfológicas) de la viabilidad de estos fibroblastos, posiblemente con Calcein-AM
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Antecedentes y estado actual del tema
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Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Bibliografía más relevante
(Máximo 1 página)
Bibliografia:
[1] Ramon Risco and Jorge Aguilar. “Microwaves and vascular perfusion: getting very fast organ cooling
rates”. CRYO2004-Beijing, July 15-19, 2004. 41th Meeting of the Society for Cryobiology.
[2] Alex Fowler and Mehmet Toner. “Cryopreservation of cells using ultra-rapid freezing”, HTD-Vol355/Bed –
Vol 37, Advances in Heat and Mass Transfer in Biotechnololgy, ASME 1997.
[3] Alex Fowler and Mehmet Toner. “Prevention of Hemolysis in rapid frozen erythrocytes by using a laser
pulse” Annals of the New York Academy of Sciences 858:245-252 (1998). New York Academy of Sciences.
[4] Dubravko Risovic and Kresimir Furic, "Comparison of Raman spectroscopic methods for the
determination of supercooleed and liquid water temperature", J. Raman Spectrosc (2005)
[5] Elkin Lucena, Diana Patricia Bernal, Carolina Lucena, Alejandro Rojas, Sandra Mojica, Ángela María Sao,
Zulma Suárez, Abby Morán, "Primera gestación lograda a partir de óvulos vitrificados", Revista Colombiana
de Obstetricia y Ginecología Vol 55 No. 3 (2004)
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Bibliografía más relevante
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Hipótesis
Las hipótesis de partida que justifican el proyecto a realizar serían las que se consideran a continuación:
- El espectro Raman de la luz dispersada (scattering) por una muestra que ha sido irradiada con luz láser
(radiación monocromática y coherente) tiene unas caracteristicas que dependen de la temperatura de la
muestra. En particular, en el caso del agua se distinguen dos picos de emisión en longitudes de onda de
577.6 nm y 589.4 nm. Midiendo la relación de intensidad entre estos dos picos espectrales (relacionados con
la concentración de moléculas de agua enlazadas con puente de hidrógeno, y no enlazadas) encontramos
una sencilla relación con la temperatura (ln(Sm Ip/Sp Im)=(Ho/RT)+RSo). Mediante un espectrofotómetro
digital focalizado mediante el objetivo del criomicroscopio obtendremos el espectro Raman de células y
desarrollaremos un método no invasivo para determinar su temperatura, tanto en un instante concreto como
su evolución en el tiempo.
- Si mantenemos una célula o conjunto de células, mediante un sistema de control que combine el uso de un
laser para calentarlas y una criostage enfriarlas, mantendremos la temperatura de la célula entre 4ºC y 20
ºC: el medio extracelular alcanzará, sin embargo, -196ºC. Si seguidamente desconectamos súbitamente el
laser de calentamiento, la celula se verá sometida casi instanténeamente a una temperatura muy baja, de
forma que no dará tiempo a la formación del hielo intracelular sino que se producirá la vitrificación de esta,
evitando así un problema especilamente grave a la hora de llevar a cabo la criopreservación de cualquier
tejido, órgano o célula.
Objetivos
El objetivo principal que persique este proyecto es doble:
- En primer lugar se pretende poner a punto un procedimiento, basándonse en las propiedades del efecto
Raman, que permita determinar, sin necesidad de utilizar sustancias externas como la Rodamina, la
temperatura de una célula, con cierta precisión, de forma fiable, rápida y no agresiva. Esto permitiría
obtener, entre otras posibles aplicaciones, con cierta facilidad la calorimetría y termometría de una célula
(algo que no se ha realizado hasta la fecha en ningún laboratorio), y de esta forma conocer el
comportamiento y la reacción de la misma ante diferentes situaciones. Así pues el primer objetivo que
podría alcanzarse con este desarrollo podría ser lograr un "termómetro Raman para células aisladas".
- En segundo lugar, y utilizando la información obtenida por el termómetro Raman, se lograría desarrollar
una técnica de enfriamiento ultrarrápida de células evitando la formación de cristales de hielo intracelular,
que es uno de los problemas principales a tener en cuenta en el campo de la criopreservación, así como
eliminar la necesidad de utilizar soluciones crioprotectoras que resultan altamente tóxicas, en especial para
determinados tipos de células de enorme interés en criopreservación como puede ser el oocito humano,
entre otras.
Ajustarse al espacio disponible
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Hipótesis y objetivos
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Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Metodología (Diseño, sujetos de estudio, variables, recogida y análisis de datos y limitaciones del estudio)
(Máximo 3 páginas)
Metodología:
1. Desarrollo de sistema de medición de temperatura de una única célula: existen diferentes métodos y
técnicas para llevar a cabo la operación de medición de la temperatura en diversos campos; no ocurre lo
mismo a la hora de determinar la temperatura en el ámbito celular. Esto es debido a que no debemos alterar
la célula mientras realizamos la medición.
En este proyecto se propone una novedosa técnica de medición de temperatura basada en las
características y propiedades del espectro Raman en relación con la temperatura. Este procedimiento
permitiría realizar mediciones no invasivas de la temperatura celular, información que podría emplearse en la
realización de una calorimetría de la célula a estudiar. Así podríamos conocer con más detalle las
reacciones térmicas de la célula en relación a diferentes situaciones. Para ello llevaremos a cabo las
siguientes etapas.
A. Montaje de los sistemas requeridos: Aquí se llevaría a cabo el montaje del sistema láser en la mesa
óptica, calibrando adecuadamente su potencia, posición y orientación. Mediante un sistema colimador se
puede corregir el patrón de radiación del láser para adaptarlo a nuestros intereses. El láser utilizado para
realizar la espectroscopía Raman puede trabajar en el visible o en el ultravioleta, donde la absorción óptica
es más reducida, de forma que la interferencia con la célula será prácticamente inexistente.
Dado que el objetivo principal de la aplicación es la criopreservación de células aisladas nos vemos
obligados a trabajar a escalas micrométricas de forma que hemos de emplear un microscopio, con un
objetivo de A.N. 0.65 para poder focalizar correctamente la luz láser sobre la muestra a estudiar. La muestra
absorberá energía electromagnética que reemitirá. En su mayor parte la luz reemitida presenta la misma
longitud de onda de la radiación incidente (scattering Rayleigh), pero existe una pequeña fracción de
radiación reemitida a diversas longitudes de onda diferentes de la incidente y que constituirán el espectro
Raman que a nosotros nos interesa. El objetivo del microscopio nos servirá también para recoger esta
radiación y guiarla hacia el fotoespectrómetro, utilizando diversos filtros ópticos para eliminar componentes
espectrales no deseadas (como pude ser la componente Rayleigh). La dirección de propagación de esta
radiación se llevará a cabo empleando diversos sistemas ópticos (dicroicos, beam-splitters y lentes) para
lograr una adecuada focalización de la luz a la entrada del fotoespectrómetro.
El fotoespectrómetro se encargará de descomponer la radiación luminosa en diversas componentes
epectrales, mediante el uso de redes de difracción. Estas componentes espectrales incidirán sobre
diferentes puntos de una cámara CCD. Con esta cámara CCD dispondremos de una información adecuada
de la intensidad luminosa de cada una de las componentes espectrales, en cada uno de sus puntos. Gracias
a esta información resolveremos el espectro Raman de la radiación considerada.
El espectro Raman recogido por la cámara CCD será enviada al puerto USB del ordenador. Se desarrollará
pues un software que se comunique con el puerto USB del ordenador con el fin de leer la información
suministrada por la cámara CCD acerca de las intensidades del espectro Raman. Mediante este software se
determinarán las intensidades de los picos de interés (577.6 nm y 589.4 nm) y se estimará la temperatura de
la muestra con cieta precisión.
Una vez que el sistema de medición Raman de temperatura se haya puesto a punto tendremos a nuestra
disposición un sensor no invasivo que nos permitiría continuar con la realización de la segunda parte del
proyecto considerado. No obstante antes de esta etapa se podrán realizar diversos experimentos de
comprobación del funcionamiento del sistema:
- Calorimetría y termometría de diversos tipos celulares en distintas condiciones.
- Montaje en el mismo criomicroscopio de sistema para de determinación de viabilidad celular,
mediante 'dyes' fluorescentes Calceim-AM/Ethidium.
2. Desarrollo del sistema de enfriamiento ultrarápido: Realizaremos la conexión de la cryostage al sistema
de enfriamiento, que previamente habremos dispuesto a través de sus diversas entradas y salidas al sistema
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Metodología
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
de enfriamiento (conductos por los que circulará nitrogeno líquido de refrigeración, válvulas controladas
eléctricamente, vaso Dewar conteniendo nitrógeno líquido, etc). La ventana dispone de una ventana
transparente a la radiación infrarroja puesto que como método de calentamiento de la muestra se utilizará un
láser con longitud de onda de 1440 nm, con el fin de aprovechar el máximo relativo que la curva de
absorción del agua presenta en esta longitud de onda.
Una vez dispuesta la cryostage y conectada al sistema de enfriamiento y al láser a través del microcopio
anteriormente citado (que se encargará de focalizar el rayo sobre la muestra contenida en la cryostage)
empleando para ello diversos elementos ópticos, utilizaremos el termómetro Raman descrito más arriba
como elemento de medición de temperatura, información esencial en el establecimiento del bucle de control
del sistema.
La información acerca del espectro Raman recogida por la cámara CCD será enviada al ordenador, bien a
través del puerto USB del ordenador, que será empleado para realizar diversas tareas, como controlador del
sistema completo, tanto en la determinación de la temperatura a partir de la información de la cámara CCD,
como en la actuación sobre la potencia del láser de calentamiento o las válvulas del sistema de enfriamiento.
Mediante el software desarrollado se determinarán las intensidades de los picos de interés (desplazamientos
Raman de 577.6 nm y 589.4 nm respectivamente) a partir de la información procedente de la cámara CCD y
se estimará la temperatura de la muestra. Comparando esta temperatura con la referencia que le hayamos
especificado al sistema de control se encargará de general las señales de control apropiadas.
El sistema de control escribirá los valores apropiados en los canales de salida correspondientes de la tarjeta
de adquisición de datos, conectada al ordenador. De esta manera controlaremos la potencia que aplica el
láser a la muestra calentando más o menos su objetivo, así como las válvulas que permiten el paso del
nitrógeno gaseoso, enfriando más o menos la muestra, y logrando de esta forma estabilizar la temperatura
de la muestra en unos límites tolerables para la vida celular (entre 4ºC y 20ºC), gracias a este mecanismo de
realimentación. Mediante una cámara acoplada al microsopio podremos observar adecuadamente el
comportamiento de la célula en tiempo real, al mismo tiempo que se realiza su criopreservación, pudiendo
comprobar si se forma o no hielo durante el proceso, si se daña la membrana celular, etc.
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Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Plan de trabajo (Etapas de desarrollo y distribución de tareas de todo el equipo investigador, incluyendo los
proyectos en los que participe cada uno de sus integrantes y las asignaciones previstas para los becarios.
Indicar también el lugar de realización del proyecto)
(Máximo 1 página)
Plan de desarrollo del proyecto:
1. Adquisición del material necesario: espectrómetro, láseres, microscopio, ordenador, etc.
Duración: 1 mes
Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero Gonzalez
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
2. Comprobación del correcto funcionamiento de los elementos que configurarán al sistema.
Duración: 1 mes
Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryobioTech (Junta Andaluc)
3. Montaje del termómetro Raman.
Duración: 3 meses
Asignación de tarea: Javier Rivero González
Lugar: Laboratorio de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
4. Desarrollo de software de comunicación con la cámara CCD para obtención del espectro Raman
y determinación de la temperatura a partir de dicha información.
Duración: 2 meses
Asignación de tarea: Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
5. Calibrado y puesta a punto del termómetro Raman, para maximizar su precisión.
Duración: 2 meses
Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
6. Realización de comprobaciones del funcionamiento del termómetro Raman con diversos
experimentos.
Duración: 3 meses
Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
7. Conexión con los elementos restantes para implementar el sistema de criopreservación por "ultra-fast
'laser' cooling".
Duración: 3 meses
Asignación de tarea: Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
8. Desarrollo del software de control del sistema.
Duración: 2 meses
Asignación de tarea: Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
9. Ajuste y puesta a punto del sistema de criopreservación.
Duración: 3 meses
Asignación de tarea: Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
10. Realización de experimentos diversos de criopreservación con el sistema anterior, empleando
diferentes tipos de cultivos celulares.
Duración: 4 meses
Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González
Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc)
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Plan de trabajo
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Experiencia del equipo investigador sobre el tema
RAMON RISCO DELGADO
(Máximo 1 página)
CRYOPRESERVACION:
Responsable del grupo de Investigación de la Junta de Andalucia: CVI-289: CRYOPRESERVACIÓN DE
TEJIDOS Y ORGANOS PARA TRASPLANTES. Desde 2001
Diirección de multriples proyectos en Ingenieria Superior sobre criopreservación que han dado lugar a los
trabajos:
AUTORES: Jaime Saenz, Khaid El-Moussaoui, José Antonio Calvillo, Ricardo Campa, Ramon Risco
TITULO: Non-linear cooling rates and the kinetics of water loss
REVISTA: Cryobiology 32, 316 (2001)
AUTORES: Roberto Baena y Ramon Risco
TITULO: “Results of the application of an ultrasound field on the statistical properties of water freezing”
REVISTA: Cryobiology 47, 256 (2003).
AUTORES: Jaime Saenz y Ramon Risco
TITULO: “Linear and non linear cryopreservation protocols for spermatozoa: comparison of ideal and nonideal solution models”
REVISTA: Cryobiology 47, 268 (2003)
AUTORES: Jorge Aguilar, Servando Alvarez, Jose Manuel Salmeron y Ramon Risco
TITULO: Real transient temperature and mass fields of perfused tissues and organs: a digital image and
finite differences method.
REVISTA: Cryobiology 47, 286 (2003).
AUTORES: Jorge Aguilar y Ramon Risco
TITULO: Microwaves and vascular perfusion: getting very high organ cooling rates.
REVISTA: Cryobiology 49, (2004).
AUTORES: Ramon Risco
TITULO: Organ Cryopreservation
LIBRO (capitulo): Extending Lifespan, LIT Verlag Ed. (Hamburg, Germany), ISBN:3-8258-8563-1
LASERES:
Responsable, durante cuatro años del grupo de investigación Fundamentos de Mecánica Cuántica, de la
Junta de Andalucía, (FQM-239). En el mismo ha realizado trabajos tanto teóricos como experimentales
publicados en Physical Review, Eurpopean Physical Journal, Ziftschriftfurnaturforschung y otras revistas
internacionales de reconocido prestigio (ver curriculo) sobre APLICACIONES IMPORTANTES DE LA
RADIACION LASER (ver Curriculo).
LASERES Y CRIOPRESERVACIÓN:
Officer: Harvard Medical Shool. Harvard Univesity (Boston, USA). Desarrolla trabajo de colaboración con
"Center for Engineering in Medicine and Surgical Services", Massachusetts General Hospital. Aquí colabora
en la implementación del sistema de enfriamiento ultrarrapido con laser de celulas y tejidos, donde explora la
via del uso de rhodamina B como sistema sensor de la temperatura para el control durante el proceso de
enfriaminto. El proyecto solicitado es muy similar, la única diferencia radica en el uso de la espectroscopia
Raman en vez de la Rhodamina
JAVIER RIVERO GONZALEZ (Becario)
INGENIERO SUPERIOR (Escuela Superior de Ingenieros, Univ Sevilla): Proyecto de Fin de Carrera titulado:
"Criopreservación celular mediante láser y espectroscopia Raman: modelo matemático y propuesta experim"
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Experiencia del equipo investigador sobre el tema
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Resumen del historial científico del grupo en el seno del nodo de la red temática de investigación
cooperativa, incluyendo publicaciones y proyectos derivados de la pertenencia a la red (cumplimentar SOLO
los proyectos coordinados en el marco de las redes temáticas de investigación cooperativa)
(Máximo 1 página)
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Resumen del historial científico
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Actividades de integración y relaciones científicas cooperativas con otro nodo de la red (cumplimentar SOLO
los proyectos coordinados en el marco de las redes temáticas de investigación cooperativa)
(Máximo 1 página)
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Actividades de integración
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
Utilidad práctica de los resultados en relación con la salud. Posibilidad de patentes u otros resultados
explotables comercialmente
Aplicaciones prácticas:
En primera instancia este proyecto permitiría desarrollar una técnica no invasiva de determinación de
la temperatura de una única célula, dado que al basarse en el uso de la información suministrada por el
espectro Raman tan sólo es necesario iluminar la muestra con una luz láser de una frecuencia en la que
prácticamente no hay absorción de energía por parte de la célula. Este procedimiento permite por lo tanto,
sin alterar el estado de la célula, conocer el comportamiento calorimétrico de una célula al ser sometida a
diversas condiciones.
En segundo lugar proporciona una técnica de criopreservación que solventa muchos de los posibles
problemas con los que se encuentra actualmente la biomedicina a la hora de conservar diversos tipos de
células como oocitos humanos, algunas lineas tumorales,etc.
1. Se elimina la necesidad de emplear sustancias anticongelantes como glicerol, DMSO, etc. para
evitar la formación de hielo intracelular, sustancias que para muhas células de interés práctico resultan
tóxicas. Esto ocurre,por ejemplo en el caso del oocito humano. Al no poder emplear criopreservantes nos
vemos obligados a utilizar temperaturas más altas y consecuentemente disminuye el timepo de
conservación.
2.
Por otra parte el proceso de descongelación o recuperación de las células resulta
tremendamente simple, dado que bastaría con recalentar la mustra con el láser hasta alcanzar una
temperatura óptima, sin necesidad de extraer las substancias criopreservadoras dado que no son
necesarias.
Medios disponibles para la realización del proyecto
Medios disponibles:
- Laboratorios de la Escuela Superior de Ingenieros de la Universidad de Sevilla.
- Material del grupo de investigación CrioBioTech (Campana de extracción, microscopio, estufa, fungible
para cultivos celulares, calceim AM/Ethidium)
- Colaboración con centros diversos:
1.-Departamento de Fisiología Médica y Biofísica (Univ. Sevilla)
2.-CSIC (Bioquimica Vegetal, Sevilla): Citómetro de Flujo y Microscopio confocal
3.-Harvard Medical School (Harvard University; Center for Engineering in Medicine), con quien se esta
colaborando en un proyecto similar, basando el control de la temperatura en la dependencia de la
fluorescencia de la rodamina B con la temperatura, en vez del uso de la fotoespectrometria Raman (que se
propone aquí).
Ajustarse al espacio disponible
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Utilidad práctica de los resultados / Medios disponibles
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal:
Justificación detallada de la ayuda solicitada
(Máximo 1 página)
La cuantía de la ayuda solicitada se repartiría entre las siguientes partidas que se mencionan:
Equipamiento
- Cryostage (FTIR600 de Linkam): sistema en el que se coloca la muestra que se desea criopreservar.
Dispone de una ventana transparente que permitirá al láser calentar la muestra, así como enfriarla de forma
ultrarápida utilizando un circuito de refrigeración.
- Láseres: Se requieren dos láseres, uno de ellos para lograr el calentamiento de la muestra, y otro para
implementar el sistema de medición de temperatura por efecto Raman.
Laser de Argon-ión: 488nm
Laser infrarrojo para calentamiento: 1440nm
- Espectrofotómetro (U21830 de B3 Scientific): con el fin de obtener el espectro Raman de la muestra y a
partir de ella obtener una medida fiable acerca de la temperatura. Es necesario capturar la luz irradiada por
la muestra y separarla en sus componentes espectrales constitutivas. Este equipo se encarga de tales
funciones, generando información vital para establecer el control del sistema.
- Microscopio y objetivos especiales para IR (Olympus): Aquí el microscopio tendrá una triple función:
- Por una parte permitirá observar que ocurre con la muestra durante toda el proceso.
- En segundo lugar permitirá focalizar la radiación de los láseres hacia la muestra.
- En tercer lugar servirá como mecanismo de captación de la luz irradiada por la muestra, que será guiada
hacia el espectrómetro anteriormente referido.
- Cámara CCD (2)
-Tarjeta de adquisición de señales I/O, que se conectará al ordenador y permitirá que éste se comunique
con su entorno cerrando así el bucle de control.
-Ordenador: será el centro de control del sistema, encargado de procesar la señal procedente de la cámara
CCD y del fotoreceptor, con el fin de calcular la temperatura de la muestra y modificar las actuaciones sobre
el láser de calentamiento y el sistema de enfriamiento y así poder establecer el control.
-Software necesario:
- Control de cryostage (Lynksys32)
- Mesa óptica
- Dispositivos ópticos diversos:
- Dicroicos
- Filtros ópticos
- Colimadores para la luz láser
- Beamsplitters.
Personal
- Un becario que se encargaría de realizar el montaje del sistema, así como de la calibración de los
diferentes elementos
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Justificación detallada de la ayuda solicitada
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MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Expediente Nº
PI052815
Investigador principal: Ramón Risco Delgado
PRESUPUESTO SOLICITADO
1. Gastos de personal
Euros
1 Becario (a tiempo completo)
1200/mes€
SUBTOTAL
28800€
2. Gastos de ejecución
a) Adquisición de bienes y contratación de servicios
(Inventariable, fungible y otros gastos)
Cryostage (Linkam)
Láser (infrarrojo) de 1440nm.
Láser de semiconductor para espectroscopia Raman de 488nm
Mesa Óptica
Espectrofotómetro (modelo U21830 de B3 Scientific)
Objetivos específicos transparentes a luz infrarroja (Olympus)
Ordenador (incluyendo software y tarjeta de adquisición de datos apropiada)
Software(Lynsys32)
SUBTOTAL
10900€
500€
300€
600€
3000€
1000€
1320€
800€
552€
18972€
b) Viajes y dietas
SUBTOTAL
SUBTOTAL GASTOS EJECUCIÓN
47772€
TOTAL AYUDA SOLICITADA
47772€
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Anexos
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Investigador principal: Ramón de Jesús Risco Delgado
MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
ANEXOS
Expediente Nº PI052815
Modelos matemáticos
Con anterioridad a la propuesta de este proyecto y con el objeto de disponer de un modelo adecuado que
simulara el comportamiento de la evolución temporal de la temperatura en una célula sometida a un rápido
enfriamiento de la misma se desarrollaron una serie de modelos de transferencia de calor. Partimos para
ello de la hipótesis de que mediante un determinado sistema de control se puede lograr la estabilización la
temperatura en la célula en un entorno apropiado para su desarrollo vital; para ello utilizamos la
combinación de un sistema de refrigeración (cryostage) y de un sistema de calentamiento por láser. Este
láser, con el fin de considerar un efecto más realista, suponemos que no calienta uniformemente toda la
célula sino que induce una distribución inicial determinada en la misma, de forma que una vez apagado el
láser, la temperatura en el interior de la muestra caerá con una determinada velocidad de enfriamiento.
Gracias a estos modelos podemos comprobar como será la evolución de la temperatura a partir de este
instante en cada punto de la muestra.
La obtención de tales modelos procede del planteamiento y posterior resolución de la ecuación de
transferencia del calor, en diversas situaciones, tanto de geometría como de distribución inicial de la
temperatura inducida por el láser. En nuestro caso, dada la forma del haz laser, lo más simple resulta
emplear una geometría circular (bidimensional) o cilíndrica (tridimensional). Así pues la ecuación a resolver
será la que se muestra a continuación:
∂ 2 T (r ,θ ,t ) 1 ∂ T (r ,θ , t ) 1 ∂ 2 T (r ,θ ,t ) ∂ 2 T (r ,θ ,t )
1 ∂ T (r ,θ , t )
+
+ 2
+
=
2
2
2
r
∂r
α
∂t
∂r
r
∂θ
∂z
Tomemos en cuenta una serie de aspectos:
•
La geometría de nuestro problema permite suponer la existencia de simetría cilíndrica luego la
dependencia de la temperatura con respecto al ángulo desaparece.
•
El término α se conoce como difusividad térmica y tiene relación con la velocidad con que el calor
se difunde hacia zonas más frías durante el proceso de transferencia térmica. Para nuestro modelo
supondremos que este término es una constante que no depende de la temperatura. En el caso del
agua, el valor que tomaremos será: 1.48·10-7 ms-2.
Así pues la ecuación diferencial en derivadas parciales a resolver, queda reducida a:
∂ 2 T (r ,θ ,t ) 1 ∂ T (r ,θ , t ) ∂ 2 T (r ,θ ,t ) 1 ∂ T (r ,θ , t )
+
+
=
r
∂r
α
∂t
∂r 2
∂z2
Como en toda ecuación en derivadas parciales será necesario imponer una serie de condiciones, que
ayuden a delimitar la solución de la expresión anterior. Distinguiremos entre condiciones de contorno,
relacionadas especialmente con la geometría del problema, y condiciones iniciales, relacionadas con el
comportamiento temporal.
En relación con las primeras, trabajaremos especialmente con dos tipos diferentes:
•
Conducción: podemos especificar la temperatura que tendrán los puntos de una curva o superficie
a través de las condiciones de contorno conductivas. En nuestro caso serán de la forma:
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Anexos
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T (r ,θ , z ,t )| r = R1 = T0
T (r ,θ , z ,t )| z = z1 = T1
•
Convección: estas condiciones de contorno se utilizan cuando la transferencia de calor no se
produce por el simple contacto de dos cuerpos con temperaturas diferentes, sino cuando el
elemento encargado de extraer calor del sistema es un fluido, a una temperatura diferente, en
movimiento. En nuestro caso serán de la forma:
−k
∂T (r ,θ , z ,t )
∂z
z = z1
+ h T (r ,θ , z ,t ) = 0
donde las constantes que aparecen son:
k: conductividad térmica del medio.
h: coeficiente de convección.
A continuación se muestran los resultados obtenidos para esta ecuación diferencial en diversas condciones
de contorno.
Modelo bidimensional
En una primera aproximación a nuestro problema se modeló la muestra contenida en la cryostage como un
disco plano sometido a una serie de condiciones:
•
Condiciones de contorno: supusimos que las condiciones de contorno en el borde de contacto
entre la muestra y el resto del medio la transferencia de calor se realizaría mediante el mecanismo
de conducción, de forma que al apagarse el láser y transcurrido un breve periodo de tiempo la
muestra acabaría a la misma temperatura que el entorno. La tasa de enfriamiento alcanzada
mediante este mecanismo es muy elevada.
•
Condiciones iniciales: con el fin de modelar de forma realista la forma del haz láser, supusimos
que la distribución inicial de la temperatura seguía un perfil determinado. Aunque se realizaron
diversos modelos, sin duda el más realista es el gaussiano.
En esta situación la ecuación diferencial a resolver resulta un tanto más simple, dado que estamos
utilizando un modelo bidimensional. Esto es, se supone que la distribución de temperatura no depende la
componente z.
∂ 2 T (r ,θ ,t ) 1 ∂ T (r ,θ , t ) 1 ∂ T (r ,θ , t )
+
=
∂r
r
∂t
α
∂r 2
Así pues resolviendo la ecuación de transferencia de calor en coordenadas polares, sometidas a una
condición de contorno conductiva en el borde del disco y modelando la distribución inicial de temperatura en
el interior como gaussiana, la evolución de la temperatura con el tiempo una vez que se produce el
apagado del láser generan las curvas que se indican a continuación. Dada la simetría angular del problema
planteado basta con estudiar el comportamiento en una dirección determinada. Además se comprueba
como ajustando la gaussiana podemos obtener unas variaciones más o menos rápidas en la pendiente
(tasa de enfriamiento), del orden de 106 ºC/s
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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Modelo tridimensional
Una vez desarrollada una primera aproximación al problema, mediante modelos bidimensionales, optamos
por modelar la muestra a estudiar mediante un cilindro finito, sometido a una serie de condiciones de
contorno y una distribución inicial de temperaturas determinada.
En la práctica podemos plantear dos posibles situaciones:
•
Utilizar como soporte de la muestra a criopreservar una cryostage en la que el enfriamiento de la
muestra se realice únicamente por la superficie inferior de la misma. En esta situación la parte
superior de la muestra queda al aire, con lo que se puede suponer que la transferencia de calor a
través de esta superficie es prácticamente despreciable; esto permite modelarla como adiabática.
La resolución de la ecuación diferencial en derivadas parciales, en coordenadas cilíndricas, para el
caso tridimensional y asumiendo el comportamiento adiabático de la superficie superior de la
muestra, nos permite conocer cómo es la evolución de la temperatura en la muestra una vez que el
láser se apaga.
En la gráfica puede verse un ejemplo de distribución de temperaturas en un instante dado según un
corte r-z del cilindro (dada simetría cilíndrica del problema, basta con conocer que ocurre en una
dirección cualquiera), en este caso para unas condiciones conductivas en la base (En todas las
gráficas siguientes: eje OX: dirección radial; eje OY: dirección del laser; curvas con temperatura
adimensionalizada):
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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•
Utilizar como soporte para contener la muestra una cryostage en la que el enfriamiento por
nitrógeno gaseoso se produzca tanto por la superficie inferior de la muestra como por la parte
superior. Este tipo de cryostage, de más reciente aparición será el que se utilice en la
implementación del sistema de criopreservación anteriormente propuesto. Extraer el calor contenido
en la muestra por ambas caras hace que el enfriamiento sea aún más rápido, permitiendo una
mayor velocidad de enfriamiento respecto al esquema anterior. Evidentemente el montaje será algo
más complejo. La resolución de la ecuación de transferencia del calor, supuesto que el
enfriamiento de la muestra se realice por las dos caras del cilindro, imponiendo tanto condiciones
de contorno conductivas (la pérdida de calor se produce por el contacto de dos cuerpos con
temperaturas distintas) como convectivas (en éste caso se tiene en cuenta la influencia del
movimiento del gas en la extracción de calor de la muestra considerada) y teniendo en
consideración cómo era la distribución de temperaturas en el interior de la misma justo antes de
apagar el láser (suponemos generalmente distribución gaussiana), nos permiten conocer la
distribución de la temperatura a partir de ese instante, pudiendo estimar la rapidez de enfriamiento
de la muestra, siendo esta muy superior a los valores obtenidos por otros procedimientos. El
desrrollo matemético del problema condujo a una solución de la forma:
⎛ ∞
⎞⎛ ∞
⎞
2
2
T (R, Z ,τ ) = ⎜⎜ ∑ Am e − β m τ J 0 ( β m R) ⎟⎟⎜⎜ ∑ Qn e −η n τ sen (η n Z )⎟⎟
⎝ m =1
⎠⎝ n = 1
⎠
donde Am y Qn son coeficientes conocidos.
En la gráfica sigiuiente puede verse un ejemplo de distribución de temperaturas en un instante dado
según un corte r-z del cilindro en este caso para unas condiciones conductivas en las bases,
calculado mediante la expresión anterior:
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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La ecuación normalizada de evolución temporal de la temperatura en la muestra considerada en el
caso de que las condiciones de contorno en las tapas del cilindro sean e tipo convectivo conducen a
una expresión algo más compleja, pero con una estructura similar
⎞
⎛
⎟
⎜ ∞
⎛
⎞⎜
− β m2 τ
−η n2 τ η n cos(η n Z ) + H 1 sen (η n Z ) ⎟
T (R, Z ,τ ) = ⎜⎜ ∑ Am e
J 0 ( β m R) ⎟⎟ ∑ Qn 'e
⎟
H
⎝ m =1
⎠⎜⎜ n = 1
(η n2 + H12 ) (c + 2 2 2 ) + H1 ⎟
ηn + H 2
⎠
⎝
∞
También se muestra a continuación el ejemplo de una muestra sometida a condiciones convectivas
en ambas caras, supuesta una distribución inicial de temperaturas, en un instante determinado
después de apagar el láser.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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Gracias a estos modelos desarrollados, es posible evaluar entre otras cosas dos parámetros de
especial importancia para el problema que se nos plantea:
1. Potencia necesaria que debe tener el láser.
2. Velocidad de enfriamiento de la muestra en cuestión.
En la actualidad se desarrollan modelos más complejos que incorporen nuevas variables al
problema, como son la presencia del cristal de soporte de la muestra, etc.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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FIGURAS:
microsco
pe
LASER, 514
nm
Filte
rs
Hg
lamp
VALV
ES
electroni
DA
C
N
2
Fig. 1 Esquema del montaje experimental
Figura 2 a (izquierda): Detalle de criomicroscopio. Se observa vaso Dewar para circuito refrigerante y
resistencia para circuito calefactor. También se observa plataforma de criocroscopio con cámara para
inserción de capilar y termopar de control. En el centro se aprecian las dos válvulas de tres vías sobre las
que actúa el software.
Figura 2 b (derecha). Vista parcial de sistema óptico, con telescopio (al fondo), y puerto de entrada en
microscopio invertido.
0.025mg/l Rhodamine B in 1xPBS
120
100
80
60
Serie1
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Figura 3a (izquierda). Curva de calibración de la fluorescencia de la rhodamina en función de la temperatura
mediante lector de microplacas. En el eje vertical se representa la intensidad de la fluorescencia (pWatts) y
en el eje horizontal se representa la temperatura en grados Celsius.
Figura 3b (derecha). Curva de calibración de la fluorescencia de la rhodamina en función de la temperatura
mediante el criomicroscopio. La primera línea horizontal es la fluorescencia a 4 C para 0.2 miliwattios de
excitación. La segunda línea horizontal es a 37 C, también para 0.2 miliwattios. La tercera línea horizontal
es a 37 C para 0.6 miliwattios y la cuarta es a 4 C, también para 0.6 miliwattios.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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Figura 4. (izquierda)Capacidad de focalización del sistema láser-criomicroscopio implementado. Cultivo de
fibroblastos en el que se ha seleccionado una célula concreta (flecha) y se ha sometido a un pulso láser de
10 miliwattios durante 5 segundos. Se observa como el fibroblasto queda destruido sin producirse daño
aparente en ninguna de las células vecinas.
Figura 4bª (centro). Agua pura con rhodamina (0.025g/l) a la que se ha aplicado el protocolo de
enfriamiento ultrarrápido. Se muestra una imagen ampliada a 400X de la zona superior izquierda del lugar
tratado. En ella se puede observar la presencia de hielo en la zona no tratada y una estructura opaca que
bien pudiera ser agua vitrificada o cristales de hielo de tamaño muy inferior al presente en la otra región.
Figura 4c (derecha). Tras el recalentamiento de la sección descrita en la imagen anterior lo que se obtiene
es siempre un patrón como el mostrado en esta figura. Se observa cómo la transición sólido-líquido
comienza siempre en la zona tratada, algo que está de acuerdo con el hecho de que esta zona sea un
sólido amorfo o microcristales de hielo.
Figura 5a (izquierda). Solución (10% glicerol) tratada con el procedimiento de enfriamiento ultrarrápido con
láser. Cuándo la temperatura del criomicroscopio alcanzó –90 C, el láser de calentamiento fue
desconectado. En la figura se observa cómo las burbujas quedan atrapadas en lo que parece un claro
estado vítreo. La temperatura se siguió descendiendo hasta –130 C y la imagen permaneció idéntica. La
zona oscura que rodea la zona tratada muestra denota la presencia de hielo.
Figura 5b (centro). Tras el recalentamiento la imagen se torna súbitamente opaca en cierto instante. Esto
denota la formación de cristales de hielo (devitrificación o recristalización).
Figura 5c (derecha) Si se continua subiendo la temperatura la muestra comienza a licuarse. Dicho proceso
comienza allá donde los cristales eran más pequeños, y esto ocurre en la zona que había sido vitrificada
inicialmente. Por ello esta zona retoma en primer término el aspecto trasparente.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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Figura 6a (izquierda). Cultivo de fibroblastos tratados con la técnica anterior (1.000.000ºC/segundo). Los
fibroblastos son, al menos morfológicamente, normales. Los fibroblastos han sido incubados previamente
en 10% DMSO.
Figura 6b (derecha). Mismo experimentos que en la figura 7ª, pero ahora la imagen es de la zona del capilar
que no fue calentada con el láser y que siguió el perfil de enfriamiento impuesto por el criomicroscopio (10º
C/minuto). La morfología es totalmente distinta al caso anterior y el aspecto denota la muerte de estas
células.
Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado
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ANEXO
RESOLUCIÓN DE LA DIRECCIÓN DEL INSTITUTO DE SALUD «CARLOS III» POR LA QUE SE APRUEBA LA RELACIÓN
PROVISIONAL DE RESULTADOS DE LA CONVOCATORIA DE AYUDAS DEL PROGRAMA DE PROMOCIÓN DE LA
INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA Y EN CIENCIAS DE LA SALUD DEL MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO (RESOLUCIÓN DE
2 JUNIO DE 2005, BOLETÍN OFICIAL DEL ESTADO DE 4 DE JUNIO DE 2005)
PROYECTOS 2005
PROYECTOS CON RECURSO A LA ADMISION ESTIMADO Y EVALUACION FAVORABLE
PROYECTO CON RECURSO A LA DENEGACION ESTIMADO
Se incluye el 19% de gastos de administración
Página 1 de 3
EXPTE
PI050030
INVESTIGADOR
LAGUNA EGEA, JUAN
CARLOS
Presupuesto:
CENTRO SOLICITANTE
CENTRO REALIZACION POBLACION
UNIVERSIDAD DE
BARCELONA
UNIVERSIDAD DE
BARCELONA
Personal:
Bienes y serv:
Viajes:
Subtotal:
19%
Total:
PI050767
ATENCION
Primer año
0
6.000
0
6.000,00
1.140,00
BARCELONA
Segundo año
0
0
0
0
0,00
Tercer año
0
0
0
0
0,00
0,00
0,00
7.140,00
TITULO DEL PROYECTO
ESTUDIO GENETICO, METABOLICO, CLINICO, TERAPEUTICO Y
EPIDEMIOLOGICO DE LAS HIPERLIPEMIAS HEREDITARIAS EN
ESPAÑA
Becarios concedidos:
Licenciado:
Técnico:
Contratados concedidos:
TOTAL:
Postdoctoral
Licenciado:
Diplomado
Técnico FP
7.140,00
OBAYA REBOLLAR,
AGENCIA PEDRO LAIN
CENTRO DE SALUD DE TRES
TRES CANTOS
JUAN CARLOS
ENTRALGO
CANTOS
PRIMARIA: RELACION CON MARCADORES INFLAMATORIOS Y DE
ATEROSCLEROSIS
Becarios concedidos:
Licenciado:
Técnico:
Presupuesto:
Personal:
Bienes y serv:
Viajes:
Subtotal:
19%
Total:
Primer año
0
3.800
0
3.800,00
722,00
4.522,00
Segundo año
0
120
0
120
22,80
Tercer año
0
120
0
120
22,80
142,80
142,80
PREVALENCIA DEL SINDROME METABOLICO EN
Contratados concedidos:
TOTAL:
4.807,60
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Postdoctoral
Licenciado:
Diplomado
Técnico FP
EXPTE
PI052586
INVESTIGADOR
CENTRO SOLICITANTE
MORALEDA JIMENEZ, SERVICIO MURCIANO DE
JOSE MARIA
SALUD
Presupuesto:
Personal:
Bienes y serv:
Viajes:
Subtotal:
19%
Total:
PI052815
RISCO DELGADO,
RAMON
Presupuesto:
Total:
HOSPITAL DR. MORALES
MESEGUER
Primer año
0
3.000
0
3.000,00
570,00
3.570,00
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
Personal:
Bienes y serv:
Viajes:
Subtotal:
19%
CENTRO REALIZACION POBLACION
Segundo año
0
0
0
0
0,00
Tercer año
0
0
0
0
0,00
0,00
0,00
ESCUELA T.S.INGENIEROS SEVILLA
INDUSTRIALES SEVILLA
Primer año
0
10.000
0
10.000,00
1.900,00
11.900,00
MURCIA
Segundo año
0
9.000
0
9.000
1.710,00
Tercer año
0
0
0
0
0,00
10.710,00
0,00
TITULO DEL PROYECTO
NUEVOS ESTUDIOS INMUNO-GENOTIPICOS EN LA CLASIFICACION Y
TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (LMA) Y
SINDROMES MIELODISPLASICOS (SMD). PROYECTO COOPERATIVO
DE LA RED DE GRUPOS DE LMA (SUBPROYECTO NODO MORALES
MESEGUER-MURCIA)
Becarios concedidos:
Licenciado:
Técnico:
Contratados concedidos:
TOTAL:
Postdoctoral
Licenciado:
Diplomado
Técnico FP
3.570,00
SISTEMA DE ENFRIAMIENTO ULTRARRAPIDO BASADO EN LA
APLICACION DE RADIACION LASER Y ESPECTROFOTOMETRIA
RAMAN DEL AGUA PARA CRIOPRESERVACION CELULAR
MEDIANTE VITRIFICACION
Becarios concedidos:
Licenciado:
Técnico:
Contratados concedidos:
TOTAL:
22.610,00
NUMERO DE PROYECTOS: 4
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Postdoctoral
Licenciado:
Diplomado
Técnico FP