Tesis - Universidad de Colima

Universidad de Colima
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
“Efecto de la glibenclamida sobre la fatiga
en músculo esquelético lento de pollo”
TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE
DOCTORA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PRESENTA:
M. en C. MARIA FELIPA ANDRADE URZUA
ASESOR: DRA. XÓCHITL A. R. TRUJILLO TRUJILLO
CO-ASESOR: DR. MIGUEL HUERTA VIERA
COLIMA, COLIMA, ABRIL DE 2004.
DEDICATORIA
A mi María Fernanda
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, por su amor y por el apoyo incondicional que me han brindado.
A la Dra. Xóchitl Trujillo y al Dr. Miguel Huerta por guiarme y presionarme
durante todo este tiempo para poder ver terminado el trabajo que parecía
interminable.
A los integrantes del jurado por todas sus sugerencias para enriquecer el
presente trabajo.
A EASP por todo su apoyo para la realización de este trabajo.
A Yoyi, Dora, Gab, Adrián, Héctor, Taniushka y al cuatito porque han estado
conmigo aún en los momentos más difíciles.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y al Fondo Juan
García Ramos por el apoyo económico para la realización de esta tesis.
i
INDICE
RESUMEN....................................................................................................................1
ABSTRACT..................................................................................................................2
INTRODUCCIÓN..........................................................................................................3
a) Inervación de las fibras musculares esqueléticas..............................................4
b) Respuesta mecánica a un estímulo químico.......................................................4
c) Respuesta mecánica a un estímulo eléctrico......................................................5
1) Fibras musculares de sacudida lenta o tipo I...........................................5
2) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIa......................................6
3) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIb......................................6
d) Suma de contracciones y contracción tetánica.................................................9
e) La fatiga muscular.................................................................................................9
f) El ATP como un factor limitante de la fuerza muscular.....................................11
g) Canales K ATP..........................................................................................................12
h) Papel del calcio en la fuerza muscular...............................................................13
i) Canal KATP en el músculo esquelético y su papel en la fatiga y justificación de
su estudio..................................................................................................................15
HIPÓTESIS.................................................................................................................18
OBJETIVO GENERAL...............................................................................................18
METODOLOGÍA.........................................................................................................19
a) Registro mecánico................................................................................................19
1) Contracturas inducidas por alto potasio.................................................20
2) Caracterización del modelo experimental de fatiga en el músculo lento
del pollo …………………………………………………………………………………….20
ii
3) Contracturas inducidas por cafeína.........................................................22
b) Análisis de datos..................................................................................................22
c) Obtención de vesículas sarcolemales de músculo lento ALD.........................22
d) Cultivo primario de células musculares esqueléticas lentas...........................24
e) Registro de corrientes iónicas............................................................................26
f) Soluciones.............................................................................................................26
RESULTADOS...........................................................................................................28
1. Efectos de la glibenclamida sobre la sacudida en el músculo lento
fatigado......................................................................................................................28
2. Efectos de la glibenclamida sobre el tétanos en el músculo fatigado............30
3. Efectos de la glibenclamida sobre las contracturas por cafeína en las fibras
musculares lentas.....................................................................................................34
4. Efecto de la glibenclamida durante la inhibición metabólica inducida por
cianuro en las fibras musculares lentas.................................................................36
5. Registro de corrientes unitarias en vesículas sarcolemales y en células
cultivadas de músculo lento....................................................................................38
DISCUSIÓN................................................................................................................42
CONCLUSIONES.......................................................................................................47
REFERENCIAS..........................................................................................................48
iii
RESUMEN
En la presente tesis se diseñó un modelo de fatiga in vitro para el músculo
esquelético lento de pollo. El músculo lento en contraste con el músculo rápido, es
resistente a la fatiga. En este tipo de músculo existen pocos estudios en relación con
el fenómeno de la fatiga muscular. Por lo cual nos propusimos investigar la posible
participación de los canales de potasio sensibles a ATP (K ATP) en el proceso de fatiga
muscular. Se ha propuesto que estos canales KATP participan en isquemia en el
sistema nervioso y en la fatiga en músculo rápido. Nos enfocamos a estudiar los
efectos de la glibenclamida (una sulfonilurea antidiabética que bloquea los canales
KATP) sobre la tensión de la sacudida única y el tétanos en músculo esquelético lento
anterior latissimus dorsi inducido a fatiga. Los resultados muestran que la
glibenclamida incrementa la tensión del músculo fatigado. También, el músculo lento
fue expuesto a envenamiento metabólico inducido por cianuro, condición bajo la cual
se inhibe la formación de ATP por lo cual disminuye su concentración intracelular y
por consiguiente se activa el canal KATP, esto hace que la tensión muscular
disminuya. La adición de glibenclamida en esas condiciones inhibió el efecto
producido por el cianuro. Se estudió el posible papel del calcio intracelular mediante
el efecto de la glibenclamida sobre las contracturas inducidas por cafeína, que se
sabe libera calcio del retículo sarcoplásmico; encontrando que la glibenclamida
incrementa la tensión de estas contracturas. Por otro lado, con el objeto de
determinar la presencia de canales KATP en la membrana de estas células de fibras
lentas de pollo se registraron corrientes iónicas en condiciones simétricas de potasio
(172 mM) mediante la técnica de fijación de voltaje en áreas pequeñas de membrana
(patch clamp), en vesículas de membrana de fibras musculares lentas y en células
en cultivo primario procedentes de músculo lento. La presencia de glibenclamida no
bloqueó las corrientes unitarias registradas. En conclusión, los resultados obtenidos
en esta tesis muestran evidencia indirecta de la participación de canales KATP en el
proceso de fatiga, puesto que la glibenclamida incrementó la tensión de la sacudida y
el tétanos en el músculo lento fatigado de pollo. Este efecto está mediado por un
incremento en la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico.
1
ABSTRACT
In the present thesis, we designed an in vitro model of fatigue for chicken slow–twitch
skeletal muscle. The slow-twitch muscle in contrast to the fast-twitch, is fatigueresistant. In this muscle type there exist a few studies related to the muscle fatigue
phenomena. By this, we have proposed to investigate the possible participation of the
ATP-sensitive potassium channels (K ATP) in the muscle fatigue process. It has been
proposed that these KATP channels participate in ischemia in nervous system and in
fatigue in the fast-twitch skeletal muscle. We focus to study the effects of
glybenclamide (an antidiabetic sulphonylurea that blocks KATP channels) on twitch
and tetanus tension in the anterior latissimus dorsi slow muscle induced to fatigue.
The results show that glybenclamide increases tension in the fatigued muscle. Too,
the slow muscle was exposed to metabolic venom by cyanide, a condition in which
the ATP formation is inhibited and when its intracellular concentration is diminished,
consequently, KATP channels are activated which in turn produces a reduction in
muscle tension. The addition of glybenclamide in these conditions abolished the
effect produced by cyanide. In addition, we studied the possible role of intracellular
calcium by the effects of glybenclamide on the contractures evoked by caffeine, which
as is known release calcium from sarcoplasmic reticulum; finding that glybenclamide
increases tension in these conditions. In the other hand, with the aim to determine the
presence of KATP channels in the membrane of these chicken slow fibers we recorded
ionic currents in symmetric potassium conditions (172 mM) by the patch clamp
technique in membrane vesicles derived from slow muscle fibers and in cells in
primary culture proceeding from slow muscle. The presence of glybenclamide did not
block the recorded unitary currents. In conclusion, the results obtained in this thesis
show an indirect evidence of the participation of KATP channels in the fatigue process,
since the glybenclamide increased twitch and tetanus tension in chicken fatigued slow
muscle. This effect is mediated by an increase in the calcium release form
sarcoplasmic reticulum.
2
INTRODUCCIÓN
La contracción muscular es un mecanismo que hace posible el movimiento
(desplazamiento corporal) y el mantenimiento de la postura. El tejido responsable de
esta función es el músculo esquelético. Cada músculo se une al esqueleto a través
de los tendones y en conjunto forma la musculatura somática, que es la de mayor
proporción en el cuerpo de los animales. Las fibras musculares esqueléticas que
integran al músculo son células multinucleadas y para contraerse requieren del ión
calcio (Ca2+) y de energía química (ATP), la cual se transforma en energía mecánica
a través de la acción de sus elementos contráctiles, los filamentos de actina y de
miosina (Fig. 1).
Figura 1. Niveles de organización del músculo esquelético. Los mioblastos dan origen a las fibras
musculares. En la parte inferior se observan los filamentos de actina y de miosina (Modificada de
Eckert y cols., 1998).
3
La contracción muscular, de acuerdo a su curso temporal, puede ser rápida o
lenta dependiendo del tipo de fibra muscular involucrada, es decir, en los músculos
esqueléticos coexisten dos tipos de fibras: 1) las fibras rápidas (responsables de los
movimientos rápidos o fásicos) y, 2) las fibras lentas (responsables de los
movimientos lentos, del mantenimiento de la postura y junto con las fibras rápidas de
los movimientos finos como los que realizan los músculos extraoculares). Además de
las diferencias funcionales, las fibras musculares difieren en su estructura, patrón de
inervación y metabolismo.
a) Inervación de las fibras musculares esqueléticas
Las
fibras
musculares
rápidas
usualmente
son
monoinervadas
por
motoneuronas con axones motores gruesos y velocidades de conducción de 58-106
m/seg. En contraste, las fibras musculares de sacudida lenta poseen inervaciones
múltiples efectuadas por motoneuronas con axones motores delgados, cuya
velocidad de conducción se halla en el rango de 50-80 m/seg (valores de velocidad
descritos para músculo de mamífero) (Pette y Vrbova, 1985). A su vez, las fibras
musculares e
l ntas pueden ser de dos tipos: a) fibras tónicas y b) fibras lentas. Es
decir, mientras que las fibras lentas y las fibras rápidas generan potenciales de
acción, las fibras tónicas carecen del mecanismo que los genera; es decir, no poseen
canales de Na + voltaje-dependientes (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953 a, b). Sin
embargo, cuando estas fibras son denervadas generan potenciales de acción, es
decir, expresan canales de Na + dependientes de voltaje y además expresan canales
iónicos de K + responsables de la rectificación anómala (Huerta y cols., 2003).
b) Respuesta mecánica a un estímulo químico
Cuando las fibras musculares son estimuladas con soluciones de alto K+, las
fibras rápidas responden con una contractura transitoria; es decir, se relajan
espontáneamente. En contraste, tanto las fibras lentas como las tónicas responden
con una contractura que se mantiene todo el tiempo en que estén presentes las
soluciones de alto K+. Esta respuesta presenta un pico máximo de tensión seguido
por un componente sostenido. La conformación de estos componentes está
4
relacionada con la presencia del calcio en la solución externa y de la concentración
de calcio intracelular en la fibra muscular (Huerta y Stefani, 1981; Huerta y cols.,
1986).
c) Respuesta mecánica a un estímulo eléctrico
Ante un estímulo eléctrico, las fibras lentas generan una sacudida que tiene un
curso temporal de seis a ocho veces mayor que el curso temporal de las fibras
rápidas (Page, 1969). En el caso de las fibras tónicas, éstas desarrollan una
contracción graduada, en contraste a las fibras rápidas que responden con una
sacudida única (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953 a, b). A la respuesta mecánica
(sacudida única) que las fibras musculares rápidas y lentas desarrollan se le puede
medir la amplitud al pico, la velocidad de contracción, la resistencia a la fatiga, etc.
Con estas características Burke y cols. (1971) clasificaron a las fibras musculares en
los tipos que se describen en la Tabla 1.
Tabla 1. Clasificación de las fibras musculares esqueléticas de acuerdo a Burke y cols.
(1971).
Tipo I
Tipo IIa
Tipo IIb
Fibras de sacudida
lenta
Fibras de sacudida
rápida (a)
Fibras de sacudida
rápida (b)
Metabolismo oxidativo
lento
Metabolismo oxidativo y
glicolítico
Metabolismo glicolítico
Fibras rojas
Fibras pálidas
Fibras blancas
1) Fibras musculares de sacudida lenta o tipo I
Son fibras cuya velocidad de contracción es lenta; desarrollan poca fuerza y
presentan resistencia a la fatiga. Bioquímicamente, son ricas en enzimas oxidativas,
pero bajas en enzimas glicolítícas y presentan baja actividad ATPasa. Son llamadas
también fibras rojas por su alto contenido de mioglobina y poseen alto número de
mitocondrias; son más dependientes del metabolismo aeróbico. Su diámetro es
menor en comparación con las fibras rápidas. Presentan escaso desarrollo del
5
retículo sarcoplásmico (RS), por lo que son más dependientes del calcio extracelular
que los otros tipos de fibras (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981).
2) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIa
Son fibras de velocidad de contracción más rápida que la de las fibras lentas,
pero a diferencia de las fibras tipo Ib, éstas presentan una resistencia a la fatiga
intermedia, puesto que pueden mantener la fuerza aún después de un gran número
de contracciones. Estas fibras tienden a tener una gran actividad glicolítica y
oxidativa y además, presentan una gran actividad ATPasa. Son llamadas también
fibras pálidas; presentan menor contenido de mioglobina, alto número de
mitocondrias y moderada capacidad oxidativa. Son fibras de diámetro intermedio y
poseen un buen desarrollo del RS, teniendo hasta tres veces más disponibilidad de
Ca2+ que las fibras tipo I.
3) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIb
Este grupo de fibras tiene como caracteristica una velocidad de contracción
muy rápida (6 a 8 veces más rápida que las fibras lentas) y desarrollan mayor
cantidad de fuerza que las fibras tipo I y tipo IIa. Sin embargo, son incapaces de
mantenerla; es decir, se fatigan fácilmente. Tienen alta velocidad de consumo de
ATP y presentan baja capacidad oxidativa. Son llamadas también fibras blancas por
su bajo contenido de mioglobina. Poseen pocas mitocondrias y son muy
dependientes del metabolismo glicolítico. Son fibras de diámetro grande y al igual
que las fibras tipo IIa, poseen un buen desarrollo del RS y una gran capacidad de
almacenamiento de Ca2+.
En los músculos esqueléticos de los vertebrados generalmente coexisten los
dos tipos de fibras y la proporción de un tipo u otro está genéticamente regulada.
Una característica importante del músculo esquelético es la capacidad de adaptarse
para cambiar las propiedades funcionales, variando las propiedades de las fibras
musculares (Punkt, 2002). En los músculos rápidos de los mamíferos, esa mezcla de
fibras tipo I y II confiere la velocidad de contracción del músculo completo y la
6
contracción es rápida o lenta dependiendo de la mayor proporción del tipo de fibras
que el músculo tenga (véase figura 2). Además, la actividad de la fibra muscular
depende del tipo de neurona que las inerva; es decir, éstas adquieren las
características que les confiere el patrón de disparo de la neurona que las inerva. En
el ser humano, la proporción de fibras IIa y IIb varía con la edad y el entrenamiento
las hace más resistentes a la fatiga, una actividad que ha sido aprovechada por los
atletas.
Figura 2. Contracción rápida o lenta de diferentes músculos. A, frontalis/orbicularis oculi (15% de
fibras lentas); B, Interóseo del primer dedo (57% de fibras lentas); C, sóleo (80% de fibras lentas); D,
extensor digitorum brevis (60% de fibras lentas). Nótese que cuanto menor es la proporción de fibras
rápidas, la duración de la sacudida se incrementa (Modificado de McArdle y cols., 1996).
7
Como ya se mencionó, las fibras lentas generalmente se encuentran
entremezcladas con las fibras rápidas en los músculos de los vertebrados; sin
embargo, en las aves la parte anterior del músculo latissimus dorsi (ALD) se
caracteriza por poseer exclusivamente fibras lentas y la parte posterior de dicho
músculo latissimus dorsi (PLD) está constituído sólo de fibras rápidas (Ginsborg,
1960; Ginsborg y Mackay, 1961). Esta disposición y composición del músculo
latissimus dorsi posibilita estudiar en detalle características propias de los tipos de
fibras musculares de nuestro interés. Además, las contracturas inducidas por K+ en
ambos tipos de fibras están bien caracterizadas, ya que las fibras rápidas del PLD al
sumerjirse en soluciones con K+ o cafeína, desarrollan una contractura transitoria; es
decir, relajan espontáneamente. En contraste, las fibras lentas del ALD desarrollan
una contractura sostenida que depende de la entrada de Ca2+ (Page, 1969; Huerta y
Stefani, 1981; Trujillo y cols., 2002). Cuando estas fibras musculares son estimuladas
repetitivamente presentan una gran resistencia a la fatiga, una característica propia
de las fibras musculares lentas tipo I de acuerdo a la clasificación de Burke y cols.
(1971) (véase Figura 3).
8
Figura 3. En A, se ilustra la respuesta mecánica (sacudida única) de las fibras musculares fatigables.
En B, se muestra la respuesta de las fibras musculares resistentes a la fatiga. En C, la respuesta de
las fibras musculares no fatigables (Modificado de Burke y cols., 1971).
Grosso modo, como ya se mencionó, la función de las fibras musculares
rápidas está relacionada con los movimientos rápidos (atrapamiento, huida), mientras
que las fibras lentas están relacionadas más con los movimientos tónicos y
posturales, así como con los movimientos finos como los de los músculos
extraoculares para el acomodo de la visión.
d) Suma de contracciones y contracción tetánica
La estimulación repetitiva de las fibras musculares provoca una activación de
los elementos contráctiles que se va adicionando cada vez antes que la relajación
ocurra y por consiguiente, se agrega una respuesta a la contracción presente. Como
resultado, las contracciones se van sumando y si la estimulación se repite
consecutivamente, las respuestas individuales se fusionan en una contracción
continua llamada contracción tetánica o tétanos fusionado (Burke y cols., 1971)
(véase Figura 4).
Figura 4. Se muestra la sacudida única en músculo rápido de mamífero, la suma de contracciones y el
tétanos fusionado o contracción tetánica, resultado del incremento en la frecuencia de estimulación
(Modificado de Burke y cols., 1971).
9
e) La fatiga muscular
La fatiga muscular, se define como la incapacidad de un músculo para
mantener la fuerza y/o hacer un trabajo dado (Fitts y Metzger, 1993; Edwards, 1983).
Los factores subyacentes a la fatiga varían en intensidad y duración y entre éstos se
involucran procesos a nivel del sistema nervioso central (SNC) y procesos de nivel
periférico (Davies y cols., 1996), los cuales se resumen en las Figuras 5 y 6.
Fati ga de ori gen central
__________________________________________________________________
Fati ga de ori gen peri féri ca
Túbulo-T
sarcolema
Disponibilidad de ATP
2+
Liberación de Ca -RS
Interacción actina-miosina
Figura 5. Ilustra los principales mecanismos involucrados en la fatiga del músculo esquelético de
origen central (parte superior delimitada por la línea central) y periférica (parte inferior, delimitada por
la línea central) (Modificado de Fitts y Metzger, 1993).
Los mecanismos de origen central se muestran en la Figura 6A e involucran:
1) fallas a nivel supraespinal, 2) inhibición aferente, 3) baja excitabilidad de las
motoneuronas, 4) pérdida de la inervación y 5) falla presináptica. En contraste,
dentro de los sitios potenciales de la fatiga de origen periférica (Figura 6B) se hallan:
1) falla presináptica, 2) incapacidad del sarcolema para desarrollar un potencial de
acción (PA), 3) falla para sostener el potencial de acción, 4) pérdida del acople entre
la excitación y la contracción (E-C), 5) disminución del acople E-C, 6) afinidad
reducida en la unión del Ca2+ con las proteínas contráctiles, 7) falla en la interacción
entre los miofilamentos y en la formación de los puentes cruzados, 8) disociación de
puentes cruzados retardada y 9) baja recaptura de Ca2+
sarcoplásmico.
10
por el retículo
A
B
Figura 6. Se indican los principales mecanismos involucrados en la fatiga de origen central (A) y de
origen periférico (B). La descripción de cada uno de los mecanismos se encuentra en el texto.
Con respecto a la actividad metabólica a nivel periférico, también se ha
atribuido como posible causa de fatiga la acumulación de difosfato de adenosina
(ADP, por sus siglas en inglés) y fosfato inorgánico (Pi), así como la falta de trifosfato
de adenosina (ATP, por sus siglas en inglés) y de fosfato de creatina (PCr) (Enoka y
Stuart, 1992). Estudios recientes del grupo de Westerblad (Westerblad y Allen, 2002)
sugieren que de estos componentes, el Pi tiene un efecto más importante como
causa de fatiga, puesto que un incremento de este metabolito produce una reducción
de la fuerza y además ocurren fallas en los mecanismos de liberación y recaptura de
Ca2+ por el RS (Fitts y Metzger, 1993).
f) El ATP como un factor limitante de la fuerza muscular
Como ya se mencionó, la falta de ATP se ha relacionado con la fatiga
muscular. La concentración intracelular de ATP durante una actividad muscular
intensa no cae más allá del 70% de los niveles preexistentes; sin embargo, se ha
11
especulado que el ATP intracelular está restringido a la mitocondria, es decir, está
“secuestrado” y que aunque haya suficiente en el medio intracelular éste no se
encuentra en el sitio donde es requerido, como sería en el caso de los miofilamentos.
Además, también se sabe que durante el ejercicio exhaustivo, durante una
estimulación constante y durante la fatiga, lo que se reduce es la velocidad de
hidrólisis del ATP.
g) Canales K ATP
Los canales KATP fueron descritos por primera vez en el sarcolema de músculo
cardiaco (Noma, 1983) y se caracterizan por presentar una inhibición o bloqueo
cuando la concentración de ATP intracelular se incrementa a niveles milimolares.
Posteriormente, su actividad fue reportada en otros tejidos como páncreas (Cook y
Hales, 1984; Ashcroft y cols., 1984; Rorsman y Trube, 1985), músculo esquelético
rápido de anfibio (Spruce y cols., 1987), de mamífero (Burton y cols., 1988) y de aves
(Thomas y Hume, 1993; Fosset y cols., 1995); en músculo liso (Standen y cols.,
1984), en células hipofisiarias (Bernardi y cols., 1993) y en neuronas del sistema
nervioso central (Ashford y cols., 1988). Su actividad ha sido relacionada con el
acople del estado metabólico de la célula con la actividad eléctrica, atribuyéndoseles
un importante papel como sensores de los niveles de ATP y ADP intracelular (Inagaki
y Seino, 1998) y como resultado se activan cuando las células se hallan
metabólicamente comprometidas, como en el caso de la diabetes, la isquemia (falta
de oxígeno) y la fatiga (disminución de la fuerza muscular) (Yokoshiki y cols., 1997).
Un canal KATP es una proteína transmembranal formada por dos subunidades,
un canal rectificador entrante (Kir 6.x) y un receptor a sulfonilureas (SUR) en una
estequiometría 4:4 (Babenko y cols., 1998) (Fig. 7). Estos canales son activados por
fármacos que abren canales de K+ (como el cromakalim, pinacidil, BRL 38227, etc.,
Weik y Neumcke, 1990) y su apertura es inhibida por sulfonilureas hipoglucemiantes
como la glibenclamida y por el ATP (Hussain y cols., 1994; Quayle y cols., 1997). El
canal responde también a nucleótidos de adenina como son el NADP (fosfato de
12
dinucleótido de nicotinamida y adenina) y NADPH (forma reducida de NADP)
(Nichols y Lederer, 1991) y a cambios de pH (Davies y cols., 1992; Honore y
Lazdunski, 1995).
Fig. 7. Ensamble de las subunidades SUR y KIR para formar el canal KATP. Arriba: modelo de 17
dominios transmembrana propuesto por Tusnady, Bakos, Varadi y Sarkadi (1997). N y C indican los
grupos amino y carboxilo terminal. Abajo: ilustración esquemática del canal KATP. Los árboles indican
los sitios de glicosilación (modificado de Aguilar-Bryan y Bryan, 1999).
Se ha sugerido que estos canales actúan como sensor metabólico que acopla
la excitabilidad de la membrana con la función muscular protegiendo al músculo de la
falta de ATP, y por consecuencia evitando un daño irreversible (Davies y cols., 1991;
Baukrowits y Flaker, 2000).
h) Papel del calcio en la fuerza muscular
13
La velocidad con que se desarrolla la tensión al pico está relacionada con la
velocidad con que interactúan los miofilamentos y también con la cantidad de Ca2+
intracelular liberado por el RS. La disminución de la fuerza está relacionada con una
reducción en la liberación de Ca2+ por el RS o con una menor entrada de Ca2+ del
medio extracelular. Se conoce que las fibras musculares rápidas poseen un RS más
desarrollado y, por lo tanto, poseen una mayor cantidad de bombas Ca2+-ATPasa
que las fibras musculares lentas. Así, la velocidad de contracción se relaciona con la
velocidad con que las bombas recapturan el Ca2+. Sin embargo, la bomba de Ca2+
del RS es la mayor consumidora de ATP durante el reposo y durante la actividad de
las células musculares, por ejemplo, en una contracción isométrica el consumo de
ATP por estas proteínas representa aproximadamente el 30% del total.
Por otro lado, se ha sugerido que la disminución de la fuerza durante la fatiga
se debe al menos en parte, a una falla en el mecanismo de acople entre la excitación
y la contracción, lo que conduce a una reducción de la concentración de Ca2+ en el
mioplasma disponible para la contracción (Westerblad y Allen, 1991). La
prolongación en el curso temporal de la relajación observada durante el ejercicio
extremo está muy relacionada con una disminución en la velocidad de recaptura del
Ca2+ por el RS. Así, algunas drogas como la cafeína incrementan la fuerza en el
músculo fatigado al incrementar la liberación de Ca2+ por el RS (Eberstein y Sandow,
1961; Delay y cols., 1986; Germinario y cols., 2004) (véase Figura 8) y además la
cafeina induce contracturas sostenidas en fibras lentas de pollo (Huerta y Stefani,
1981) y tónicas de rana (Muñiz y cols., 1992).
14
Figura 8. Ilustra el incremento en la fuerza de las sacudidas en un músculo fatigado cuando se
adiciona cafeína a la solución que baña a las fibras musculares. Nótese el desarrollo de una
contractura sostenida inducido por la cafeína (modificada de Eberstein y Sandow, 1961).
i) El Canal KATP en el músculo esquelético, su papel en la fatiga y justificación
de su estudio
A pesar que desde 1985 Spruce y cols. reportaron que los canales KATP están
presentes en la membrana del músculo esquelético, su función todavía es
desconocida.
Los trabajos donde se han empleado fármacos que abren éstos canales de
potasio muestran evidencia de la participación de los canales KATP en la disminución
de la fuerza característica de la fatiga muscular (Weselcouch y cols., 1993; Light y
French, 1994; Wickenden y cols., 1996; Matar y cols., 2000 y Matar y cols., 2001).
Sin embargo, los resultados obtenidos al emplear bloqueadores de estos canales,
específicamente la glibenclamida, está todavía en discusión. Algunos autores han
reportado que la glibenclamida no tiene efecto sobre la fatiga (Van Lunteren y cols.,
1998; Gong y cols., 2000; Light y cols. 1994; Matar y cols., 2000). Otros autores han
reportado que la glibenclamida acelera el proceso de fatiga (Comtois y cols., 1994) y
algunos otros han reportado que este bloqueador de canales KATP incrementa la
fuerza tetánica y los niveles de calcio intracelular en fibras rápidas de mamífero (Duty
y Allen, 1995).
En este trabajo, mediante el registro de corrientes unitarias en vesículas de
membrana procedentes de fibras musculares lentas (que describiremos más
adelante), tratamos de demostrar la presencia de estos canales y darle una posible
explicación funcional a la participación de los canales KATP en el proceso de fatiga
muscular.
En el sarcolema de las fibras musculares lentas los canales iónicos están poco
estudiados y, por consiguiente, sus funciones son escasamente conocidas (Stefani y
15
Chiarandini, 1982; Huerta y cols., 2003). Una posible razón de la escasez de
estudios electrofisiológicos en fibras musculares lentas es la enorme dificultad
técnica que representa estudiarlas (fibras de diámetro pequeño, alto contenido de
tejido conectivo [Nakamura y cols., 2003], etc.) y uno de los problemas asociados al
registro de las corrientes iónicas en células musculares intactas es la dificultad para
fijar el voltaje con la técnica de fijación de voltaje con tres microelectrodos en el
extremo de la fibra (Huerta y col.s, 2003). En este trabajo, se utilizó el modelo de
vesículas de membrana (sarcolema) donde se aplicó la técnica electrofisiológica de
fijación de voltaje en microáreas de membrana (patch clamp) a fin de eliminar los
problemas técnicos previamente descritos. Inicialmente, el estudio en este tipo de
vesículas con la técnica de patch-clamp fue hecho en músculo rápido de rana
(Standen y cols., 1984), en músculo lento de pollo (Trujillo y cols., 1992) y aunque la
procedencia exacta de estas vesículas a la fecha no ha sido bien establecida, el
trabajo realizado por Camacho y cols. (1999) usando fluorescencia emitida con el
reactivo
de
fluorescencia
tubular
(RH-795)
sugiere
que
el
túbulo-T
está
contribuyendo en su formación. Adicionalmente, estas vesículas carecen de
componentes del citoesqueleto, de organelos intracelulares y la membrana pierde las
invaginaciones características de la membrana de las fibras musculares intactas
(Camacho y cols., 1996; Camacho y cols., 1999), lo que facilita estudiarlas mediante
la técnica de patch-clamp.
Para explorar la posible relación entre el canal KATP y la fatiga muscular en
este trabajo utilizamos la glibenclamida, puesto que se sabe que bloquea
selectivamente al canal KATP en músculo esquelético de perro, rana y cobayo (Van
Lunteren y cols., 1998). Esta droga ha sido usada en diversos estudios que exploran
la relación entre la fatiga muscular y los canales KATP en músculo esquelético
(Comtois y cols., 1994; Gutierrez y cols., 1995; Light y cols., 1994; Wickenden y cols.,
1996; Van Lunteren y cols., 1998), lo que facilita la comparación de nuestros
resultados con los obtenidos por esos autores. Adicionalmente exploramos la acción
de la cafeína para estudiar la regulación del calcio intracelular en fibras musculares
16
lentas, como ha sido reportado en fibras rápidas de rana (Delay y cols., 1986) y en
fibras musculares esqueléticas de ratón (Germinario y cols., 2004).
Con el fin de correlacionar los registros electrofisiológicos obtenidos en
vesículas de membrana y controlar de alguna manera la influencia de componentes
celulares (citoesqueleto, metabolitos, etc.) sobre los canales iónicos de interés se
estableció y estandarizó un cultivo primario de células musculares lentas del músculo
ALD de pollo recién nacido de la variedad arbor acres.
17
HIPÓTESIS
La glibenclamida al bloquear los canales KATP modifica el acople excitacióncontracción en las fibras musculares lentas, aumentando la liberación de calcio del
retículo sarcoplásmico durante la fatiga, lo que mejora la tensión postfatiga.
OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de la glibenclamida sobre la fatiga en músculo
esquelético lento de pollo, para lo cual nos propusimos los siguientes objetivos
particulares:
1) Inducir la fatiga en el músculo lento mediante estimulación repetitiva en
fascículos de fibras lentas de pollo, es decir, diseñar un modelo de fatiga in
vitro.
2) Explorar el efecto de la glibenclamida sobre la sacudida post-fatiga y sobre la
contracción tetánica post-fatiga.
3) Inducir indirectamente la apertura de canales (K ATP) mediante la inhibición
metabólica (disminución de la concentración intracelular de ATP) y explorar en
estas condiciones el efecto de la gibenclamida.
4) Explorar si el efecto de la glibenclamida está relacionado con la liberación de
calcio del retículo sarcoplásmico, mediante el estudio de contracturas por
cafeína en presencia de glibenclamida.
5) Investigar si el efecto de la glibenclamida está relacionado con el bloqueo de
canales de potasio dependientes de ATP (K ATP), mediante el registro de
corrientes unitarias para detectar la presencia de estos canales en estas fibras
musculares lentas.
18
METODOLOGÍA
La presente tesis fue hecha en fascículos obtenidos del músculo lento anterior
latissimus dorsi (ALD) de pollo de la variedad arbor acres. Los pollos fueron
adquiridos de una proveedora comercial de nuestra ciudad en lotes según nuestras
necesidades experimentales. Los procedimientos en el manejo de los animales y su
mantenimiento en el bioterio se llevaron de acuerdo a la guía y norma para el
cuidado de animales de experimentación del Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas de la Universidad de Colima.
Para obtener los músculos lentos (ALD), los pollos fueron sacrificados usando
el procedimiento descrito por Huerta y Stefani (1981) y Trujillo y cols. (2002). Este
consistió brevemente en sacrificar a los pollos por decapitación para posteriormente
disecar el músculo ALD, el cual fue colocado en una caja de Petri revestida con
fondo de resina transparente (Sylgard). El músculo fue fijado mediante alfileres
entomológicos al fondo de la cámara e inmerso en solución Ginsborg (véase
soluciones). Bajo el microscopio estereoscópico se retiró el exceso de tejido
conectivo y se procedió a obtener fascículos delgados (de 1-1.5 mm de grosor), para
con ellos llevar a cabo el registro mecánico, o bien el músculo completo era expuesto
a una solución con alto potasio y carente de calcio (ver soluciones) para la obtención
de vesículas sarcolemales.
a) Registro mecánico
Se registraron las siguientes respuestas mecánicas: sacudida única, tétanos
no fusionado (5 Hz) y tétanos completo (50 Hz), contracturas inducidas por alto K+
(80 mM) y por cafeína (8 mM) en fascículos de músculo lento. Para el registro de
cada una de las respuestas mecánicas, el fascículo fue colocado en una cámara
experimental de lucita transparente, con dos placas deslizables para ajustar el ancho
del canal. El fascículo fue fijado del extremo proximal al fondo de la cámara mediante
alfileres entomológicos y fue atado del extremo distal, con parte del hueso húmero, al
ganchito del transductor mecanoeléctrico Grass FT03. El transductor estaba
conectado a un amplificador Cyberamp 320 (Axon Instruments, Co.), el cual a su vez
19
estaba conectado a una interfase analógico-digital DMA TL-1 (Axon Instruments,
Co.), que estaba conectada a una computadora Acer pentium I que nos permitió
adquirir (con el programa Axotape, Axon Instruments, USA) y almacenar los datos
para su posterior análisis (ver más adelante). Antes de proceder con el registro de
tensión isométrica, el fascículo fue estirado hasta 1.3 veces su longitud de reposo y
equilibrado en solución Ginsborg normal (ver soluciones). Los cambios de soluciones
se hicieron a través de una llave de tres vías conectada a la cámara con salida
directa hacia el fascículo. Para el registro de las sacudidas y de los tétanos se
aplicaron protocolos diferentes de estimulación a través de electrodos de platinoiridio colocados paralelamente al músculo dentro de la cámara experimental. Durante
todos los experimentos, los fascículos fueron bañados por la solución Ginsborg con
manitol (ver soluciones). En las contracturas inducidas por cafeína los fascículos se
incubaron en presencia de glibenclamida por un periodo de 4 minutos previo a la
contractura en presencia de este fármaco para permitir la difusión de la droga y su
interacción con la membrana de las células musculares (Ligth y cols., 1994). Todos
los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente (22-25 °C).
1) Contracturas inducidas por alto potasio:
Al inicio y al final de cada experimento se registró una contractura inducida por
80 mM de K+ durante 5 minutos a fin de conocer el estado del fascículo ya que este
tipo de contractura está bien caracterizado en este músculo (Huerta y cols., 1986).
2) Caracterización del modelo experimental de fatiga en el músculo lento del pollo:
Protocolos de estimulación: Las fibras musculares esqueléticas pueden
responder a la estimulación eléctrica repetitiva con dos tipos de respuestas
mecánicas dependiendo de la frecuencia de estimulación: 1) la sacudida única y 2) la
contracción tetánica (ver introducción). Se han empleado diversos protocolos de
estimulación eléctrica para provocar fatiga muscular, registrando como respuesta
mecánica la sacudida única con pulsos de 0.2 ms de duración a frecuencias de 2,
3.2, 4, 5.2 y 7.6 Hz (Giannesini y cols., 2001) o registrando las contracciones
tetánicas aplicando trenes de 200 ms de duración a una frecuencia de 140 Hz, con
20
pulsos de 0.5 ms de duración (Light y cols., 1994) o mediante trenes de 350 ms de
duración a una frecuencia de 100 Hz y pulsos de 0.5 ms de duración (Westerblad y
Allen, 1991; Duty y Allen, 1995; Matar y cols., 2000). Cuando aplicamos estos
protocolos de estimulación ya establecidos para inducir fatiga en el músculo ALD de
pollo, no observamos ninguna respuesta mecánica, por lo que procedimos a aplicar
diferentes frecuencias de estimulación y a variar la duración de los pulsos hasta
establecer nuestros propios protocolos de estimulación eléctrica para estudiar tanto
la sacudida única como la contracción tetánica e inducir la fatiga en estas
condiciones.
Fatiga (sacudidas únicas): Para el registro de las sacudidas únicas aplicamos
estimulación eléctrica repetitiva a una frecuencia de 0.2 Hz con pulsos de 300 ms de
duración. Se continuó el registro hasta observar la disminución de las respuestas en
aproximadamente 70% con respecto al valor inicial registrado para la sacudida única.
Una vez inducida la fatiga, se aplicó la droga de prueba (glibenclamida) realizando
observaciones durante 5 min a fin de determinar su efecto.
Fatiga (tétanos): Se aplicó una estimulación eléctrica repetitiva (trenes de 5 s,
pulsos de 10 ms de duración; frecuencia de 5 o 50 Hz). Se registró la respuesta
hasta observar la disminución del 70 u 80% con respecto al valor al inicio de la
estimulación. Una vez presentada la fatiga, se aplicó la droga de prueba
(glibenclamida 150 µM) realizando observaciones durante 5 min a fin de determinar
su efecto.
Sacudidas únicas en presencia de cianuro (CN): Se aplicó estimulación
eléctrica repetitiva con pulsos de 300 ms de duración a una frecuencia de 0.2 Hz
durante 10 min y se adicionó 10 mM de CN continuando con el registro durante 5
min; posteriormente se lavó el CN con la solución normal permitiendo que la tensión
se recuperara hasta valores similares a los registrados al inicio del experimento. A
continuación se agregó CN (10 mM) en presencia de glibenclamida (150 µM)
realizando la observación durante 5 min, posteriores a los cuales se lavaron el CN y
21
la glibenclamida con la solución normal continuando el registro por un periodo de 10
min.
3) Contracturas inducidas por cafeína
Para determinar si la acción de la glibenclamida está relacionada con un
incremento en la liberación de Ca2+ por el RS (Delay y cols., 1986), se realizó una
serie experimental mediante contracturas inducidas por 8 mM de cafeína. Para cada
experimento se indujeron tres contracturas por cafeína con una duración de 5 min
con periodos de 20 minutos entre contracturas. Se incubó el fascículo en presencia
de glibenclamida durante 4 min previos a la contractura inducida en presencia de
este fármaco (Light y cols., 1994).
b) Análisis de los datos
Se midió la tensión al pico y la tensión total (área bajo la curva) de la sacudida
única, además se midió la tensión máxima en el tétanos y la tensión total del tétanos,
(área bajo la curva). Asimismo, la tensión máxima y la tensión total de las
contracturas por K+ o cafeína. La tensión al pico fue medida como la diferencia entre
la tensión basal y la tensión máxima (al pico) desarrollada por el fascículo antes,
durante la aplicación de la droga y de forma posterior al lavado de las sustancias de
prueba. El análisis fue realizado con una computadora Pentium III (Compaq
deskpro), utilizando la subrutina Clampfit del programa pClamp (versión 8.0) y las
gráficas fueron elaboradas con el programa Sigmaplot (versión 8.0). Las mediciones
obtenidas de las sacudidas únicas y tétanos de prueba fueron normalizadas con
respecto a las sacudidas y tétanos control. Los resultados se expresan como el
promedio ± el error estándar de las observaciones realizadas. Se aplicó la prueba
estadística “t” de Student para comparar los promedios empleando una P<0.05 para
determinar la significancia de los resultados.
c) Obtención de vesículas sarcolemales de músculo lento ALD
Las vesículas son estructuras esféricas de membrana (diámetro promedio de
10 µm), derivadas de la membrana plasmática de las fibras del músculo ALD. Éstas
22
fueron obtenidas por un procedimiento enzimático que causa “hinchamiento” de la
membrana, con el cual se forman y se desprenden. Para obtener las vesículas se
empleó un procedimiento modificado del originalmente descrito por Standen y cols.
(1984), que consistió en exponer durante 90 minutos al músculo en una solución
carente de calcio (ver soluciones) adicionada con 50 unidades/ml de colagenasa Tipo
IA (Sigma) para posteriormente lavarlo con una solución similar sin colagenasa y
dejarlo reposar a temperatura ambiente por una hora (22-24°C). Con este
procedimiento las vesículas se forman espontáneamente (véase Figura 9). En estas
vesículas se llevó a cabo el registro de corrientes iónicas que se describe más
adelante.
Figura 9. Muestra las vesículas de
membrana de fibras musculares
lentas de pollo. Las flechas
señalan la localización de algunas
de estas vesículas y en círculos
negros se contrastan sus tamaños.
Microfotografía obtenida a una
magnificación de 40X.
23
d) Cultivo primario de células musculares esqueléticas lentas
Para realizar el cultivo primario de células musculares, se usaron pollos recién
nacidos y, bajo condiciones estériles, se disecó el músculo ALD, que fue seccionado
y colocado en una solución de tripsina-EDTA 0.25% (Gibco 25200-056) y luego se
disoció bajo agitación durante 30 minutos. Se obtuvo una suspensión celular que fue
filtrada con malla de nylon de 75 µm. El filtrado fue resuspendido en un medio
completo de Dubbelco (DMEM GibcoBRL 10569-010), suplementado con 10% de
extracto de embrión de pollo (GibcoBRL) y 1% de antibiótico-antimicótico (GibcoBRL
15240-062) y centrifugado en frío (4ºC) a 350 g por 10 minutos. Al finalizar, el
sobrenadante fue descartado y las células fueron resuspendidas en 10 ml en medio
completo y presembradas en una caja de Petri por un periodo de una hora a 37ºC en
una atmósfera de 95% de O2 y 5% de CO2. Este proceso fue necesario para adherir
al fondo de la caja las células no miogénicas (fibroblastos) y extraer -por agitación
ligera- las células miogénicas, las cuales fueron transferidas a cajas-calidad-cultivode-tejidos con sustrato de polilisina (Sigma P-4707) o gelatina (Sigma G1393). Las
células fueron observadas cada 24 hrs, y el medio cambiado cada 48 hrs. Después
de una semana, las células fueron tripsinizadas y resembradas a baja densidad en
un medio de diferenciación (DMEM suplementado con 10% de suero de caballo
[GibcoBRL 26050-070], 2% de extracto de embrión de pollo y 1% de antibióticoantimicótico) y colocadas en cajas-calidad-cultivo-de-tejidos con un sustrato de
colágena obtenida de cola de rata y esterilizada con luz UV. La diferenciación de las
células fue caracterizada mediante tinción diferencial (Wright-Giemsa), de acuerdo a
los procedimientos descritos por Florini y cols. (1989). El conteo de núcleos en el
miotubo y el patrón de bandas distintivo de las células musculares ocurrió entre los
10 y 20 días de cultivo. La figura 10 muestra fotografías de las células musculares en
diferentes etapas del cultivo. En este tipo de células se realizó el registro de
corrientes iónicas que se describe más adelante.
24
A
Fig. 10. Células derivadas del
músculo ALD en cultivo.
En A, se muestra la mezcla de
células en presiembra (no
miogénicas, de forma triangular
y miogénicas, fusiformes).
En B, el proceso de fusión
celular conlleva a la formación
de miotubos, cuya forma es
alargada y su diámetro es
variable.
B
En C, un miotubo de 13 días de
cultivo muestra ya el aspecto
característico de las células
musculares
esqueléticas
(estriaciones). Magnificaciones
de
10,
20
y
40X,
respectivamente.
C
25
e) Registro de corrientes iónicas
Se llevó a cabo el registro de corrientes unitarias de potasio en vesículas de
membrana y en células musculares cultivadas en concentraciones simétricas de
potasio (ver soluciones), aplicando la técnica de fijación de voltaje (patch-clamp) en
su configuración de “inside-out” (Hamill y cols., 1981). Se utilizaron pipetas de vidrio
borosilicato cuya región proximal a las puntas fue recubierta con sylgard y las puntas
pulidas al calor y al ser llenadas con solución externa tenían resistencias entre 5 - 15
MΩ. Se empleó un amplificador AXOPATCH 200B (Axon Instruments, Inc. USA.) y
las señales se digitalizaron a 5 KHz con una tarjeta A/D DIGIDATA 1200 (Axon
Instruments, Inc. USA) conectada a una computadora Pentium III (Compaq deskpro),
donde se almacenaron los registros.
La adquisición y el análisis de las corrientes unitarias se realizaron con el
programa pCLAMP (versión 6.04; Axon Instruments, Inc. USA). Todos los registros
obtenidos tenían 30 segundos de duración. Las relaciones corriente-voltaje fueron
construídas con los valores resultantes al ajustar a una función gaussiana (mediante
el método de mínimos cuadrados) los histogramas de amplitud obtenidos a diferentes
potenciales de membrana.
f) Soluciones
La solución normal (Ginsborg) tenía la siguiente composición: NaCl 167 mM,
KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 5 mM, glucosa 2 g/L y la solución fue ajustada a un
pH de 7.4 con cloruro de imidazol 2 mM.
La solución Ginsborg con manitol tenía la misma composición que el Ginsborg
normal, excepto que la glucosa fue sustituída por manitol.
La solución interna (ver registro de corrientes iónicas) o solución carente de
calcio (ver obtención de vesículas sarcolemales) contenía: KCl 172 mM, EGTA 2 mM
y HEPES 10 mM y fue ajustada a un pH de 7.2 con KOH.
26
La solución externa tenía la siguiente composición: KCl 172 mM, CaCl2 5 mM,
MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM, glucosa (2 g/l) y fue ajustada a un pH de 7.4 con KOH.
La solución con alto potasio se preparó sustituyendo equimolarmente el Na +
por K+ de la solución Ginsborg y tenía la siguiente composición: NaCl 92 mM, KCl 80
mM, CaCl2 5 mM, MgCl2 2 mM y Glucosa 2 g/l. Se ajustó el pH de esta solución a 7.4
con Imidazol-Cl 2 mM.
La solución de cafeína 8 mM fue preparada adicionando a la solución
Ginsborg con manitol el volumen necesario de una solución madre que contenía 0.1
M de cafeína.
La solución de CN 10 mM fue preparada adicionando a la solución Ginsborg
con manitol el volumen necesario de una solución madre de NaCN 0.1 M.
La glibenclamida fue adicionada a la solución interna (registro de corrientes
iónicas) o a la solución Ginsborg con manitol (registro mecánico) a partir de una
solución madre que contenía 2 mM de glibenclamida disuelta en NaOH 0.05M, para
obtener la concentración de prueba deseada (100 µM y 150 µM respectivamente).
27
RESULTADOS
1. Efectos de la glibenclamida sobre la sacudida en el músculo lento fatigado
Hay reportes en las fibras musculares rápidas de mamífero y de aves que
indican que el canal de K+ sensible a ATP está presente en sus membranas y se ha
sugerido que podría tener un papel funcional en el músculo fatigado de mamífero.
Sin embargo, hasta ahora su papel en la fisiología muscular todavía no ha sido
totalmente comprendido (Davies y cols. 1991; Nichols y Lederer, 1991; Fosset y
cols., 1995) (véase Introducción).
Las fibras musculares lentas del ALD se comportan funcionalmente como
fibras resistentes a la fatiga en contraste con las fibras rápidas, que se fatigan
fácilmente (véase Introducción). Con el fin de constituir un modelo de fatiga en estas
fibras musculares lentas de pollo, nuestros resultados del laboratorio nos indican que
este tipo de fibras musculares al ser estimuladas repetitivamente tardan alrededor de
60 minutos en reducir al 70% la amplitud pico de la sacudida única respecto a la
sacudida control cuando la frecuencia de estimulación fue de 0.2 Hz (véase
Metodología).
Una vez caracterizado este modelo de fatiga en este tipo de fibras musculares
lentas de pollo y con el fin de obtener información adicional en relación al posible
papel del canal KATP durante la fatiga, utilizamos las fibras lentas fatigadas para
estudiar el efecto de la glibenclamida (100-150 µM) que se sabe que bloquea el canal
KATP (Van Lunteren y cols., 1998) y se ha probado que una dosis de 100 µM bloquea
la totalidad de estos canales (Light y French, 1994).
La figura 11 muestra un registro representativo del efecto de la glibenclamida
(150 µM) sobre la fatiga en las fibras musculares lentas de pollo, tomando como
parámetro la sacudida única. En A, el registro muestra la sacudida única control al
inicio del experimento. En B, se muestra la sacudida única una vez fatigado el
músculo de acuerdo al modelo de estudio de fatiga (véase primer párrafo). C
28
corresponde a la sacudida única después de la aplicación de la glibenclamida, donde
se observa hasta un 25% de incremento en la tensión postfatiga y, finalmente, en D
el registro corresponde a la tensión una vez lavada la glibenclamida (postlavado).
glibenclamida
Figura 11. Efecto de la glibenclamida 150 µM sobre la sacudida al 70% de fatiga. En A, la tensión
registrada al inicio del experimento. En B, la tensión registrada después de aproximadamente una
hora de estimulación a una frecuencia de 0.2 Hz. Nótese la reducción en la tensión. En C, se muestra
el registro obtenido al adicionar la glibenclamida (5 min). En D, se muestra el registro 10 min posterior
al lavado de la glibenclamida.
La figura 12 muestra gráficamente los resultados obtenidos cuando aplicamos
glibenclamida (150 µM), tomando como parámetro la sacudida única. La tensión
promedio registrada durante la fatiga fue de aproximadamente el 45% (44.54 ±
7.66% en la tensión promedio de la sacudida al pico y 45.94 ± 8.79% en la tensión
total) con respecto al control (p < 0.05). Cuando adicionamos la glibenclamida, la
tensión promedio de la sacudida al pico fue de 69.86 ± 6.09% y la tensión total fue de
69.53 ± 8.20%, siendo ambas estadísticamente significativas con respecto a la
tensión de fatiga (p < 0.05). Después de lavar la glibenclamida, la tensión promedio
de la sacudida al pico fue de 56.13 ± 9.68% y la tensión total fue de 57.42 ± 8.17% (n
= 4). Estos valores no presentan diferencias estadísticamente significativa con
respecto a la tensión de fatiga.
29
Figura 12. Muestra el efecto de la glibenclamida sobre la sacudida única. Nótese que la glibenclamida
incrementa significativamente la tensión tetánica del músculo fatigado. Los asteriscos indican la
significancia estadística de los resultados para una p<0.05.
2. Efectos de la glibenclamida sobre el tétanos en el músculo fatigado
Otra manera de inducir fatiga en estos músculos es utilizando tétanos
repetitivo (5 y 50 Hz). Nuestros experimentos indicaron que alrededor de los 10
minutos de estimulación, la amplitud de la tensión máxima del tétanos se reduce
entre un 70 y 80%, dependiendo de la frecuencia de estimulación. Resultados
semejantes fueron reportados para los músculos rápidos fatigados de mamífero con
una disminución
de la tensión tetánica al 70%, aunque en el caso de las fibras
rápidas esta disminución se alcanzó en menor tiempo (Duty y Allen, 1995) (véase
Metodología). En la figura 13 se muestran registros representativos del efecto de la
30
glibenclamida (150 µM) sobre la tensión tetánica obtenida a 5 Hz sobre el músculo
fatigado. En A, un tétanos registrado al inicio del experimento (control). En B, la
tensión registrada después de 10 minutos de estimulación a una frecuencia de 5 Hz.
En C, se muestra el registro obtenido al adicionar la glibenclamida. Nótese que en
estas condiciones se incrementa la tensión del tétanos. En D, se muestra el registro
posterior al lavado de la glibenclamida, donde la amplitud del tétanos vuelve a la
condición de fatiga antes de la aplicación de la glibenclamida.
glibenclamida
A
B
C
D
Figura 13. Registro representativo del efecto de la glibenclamida (150 µM) sobre la tensión tetánica en
músculo fatigado. En A, el tétanos control registrado al inicio del experimento. En B, el tétanos
registrado después de 10 minutos de estimulación a una frecuencia de 5 Hz (tétanos no fusionado).
Nótese la reducción en la tensión tetánica. En C, se muestra el registro obtenido al adicionar la
glibenclamida (después de la tensión de fatiga). Nótese el incremento en la tensión tetánica en el
músculo fatigado (comparar C contra B). En D, se muestra el tétanos 5 minutos posterior al lavado de
la glibenclamida.
En la Figura 14 se grafican los resultados experimentales encontrados con
glibenclamida (150 µM), tomando como parámetro el tétanos generado a 5 Hz. La
tensión promedio se redujo durante la fatiga en casi el 70% (35.64 ± 4.79% en el pico
máximo y 35.81 ± 5.99% en la tensión total del tétanos [área bajo la curva] con
respecto al control (p = 0.00001 y p = 0.00004, respectivamente, n = 3)). Compare A
vs. B de la figura 13. Al adicionar la glibenclamida, la tensión se incrementó con
respecto a la tensión tetánica de fatiga en el pico máximo a un 83.61 ± 15.71% y en
la tensión total a un 85.06 ± 19.00% (n = 3; p = 0.0267 y p = 0.0484,
respectivamente). Las figuras corresponden a B vs. C de la figura 13. Con el lavado,
31
la tensión tetánica fue ligeramente menor a aquella encontrada en el músculo
fatigado (véase B vs. D de la figura 13); sin embargo, no hay una diferencia
significativa con respecto a ésta (p = 0.6949 y p = 0.7174, respectivamente, n = 3).
Figura 14. Muestra los efectos de la glibenclamida sobre el tétanos obtenido a 5 Hz. Nótese que la
glibenclamida incrementa significativamente la tensión tetánica del músculo fatigado. Los asteriscos
indican la significancia estadística de los resultados para una p<0.05.
En la Figura 15 se muestran gráficamente los resultados encontrados cuando
se aplicó glibenclamida 150 µM sobre el tétanos generado a 50 Hz. En este caso, se
utilizó una frecuencia de 50 Hz para poder comparar los resultados obtenidos con los
resultados en músculo rápido de mamífero de otros autores e.g. Duty y Allen (1995);
sin embargo, estos autores utilizaron una frecuencia de 100 Hz. Cuando nosotros
32
utilizamos esa misma frecuencia e incluso 70 Hz el músculo se dañaba, por lo cual
se optó por el uso de 50 Hz. En estas condiciones, la tensión tetánica durante la
fatiga se reduce hasta un 80% con respecto al control, siendo la tensión al pico
máximo de 12.68 ± 4.53% con respecto a este control y de la tensión total en un
10.41 ± 4.98%, con respecto a dicho control. Esta reducción fue significativa (p =
0.000001 y p = 0.000002, respectivamente, n = 3). Al adicionar la glibenclamida, la
tensión al pico máximo se incrementó con respecto a la tensión tetánica de fatiga en
un 18%, siendo de 30.58 ± 5.00% y el área de 28.96 ± 5.64% (n = 3). La prueba “t”
de Student nos muestra que la glibenclamida incrementa significativamente la
tensión tetánica del músculo fatigado; es decir, la amplitud al pico máximo y la
tensión total se recupera (p = 0.038 en el pico y p = 0.049 en el área con respecto a
la tensión tetánica de fatiga).
Figura 15. Muestra los efectos de la glibenclamida sobre la tensión tetánica obtenida a 50 Hz. Nótese
que la glibenclamida incrementa significativamente la tensión tetánica del músculo lento fatigado. Los
asteriscos indican la significancia estadística de los resultados para una p<0.05.
33
3. Efectos de la glibenclamida sobre las contracturas por cafeína en las fibras
musculares lentas
Con el fin de explorar la posibilidad de que el efecto de la glib|enclamida sea
mediado por el incremento en la liberación de Ca2+, estudiamos el efecto de este
fármaco sobre las contracturas por cafeína, un alcaloide que libera Ca2+ del retículo
sarcoplásmico (Caputo, 1966; Huerta y Stefani, 1981; Muñiz y cols., 1992).
Cuando agregamos 150 µM de glibenclamida sobre las contracturas inducidas
por cafeína (8 mM) en fascículos de fibras lentas de ALD de pollo, se observó un
incremento de dichas contracturas. La figura 16 muestra un registro representativo
de esta serie de experimentos realizados con cafeína. Con respecto a la tensión
control, la glibenclamida incrementa el pico máximo de la contractura por cafeína en
un 6.55 ± 1.57% y la tensión total en un 5.93 ± 3.86%, respectivamente (n = 3),
siendo la tensión al pico máximo estadísticamente significativa con respecto al
control (p = 0.031). Este efecto es reversible después del lavado y la contractura
vuelve a la tensión inicial (no mostrado). Estos resultados sugieren, al menos en
parte, que la glibenclamida podría incrementar la tensión de estas fibras musculares
lentas al promover una mayor liberación de calcio del RS. En la figura 17 se
muestran gráficamente los resultados obtenidos en estos experimentos.
34
glibenclamida
Figura 16. Muestra un registro representativo de los efectos de la glibenclamida sobre las contracturas
inducidas por 8 mM de cafeína. El trazo inferior corresponde al registro control y el trazo superior
corresponde a la contractura observada en presencia 150 µM de glibenclamida.
Figura 17. Ilustra los efectos de la glibenclamida sobre la tensión máxima y sobre la tensión total (área
bajo la curva) de las contracturas inducidas por 8 mM de cafeína. El asterisco indica significancia
estadística para la tensión máxima con respecto al control cuando se adiciona la glibenclamida 150
µM.
35
4. Efecto de la glibenclamida durante la inhibición metabólica inducida por
cianuro en las fibras musculares lentas
Se utilizaron las fibras musculares lentas con inhibición metabólica inducida
con cianuro (10 mM). Este modelo de inhibición metabólica inducida por esta droga
fue utilizado por Gramolini y Renaud (1997) con el fín de que no se produjera ATP.
Por lo tanto decrece la concentración intracelular de este metabolito. En estas
condiciones experimentales se estudió el efecto de la glibenclamida, para lo cual se
utilizó la sacudida.
En la figura 18 se muestran sacudidas representativas del efecto de la
glibenclamida durante la inhibición metabólica inducida por cianuro en las fibras
musculares lentas de pollo. El registro A corresponde al control de la sacudida al
inicio del experimento. En B, se muestra la sacudida posterior a la incubación
durante 5 minutos en cianuro (10 mM), donde puede apreciarse que en presencia de
cianuro, la tensión de la sacudida disminuye notablemente con respecto al control (B
vs A). Después el fascículo era lavado con solución Ginsborg, y una vez que la
sacudida se recuperaba a valores similares al control se incubaba nuevamente por 5
minutos con cianuro pero en presencia de glibenclamida. El registro C corresponde a
la tensión registrada en estas condiciones, donde se puede apreciar que el efecto del
cianuro es bloqueado por la glibenclamida; es decir, la tensión se mantiene en
valores similares a los del control inicial. El registro D corresponde a la tensión
registrada después del lavado de la glibenclamida y del cianuro con la solución
normal, donde se muestra que la sacudida única es de amplitud similar que la del
control inicial. Es importante resaltar que la tensión basal sobre la cual se generaron
las sacudidas únicas se incrementó; este incremento de la misma es mucho menor
en presencia de glibenclamida más cianuro que cuando el fascículo se incubó
unicamente con cianuro.
36
A
B
C
D
Figura 18. Efecto de la glibenclamida sobre la tensión registrada durante la inhibición metabólica
inducida por cianuro. El registro A corresponde al control de la sacudida al inicio del experimento. En
B, se muestra la sacudida posterior a la incubación durante 5 minutos en cianuro (10 mM). Nótese que
la tensión de la sacudida disminuye notablemente con respecto al control (A). Este efecto es
totalmente reversible, ya que la sacudida se recuperaba a valores similares al control y en esas
condiciones se incubaba nuevamente por 5 minutos en cianuro junto con glibenclamida. Así, se puede
apreciar que el efecto del cianuro es bloqueado por la glibenclamida (ver registro C). El registro D
corresponde a la tensión registrada después de lavar el cianuro y la glibenclamida (control final). Los
cambios son significativos después de la adición de la glibenclamida (p < 0.05).
En la figura 19 se grafican los resultados obtenidos en cinco experimentos,
donde se muestra el efecto de la glibenclamida sobre la tensión al pico y la tensión
total durante la inhibición metabólica inducida por cianuro. En presencia de cianuro,
la tensión al pico se redujo a 49.95 ± 15.69% y la tensión total a 38.9 ± 15.82 % con
respecto al control. Esta disminución es estadísticamente significativa (p < 0.05).
Cuando se adicionó glibenclamida en presencia de cianuro, este efecto fue
bloqueado; es decir, la glibenclamida inhibió la disminución de la tensión. Puede
apreciarse que después de lavar el cianuro y la glibenclamida, la tensión se mantiene
en valores similares al control inicial.
37
160
∗ ∗∗ ∗
140
Tensión máxima
Tensión total
Tension (%)
120
100
80
∗
60
∗
40
20
0
Control
Cianuro
Cianuro +
Lavado
Glibenclamida
∗ Comparado con el control (100 %)
∗ ∗ Comparado con Cianuro
Figura 19. Efecto de la glibenclamida sobre la tensión al pico (tensión máxima) y sobre la tensión total
de la sacudida durante la inhibición metabólica inducida por cianuro. Los asteriscos indican que los
cambios son significativos (p < 0.05).
5. Registro de corrientes unitarias en vesículas sarcolemales y en células
cultivadas de músculo lento
Los siguientes experimentos se llevaron a cabo con el fin de detectar la
presencia del canal de K+ sensible al ATP (K ATP) en estas fibras musculares lentas,
para lo cual se utilizaron vesículas de membrana de fibras musculares lentas (Trujillo
y cols. 1992) (véase metodología). Se registraron corrientes unitarias con la técnica
38
de fijación de voltaje en microáreas de membrana (patch-clamp) en la configuración
de “inside-out” en concentraciones simétricas de K+ (172 mM). La figura 20 ilustra un
ejemplo de las corrientes unitarias registradas en vesículas sarcolemales de fibras
musculares lentas a diferentes potenciales de membrana (ver figura 20A). Es
importante señalar que en los registros obtenidos siempre se observó mas de un
nivel de amplitud de la corriente. En la figura 20B se muestra la conductancia de la
corriente correspondiente al primer nivel de amplitud (97 pS).
A
B
6
pA
4
2
mV
-60
-40
-20
20
40
60
-2
g = 97 pS
-4
-6
+
Figura 20. Registro típico de corrientes unitarias registradas en concentraciones simétricas de K (172
mM) en vesículas sarcolemales. Nótese la amplitud de las corrientes y el valor de su conductancia.
La figura 21 muestra dos trazos representativos de las corrientes registradas en
vesículas de membrana de músculo lento a un potencial de membrana de –40 mV, A
(registro control) que corresponde a las corrientes observadas en concentraciones
simétricas de potasio (172 mM). El trazo B corresponde a las corrientes registradas
en concentraciones simétricas de potasio en presencia de 100 µM de glibenclamida.
39
Puede apreciarse que la glibenclamida no bloquea los niveles de corrientes
observados en el registro control. El incremento en el número de aperturas
observado en presencia de glibenclamida también fue observado en condiciones
control, dicho incremento era dependiente del tiempo (registros no mostrados).
A
B
Figura 21. Registros de corrientes en configuración de “inside-out” en concentraciones simétricas de
potasio (172 mM) a un potencial de membrana de –40 mV. En A, registro control (antes de la
aplicación de la glibenclamida). B, registro en presencia de glibenclamida (100 µM).
Al no poder evidenciar la presencia de corrientes de potasio que fueran
sensibles a la glibenclamida en las vesículas de membrana obtenidas de las fibras
musculares esqueléticas lentas de pollo, y con el fín de descartar que ésto fuera
debido a la falta de integridad del citoesqueleto y/o a la probable ausencia de
metabolitos intracelulares, procedimos a realizar cultivos primarios de las fibras
musculares lentas del pollo obtenidas de músculo ALD, estandarizando previamente
las condiciones de cultivo (Trujillo y cols., 2001) (veáse figura 10). En células
diferenciadas realizamos el registro de corrientes unitarias en la configuración de
“inside-out” en concentraciones simétricas de potasio (172 mM). La figura 22 muestra
un registro representativo de las corrientes obtenidas a un potencial de 40 mV en
ausencia (A) y presencia de 100 µM de glibenclamida (B), donde se puede observar
que estos canales no son bloqueados por la glibenclamida.
40
A
B
Figura 22. Registros de corrientes en un parche de membrana obtenido de una célula cultivada en
configuración inside-out en concentraciones simétricas de potasio (172 mM), a un potencial de
membrana de 40 mV. En A, registro control (antes de la aplicación de la glibenclamida). B, registro en
presencia de glibenclamida (100 µM).
41
DISCUSIÓN
Los canales KATP están presentes en diversos tipos de tejidos y han sido
involucrados en procesos tales como la isquemia en células cardiacas y neuronales,
en la liberación de insulina en células â del páncreas y recientemente en la fatiga
muscular principalmente en los músculos esqueléticos rápidos.
En la presente tesis, se exploró la posible relación entre la fatiga muscular y el
KATP, mediante el estudio del efecto de la glibenclamida sobre la fatiga, en este
sentido tuvimos primeramente que diseñar un modelo de fatiga en las fibras
musculares lentas de pollo utilizando la sacudida única y el tétanos, puesto que los
protocolos existentes para provocar fatiga en distintos músculos esqueléticos de
diversas especies (ver metodología) no indujeron la reducción de la fuerza en el
músculo de estudio (ALD). Como es conocido, en contraste con las fibras rápidas
que se fatigan fácilmente cuando se someten a sacudidas repetidas (ver
Introducción) las fibras musculares del ALD son resistentes a la fatiga y en nuestros
experimentos mostramos que a una frecuencia de 0.2 Hz estas fibras musculares
lentas del pollo tardan alrededor de 60 minutos en disminuir en aproximadamente el
70% la amplitud de la sacudida. En cambio, cuando se utilizó el tétanos para inducir
fatiga en estas fibras musculares con una frecuencia de estimulación de 5 y 50 Hz,
estas tardaron alrededor de 10 minutos en disminuir la tensión máxima entre 70 y
80%. Un hecho relevante es que al aplicar frecuencias que se utilizan en los
músculos rápido y lento de mamífero (140, 100 y 70 Hz) (Westerblad y Allen, 1991;
Light y cols., 1994; Duty y Allen, 1995; Matar y cols., 2000) se produce daño en estas
fibras.
Los resultados experimentales de esta tesis muestran evidencia de que la
glibenclamida tiene un efecto en el músculo fatigado, incrementando su fuerza
muscular (tensión de sacudida y tensión tetánica). Por otra parte, a pesar de que
Spruce y cols. (1985) reportaron una alta densidad de canales KATP en el músculo
esquelético rápido de rana y que mas tarde Fosset y cols. (1995) reportaron la
presencia de dos tipos de estos canales en el músculo rápido de pollo (músculo del
42
muslo), en nuestros resultados obtenidos al utilizar la técnica de fijación de voltaje
para el registro de corrientes unitarias (patch-clamp) no pudimos evidenciar el efecto
de la glibenclamida sobre las corrientes registradas y hasta ahora no hemos
detectado la presencia de canales de potasio sensibles a ATP ni en vesículas de
membrana obtenidas del músculo lento, ni en las células musculares cultivadas de
este mismo músculo, para de esta forma poder relacionar directamente que el efecto
de la glibenclamida sobre la fatiga muscular sea mediante el bloqueo de canales
KATP.
Por otro lado, los resultados de nuestra tesis coinciden con los trabajos
reportados por Duty y Allen (1995) en el músculo fatigado rápido de mamífero. En
estos trabajos, registran simultáneamente la tensión tetánica y la concentración de
calcio intracelular mostrando que la tensión del músculo fatigado se recupera en
presencia de la glibenclamida. Este efecto es atribuído a que la glibenclamida
además de bloquear selectivamente los canales KATP, ejerce un efecto indirecto
sobre la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico y/o una mayor entrada de
calcio del exterior. En nuestros experimentos, las contracturas inducidas por cafeína
al ser incrementadas en presencia de glibenclamida, sugieren que la liberación de
calcio del retículo sarcoplásmico podría explicar el incremento de tensión observado
en estas fibras musculares lentas de pollo en presencia de la glibenclamida. Otra
posibilidad es que la glibenclamida incremente la sensibilidad de los miofilamentos al
calcio, como ha sido propuesto por Duty y Allen (1995); sin embargo, esta acción
tendría que ser confirmada de manera directa en preparaciones de fibras musculares
desnudas de membrana (Natori, 1975; Duty y Allen, 1995) en presencia y en
ausencia de glibenclamida.
En relación a que el efecto de la glibenclamida sea a través del bloqueo de
canales KATP, en este trabajo también exploramos la inhibición metabólica inducida
por cianuro y mostramos que la glibenclamida evita la casi total pérdida de la tensión
muscular durante el envenenamiento metabólico causado por la presencia de
cianuro.
43
Aunque nuestro abordaje no constituye una forma directa que muestre que la
modulación de la tensión por glibenclamida fuese a través de los canales KATP, si
podemos inferir que durante el envenenamiento metabólico el cianuro (un bloqueador
de la fosforilación oxidativa) impide la producción de ATP y que su disminución
intracelular sea sensada por los canales KATP presentes en el sarcolema, los cuales
se activarían en esta condición y ligarían así la excitabilidad de la membrana con el
metabolismo. De esta manera, una posibilidad sería que la activación de estos
canales KATP sea el mecanismo por el cual el cianuro disminuye la tensión en el
músculo ya que como se ha comentado, la glibenclamida bloquea selectivamente
este canal KATP. Además, existen diversos estudios donde se han empleado
fármacos que abren canales KATP tales como el pinacidil y el cromakalim
(Weselcouch y cols., 1993; Wickenden y cols., 1996), que muestran evidencia de que
los canales KATP participan en la reducción de fuerza durante estados de estrés
metabólico tales como la fatiga, la anoxia, la isquemia y durante la inhibición
metabólica con el fín de preservar el ATP y prevenir el daño en la función muscular
(Matar y cols., 2000).
El hecho de encontrar que durante la inhibición metabólica la tensión basal se vea
incrementada constituye un hallazgo similar al reportado por Gramolini y Renaud
(1997) en músculo rápido de rana. Sin embargo, nuestros resultados difieren en que
en presencia de glibenclamida y cianuro, este incremento en la tensión basal fue
menor. Para este fenómeno aunque no tenemos una explicación satisfactoria del
mecanismo involucrado, se podría, en experimentos posteriores obtener información
adicional midiendo el potencial de membrana y la concentración intracelular de calcio
en presencia de cianuro y en la presencia conjunta de cianuro y glibenclamida.
Por otro lado, Allen y Westerblad (2001) proponen que el cianuro previene la
recuperación del almacenamiento del calcio en el retículo sarcoplásmico ya que la
recaptura de calcio por el retículo depende del ATP, lo cual pudiera explicar el
incremento de la tensión basal. Sin embargo, se requiere de cuantificar el calcio
mioplásmico para determinar el mecanismo de este incremento en estas
condiciones.
44
Con relación al hecho de no observar un bloqueo de las corrientes unitarias de
potasio, en presencia de glibenclamida, registradas en vesículas de membrana del
músculo lento, ésto podría deberse a que los componentes del citoesqueleto (Terzic
y Kurachi, 1996) sean necesarios para que los canales KATP tengan actividad (Brady
y cols., 1996; Furukawa y cols., 1996). Por otra parte, el no haber encontrado dichos
canales en las células musculares cultivadas pudiera deberse a que las fibras lentas
de pollo, al ser resistentes a la fatiga, expresan menos canales KATP y
consecuentemente, al explorar en parches de membrana no resulte fácil encontrar
este tipo de canales, puesto que su densidad en la membrana pudiera ser baja. Otra
posibilidad es que estos canales KATP se modifiquen con el desarrollo muscular como
fue sugerido por Fosset y cols. (1995) en su hallazgo de dos tipos de canales KATP en
cultivo de células musculares de muslo de pollo, quienes además mostraron que su
densidad depende del desarrollo, y es posible que también del tipo de célula de
donde provengan, considerando que el muslo posee en su mayoría fibras rápidas.
Por otra parte, no podemos descartar la posibilidad de que, al igual que en otros
tejidos (hígado y corazón), los canales KATP mitocondriales estén presentes en estas
fibras musculares (Inoue y cols., 1991; Paucek y cols., 1992) y que el efecto de la
glibenclamida sobre la fatiga muscular sea debido a la acción de este bloqueador
sobre los KATP mitocondriales, ya que existen trabajos que muestran evidencia de
que la glibenclamida bloquea tanto los KATP sarcolemales como los mitocondriales
(Paucek, y cols., 1992). Una manera de explorar esta posibilidad sería realizar
registros de las corrientes unitarias de potasio en mitocondrias de músculo
esquelético.
Por otra parte, se ha mostrado en el músculo esquelético que después de un
periodo de contracciones fatigantes, el músculo entra en un periodo de disminución
de su capacidad contráctil (Fitts y Metzger, 1993), lo cual ha sido asociado a una
disminución en la concentración intracelular de calcio (Allen y cols. 2001), lo cual a
su vez podría también afectar el acople entre la excitación y la contracción. Así, las
contracturas por cafeína y los efectos de la glibenclamida sobre éstas, nos orientan a
pensar que esta droga pudiera participar en alguna parte del acople excitación-
45
contracción y en la modulación del calcio intracelular durante la fatiga en estas fibras
musculares lentas. Una posibilidad sería que la glibenclamida podría reducir la
amplitud del potencial de acción de estas fibras musculares (Gong y cols. 2003) o
bien actuar indirectamente sobre el receptor externo del acople excitacióncontracción, el cual está situado en el canal de calcio tipo L; o actuando directamente
sobre el propio canal de calcio incrementando el flujo de calcio al interior de la fibra
(Gamboa-Aldeco y cols., 1986; Huerta y Stefani, 1986; Ríos y Pizarro, 1991; Trujillo y
cols., 2002). Existen evidencias de que durante la fatiga inducida a baja frecuencia
las concentraciones de Ca2+ se ven importantemente reducidas debido a una
reducción en la ilberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico (Duty y Allen, 1995;
Jones, 1996). Aquí, sería también adecuado manejar otras técnicas más directas de
medición del calcio intracelular como la fluoroscopia para determinar los niveles
intracelulares de calcio antes y posteriores a la adición de glibenclamida.
Finalmente, el uso de las fibras musculares lentas de pollo provee un modelo muy
útil, escasamente estudiado, ya que este músculo lo forman exclusivamente fibras
lentas y comparte propiedades electrofisiológicas y mecánicas con las fibras de
sacudida lenta de mamíferos y con las fibras tónicas de los anfibios (Trujillo y cols.,
2002). También, en el laboratorio está en proceso el estudio de la glibenclamida en
músculo rápido fatigado (el posterior latissimus dorsi) de pollo, que está formado por
fibras exclusivamente rápidas y es en este tipo de fibras, como ya se mencionó
anteriormente, donde se ha reportado la presencia de dos tipos de canales KATP
(Fosset y cols., 1995). Los resultados encontrados en esta misma preparación (pollo)
podrían ser comparados y nos ofrecería mayor información del papel de la
glibenclamida en las fibras musculares lentas.
Como parte de la línea de trabajo del laboratorio se pretende explorar la
presencia de canales KATP en células adultas del músculo lento ALD de pollo usando
otro tipo de técnicas más directas, por ejemplo, mediante el uso de marcadores
selectivos para este tipo de canales iónicos o bien mediante la determinación del
RNA mensajero (RNAm) tratando de explorar si en las células musculares lentas
existe este mensajero y comparar su abundancia con respecto a las células
46
fatigables como son las fibras rápidas (Parent y Coronado, 1989), o bien, mediante
hibridación in situ con técnicas de inmunohistoquímica como es el western blot que
aunque tampoco mide la densidad absoluta de canales, sí permite inferir densidades
relativas (Nielsen y cols., 2003).
CONCLUSIONES
1.
Establecimos un modelo de fatiga en las fibras musculares lentas.
2.
Las fibras musculares lentas del ALD de pollo son fibras resistentes a la fatiga.
3.
La glibenclamida, un bloqueante de los canales KATP mejora la tensión
postfatiga de las fibras lentas de pollo.
4.
El incremento en la tensión inducido por la glibenclamida está relacionada al
menos en parte, con un incremento en el calcio intracelular.
5.
La glibenclamida evita la pérdida de la tensión durante la inhibición metabólica
inducida por cianuro.
6.
Las corrientes de potasio registradas en el sarcolema de estas fibras
musculares posiblemente no corresponden a los canales KATP, puesto que no son
bloqueadas por la glibenclamida.
47
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