manual de prácticas laboratorio de parasitologia - Bivir
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MANUAL DE PRÁCTICAS LABORATORIO DE PARASITOLOGIA CLINICA PROGRAMA DE QUÍMICA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA DPTO. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS ICB, UACJ. 2012 DRA. EVANGELINA OLIVAS E. 1 2012 INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMEDICAS Mtro. Francisco Javier Sánchez Carlos Rector de la U.A.C.J M.C. David Ramírez Perea Secretario General de la UACJ. M.C. Hugo Salvador Staines Orozco Director del ICB Dr. Alejandro Martínez Martínez Jefe del Depto. de Ciencias Qimicobiológicas, ICB. M.C. M. en C. Katya Aimeé Carrasco Jefe del Programa de Química M.C. Bertha Alicia Borrego Ponce Coordinadora de la Academia de Microbiología y Parasitología. AGRADECIMIENTOS: A todos los profesores de la Academia de Microbiología y Parasitología, por sus valiosas sugerencias en la elaboración de este manual 2 CONTENIDO PAGINA REGLAMENTO………………………………………………………………….…...4 PRACTICA . INTRODUCCION A LA PARASITOLOGIA………………..…..….6 PRACTICA 1. PROTOZOARIOS……………………………………………....……8 PRACTICA 2. PLATYHELMINTHOS………………...……………………..…..…10 PRACTICA 3. ASCHELMINTOS………………………..……………………….…12 PRACTICA 4. TECNICAS COPROPARASITOSCOPICAS……………..…….…..14 PRACTICA 5. CONCENTRACION DE PARASITOS POR FLOTACION……………………………….…………..…..….16 PRACTICA 6. COPROPARASITOSCOPICO POR SEDIMENTACION………………………………….……….....…….18 PRACTICA7. DIAGNOSTICO DE CISTICERCOSIS…………………..………....20 PRACTICA 8. TINCION DE GIARDIA Y CRYPTOSPORIDIUM…………………………………..……...…...22 PRACTICA 9. CULTIVO DE PROTOZOARIOS Y PREPARACIONES FIJAS…………………………..….……..……24 PRACTICA 10. ARTROPODOS…………………………………………..……..…27 BIBLIOGRAFIA………………………………………………………….….……….29 3 REGLAMENTO INTRODUCCION Este reglamento regirá la actitud, el comportamiento y el desempeño del estudiante dentro de los laboratorios de Microbiología y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el laboratorio es un área donde se manejan microorganismos patógenos, parásitos y algunos compuestos químicos peligrosos. Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la cristalería. REGLAS 1. Todos los alumnos deberán asistir con bata blanca larga y el cabello recogido. 2. La entrada al laboratorio quedará restringida exclusivamente a los alumnos inscritos 3. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminación con microorganismos patógenos. 4. Está estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio. 5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debiéndose colocar estas en los lockers de la entrada de 6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se deberá comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de contaminación con los microorganismos patógenos o parásitos manejados en las prácticas. 7. Se nombrará un jefe de mesa quien será el responsable del cuidado del material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. También vigilará que todos los integrantes de la mesa se laven las manos con antiséptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibirá del profesor los microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo de las prácticas, y posteriormente los devolverá en las mismas condiciones que los recibió, a excepción de los materiales especiales indicados por el profesor. (ejemplo cultivos). En caso de algún daño al material o aparatos, los alumnos integrantes del equipo estarán obligados a reparar dicho daño en forma que indique el profesor. 8. Para tener derecho a la evaluación final en la teoría, el alumno deberá tener el 80 % de asistencia. 9. Para poder tener derecho a la asistencia se dará 10 minutos como retardo 10. La calificación final de la materia de Microbiología quedará constituida por la puntación obtenida en la práctica y en la teoría, cuya suma se efectuará en la forma siguiente: a) La calificación final obtenida en el laboratorio tendrá un valor del 30 % de la calificación final total. b) La calificación total de la teoría corresponderá al 70 % de la calificación final. c) La suma de ambas calificaciones (teoría y práctica) será igual al 100 %. d) El alumno no podrá acreditar la materia si obtiene calificación reprobatoria en el laboratorio o en la teoría. Debe aprobar ambas para promediarse. 11.- El alumno deberá capacitarse con la NOM-087 sobre la Separación, Tratamiento y Destino de los Residuos Biológico- Infecciosos 4 Introducción.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestación de servicios para promoción, prevención, diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de la salud, regulando los servicios médicos para que respondan a las demandas y necesidades de la población. Los servicios médicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos, independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea público, social o privado. Las soluciones tecnológicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta norma, deben ser el resultado de las demandas de actividades de promoción y prevención de la salud, así como aquéllas dirigidas al diagnóstico y tratamiento de las diversas patologías. Se debe indicar qué tecnologías diagnósticas, terapéuticas y de rehabilitación se utilizarán en los establecimientos médicos para atender correctamente tales demandas, lo cual integra el programa médico. La indicación o el uso de las tecnologías para la salud dependen de la motivación, de los conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una correcta organización funcional de los establecimientos de atención que asegure realizar las actividades médicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integración de la infraestructura y el equipamiento. En esta norma se presentan los requisitos mínimos de infraestructura y equipamiento para hospitales y consultorios de atención médica especializada, incluyendo la infraestructura y el equipamiento para ejercer actividades directivas y de formación de personal de salud, establecido como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de prestación de Servicios de Atención Médica. 1. Objetivo Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mínimos de infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atención médica especializada. 2. Campo de Aplicación Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los hospitales de los sectores público, social y privado, cualquiera que sea su denominación, que realicen internamiento de enfermos para la ejecución de los procesos de diagnóstico, tratamiento médico. 5 INTRODUCCION A LA PARASITOLOGIA Los parásitos son organismos que requieren de otro organismo (un huésped u hospedero) para vivir o por lo menos para completar una parte de su ciclo vital. Son eucariotas y contienen estructuras y organelos similares a los de las células humanas, presentan pared celular y se consideran animales. Por ello es muy difícil crear antibióticos eficaces y seguros contra los parásitos, ya que la mayor parte de los fármacos antiparasitarios ejercen algunos efectos adversos en las células de los humanos. Aunque los microorganismos patógenos, como los virus, algunas bacterias y hongos, también son parásitos, éstos son estudiados por la microbiología. La parasitología es la ciencia que estudia los protozoarios, los helmintos y los artrópodos parásitos. Los protozoarios son animales inicelulares, dentro de los cuales se encuentran varios grupos como parásitos: - Apicomplexa (esporozoarios): se localizan en la sangre, los tejidos o en el intestino y presentan reproducción sexual y asexual. Entre los más importantes se encuentran Plasmodium (paludismo), Pneumocystis (neumonía), Toxoplasma (toxoplasmosis) y Cryptosporidium (cryptosporidiasis). - Ciliophora (ciliados): Balantidium coli (disentería) - Sarcomastigophora (flagelados y amibas): incluye los flagelados que se encuentran en la sangre (Trypanosoma), tejido linfático (Leishmania) o aparato digestivo (Giardia). Entre los sarcodina se tiene a Entamoeba histolytica (disentería amibiana), y a las amibas de vida libre Acanhthamoeba y Naegleria. Cerca del 10 % de la población mundial está infectada con E. histolytica, el paludismo es la causa principal de muerte relacionada con enfermedades infecciosas en todo el mundo. La neumonía por Pneumocystis carinii es la principal causa de muerte en enfermos de SIDA. Los Helmintos incluyen animales metazoarios denominados gusanos (redondos y planos) que miden desde unos mm hasta varios metros, aunque sus huevos son microscópicos, así como algunas de sus larvas (etapas juveniles). Los Helmintos son miembros de dos grupos: - Asquelmintos (gusanos redondos), por ejemplo Ancylostoma, Ascaris , Enterobius, Necator, Onchocerca, Strongyloydes, Trichinella, Trichuris. - Platelmintos (gusanos planos), como Taenia, Hymenolepis, Echinococcus, Dypylidium, Fasciola. Todos las etapas de un parásito pueden ser desarrolladas en un sólo huésped o en varios, o parte en un huésped y parte en el medio ambiente. En el caso de los parásitos que desarrollan ciclo sexual y asexual, se le denomina huésped intermediario a aquél donde forma las etapas asexuales. Y huésped definitivo, donde desarrolla la estapa sexual. El parásito después de penetrar en un huésped se establece en un órgano blanco o en tejidos. La mayoría de los parásitos que entran por ingestión de alimentos o agua contaminados con heces (vía fecal-oral) pasan su ciclo de vida en el aparato digestivo. Los que penetran de manera directa a través de la piel o se introducen a través de un vector , infectan la sangre o los vasos 6 sanguíneos o establecen infecciones en los tejidos subcutáneos u órganos principales, incluso en la médula ósea y en los tejidos linfáticos. Diagnóstico de parásitos en el laboratorio. Se basa sobre todo en el hallazgo del parásito en los tejidos infectados, en heces y en líquidos corporales (sangre, L.C.R, orina, esputo y otros). Casi todos los parásitos se pueden detectar en muestras de los tejidos infectadados, observadas al microscopio. Cuando el parásito es un protozoario, las muestras se tiñen y se examinan al microscopio, donde se pueden detectar trofozoítos (formas metabólicamente activas que se nutren del huésped) o quistes (formas latentes). Cuando el agente infeccioso es un helminto, el diagnóstico se basa en el hallazgo de huevos del gusano o de larvas en heces, microfilarias en sangre, gusanos adultos en los tejidos subcutáneos o en el aparato digestivo. RESULTADOS, DISCUSION, CONCLUSIONES 7 PRACTICA #1 Protozoarios parásitos OBJETIVO DE LA PRACTICA. Diferenciar morfológicamente los protozoarios intestinales más comunes (trofozoítos u otras etapas) y distinguirlos de los restos del material de la muestra. INTRODUCCION. Los Protozoarios son organismos unicelulares que se consideraron durante mucho tiempo como un solo phylum, pero recientemente se han dividido en una serie de grupos con carácter de phylum. Los phyla que incluyen especies parásitas humanas son Sarcomastigophora, Ciliophora, Apicomplexa y raras veces Microspora. Los protozoarios parásitos incluyen animales unicelulares que muestran modificaciones fisiológicas parásitas fuertes en aquellos grupos que son completamente parásitos, en relación a aquéllos que incluyen especies de vida libre y especies parásitas. Con frecuencia los órganos que no son necesarios para una existencia parásita se han perdido. El único grupo de protozoos que sólo incluye especies parásitas es el phylum Apicomplexa. Los miembros de este phylum carecen de órganos locomotores, mientras que estas estructuras de uno u otro tipo existen en los phyla restantes de protozoos. PHYLUM SARCOMASTIGOPHORA. Subphylum Mastigophora: se mueven mediante estructuras especializadas denominadas flagelos, que son extensiones citoplásmicas largas como hilos. Los flagelos se originan en estructuras citoplásmicas denominadas blefaroplastos. Su número varía en cada especie. Algunos son parásitos hemáticos o tisulares y otros son intestinales. Se reproducen generalmente en forma asexual. Los principales generos patogenos son Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Dientamoeba fragilis, Leishmania y Trypanosoma. Subphylum Sarcodina: incluye a protozoos que se mueven por medio de extensiones citoplásmicas denominadas pseudópodos. La especie patógena importante es Entamoeba histolytica, una amiba intestinal. El grupo incluye tambien los generos Naegleria y Acanthamoeba que aunque son amibas de vida libre, su potencial invasivo ya se ha demostrado al causar meningoencefalitis y otros danos serios como queratitis. PHYLUM APICOMPLEXA. Los miembros de este phylum (antes denominado Sporozoa), son parásitos estrictos, tisulares. Presentan un ciclo de vida complejo con una alternancia de generaciones sexuales y asexuales. Los generos patógenos mas importantes son Plasmodium, Toxoplasma, Isospora, Cryptosporium, Pneumocystis y Sarcocystis. PHYLUM CILIOPHORA. En estos organismos la locomoción se lleva a cabo por medio de cilios, que son proyecciones citoplásmicas relativamente cortas, que se originan en pequeños gránulos basales. Son más cortos y más numerosos que los flagelos. El único género parásito es Balantidium, en el intestino. 8 MATERIALES Y METODOS. Observe al microscopio Protozoarios parásitos intestinales, montados en laminillas fijas. Observe al microscopio Protozoarios parásitos tisulares, montados en laminillas fija. Note las diferencias morfológicas fundamentales entre los protozoarios observados, así como sus estructuras mostradas en cada caso y haga dibujos. Haga dibujos detallados de los ciclos vitales en cada caso, para los parásitos observados. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 9 PRACTICA #2 PLATYHELMINTHES OBJETIVO DE LA PRACTICA Aprender a diferenciar morfológicamente a los Platyhelminthes, en ejemplares adultos, huevos y larvas, con el fin de identificarlos. INTRODUCCION. El phylum de los Platyhelminthes o gusanos planos incluye animales pluricelulares que se caracterizan por tener el cuerpo aplanado con simetría bilateral. La mayoría son hermafroditas. Los adultos pueden tener menos de 1 mm de longitud o alcanzar una longitud de varios metros. La mayoría de los miembros son simbiontes que viven sobre o dentro de sus hospedadores. Las especies de vida libre pertenecen a la clase Turbellaria, que también incluye formas parásitas de animales inferiores. Las clasaes Trematoda y Cestoda incluyen solo organismos parásitos. Los Trematoda o "duelas" tienen forma de hoja alargada; son organismos delgados, con órganos de fijación consistentes en ganchos o en depresiones musculares en forma de copa terminada en ventosas. Su aparato digestivo es muy simple. De los tres órdenes de Trematoda, el Orden Digenea incluye todas las especies parásitas humanas. Los miembros tienen ciclos de vida complejos, por lo menos con un hospedador intermediario molusco. Hay especies intestinales, hepáticas, hemáticas y pulmonares. Las especies más comunes son Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Schistosoma spp., Paragonimus westermani, Clonorchis sinensis. Los miembros de la Clase Cestoda tienen cuerpo alargado en forma de cinta segmentada, que lleva en el extremo anterior un órgano especial de fijación: el escólex. No poseen aparato digestivo. Los céstodos adultos o tenias, viven en el intestino delgado. Con excepción de Hymenolepis nana, los cestodos requieren un hospedador intermediario para el desarrollo larvario. El hombre puede ser hospedador de los adultos, o de las fases larvarias, dependiendo de la especie. Ejemplos comunes son T. solium, T. saginata, Echinococcus granulosus, Hymenolepis nana, H. diminuta. MATERIALES Y METODOS 1. Observe a simple vista (macroscópicamente), parásitos adultos o fragmentos de ellos y note las diferencias morfológicas. Escriba el nombre científico correspondiente y los nombres de sus estructuras, aclarando si es ejemplar completo o es fragmento. Haga dibujos. 2. Observe al microscopio larvas y huevos, montados en laminillas fijas y aprenda a diferenciarlos morfológicamente. Anote la etapa de desarrollo correspondiente en cada caso. Escriba el nombre científico en cada caso y los nombres de sus estructuras. 10 3. Haga dibujos detallados de los diferentes estadíos observados en cada parásito con el nombre de la fase observada. Discuta las similitudes y diferencias, entre ellos, en sus diferentes etapas. Haga un esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los parásitos observados. Anote los nombres de las etapas de desarrollo correspondientes en cada uno. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 11 PRACTICA #3 ASCHELMINTHES (CLASE NEMATODA) OBJETIVO DE LA PRACTICA Diferenciar morfológicamente huevos, larvas y adultos de los nemátodos principales, ya sea en forma macro o microscópica, según el caso, comparando sus ciclos vitales. INTRODUCCION. Los Aschelminthes (nemátodos) o gusanos redondos son animales cilíndricos, alargados, generalmente con los extremos adelgazados. Poseen una cutícula gruesa que puede ser lisa, o puede extenderse formando una serie de estructuras, sobre todo en los extremos anterior y posterior. Los sexos están separados, siendo el macho generalmente más pequeño que la hembra. Tienen un aparato digestivo bien desarrollado. Aunque la mayoría de los nemátodos son de vida libre, numerosas especies parasitan al hombre, a los animales y plantas. Para el desarrollo larvario de algunos, se necesitan hospedadores intermediarios. Los huevecillos de algunos requieren maduración en el suelo y otros deben ser transmitidos por insectos. Las especies humanas son intestinales y tisulares. Los géneros importantes en humanos son Trichinella, Trichuris, Strongyloides, Ancylostoma, Necator, Ascaris, Toxocara, Enterobius, Gnathostoma, Wuchereria, Onchocerca, Mansonella, Brugia, Loa Loa, Dipetalonema, Dracunculus. MATERIALES Y METODOS I. Estudie en un Ier grupo los nemátodos intestinales. Observe al microscopio de luz, ejemplares de huevos y larvas microscópicos de nemátodos, montados en laminillas fijas. Note las diferencias morfológicas para su identificación. Observe bajo el microscopio de disección ejemplares de adultos macroscópicos. Haga dibujos detallados de todos los parásitos observados, con el nombre de sus estructuras y el nombre científico correspondiente de cada parásito. Compare las similitudes y diferencias entre los dieferentes géneros observados. Dibuje los ciclos vitales correspondientes para cada género, indicando las fases observadas en el laboratorio. II. Estudie en un segundo grupo los nemátodos tisulares Observe al microscopio de luz, ejemplares de huevos y larvas microscópicos de nemátodos, montados en laminillas fijas. Note las diferencias morfológicas para su identificación. Observe bajo el microscopio de disección ejemplares de adultos macroscópicos. Haga dibujos detallados de todos los parásitos observados, con el nombre de sus estructuras y el nombre científico correspondiente de cada parásito. Compare las similitudes y diferencias entre los dieferentes géneros observados. Dibuje los ciclos vitales correspondientes para cada género, indicando las fases observadas en el laboratorio RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. Haga dibujos detallados de todos los ejemplares observados, como se indicó anteriormente. Discútalas y concluya. 12 CUESTIONARIO. 1. Haga separadamente un esquema del ciclo vital completo de cada uno de los parásitos observados en la práctica. 13 PRACTICA #4 COPROPARASITOSCOPICO DIRECTO OBJETIVO DE LA PRACTICA. Desarrollar la técnica del coproparasitoscópico directo y adquirir el criterio para saber cuándo usarlo. INTRODUCCION. Un examen coproparasitoscópico es el estudio de material fecal, para la búsqueda e identificación de formas parasitarias intestinales. Puede ser cualitativo o cuantitativo. Las muestras fecales son seriadas con un mínimo de tres y deben colocarse en frascos de boca ancha, guardados en lugares frescos, mientras se analizan, pues con el calor se aceleran los fenómenos de fermentación y con el frío se pueden destruir los quistes y trofozoítos de protozoos. Si son heces formadas, para conservar los parásitos se puede utilizar refrigeración a 10 C. Los métodos químicos permiten la conservación durante un tiempo más prolongado, sin correr el riesgo de que los parásitos se deformen o se destruyan, por ejemplo con soluciones que contienen formol, yodo-mertiolate, etc. EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO. En este estudio, el material fecal más utilizado es el recién obtenido por expulsión natural del paciente, ya sean heces bien formadas o evacuaciones disminuídas de consistencia, con moco y/o sangre. Este método es de gran utilidad para la detección en fresco de trofozoítos de Entamoeba histolítica, Giardia lamblia, Balantidium coli, Trichomonas hominis y Blastocytis hominis. En la suspensión teñida con lugol se pueden identificar con facilidad quistes de protozoos. Este examen en fresco es sencillo, rápido y económico, pues requiere poco material. -Es excelente para la búsqueda de trofozoítos y protozoos. -Es eficaz en la búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas. -Sin embargo, la muestra utilizada es muy pequeña y poco representativa. Los montajes en solución salina tienen la ventaja de que retienen la movilidad de los trofozoitos, sin embargo, es difícil la observación de las estructuras internas, pues con frecuencia son poco definidas. El Yodo se emplea para destacar las estructuras internas de los parásitos presentes, pero inmoviliza trofozoítos. MATERIALES Y METODOS Cada alumno debe trabajar por lo menos con dos especímenes diferentes, además de la muestra testigo que proporcione el profesor. Una muestra debe ser propia del alumno y una segunda puede ser de otra persona. *Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo el procedimiento. COPROPARASITOSCOPICO DIRECTO. 14 1. Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La muestra debe ser reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al laboratorio. 2. En un portaobjetos se coloca en un extremo una gota de solución salina isotónica y en el otro extremo una gota de lugol. 3. Con un aplicador se toma una muestra de heces (lo que se embarre solo en la punta), de preferencia que contenga moco y sangre y se deposita en la gota de sol. salina, haciendo una suspensión (no se hace frote). Se monta con un cubreobjetos. 4. Se repite la operación en la gota de lugol. 5. Puede hacer lo mismo con una gota de sol. de Nair. 6. Observe al microscopio, a 10 X y después a 40 X. 7. Con ayuda de los libros, se aprecian los diferentes tipos de residuos fecales, así como los posibles parásitos. 8. En un segundo portaobjetos coloque una gota de sol. de Nair y una gota de lugol, para hacer dos nuevas preparaciones. 9. De ser necesario, se adiciona más reactivo por un lado del cubreobjetos para no dejar secar la preparación. 10. Haga dibujos detallados de los protozoarios encontrados en las heces estudiadas. Hay posibilidad de que encuentre Giardia, E. histolytica, Balantitdium y Cryptosporidium principalmente. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 15 PRACTICA #5 COPROPARASITOSCOPICO. CONCENTRACION POR FLOTACION. OBJETIVO DE LA PRACTICA. Desarrollar y comprender la técnica, con el fin de diferenciar e identificar los parásitos en una muestra. INTRODUCCION. La concentración de parásitos por FLOTACION en muestras fecales permite comprobar la existencia de quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos, aún cuando estén presentes en pequeñas cantidades. Esta técnica se basa en la propiedad que tienen las soluciones de densidad mayor, para hacer flotar objetos menos densos. Por su sencillez se puede utilizar en encuestas en el campo. El método de Faust, con ZnSO4, es uno de los más utilizados, aunque es poco eficaz para huevos pesados como los de Tremátodos o como los huevos no-fértiles de Ascaris. Tampoco es muy efectivo para muestras de heces ricas en grasas. Este método puede realizarse en muestras recientes , refrigeradas o fijadas con formol (5% ó 10%). MATERIALES Y METODOS. CONCENTRACION DE PARASITOS POR FLOTACION. 1. Con un abatelenguas se toman aproximadamente 1 g de heces (el tamaño de un cacahuate) y se deposita en un vasito que contenga de 10 a 15 ml de agua de la llave y se mezclan con un aplicador. 2. La suspensión se filtra a través de una coladera o malla y se recibe el fltrado en un tubo de centrífuga de 14 ml. Se le adicionan 1-2 ml de éter. Tape con un corcho y agite vigorosamente. Adicione agua hasta que la muestra quede a 1cm por debajo del bordo superior del tubo. 3. Centrifugue por 45 segundos a 2500 rpm. Rompa cualquier acúmulo que pudiera haberse formado en la parte superior y decante el sobrenadante. 4. Añada 2 a 3 ml de agua de la llave y agite para resuspender el sedimento. Se resuspende nuevamente el sedimento, adicionando agua de la llave poco a poco, hasta que quede la muestra a 1 cm del borde superior del tubo. Se centrifuga de nuevo. 5. Se decanta el sobrenadante y se agregan al sedimento 2 a 3 ml de sulfato de zinc (dens. 1.180. Equivale a 330 g de sulfato de zinc en 1 litro de agua), moviendo con un aplicador para resuspender. Se agrega más sulfato de zinc hasta que llegue a unos 0.5 cm del borde superior del tubo. 6. Se centrifuga a 2300 rpm durante 2 min. y NO SAQUE EL TUBO. 16 7. Sin sacar el tubo de la centrífuga, recoja algunas gotas del material que flota en la superficie con una asa de platino (se debe cuidar que el asa no penetre demasiado bajo la superficie). 8. Se deposita la gota en un portaobjetos y se monta con una gota de lugol entre porta y cubre. 9. Se observa al microscopio, a 10X y 40X. 10. Haga dibujos detallados de las parásitos observados. 11. Discuta las dificultades de la técnica y dibuje los parásitos encontrados. Compare con la literatura para identificarlos. Concluya cuales parásitos identificó. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 17 PRACTICA #6 COPROPARASITOSCOPICO POR SEDIMENTACION OBJETIVO DE LA PRACTICA Desarrollo y comprensión de la técnica para aprender a diferenciar e identificar los parásitos en la muesta. INTRODUCCION. La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente huevos de tremátodos. Concentra bien estas formas y elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo aún en heces con cantidades excesivas de grasas. Sin embargo, durante la sedimentación, aparte de concentrarse los parásitos, se quedan reunidos también algunos otros materiales, abundando los artefactos durante la observación. Debido a que se usan varios reactivos resulta antieconómico, no obstante su eficacia. MATERIALES Y METODOS. Método del Formol-éter (Método de Ritchie): 1. Con un abatelenguas coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate) y adicione 10-12 ml de solución salina. Homogenice. 2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de centrífuga de vidrio de 14 ml 3. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en solución salina. 4. Repita el paso anterior, dos o tres veces, resuspendiendo el sedimento en solución salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un sedimento más limpio. 5. Agregue al sedimento 10 ml de formol al 10% , mezcle y deje en reposo de 5 min. 6. Añada 3 ml de éter y agite vigorosamente 30 segundos. 7. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. 8. Después de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente. 1) éter y lípidos en la superficie 2) un tapón de restos fecales 3) formaldehido 4) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parásitos. 9. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Se le adiciona unas gotitas de lugol y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur y se monta entre porta y cubre. Se observa a 10 y a 40 X. 18 10. Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros. Discuta las dificultades y las facilidades de la técnica, con respecto a las anteriores. Para la identificación de los parásitos compare con los parásitos observados en los libros. Haga dibujos detallados. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 19 PRACTICA #7 DIAGNOSTICO DE CISTICERCOSIS. OBJETIVO DE LA PRACTICA. Aprender a desarrollar las técnicas de diagnóstico de cisticercoisis y comprender su fundamento, para establecer la confirmación de cisticercosis. INTRODUCCION Los huevos de Taenia solium al ser ingeridos por humanos (en alimentos contaminados con heces) dan lugar a larvas que se dirigen a los órganos o tejidos del cuerpo, donde desarrollan los cisticercos. La presencia de unos pocos cisticercos en áreas no vitales (tejido subcutáneo, entre otros) puede ser asintomática, pero puede producirse una enfermedad grave cuando se fijan en áreas de importancia vital, como el cerebro o los ojos. Localización: a) mucosas, b) tejido celular subcutáneo, c) muscular, d) Ocular, e) sistema nervioso central, f) otros. El diagnóstico de la infección puede ser difícil. Se efectúa en diferentes maneras: a) clínico, b) de laboratorio, c) de gabinete. El diagnóstico debe hacerse mediante la correlación de todos los datos obtenidos. El cisticerco puede recuperarse completo o demostrarse histológicamente, en los tejidos separados por cirugía. Puede detectarse el ya calcificado, por rayos X o tomografía computarizada. En el ojo, se efectúa la visualización de los quistes. Las pruebas inmunológicas incluyen: 1) Fijación del complemento en L.C.R., detecta inmunoglobulinas. Un título positivo indica presencia del parásito, pero puede dar falsas negativas. 2) Hemaglutinación en suero sanguíneo, detecta anticuerpos circulantes. Títulos positivos deben relacionarse con la clínica. 3) Inmunofluorescencia es de las más específicas. 4) ELISA y aglutinacion con partículas látex, son de gran futuro MATERIALES Y METODOS. Haga una visita al rastro de la ciudad o a la escuela de Medicina Veterinaria y trate de obtener cisticercos en carne. 1. Observe al microscopio preparaciones fijas de cisticercos de Taenia solium o de T. saginata. 2. Con muchas precauciones y usando guantes, haga disecciones bajo el microscopio estereoscópico, de fragmentos de carne de cerdo, conteniendo cisticercos. Separe los parásitos y obsérvelos al microscopio. 2. Haga dibujos detallados de lo observado, con su leyenda correspondiente. fundamento de la técnica serológica utilizada e interprete los resultados. Explique el 20 3. Desarrolle la técnica serológica para diagnóstico de cisticercos, siguiendo las instrucciones que acompañan a los reactivos. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. CUESTIONARIO 1. Haga un esquema del ciclo vital de Taenia solium y uno del ciclo de Taenia saginata. Compárelos y describa sus similitudes y diferencias. 2. Nuevamente diga, qué tipo de alimentos llevan los huevos de Taenia solium para que a un humano se le desarrolle cisticercosis. Qué recomendaciones haría al paciente para evitar contraercisticercosis. 3. Qué tipo de alimentos llevan los cisticercos, que al ingerirse causan la teniasis o sea el desarrollo de los adultos. Qué recomendaciones haría al paciente para evitar contraer la tenia adulta intestinal. 4. Investigue cuál es el tratamiento para la cisticercosis humana. 21 PRACTICA #8 DIAGNOSTICO DE Giardia y Cryptosporidium POR TINCION CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES OBJETIVO DE LA PRACTICA Conocer una técnica de tinción para diagnosticar Giardia y Cryptosporidium y comprender su fundamento. INTRODUCCION. La tinción de Cryptosporidium aunque pueda realizarse con relativa facilidad, la observación es difícil por su tamaño tan pequeño (mucho menor que Giardia). Al recurrir a la tinción con anticuerpos fluorescentes no queda duda del hallazgo. Por otro lado, la tinción de los parásitos en preparaciones fijas permiten una mejor observación del núcleo y otras estructuras de los parásitos y proporciona el método mejor para el diagnóstico morfológico de especies intestinales, como amibas y flagelados. Estas técnicas son útiles para la conservación de los parásitos en colecciones. Desafortunadamente no son recomendables como métodos rutinarios, porque requieren mucho tiempo, el proceso es complicado, y no siempre resulta uniforme. Sin embargo se han desarrollado algunos métodos de tinción menos laboriosos, e incluso algunos de ellos se han adoptado como rutinarios en diagnóstico, tal como la tinción modificada de ZiehlNeelsen para diagnóstico de Cryptosporidium a partir de heces, permitiendo la observación de ooquistes teñidos del parásito. Esta técnica es sencilla de realizar y poco costosa, por lo que ha cobrado importancia, debido al reciente incremento de este protozoario en individuos inmunocomprometidos. Aunque la tinción de Ziehl-Neelsen es fácil de desarrollar, hay posibilidad de confución con artefactos. Además, en muestras de agua, los organismos como algas y otros son muy numerosos y no es aplicable, por lo que hay que recurrir a los anticuerpos marcados. En este caso, aunque Giardia sea lo suficientemente grande para observarse bien simplemente con Lugol, también se pierde en las muestrasde agua. MATERIALES Y METODOS I.Tinción simple de los parásitos con Lugol. Haga preparaciones entre porta y cubre en una gota de lugol y observe a 40 X. Discuta el éxito de la tinción en la observación. II. Tinción de Ziehl-Neelsen. 1. Haga extendidos (frotis) de heces frescas o consevadas en formol, con un aplicador de madera, 2. Fije los extendidos cubriéndolos con metanol durante dos a cinco minutos, para fijar al porta. Deje secar al aire libre. 3. Cubra los extendidos con carbol fucsina y teñir durante 20-30 minutos. No requiere calentarse. 4. Enjuague con agua de la llave. 22 5. Decolorar por goteo con Alcohol acido al 3% durante un min. hasta que no escurra más colorante. Lave con agua de la llave. 6. Cubra los portaobjetos con verde de malaquita durante cinco minutos. Lave con agua de la llave y deje secar al aire libre. 7. Observe al microscopio. Los ooquistes de Cryptosporidium se tiñen de color rojo intenso, sobre un fondo verde. Identifique las fases del parásito observadas en el ciclo vital. Dibuje el ciclo completo. 8. La laminilla puede guardarse, haciendo montaje con resina sintética. 9. Discuta las dificultades de la técnica y haga dibujos detallados. I. Tinción con anticuerpos fluorescentes. 1. 200 l de los parásitos de heces en un tubo ependorf, más PBS para lavar, se centrifugan a 3000 rpm 5 min. 2. El sedimento se fija con 250 l paraformaldehido 20 min. Se usa un control de parásitos sin fijar. Se centrifuga a 3000 rpm 20 min. 3. El sedimento resuspendido se coloca en una membrana de acetato de celulosa (sobre un soporte de filtración) y en la superficie se adicionan 75 a 100 l de DAPI 4. Incubar a 37 C 30 min en cámara húmeda (cubriendo con papel de aluminio). 5. Adicionar 350 lde la mezcla de anticuerpos marcados con fluoresceína (para Giardia y Cryptosporidium) e incubar 10 min a temperatura ambiente 6. Lavar con TRIS con vacío. Lavar con PBS. 7. Observar en el microscopio de fluorescencia con el filtro adecuado. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 23 PRACTICA 9 CULTIVO DE PROTOZOARIOS OBJETIVO: Aplicación de algunas técnicas para cultivo y estudio microscópico de protozoarios. Descripción de los protozoarios aislados. INTRODUCCION. Los protozoarios son organismos eucarióticos unicelulares, del reino animal, que varían en forma y tamaño. Se encuentran en hábitats húmedos y son muy comunes en agua dulce, como estanques, lagos, ríos, arroyos, suelos húmedos, aguas negras, estanques costeros, vegetación flotante, estuarios, bahías, aguas termales, estanques glaciares, etc. Los protozoos juegan un papel importante en la ecología. Algunos aportan materia orgánica en ambientes acuáticos y otros actúan como depredadores de otros microorganismos y como degradadores de materia orgánica. Son particularmente importantes en el suelo y en aguas contaminadas. Ciertos grupos viven en asociaciones de comensalismo o de mutualismo, otros son parásitos de animales o de humanos. Los protozoarios de vida libre son relativamente fáciles de cultivar en medios de laboratorio que contengan infusiones de vegetales y bacterias. Los parásitos en general no son cultivables, teniendo que recurrir a animales de laboratorio. Para el aislamiento de protozoarios saprófitos son buenas las muestras de agua dulce que incluyan fragmentos de algas filamentosas y lodo con abundante materia orgánica. También son buenos los suelos con abundante materia orgánica en descomposición. Para la incubación es buena una alta humedad. Se recomienda usar en los medios la misma agua de la muestra. Para aislar parásitos intestinales se usan muestras de heces. Los parásitos Giardia y Cryptosporidium pueden aislarse a partir de agua, incluso de agua potable. Naegleria y Acanthamoeba pueden encontrarse en muestras de suelo y en agua. MATERIALES Y METODOS I. Aislamiento de protozoarios de vida libre. 1. Siembre la muestra (agua, fango o suelo), en un frasco de boca ancha conteniendo medio a base de medio de chícharo, en proporción 1:1, es decir una parte de muestra y un volumen igual del medio. Tape el frasco. 2. Inocule la muestra en un frasco con medio A en proporción de 1:4 , un volumen de muestra por 3 del medio. 3. En un frasco con medio Chalkley, agregue 7 a 12 gotas de leche descremada. Inocule la muestra en proporción 1:4 4. En una caja de Petri vacía coloque un poco de lodo o de suelo y cubra la muestra con agua del mismo charco o de la llave. Agregue 3 granos de arroz crudo y tape la caja. 24 5. En una caja de Petri conteniendo agar nutritivo, inocule 0.1 ml de una suspensión bacteriana (gramnegativas, como E. coli). Enseguida inocule la caja con una muestra de suelo suspendido en agua, en cantidad suficiente para formar una película líquida sobre el agar. Tape la caja. 6. Incube todos los medios de cultivo a temperatura ambiente, con luz tenue, durante 7- 10 días. Mantenga la humedad inicial, agregando agua si es necesario. II. Estudio microscópico de los protozoarios cultivados. Preparación en Fresco 1. Forme un círculo de metilcelulosa en un portaobjetos 2. Con una pipetita desechable coloque una gota del cultivo de protozoarios en el centro del anillo 3. Adiciones una gota de rojo neutro sobre la muestra. Las vacuolas ácidas se teñirán de rojo y las alcalinas de amarillo. 4. Monte la preparación con un cubreobjetos. Observe a 10 X y a 40 X. 5. Puede repetir otras preparaciones, substituyendo el rojo neutro por otros reactivos. El Lugol tiñe el almidón de azul, el paramilo de rojo y el glucógenode café negruzco. El Verde de metilo tiñe el núcleo. La solución de Noland permite teñir flagelos, cilios y otras estructuras. III. Cultivo de Entamoeba Medio de cultivo: puede utilizar un medio ya preparado en el mercado o puede prepararlo en la forma siguiente: Mezcle la clara (albúmina) de 4 huevos de gallina con 1 litro de solución de Ringer. Preparación de la sol. de Ringer: NaCl………………9.0 g KCl………………..0.2 g CaCl……………….0.2 g H2O………………..1000 ml 1. Filtre la mezcla de la albúmina más la sol. de Ringer, en un filtro bacteriológico para esterilizar 2. Coloque suero de caballo inactivado estéril en tubos de ensayo estériles(1/3 de lleno) 3. Incline los tubos dentro de un baño a 80 C por 1 hora, para coagular el suero. 4. Cubra la superficie del suero en los tubos, con la sol. de albúmina-sol. de Ringer. 5. Antes de la inoculación con las heces, añada una asada de almidón de arroz en polvo y deposítelo en el fondo del tubo (use el asa bacteriológica previamente mojada en el líquido del tubo antes de tomar el arroz). 6. Inocule cada tubo con heces, el equivalente al tamaño de un chícharo. 7. Incube a 37 C una semana, examinando diariamente al microscopio. IV. Preparaciones Permanentes con Hematoxilina de Harris-eosina 25 1. Coloque una gota de la muestra de protozoos sobre un portaobjetos 2. Elimine los residuos de materia orgánica grandes y extienda la muestra homogéneamente 3. Fije con solución de Schaudinn durante 15 min, a 60-70 C. 4. Lave con agua destilada 5. Tiña con Hematoxilina de Harris o de Delafield (filtre la solución antes de usarla) 6. Lave con agua destilada. 7. Observe la preparación antes de que seque para ver si se tiñó bien 8. Para que vire el color, lave con agua de la llave 9. Deshidrate con alcohol de 70 10. Tiña con eosina alcohólica por 30 a 60 segundos 11. Para deshidratar la preparación, cubra con alcohol de 96 y después con alcohol absoluto 12. Aclare con xilol 13. Cubra con bálsamo de Canadá y monte con un cubreobjetos. Deje secar y observe a 10X y a 40 X RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. Haga esquemas de los protozoarios observados y trate de descubrir por lo menos 5 géneros diferentes, comparando con la literatura. Localice sus diferentes estructuras, Relacione cada especie con la fuente de donde se aislaron, así como su abundancia. Apéndice: Medios y reactivos utilizados: Medio infusión de chícharo: chícharos …………… cinco granos Agua de la llave ………500 ml Hervir el agua 10 min y añadir los chícharos. Hervir de nuevo 10 min. Enfriar y repartir la infusión en frascos. Medio de Chalkley: NaCl …………..0.1 g KCl ……………0.004 g CaCl 2 …………0.006 g Agua dest. ……..1000 ml Disolver y distribuir en frascos. Medio A para flagelados. Peptona de carne……….. 2 g Fosfato monopotásico……0.25 g Sulfato de magnesio………0.25 g Cloruro de potasio ……….0.25 g Cloruro férrico…………….huellas Agua destilada…………….1000 ml Disolver y distribuir en frascos. 26 PRACTICA #10 ARTHROPODA OBJETIVO DE LA PRACTICA: Observar las diferencias morfológicas de los artrópodos más comunes, para aprender a identificarlos. INTRODUCCION Los animales de este phylum son segmentados, con simetría bilateral, el cuerpo incluído en una cubierta quitinosa rígida o exoesqueleto y llevan apéndices pares, articulados. El aparato digestivo está bien desarrollado. Los sexos están separados. Los de interés médico pueden dividirse en dos grupos: aquellos que son auténticos parásitos, y los que por diferentes medios afectan la salud o al bienestar. CLASE CRUSTACEA: Incluye formas acuáticas, como cangrejos, langostas, copépodos, gambas. Algunos son huéspedes intermedaiarios de parásitos humanos. CLASE QUILOPODA: Incluye a los ciempies, caracterizados por tener un par de patas en cada segmento corporal. El primer par de apéndices está transformado en uñas venenosas. CLASE ARACHNIDA: Tienen el cuerpo dividido en dos partes, llamadas cefalotorax y abdomen. Los adultos tienen cuatro pares de patas. Ejemplo, los escorpiones (alacranes), arañas, garrapatas y ácaros. Algunos producen veneno tóxico en diferente grado. Otros pueden transmitir patógenos. CLASE PENTASTOMIDA: Incluye solo endoparásitos llamados gusanos lengua. Carecen de apéndices externos y poseen dos pares de ganchos cerca de la boca. Los adultos viven en el aparato respiratorio de vertebrados. En el hombre pueden formarse fases larvarias enquistadas. CLASE INSECTA: Incluye los artrópodos más importantes de importancia médica. Tienen el cuerpo dividido en tres partes: cabeza, tórax y abdomen. Poseen tres pares de patas. Orden Anoplura: Son piojos chupadores, aplastados dorsoventralmente, ápteros. Orden Hemiptera: Chinches verdaderas, ej: las de cama. Pueden ser ápteras o aladas. Los redúvidos (de nariz cónica) son vectores de Tripanosomas. 27 Orden Coleoptera: Son los escarabajos. Algunos son huéspedes intermediarios de céstodos. Tienen alas endurecidas. Orden Hymenoptera: Incluyen hormigas, abejas, avispas. Son importantes por el veneno de sus aguijones. Algunas hormigas son huéspedes intermediarios de un céstodo. Orden Diptera: Con un par de alas auténticas, incluye moscas y mosquitos. Algunas larvas de moscas son parásitas del hombre y de animales y los mosquitos transmiten diferentes patógenos. MATERIALES Y METODOS 1. Haga observaciones macroscópicas (a simple vista) de artrópodos montados en preparaciones permanentes. A continuación véalos con el microscopio estereoscópico. Los más pequeños puede observarlos bajo el microscopio compuesto. Haga dibujos detallados anotando los nombres de las partes del cuerpo y el nombre científico correspondiente de cada ejemplar, acompañado del nombre popular. Compare y discuta las similitudes y diferencias. 2. Improvise una red para cazar artrópodos en la forma siguiente: con un gancho de alambre (de los usados para colgar ropa) forme un círculo y sujételo a un palo de escoba o similar. Con un pedazo de manta de cielo cosa un cono y amárrelo al círculo de alambre. Haga una excursión al campo y colecte artrópodos con la red fabricada. Llévelos al laboratorio y clasifíquelos. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. CUESTIONARIO. 1. Investigue en la biblioteca los datos sobre los artrópodos mas comunes importantes en México, ya sea como parasitos o como animales venenosos, que incluya arácnidos e insectos y su distribución geográfica. 28 BIBLIOGRAFIA PARASITOLOGIA Benson, H. . 1990 Microbiological Applications. A laboratory Manual in General Microbiology WCB Wm.C.Brown Publishers Colomé, J, R. Cano, A. M. Kubinski y D. Grady. 1986. Laboratory Exercises in Microbiology. Best. Publ. Co. California. Desowitz, R.S. 1990. Ova and Parasites. Ed. Harper & Row, Publ. Faust, C. E., P.C. Beaver, y R.C. Jung. Animal Agents and Vectors of Human Disease. Ed. Lea & Febiger. Pa. USA. Manual de Procedimientos de laboratorio y de productos BBL. 1974 Becton Dickinson, S.A. de C.V. Romero-Cabello, R. 1999. Microbiología y Parasitología humana. Ed. Médica Panamericana, Méexixo. Stevens, R. 1986. Diagnostic Devices Manual and Directory. Immunology and Microbiology Tests. Marcel Dekker, Inc. Tay-Zavala, J., R. Lara-Aguilera, O. Velasco-Castrejón y M. Gutiérrez Quiroz. Parasitología Médica.1980. Ed. Fco. Méndez Cervantes. México, D.F. 29
