Interacciones de Brucella abortus con la inmunidad innata d
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Interacciones de Brucella abortus con la inmunidad innata del sistema nervioso central como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis García Samartino, Clara 2010 Tesis Doctoral Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires www.digital.bl.fcen.uba.ar Contacto: [email protected] Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Ciencias Biológicas “Interacciones de Brucella abortus con la inmunidad innata del sistema nervioso central como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis” Tesis para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires Área: Ciencias Biológicas Autora: Lic. Clara García Samartino Director: Dr. Guillermo H. Giambartolomei Consejero de Estudios: Dr. Omar A. Coso Lugar de trabajo: Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA) Buenos Aires, 2010 Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Índice Índice Abreviaturas 4 Resumen 5 Introducción 8 Brucelosis Generalidades Etiología Brucella spp Estructura antigénica Epidemiología Transmisión de la enfermedad Diagnostico, tratamiento y control Respuesta inmune contra Brucella spp. Inmunidad innata Receptores Inmunidad adaptativa Células T α CD4+ y CD8+ Células T δ Respuesta humoral Citoquinas Manifestaciones clínicas Factores de virulencia Respuesta inflamatoria y patogenia Activadores bacterianos de la respuesta inflamatoria Sistema Nervioso Central Funciones de las células neurogliales Inmunidad e infección en el SNC Consecuencias de la infección en el SNC Inflamación y apoptosis Neurobrucelosis Diagnóstico diferencial Tratamiento Manifestaciones clínicas Patobiología 9 9 9 9 11 12 13 13 15 15 16 16 16 17 17 17 18 20 20 21 23 23 25 26 28 30 30 31 31 33 Hipótesis y objetivos 36 Materiales y métodos 38 Animales Bacterias Lipoproteínas y LPS Inyecciones estereotácticas intracraneales Histología e inmunohistoquímica -2- 39 39 40 40 40 Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Cultivos celulares Infección in vitro Estimulación de citoquinas y quimiocinas Proliferación de astrocitos Ensayos de apoptosis Bloqueo de la actividad de caspasas Análisis estadístico Índice 41 42 42 43 43 44 44 45 Resultados La presencia de B. abortus induce astrogliosis en el cerebro de ratones BALB/c 46 Caracterización inmunoquímica y morfológica de astrocitos y microglía 48 B. abortus infecta y se multiplica en astrocitos y microglía 50 HKBA induce la producción de citoquinas y quimiocinas en astrocitos y microglía 53 El LPS de B. abortus no es el responsable de la respuesta inflamatoria 55 L-Omp19 induce la producción de citoquinas y quimiocinas en astrocitos y microglía 57 L-Omp19 induce astrogliosis en el cerebro de ratones 59 TLR2 media la respuesta inflamatoria desencadenada por B. abortus y L-Omp19 61 HKBA y L-Omp19 inducen proliferación de astrocitos 64 La infección con B. abortus induce apoptosis de astrocitos 66 HKBA y L-Omp19 inducen apoptosis de astrocitos in vitro 67 La apoptosis de astrocitos está mediada por TNFR1 70 Las caspasas median la apoptosis inducida por HKBA y L-Omp19 73 Discusión 75 Conclusiones 83 Referencias 85 -3- Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis ABREVIATURAS Aa Ac ADN Ag ARN ARNm CD11b DMEM Fig. GFAP HKBA h Ig IL IPTG kDa LPS Aminoácido Anticuerpo Ácido desoxirribonucleico Antígeno Ácido ribonucleico Ácido ribonucleico mensajero Ac. específico microglía Medio de cultivo DMEM Figura Gliar Fibrilar Acidic Protein Brucella abortus muerta por calor horas Inmunoglobulina Interleuquina Isopropil-beta-D-thiogalactopiranosido kilo Dalton Lipopolisacárido O4 Omp Ac. específico para oligodendrocitos Proteína de membrana externa Pam3Cys PB PBS PFA N-palmitoil-S-(dipalmitoilgliceril)-cisteína Polimixina Buffer fosfato salino Paraformaldehído R S cepa fenotipo rugoso cepa fenotipo liso SF SNC SNP TNF-α UFC WB Solución fisiológica Sistema Nervioso Central Sistema Nervioso Periférico Factor de Necrosis Tumoral alfa Unidad Formadora de Colonias Western Blot -4- Abreviaturas Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis RESUMENES -5- Resumen Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resumen “Interacciones de Brucella abortus con la inmunidad innata del sistema nervioso central como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis” La invasión al sistema nervioso central (SNC) por bacterias del genero Brucella resulta en un desorden inflamatorio llamado neurobrucelosis. En este trabajo nosotros presentamos evidencia in vivo e in vitro mostrando que B. abortus y sus lipoproteínas activan la inmunidad innata del SNC, originando una respuesta inflamatoria que lleva a la astrogliosis, una característica típica de neurobrucelosis. Inyecciones intracraneales de B. abortus muerta por calor (HKBA) o de la proteína de la membrana externa 19 (Omp19), una lipoproteína de B. abortus utilizada como modelo, indujeron astrogliosis concomitantemente con un infiltrado neutrofílico en el cuerpo estriado de los ratones. La infección de astrocitos y microglía con B. abortus incitó la secreción de IL-6, IL-1β, TNF-α, MCP-1 y KC (CXCL1). HKBA también estimuló la liberación de estos mediadores inflamatorios, sugiriendo la independencia de la viabilidad bacteriana en este fenómeno e implicando a un componente estructural de la bacteria. De acuerdo con esto, Omp19 indujo el mismo patrón de secreción de citoquinas y quimiocinas. La respuesta inflamatoria desencadenada por Omp19 estuvo mediada por TLR2, ya que cultivos de células gliales provenientes de ratones TLR2 KO no promovieron la secreción de mediadores proinflamatorios. Sin embargo este receptor no media la infección ni la replicación de la bacteria en astrocitos o en microglía. La infección con B. abortus promovió apoptosis de astrocitos pero no de microglía. HKBA y Omp19 indujeron, no solo la apoptosis de los astrocitos sino también su proliferación, dos de las características que se observan durante la astrogliosis. La proliferación inducida por HKBA y Omp19 disminuyó en presencia de Ac anti-IL-6. Por otro lado, la apoptosis promovida por los 2 estímulos fue completamente suprimida en células provenientes de ratones deficientes del receptor p55 de TNF-α o cuando se agregó a los cultivos el inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK. Por lo tanto, IL-6 contribuye a la proliferación de astrocitos, y la señalización de TNF-α vía TNFR1 a través de caspasas determina la apoptosis, cuando son estimulados con B. abortus y sus lipopoproteínas. Los resultados de esta tesis son prueba de principio de que las lipoproteínas de Brucella podrían ser determinantes de patogenia claves en neurobrucelosis, y que la astrogliosis podría contribuir a la patogénesis de la misma. Palabras claves: B. abortus, Lipoproteínas, Inmunidad innata, Neurobrucelosis, Astrogliosis. -6- Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resumen “Interactions of Brucella abortus with innate immunity of central nervous system as a determinant of neurobrucellosis” Central nervous system (CNS) invasion by bacteria of the genus Brucella results in an inflammatory disorder called neurobrucellosis. In this study we present in vivo and in vitro evidence showing that B. abortus and its lipoproteins activate the innate immunity of the CNS, eliciting an inflammatory response that leads to astrogliosis, a characteristic feature of neurobrucellosis. Intracranial injection of heat killed B. abortus (HKBA) or outer membrane protein 19 (Omp19), a B. abortus lipoprotein used as a model, induced astrogliosis with concomitant neutrophil´s infiltrate in mouse striatum. Infection of astrocyte and microglia with B. abortus induced the secretion of IL-6, IL-1β, TNF-α, MCP-1 and KC (CXCL1). HKBA also induced these inflammatory mediators, suggesting independency of bacterial viability and involvement of a structural component of the bacterium. Accordingly, Omp19 induced the same cytokine and chemokine secretion pattern. TLR2 mediated the inflammatory response induced by Omp19 since cultures from TLR2 KO mice did not induced the secretion of proinflammatory mediators. However, this receptor is not envolved in the infection or replication of the bacteria inside astrocytes or microglía. B. abortus infection induced astrocyte, but not microglia, apoptosis. HKBA and Omp19 elicited not only astrocyte apoptosis but also proliferation, two features observed during astrogliosis. Proliferation induced by HKBA and Omp19 was diminished in the presence of anti-IL-6 antibody, and apoptosis induced by both stimuli was completely suppressed in cells of TNF-α receptor p55-/- mice or when the general caspase inhibitor Z-VAD-FMK was added to cultures. Hence, IL-6 contributes to astrocyte proliferation, and TNF-α signaling via TNFR1 through the coupling of caspases determines apoptosis, as elicited by B. abortus and its lipoproteins. Our results provide proof of the principle that Brucella lipoproteins could be key virulence factors in neurobrucellosis, and that astrogliosis might contribute to neurobrucellosis pathogenesis. Key words: B. abortus, Lipoproteins, Innate immunity, Neurobrucellosis, Astrogliosis. -7- Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis INTRODUCCIÓN -8- Introducción Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción INTRODUCCIÓN Brucelosis Generalidades La brucelosis es una zoonosis endémica causada por bacterias Gram negativas del género Brucella, las cuales se comportan como parásitos intracelulares facultativos. Fue descubierta por el microbiólogo David Bruce en 1887 a partir de un soldado que presentaba fiebre de malta, estableciendo una relación causal entre la bacteria y la enfermedad 1. Esta enfermedad afecta al hombre y a distintas especies animales, tanto domésticas (bovinos, caprinos, porcinos, caninos, etc.) como salvajes (camellos, delfines, roedores, etc.). En animales esta enfermedad causa disminución de la capacidad reproductora, abortos, crías débiles y contaminación de lácteos y carnes. Algunas de las especies que afecta la enfermedad se encuentran muy relacionadas con la alimentación y la actividad laboral ganadera 2, 3 . Resulta, entonces, un importante problema alimentario y sanitario; tanto en nuestro país como a nivel mundial 4. Etiología Brucella spp. Las bacterias del género Brucella pertenecen a la clase alfa-proteobacterias, orden Rhizobiales, familia Brucellaceae 5, 6. Los agentes causales de la brucelosis son bacilos cocoides pequeños, Gram negativos, inmóviles, no esporulantes y que no poseen cápsulas ni flagelos. Estas bacterias son microorganismos intracelulares facultativos capaces de sobrevivir y multiplicarse dentro de las células del sistema reticuloendotelial y tejidos asociados. Se considera que esta cualidad es el factor que les confiere virulencia. Son capaces de infectar a fagocitos profesionales (macrófagos, linfocitos B y células dendríticas) y no profesionales como neutrófilos y monocitos. Además de otros tipos celulares como, células endoteliales, y osteoblastos 7-11. -9- Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Especie Especies Lisas (S) Especies Rugosas (R) Hospedador Introducción Patogenicidad en humanos B. melitensis Caprinos, ovinos, camélidos Elevada B. suis Moderada B. pinnipedae Porcinos, roedores salvajes Bovinos, camélidos, búfalos, bisontes Focas, lobos marinos B. cetaceae Cetáceos Desconocida B. neotomae Roedores Desconocido B. ovis Ovinos No posee B. canis Caninos Moderada B. abortus Moderada Moderada Tabla 1. Características de las diferentes especies del género Brucella Las distintas especies del género Brucella se clasifican en lisas o rugosas según el tipo de colonias que forman en cultivo. Estas diferencias en el fenotipo de la colonia reflejan las diferencias en la composición química del lipopolisacárido (LPS). A su vez existe una relación entre el tipo de colonia que forman y la virulencia; las cepas lisas son más virulentas que las rugosas 12, 13. El género Brucella es un género en expansión. Hasta el año 2008 constaba de 8 especies clasificadas de acuerdo a variaciones antigénicas y al hospedador preferencial. Estas eran: B. melitensis, B. suis, B. abortus, B. pinnipedae, B. cetaceae, B. neotomae, B. canis y B. ovis 14. De estas 8 especies sólo 5 son patógenas para el hombre: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis y B. pinnipedae. De ellas, las 3 primeras son responsables de la mayoría de los casos de brucelosis humana 7, 15, 16 (Tabla 1). En el 2008 se reportaron 2 nuevas especies: B. microti 17 cuya secuencia es muy similar a la de B. suis (aislada a partir de ratones salvajes) y B. inopinata 18 , aislada en un implante mamario de una mujer de 71 años con síntomas de brucelosis. El genoma de Brucella consiste de 2 cromosomas circulares sin plásmidos 19 y al igual que se encontró para otras proteobacterias los genes asociados a la replicación del ácido desoxirribonucleico (ADN), a la trascripción y traducción de genes y a la biosíntesis de la pared celular están presentes en ambos. Recientemente se secuenciaron los genomas de todas las especies de Brucella los cuales proveerán abundante información para dilucidar los mecanismos de patogenicidad de la bacteria 20. - 10 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Estructura antigénica La envoltura celular de las bacterias del género Brucella está formada por una membrana interna, una membrana externa y un espacio periplasmático intermedio (Ilustración 1). Éste contiene algunas enzimas y proteínas relacionadas con el transporte de solutos y un gel glucopeptídico denominado peptidoglicano, responsable de la forma e integridad osmótica de la bacteria. La membrana externa contiene distribuidos asimétricamente fosfolípidos, proteínas y un lipopolisacárido (LPS) considerado el principal antígeno (Ag). El LPS consta de una parte glucolipídica (Lípido A) inserta en la membrana externa, y por tanto no expuesta en la superficie, y otra exclusivamente polisacarídica dirigida hacia el exterior. Ilustración 1. Esquema representativo de la membrana de las especies lisas de Brucella spp. La parte polisacarídica del LPS se divide en 2 secciones: un oligosacárido intermedio, llamado núcleo y la cadena O. El Ag “O” es la porción antigénicamente dominante de la molécula y está constituido por unidades repetitivas de oligosacáridos en los cuales suelen residir los determinantes antigénicos del LPS de las cepas lisas (S). Este segmento está ausente en el LPS de las cepas del tipo rugoso (R). El lípido A se encuentra inmerso en la capa lipídica actuando como soporte o unión del resto de la molécula a la superficie bacteriana. El lípido A del LPS de Brucella, a diferencia del de la mayoría de las enterobacterias, posee una estructura atípica caracterizada por su alta hidrofobicidad, su bajo grado de sustitución y por poseer cadenas alifáticas más largas 5. - 11 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Asociadas al LPS y formando parte de la membrana se encuentran proteínas de la membrana externa (Omps). Estas proteínas se han dividido en 3 grupos de acuerdo a su peso molecular: grupo 1 (89 y 94 kDa); grupo 2 (35 y 40 kDa) y grupo 3 (25 y 30 kDa). Las proteínas de los grupos 2 y 3 se encuentran en mayor cantidad y son conocidas como Omp “mayores”. Las proteínas del grupo 1, junto con otras con pesos moleculares entre 10 y 20 kDa, son denominadas Omp “menores”. Se conoce que las proteínas del grupo 2 funcionan como porinas 21-23 mientras que las proteínas del grupo 3 son similares a la Omp A de E. coli 24. Tibor y col. 25 han demostrado que las Omp 10, 16 y 19 son lipoproteínas. Estos 3 grupos de proteínas se encuentran expuestos en la membrana externa, y son reconocidos por el sistema inmune en el curso de la infección 26. A través de diversos estudios se ha confirmado la inmunogenicidad de las Omps y su posible utilidad como vacunas 24, 27, 28. Epidemiología La incidencia y prevalencia de la brucelosis varían según el área geográfica. Las zonas con mayor prevalencia son el Mediterráneo, el oeste de Asia y algunas zonas de África y Latinoamérica, especialmente países con bajos recursos económicos 29-31 . A nivel mundial, la infección en animales con B. abortus es la más frecuente a pesar de la vacunación masiva; excepto en Europa y en Australia donde ha sido prácticamente erradicada. En América del Norte, la brucelosis afecta preferencialmente zonas agrícolas del norte y centro de México 32, aunque en Canadá y Estados Unidos ha disminuido en los últimos años. En América Central todos los países son afectados por B. abortus, siendo la prevalencia de hasta un 8% 30. En Sudamérica se encuentra en varios países, en la mayoría es endémica y representa un problema sanitario importante 29, 33 . En Chile, sobre todo en las zonas ganaderas y productoras de leche, se encuentra la mayor concentración de ganado infectado 34. La incidencia de la brucelosis es muy alta en nuestro país, si bien la enfermedad se encuentra subdiagnosticada y subreportada 35 , cerca del 15% de los bovinos se encuentran infectados y el número de personas que adquiere la infección anualmente oscila entre 10.000 y 20.000 3. Datos aportados por el SENASA en el año 2005 muestran que la prevalencia de la brucelosis en los bovinos fue del 5% 36. Sin embargo, una encuesta realizada el mismo año por el INTA Bariloche, la Dirección de Ganadería de la provincia de Río Negro y el laboratorio de brucelosis de la Fundación Barrera Patagónica, reveló que la prevalencia de la enfermedad era de 21,4 % de establecimientos positivos a B. abortus -con un rango de 10% al 40%- y una tasa de - 12 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción reaccionantes del 3,7% 37. Las áreas más afectadas son el nordeste, la pre-cordillera de los andes, la Mesopotamia y la pampa húmeda, ubicando a la brucelosis en el cuarto lugar entre las enfermedades transmisibles crónicas de la Argentina, después de la enfermedad de Chagas, la tuberculosis y la sífilis. La distribución geográfica de la brucelosis humana está en estrecha relación con la distribución de la brucelosis animal. La incidencia puede variar desde valores inferiores a 0,01/100.000 habitantes en los países desarrollados hasta cifras superiores a 200/100.000 habitantes en los países menos desarrollados. En la Argentina, donde no sólo hay un importante consumo de lácteos y carnes, sino que además la producción y elaboración de estos productos es una de las principales actividades económicas, la incidencia es muy alta siendo una de las enfermedades laborales más importantes 38. Transmisión de la enfermedad Los reservorios naturales de la bacteria suelen ser los mismos animales que infecta: cerdos, ovinos, caprinos, bovinos y mamíferos marinos 39. La variedad de mamíferos que se ven afectados son muy diversos: roedores, cánidos, camellos y cetáceos. Hay que tener en cuenta que estos animales también manifiestan la enfermedad, solo que con diferentes sintomatologías dependiendo del hospedador y la especie de Brucella de la que se trate. La bacteria también es capaz de sobrevivir en el suelo y en los alimentos (leche, manteca y queso) por varias semanas. La entrada de las bacterias se puede producir por contacto directo con material infectado, por aerosoles o alimentos contaminados 31, 40 a través de las vías conjuntival, inhalatoria, gástrica o dérmica en la piel lesionada40, 41. Además, la entrada por inoculación accidental con cepas vacunales es frecuente en peones y veterinarios 2, 42 así como trabajadores de la industria de la carne. En países desarrollados es una enfermedad típicamente ocupacional. Diagnóstico, tratamiento y control En general el diagnóstico de la enfermedad es difícil debido a que los síntomas que caracterizan a la enfermedad en la primera etapa no son patognomónicos 43. Es muy importante que el médico realice una exhaustiva anamnesis que le permita pensar en la posibilidad de que se trate de brucelosis. - 13 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Para corroborar el diagnóstico se realizan estudios de laboratorio como detección de anticuerpos (Ac) específicos contra Brucella en sangre por seroaglutinación. También se puede utilizar el diagnóstico por PCR (Polymerase Chain Reaction) la cual es altamente específica e incluso sirve para distinguir entre las diferentes especies de Brucella, pero su costo hace que la seroaglutinación siga siendo la técnica más utilizada. Aunque el diagnóstico de certeza se establece aislando al microorganismo a partir de cultivos de sangre, médula ósea u otros tejidos; esto solo se logra en un 50% de los casos donde los métodos serológicos dieron positivos 44. Si la enfermedad es confirmada tempranamente, con un adecuado tratamiento en la mayoría de los casos la evolución del paciente es favorable. En las formas agudas de la enfermedad, la administración precoz y prolongada de una apropiada combinación de antibióticos durante períodos de varias semanas (en promedio de 6 a 8) provoca la remisión del cuadro clínico en al menos el 90% de los pacientes. La asociación de doxiciclina y estreptomicina constituye el tratamiento de elección ya que en estas condiciones se presenta un menor porcentaje de pacientes con recaídas 45. La administración de doxiciclina y rifampicina es empleada como tratamiento alternativo. En cuanto al control de la enfermedad, dado que no existen hasta el momento vacunas para humanos, la forma más efectiva de tratar esta zoonosis es evitar que se infecten los animales. Las vacunas para animales más utilizadas se obtienen a partir de cepas vivas atenuadas. Actualmente se utilizan dos cepas vacunales lisas: B. abortus cepa 19 (S19) para el ganado vacuno y B. melitensis REV-1 para pequeños rumiantes, y una cepa atenuada rugosa: B. abortus RB51 para el ganado vacuno 29. En Argentina la brucelosis humana es una enfermedad que persiste en las regiones donde la infección animal no está controlada; a pesar de ello se están realizando esfuerzos para proveer asistencia, diagnóstico y vacunación en todas las provincias argentinas 4. Algunas medidas de prevención a tener en cuenta son: programas de saneamiento del ganado, educación para la salud en áreas endémicas, medidas de higiene y seguridad en el trabajo y control sanitario en las fronteras. - 14 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Respuesta inmune contra Brucella spp. Inmunidad innata El rol de la respuesta innata en estadíos tempranos de la infección por Brucella, es reducir el número inicial de bacterias promoviendo un ambiente adecuado para generar una respuesta Th1 en el hospedador 15. Los neutrófilos, los macrófagos y el complemento juegan un rol clave en esta fase temprana de la respuesta a la invasión frente al microorganismo 46. Diversos autores han demostrado que macrófagos y neutrófilos poseen la capacidad de eliminar un alto porcentaje de las bacterias fagocitadas 47, 48 . Del mismo modo se pudo determinar que tanto la fagocitosis como el estallido respiratorio en macrófagos son dependientes de la opsonización de las bacterias por Acs y complemento, así como de la activación celular por el interferón gama (IFN- ) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) que puedan producir otras células 48 . Todas las especies del género Brucella son sensibles a los metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, sin embargo son capaces de inhibir la degranulación de los gránulos primarios y secundarios aumentando su supervivencia intracelular 49, 50 . Si bien hasta el momento no se ha establecido la importancia de las células dendríticas (DC) en el control de la infección por Brucella spp., recientemente se ha demostrado que la bacteria puede sobrevivir dentro de estas células tal como lo hace en otros tipos celulares 51. Un estudio reciente ha implicado a las DC B220- CD11b+ LY-6C+ NK1.1- iNOS+ en la infección con Brucella, sugiriendo que las mismas serían los principales efectores de la respuesta Th1 murina contra bacterias intracelulares y que podrían estar involucradas en el desarrollo de la respuesta Th1 en humanos. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que B. abortus es capaz de inducir la maduración de DC e inducir una respuesta Th1 en DC humanas 10. Por otro lado, el rol de las células NK en la infección con Brucella no está del todo claro. Aparentemente estas células no son claves en la erradicación de la bacteria durante la infección aguda, ya que ratones susceptibles (BALB/c) y resistentes (C57BL/10) controlan la infección por B. abortus 2308 en ausencia de células NK 52 . En pacientes con brucelosis, la actividad de las células NK se encuentra aparentemente suprimida 53. Sin embargo, el co-cultivo de células NK humanas con macrófagos infectados con B. suis, activa a las NK para producir IFN- y TNF-α y destruir a los macrófagos infectados 54. - 15 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Receptores Los receptores de la inmunidad innata de tipo Toll (TLR) reconocen a Brucella spp. y a sus componentes bacterianos, y luego los fagocitos mononucleares inician respuestas inmunes que influyen tanto en la inmunidad innata como adaptativa. Los TLR reconocen patrones moleculares asociados a patógenos. Estos patrones incluyen entre otros al LPS que es reconocido por TLR4; los ácidos nucleicos (ADN/ARN) son reconocidos por TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9; el peptidoglicano y las lipoproteínas son reconocidos por TLR1, TLR2, TLR6, y la flagelina que es reconocida por TLR5 55. Estudios recientes han revelado las cascadas de señalización intracelulares que participan en el inicio de la respuesta inmune mediada por TLR en la infección por Brucella. Los receptores TLR2, TLR4 y TLR9 han sido implicados en las interacciones del hospedador con Brucella. Las vías de señalizaciones dependientes de MyD88 e independientes de TRIF participan en la activación de la respuesta innata por parte de Brucella. Recientemente se ha demostrado el rol crítico de la molécula MyD88 en la maduración de las células dendríticas y la producción de IL12 durante la infección por B. abortus 56 . También hay que destacar la contribución de NOD y los receptores IFN tipo-I durante la infección por Brucella 57. Inmunidad adaptativa La respuesta adaptativa contra Brucella involucra 3 mecanismos principales. Primero, el IFN- producido por células T CD4+, CD8+ y δ activa las funciones bactericidas del macrófago inhibiendo la supervivencia intracelular de Brucella. Segundo, la citotoxicidad T CD8+ y δ puede destruir al macrófago infectado. Tercero, los isotipos de Acs de tipo T "helper 1" (Th1) como IgG2a e IgG3 opsonizan al patógeno y facilitan la fagocitosis 15. Células T α CD4+ y CD8+ La importancia tanto de las células T CD4+ como CD8+ ha sido definida en la inmunidad contra Brucella 58,28. Estudios de transferencia adoptiva de Winter y col.24 han demostrado que la inmunidad protectora contra B. abortus S19 en ratón se debe a un efecto combinado de células CD4+ (L3t4) y CD8+ (Lyt2). A pesar de ello, experimentos en ratones deficientes en los genes que codifican para moléculas MHCI o MHCII demuestran que los ratones que no tienen células T CD8+ controlan la infección más lentamente que los ratones de la cepa salvaje. Mientras que los ratones deficientes en células T CD4+ lo hacen en forma similar a los ratones de la cepa - 16 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis salvaje 59 Introducción . Por otro lado, otros autores utilizando B. abortus 2308 sugieren que los ratones deficientes en 2 microglobulina controlan eficazmente la infección y que las células T CD8+ no son importantes hasta después de la primera semana de infección 54. Células T δ Se ha descripto que este tipo celular con el receptor T V 9Vδ2 está aumentado a nivel periférico en pacientes agudos infectados con B. melitensis 60. Estas células activadas por Ags no peptídicos controlan el número de bacterias intracelulares porque secretan TNF-α e IFNactivando las funciones bactericidas del macrófago. Estudios in vitro sugieren que las células T V 9Vδ2 también podrían lisar directamente a las células infectadas 61. Respuesta humoral Al comienzo de la infección aparecen Acs que suelen permanecer detectables en el suero durante años. Éstos están dirigidos contra diferentes componentes del microorganismo, pero especialmente contra los Ags superficiales, en especial el LPS 62 . A pesar que dichos Acs colaboran en la lucha contra el patógeno, no son suficientes para evitar la enfermedad. No obstante, la detección de Acs dirigidos contra el LPS es útil para el diagnóstico, pronóstico y curso de la infección 62. Citoquinas Hay varias citoquinas que juegan un rol importante en el control de la infección por Brucella spp.: IL-12, IFN- y TNF- α 63, 64. La IL-12 es la responsable de dirigir la respuesta inmune hacia un perfil de tipo Th1 tanto in vitro como in vivo 65, 66, con producción de IFN- , y es producida por células B, macrófagos y DC. Si bien se conoce la importancia de esta citoquina en brucelosis 67, 68 ; los mecanismos de inducción de IL-12 en estas células no se han esclarecido. El IFN- permite a la inmunidad enfrentarse a Brucella mediante la activación de las funciones bactericidas del macrófago, induciendo la apoptosis, aumentando la diferenciación celular y la producción de citoquinas, induciendo el “switch” de inmunoglobulina G (IgG) a IgG2a y aumentando la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica 43, 50. - 17 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción La relevancia del IFN- en la resolución de la infección por Brucella se evidencia en estudios con ratones deficientes en el gen de esta citoquina ya que éstos mueren luego de 6 semanas de la infección con B. abortus 54 . Sin embargo a pesar de ser Brucella un potente inductor de IFN- , esta bacteria es capaz de sobrevivir y reproducirse durante un largo período en el bazo de ratones infectados 69 . Otros estudios han sugerido que la activación con IFN- impide que Brucella establezca su nicho replicativo, y por tanto si ya se estableció el brucelosoma, el IFN- no tiene efecto alguno 70. La producción temprana durante la infección de una citoquina inmunomoduladora como IL-10 podría explicar en parte este fenómeno52. Estudios conducidos hasta la fecha han revelado que B. abortus puede inducir en diversos tipos celulares la producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1 , IL-6, IL-12 y TNF-α 59, 63, 68, 71-74 . El IFN- es el componente crucial de la inmunidad que permite la sobrevida del hospedador, y así el estado crónico de infección. A pesar que las células T CD4+ y CD8+ están claramente involucradas en la producción de interferón, y que las células T CD8 pueden ser citotóxicas, el rol para las células NK y la citotoxicidad no se ha sustentado experimentalmente 53 . Manifestaciones clínicas En el hombre la brucelosis presenta una gran tendencia a la cronicidad y se caracteriza por fiebre y focalización de las bacterias en distintos tejidos (articulaciones, hueso, endocardio, sistema nervioso, etc.). La supervivencia intracelular de Brucella condiciona el curso ondulante de la enfermedad y la tendencia a la recaída y evolución crónica. Si bien constituye una enfermedad de baja mortalidad, puede dejar secuelas discapacitantes de magnitud variable. Por otra parte, la brucelosis humana no presenta un cuadro clínico característico que permita una detección precoz del infectado, lo que favorece la evolución a la cronicidad, complicando las alternativas terapéuticas y la curación definitiva. Muchos pacientes padecen infecciones asintomáticas. El período de incubación varía entre 10 y 20 días, aunque la sintomatología puede aparecer varios meses después 74. La brucelosis puede ser clasificada como aguda, subaguda o crónica en base al tiempo de evolución de la misma 74, 75 . La etapa aguda se manifiesta con fiebre elevada, escalofríos, sudoración de olor característico, dolores musculares y articulares 75. Es difícil la identificación de la enfermedad en esta etapa, ya que los signos y síntomas pueden ser comunes a otras - 18 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción enfermedades como la salmonelosis, fiebre tifoidea, tuberculosis y leptospirosis. Debido al empleo de los antibióticos ya no se registra el clásico patrón de fiebre ondulante. El recuento de células en sangre se caracteriza usualmente por una leucopenia moderada y una relativa linfocitosis, junto con una leve anemia y trombocitopenia 43. La tercera parte de los pacientes presenta tos seca o productiva, el 30% estreñimiento y el 5-10% diarreas. En el 50% de los casos se produce hepatomegalia (ligera o moderada) y esplenomegalia y en el 25% adenopatías. Más del 5% de los pacientes presentan lesiones cutáneas: erupciones papulonodulares en el tronco y extremidades, de las que puede aislarse el microorganismo. Es característico el desarrollo de localizaciones específicas como la osteoarticular 76, respiratoria, genitourinaria y nerviosa. Las recaídas o recidivas se presentan en el 15% de los casos, luego de 2 a 3 meses de la finalización del tratamiento. En ambas fases, aguda y crónica, se observa un proceso inflamatorio generalizado. Los signos clínicos de esa inflamación son: fiebre ondulante, artritis, endocarditis, meningitis, pleocitosis, infiltración monocitaria de las articulaciones, granulomas, etc. 74 . La presencia de tejido granulomatoso es frecuentemente asociada con la persistencia de Brucella. La liberación de bacterias de estos granulomas puede favorecer la diseminación de la bacteria a distintas localizaciones a través de repetidos episodios de bacteremia 77. La complicación osteoarticular es la más frecuente de las formas localizadas de la enfermedad, la cual puede afectar articulaciones periféricas, articulaciones sacroilíacas o la columna vertebral 78-81. En etapas tempranas de brucelosis humana se puede presentar una artritis inflamatoria intermitente o crónica, que asemeja otras formas de artritis inflamatorias humanas 74 . El tejido sinovial de pacientes con artrosis producida por Brucella revela un infiltrado linfocítico y una hiperplasia de las células sinoviales 7. El daño en las articulaciones está frecuentemente asociado con la presencia de Brucella en las mismas 82. En el hígado, la infección con Brucella induce lesiones hepáticas que pueden ser tanto granulomatosas como no granulomatosas 7, 83 . Histológicamente, los granulomas muestran necrosis central, un infiltrado de células polimórficas y fibrosis periférica 84. En neurobrucelosis, el rasgo característico de la inflamación es la meningoencefalitis, la cual es ocasionada por la invasión al SNC por Brucella 19. El examen del líquido cefalorraquídeo en la meningitis ocasionada por Brucella generalmente revela un elevado contenido de proteínas y pleocitosis linfocítica 19 . Las biopsias quirúrgicas del cerebro o meninges y el examen postmórtem del tejido nervioso evidencian infiltrado linfocítico perivascular y formación de granulomas 19. - 19 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Factores de virulencia Brucella presenta varias cualidades que la diferencian del resto de las bacterias respecto a la virulencia; ya que no cuenta con factores clásicos de virulencia como cápsulas, fimbrias, flagelos, exotoxinas, exoenzimas incluyendo exoproteasas, citolisinas, formas de resistencia, variaciones antigénicas, plásmidos y fagos lisogénicos 85-87 . En cambio Brucella delega su virulencia en su capacidad de sobrevivir y replicarse en los compartimentos fagocíticos vacuolares de los macrófagos 86. Los macrófagos están altamente adaptados a la destrucción de bacterias, la modulación de la apoptosis por algunas especies de bacterias es un mecanismo de virulencia muy importante. Las cepas virulentas lisas como B. abortus 2308, son capaces de inhibir la muerte celular programada en macrófagos humanos y de ratón 13, 88, 89. La inhibición de la muerte celular facilita la sobrevida y la replicación de las cepas lisas de brucella dentro de los macrófagos. En contraste muchas cepas rugosas derivadas de B. abortus, B. melitensis y B. suis, deficientes en el Ag O del LPS, no pueden sobrevivir dentro de los macrófagos y por lo tanto son atenuadas 12, 90. La supervivencia de Brucella dentro de las células se ha asociado con la síntesis de enzimas antioxidantes 91 inhiben fagosoma-lisosoma, la fusión y a la producción de GMP (guanosina 5´monofosfato) y adenina, que la degranulación, la activación del sistema mieloperoxidasa-haluro y la producción del TNF-α 50. Respuesta inflamatoria y patogenia A pesar de la diversidad de signos y síntomas en la brucelosis humana, la inflamación es un rasgo característico de esta enfermedad presente virtualmente en todos los órganos afectados. Esta particularidad, junto con la detección de bacterias en los tejidos inflamados, sugiere que Brucella estimula una robusta respuesta inflamatoria en los sitios en que se localiza. B. abortus, uno de los agentes etiológicos de la enfermedad, ha demostrado ser capaz de activar poderosamente el sistema inmune innato y adaptativo, conduciendo a una fuerte respuesta pro-inflamatoria que favorece un perfil Th1 tanto in vitro como in vivo 46, 66 . Como ya mencionamos, B. abortus puede inducir en diversos tipos celulares la producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1 , IL-6, IL-12 y TNF-α 59, 63, 68, 71-73, 92 . Estas citoquinas generalmente poseen potentes funciones efectoras que se superponen para dar lugar a distintos - 20 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción componentes de la inflamación como por ejemplo: necrosis tisular 93, quemotaxis de infiltrados celulares, inducir la secreción de colagenasas y prostaglandinas por los fibroblastos sinoviales y condrocitos 94, 95 , reabsorción ósea y destrucción del cartílago mecanismos microbicidas 97 96 , al igual que una plétora de . Además, se han reportado niveles aumentados de IFN-γ en pacientes con brucelosis aguda 66 ; y otros estudios confirmaron que el IFN-γ y el TNF-α están involucrados en la patofisiología de la brucelosis y que se encuentran estrechamente relacionados con la activación inflamatoria de la enfermedad 66. Sin embargo, los mecanismos por los cuales estas bacterias desencadenan la respuesta inflamatoria son hasta el momento parcialmente conocidos. Activadores bacterianos de la respuesta inflamatoria La mayoría de los rasgos relacionados con la patogenicidad de estas bacterias parecen estar concentrados en su membrana externa. Dentro de los componentes de la membrana con posible asociación a la patogenicidad, el LPS de Brucella ha suscitado especial interés 98, 99 ,a pesar de que ha sido demostrado que la mayoría de las características químicas, físicas y biológicas de esta molécula difieren cuantitativamente y cualitativamente del LPS “clásico” de las enterobacterias 100 . A diferencia de otras endotoxinas, el LPS de Brucella no es pirogénico, no activa la cascada del complemento de manera significativa y es un mitógeno muy débil de linfocitos B murinos y humanos. Comparado con el LPS de las enterobacterias, se requieren concentraciones 100 veces más altas de LPS de Brucella para inducir muerte por shock endotóxico. En cuanto a la producción de mediadores inflamatorios, se ha demostrado que la actividad biológica del LPS de Brucella es entre 3 y 4 órdenes de magnitud menor que el LPS de las enterobacterias 65, 72, 92 . Todas las propiedades biológicas del LPS dependen del lípido A, cuya estructura está conservada en un gran número de especies bacterianas 101 . La atenuada actividad biológica del LPS de Brucella parece estar relacionada con el lípido A de esta molécula y su particular estructura química mencionada anteriormente 102-104. El mayor enigma que plantea el estudio de la patogenicidad en brucelosis es cómo pueden las bacterias del género Brucella desencadenar una respuesta inflamatoria si la actividad endotóxica de su LPS es despreciable. En forma alternativa, B. abortus podría utilizar su ADN para provocar una respuesta pro-inflamatoria. El ADN bacteriano se encuentra enriquecido en motivos CpG no metilados los cuales han demostrado activar el sistema inmune innato 105 . Sin embargo, se ha comprobado que el ADN de B. abortus es relativamente ineficiente en - 21 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis desencadenar la producción de citoquinas 92 Introducción . Se ha demostrado recientemente que HKBA (Brucella muerta por calor) induce la producción de TNF-α a través de una vía dependiente de TLR2; transductor específico de peptidoglicano y lipoproteínas; e independiente de TLR4 y TLR9 73 . Dado que el LPS y el ADN bacteriano utilizan TLR4 y TLR9, respectivamente, para estimular la producción de citoquinas, éste último hallazgo sostiene la noción de que el LPS y el ADN de B. abortus no están involucrados en desencadenar la respuesta pro-inflamatoria en brucelosis. Esto implica que otros componentes bacterianos son los responsables de desencadenar la respuesta inflamatoria. Estudios desarrollados por el director de esta tesis, así como investigaciones realizadas por otros grupos de trabajo TLR2 109 106-108 , han demostrado que las lipoproteínas bacterianas, ligandos , son capaces de estimular la proliferación celular al igual que la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Este fenómeno está asociado a la acilación de estas proteínas 106-108. Además, se ha demostrado que las lipoproteínas bacterianas también son capaces de inducir la producción de IL-10, una citoquina anti-inflamatoria, en monocitos humanos 110 . La inhibición tanto autócrina como exócrina de la producción de IL-10 da como resultado un aumento en la producción de las citoquinas pro-inflamatorias IL-6 e IL-12 111. El hecho de que las lipoproteínas puedan inducir no sólo citoquinas inflamatorias, sino también anti-inflamatorias, como IL-10, ha reforzado la idea de que las lipoproteínas son factores cruciales en la patogénesis de las infecciones bacterianas. Mediante clonado y secuenciación se ha demostrado que 3 genes que codifican para Omps de B. abortus, Omp10, Omp16 y Omp19, exhiben características estructurales de precursores de lipoproteínas 23, 112 , es decir que poseen un péptido señal aminoterminal que conforma la secuencia consenso necesaria para la modificación lipídica y el procesamiento de las lipoproteínas 23, 112 . El correcto procesamiento de Omp10, Omp16 y Omp19 en E. coli sugiere que el camino de maduración para lipoproteínas es funcionalmente compartido entre Brucella spp. y E. coli 23 . Análisis fisicoquímicos y funcionales confirmaron que Omp10, Omp16 y Omp19 son lipoproteínas y que se encuentran expuestas en la superficie de la membrana externa de Brucella 25. El mismo trabajo ha demostrado que estas lipoproteínas están presentes en todas las especies del género Brucella y sus biovares. A pesar del poderoso potencial inmunomodulador de las lipoproteínas, se les ha prestado hasta el momento poca atención en la brucelosis, siendo nuestro grupo de trabajo un precursor en la investigación de la función de estas moléculas en la patogenia inflamatoria de la brucelosis 10, 113, 114 . - 22 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Sistema Nervioso Central Dado que el trabajo se enfocará en los mecanismos de patogenia de la neurobrucelosis, es importante recordar como está formado el SNC y qué células del parénquima cerebral son las responsables de generar la respuesta inmune inflamatoria. El SNC está formado por el encéfalo y la médula espinal. En él se integra y relaciona la información sensitiva aferente, se generan los pensamientos y almacena la memoria. El SNC está conectado con los receptores sensitivos, los músculos y las glándulas de las zonas periféricas del organismo, a través del sistema nervioso periférico (SNP). Este último está formado por los nervios craneales, que nacen en el encéfalo y los nervios raquídeos que nacen en la médula espinal. Una parte de estos nervios lleva los impulsos nerviosos hasta el SNC, mientras que otras partes transportan los impulsos que salen del SNC. El componente aferente del SNP consiste en células nerviosas, llamadas neuronas sensitivas o aferentes, que conducen el impulso desde receptores sensitivos de varias partes del organismo hasta el SNC. El componente eferente consiste en células nerviosas llamadas neuronas motoras o eferentes, se originan dentro del SNC y conducen los impulsos nerviosos hasta músculos y glándulas. Las neuronas del SNC están sostenidas por células no excitables que se denominan neuroglía. Estas células son más pequeñas que las neuronas y las superan de 5 o 10 veces en número (50% del volumen del encéfalo y la médula espinal). Hay 4 tipos principales de células neurogliales, los astrocitos, los oligodendrocitos, la microglía y las células del epéndimo. El SNC está protegido por los huesos del cráneo y la columna vertebral, las meninges, el líquido cefalorraquídeo dentro del espacio subaraquidoineo y la barrera hematoencefálica (BHE). Sin embargo puede ser invadido y dañado por una gran variedad de microorganismos 115 . La defensa del cuerpo contra estas infecciones involucra a las células residentes del SNC, especialmente a los astrocitos, la microglía, y las células inmunes que invaden el tejido nervioso desde la vasculatura 115. Funciones de las células neurogliales Los astrocitos tienen cuerpos celulares pequeños con prolongaciones que se ramifican y extienden en todas direcciones y que en su interior poseen filamentos intermedios. Estos filamentos intermedios están compuestos en su gran mayoría por una proteína denominada - 23 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) 116 Introducción . Existen 2 tipos de astrocitos según su morfología celular y ubicación anatómica, los fibrosos (tipo I) se encuentran principalmente en la sustancia blanca (formada principalmente por las prolongaciones nerviosas: dendritas y axones) y los protoplasmáticos (tipo II), se encuentran en la sustancia gris (constituida por los cuerpos neuronales) 117 . Ambos, los fibrosos y los protoplasmáticos, proporcionan un marco de sostén, son aislantes eléctricos, limitan la diseminación de los neurotransmisores, captan iones de K+, almacenan glucógeno y tienen función fagocítica, ocupando el lugar de las neuronas muertas (gliosis de reemplazo). Son de origen neuroectodérmico y son esenciales para la homeostasis cerebral y las funciones neuronales 118. Además son los responsables de formar los limitantes de la glía alrededor de las venas restringiendo el acceso de las células inmunes al parénquima del SNC 119. Los oligodendrocitos tienen cuerpos celulares pequeños y algunas prolongaciones delicadas; no hay filamentos en su citoplasma. Son los responsables de la formación de la vaina de mielina de las fibras nerviosas del SNC. Se cree que influyen en el microambiente de las neuronas120. Los oligodendrocitos se originan a partir de las células de un precursor propio O-2A (precursores de oligodendrocitos y astrocitos tipo-II) 121 . Estas células progenitoras O-2A, son bipotenciales in vitro y pueden originar, también, una segunda población de astrocitos tipo-II 122. La microglía son las células más pequeñas y se hallan dispersas en todo el SNC. En sus pequeños cuerpos celulares se originan prolongaciones ondulantes ramificadas que tienen numerosas proyecciones como espinas. Son inactivas en el SNC normal pero proliferan en la enfermedad y son activamente fagocíticas (su citoplasma se llena con lípidos y restos celulares). Pertenecen al linaje mieloide y son consideradas los macrófagos del SNC. Estas células son capaces de modificar su fenotipo y reactividad luego de una injuria o inflamación 123. Las células ependimales revisten las cavidades del encéfalo y el conducto central de la médula espinal. Forman una capa única de células cúbicas o cilíndricas que poseen microvellosidades y cilias. Las cilias son móviles y contribuyen al flujo de líquido cefalorraquídeo. Ante una injuria, las primeras células del SNC que reaccionan son los astrocitos y la microglía. Los astrocitos responden con firmeza a las infecciones del SNC así como a las enfermedades desmielinizantes inflamatorias inducidas por células inmunes autorreactivas 124 . La astrocitosis reactiva característicamente incluye un aumento en el número y tamaño de células que expresan GFAP 19 y con frecuencia se supone que es el resultado de la proliferación astroglial y migración de astrocitos que expresan GFAP desde las regiones vecinas. Este cambio fenotípico es complejo; implica la expresión de muchas moléculas nuevas no detectables en la - 24 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción astroglía en reposo, así como el aumento en la modulación de una variedad de moléculas, además de GFAP, que se encuentran en astrocitos en reposo 125. Inmunidad e infección en el SNC El SNC ha sido comúnmente tratado como un sitio inmuno-privilegiado 55, 126 . Sin embargo importantes estudios publicados durante los últimos 10 años indican que el SNC puede ofrecer un lugar para la respuesta inmune innata y la adaptativa 127. Esto refleja la habilidad del SNC de luchar contra las infecciones a pesar de su supuesto estado inmunoprivilegiado128. Las infecciones en el SNC siguen siendo de importante morbilidad y mortalidad 129, 130 . La invasión microbiana a través de la BHE es un prerrequisito para la infección del SNC. La BHE es una barrera funcional y estructural formada por células endoteliales vasculares, astrocitos y pericitos (células que se encuentran alrededor de capilares y están relacionadas con células del músculo liso). La asociación con los pericitos reduce la apoptosis endotelial y estabiliza la vasculatura, manteniendo el microambiente neural regulando el pasaje de moléculas dentro y fuera del cerebro, protegiendo el cerebro de cualquier microorganismo y toxinas que están circulando en la sangre 131-134 . Los astrocitos junto con las células microgliales y las endoteliales, regulan el reclutamiento de células hematopoyéticas infiltrantes y pueden afectar la translocación de algunos microorganismos 135. Además de las actividades antimicrobianas de los astrocitos y la modulación de las vías de señalización de transducción en el cerebro, las células endoteliales junto con los pericitos pueden afectar la integridad de la barrera 136, 137. Los patógenos pueden atravesar BHE de forma transcelular, paracelular y/o infectando fagocitos (mecanismo de caballo de Troya) 130. Consecuentemente los patógenos pueden causar la disfunción de la BHE, inclusive aumentar su permeabilidad, ocasionando pleocitosis y encefalopatías 130. La vía transcelular se refiere a la penetración del microorganismo a través de las células de la barrera sin evidencia del microorganismo entre las células o de disrupción de las uniones entre las mismas 130, 138. La vía paracelular está definida como la penetración del microorganismo entre las células de la barrera con o sin evidencia de disrupción de la uniones de las células de la barrera. El mecanismo del Caballo de Troya involucra la penetración de la barrera utilizando trasmigración dentro de fagotitos infectados 130, 138. La vía transcelular ha sido demostrada para la mayoría de los patógenos bacterianos causantes de meningitis, incluyendo a E. Coli 129, 139, 140 - 25 - , Streptococos agalactiae 129, 139, 141 , S. Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis pneumoneae albicans 144 129, 139, 142 , Neisseria meningitides y Cryptococcus neoformans protozoos como Tripanosoma spp. 146, 147 145 129, 139, 143 Introducción y patógenos como hongos Candida . La vía paracelular ha sido sugerida para los y Borrelia spp. 147, 148 , aunque estos microorganismo también han demostrado atravesar la barrera hematoencefálica de forma transcelular. El mecanismo de caballo de Troya ha sido sugerido para Listeria monocitogenes y Mycobacterium tuberculosis 31, 139 pero también se demostró que lo hacen por medio de la vía transcelular 129, 139, 149-151 . Consecuencias de la infección en el SNC Como discutimos anteriormente, la infección de microorganismos al SNC puede inducir la disfunción de la BHE y afectar a la secreción y expresión de citoquinas, quimiocinas y moléculas de adhesión induciendo citotoxicidad y apoptosis en las células endoteliales de la microvasculatura cerebral, lo que resulta en un aumento en la permeabilidad de la BHE, pleocitosis y encefalopatías 139. Una vez que los microorganismos logran atravesar la BHE, la infección en el SNC representa un desafío para la defensa contra los patógenos, debido a que el SNC cuenta con un sistema de vigilancia mínimo y no posee drenaje linfático 152. Por lo tanto las células residentes del SNC deben ser capaces de montar una respuesta rápida y efectiva para controlar la infección hasta que las células del sistema inmune adaptativo periférico, macrófagos y linfocitos sean reclutadas. Si bien la microglía juega un rol crucial en la respuesta inmune en el SNC 123, 152-154; los astrocitos, el tipo celular más numeroso de la glía, también son capaces de contribuir al ambiente inflamatorio 118, 155. En estadíos tempranos de la infección, productos bacterianos o virales activan el sistema inmune innato, en gran medida por medio de los receptores TLR (Toll-like receptors) que reconocen patrones moleculares específicos astrocitos murinos y humanos en reposo 156 .La expresión de TLR ha sido demostrada en 55, 157-159 infección. Ambos han demostrado tener TLR2 , permitiendo a estas células responder a la 157, 158 , TLR3138, TLR4 158, 160 , TLR5 158, 160 y TLR9 158, 160 los cuales son importantes para el reconocimiento de las bacterias 161. La microglía también cuenta con la expresión de diferentes TLR: TLR1-13 162,163-165. Los astrocitos y la microglía han demostrado responder a señales de infecciones bacterianas como LPS, peptidoglicano, o motivos de ADN no metilados CpG, tanto in vivo como - 26 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción in vitro, con incrementos en la secreción de citoquinas y quimiocinas inflamatorias, incluyendo interleuquina 6 (IL-6), TNF-α, IL-12, CCL2, CCL3 y CCL4 159, 166-169. Los mediadores liberados por los astrocitos y la microglía luego del reconocimiento al patógeno disparan 2 tipos de eventos: i) activan células vecinas y amplifican la respuesta local iniciando la respuesta inmune innata y ii) modifican la permeabilidad de la BHE y atraen células inmunes de la circulación dentro del tejido neural, dando comienzo a la respuesta inmune adaptativa. Entre las citoquinas, el TNF-α, el IFN-γ y la IL-1 son las principales activadoras de los astrocitos y la microglía. Estudios de perfiles genéticos en astrocitos expuestos in vitro a las citoquinas inflamatorias mencionadas demostraron que regulan genes involucrados en varias vías celulares (de la inmunidad innata y la adaptativa), la presentación de antígenos, la apoptosis, la migración de leucocitos y la permeabilidad de BHE 170, 171 . Diversas citoquinas (IL-6, INF- , TGF- , GM-CSF, IL1- , y TNF-α) tienen un efecto dual. Por un lado son pro-inflamatorias: aumentan la permeabilidad de la BHE y activan las células del endotelio. También producen la activación, diferenciación y proliferación de monocitos, microglía y astrocitos. Así mismo inducen la sobrevida y diferenciación de células B. Por otro lado el efecto anti-inflamatorio conduce a la inmnosupresión y liberación de mediadores neuroprotectores 55. Las respuestas de los astrocitos a las quimiocinas involucran la quimiotaxis, la proliferación celular y la supervivencia. Las quimiocinas como CCL2, CCL5, CCL20, CXCL10, CXCL12, CXCL1, CXCL2 y CX3CL1, poseen efectos duales. Un efecto pro-inflamatorio como el reclutamiento de monocitos y macrófagos, células dendríticas, linfocitos B y T, y neutrófilos; y un efecto anti-inflamatorio como es la regulación de la mielinización y la actividad microglial. A su vez inducen la proliferación y sobrevida de los astrocitos y la migración de microglía y progenitores neurales 55. Además, CXCL12 y CCL5, pueden inducir la liberación de glutamato y la síntesis de citoquinas y quimiocinas, evidenciando el rol de esta clase de moléculas en la regulación de la comunicación entre glía-glía y glía-neurona 155, 172. Los factores derivados de astrocitos, tales como GM-CSF, IL-6, CCL2 y CCL5 regulan la migración microglial, la activación y proliferación celular. Algunos mediadores solubles derivados de las células gliales, incluyendo CCL2, CCL5, CXCL10, CXCL12 y BAFF, también son responsables de la activación la inmunidad adaptativa en el SNC inflamado. Los astrocitos además de quimiocinas y citoquinas, liberan factores neurotróficos. Los factores neurotróficos tales como NGF, CNTF, BDNF, VEGF, IGF1 y LIF, poseen mayormente - 27 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción actividad anti-inflamatoria generando sobrevida, diferenciación y regeneración neuronal. Así como sobrevida de oligodendrocitos, promoviendo la remielinización y la neurogénesis 55. La infección viral también puede inducir expresión de citoquinas y quimiocinas proinflamatorias en astrocitos a través de mecanismos aún no determinados 54, 166, 173, 174 . Las quimiocinas sirven como señales de reclutamiento in vivo para neutrófilos (MIP-2), monocitos y linfocitos (MCP-1 y MIP-1α respectivamente). Mientras que IL-1 y TNF-α suelen alterar la permeabilidad de la BHE e inducir la expresión de moléculas de adhesión críticas en el endotelio vascular del SNC. Estudios recientes demuestran que las metaloproteasas (MMP) MMP2 y MMP9 son requeridas para inducir neuroinflamación intraparenquimal 119, 175 . Estas observaciones proveen un escenario para la interacción entre células T y macrófagos luego de la restimulación perivascular y/o por señales de los neutrófilos (quimiocinas como MCP-1, conocida como CCL2 176 ) induciendo la expresión de MMP y otras exoenzimas, permitiendo la penetración de la glía limitante 177. Durante el curso de la infección en el SNC, la infiltración de células inmunes de la periferia también es una fuente potencial de citoquinas pro-inflamatorias que pueden luego activar a los astrocitos y la microglía. El balance entre los caminos inflamatorios y los inmunosupresores es fundamental para controlar las reacciones ante un trauma en el SNC. La desregulación de estos caminos puede llevar a la neuroinflamación y neurodegeneración crónica. Inflamación y apoptosis La inflamación contribuye a una amplia variedad de patologías cerebrales (Enfermedad de Azheimer, Parkinson, Esclerosis Múltiple, síndrome de demencia asociado al SIDA, etc.), así como a la meningitis y el accidente cerebrovascular 178-182 . Estas patologías tienen diferentes causas y cursos, pero todos involucran la inflamación cerebral. Hay diferentes tipos de inflamación y es importante entender por qué a veces la inflamación es protectiva y otras dañina 117 . Se han identificado varios mecanismos por los cuales astrocitos y microglía activados como consecuencia de la inflamación, inducen la muerte neuronal 117. La muerte celular programada es crucial durante el proceso de desarrollo y la homeostasis de los organismos, su desregulación está asociada a numerosas patologías, incluida la patología inflamatoria. Es inducida generalmente luego de una infección como parte de un mecanismo de defensa del hospedador frente al patógeno 183. La apoptosis de las células del hospedador durante - 28 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción la infección funciona como un mecanismo de defensa destruyendo el sitio de replicación donde se encuentra el patógeno. Las características fenotípicas de la apoptosis incluyen la fragmentación del DNA y la condensación de la cromatina, el encogimiento celular y la formación de cuerpos apoptóticos los cuales son eliminados por fagocitosis, sin iniciar una respuesta sistémica inflamatoria. La ejecución de la apoptosis requiere de la expresión de novo de genes y síntesis de proteínas 184. El proceso de apoptosis puede ocurrir por múltiples caminos, que pueden ser independientes, sin embargo, puede haber comunicación entre ambos. La apoptosis puede ocurrir a través de dos caminos; uno involucra la activación de cisteína proteasas, llamadas caspasas y el otro involucra la liberación de factores apoptóticos independientes de caspasas por parte de la mitocondria 184. La apoptosis mediada por caspasas puede ocurrir vía extrínseca o intrínseca. La vía extrínseca involucra receptores de membrana presentes en múltiples tipos celulares incluyendo neuronas; involucra al receptor de TNF (TRADD) y el de Fas (FADD). Estos complejos señalizadores de muerte luego se unen e inducen el autoclivaje y activación de caspasas. La vía intrínseca es iniciada por estrés en organelas celulares, incluyendo la mitocondria y el retículo endoplasmático. La liberación del citocoromo c luego de la despolarización de la membrana mitocondrial y la formación de poros de transitorios que la permeabilizan. Éste interactúa con proteasas apoptóticas activando al factor 1 (Apaf-1), ATP, y procaspasa 9, par formar el apoptosoma y llevar así a la muerte celular programada 184. La apoptosis independiente de caspasas involucra vías de proteínas mitocondriales. El factor de inducción de apoptosis (AIF) puede ser liberado desde la mitocondria luego de la despolarización de su membrana. Esto ocurre, por ejemplo, en neuronas bajo condiciones de estrés oxidativos Otras proteínas mitocondriales relacionadas con la apoptosis incluyen la endonucleasa F, Htr2A/Omi, y Smac/Diablo 184. La regulación de la apoptosis tanto la vía dependiente como independiente de caspasas depende de la familia de proteínas del linfoma de células B (Bcl2), que incluye miembros pro y anti-apoptóticos. La apoptosis también puede estar regulada por una vía intracelular de transducción de señal. Perturbaciones en la vía de las proteínas kinasas activadas por mitógenos (MAP-K) pueden ocurrir luego del daño cerebral. Varios de los componentes de la vía de las MAPK, c-Jun y p38 son diferencialmente activados dependiendo de la región cerebral y el tiempo de injuria 184. - 29 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Neurobrucelosis La neurobrucelosis fue descripta por primera vez en 1897 por Hughes, quien aisló el agente patógeno a partir del tejido cerebral de un caso mortal 185 . La neurobrucelosis ha sido considerada una complicación rara, sin embargo la frecuencia puede llegar hasta el 18% de los casos de brucelosis 19, 186 . Algo que es importante destacar es que si bien no es la focalización más frecuente, es la más mórbida. Tanto el SNC como el SNP pueden ser afectados y su prognosis es aciaga 43. La mayoría de los casos de neurobrucelosis se describieron en individuos infectados por B. melitensis, pero también existen casos relacionados con B. suis, B. abortus y B. pinipedae 4, 74, 187, 188 . Hasta el momento no queda claro si la mayor proporción de neurobrucelosis debido a B. melitensis se debe a características intrínsecas de la especie (un tropismo especial hacia SNC respecto de otras especies de Brucella), a factores epidemiológicos como la forma de transmisión o simplemente al sesgo. Esta focalización puede iniciarse en forma constitutiva o puede ocurrir en cualquier etapa de la enfermedad. El compromiso neurológico generalmente ocurre por diseminación sanguínea, pero puede ser también secundaria a la extensión de un foco de osteítis del cráneo 189. Se estima que las lesiones pueden ser producidas por la presencia directa de la bacteria, la acción de citoquinas inflamatorias o por el efecto dañino de la respuesta inmuno patológica 190 . Las manifestaciones neurológicas pueden o no estar acompañadas por síntomas sistémicos. Mientras que la meningoencefalitis es la manifestación clínica mas frecuente, otras condiciones patológicas como mielitis, radiculitis, poliradiculitis, Síndrome de Guillian-Barré 191 , compromiso cerebrovascular, astrogliosis, abscesos cerebrales y neuropatías periféricas también han sido descriptos 190. Diagnóstico diferencial El diagnóstico de neurobrucelosis debe basarse en datos clínicos, epidemiológicos, de imágenes y de laboratorio. Si bien la historia de una probable fuente de infección es fundamental para el diagnóstico de la brucelosis, algunos autores han reportado casos de neurobrucelosis en donde los datos epidemiológicos no fueron de ayuda 19, 192. El aislamiento de la bacteria a partir de líquido cefalorraquídeo (LCR) para confirmar el diagnóstico es muy difícil y solo es exitoso en un 20% de los casos 44 . Por lo tanto se utilizan diferentes técnicas [aglutinaciones, fijación del complemento, ELISA y ensayo de polarización - 30 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción fluorescente (FPA)] para detectar anticuerpos específicos en el LCR. Estas pruebas junto con tomografías computadas (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN), son herramientas indispensables para el diagnóstico y el tratamiento de la neurobrucelosis. 193, 194 Tratamiento En el caso de la neurobrucelosis los antibióticos que se utilicen deberían contar con ciertas características como la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica y mantenerse a concentraciones adecuadas en el LCR, además de los requisitos generales de acción contra la Brucella: que tengan penetración y actividad intracelular. Para el tratamiento de esta afección se utiliza la combinación de 3 drogas: doxicilina combinada con rifampicina y gentamicina es el más utilizado. Aunque doxiciclina con rifampicina y trimetropina/sulfametazona es un tratamiento alternativo 43. Se desaconseja el uso de estreptomicina, dado que tiene baja capacidad de penetrar dentro del liquido cefalorraquídeo y debido a su potencial neurotóxico 195 . El uso de corticoesteroides en etapas tempranas de la meningoencefalitis suele ser beneficioso 195 . El tratamiento es por lo general eficaz con los tratamientos disponibles, aunque de vez en cuando los pacientes desarrollan síntomas persistentes o recurrentes 190. La recuperación se basa en el seguimiento clínico, con serologías en sangre y toma de muestras de LCR periódicas hasta observar "curación" clínica y una tendencia a la disminución de la serologías; aunque pueden no negativizarse nunca sin ello indicar infección activa. El tiempo recomendado de tratamiento para la neurobrucelosis ronda las ocho semanas, extendiéndose incluso más de 15 meses si es preciso. La duración del tratamiento debe ser individualizado dada la ausencia de un índice corte adecuado 190. En los casos de afectación neurológica por compresión extrínseca (medular, craneal), puede estar indicada la cirugía, así como en los casos que desarrollan una hidrocefalia secundaria a meningitis. Manifestaciones clínicas La neurobrucelosis puede presentarse al principio (forma aguda) o en cualquier etapa posterior de la enfermedad (formas sub aguda y crónica) 7, 196. Por otra parte, se puede manifestar - 31 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis como un episodio agudo varios meses después de la recuperación clínica generalmente no presentan enfermedades asociadas 7, 19 Introducción 186 . Los pacientes . Sin embargo, se han informado casos con condiciones asociadas tales como tumor cerebral o la sinusitis maxilar 196, 197 . En zonas endémicas, se debe sospechar de brucelosis en cualquier paciente con un síndrome neurológico sin explicación 194. Como cualquier otra focalización de la brucelosis, la neurobrucelosis puede presentarse junto con los síntomas generales de esta afección descriptos anteriormente. Sin embargo, los hallazgos clínicos y patológicos de la neurobrucelosis más frecuentes se describen en la Tabla 2. Las manifestaciones neurológicas, como meningitis, encefalitis, mielitis, radiculitis y neuritis, se pueden presentar con o sin síntomas sistémicos, y pueden estar asociadas con otras formas de focalización de la brucelosis 19, 42, 198 . La meningitis brucelar se puede presentar como una meningitis aguda, subaguda o crónica. El examen del fluido cerebroespinal en meningitis provocada por Brucella generalmente revela alto contenido proteico (superior a 2 g/l), pleocitosis linfocítica, la producción de anticuerpos intratecales anti-Brucella 147, 186 y glucosa baja, aunque puede ser normal. Meningitis Radiculitis y neuritis Mielitis y mielopatía Neuropatías craneales Narcolepsia-cataplejia Síndrome parkinsoniano Corea Síndrome cerebeloso Lesiones desmielinizantes focales Manifestaciones paroxísticas Vasculares Neuritis óptica Infarto Hemorragia subaracnoidea Aneurisma micótico Epilepsia Migraña Hipertensión intracraneal pura Oculomotores Tabla 2: Categorías de cuadros clínicos con demostración de afectación directa de Brucella spp. en el SNC o SNP. Otras manifestaciones patológicas de neurobrucelosis incluyen poliradiculoneuritis, poliomielitis anterior, síndrome de Guillain-Barré, trastornos cerebrovasculares, supuración del cerebro, absceso epidural, corea, parkinsonismo, y pseudotumores cerebrales 199, 200. Madkour y col. 201 ha descrito condiciones neurológicas primarias y secundarias. Las condiciones primarias incluyen manifestaciones como meningoencefalitis, mielitis, Síndrome de Guillain-Barré, complicaciones cerebrovasculares, supuración cerebral, y esclerosis múltiple. Las condiciones secundarias incluyen la espondilitis con absceso epidural, compresión medular, la radiculopatía, y neuropatías periféricas. Otros autores 202 han clasificado la neurobrucelosis en forma central y periférica. Las formas centrales se presentan como meningoencefalitis y las formas periféricas como polirradiculoneuritis. Mientras que la mayoría de los casos de neurobrucelosis presentan la participación tanto a nivel central como periférico, existen casos con la participación primaria - 32 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis del SNP 202 . Sin embargo, la participación aislada del SNP es poco frecuente Introducción 203, 204 . La meningoencefalitis es el síndrome más frecuente en neurobrucelosis, y ha sido descrito en más del 90% los pacientes con neurobrucelosis 205, 206 . Aunque esta forma clínica predomina en los varones adultos, se ha se ha descrito también en niños 207, 208. La encefalitis y la mielitis pueden deberse tanto a la acción directa de la bacteria en el tejido cerebral como en la médula espinal 208. La presentación clínica puede ser aguda, subaguda, o crónica. En la mayoría de los casos, las manifestaciones iniciales son fiebre, dolor de cabeza, fotofobia, y vómitos. Además, hasta el 60% de los pacientes pueden presentar síntomas sistémicos, como artralgia, mialgia, astenia y sudoración 19. El síndrome de Guillain-Barré es una polirradiculoneuropatía que se manifiesta como una enfermedad inflamatoria aguda desmielinizante y que resulta de la autorreactividad inmune a antígenos del SNP. El síndrome puede ser consecuencia de enfermedades infecciosas (en el 60% de los casos), vacunas, cirugías, o enfermedades malignas, y ha sido asociada con brucelosis por algunos autores 191, 194, 209, 210. Desde el punto de vista clínico, el síndrome se caracteriza por una parálisis simétrica de las extremidades con la pérdida de reflejos, discapacidad sensorial, la participación de los músculos respiratorios, la parálisis de la vejiga, y la regulación deficiente de la presión sanguínea arterial. El análisis del LCR revela el incremento de la concentración de albúmina. La neurobrucelosis también puede manifestarse como ataques isquémicos transientes 211, ocasionar granulomas brucelares intramedulares cervicales 212 y abscesos intramedulares 213 .A su vez en un estudio retrospectivo de casos de neurobrucelosis se manifestaron síntomas como dolor de cabeza, fiebre, escalofríos, vómitos, pérdida de conocimiento, paraplejia, pérdida de la visión y ataxia 214. La neurobrucelosis también suele cursar con síntomas neuropsiquiátricos. Estos incluyen irritabilidad y depresión. Además, pueden presentarse alteraciones del estado mental tales como obnubilación, deficiencias neurológicas, alteraciones intelectuales, convulsiones y coma 82, 215. Patobiología La afectación del SNC por lo general ocurre a través de la diseminación sanguínea en etapas tempranas de la enfermedad, dando lugar a la meningitis, que puede ser clínica o subclínica. Desde el emplazamiento meníngeo, la bacteria puede llegar a afectar tejidos nerviosos vecinos 216. En raras ocasiones, los resultados de la invasión al SNC son consecuencia - 33 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción de una extensión de una lesión focal granulomatosa o supurativa de una vértebra o una osteítis del cráneo 77. Los mecanismos precisos por los cuales la bacteria entra en el SNC no se conocen. Las especies lisas de Brucella han desarrollado varios mecanismos para sobrevivir dentro de la célula, especialmente dentro de los macrófagos 10, 28. Por lo tanto, la infección por medio de los fagocitos (caballo de Troya) es un mecanismo posible para la entrada al SNC. Además, la bacteria puede invadir células fagocíticas no profesionales 11, 217. Por lo tanto, otra posible vía de infección e invasión al SNC sería a través de células endoteliales 130. Prácticamente no hay estudios patológicos en la literatura. Solo se han realizado biopsias en casos sospechosos de tumor cerebral u otra manifestación clínica. Las alteraciones tisulares descritas incluyen diferentes grados de inflamación vascular, desde infiltrados crónicos (mononucleares, plasmáticas y macrófagos) o agudos (polimorfonucleares), inflamación meníngea difusa; edema cortical; granulomas no caseificantes e infiltrados inflamatorios en el perineuro de las raíces nerviosas. No hay casos patológicos correspondientes a lesiones de tipo desmielinizante en la resonancia magnética. Entre los casos clínicos en los que se realizaron biopsias de cerebro fueron, por ejemplo, en el de dos ciudadanos peruanos 188 , en uno de ellos fue a partir de donde se aisló por primera vez B. maris (que luego se subdividió a las especies B. pinipedae y B. cetaceae). En ambos casos se encontraron infiltrados linfocíticos perivasculares y granulomas junto con astrogliosis 188. En otro caso un niño de 14 años que había sido diagnosticado y tratado para brucelosis, luego de 4 meses de haber finalizado con el tratamiento comenzaron los síntomas que referían al compromiso neurológico (pérdida de conocimiento y convulsiones) 216 . Los resultados histopatológicos mostraron un infiltrado compuesto por linfocitos y células plasmáticas, indicando un proceso inflamatorio crónico no granulomatoso en el tejido cerebral y en las meninges adyacentes. La corteza estaba infiltrada, especialmente en la zona perivascular. Si bien se observó astrogliosis y una intensa reacción inflamatoria, no se aislaron microorganismos 216 . Otros casos en niños reportaron pérdida de la visón y del oído 218 y cuadriplegia 219. Recientemente, en un caso de neurobrucelosis fue descripta la afectación difusa de la sustancia blanca con un patrón parecido al de leucoencefalopatía. La biopsia reveló una astrogliosis recativa y el infiltrado inflamatorio estaba predominantemente compuesto de células T, incluyendo numerosos linfocitos T citotóxicos (CTL) 220. Algunos autores creen que déficit de la clínica y anomalías en la RM son mediadas, al menos en parte, por los mecanismos mediados por linfocitos T citotóxicos de la sustancia blanca y la corteza cerebral. - 34 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Introducción Se cree que la asociación entre las infecciones bacterianas y el desarrollo de Síndrome de Guillain-Barré es el resultado de mimetismo molecular entre las estructuras del núcleo exterior de lipo-oligosacáridos bacterianos y los gangliósidos humanos 221, 222. Esto fue demostrado para Campylobacter jejuni, bacteria frecuentemente asociada con el desarrollo de Síndrome de Guillain-Barré 223 , dado que expresa lipo-oligosacáridos estructuralmente homólogas al gangliósido GM1 en su superficie 221 Como quedó evidenciado, a pesar de no contar con muchos estudios patológicos, en los casos de brucelosis en los que se realizaron descripciones microscópicas de las patologías del SNC se han reportado consistentemente astrogliosis (es decir proliferación y apoptosis de astrocitos) y microgliosis reactiva 188, 220 . La dificultad en el diagnóstico de la neurobrucelosis y la escasez de biopsias de cerebro hace que el conocimiento de la patogénesis de esta enfermedad sea escaso. Allí radica la importancia de establecer un modelo que permita el estudio de la misma y así esclarecer cómo el deterioro de las funciones de la astroglía y microglía por Brucella contribuye al desarrollo de ésta y otras enfermedades neurológicas. - 35 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Hipótesis y objetivos HIPÓTESIS Y OBJETIVOS - 36 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Hipótesis y objetivos HIPÓTESIS Y OBJETIVOS El objetivo general de esta tesis es dilucidar los determinantes de la patogénesis de la neurobrucelosis, es decir la brucelosis del SNC. Nosotros sostenemos que la inflamación es un factor clave en la patogénesis de la brucelosis 224 . Por lo tanto, durante la invasión al SNC por parte de Brucella, la respuesta inflamatoria generada contra este organismo podría también contribuir a la patogénesis de la neurobrucelosis. Las 2 hipótesis principales que serán exploradas en este trabajo son 1) que las interacciones de B. abortus con las células del SNC pueden estimular en las mismas la producción de mediadores inflamatorios y que 2) esas respuestas inflamatorias pueden causar astrogliosis y activación de la microglía, 2 de los signos patológicos más frecuentes de la neurobrucelosis. La hipótesis secundaria que será examinada es que las lipoproteínas de B. abortus, y no su LPS, pueden inducir, parcial o totalmente, los efectos inflamatorios producidos por la bacteria. Un corolario de nuestra hipótesis secundaria es que la inmunidad innata, en la forma de una respuesta contra un patrón molecular asociado a patógenos (en este caso lipoproteínas) ejerce vía los TLR alguno o todos los efectos inflamatorios desencadenados por B. abortus. La corroboración de ambas hipótesis implica un mecanismo patogénico para la brucelosis en el SNC. - 37 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos MATERIALES Y MÉTODOS - 38 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos MATERIALES Y MÉTODOS Animales Para las inyecciones estereotácticas, se utilizaron ratones BALB/c (hembras) de 6 a 8 semanas de vida. Para los cultivos primarios de astrocitos y microglía se utilizaron ratones de 1 a 3 días de vida BALB/c (provistos por el Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU), Facultad de Farmacia y Bioquímica), ratones C57BL/6 que carecen de la subunidad p55 de receptor de TNF-α (TNFR p55-/-) (provistos por la Dra. Silvia de Genaro, Universidad de San Luis, San Luis, Argentina) 225 , ratones C57BL/6 salvajes (provistos por la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales) y ratones C57BL/6 que carecen del receptor TLR2 (TLR2 KO) (provistos por el Dr. Sergio Oliveira, Minas Gerais, Brasil). Los animales fueron alojados en condiciones controladas de temperatura (22°C ± 2°C) y luz artificial bajo ciclos de 12 h en un ambiente libre de patógenos en un gabinete de presión positiva (EHRET, Emmendingen, Alemania) y fueron provistos de comida y agua ad libitum. Todos los procedimientos con animales fueron realizados de acuerdo a las reglas y estándares de los usos de animales de laboratorio aprobados por el comité de ética del Instituto Fundación Leloir y el Instituto IDEHU. Bacterias B. abortus S2308 fue cultivada en medio de triptosa-soja suplementado con extracto de levadura (Merck, Buenos Aires, Argentina). El número de bacterias en la fase estacionaria se determinó comparando la DO a 600 nm con una curva estándar como fuera descripto previamente por Giambartomei y col 113. Luego el cultivo de Brucella fue lavado 5 veces por 10 min cada vez en PBS estéril, y se hirvió durante 20 min para obtener Brucella muerta por calor (Heat killed Brucella abortus, HKBA). Se realizaron alícuotas de esta preparación y se guardaron a -70 °C hasta ser utilizadas. La ausencia de viabilidad de B. abortus subsiguiente a la muerte por calor fue verificada por la ausencia de crecimiento en triptosa-agar. - 39 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos Lipoproteínas y LPS La proteína de membrana externa de B. abortus de 19 kDa lipidada (L-Omp19) así como la versión no lipidada de la misma (U-Omp19) fueron obtenidas como fue descrito previamente por Giambartolomei y col 113. Ambas proteínas recombinantes contenían menos de 0,25 unidades endotóxicas/μg según fue determinado por el ensayo de Limulus Amebocyte Lysates (Associates of Cape Cod). El LPS de B. abortus S2308 y el LPS de Escherichia coli O111k58H2 fueron provistas por el Dr. I. Moriyón (Universidad de Navarra, Pamplona, España). El lipohexapéptido sintético [tripalmitoyl-S-glyceryl-Cys-Ser-Lys4-OH (Pam3Cys)] fue comprado a Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Inyecciones estereotácticas intracraneales Para las inyecciones estereotácticas, los animales (n = 5) fueron anestesiados con ketamina clorhidrato (150 mg/kg) y xylazin (15 mg/kg) y luego fueron inyectados en el cuerpo estriado del hemisferio izquierdo del cerebro con 1 μl de HKBA (1 x 106 bacterias), L-Omp19 (500 ng), U-Omp19 (500 ng) o solución de PBS (control negativo), utilizando un capilar de 50 μm. Las coordenadas del cuerpo estriado izquierdo fueron: bregma + 0,4 mm; lateral + 1,8 mm; ventral – 3,0 mm 226 . Las inyecciones con HKBA, U-Omp19, L-Omp19 o solución de PBS fueron administradas en el transcurso de 4 min, y el capilar fue dejado en el lugar por 2 min adicionales antes de retirarlo. Luego de 24 h los animales fueron sacrificados. Histología e inmunohistoquímica Los animales fueron anestesiados y perfundidos transcardiacamente con una solución de heparina seguida de paraformaldehido (PFA) 4% frío 0,1 M en PBS. Luego de remover los cerebros, éstos fueron colocados en la misma solución fijadora toda la noche a 4 °C. Posteriormente, los tejidos fueron crioprotegidos sumergiéndolos en sacarosa 30%, congelados en isopentano y seccionados en cortes seriados mediante un crióstato (30 μm) a lo largo del estriado en el plano coronal. Se utilizaron secciones de 30 μm para la tinción con violeta de cresilo, para determinar la morfología nuclear o para determinar la presencia de proteína fibrilar ácida (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP), un marcador de activación de astrocitos. Para detectar las células GFAP+, las secciones flotantes fueron incubadas en solución de bloqueo (1% suero de burro, 0,1% Tritón en 0,1M PBS) por 45 min, y enjuagadas en 0,1% Tritón en 0,1M - 40 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos PBS, e incubadas toda la noche con anticuerpo anti-GFAP (DAKO, Glostrup, Dinamarca) diluído 1:700 en solución de bloqueo. Después de 3 lavados, las secciones fueron incubadas con anticuerpos de burro-anti-conejo conjugados con Cy2 (1:250; Jackson Immuno Research Laboratories, Inc, West Grove, PA) por 2 h, enjuagadas en 0,1 M PBS y montadas en Mowiol (Calbiochem, San Diego, CA). Las imágenes digitales fueron obtenidas con un microscopio láser confocal Zeiss LSM 510 equipado con un láser de kripton-argon. Cultivos celulares Los cultivos primarios de células gliales fueron obtenidos a partir de cerebros de ratones de 1 a 3 días de vida BALB/c, C57BL/6, C57BL/6 TNFRp55-/- o C57BL/6 TLR2 KO siguiendo los procedimientos publicados en 227 . Los cerebros fueron cuidadosamente separados de las meninges, cortados y disociados mediante el uso de pipetas seguido de un tratamiento con tripsina junto con agitación por 20 min a temperatura ambiente. Las células fueron colocadas en botellas de cultivo de 75 cm2 (TPP, Renner, Alemania) previamente tratadas con poly-lisina y crecidas en una estufa con 95% aire, 5% CO2, en DMEM alta glucosa (Hyclone) conteniendo 10% suero fetal bovino (SFB) (GIBCO BRL, Life Technologies, Grand Island, Nueva York) suplementado con 2 mM L-glutamina, 1mM piruvato de sodio, 100 U/ml penicilina, 100 μg/ml estreptomicina y 25 μg/ml fungizona (GIBCO BRL) (medio completo). El medio se cambió luego de 24 h y cada 3 días. Después de 10 días aproximadamente se obtuvo la confluencia celular. La microglía fue separada del cultivo mixto de células gliales por medio de agitación durante 1 h a 180 rpm. Las células fueron recolectadas del sobrenadante, centrifugadas y cultivadas en placas de 24 pocillos (GBO, Greiner Bio One, Maybachstrasse, Alemania), colocando 1 x 106 células/pocillo en medio completo. Luego de 1 h se cambió el medio para remover las células no adheridas. Para obtener astrocitos puros, los cultivos de células gliales mixtos que habían alcanzado confluencia celular luego de 10 días de cultivo, fueron colocados en agitación por 3 h a 180 rpm para eliminar la microglía y oligodendrocitos que crecían como una monocapa sobre éstos. Las células remanentes fueron tratadas con tripsina, lavadas y centrifugadas; la suspensión obtenida se colocó en botellas de 75 cm2 y se dejó a temperatura ambiente para permitir que se adhiera la microglía en la superficie del plástico. Treinta minutos después, las células no adheridas (astrocitos) se centrifugaron y se resuspendieron en medio completo en placas de 24 pocillos colocando 1 x 106 células/pocillo. La pureza celular se corroboró mediante citometría de flujo. Para la detección de microglía, las células se marcaron con anticuerpos anti-ratón CD11b-FITC (clon M170) (BD - 41 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos Pharmingen, San Diego, CA) o con el respectivo control de isotipo. Para la detección de oligodendrocitos, las células se marcaron con anticuerpos anti-O4-FITC (Chemicon, Temecula, California) o con el respectivo control de isotipo. Para la detección de los astrocitos, las células fueron fijadas con 4% PFA en PBS por 10 min a temperatura ambiente. Luego fueron permeabilizados con Tritón X-100 (0.1% en PBS) por 5 min a temperatura ambiente. Más tarde las células fueron bloqueadas con suero normal de cabra por 30 min. Después, fueron incubados por 30 min en hielo con anticuerpos anti-GFAP (1:200) (BioGenex Laboratories, San Ramon, California) o con el respectivo control de isotipo seguido de un anticuerpo de cabra F(ab')2 antiratón IgG (1:50) por 30 min en hielo. Subsecuentemente, las células fueron analizadas con un citómetro de flujo FACSCalibur® (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California), adquiriendo 10.000 eventos. Los datos fueron procesados y normalizados (se graficaron como % of maximun) utilizando el software de FlowJo (Tree Star). Infección in vitro Los astrocitos y la microglía fueron cultivados en placas de 24 pocillos colocando 1 x 106 células/pocillo en medio completo (sin el agregado de antibióticos). La infección con B. abortus S2308 fue realizada a diferentes multiplicidades de infección (MOI) y luego las células fueron incubadas por 2 h a 37ºC en una atmósfera de CO2 5%. Luego los astrocitos y la microglía fueron lavados extensivamente con DMEM para remover las bacterias extracelulares e incubados en medio suplementado con 100 µg/ml gentamicina y 50 µg/ml estreptomicina para eliminar las bacterias extracelulares que pudieran haber quedado. A diferentes tiempos post-infección las células fueron lavadas 3 veces con PBS antes de procesarlas. Para monitorear la sobrevida intracelular de la bacteria, las células infectadas fueron lisadas con 0,1% (vol/vol) Tritón X-100 en H2O, después de lavar con PBS y hacer diluciones seriadas de los lisados, se cultivó en placas con TBS agar para contar unidades formadoras de colonias (UFC). Estimulación de citoquinas y quimiocinas Cultivos primarios de microglía y astrocitos fueron infectados (como se describió anteriormente) o incubados por 24 h con LPS B. abortus (1 μg/ml), LPS E. coli (1 μg/ml), HKBA (1 x 107 - 1 x 109 bacterias/ml), U-Omp19, (500 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 500 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Luego se cuantificó la secreción de IL-1 , IL-6, TNF-α, MCP-1 en - 42 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos sobrenadantes de cultivo mediante ELISA de BD y la secreción de KC (CXCL1) fue cuantificada con ELISA de R&D Systems Inc. (Mineapolis, MN, USA). Proliferación de astrocitos Los astrocitos fueron cultivados (2 x 104 células/pocillo) en medio completo en placas de 96 pocillos de fondo plano (GBO). Luego de 24 h, el medio de cultivo fue reemplazado con medio sin suero por 24 h y las células fueron tratadas con HKBA (1 x 109 bacterias/ml), LOmp19 (500 ng/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml), mIL-6 (10 ng/ml) o medio de cultivo (SFB 2%). Cinco días mas tarde se le agregó 1 μCi de [3H]-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) a cada pocillo. Después de 18 h, las células fueron cosechadas en filtros de papel, secados y cuantificadas utilizando un analizador de líquido de centelleo 1600TR (Pachard Instruments, Meriden, CT, USA). Cada ensayo fue realizado por triplicado. Los resultados fueron expresados como la media del total de cpm ± S.E.M. Para estudiar el efecto de IL-6 endógena, los astrocitos (1 x 106 células/ml) fueron incubados con HKBA (1 x 109 bacterias/ml) o L-Omp19 (500 ng/ml) en presencia de anticuerpos neutralizantes de IL-6 (clone MQ2-13A5) (eBioscience) o su respectivo control de isotipo (20 μg/ml). La proliferación celular también fue corroborada mediante la incorporación de BrdU y por citometría de flujo. Brevemente, los astrocitos purificados fueron obtenidos como se describió anteriormente, y se estimularon durante 5 días con HKBA (1 x 109 bacterias/ml), o con medio de cultivo (SFB 2%) en presencia de BrdU (10 μM). Luego las células fueron cosechadas, fijadas, permeabilizadas, teñidas con un anticuerpo anti-BrdU-FITC y analizados mediante la incorporación de BrdU con el citómetro de flujo FACSCalibur®. Los datos fueron procesados por el software de FlowJo (Tree Star). Ensayos de apoptosis Para determinar la apoptosis cultivos primarios de astrocitos fueron cultivados en placas de 24 pocillos (1 x 106 células/pocillo) y estimulados por 24 h con HKBA (1 x 107 - 1 x 109 bacteria/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml), TNF-α (5 ng/ml), o PFA 2%. Luego, se recuperaron mediante la utilización de tripsina y se incubaron con Anexina V-FITC / Ioduro de Propidio (IP) por 10 min en hielo. Posteriormente se analizó la apoptosis por citometría de flujo con un citómetro de flujo FACSCalibur® y los datos fueron procesados utilizando el software de FlowJo (Tree Star). - 43 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Materiales y Métodos A su vez la apoptosis también fue aseverada cuantitativamente por el ensayo de TUNEL utilizando Fluorescein-FragELTM DNA Fragmentation Detection Kit (Calbiochem, San Diego, USA); por tinción con Hoechst dye 33342 (que permitió visualizar morfología nuclear) o por anexina V-FITC/IP. Para ello las células fueron cultivadas (2 x 105 células/pocillo) en cámaras de permanox (Nunc, Roskilde, Dinamarca), y estimuladas utilizando los mismos estímulos que los mencionados anteriormente. Las células marcadas fueron analizadas y cuantificadas por microscopía de fluorescencia. El porcentaje de células que presentaban apoptosis (apoptosis temprana más apoptosis tardía) fue calculado mediante la relación entre células FITC+ + FITC+/PI+ y el número total de células por campo x 100. Bloqueo de la actividad de caspasas Se cultivaron astrocitos (1 x 106 células/pocillo) en placas de 24 pocillos y se trataron con o sin un inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK (R&D Systems) (50 μM) por 2 h, luego fueron incubadas por 24 h con HKBA (1 x 109 bacterias/ml), L-Omp19 (500 ng/ml), Pam3Cys (0,1 μg/ml), TNF-α (5 ng/ml), Staurosporina (STS, 1 μM) (Sigma, Steinheim, Alemania) o con medio de cultivo. Posteriormente se determinó apoptosis mediante la tinción con anexina V/IP y se analizó por citometría de flujo como se describió anteriormente. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA 1 factor, seguido de un ensayo de Tuckey Post Hoc. Los datos se representaron como la media ± S.E.M. . - 44 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis RESULTADOS - 45 - Resultados Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados RESULTADOS La presencia de B. abortus induce astrogliosis en el cerebro de ratones BALB/c Nuestra hipótesis establece que cuando B. abortus tiene acceso al cerebro podría causar inflamación y que esta respuesta inflamatoria podría inducir astrogliosis. Para corroborar dicha hipótesis, B. abortus muerta por calor (HKBA) fue inyectada mediante estereotaxis en el cuerpo estriado de ratones BALB/c, 24 h más tarde los animales fueron sacrificados y se obtuvieron cortes del cuerpo estriado. Luego de haber realizado una inmunomarcación con GFAP y una tinción con violeta de cresilo, las secciones del cuerpo estriado fueron analizadas por microscopía confocal. Una extensa y amplia astrogliosis, evidenciada como células GFAP+ ramificadas, fue observada en el cuerpo estriado de todos los animales inyectados con HKBA. Esta activación fue considerablemente más notoria cerca del sitio de inyección aunque también se extendió, en menor grado, hasta los alrededores del sitio de inyección (Fig. 1A). El cuerpo estriado del mismo modo exhibió un infiltrado inflamatorio moderado cerca del sitio de inyección compuesto principalmente por neutrófilos (Fig. 1B, flechas), así como también una pequeña vasodilatación. No se observaron células GFAP+, ni reclutamiento de ningún tipo de leucocitos en los ratones inyectados con PBS o en el hemisferio contralateral (Fig. 1A y datos no mostrados). Estos resultados indican que la presencia de B. abortus dentro del cerebro puede inducir una respuesta inflamatoria que lleva a la astrogliosis y a la inducción de un infiltrado neutrofílico. - 46 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis HKBA PBS Distante del sitio de inyección Cerca del sitio de inyección A Resultados Cerca del sitio de inyección B Figura 1. HKBA induce astrogliosis en el cuerpo estriado de ratones. Ratones BALB/c fueron inyectados intracranealmente con HKBA (1 x 106 bacterias) o PBS. Luego de 24 h los animales fueron sacrificados y los cortes del cuerpo estriado fueron marcados con Ac. anti-GFAP (A) o teñidos con violeta de cresilo (B). Luego se tomaron imágenes con microscopía confocal cerca o distante del sitio de inyección. Las imágenes revelaron astrogliosis (A) e infiltrado neutrofílico (B, flechas) en aquellos animales que fueron tratados con HKBA, pero no en los tratados con PBS. Barra = 50 μm. - 47 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados Caracterización inmunoquímica y morfológica de los cultivos de microglía y astrocitos Puesto que in vivo la bacteria fue capaz de reproducir el fenómeno de astrogliosis, decidimos analizar la capacidad de ésta para interactuar con dos de los tipos de células más importantes de la neuroglía, los astrocitos y la microglía 123. Para evaluar la interacción de Brucella con astrocitos y microglía como determinantes de inflamación en el SNC, nos aseguramos que todos los experimentos que realizáramos se llevaran a cabo con cultivos primarios de estas células, carentes de cualquier contaminación con algún otro tipo celular. La pureza del cultivo fue comprobada por medio de la marcación superficial con Ac. anti-Mac-1/CD11b, marcador para macrófagos/microglía, y por medio de una marcación intracelular con un Ac. específico para astrocitos, Ac. anti-GFAP. Los análisis por medio de citometría de flujo revelaron que los cultivos de microglía y astrocitos contenían más del 90% de células CD11b+ y de células GFAP+, respectivamente. En ningún caso se observó contaminación cruzada, ni tampoco contaminación con oligodendrocitos (O4) (Fig. 2A). También se corroboró la morfología de los cultivos a través de microscopía de contraste de fase (Fig. 2B). Estos cultivos puros permitieron llevar a cabo los experimentos descriptos a continuación. - 48 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A s tr o c ito s A M ic r o g lía I s o tip o GFAP %of Max %of Max GFAP I s o tip o GFAP I s o tip o C D 11b %of Max %of Max CD11b I s o tip o C D 11b I s o tip o O4 %of Max %of Max I s o tip o O4 O4 Resultados B Figura 2. Pureza de los cultivos primarios. Cultivos de astrocitos y microglía obtenidos a partir de cerebros de ratones BALB/c fueron teñidos con Ac. específicos para macrófagos/microglía (Mac-1/CD11b), para oligodendrocitos (O4) o para astrocitos (GFAP). Los mismos se analizaron por citometría de flujo (A). También se muestran microscopías de contraste de fase de los cultivos de microglía y astrocitos (B). Barra = 50 µm. - 49 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados B. abortus infecta y se multiplica dentro de astrocitos y microglía Para evaluar la interacción de Brucella con astrocitos y microglía como determinantes de inflamación en el SNC; lo primero que hicimos fue determinar la habilidad de B. abortus para infectar estos tipos celulares. Para ello cultivos primarios de astrocitos y microglía fueron infectados con B. abortus 2308 a diferentes multiplicidades de infección (MOI) y a distintos tiempos. Luego, fue determinada la magnitud de la infección y la secreción de citoquinas y quimiocinas en los sobrenadantes de cultivo de dicha infección. Los experimentos de infección demostraron que B. abortus fue internalizada por los astrocitos y la microglía in vitro. La bacteria fue también capaz de multiplicarse eficientemente dentro de ambos tipos celulares. La magnitud de la infección (UFC intracelulares) fue directamente proporcional a la MOI utilizada. Tanto la infección como la replicación intracelular fueron observadas a partir de la MOI de 10 (Fig. 3A–B). El número de bacterias internalizadas dentro de microglía fue mayor a la observada en astrocitos luego de 2 h de infección (MOI 100) (1.750 ± 350 vs 315 ± 163 UFC por pocillo). En ambos tipos celulares, luego de una disminución en el número de bacterias a las 8 h, el número de bacterias intracelulares aumentó a las 24 h, y siguió haciéndolo de ahí en más. A pesar de ello, a cualquier tiempo ensayado el número de bacterias intracelulares fue mayor en microglía que en astrocitos (Fig. 3C). Como control, fueron infectadas en paralelo células J774.A1, una línea celular en la cual B. abortus es capaz de infectar y replicarse 228, 229. La magnitud y la cinética de infección en microglía fueron comparables con la de éstas células (Fig. 3C). La infección indujo la secreción significativa (P<0.05) de las citoquinas IL-6, IL-1 y TNF-α, y de las quimiocinas MCP-1 y KC de forma MOI-dependiente en ambos tipos celulares (Fig. 4). Estos resultados indican que B. abortus puede infectar y replicarse tanto en astrocitos como en microglía y, como resultado, la bacteria activa la respuesta inmune produciendo la secreción de mediadores pro-inflamatorios. - 50 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A s tr o c ito s A UFC/pocillo (Log) 4 3 2 1 10 25 50 100 250 500 1000 500 1000 M OI M ic r o g lía B UFC/pocillo (Log) 4 3 2 1 10 25 50 100 250 MOI UFC/pocillo (Log) C 5 4 3 2 J7 7 4 .A 1 M ic ro g lia A s tro c ito s 1 0 0 10 20 30 40 50 Ti e m po (h) Figura 3. B. abortus infecta y se replica en astrocitos y microglía. Cultivos de astrocitos (A) y microglía (B) fueron infectados con B. abortus a diferentes multiplicidades de infección (MOI). Cultivos de astrocitos, microglía y J774.A1 fueron infectados con B. abortus (MOI 100) y se determinó la replicación dentro de cada tipo celular mediante UFC luego de 2, 8, 16, 24 o 48 h (C). Los símbolos expresan la media ± S.E.M de duplicados. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. - 51 - Resultados Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Astrocitos Microglía 40 *** *** 6000 *** * *** IL-6 (ng/ml) IL-6 (pg/ml) 12000 ** *** *** 20 * ** *** *** 0 0 NI 10 25 50 100 250 NI 500 1000 10 25 MOI *** 100 250 500 1000 3000 TNF-α (pg/ml) *** *** *** ** 175 50 MOI 350 TNF-α (pg/ml) Resultados * *** 1500 * * ** *** 0 0 NI 10 25 50 100 250 NI 500 1000 M OI 60 10 25 50 100 250 500 1000 M OI 90 *** ** 30 *** *** IL-1β (pg/ml) IL-1β (pg/ml) *** *** 0 10 25 50 100 250 500 1000 ** NI M OI 150 75 KC (ng/ml) *** *** *** *** 10 25 50 200 100 250 500 1000 MOI *** *** 100 ** ** 0 0 NI 10 25 50 100 250 NI 500 1000 10 25 50 100 250 500 1000 MOI MOI 200 *** 2000 *** ** 100 * ** MCP-1 (pg/ml) MCP-1 (ng/ml) *** 0 NI KC (ng/ml) *** 45 *** *** 1000 0 * ** ** 0 NI 10 25 50 100 250 500 1000 NI 10 25 50 100 250 500 1000 MOI MOI Figura 4. La infección con B. abortus produce la secreción de mediadores pro-inflamatorios. Cultivos de astrocitos y microglía fueron infectados con B. abortus durante 24 h a diferentes MOI y se determinó en sobrenadantes de cultivo la presencia de citoquinas (IL-6, IL-1β y TNF-α) y quimiocinas (KC y MCP-1) mediante ELISA. Las barras expresan la media ± S.E.M de duplicados. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001 vs. NI (no infectado). - 52 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados HKBA induce la producción de citoquinas y quimiocinas en astrocitos y microglía Para determinar si la viabilidad bacteriana era necesaria para inducir la respuesta inflamatoria en astrocitos y microglía, decidimos examinar la habilidad de HKBA para estimular la secreción de citoquinas y quimiocinas. Para ello, estimulamos con diferentes concentraciones de HKBA cultivos primarios de astrocitos y microglía murinos, utilizando LPS de E. coli como control positivo. Luego de 24 h se cuantificaron las citoquinas y quimiocinas en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. HKBA indujo tanto la producción de citoquinas como de quimiocinas en ambos tipos celulares de manera dosis dependiente, observándose secreción significativa (P<0,05) a partir de una concentración de 1 x 108 bacterias/ml (Fig. 5). Estos resultados indican que HKBA es capaz de generar una respuesta inflamatoria al interaccionar con células de la inmunidad innata del SNC y sugieren que un componente estructural de la bacteria induciría este fenómeno. - 53 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A s trocitos M icrog lía 60 *** *** IL-6 (ng/ml) 10 *** 5 ** 10 E. co li 9 8 10 7 H K BA LP S 10 H K BA H K BA S D M E. EM co li 10 BA LP TNF-α (pg/ml) ** 4000 2000 * * 1000 E. co li 9 10 8 10 LP S H K BA 10 H K BA D M LP H K S E. BA BA H K EM co li 7 9 10 8 10 10 BA H K D M EM 7 0 400 IL-1β (pg/ml) ** * 35 *** 200 125 * co li 9 S E. K BA 10 10 K BA H LP 7 10 H H D M EM E. co li LP S BA H K H K H K BA BA 10 10 9 8 7 10 EM D M 80 8 0 0 K BA 150 *** *** KC (ng/ml) *** 40 ** 0 *** 100 * 50 * 50 10 co li 9 8 10 E. LP S H K BA H K BA 10 250 MCP-1 (ng/ml) *** ** 25 H K BA LP S D E. co li 10 H K BA M EM 9 8 H K BA 10 10 H K BA D M EM 7 7 0 * 0 *** 125 ** ** LP S E. 10 co li 9 8 10 H K BA 10 H K BA D M EM E. co li LP S 10 K BA H 7 9 8 10 H K BA 10 K BA H D M EM 7 0 H K BA TNF-α (pg/ml) 500 400 70 IL-1β (pg/ml) 2 8000 0 MCP-1 (ng/ml) ** ** 10 9 8 H K H K H K BA BA 10 10 M EM D *** 1700 KC (ng/ml) 35 0 7 0 *** H K BA IL-6 (ng/ml) 15 Resultados Figura 5. HKBA induce secreción de mediadores pro-inflamatorios. Cultivos de astrocitos y microglía fueron estimulados con medio de cultivo (DMEM), HKBA (1 x 107- 1 x 109 bacterias/ml) o 1 μg/ml de LPS de E coli (LPS E. Coli). Luego de 24 h se cuantificaron TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 y KC en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. Las barras representan la media ± S.E.M de duplicados *P<0,05; **; P<0,01; ***P<0,001 vs. DMEM - 54 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados El LPS de Brucella abortus no es el responsable de la respuesta inflamatoria El LPS de E. coli es un componente de las bacterias Gram negativas con una poderosa actividad inflamatoria 65. Dado que B. abortus también es una bacteria Gram negativa, decidimos investigar si su LPS era el responsable de la inflamación desencadenada en células de la inmunidad innata del SNC. Para ello astrocitos y microglía fueron estimulados con medio de cultivo (DMEM) o HKBA en presencia o ausencia de polimixina B (PB), un inhibidor de la actividad biológica del LPS 230. Como control fue utilizado LPS de E. coli. Luego de 24 h se cuantificaron citoquinas y quimiocinas en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. HKBA indujo niveles similares de TNF-α, IL-6, IL-1 , MCP-1 y KC tanto en presencia como en ausencia de PB. Como era de esperar, la inducción de citoquinas y quimiocinas mediada por el LPS de E. coli fue inhibida en presencia de PB. Más aún, el LPS de Brucella altamente purificado, utilizado a concentraciones similares a las presentes en la cantidad de bacterias utilizadas para estimular astrocitos y microglía 231 , fue también incapaz de inducir en forma significativa, la producción de TNF-α, IL-6, IL-1 , MCP-1 y KC (Fig. 6). En conjunto estos resultados indican que el LPS de Brucella no es el responsable de desencadenar una respuesta inflamatoria en astrocitos y microglía. - 55 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A s tro c ito s M ic ro g lía 60 *** *** *** IL-6 (ng/ml) IL-6 (ng/ml) 1 5 .0 Resultados 7 .5 2 0 *** 35 ** 10 * 5 1 ** ** 0 ** 2 * H PB li+ co LP K S E. LP S 10 E. +P B 9 co li 9 10 A B H S LP * 400 IL-1β (pg/ml) 55 A K LP B S M B ru EM B D S LP BA E. co li+ P E. co +P 10 9 li B 9 BA K H K H 4 0 10 Br u LP S EM M D co li+ E. LP S K H *** PB co li E. +P B BA LP S 10 BA 9 10 Br u H K E. LP S *** 8 TNF-α (ng/ml) TNF-α (ng/ml) 2 IL-1β (pg/ml) LP S S LP D M co li+ PB E. co li +P B 9 H H K BA K 10 BA 10 Br u LP S D M EM 9 EM 9 0 30 0 ** 300 200 * 100 ** 0 co li+ PB E. co li +P B 9 S 10 E. LP S *** 125 ** ** H K co li+ PB LP S E. LP S E. co li +P B 9 BA K H LP S H 10 BA 10 Br u LP S EM E. D M co li+ PB co li E. +P B K BA LP S 10 9 10 BA H K Br u LP S D M EM 9 9 0 80 150 *** *** *** *** KC (ng/ml) 40 ** 75 0 PB E. co li+ co li E. LP S LP S 9 +P B 9 10 BA H K BA H K Br u D M E. LP S EM PB co li+ co li +P B E. LP S BA K H LP S 10 9 10 BA H K Br u LP S D M EM 9 0 *** 10 KC (ng/ml) LP H H MCP-1 (ng/ml) ** K BA K BA 10 Br ru LP S EM M E. LP S 250 *** 25 D S LP BA H K H 50 MCP-1 (ng/ml) co li+ PB E. co li +P B 10 9 10 K BA Br u LP S D M EM 9 9 0 Figura 6. El LPS de B. abortus no induce secreción de mediadores pro-inflamatorios Cultivos de astrocitos y microglía fueron estimulados con DMEM, HKBA (1 x 109 bacterias/ml) en presencia o ausencia de polimixina B (PB), LPS de B. abortus (LPS Bru) (1μg/ml), LPS de E. coli (1 μg/ml) o LPS de E. coli (1 μg/ml) + PB. Luego de 24 h se cuantificó TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 y KC en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. Las barras representan la media ± S.E.M de los duplicados. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 vs. DMEM - 56 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados L-Omp19 induce la producción de citoquinas y quimiocinas en astrocitos y microglía Teniendo en cuenta que HKBA induce la secreción de quimiocinas y citoquinas inflamatorias, que el LPS de Brucella no es el responsable de inducir dicha respuesta, y que trabajos previos publicados por nuestro grupo 10, 113, 114 establecen que las lipoproteínas de B. abortus son moléculas con una considerable actividad inflamatoria, decidimos investigar si éstas podrían inducir la producción de mediadores inflamatorios en las células del SNC. Para investigar esto, fue utilizada la proteína recombinante L-Omp19 como modelo de lipoproteína de Brucella. Esta lipoproteína forma parte de la membrana externa de la bacteria, y se encuentra presente en todas las especies de Brucella 25. Con este fin, astrocitos y microglía de ratones BALB/c fueron estimulados con DMEM, U-Omp19 (la versión no lipidada de Omp19) o diferentes concentraciones de L-Omp19. Como control fue utilizado un lipohexapéptido sintético que mimetiza la estructura lipídica de las lipoproteínas (Pam3Cys). Luego de 24 h fueron cuantificadas en los sobrenadantes de cultivo citoquinas y quimiocinas mediante ELISA. L-Omp19 indujo la producción tanto de las citoquinas como de quimiocinas de una manera dosis-dependiente a partir de una concentración de 10 ng/ml. Este fenómeno fue dependiente de la acilación de las moléculas, ya que U-Omp19 no fue capaz de promover la secreción de dichos mediadores pro-inflamatorios. El hecho de que Pam3Cys indujera la misma respuesta que la versión lipidada de la proteína corrobora la dependencia de la acilación en el fenómeno observado (Fig. 7). De esta manera estos resultados indican que las lipoproteínas de B. abortus son capaces de generar una respuesta inflamatoria al interaccionar con células de la inmunidad innata del SNC. - 57 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A s tro c ito s M ic ro g lía *** *** ** * 20 10 2 0 .0 ys 3C Pa m p19 LO m LO m p19 50 10 0 0 10 0 LO m p19 p19 50 EM M D U -O m LO LO Pa m 3C 50 ys 0 0 m p1 9 m p1 9 10 10 0 m p1 9 LO 50 EM m p1 9 M -O D U 100 TNF-α (pg/ml) 2000 * 500 300 ys C 3 m p1 9 Pa m 10 0 10 p1 9 m p1 9 LO U ** 125 IL-1β (pg/ml) ** * 30 LO m LO m p1 9 D M 50 0 EM ys C 3 -O LO m Pa m p1 9 50 0 10 0 10 p1 9 LO m LO m p1 9 p1 9 50 0 M EM D U -O m ** 50 0 0 * 80 10 0 C 3 Pa m m p1 9 LO LO ys 50 0 10 0 m p1 9 p1 9 LO m p1 9 m -O U 14 10 50 0 EM D M m 9 LO m Pa p1 3 50 C ys 0 0 10 p1 9 p1 9 LO m LO m U -O m p1 9 D M 50 EM 0 10 0 ** ** 7 * KC (ng/ml) 130 ** 70 20 * 10 * * O m C ys Pa p1 m 9 9 3 50 0 0 10 10 p1 L- L- O m m LO ** 70 MCP-1 (ng/ml) ** p1 9 p1 -O m U ** 9 50 EM M D 3C LO Pa m m p1 9 50 ys 0 0 10 m p1 9 LO LO m p1 9 10 0 -O m p1 9 50 EM D M U 30 15 0 0 0 0 40 30 * 20 * 10 Pa m p1 9 3C ys 0 50 0 p1 9 10 LO m LO m p1 9 10 0 LO m 50 M EM U -O m D 3C ys 0 9 p1 Pa m 50 0 p1 9 LO m LO m LO m p1 9 10 10 0 50 9 p1 U -O m D M EM 0 p1 9 TNF-α (pg/ml) ** * 50 IL-1β (pg/ml) ** 3500 ** 0 MCP-1 (ng/ml) * 0 200 KC(ng/ml) ** 30 IL-6 (ng/ml) IL-6 (ng/ml) 7 .0 3 .5 Resultados Figura 7. L-Omp19 induce secreción de mediadores pro-inflamatorios Cultivos de astrocitos y microglía fueron estimulados con DMEM, U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (10, 100, 500 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Luego de 24 h se cuantificó TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 y KC en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. Las barras representan la media ± S.E.M de duplicados. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 vs. DMEM. - 58 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados L-Omp19 induce astrogliosis en el cerebro de ratones En vista que L-Omp19 fue capaz de inducir la activación de astrocitos in vitro, mediante la secreción de mediadores pro-inflamatorios; examinamos subsecuentemente su habilidad de inducir astrogliosis in vivo. Para llevar a cabo este cometido, L-Omp19, U-Omp19 o PBS fueron inyectados en el cuerpo estriado de ratones BALB/c mediante estereotaxis, 24 h más tarde los animales fueron sacrificados y se realizaron cortes seriados del cuerpo estriado. Estos cortes luego fueron marcados con Ac. anti-GFAP y teñidos con violeta de cresilo para ser analizados por microscopía confocal. Una marcada astrogliosis, establecida como un aumento de células GFAP+, fue evidenciada en aquellos ratones que habían sido inyectados con L-Omp19. Al igual que con la bacteria entera, se observaron células GFAP+ intensamente ramificadas cerca del sitio de inyección (Fig. 8A). El cuerpo estriado también exhibió un leve infiltrado inflamatorio cerca del sitio de inyección compuesto por neutrófilos así como una leve vasodilatación (Fig. 8B). No se observó infiltrado neutrofílico ni células GFAP+ en los ratones inyectados con U-Omp19 o con PBS ni tampoco en los hemisferios no inyectados (contralateral) (Fig. 8 y datos no mostrados). En conjunto estos resultados demuestran que B. abortus y sus lipopoproteínas son capaces de inducir astrogliosis in vivo e in vitro. - 59 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis L-Omp19 U-Omp19 PBS Distante del sitio de inyección Cerca del sitio de inyección A Resultados Cerca del sitio de inyección B Figura 8. L-Omp19 induce astrogliosis en el cuerpo estriado de ratones. Ratones BALB/c fueron inyectados intracranealmente con L-Omp19 (500 ng/ml), U-Omp19 (500 ng/ml) o PBS. Luego de 24 h los animales fueron sacrificados, las secciones del cuerpo estriado fueron marcados con Ac. AntiGFAP (A) o violeta de cresilo (B) y se tomaron imágenes mediante microscopía confocal, cerca o distante del sitio de inyección. Las imágenes revelaron astrogliosis (A) e infiltrado neutrofílico (B, flechas) en los animales tratados con L-Omp19, no así en los tratados con U-Omp19 o PBS. Barra = 50 μm. - 60 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados TLR2 media la respuesta inflamatoria desencadenada por B. abortus y L-Omp19 Resultados previos de nuestro laboratorio demuestran que la respuesta inflamatoria inducida por B. abortus en diversas células de la inmunidad innata es mediada por TLR2 114 10, 113, . Por tal motivo decidimos investigar el rol de este receptor en la respuesta inflamatoria desencadenada en astrocitos. Para ello es que repetimos los mismos experimentos de infección que fueron realizados con B. abortus y ratones BALB/c, solo que a partir de cultivos de astrocitos de ratones TLR2 KO. Como el background genético de estos ratones es C57BL6/6J, como control fueron utilizados cultivos de astrocitos provenientes de ratones salvajes C57BL6/6J. Los cultivos fueron infectados a distintos tiempos, con una multiplicidad de infección (MOI) de 100. En las primeras horas de infección los ratones de la cepa salvaje se infectaron en un grado menor que los TLR2 KO; sin embargo a partir de las 8 h no hubo diferencias significativas (P>0,05) entre ambas cepas de ratones (Fig. 9A). A B 10 4 4000 *** IL-6 (pg/ml) UFC/pocillo *** 10 3 10 2 TLR2 KO C57 2000 ** 10 1 0 0 10 20 30 40 50 0 ** 10 20 Tiempo (h) C 40 50 D 400 100 *** *** *** 200 0 0 10 *** 20 *** 30 40 Tiempo (h) C57 No Infectado C57 Infectado IL-1β (pg/ml) *** TNF-α (pg/ml) 30 Tiempo (h) *** *** **** 50 0 50 0 10 20 30 40 50 Tiempo (h) TLR2 KO No Infectado TLR2 KO Infectado Figura 9. La secreción de citoquinas pro-inflamatorias depende de TLR2. Cultivos de astrocitos de ratones TLR2 KO (verde) y C57BL6/6J (rojo) fueron infectados con B. abortus a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 a diferentes tiempos y se determinó la replicación de la bacteria mediante el cálculo de UFC luego de 2, 8, 16, 24 o 48 h (A). Se detectó la presencia de citoquinas (IL-6, IL-1β y TNF-α) en los sobrenadantes de infección de los cultivos a diferentes tiempos (2, 8, 24 y 48 h) mediante ELISA (B, C y D). Las barras expresan la media ± S.E.M de duplicados. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. - 61 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados La liberación de citoquinas IL-6, TNF-α e IL-1 generadas durante la infección, fue dependiente de TLR2 ya que la misma fue abrogada en los astrocitos de los ratones TLR2 KO respecto de los niveles secretados por los astrocitos de los ratones normales C57BL6/6J (Fig. 9B, C y D). Estos resultados revelan que si bien la bacteria no requiere del receptor TLR2 para infectar astrocitos o replicarse dentro de éstos, la respuesta inmune generada si se ve afectada, ya que se ve totalmente abolida la secreción de mediadores inflamatorios. Asimismo analizamos si la capacidad de HKBA y las lipoproteínas de promover la liberación de dichos mediadores era mediada por TLR2. Para lo cual cultivos de astrocitos provenientes de ratones TLR2 KO fueron estimulados con U-Omp19, diferentes dosis de HKBA y L-Omp19 o Pam3Cys. El LPS de E. coli fue utilizado como control positivo, ya que es un ligando que utiliza la vía de TLR4 y no la vía de TLR2. Luego de 24 h fueron cuantificados TNF-α, IL-1β e IL-6 en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Tanto HKBA como L-Omp19 y el péptido sintético Pam3Cys fueron incapaces de inducir la secreción de IL-6, IL-1β y TNF-α en los cultivos de astrocitos provenientes de los ratones TLR2 KO. El único estímulo que indujo la liberación significativa de citoquinas proinflamatorias fue el LPS de E. Coli (Fig. 10). En función de lo expuesto, nuestros resultados demuestran que la respuesta inflamatoria inducida por B. abortus es dependiente de TLR2 y que las lipoproteínas de B. abortus serían el ligando TLR2 que utiliza la bacteria para inducir dicha respuesta. - 62 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis 250 IL-6(pg/ml) ** 125 E. co li C ys LP S 3 Pa m 9 LO m p1 m p1 LO m p1 U -O H K 9 10 0 50 0 9 BA BA H K H K 50 0 9 10 8 10 10 BA D M EM 7 0 1 7 5 .0 TNF-α(pg/ml) ** 8 7 .5 E. co li ys 0 C LP S 3 Pa m p1 9 O m p1 9 L- O m p1 9 L- U -O m H 50 0 10 50 10 K BA K BA H 0 9 8 10 10 K BA H D M EM 7 0 .0 ** IL-1β(pg/ml) 1 7 5 .0 8 7 .5 cy s 3 E. co li LP S 50 0 Pa m m p1 9 10 0 LO m p1 9 p1 9 m -O LO 10 BA K U H K H 50 0 9 8 10 BA 10 BA K H D M EM 7 0 .0 Figura 10. TLR2 media los efectos inducidos por HKBA y LOmp19 Cultivos de astrocitos de ratones TLR2 KO fueron estimulados con DMEM, HKBA (1 x 107 - 1 x 109 bacterias/ml), UOmp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (100, 500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o LPS de E.Coli (1 μg/ml) como control. Luego de 24 h se cuantificó TNF-α, IL-1β y IL-6 en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 realizados. Las barras representan la media ± S.E.M de los duplicados *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 vs. DMEM. - 63 - Resultados Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados HKBA y L-Omp19 inducen proliferación de astrocitos La astrogliosis está caracterizada tanto por la apoptosis como por la proliferación de los astrocitos 232, 233 . Ya que in vivo HKBA y L-Omp19 indujeron astrogliosis decidimos, para comenzar a investigar con más detalle este fenómeno, desafiar nuestro modelo in vitro con ambos estímulos para determinar si éstos podían inducir la proliferación de los astrocitos. En primer lugar, medimos proliferación celular mediante la incorporación de [3H]timidina. Para ello, cultivos de astrocitos fueron tratados con DMEM, HKBA, U-Omp19, LOmp19 o Pam3Cys. IL-6 fue usada como control positivo de la proliferación. Aproximadamente 18 h antes de ser cosechadas las células, se les agregó 1μCi de [3H]-timidina al cultivo. Al cabo de 5 días se midió con un contador de centelleo la incorporación de [3H]-timidina. HKBA, L-Omp19 y Pam3Cys fueron capaces de inducir en forma significativa (P<0,01) la proliferación de los astrocitos. Sin embargo U-Omp19 no fue capaz de inducirla, indicando que la porción lipídica es requerida para inducir dicho fenómeno. Como era de esperar, la exposición de los cultivos primarios de astrocitos a IL-6 recombinante indujo una proliferación celular significativa (P<0,05) (Fig. 11A). Para determinar el rol de IL-6 en el fenómeno de proliferación repetimos el experimento anterior, solo que pre-incubando las células con Ac. anti-IL-6 o un control de isotipo 2 h antes de colocar los estímulos. Nuevamente se determinó proliferación mediante la incorporación de [3H]-timidina, como se detalló anteriormente. Cuando las células fueron tratadas con Ac. anti-IL-6 hubo una disminución de la proliferación celular, tanto cuando las células fueron estimuladas con HKBA (29%), como con L-Omp19 (25%) o con Pam3Cys (20%) indicando que, al menos parcialmente, IL-6 está involucrada en el fenómeno de proliferación de los astrocitos (Fig. 11B). El fenómeno de proliferación también fue corroborado por medio de la incorporación de Bromodioxiuridina (BrdU). Para ello se estimularon cultivos de astrocitos de ratones BALB/c con DMEM o con HKBA en presencia de BrdU-FITC. Al cabo de 5 días las células fueron cosechadas y por medio de citometría de flujo fue determinada la incorporación de BrdU-FITC en los cultivos. La BrdU fue incorporada tanto en presencia como en ausencia del estímulo, como fue evidenciado con el aumento de la intensidad fluorescencia de esos cultivos comparados con los niveles de fluorescencia en ausencia de BrdU (Fig. 11C). Los astrocitos estimulados con HKBA mostraron 2 poblaciones, una que exhibía una media de intensidad de fluorescencia 4 veces mayor a aquellas células que habían sido expuestas al medio de cultivo solo; y otra población - 64 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados cuya intensidad de fluorescencia fue de aproximadamente la mitad respecto de las células no estimuladas (Fig. 11C). Estos resultados indican que B. abortus es capaz de inducir la proliferación de astrocitos in vitro. Es más, el hecho que una subpoblación de células parece incorporar BrdU a una tasa mucho menor comparada con las células no estimuladas estaría indicando que un fenómeno concomitante se está llevando a cabo. B [3 H]-Timidina(cpm) 8000 *** *** 4000 ** ** 0 DMEM U-Omp19 L-Omp19 Pam3cys HKBA IL 6 H 3 -Timidina (cpm ) A 8000 Control Isotipo 4000 anti-IL-6 20% 29% 25% 0 HKBA L-Omp19 Pam3cys C % of M ax AntiBrdU - FITC Mab - No BrdU Medio+BrdU+ antiBrdU-FITC Mab HKBA+BrdU+ antiBrdU-FITC Mab anti-BrdU-FITC Figura 11. HKBA y L-Omp19 inducen proliferación de astrocitos. Astrocitos fueron estimulados con DMEM, HKBA (109 bacterias/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o IL-6 (10 ng/ml). Luego de 5 días se determinó proliferación por medio de la incorporación de [3H]-timidina (A). Astrocitos se preincubaron 2 h con Ac. anti-IL-6 o control de isotipo, luego se estimularon con HKBA (109 bacterias/ml), L-Omp19 (500 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Después de 5 días se determinó proliferación por medio de la incorporación de [3H]-timidina. Los números sobre las barras indican la disminución en la incorporación de [3H]-timidina de las células tratadas con anti-IL-6 vs. células tratadas con el control de isotipo, en porcentaje Las barras indican la media ± S.E.M por triplicado* P<0,05; ** P<0,01; ***P<0,001 vs. DMEM (B). Cultivo de astrocitos tratados con DMEM o HKBA (109 bacteria/ml). Luego de 5 dias se analizó la proliferación mediante la incorporación de BrdU-FITC (C). Los datos mostrados son representativos de 5 ex realizados. - 65 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados La infección con B. abortus induce apoptosis de astrocitos Uno de los rasgos característicos de la astrogliosis es la apoptosis, y ésta puede ocurrir en el contexto de la gliosis 232, 233 . Es por ello que decidimos evaluar este fenómeno desafiando nuestro modelo in vitro mediante la infección de astrocitos. Para ello, astrocitos provenientes de ratones BALB/c fueron infectados con B. abortus, 24 h más tarde las células fueron marcadas con anexina V/IP y la apoptosis fue determinada por medio de citometría de flujo. La bacteria fue capaz de inducir la apoptosis en astrocitos (Fig. 12). Así como B. abortus y otras especies de Brucella son capaces de inhibir la apoptosis de macrófagos 88, 234 , y teniendo en cuenta que la microglía es considerada como los macrófagos residentes del cerebro 235 , decidimos investigar también el efecto de la infección con B. abortus sobre la muerte celular programada en microglía. Se infectó microglía tal como se hizo con los astrocitos. A diferencia de lo que ocurrió con los astrocitos, la infección con Brucella en microglía no condujo a la apoptosis (Fig. 12). Estos resultados estarían indicando que Brucella induce apoptosis en astrocitos luego de infectarlos; y que en microglía la bacteria es capaz de desarrollar durante la infección, mecanismos de evasión a la muerte celular programada. Astrocitos Microglía No infectado B. abortus % of Max % of Max No infectado B. abortus Anexina V Anexina V Figura 12. B. abortus induce apoptosis en astrocitos pero no en microglía. Astrocitos y microglía fueron infectados o no, con B. abortus a una MOI de 100. Luego de 24 h, fue determinada la apoptosis utilizando Anexina V/PI por medio de citometría de flujo. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 5 realizados. - 66 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A capacidad su vez analizamos de HKBA y de la Resultados Microglía las DMEM L-Omp19 HKBA Pam 3Cys PFA microglía in vitro. Para ello, se trataron cultivos primarios de microglía durante 24 h % of Max lipoproteínas de inducir la apoptosis de con HKBA, L-Omp19, Pam3Cys o PFA 2% y luego se determinó la apoptosis mediante anexina V/IP utilizando citometría de flujo. Al igual que ocurrió con la infección, no fue detectada la apoptosis en los cultivos de microglía, donde solo el PFA (control positivo) fue capaz inducirla (Fig. 13). de Anexina V/IP Figura 13. HKBA y L-Omp19 no inducen apoptosis en microglía Se estimularon cultivos primarios de microglía durante 24 h con DMEM, HKBA (1 x 109 bacterias/ml), LOmp19 (500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o PFA 2%. Luego fueron incubados con anexina V/IP y analizados por citometría de flujo. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 5 realizados. En conjunto estos resultados señalan que la bacteria, viva o muerta, es capaz de inducir mecanismos diferentes en cada tipo celular, ya que la microglía es capaz de resistir a la muerte celular programada. HKBA y L-Omp19 inducen apoptosis de astrocitos in vitro. Asimismo analizamos el efecto de HKBA y L-Omp19 sobre la apoptosis de los astrocitos. Para este fin, astrocitos provenientes de ratones BALB/c fueron estimulados durante 24 h con medio (DMEM), HKBA, U-Omp19, L-Omp19 o Pam3Cys y se marcaron las células con anexina V/IP. Luego la apoptosis fue determinada por citometría de flujo y fue establecida la intensidad de fluorescencia media (MFI) generada por cada estímulo. El TNF-α y paraformaldehído (PFA) fueron utilizados como controles positivos (Fig. 14A y B). Tanto HKBA como L-Omp19 fueron capaces de inducir una apoptosis significativa (P<0,05) de manera dosis dependiente. U-Omp19 no fue capaz de promover la muerte celular programada, indicando que la porción lipídica de la lipoproteína está directamente involucrada en el fenómeno. Esto fue corroborado por la habilidad que presentó el Pam3Cys en reproducir dicho efecto (Fig. 14C y D). - 67 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A Resultados B D M EM U -O mp 19 500 L-O mp 19 100 L-O mp 19 500 P a m 3c y s PFA % of Max % of Max D M EM H K B A 10 7 H K B A 10 8 H K B A 10 9 T N F -α C D 13.0 *** 17.0 *** 6.5 MFI ** ** * 8.5 0.0 A PF 3c m ys 50 0 Pa 9 10 0 L- O m p1 9 50 0 O m p1 -O U L- Fα H K TN 10 B A D M EM 9 8 10 K H H K D B A B A 10 M EM 7 0.0 m p1 9 MFI *** Figura 14. HKBA y L-Omp19 inducen apoptosis de astrocitos in vitro (Anexina). Astrocitos de ratones BALB/c fueron estimulados con DMEM, HKBA (1 x 107 - 1 x 109 bacteria/ml), TNF-α (5 ng/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (100 ng/ml y 500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o PFA 2%. Luego de 24 h, fue determinada la apoptosis mediante anexina V/IP por medio de citometría de flujo (A y B). El gráfico de barras muestra la media de la intensidad de fluorescencia (MFI) para cada estímulo. Las barras expresan la media ± S.E.M de duplicados (C y D). Los datos mostrados son un experimento representativo de 5 realizados. * P<0,05 ** P<0,01 ***P<0,001 vs. DMEM. - 68 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados HKBA L-Omp19 PFA DMEM HKBA L-Omp19 PFA DMEM HKBA L-Omp19 PFA *** *** 40 *** ** *** *** *** 75 50 *** *** *** *** *** *** *** 25 0 H H D M K EM BA H K 10 7 B H A1 K 08 BA L- 10 9 O m p Pa 19 m 3C y TN s Fα PF A 0 ANEXINA M K EM BA H K 10 7 B H A1 K BA 0 8 L - 10 9 O m p Pa 19 m 3C y TN s Fα PF A % C é lu la s a p o p to tic a s C TUNEL 80 % C é lu la s a p o p to tica s B DMEM D A N E X IN A HOECHST TUNEL A Figura 15. HKBA y L-Omp19 inducen apoptosis de astrocitos in vitro (TUNEL y HOECHST). Astrocitos de ratones BALB/c fueron estimulados con DMEM, HKBA (1 x 107 - 1 x 109 bacteria/ml), TNFα (5 ng/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (100 y 500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o PFA 2%. Luego de 24 h, se determinó apoptosis mediante de Anexina V/IP, Hoechst dye 33342 y TUNEL. Las flechas indican las células apoptóticas (A). Cuantificación de apoptosis por Anexina V/PI y TUNEL. Las barras expresan la media ± S.E.M de los duplicados (B, C). Los datos mostrados son un experimento representativo de 5 realizados. * P<0,05 ** P<0,01 ***P<0,001 vs. DMEM. - 69 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados Además la apoptosis fue aseverada cualitativamente (Fig. 15A, flechas) y cuantitativamente por tres métodos diferentes: por medio del ensayo de TUNEL; por tinción con Hoechst dye 33342 y por anexina V-FITC/IP (Fig. 15B y C). Estos ensayos determinaron que HKBA, L-Omp19 y Pam3Cys inducían apoptosis en forma significativa (P<0,05), confirmando y extendiendo los resultados obtenidos por citometría de flujo (Fig.14 y datos no mostrados). En conjunto estos resultados indican que el fenómeno de apoptosis no depende de la viabilidad de Brucella, y que las lipoproteínas de Brucella pueden inducir en astrocitos la muerte celular programada. La apoptosis de astrocitos está mediada por TNFR1 Nuestros resultados indican que tanto B. abortus como sus lipoproteínas tienen la capacidad de inducir la secreción de TNF-α en las células de la inmunidad innata del SNC. Dado que esta citoquina está involucrada en los procesos de apoptosis 236, 237, decidimos evaluar si era la responsable de inducir la apoptosis de los astrocitos. Para verificar el efecto de TNF-α en astrocitos, células de ratones TNFRp55-/- fueron estimuladas por 24 h con medio (DMEM), HKBA, L-Omp19 o U-Omp19 y después de marcarlas con anexina V/IP se determinó la apoptosis por medio de citometría de flujo. Los astrocitos de ratones C57BL/6 fueron utilizados como control. Tanto HKBA como L-Omp19 fueron incapaces de inducir apoptosis en los astrocitos -- provenientes de ratones TNFRp55 / (Fig. 16A y B). En contraste, ambos estímulos fueron capaces de promoverla en astrocitos provenientes de ratones C57BL/6 de forma significativa (P<0,05). Sin embargo, U-Omp19 no logró inducir apoptosis en astrocitos de ninguna de las cepas (Fig. 16A y B). Como era de esperar TNF-α no indujo apoptosis en astrocitos de ratones TNFRp55-/-, pero si lo hizo en cultivos de ratones normales. Por otro lado, PFA fue capaz de inducir la apoptosis en cultivos de ambas cepas (Fig. 16). -- La incapacidad de los astrocitos de ratones TNFRp55 / para entrar en apoptosis luego de la estimulación con HKBA o L-Omp19 fue corroborada mediante otras dos formas independientes: el ensayo de TUNEL y la tinción con Hoechst dye; que fueron analizadas (Fig. 17A) y cuantificadas (Fig. 17B y C) por medio de microscopía de fluorescencia. Teniendo en cuenta todo lo expuesto, nuestros resultados indican que el TNF-α actuando vía TNFR1 determina la apoptosis de astrocitos inducida por B. abortus y sus lipoproteínas. - 70 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis A B DMEM U-Omp19 500 HKBA 109 L-Omp19 500 TNF-α PFA % of Max % of Max DMEM U-Omp19 500 HKBA 109 L-Omp19 500 TNF-α PFA Resultados D C *** *** *** *** 12.5 0.0 PF A D M EM U -O m p1 9 50 0 H K BA L10 9 O m p1 9 50 0 TN Fα 0 D M U EM -O m p1 9 50 0 H KB A L10 9 O m p1 9 50 0 TN Fα *** PF A 10 25.0 MFI MFI 20 Figura 16. HKBA y L-Omp19 son incapaces de inducir apoptosis en astrocitos de ratones TNFRp55-/- (ANEXINA). Astrocitos de ratones C57BL/6 (A) o TNFRp55-/- (B) fueron estimulados con DMEM, HKBA (1 x 109 bacteria/ml), TNF-α (5 ng/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (500 ng/ml) o PFA 2%. Luego de 24 h, se determinó apoptosis mediante Anexina V/IP por medio de citometría de flujo. El gráfico de barras muestra la media de la intensidad de fluorescencia (MFI) para cada estímulo. Las barras expresan la media ± S.E.M de los duplicados (C y D). Los datos mostrados son un experimento representativo de 5 realizados. * P<0,05 ** P<0,01 ***P<0,001 vs. DMEM. - 71 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados TUNEL A DMEM PFA L-Omp19 HKBA HKBA L-Omp 19 HKBA L-Omp19 PFA A N E X IN A HOECHST DMEM B % C élu las ap op tot icas 40 PFA C TUNEL *** 20 ANEXINA 80 % C éu las ap op t ot icas DMEM 0 *** 40 D H ME K B M H A K 1 7 B 0 H A1 K L- B 0 8 O A m 1 p1 0 9 9 Pa 500 m 3C TN ys Fα PF A U -O D m M L- p1 EM O 9 m L- p1 500 O 9 m 1 p1 00 H 95 KB 0 A 0 Pa 10 9 m 3c TN ys Fα PF A 0 Figura 17. HKBA y L-Omp19 no inducen apoptosis en astrocitos de ratones TNFRp55-/- (TUNEL y HOECHST). Astrocitos de ratones TNFRp55-/- fueron estimulados con DMEM, HKBA (1 x 107 - 1 x 109 bacteria/ml), TNF-α (5 ng/ml), U-Omp19 (500 ng/ml), L-Omp19 (100 ng/ml y 500 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o PFA 2%. Luego de 24 h, se determinó apoptosis por medio de Anexina V/IP, Hoechst dye 33342 y TUNEL. Las flechas indican las células apoptóticas (A). Cuantificación de apoptosis por Anexina V/PI y TUNEL. Barras expresan la media ± S.E.M de los duplicados (B, C). Los datos mostrados son un experimento representativo de 5 realizados. * P<0,05 ** P<0,01 ***P<0,001 vs. DMEM. - 72 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Resultados Las caspasas median la apoptosis inducida por HKBA y L-Omp19 Se ha descrito que la señalización de TNF-α vía TNFR1 induce apoptosis a través de la unión de caspasa-8 con el adaptador TRADD (Tumor necrosis factor Receptor type 1Associated Death Domain), que a su vez activa a la caspasa-3 (26) 237 . Por lo tanto, nosotros decidimos investigar el rol de las caspasas en la apoptosis inducida por HKBA y L-Omp19. Para llevarlo a cabo, cultivos de astrocitos fueron tratados con un inhibidor general de las caspasas (Z-VAD-FMK) 238 y luego estimulados con medio completo, HKBA o L-Omp19. El TNF-α y la staurosporina (STS) – un inductor de la apoptosis por medio de la vía de caspasas 238fueron usados como controles positivos. La apoptosis fue estimada por medio de la tinción con anexina V/IP y analizada mediante citometría de flujo. El Z-VAD-FMK inhibió la apoptosis de los astrocitos inducida por HKBA y L-Omp19. Como era de esperar, la apoptosis mediada por el TNF-α y la staurosporina también fue abolida (Fig. 18). Estos resultados indican que las caspasas están involucradas en la apoptosis de astrocitos inducida por HKBA y L-Omp19. Asimismo corroboran que la señalización de TNF-α vía TNFR1 es crítica en la apoptosis de los astrocitos inducida por HKBA y L-Omp19. - 73 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis HKBA Resultados % of Max % of Max L-Omp19 Medio L-Omp19 L-Omp19+IC Medio HKBA 109 HKBA 109 +IC Anexina V/IP Anexina V/IP STS % of Max % of Max TNF-α Medio TNF-α TNF-α+IC Medio STS STS+IC Anexina V/IP Anexina V/IP Figura 18. Las caspasas están involucradas en la apoptosis inducida por HKBA y L-Omp19. Astrocitos de ratones BALB/c fueron tratados con un inhibidor general de caspasas (IC) (50 μM), 2 h después las células fueron estimuladas con DMEM, HKBA (1 x 109 bacteria /ml), L-Omp19 (500 ng/ml), TNF-α (5 ng/ml) o staurosporina (STS) (1 μM). Luego de 24 h, la apoptosis fue determinada utilizando anexina V/IP por medio de citometría de flujo. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 5 realizados. - 74 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis DISCUSIÓN - 75 - Discusión Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Discusión DISCUSIÓN El mecanismo preciso por el cual Brucella entra en el SNC es desconocido. Dado que las cepas lisas de Brucella han desarrollado varios mecanismos para sobrevivir intracelularmente, especialmente dentro de los macrófagos, la infección facilitada por fagocitos (llamado mecanismo de caballo de Troya) es un mecanismo probable para la entrada de la bacteria al SNC 130 . Además, Brucella spp. puede invadir fagocitos no profesionales 239, y por lo tanto la invasión transcelular a células endoteliales podría ser otra ruta posible para la infección del SNC por parte de estas bacterias 130. Ya sea que la bacteria use uno u otro mecanismo, es claro que una vez que alcanza el SNC causa una respuesta inflamatoria patológica 208. Los mecanismos que llevan a los signos y síntomas de la neurobrucelosis aún son desconocido. Se ha propuesto que el daño causado en el SNC, puede ser atribuido a la acción directa de la bacteria o a un proceso inmunopatológico debido al efecto de las citoquinas inflamatorias 208, 239. En este trabajo nosotros presentamos evidencias de que la presencia directa de B. abortus en el cerebro de ratones normales induce una respuesta inflamatoria que lleva a la astrogliosis. Esto fue logrado utilizando HKBA. No podemos determinar si la bacteria viva podría inducir una respuesta mayor o no. Sin embargo si HKBA fue capaz de inducir astrogliosis nosotros esperaríamos que la bacteria viva también pudiera reproducir este fenómeno, al menos en un nivel similar. Imitando lo que fue documentado en pacientes con neurobrucelosis 240, junto con la astrogliosis se indujo un infiltrado celular compuesto de neutrófilos, indicando que la injuria del microorganismo desencadenó un proceso inflamatorio. Ni la astrogliosis ni el infiltrado neutrofílico fueron observados en animales inyectados con solución fisiológica o en áreas del cerebro donde la bacteria no fue inyectada. Por lo tanto, hay una relación causal entre la presencia de Brucella y el proceso inflamatorio inducido en el cerebro. En vista de esto, la aproximación experimental que nosotros postulamos fue i) demostrar, aunque in vitro, la habilidad de B. abortus para infectar y replicarse dentro de astrocitos y microglía, e inducir una respuesta inflamatoria debido a la infección y ii) probar que B. abortus, particularmente sus lipoproteínas, pueden causar astrogliosis en astrocitos en reposo debido a la inflamación producida. Creemos haber logrado ambas metas. Hasta donde nosotros sabemos, este es el primer trabajo que muestra que B. abortus puede infectar y multiplicarse dentro de astrocitos y microglía. La bacteria infecta preferentemente microglía murina más que astrocitos. Este descubrimiento no es particularmente sorprendente dada la considerable bibliografía que establece que B. abortus tiene tropismo por - 76 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Discusión los macrófagos 30, 241. Existen otras bacterias intracelulares que infectan el SNC como Listeria y Mycobacterium, que también tienen tropismo preferencial por microglía más que por astrocitos 242, 243 . El hecho que B. abortus sea capaz de infectar astrocitos suma nueva evidencia acerca de la habilidad de la bacteria para sobrevivir dentro de células no fagocíticas como osteoblastos 11 y células epiteliales 244. Evidencias crecientes le asignan un rol prominente a la inflamación como un factor patogénico potencial en muchas enfermedades del SNC. Tanto astrocitos como microglía son los principales efectores de la respuesta inmune innata del SNC 55, 118, 123, 245 condiciones patológicas como las infecciones microbianas neurodegenerativas 247, 248 159, 242, , siendo activados en 246 y enfermedades . La infección de astrocitos y microglía por B. abortus induce la producción de una variedad de citoquinas (TNF-α, IL-1 y IL-6) y quimiocinas (KC y MCP-1). A pesar que estos mediadores pro-inflamatorios podrían hipotéticamente jugar un rol tanto directa o indirectamente en la defensa del hospedador con B. abortus, también podrían tener un rol importante en la iniciación, propagación y regulación de la respuesta inmune innata inflamatoria en el cerebro. Diversos mediadores pro-inflamatorios incluyendo IL-1 , IL-6, TNFα, oxido nítrico, especies reactivas del oxigeno y quimiocinas liberadas por los astrocitos y microglía demostraron actuar acrecentando enfermedades como la encefalitis por HIV 249-251 , la encefalitis por Toxoplasma, la enfermedad de Alzheimer 249-251 y la esclerosis múltiple 251, entre otras. De hecho, la presencia de infiltrado neutrofílico en el cerebro de los ratones inyectados con HKBA podría reflejar la habilidad de los astrocitos y microglía de secretar KC – uno de los mayores quimioatractantes responsables del reclutamiento de neutrófilos en ratones 252 – luego de la infección/estimulación con B. abortus. La producción de los mediadores inflamatorios no fue dependiente de la viabilidad de la bacteria, dado que éstos también son inducidos al ser expuestos ambos tipos celulares (astrocitos y microglía) a la bacteria muerta por calor (HKBA), sugiriendo que son inducidos por algún componente estructural de la bacteria. Este trabajo de tesis establece que el componente estructural responsable de la respuesta no es el LPS de B. abortus. B. abortus posee lipoproteínas 25 y estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado que éstas pueden liberar mediadores inflamatorios de varios tipos celulares 10, 113, 114. Así como otras lipoproteínas bacterianas tienen la habilidad de inducir la liberación de citoquinas inflamatorias en células del SNC 246 , nosotros propusimos como hipótesis que las lipoproteínas de B. abortus podrían ser los componentes estructurales involucrados en el fenómeno observado. L-Omp 19, una lipoproteína prototípica de B. abortus, indujo la secreción de citoquinas (TNF-α, IL-1 y IL-6) y quimiocinas (KC y MCP-1) en astrocitos y microglía en forma dosis - 77 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Discusión dependiente. U-Omp19 no tuvo efecto, demostrando que la acilación de Omp19 es necesaria para su actividad biológica. No solo L-Omp19 sino también Pam3Cys fueron capaces de inducir mediadores inflamatorios. Dado que todas las lipoproteínas de Brucella comparten la modificación del Pam3Cys, esto implica que cualquier lipoproteína debería ser capaz de producir este efecto. Puesto que el genoma de B. abortus contiene no menos de 80 genes putativos que codifican para lipoproteínas 253, muchas de las cuales se expresan en la membrana externa de la bacteria 25 , uno podría esperar que la concentración local de lipoproteínas de B. abortus en espacios confinados dentro del cerebro son suficientes como para ejercer su efecto biológico. En este contexto nosotros postulamos que cualquier lipoproteína puede ser relevante más allá de cualquier experimento in vitro y que no una lipoproteína sino una combinación de las mismas podrían contribuir a la respuesta pro-inflamatoria promovida por B. abortus en astrocitos y microglía. La participación de TLR2 en la inducción de la astrogliosis y en la producción de citoquinas y quimiocinas promovidas por B. abortus merece discusión. Nuestros resultados indican que tanto HKBA como L-Omp19 estimulan la producción de TNF-α, IL-1 , IL-6, MCP1 y KC vía TLR2, y coinciden en este aspecto con los resultados obtenidos por Huang y col. 73. En dicho trabajo los investigadores observan que HKBA también induce TNF-α en células de ratones vía TLR2. En cambio Campos y col 59 obtienen evidencias que sugiere que la producción del TNF-α inducida por HKBA es dependiente de TLR4. Nosotros también mostramos, al igual que Huang y col. que el LPS no es el mediador de la actividad de HKBA y proveemos pruebas de que las lipoproteínas de Brucella serían ligandos TLR2 que la bacteria utiliza para disparar la liberación de mediadores pro-inflamatorios. Cabe destacar además que nuestros resultados indican que el TLR2 no está involucrado en la infección de la bacteria sino en la respuesta inflamatoria desencadenada. Estos resultados junto con los obtenidos por otros laboratorios 57, 59 suman evidencias a la noción de que el TLR2 solo participa en mediar respuestas inflamatorias en brucelosis. La astrogliosis es una enfermedad no específica. Los astrocitos que sufren gliosis aumentan su tamaño, se dividen más rapidamente, y expresan activamente GFAP, así como proteína S100, precursores de la proteína amieloide y muchos receptores 135, 254. Cualquier injuria cerebral (infección, autoinmunidad, tumor o accidente cerebro-vascular) puede inducir dicha gliosis, cuya intensidad y duración puede ser limitada por la apoptosis de los astrocitos, como fue reportado en la encefalitis causada por HIV 256 255 , neuroborreliosis 246 , enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple 257. La astrogliosis también está presente en la neurobrucelosis 188, 220, y en este trabajo nosotros hemos corroborado que la inyección tanto de la bacteria como de - 78 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Discusión lipoproteínas de Brucella en el cerebro de ratones sanos induce astrogliosis. En este trabajo también se corroboró in vitro que B. abortus y sus lipoproteínas pueden causar astrogliosis. Un hecho basado en dos características de este fenómeno: aumento en la tasa de división celular y apoptosis 232, 233. Nuestros resultados revelan que HKBA y L-Omp19 inducen la proliferación de astrocitos. Es más, la evaluación de la tasa de división celular por medio de la incorporación de BrdU hizo posible la observación de una dicotomía en el comportamiento de la respuesta de los astrocitos ante la estimulación con HKBA. Alrededor del 20% de la población de los astrocitos aumenta su tasa de división celular mientras el resto de las células deja de dividirse respecto a la tasa de división de las células no estimuladas. Los experimentos de incorporación de BrdU demostraron que una subpoblación de astrocitos es capaz de aumentar su tasa de división, y así exhibir esta característica de astrogliosis, en respuesta a B. abortus. Nosotros asumimos pero no demostramos, que la población de astrocitos que se divide lentamente o no se divide (que fue identificada en el experimento de incorporación de BrdU) ha entrado, al menos en parte, en apoptosis. La segunda característica de astrogliosis que nosotros decidimos explorar fue la apoptosis. La infección con B. abortus induce la apoptosis de astrocitos. Así como la capacidad de inducir mediadores inflamatorios, la apoptosis inducida por B. abortus no es dependiente de la viabilidad bacteriana y es producida, al menos, por sus lipoproteínas. Tres determinaciones diferentes (anexina V/IP, Hoechst dye y TUNEL) corroboraron que HKBA y L-Omp19 son capaces de inducir apoptosis de astrocitos. En la actualidad, aún se debate si la apoptosis inducida por un patógeno es beneficiosa o perjudicial para el hospedador 258. La desregulación de los astrocitos generada por la invasión de B. abortus podría generar un micro ambiente en el cual la secreción de mediadores pro-inflamatorios podrían llevar a la desestabilización de la estructura de la glía. Por otro lado, la apoptosis proveería los medios para que el hospedador disminuyera la respuesta inflamatoria y limitara el daño causado por los componentes bacterianos pro-inflamatorios. Parece contradictorio que B. abortus y sus lipoproteínas sean capaces de inducir la apoptosis de astrocitos cuando ha sido reportado que las especies de Brucella son capaces de inhibir la apoptosis en macrófagos 88, 234 . Sin embargo, a diferencia de los astrocitos, la microglía fue resistente a la apoptosis mediada por Brucella. Dado que Brucella está particularmente adaptada a infectar y replicarse en macrófagos 30, 241, y la microglía son los macrófagos residentes del cerebro, su resistencia a la apoptosis debería ayudar a asegurarse su viabilidad para poder establecer una infección crónica. - 79 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Discusión Desconocemos a que se podrían deber las diferentes susceptibilidades a la apoptosis entre astrocitos y microglía, pero el hecho que la apoptosis en astrocitos sea mediada por un ligando TLR2, tal como la lipoproteína de B. abortus L-Omp19 10, 113, 114, podría ayudar a clarificar esta cuestión. Aliprantis y col 109 , observaron al estudiar la activación celular mediada por TLR2, utilizando HEK293 transfectadas, que las lipoproteínas/lipopéptidos tienen propiedades proapoptóticas. En cambio, estudios con macrófagos murinos no pudieron confirmar que la señalización vía TLR2 sea intrínsicamente apoptogénica 259-262. También ha sido reportado para otras infecciones microbianas una susceptibilidad a la apoptosis dependiente del tipo celular 258, 263 incluyendo una susceptibilidad diferencial entre astrocitos y microglía 264, 265. Como muchas citoquinas la IL-6 es pleiotrópica. En el SNC, la IL-6 desarrolla efectos beneficiosos y perjudiciales. Los efectos nocivos de la IL-6 están asociados al exceso de producción de esta citoquina. Se cree que la sobre expresión de la misma puede ser un factor que contribuye en muchas de las enfermedades del SNC, dentro de los cuales se encuentran la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular, y shock séptico 249-251 . Dado que la IL-6 es capaz de promover la proliferación de astrocitos, se cree que la misma puede desempeñar un rol en la astrogliosis. En este trabajo, cuando se agregó IL-6 recombinante aumentó marcadamente la división celular en astrocitos murinos en relación a la tasa de división celular de los tratados con medio solamente. Sin embargo, la adición de un exceso molar de Ac. anti-IL-6 durante la estimulación con HKBA, LOmp19 o Pam3Cys solo pudo inhibir parcialmente la incorporación de [3H] timidina. Otras citoquinas que también son expresadas por astrocitos y por las cuales estas células tienen receptores, como IL-3 e INF-γ 266 , han sido implicadas en la proliferación de astrocitos y es posible que la producción de estas citoquinas sea inducida también por la lipoproteínas. Esto aún no ha sido establecido en nuestro laboratorio. El TNF-α actúa a través de 2 receptores de superficie: TNFR1 y TNFR2. TNFR2 se expresa solo en células hematopoyéticas y endoteliales, mientras TNFR1 es expresado en todos los tipos celulares e inicia la mayoría de los procesos biológicos mediados por TNF-α 237 .A pesar que los 2 receptores de TNF-α se encuentran en el cerebro, TNFR1 se expresa en forma constitutiva en los astrocitos estimulados 268 267 mientras que TNFR2 se observa solo cuando éstos son . La mayor diferencia entre estos 2 receptores es la presencia de dominios de muerte en TNFR1, lo cual le confiere la habilidad de inducir apoptosis 237. La IL-6 inducida por las lipoproteínas contribuye, pero no determina, a estimular la proliferación de los astrocitos. Sin embargo el TNF-α vía la señalización de TNFR1 parece ser el único determinante de la apoptosis de los astrocitos cuando son estimulados con B. abortus o sus lipoproteínas, dado que - 80 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Discusión la apoptosis es completamente inhibida cuando se utilizan astrocitos de ratones TNFRp55-/-. El hecho de que un pan-inhibidor de caspasas también inhiba la apoptosis inducida por B. abortus remarca la relevancia de la señalización del TNF-α vía TNFR1 en este fenómeno, ya que se ha descripto que la apoptosis vía TNFR1 involucra la activación de caspasas 237. Ha sido reportado tanto para la IL-6 como para el TNF-α, que juegan un rol en el daño derivado de infecciones como la meningitis bacteriana, la malaria cerebral y el síndrome de demencia del SIDA, así como desordenes neurodegenerativos como Alzheimer o esclerosis múltiple. El presente estudio de interacción de B. abortus con las células de la glía, nos ha provisto de información potencial respecto de 3 elementos de la patogénesis de la brucelosis en el SNC. En primer lugar la bacteria infecta microglía y astrocitos, con un tropismo preferencial por las primeras. Segundo, la infección de ambos tipos celulares induce la secreción de una variedad de citoquinas (TNF-α, IL-1 y IL-6) y quimiocinas (KC y MCP-1), algunas de las cuales contribuyen al daño en el SNC, ya que están involucradas directamente en el fenómeno de proliferación y apoptosis de astrocitos cuando son estimulados con la bacteria. Tercero, que las lipoproteínas de Brucella son los principales contribuyentes a la respuesta inflamatoria inducida por la bacteria. Estas razones nos llevan a postular que la respuesta inmune innata a los PAMP´s de B. abortus (principalmente las lipoproteínas) generarían una respuesta inflamatoria vía TLR2 que llevarían a una apoptosis vía TNF-α (dependiente de caspasas) de células de la glía y eventualmente de las neuronas. Este daño podría llevar a producir el déficit neurológico observado en neurobrucelosis 43, 190, 224. Dado que la red de interacciones fisiológicas descriptas en este trabajo no se circunscribe a brucelosis, es razonable asumir que el conocimiento que emerge de este trabajo no es necesariamente restringido a esta enfermedad, sino que tiene una trascendencia significativa en otras neuropatologías. Mas aún, la activación de astrocitos y microglía y la subsecuentemente iniciación de la respuesta inmune inflamatoria podría ser un importante componente de otros desordenes inflamatorios en el SNC. - 81 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis CONCLUSIONES - 82 - Conclusiones Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Conclusiones CONCLUSIONES ♣ Este trabajo permitió desarrollar un modelo en el cual fuera posible esclarecer los determinantes de una de las manifestaciones más mórbidas de la brucellosis, la neurobrucelosis. También nos proporcionó información escencial respecto de 3 elementos de la patogénesis de la brucelosis en el SNC: ♣ En primer lugar, la bacteria infecta microglía y astrocitos, con un tropismo preferencial por las primeras. ♣ En segundo lugar, la infección de ambos tipos celulares induce la secreción de una variedad de citoquinas y quimiocinas que contribuyen al daño en el SNC, ya que están involucradas directamente en el fenómeno de proliferación y apoptosis de astrocitos cuando son estimulados con la bacteria. ♣ En tercer lugar, las lipoproteínas de Brucella son los principales contribuyentes a la respuesta inflamatoria inducida por la bacteria. ♣ Estas razones nos llevan a postular que la respuesta inmune innata contra los PAMPs de B. abortus (específicamente lipoproteínas) generaría una respuesta inflamatoria vía TLR2 que llevaría a una apoptosis mediada por TNF-α (dependiente de caspasas) de células de la glía y eventualmente de las neuronas. Este daño podría llevar a producir el déficit neurológico observado en neurobrucelosis. ♣ En conjunto, este modelo posibilitó delinear un mecanismo patogénico para la brucelosis en el SNC. Además permitió analizar cómo el deterioro de las funciones de la astroglia y microglía contribuye al desarrollo de ésta y potencialmente, de otras enfermedades neurológicas - 83 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Lic. Clara García Samartino Conclusiones Dr.Guillermo. H. Giambartolomei - 84 - Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis REFERENCIAS - 85 - Referencias Interacciones de B. abortus con la inmunidad innata del SNC como determinante de patogénesis de la neurobrucelosis Referencias REFERENCIAS 1. Wilkinson L: "Brucellosis", In Kiple, Kenneth F. 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