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Caracterización molecular y funcional de bacterias del género
Azotobacter aisladas de suelos de la República Argentina. El rol de las
auxinas en la respuesta a la inoculación de trigo.
Tesis presentada para optar al título de Magister de la Universidad de Buenos Aires,
Área Producción Vegetal con orientación en cultivos extensivos
Esteban Julián Rubio
Ingeniero Agrónomo-Universidad Nacional de Luján-2003
Lugar de trabajo: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA)
Escuela para Graduados Ing. Agr. Alberto Soriano
Facultad de Agronomía – Universidad de Buenos Aires
COMITÉ CONSEJERO
Directora de tesis
Olga Susana Correa
Ingeniera Agrónoma
Magister Scientiae
Consejeros de Estudios
Fabricio Darío Cassán
Microbiólogo (Universidad Nacional de Río Cuarto)
Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional de Río Cuarto)
Alejandro Perticari
Ingeniero Agrónomo (Universidad de Morón)
JURADO DE TESIS
Directora de tesis
Olga Susana Correa
Ingeniera Agrónoma (Universidad de Buenos Aires)
Magister Scientiae (Universidad de Buenos Aires)
JURADO
José Alfredo Curá
Ingeniero Agrónomo (Universidad Nacional de Mar del Plata)
Doctor en Ciencias (Área biología) (Universidad Nacional de Mar del Plata)
JURADO
Román Augusto Serrago
Ingeniero Agrónomo (Universidad de Buenos Aires)
Doctor en Ciencias Agropecuarias (Universidad de Buenos Aires)
Fecha de defensa de la tesis: 2 de agosto de 2011
iii
Dedicada a Gimena y a mi hijo Matías
iv
Agradecimientos
A mi directora y mis consejeros de tesis, a las Dras Marcela Montecchia e Irma
Roberts, a mis compañeros del laboratorio y a Gimena.
v
“Declaro que el material incluido en esta tesis es, a mi mejor saber y
entender, original, producto de mi propio trabajo (salvo en la medida en que
se identifique explícitamente las contribuciones de otros), y que este
material no lo he presentado, en forma parcial o total, como una tesis en
ésta u otra institución.”
Esteban Julián Rubio
vi
ÍNDICE GENERAL
Agradecimientos…………………………………………………………….…………iv
Declaración……………………………………………………………………………..v
Índice de Cuadros……………………..………………………….….…..…..….........viii
Índice de Figuras………..…………………………………………...………..….........ix
Resumen……………………………………………………..………………................xi
Abstract…………………………………...……………………………….…..............xii
1. Introducción General……………………………..………...……………..…...........1
1.1. Objetivos generales…………………….…….…….………………..………….…5
Capítulo 1: “Diversidad de Azotobacter en suelos argentinos. Aislamiento y
caracterización genotípica y fenotípica de los aislamientos”...………………...….....7
Introducción………………………………………………………………….......9
Objetivos e hipótesis……………..….………………………..….……………..11
Materiales y Métodos…………………………………….………………….….12
Resultados…………………………….…...…………………………………....17
Discusión……………………………….…..…………………………..............33
Capítulo 2: “Evaluación in vitro de características de cepas de Azotobacter
relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal”………………………...…35
Introducción……………..……………………………………….………….....37
Objetivos e hipótesis.……………………….…………...………….……….….40
Materiales y Métodos………...………….………………..……….…………...41
Resultados……………….………..…..………………………….…………….44
Discusión…………………..……………………..……………….…………....54
vii
Capítulo 3: “Efecto de Azotobacter sobre la germinación y el crecimiento temprano
de plantas de trigo”………………………...…………….……………………..……..57
Introducción………….……...…….…………………………………………....59
Objetivos e hipótesis.……………….………......………………………………60
Materiales y Métodos…………………………………..………………….…....61
Resultados…………………….……………………………………………..….63
Discusión……………………..………………...………………...………….....67
Capítulo 4: La producción de auxinas por Azotobacter como mecanismo
responsable de la promoción del crecimiento temprano de trigo..............................71
Introducción…………..……….….…………………..………………………...73
Objetivos e hipótesis.………………..………………….………………..……..73
Materiales y Métodos……………………..…….………….………………..….74
Resultados…………….……………………………..……………………….....75
Discusión………………..…………………………...………………………....80
Discusión y conclusiones finales………………...………….…..…...……………..…83
Bibliografía……………..…………………..…………….……………………...…….87
Apéndice……………..………………………..……..…………………………..…….99
viii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Muestras de suelo empleadas para el aislamiento de Azotobacter…………..19
Cuadro 2. Morfología de las colonias de los aislamientos de Azotobacter crecidas en
medio LG luego de 7 días………………………………………………………………27
Cuadro 3. Velocidad específica de crecimiento (µ) tiempo de generación (g), ufc.ml-1 a
las 11 y 185 h de crecimiento y producción de auxinas por parte de cepas de
Azotobacter………………………………………………………....……………………………51
Cuadro 4. Producción de ácido-3-indolacético (AIA), ácido giberélico (GA3) y zeatina
(Z), luego de 5 días (cepas AT18 y AT42) u 8 días de crecimiento (cepas AT19, AT25,
AT31 y AT37)…...………………………………..…………………………………….52
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Dendrograma del análisis de los perfiles de rep-PCR de los aislamientos….23
Figura 2. Dendrograma del ARDRA con la enzima HhaI de las cepas
eleccionadas………………………………………………………………………..…...25
Figura 3. Colonias de aislamientos Azotobacter desarrolladas en medio LG luego de 7
días de crecimiento……………………………………………………………….…….29
Figura 4. Tinción de Gram observada con microscopio óptico de cultivos puros de
cepas Azotobacter luego de 48 hs de crecimiento en medio LG sólido……………….30
Figura 5. Producción de pigmentos no difusibles de cepas de Azotobacter en medio de
Norris y Jensen luego de 10 días.....................................................................................31
Figura 6. Tinciones de Gram observadas con microscopio óptico de los quistes
producidos por cepas de Azotobacter luego de 7 días de incubación en medio Burk con
0,3% de butanol como fuente de carbono……………………………………...…….…32
Figura 7 a. Logaritmo del número de unidades formadoras de colonia por ml
de cultivo (ufc.ml-1) y producción de auxinas de cepas de Azotobacter crecidas en
cultivos líquidos, en función del tiempo………………………………..........................45
Figura 7 b. Logaritmo del número de unidades formadoras de colonia por ml
de cultivo (ufc.ml-1) y producción auxinas de cepas de Azotobacter crecidas
en cultivos líquidos, en función del tiempo….…………….…………...…………........46
Figura 7 c. Logaritmo del número de unidades formadoras de colonia por ml
de cultivo (ufc.ml-1) y producción auxinas de cepas de Azotobacter crecidas
en cultivos líquidos, en función del tiempo……………………...……….….................47
Figura 8. Ensayos de producción de sideróforos……………….………...……...…….49
Figura 9. Ensayos de solubilización de fosfatos………….…………………….……...50
Figura 10. Comparación entre la producción de AIA determinada por LC-MS
y la producción de auxinas medida por colorimetría (Salkowsky) para los
mismos cultivos………………………………..………………………………..……..52
Figura 11. Actividad de nitrogenasa por la técnica de reducción de acetileno
de cepas de Azotobacter…………………………..……..……………………………………..53
Figura 12. Velocidad germinativa de plántulas de trigo inoculadas con cepas
de Azotobacter de baja (AT18 y AT37, AT42) y de alta producción de auxinas
x
(AT19, AT25 y AT31)……………...…….………………………………………….....63
Figura 13. Número de raíces seminales de plántulas de trigo a los 8 días de la
inoculación con cepas de Azotobacter de baja (AT18 y AT37, AT42) y de alta
producción de auxinas (AT19, AT25 y AT31)…….…......……………..…….……..….64
Figura 14. Peso seco de la raíz (a) y del tallo (b) de plántulas de trigo a los
8 días de la inoculación con cepas de Azotobacter de baja (AT18 y AT37, AT42) y de
alta producción de auxinas (AT19, AT25 y AT31)…………………………….……....64
Figura 15. Unidades formadoras de colonia por raíz de plántulas de trigo a los 8 días
de la inoculación con cepas de Azotobacter……………..............…………………….65
Figura 16. Longitud del la raíz (cm) de plántulas de trigo a los 8 días de la aplicación
de cultivos bacterianos completos (C) y sobrenadantes (S) de cepas de Azotobacter de
alta (AT19 y AT25), de baja producción de auxinas (AT18) y de soluciones de AIA de
baja (AIAb), media (AIAm) y alta (AIAa) concentración de AI…………………...…..75
Figura 17. Longitud (I) y peso seco del tallo (II) de plantas de trigo a los 8 días de la
aplicación de cultivos bacterianos completos (C) o sobrenadantes libres de células (S)
del cultivo de cepas de Azotobacter de alta (AT19 y AT25) y baja producción de AIA
(AT18) y de soluciones AIA de concentraciones baja (AIAb), media (AIAm) y alta
(AIAa)…………………………………………………………………………..............76
Figura 18. Número de raíces seminales de plántulas de trigo a los 8 días de la
aplicación de cultivos bacterianos completos (C) o sobrenadantes libres de células (S)
del cultivo de cepas de Azotobacter de alta (AT19 y AT25) y baja producción de AIA
(AT18) y de soluciones AIA de concentraciones baja (AIAb), media (AIAm) y alta
(AIAa)………………………………………………………...……………….……..…77
Figura 19. Plántulas de trigo a las 24 h del tratamiento con cultivos
completos o sobrenadantes de las cepas AT18, AT19, y AT25 o con soluciones
de 2 µg.ml-1 (AIAb), 14 µg.ml-1 (AIAm) y 26 µg.ml-1 (AIAa)..........…………….…...78
Figura 20. Plántulas de trigo de 4 días tratadas con soluciones de 2 µ.ml-1 (AIAb), 14
µ.ml-1 (AIAb) y 26 µ.ml-1 (AIAa) y con sobrenadantes del cultivo de las cepas AT18 y
AT19………………………………..…………………………………...…………...…78
Figura 21. Raíces de plántulas de trigo de 4 días tratadas con soluciones
de 2 µ.ml-1 (AIAb), 14 µ.ml-1 (AIAb) y 26 µ.ml-1 (AIAa) y con sobrenadantes del cultivo
de las cepas AT18 y AT19………………………………...……..…………….……....79
xi
Caracterización molecular y funcional de bacterias del género Azotobacter aisladas
de suelos de la República Argentina. El rol de las auxinas en la respuesta a la
inoculación de trigo.
Conocer la diversidad genética de Azotobacter en suelos de Argentina es de gran interés
científico-tecnológico debido a su uso actual y futuro en la agricultura. Por otra parte,
los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal de Azotobacter aún no han sido
completamente elucidados. En este trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la
caracterización genotípica y fenotípica de cepas de Azotobacter. La especie más
frecuentemente aislada fue A. chroococcum, mientras que reportamos por primera vez la
presencia de A. salinestris y A. armeniacus en suelos argentinos. La producción de
sideróforos, la solubilización de fosfatos y la producción de auxinas se evaluaron en 21
de los aislamientos obtenidos. Todas las cepas evaluadas produjeron sideróforos y
auxinas, con diferencias entre ellas en la cantidad producida de auxinas, mientras que
ninguna cepa solubilizó fosfatos. Se seleccionaron 6 cepas con valores contrastantes de
producción de auxinas y se determinó su capacidad de producir ácido indol-3-acético
(AIA), ácido giberélico (GA3) y zeatina (Z) por cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas, la capacidad de fijar N2 por la reducción de acetileno-etileno y
la capacidad de promover la germinación y el crecimiento temprano de plántulas de
trigo. Las 6 cepas seleccionadas produjeron distintos niveles de AIA, GA3 y Z y
difirieron en la capacidad de fijar N2. La mayor producción de AIA correlacionó con un
mayor desarrollo de raíces seminales y pelos radicales de las plantas inoculadas, y esas
respuestas fueron reproducidas por la aplicación exógena de AIA. Además, se
observaron efectos positivos de la inoculación sobre el crecimiento aéreo, los cuales no
pudieron ser atribuidos a la producción de auxinas. Los resultados obtenidos demuestran
que las fitohormonas producidas por Azotobacter jugarían un rol muy importante en la
promoción temprana del crecimiento de las plántulas de trigo.
Palabras claves: PGPR, fitohormonas, sideróforos, fijación de nitrógeno, inoculación de
semillas.
xii
Molecular and functional characterization of bacteria of the genus Azotobacter
isolated from soils of Argentina. The role of auxins in response to inoculation of
wheat.
Knowing the genetic diversity of Azotobacter in soils of Argentina is of great scientific
and technological interest because of its current and future use in agriculture. Moreover,
the mechanisms for promoting plant growth of Azotobacter have not yet been fully
elucidated. In this work it was carried out the isolation and genotypic and phenotypic
characterization of different strains of Azotobacter The most frequently isolated species
was A. chroococcum, whereas we reporte here for the first time the presence of A.
salinestris and A. armeniacus in argentine soils. The production of siderophores, the
phosphate solubilization and the production of auxins were evaluated in 21 of the
isolates obtained. All tested strains produced siderophores and auxins, with differences
in the amount of the latter, while no strain solubilized phosphates. Six strains with high
differences in auxin production were selected and their ability to produce indole-3acetic acid (IAA), gibberellic acid (GA3) and zeatin (Z) were determined by liquid
chromatography coupled with mass spectrometry. In addition, their ability to fix N2 by
the acetylene-ethylene reduction and to promote germination and early growth of wheat
seedlings was analyzed. The 6 selected strains produced different levels of IAA, GA3
and Z and differed in their ability to fix N2. The higher production of IAA correlated
with further development of seminal roots and root hairs of inoculated plants, and these
responses were reproduced by exogenous application of IAA. In addition, there were
positive effects of inoculation on shoot growth, which could not be attributed to the
production of auxins. The results show that phytohormones produced by Azotobacter
play an important role in promoting early growth of wheat seedlings.
Keywords: PGPR, phytohormones, siderophores, nitrogen fixation, seed inoculation
INTRODUCCIÓN GENERAL
______________________________________________________________________
1
3
La diversidad microbiana es fundamental para el mantenimiento y la conservación de
los recursos genéticos del mundo. Los suelos albergan una gran diversidad microbiana,
la que tiene un rol importante en el mantenimiento de la fertilidad y sanidad edáfica
(Ahmad et al. 2005a). Además, tiene un gran potencial de uso en la biotecnología,
debido a que es una fuente de genes y metabolitos aún desconocida. Colwell (1997)
señala que es necesario tomar medidas para censar y conservar dicha diversidad. La
diversidad microbiana de los suelos se ve afectada por la vegetación, las propiedades
físicas y químicas y el uso y manejo de los suelos (Haynes y Graham 2005, Franchini et
al. 2007, Clegg 2006). La pérdida de diversidad tiene un impacto profundo en la
resistencia y resiliencia de los suelos frente a perturbaciones y condiciones de estrés y
por ende en la sustentabilidad de los mismos (Degens et al. 2001).
Entre los microorganismos que habitan el suelo se incluyen a las bacterias, hongos,
virus, protozoos y algas (Nannipieri y Badalucco 2003) Las bacterias conforman el
grupo metabólico más importante del suelo, y si bien se encuentran en menor cantidad
que los virus y son menos voluminosas que los hongos, cumplen un rol fundamental en
los ciclos de carbono y nitrógeno (Nannipieri y Badalucco 2003). La población
bacteriana es mucho más abundante en el volumen de suelo influenciado por las raíces,
denominado rizósfera, en relación al suelo no rizosférico (Verma et al. 2010). Las
bacterias pueden tener efectos neutros, positivos o negativos sobre el crecimiento
vegetal. Por otro lado las plantas, a través de los exudados radicales pueden estimular,
inhibir o no tener efecto alguno sobre las bacterias del suelo (Pinton et al. 2000).
Existe un grupo de bacterias que son capaces de colonizar las raíces de las
plantas y promover el crecimiento vegetal, las llamadas rhizobacterias promotoras del
crecimiento o PGPR, de la abreviación de plant growth promoting rhizobacteria
(Kloepper et al. 1980). Estas bacterias pueden actuar de una manera directa, facilitando
la captación de nutrientes y/o a través de la producción de sustancias que estimulan el
crecimiento, o indirectamente, a través de la prevención o disminución del efecto
negativo de un organismo fitopatógeno (Verma et al. 2010). Las PGPR más estudiadas
incluyen miembros de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas,
Burkholderia y Klebsiella (Fuentes-Ramirez y Caballero-Mellado 2005). Los beneficios
de la inoculación con PGPR incluyen incrementos en la tasa de germinación,
crecimiento de la raíz y del tallo (Cassán et al. 2009); rendimiento (Díaz Zorita et al.
2009); aumento en la absorción de nutrientes (Okon y Kapulnik, 1986); tolerancia a la
sequía (Glick, 1995) y resistencia a la enfermedades entre otros.
El modelo bacteriano
Las especies del género Azotobacter agrupan a bacterias fijadoras de nitrógeno
de vida libre, que están distribuidas en diferentes ambientes de suelo, agua y sedimentos
(Aquilanti et al. 2004a). La primera especie del género fue descubierta en el año 1901
por el microbiólogo holandés Martinus Beijerinck empleando una técnica de
enriquecimiento con un medio sin nitrógeno. Desde entonces éste se considera, junto
con las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno, uno de los géneros saprófitos más
ampliamente estudiado debido principalmente a su capacidad de fijar nitrógeno
atmosférico (Mrkovacki y Milic, 2001). La especie A. vinelandii, en particular, ha sido
empleada extensamente como modelo en estudios bioquímicos y genéticos de la fijación
biológica nitrógeno (Dalton y Kramer 2006). Recientemente se realizó la secuenciación
completa del genoma de esta especie (Setubal et al. 2009).
4
Azotobacter, además de su empleo como PGPR, ha tenido otras aplicaciones de
importancia biotecnológica, tales como la producción de surfactantes (Thavasi et al.
2009), alginatos (Khanafari 2007) y bioplásticos (Khanafari 2006), a partir de la
degradación de sustancias de desecho como suero de leche, aceite lubricante para
motores y aceite comestible usados. Adicionalmente podría ser utilizado como
biorremediador de suelos, dada su capacidad de inmovilizar metales pesados tales como
cromo y cadmio (Joshi et al. 2009).
La capacidad de fijar nitrógeno de Azotobacter motivó principalmente a que se
empleara como fertilizante bacteriano. Así, en 1926, investigadores rusos reportaron que
la inoculación del suelo con esta bacteria tenía efectos positivos e importantes sobre el
crecimiento de plantas de tabaco y la acumulación de nitrógeno en el suelo. Esto llevó a
una fuerte tradición de inoculación con este género en Rusia, la que se extendió durante
décadas (Kennedy e Islam 2001). Sin embargo, numerosos ensayos a campo realizados
entre 1958 y 1960, concluyeron que sólo en el 34% de los casos, Azotobacter
incrementó el rendimiento de los cultivos y en valores menores al 10% (Mishustin
1970). Así, la práctica de inoculación con Azotobacter fue abandonada. No obstante,
otros investigadores continuaron reportando efectos positivos de esta bacteria sobre los
cultivos (Becking 2006).
Se han realizado una gran cantidad de ensayos a campo donde se demuestra el
efecto positivo de Azotobacter sobre el rendimiento de diferentes cultivos. Se han
publicado los efectos sobre cultivos extensivos como maíz (Hussain et al. 1987,
Martínez-Toledo et al. 1988, Pandey et al. 1998,), trigo (Zambre et al. 1984, Behl 2006,
Kizilkaya 2008,) y arroz (Kannaiyan et al. 1980, Kennedy et al 2004). Además del
efecto sobre el rendimiento, algunos investigadores observaron que es posible reducir la
fertilización nitrogenada hasta en un 50 % con la inoculación con este microorganismo
(Kennedy et al. 2004). También se han reportado efectos benéficos en los rendimientos
resultantes de la co-inoculación de Azotobacter con otros microorganismos como
hongos vesículo-arbusculares en trigo (Singh et al. 2004, Khan y Zaidi 2007, Bahrani et
al. 2010) y con Azospirillum también en trigo (Rai y Gaur 1988), en colza canola
(Yasari et al. 2007) y en maíz (Biari et al. 2008).
A pesar de la considerable cantidad de información experimental que demuestra
los efectos positivos de Azotobacter sobre el desarrollo vegetal, los mecanismos de
promoción del crecimiento en este género bacteriano, no han sido totalmente
comprendidos. Los mecanismos que han sido relacionados con la capacidad de
promover el crecimiento vegetal en el género Azotobacter son principalmente la fijación
del nitrógeno atmosférico (Narula et al. 2007), la producción de fitohormonas (Jackson
et al. 1964, Azcón y Barea 1975, Khalid et al. 1999); la solubilización de fósforo
(Kumar y Narula 1999) y la producción de sideróforos (Behl 2006); sin embargo, son
pocos los trabajos publicados que han intentado vincular de una manera directa alguno
de estos mecanismos con la respuesta observada en las plantas luego de la inoculación.
Por el contrario, en otras PGPR como en el género Azospirillum, se ha demostrado que
las fitohormonas y en particular las auxinas, tienen un rol fundamental en la promoción
del crecimiento vegetal (Spaepen et al. 2007, Bashan y de Bashan 2010).
El modelo vegetal
El trigo (Triticum aestivum L.) es una monocotiledónea que pertenece a la
familia de las Poáceas. Es el mayor y más importante cultivo a nivel mundial para
consumo directo de humanos, con una cosecha anual de 620 millones de toneladas en
5
más de cuarenta países y para más del 35 % de la población mundial (Gustafson et al.
2010). Más aún, la comercialización mundial de trigo es mayor que la del resto de los
cultivos en su conjunto. Debido al incremento de la población mundial, y suponiendo
que el consumo de trigo se mantenga constante, se estima que para el año 2025 se
requerirán unas 786 millones de toneladas de trigo (Plassé 2007). En Argentina existe
una gran brecha entre el rendimiento real y potencial de trigo (Miralles y Gonzáles
2009), por lo que es posible incrementar el rendimiento a través del empleo de
diferentes estrategias o manejos tecnológicos. La superficie sembrada en promedio de
las campañas 2003/04 a 2007/08 fue de aproximadamente 6 millones de hectáreas con
un rendimiento medio de 2.7 tn.ha-1 (MAGYP 2010). Sin embargo, la superficie
sembrada en las dos últimas campañas fue particularmente baja entre 3,1 y 4,25
millones de hectáreas (MAGYP 2010), debido a inconvenientes climáticos y
económicos (Ghida-Daza 2010).
El sector productivo argentino ha incorporado lentamente el empleo de
inoculantes, principalmente bacterianos en cultivos de gramíneas, tanto en maíz como
en trigo. Se estima que actualmente el 6-7 % del área sembrada con trigo y maíz ha sido
inoculada con productos formulados a base de bacterias de los géneros Azospirillum,
Pseudomonas u otros (Perticari et al. 2010). Adicionalmente, para formular estos
productos mayoritariamente se utilizan rizobacterias nativas debido a que están
adaptadas a las condiciones ecológicas y pueden ser más competitivas que otras cepas
no nativas (Kizilkaya 2008). Salantur et al. (2006) y Kizilkaya (2008) reportaron que,
en general, la inoculación de trigo con cepas nativas de PGPR generó mayores
respuestas en el rendimiento en relación a cepas exóticas. Así, resulta imprescindible
conocer la diversidad de Azotobacter en los suelos de nuestro país considerando su
potencialidad para la formulación de inoculantes y para otras aplicaciones
biotecnológicas. Por otra parte, una mejor comprensión de los mecanismos por los que
Azotobacter estimula el crecimiento vegetal permitirá mejorar la tecnología de
desarrollo y aplicación de inoculantes comerciales a partir de cepas nativas de este
microorganismo.
1.1. OBJETIVOS GENERALES
 Obtener aislamientos del género
caracterizarlos y analizar su diversidad.
Azotobacter
de
suelos
argentinos,
 Estudiar en tales aislamientos las características vinculadas con la promoción
del crecimiento vegetal y relacionar la producción de auxinas con la estimulación de la
germinación
y
el
crecimiento
temprano
de
trigo.
CAPÍTULO 1: “DIVERSIDAD DE AZOTOBACTER EN SUELOS
ARGENTINOS. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA Y
FENOTÍPICA DE LOS AISLAMIENTOS.”
______________________________________________________________________
7
9
INTRODUCCIÓN
______________________________________________________________________
Según la última edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology
(Kennedy et al. 2005), el género Azotobacter pertenece a la familia Pseudomonadaceae,
del orden Pseudomonadales y clase Gammaproteobacteria. El género Azotobacter
comprende siete especies, Azotobacter chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A.
paspali, A. armeniacus, A. nigricans y A. salinestris (Kennedy et al. 2005).
Estas bacterias poseen células gramnegativas que pueden tener forma de cocos
o bastones, con bordes redondeados o elipsoidales, de más de 2 µm de diámetro y 4 µm
de longitud. Su morfología puede cambiar según las condiciones de cultivo.
Generalmente las células suelen agruparse de a pares, aunque a veces pueden estar
aisladas o en cadenas de diferente longitud. Dependiendo de la especie pueden ser
móviles por flagelos perítricos o no móviles. Son aerobias estrictas y pueden fijar
nitrógeno tanto bajo tensiones de oxígeno reducidas como bajo condiciones aeróbicas.
Tienen la capacidad de formar estructuras de resistencia denominadas quistes, los cuales
poseen cierta resistencia a la desecación y al daño causado por agentes físicos o
químicos, y algunas especies pueden producir pigmentos. Desde el punto de vista de su
metabolismo son quimioheterótrofas utilizando carbohidratos, alcoholes y sales de
ácidos orgánicos como fuente de carbono, y pueden fijar 10 mg de nitrógeno por gramo
de carbono en un medio definido conteniendo entre 1-2% de la fuente carbonada
(Kennedy et al. 2005, Becking 2006)
Las especies del género Azotobacter se encuentran en diferentes condiciones
climáticas y generalmente en suelos ligeramente ácidos a alcalinos (Kennedy et al.
2005). También se ha reportado el aislamiento de Azotobacter de las hojas y otras
superficies vegetales. El pH tiene una gran influencia sobre la distribución de
Azotobacter en los suelos. Su presencia suele ser mayor en suelos con pH mayor a 6,5,
mientras que en suelos con pH menores de 6 no es común detectar a este género
bacteriano (Thompson y Skerman 1979, Kole et al. 1988, Martiniuk y Martiniuk 2003,
Becking 2006). Jensen (1965) analizando 264 suelos daneses, aisló Azotobacter spp. de
casi todos los suelos que poseían un pH por encima de 7,5. A. chroococcum es la
especie que se aísla más frecuentemente de los suelos, A. beijerinckii se encuentra
principalmente en suelos ligeramente ácidos, mientras que A. salinestris, una especie
dependiente de sodio para crecer, ha sido aislada de suelos levemente salinos de
Canadá, Egipto y Australia (Page y Shivprasad 1991, Kennedy et al. 2005). A. paspali
es la única especie que presenta una asociación que parece ser específica con Paspalum
notatum. El aislamiento de A. nigricans y A. armeniacus es poco frecuente, por ello
existe poca información sobre su distribución en los suelos (Kennedy et al. 2005,
Becking 2006).
La clasificación inequívoca de Azotobacter a nivel de especie es difícil de lograr si solo
se emplean métodos fenotípicos clásicos, debido a la variabilidad en las características
fenotípicas observada para distintas cepas de una misma especie (Aquilanti et al.
2004a). Por ello, los métodos genotípicos son los más adecuados para la identificación
de las especies de este género bacteriano. Varios de los métodos genotípicos empleados
para la caracterización e identificación de microorganismos están basados en la
amplificación de fragmentos específicos de ADN mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Algunos métodos se basan en la amplificación de numerosos
fragmentos distintos empleando cebadores arbitrarios o específicos, que luego se
separan en función de su tamaño, originando un patrón de bandas característico o
fingerprint. Ejemplos de estas técnicas son RAPD (Random Amplified Polymorphic
10
DNA) y rep-PCR (repetitive sequence based-PCR).
En la técnica de rep-PCR se emplean cebadores complementarios a secuencias
de ADN repetitivas, altamente conservadas, presentes en copias múltiples en la gran
mayoría de las bacterias gramnegativas y varias grampositivas (Versalovic et al. 1991,
1994). Tres familias de secuencias repetitivas, no relacionadas a nivel de secuencia de
ADN, fueron las más estudiadas: las secuencias REP (Repetitive Extragenic
Palindromes), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) y los elementos
BOX (Louws et al. 1994). Este tipo de secuencias repetitivas son transcriptas pero no
traducidas, tienen el potencial de formar estructuras secundarias del tipo horquillas y
podrían jugar un rol importante en la organización del genoma bacteriano. Dado que se
considera que la organización del genoma bacteriano es moldeada por la selección, la
distribución de las secuencias REP, ERIC y BOX podría ser un indicador de la
estructura y evolución del genoma bacteriano (Lupski y Weinstock 1992). Estas
secuencias están ubicadas en posiciones intergénicas alrededor de todo el cromosoma,
en ambas orientaciones, y sirven como sitios de unión para cebadores específicos
diseñados para amplificar los fragmentos de ADN ubicados entre los elementos
repetitivos. Luego, esos fragmentos de ADN se separan mediante electroforesis en
geles, generando un patrón de bandas específico. Esta técnica es especialmente útil para
identificar y diferenciar bacterias a nivel de subespecie o cepa, característica de
importancia para el análisis de la diversidad genotípica (Oda et al. 2002).
El gen ribosomal 16S (ADNr 16S) es uno de los más utilizados en estudios de filogenia
y taxonomía bacteriana. Es un gen altamente conservado, presentando regiones
homólogas a todos los organismos pero también regiones altamente variables, que
permiten la clasificación de las bacterias a nivel de género y especie (Rodicio y
Mendoza 2004). El análisis de secuencia del gen ribosomal 16S es uno de los métodos
más simples para la clasificación taxonómica de las bacterias. Una alternativa al análisis
de secuencia, es el análisis de restricción de este gen, que resulta especialmente útil en
estudios que involucran el análisis de un gran número de aislamientos. Esta última
metodología denominada ARDRA (Amplified ribosomal DNA restriction analysis)
(Heyndrickx et al. 1996), consiste en la amplificación por PCR del gen ribosomal 16S
completo empleando cebadores universales, y su posterior digestión con enzimas de
restricción. Los fragmentos resultantes son separados mediante electroforesis en geles y
luego el patrón obtenido es comparado y analizado empleando un programa informático
de análisis de patrones de bandas. Está técnica se utiliza generalmente para estudiar
diversidad e identificar aislamientos bacterianos a nivel de género o especie (Chenoll et
al. 2003), y es frecuentemente empleada como una alternativa frente a métodos más
laboriosos y caros. Aquilanti et al. (2004 a, b) determinaron cuales son las enzimas de
restricción más apropiadas para la identificación de cepas de los géneros Azotobacter y
Azomonas y su clasificación a nivel de especie empleando ARDRA.
Actualmente es escaso el conocimiento sobre la diversidad genética de
Azotobacter a nivel global (Bathia et al. 2009), y mucho menos es lo que se conoce de
la presencia y diversidad de Azotobacter en suelos argentinos. Trabajos como los de
Amor Asunción et al. (1983) y Vidal de Latina et al. (2009) citan el aislamiento de
Azotobacter de suelos de nuestro país. Sin embargo, en ninguno de los trabajos
publicados se ha hecho una identificación a nivel de cepa o especie y menos aún se han
empleado
técnicas
moleculares
para
su
caracterización.
11
OBJETIVOS
 Obtener aislamientos del género Azotobacter de suelos agrícolas y no agrícolas
de nuestro país.
 Caracterizar e identificar los aislamientos por técnicas de biología molecular y
analizar su diversidad.
HIPÓTESIS

Existe una gran diversidad genotípica de Azotobacter en suelos argentinos.
12
MATERIALES Y MÉTODOS
______________________________________________________________________
Aislamiento de Azotobacter.
Se analizaron un total de 84 muestras de suelos agrícolas y no agrícolas de
diferentes localidades de 11 provincias de Argentina: Buenos Aires, Entre Ríos,
Córdoba, Santa Fe, Santiago del Estero, Salta, Chubut, Río Negro, Neuquén, La Pampa
y Jujuy, recolectadas durante los años 2005 y 2006. Las muestras de suelos agrícolas se
tomaron de cultivos de trigo, maíz, girasol, soja y maní, así como de suelos sin
vegetación o con rastrojos. Las muestras de suelos no agrícolas se tomaron de pasturas
implantadas, praderas con especies naturalizadas, banquina de caminos y costas de
cursos de agua. La gran mayoría de las muestras fueron extraídas de los primeros 20 cm
del suelo, mientras que algunas fueron tomadas de mayores profundidades. Una
fracción de cada muestra fue enviada al Laboratorio del Instituto de Suelos del INTA
Castelar para la determinación de parámetros físico-químicos del suelo.
Para el aislamiento de Azotobacter a partir de las muestras de suelo, se
ensayaron varias técnicas de las numerosas citadas en la literatura (Pochon 1954, Brown
et al. 1962, Döbereiner et al. 1995, Kennedy et al. 2005, Becking 2006), con el objetivo
de establecer una metodología sencilla que permitiera obtener aislamientos exitosos de
Azotobacter spp. y redujera la posibilidad de errores en la selección de las colonias. Una
de las metodologías consistió en la siembra de diluciones decimales seriadas de
suspensiones del suelo en placas de Petri con tres medios de cultivo sin nitrógeno. Los
medios empleados fueron el medio de Brown (Brown et al. 1962) con glucosa como
fuente de carbono, el medio de Winogradsky con manitol como fuente de carbono
(Kennedy et al. 2005) y el medio LG que contiene sacarosa como fuente carbonada y
azul de bromotimol como indicador de pH (Döbereiner et al. 1995). Otro método
empleado fue el de la pasta de suelo, en el cual se mezclaron 30-50 g de suelo con
manitol (1% aproximadamente) en un mortero y luego se agregó agua hasta formar una
pasta, la cual se distribuyó en placas de Petri y se niveló con una espátula (Becking
2006). También se ensayó el método de la siembra de granos de suelo (Pochon 1954),
en el cual se tomó con una espátula una pequeña cantidad de suelo y se lo esparció
sobre placas con medio Burk (Kennedy et al. 2005) con manitol como fuente de C.
Luego de 3-5 días de incubación se observó el crecimiento de colonias en la superficie
de los medios empleados en los tres métodos y las colonias con características similares
a Azotobacter se repicaron en el mismo medio empleado para el aislamiento o en el
medio LG con el objetivo de purificarlas.
Preservación de los aislamientos.
La pureza de los cultivos se verificó a través de la tinción de Gram y
observación microscópica, y sucesivos repiques en medio TYG sólido (triptona,
extracto de levadura y glucosa 5 g.l-1 de cada uno) para verificar la ausencia de
contaminantes. Inicialmente, los cultivos obtenidos se guardaron a 4°C en tubos con
agar inclinado en el medio Burk. Al mismo tiempo, las colonias previamente crecidas en
medio agarizado se conservaron a -20°C y -70ºC en medio Burk suplementado con
glicerol al 50%, de manera similar a lo realizado con las cepas de rizobios y azospirilos
de las colecciones bacterianas del Laboratorio de Bacterias Promotoras del Crecimiento
Vegetal del Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMYZA), perteneciente al
13
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Sin embargo, luego de más de 4
meses de conservación con estas dos metodologías, muchos aislamientos no crecieron al
ser repicados a distintos medios agarizados en placas de Petri. La reactivación de la
mayoría de las cepas que no crecían de ese modo se logró al cultivarlas en medio
líquido. Debido a esta experiencia, la conservación a largo plazo de las cepas se realizó
de manera similar a la realizada en el Banco Nacional de Microorganismos (BNM),
INBA, Cátedra de Microbiología Agrícola–FAUBA, y se describe a continuación.
Los aislamientos puros se cultivaron en agitación en medio Burk líquido durante
48 h a 28 ºC. Posteriormente los cultivos se centrifugaron a 13000 rpm durante 12 min y
las células se suspendieron en medio Burk fresco suplementado con 30 % de glicerol, en
un volumen diez veces menor al del cultivo original. La suspensión resultante fue
distribuida en microtubos de 1,5 ml de capacidad y se conservaron en freezer a -70ºC.
Esta modificación permitió una conservación adecuada de las cepas para su uso
posterior en ensayos de esta tesis.
Caracterización genotípica de los aislamientos e identificación
La caracterización genotípica e identificación se llevó a cabo mediante las técnicas repPCR, ARDRA y el análisis de secuencia parcial del ADNr 16S. En las técnicas rep-PCR
y ARDRA se incluyó como cepa de referencia a A. chroococcum BNM272 (Banco
Nacional de Microorganismos, Argentina). En el ARDRA, se incluyeron además las
cepas A. vinelandii NRRL-B 14627, A. vinelandii NRRL-B 14641 y A. vinelandii
NRRL-B 14644 (Agricultural Research Service Culture Collection, USA).
rep-PCR
Todos los aislamientos se caracterizaron mediante rep-PCR con los cebadores
BOXA1R siguiendo el protocolo descripto por Versalovic et al. (1994). Para las
reacciones de amplificación, se resuspendió una colonia en agua milliQ estéril y se
utilizó 1 µl como fuente de DNA genómico. Las reacciones de PCR se hicieron en un
volumen total de 25 µl conteniendo: buffer Gitschier 1x, 2,5 µM de cebador, 1,25 mM
de cada dNTP, 2,5 U de Taq DNA polimerasa, DMSO 10% v/v, glicerol 5% v/v y 5 mM
de MgCl2. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador automático (MJ
Research PTC-100) con un ciclo de desnaturalización inicial de 7 minutos a 95ºC,
seguido de 30 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), annealing (53ºC, 1 min) y
extensión (65ºC, 8 min), y una extensión final a 65ºC por 16 min. Los productos de
reacción (6 µl) se separaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al
1,5% (20x24 cm) en buffer TBE 1x (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM y EDTA 20
mM, pH 8,3). La corrida electroforética se realizó a 5 V/cm a temperatura ambiente
durante 4,6 horas. En cada gel, en la calle central y en las de los extremos, se incluyó un
marcador de peso molecular (1Kb plus DNA Ladder, Invitrogen) como referencia. Las
bandas se revelaron sumergiendo los geles en una solución acuosa de bromuro de etidio
(0,6 µg/ml) por 30 minutos y luego se los lavó con agua milliQ por otros 30 minutos.
Los geles teñidos se observaron con un transiluminador de luz UV (Spectroline) y se
fotografiaron con el sistema de documentación Kodak EDAS120. Las imágenes
digitales de los fingerprints se normalizaron con los marcadores de peso molecular
utilizados como referencia, y se analizaron con el programa GelComparII (Applied
Maths, Kortrijk, Bélgica). El grado de similitud entre los perfiles genéticos se determinó
utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (r) y los dendrogramas se
14
construyeron utilizando el método de pares de grupos con media aritmética (UPGMA)
(Sneath y Sokal 1973, Häne et al. 1993).
Análisis de restricción del gen ribosomal 16S amplificado por PCR (ARDRA)
Las cepas representativas de cada grupo de rep-PCR se identificaron mediante ARDRA,
siguiendo la metodología descripta por Aquilanti et al. (2004 a). Para la amplificación
de los genes ribosomales 16S se emplearon los cebadores universales para eubacterias
fD1 y rD1. Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen de 50 µl conteniendo
buffer 1x (provisto con la enzima), 1,5 mM de MgCl2, 10% de DMSO, 0,3 µM de cada
cebador, 0,2 mM de cada dNTP, 1,25 U de Taq DNA polimerasa y 1 µl de suspensión
celular preparada de igual forma que en la técnica de rep-PCR. La amplificación incluyó
un ciclo inicial de desnaturalización de 5 min a 95ºC, seguido por 30 ciclos de
desnaturalización (94ºC, 1 min), annealing (60ºC, 40 seg) y extensión (72ºC, 2 min) y
una extensión final de 72ºC por 8 min. Los productos de PCR fueron digeridos con las
enzimas RsaI y HhaI. Las digestiones fueron llevadas a cabo por separado para cada
enzima en un volumen final de 20 µl que contenía 5 U de la enzima, buffer 1x (provisto
con la enzima), 0.1 mg.µl-1 de albúmina de suero bovina (BSA) y 10 µl del producto de
amplificación. Se incubó durante 2 h a 37ºC. Los productos de las digestiones se
analizaron en geles de agarosa de alta resolución al 2% (agarosa MetaPhor) de 10 cm de
largo, en buffer TBE 1x. La electroforesis se realizó a 5V/cm durante 2,5 h, incluyendo
en la calle central y en las de ambos extremos de cada gel, los marcadores de peso
molecular 50bp DNA Ladder y 100bp DNA Ladder (Promega). Los geles se tiñeron y
fotografiaron de igual manera que lo descripto para el análisis de rep-PCR. El grado de
similitud entre los perfiles se determinó utilizando el coeficiente de Dice y los
dendrogramas se construyeron utilizando el método de pares de grupos con media
aritmética (UPGMA) (Sneath y Sokal, 1973, Häne et al., 1993).
Los perfiles de restricción se compararon con aquellos publicados por Aquilanti et
al (2004a). Estos autores no incluyeron las especies A. salinestris y A. nigricans en su
trabajo, por lo tanto, los perfiles obtenidos fueron también comparados con los
generados por las restricción virtual con las enzimas RsaI y HhaI de las secuencias del
ADNr 16S de las cepas tipo de A. salinestris (ATCC 49674, Nº de acceso GeneBank
AB175656) y de A. nigricans (IAM 15005 Nº de acceso GeneBank AB175651),
disponibles en la base de datos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology
Information). Para ello, se empleó el programa Restriction Mapper versión 3
(http://www.restrictionmapper.org/).
Secuenciación parcial del ADNr 16S
Con el objetivo de confirmar la identificación de los aislamientos realizada por
ARDRA, una o más cepas de cada grupo fueron seleccionadas para la secuenciación
parcial del ADNr 16S. Además, en la selección de las cepas a secuenciar, se tuvo en
cuenta de incluir aquellas cepas que se emplearon en los ensayos de inoculación del
Capítulo 3. Se emplearon los cebadores universales Y1 e Y2 (Young et al. 1991) que
permiten amplificar un fragmento de aproximadamente 290 pb del gen ribosomal 16S.
La extracción del ADN se llevó a cabo a partir de cultivos líquidos de 24 h empleando
un kit comercial (Wizard Genomic DNA purification kit, Promega). La concentración
15
de ADN se ajustó a 50 ng.µl-1. La amplificación se llevó a cabo en un volumen de 25 µl
conteniendo Buffer 1x (provisto con la enzima), 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs,
0,4 mM de cada cebador, 2,5 U de Taq DNA polimerasa y 50 ng de ADN. Las
condiciones de amplificación consistieron en una desnaturalización inicial de 5 min a
95ºC, seguida por 30 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 min), annealing (69ºC, 40
seg) y extensión (72ºC, 1 min), y una extensión final a 72ºC durante 5 minutos.
El producto amplificado (3 µl) se analizó mediante electroforesis en geles de
agarosa al 1% (p/v) en TBE1x. El gel se tiñó con SYBR Safe DNA gel staining
(invitrogen) durante 30 min. Se incluyó un marcador de peso molecular 1Kb plus DNA
Ladder (Invitrogen). Los productos de PCR se purificaron utilizando un kit comercial
(QIA quick PCR purification kit), se ajustó su concentración a 15 ng.µl-1, y las muestras
fueron enviadas a la Unidad de Genómica del Instituto de Biotecnología del INTA
Castelar para su secuenciación. Las secuencias parciales del ADNr 16S de las cepas
nativas obtenidas se compararon con las secuencias depositadas en la base de datos
GenBank
empleando
el
programa
Basic
BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul et al, 1990) y se alinearon entre sí
con el programa ClustalX 2.0.11 (Thompson et al. 1997). Las secuencias obtenidas se
depositaron luego en la base de datos GenBank con sus correspondientes números de
acceso.
Caracterización microbiológica clásica
Se realizó la caracterización microbiológica clásica de 21 aislamientos
seleccionados en función del grado de similitud encontrado en el análisis de rep-PCR
Morfología y tamaño de las colonias
La morfología y tamaño de las colonias se determinó en cultivos sembrados en
placas de Petri con medio LG, luego de 6 días de incubación a 28 ºC. Al cabo de ese
tiempo se describió el diámetro, tamaño, forma, borde, elevación, superficie,
características físicas y estructura interna de las colonias, de acuerdo a los criterios
propuestos por Verna (1945).
Tinción de Gram
Se realizó la coloración según la técnica de Gram con la metodología de Hucker
(Doetsch 1981). Se emplearon cultivos bacterianos crecidos en medio Burk sólido y la
tinción se realizó luego de 2 días de incubación a 28ºC.
Movilidad
La movilidad se determinó en preparados húmedos a partir de un cultivo
bacteriano puro de 48 h de crecimiento en medio Burk líquido mediante su observación
en el microscopio óptico (Kennedy et al. 2005)
16
Producción de pigmentos
Para evaluar la producción de pigmentos se empleó la técnica descripta por
Kennedy et al. (2005). Se estriaron cultivos en placas de Petri conteniendo medio de
Norris y Jensen modificado por la omisión de FeSO4 y Na2MoO4 para favorecer la
producción de pigmentos. Las placas fueron examinadas con luz natural para la
visualización de pigmentos difusibles y bajo luz ultravioleta para pigmentos
fluorescentes.
Producción de quistes
Para inducir la formación de quistes, una característica diferencial del género
Azotobacter, los aislamientos se cultivaron en medio Burk con 0,3% de butanol como
única fuente de carbono (Socolofsky y Wyss 1961), durante 7 días a 28ºC. La presencia
de dichas estructuras se evaluó mediante tinción de Gram y observación con
microscopio óptico.
17
RESULTADOS
______________________________________________________________________
Con la siembra de diluciones seriadas en tres medios diferentes, todos sin
nitrógeno, se lograron obtener aislamientos con características macro y microscópicas
típicas del género Azotobacter, aunque también se observó el crecimiento de numerosos
tipos de colonias. Varias de estas colonias se asemejaron a las colonias típicas de
Azotobacter, sin embargo, al observarse al microscopio, la morfología celular de
algunas de ellas no era la típica del género. Además, la purificación se hacía muy
dificultosa y lenta requiriendo varios subcultivos. En el método de la pasta de suelo se
observó el crecimiento de colonias brillantes, algunas blancas y otras transparentes en la
superficie de la pasta. Partiendo de las colonias blancas, luego de dos o tres subcultivos
en el medio LG, se obtuvieron aislamientos con las características típicas de
Azotobacter, tanto macro como microscópicas. Por lo tanto, se consideró que esta
metodología, además de ser simple, era confiable para el aislamiento del género en
cuestión; sin embargo, se observó como desventaja el gran tiempo que demandaba dicha
metodología, la dificultad de regular la cantidad de agua a emplear para formar una
pasta y mantener un adecuado nivel de humedad en la placa durante la incubación.
Además, se necesita una muestra de suelo de tamaño considerable, a veces no
disponible. Por último, la siembra de los granos de suelo en un medio sin N y con
manitol como fuente de carbono resultó ser el método más simple y confiable para el
aislamiento de Azotobacter a partir de las muestras de suelo. La presencia de
Azotobacter se evidenciaba por el crecimiento de colonias mucosas, blancuzcas y
brillantes alrededor de algunas partículas de suelo. A partir de dichas colonias y luego
de dos a tres subcultivos en medio LG se lograron obtener cultivos puros del tipo de
Azotobacter. En función de estos resultados se decidió emplear como metodología
rutinaria para el aislamiento, la siembra de granos de suelo y el posterior subcultivo en
medio LG hasta obtener cultivos puros. Se seleccionaron las colonias de color amarillo,
en diferentes tonalidades, secas o mucosas y de diferentes formas y tamaños
desarrolladas en el medio LG. En todos los casos, al observar preparados de estas
colonias en el microscopio, se apreciaron células relativamente grandes y con las formas
típicas de Azotobacter. Además, en los primeros subcultivos en el medio LG fue común
observar además el crecimiento de pequeñas colonias transparentes y brillantes. Sin
embargo, en el microscopio se visualizaban células muy pequeñas, en forma de bastones
o cocos, gramnegativos o positivos, cuya morfología era muy diferente a la descripta
para el género Azotobacter y por lo tanto, estas colonias fueron descartadas.
En el cuadro 1 se presentan las 84 muestras de suelos empleadas para el
aislamiento de Azotobacter sp. Se logró el aislamiento y purificación de colonias con
características típicas del género Azotobacter de 31 de las 84 muestras de suelos,
obteniéndose un total de 39 aislamientos. Se analizaron 59 muestras de suelos agrícolas
y 25 muestras de suelos no agrícolas. En el 57% de las muestras de suelos no agrícolas
fue posible el aislamiento de bacterias del tipo Azotobacter, mientras que sólo en el 27%
de los suelos agrícolas se detectó la presencia de bacterias con características de dicho
género. Hubo ocho aislamientos (AT44, AT45, AT46, AT47, AT48, AT49, AT50 y AT51)
que no pudieron ser cultivados nuevamente luego de preservarlos, y por lo tanto no
fueron caracterizados.
Azotobacter se aisló de suelos muy diferentes entre sí tal como lo evidencian por
ejemplo, los valores de materia orgánica, pH, conductividad eléctrica y fósforo (Cuadro
1). En casi todas las muestras de suelos donde se logró el aislamiento de Azotobacter el
pH fue mayor a 6.Las excepciones fueron las muestras Nº38 (pH= 5,5) y la muestra
Nº47(pH=5,8).
18
Cuadro 1. Muestras de suelo empleadas para el aislamiento de Azotobacter. Las muestras fueron tomadas
entre 0-20 cm de profundidad, excepto en los sitios en los cuales se especifica entre paréntesis la profundidad
de muestreo. aAislamientos que no pudieron volver a ser cultivados luego de su conservación
Nº de
muestra
Sitio
muestreado
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Suelos agrícolas
Cultivo de maíz
Rastrojo de maíz
Cultivo de Soja
Cultivo de Trigo
Cultivo de girasol
Cultivo de avena
Cultivo de Trigo
Cultivo de trigo
Suelo desnudo
Cultivo de trigo
Cultivo de soja
Cultivo de soja (20-40cm)
Cultivo de soja (40-60 cm)
Cultivo de soja
Cultivo de soja (20-40 cm)
Cultivo de soja (40-60 cm)
Cultvo de girasol
Suelo desnudo
Rastrojo de trigo
Ubicación
(Provincia y localidad)
Buenos Aires (Azul)
Buenos Aires (Azul)
Buenos Aires (Colón)
Buenos Aires (Colón)
Buenos Aires (Tres Arroyos)
Buenos Aires (Necochea)
Buenos Aires (S. A. de Areco)
Buenos Aires (Orense)
Buenos Aires (Balcarce)
Buenos Aires (Tres Arroyos)
Buenos Aires (Chivilcoy)
Buenos Aires (Chivilcoy)
Buenos Aires (Chivilcoy)
Buenos Aires (Chivilcoy)
Buenos Aires (Chivilcoy)
Buenos Aires (Chivilcoy)
Buenos Aires (el Ciclón)
Buenos Aires (Echeverría)
Buenos Aires (Castelar)
Aislamientos
obtenidos
MO
(%)
pH
AT25
AT22
-
5,12
3,38
4,79
4,02
3,47
4,36
3,28
4,9
5,72
3,34
3,81
2,38
1,10
4,10
3,53
1,26
3,31
2,57
3,02
5,50
7,30
5,30
6,00
5,41
6,27
5,45
5,4
5,80
5,20
5,50
5,50
5,90
5,40
5,50
5,90
nd
5,69
5,62
CE
P
(mS/cm) (ppm)
0,15
0,48
0,88
1,35
0,79
0,20
0,80
0,75
1,21
0,22
0,33
0,26
0,43
0,39
0,26
0,30
nd
0,53
0,52
14,90
7,40
72,10
48,60
34,80
30,30
18,6
17,1
51,00
10,40
6,70
3,60
2,10
7,30
5,90
1,30
18,9
8,6
15,8
19
Cuadro 1. Continuación
Nº de
muestra
Sitio
muestreado
Ubicación
(Provincia y localidad)
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Cultivo de soja(0-30cm)
Cultivo de soja(30-60cm)
Cultivo de soja(60-200cm)
Cultivo de soja
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Cultivo de Soja
Cultivo de maní
Cultivo de trigo
Buenos Aires (Junín)
Buenos Aires (Junín)
Buenos Aires (Junín)
Córdoba (Villa Dolores)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Corral De Bustos)
Córdoba (Huinca Renancó)
Córdoba (Santa Eufemia)
Córdoba (Santa Eufemia)
34
Cultivo de soja
Córdoba (Bell Ville)
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
Cultivo de soja
Cultivo de trigo
Cultivo de trigo
Suelo desnudo
Cultivo de soja
Cultivo de soja (20-40cm)
Cultivo de soja (40-60 cm)
Cultivo de soja (0-20 cm)
Cultivo de soja (20-40 cm)
Cultivo de soja (40-60 cm)
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Córdoba (Bell Ville)
La Pampa (Gral Pico)
La Pampa (Paraná)
Entre Ríos (C. del Uruguay)
Santa Fe (Videla)
Santa Fe (Videla)
Santa Fe (Videla)
Santa Fe (Videla)
Santa Fe (Videla)
Santa Fe (Videla)
Santa Fe (Runciman)
Santa Fe (Runciman)
Aislamientos
obtenidos
MO
(%)
pH
CE
P
(mS/cm) (ppm)
a
AT50
AT33
AT32
AT36
-
2,07
0,86
0,12
1,76
3,10
2,90
3,00
2,86
3,12
3,48
3,15
1,34
2,16
3,57
6,1
7,35
8,92
7,66
5,81
6,00
5,93
6,20
6,13
6,08
6,06
6,33
5,1
5,53
0,42
0,32
0,33
0,34
0,68
0,55
0,63
0,57
0,69
0,63
0,52
0,4
1,21
0,72
3,4
2,1
3,1
34,2
24,10
11,30
21,10
7,40
10,10
11,60
11,1
31,6
41,7
31,3
-
2,02
6,13
0,65
16,5
AT46a
AT39
a
AT48
AT37
AT38
-
2,02
3,45
4,47
8,17
2,10
1,59
1,00
2,45
1,79
1,12
3,43
4,64
6,13
nd
7,00
5,.5
7,43
8,07
8,28
6,53
6,38
6,71
5,00
5,00
0,65
nd
0,93
1,5
0,54
1,04
0,94
0,75
0,28
0,46
1,26
1,45
16,5
42,2
13,50
16,6
7
3,10
3,00
18,00
6,40
5,3
33,50
67,00
20
Cuadro 1. Continuación
Nº de
muestra
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Ubicación
(Provincia y localidad)
Santa Fe(Amstrong)
Santa Fe (Amstrong)
Santa Fe (Amstrong)
Santa Fe (Amstrong)
Santa Fe (Oliveros)
Santa Fe (Venado Tuerto)
Santiago del Estero (Quimilí)
Santiago del Estero (Quimilí)
Santiago del Estero (Quimilí)
Salta (Embarcación)
57
58
59
60
61
Sitio
muestreado
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Cultivo de Soja
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Cultivo de soja
Cultivo soja
Suelos no agrícolas
Pastura de trébol
Costado de camino
Terreno urbano
Pastura de trébol rojo
Costado de laguna
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
Costado laguna
Pastura de Festuca
Pastura de Festuca
Pastura de Festuca
Pastura de Agropiro
Pastura de Agropiro
Banquina
Pastura de gramíneas
Pastura de gramíneas
Pastura de gramíneas
Pradera natural
Pradera natural
Buenos Aires (Mar chiquita)
Buenos Aires (Bordenave)
Buenos Aires (Bordenave)
Buenos Aires (Bordenave)
Buenos Aires (Bordenave)
Buenos Aires (Bordenave)
Buenos Aires (necochea)
Santa Fe (Runciman)
Santa Fe (Runciman)
Santa Fe (Runciman)
Chubut (Pto Mdryn)
Chubut (Gaiman)
Buenos Aires (Arrecifes)
Buenos Aires (Sta. Clara del Mar )
Buenos Aires (Sta. Clara del Mar )
Buenos Aires (Vedia)
Buenos Aires (Mar chiquita)
Aislamientos
obtenidos
a
AT49
AT16, AT1, AT2
AT17, AT18
AT19
MO
(%)
3,45
3,36
3,41
3,45
1,88
3,74
2,84
3,10
2,78
1,78
AT9
AT4,AT5
AT30
4,36
5,72
0,98
2,95
1,86
AT31
a
AT44
a
AT51
a
AT45
a
AT47
AT42
AT28
pH
5,8
6,00
6,00
6,10
5,63
6,07
7,03
7,17
7,16
6,40
CE
(mS/cm)
0,39
0,71
0,67
0,39
0,51
0,44
nd
nd
nd
0,21
P
(ppm)
52,1
101,4
76,1
40,20
12,1
35,80
125,70
127,80
104,20
48,80
4,70
7,83
8,45
5,50
8,20
0,53
0,80
0,48
0,29
0,43
29,70
8,50
8,50
15,00
1,90
1,05 8,00
2,31 7,.20
2,79 6,57
3,38 6,99
5,00 6,54
6,79 6,40
7,07 6,05
1,.57 8,21
4,55
nd
4,24
nd
1,09 7,5
3,15 8,3
1,45
0,12
0,16
0,17
0,23
0,24
0,22
2,46
nd
nd
0,48
0,66
7,70
22,00
21,60
11,10
12,90
11,40
146,40
226,2
72,2
79,4
7,4
45,8
21
Cuadro 1. Continuación
Nº de
muestra
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
Sitio
muestreado
Orilla de río
Orilla de Río
Pradera natural
Costa de Arroyo
Costa de arroyo.
Pradera natural
Pradera natural
Banquina camino
Pradera natural
Campo natural (sierra)
Campo natural (valle)
Ubicación
(Provincia y localidad)
Chubut (Villa Ameghino)
Chubut (Trevelín)
Chubut (Esquel)
Neuquén (Villa La Angostura)
Río Negro(Gutiérrez)
Río Negro(Gutiérrez)
Salta (J.V.González)
Jujuy (Tilcara)
Jujuy (Tilcara)
Córdoba (V. Gral. Belgrano)
Córdoba (La Cumbrecita)
Aislamientos
obtenidos
AT29
AT43
AT24
AT14
AT10, AT11, AT12, AT13
AT26, AT27
MO
(%)
2,81
1.02
2,74
1,79
8,03
2,74
1,64
0,19
0,19
nd
nd
pH
7,7
6.60
6,40
6,20
6,20
5,40
7,80
8,77
8,77
nd
nd
CE
(mS/cm)
1,5
1.58
0,49
1,51
nd
1,48
2,24
0,28
0,28
nd
nd
P
(ppm)
43,5
8.10
40,40
17,50
45,50
1,00
3,00
4,80
4,80
nd
nd
22
Caracterización genotípica e identificación de los aislamientos
rep-PCR
Para evaluar la diversidad entre las cepas aisladas se realizó una caracterización
genotípica inicial mediante rep-PCR. Los perfiles genéticos obtenidos y el análisis de
agrupamiento se muestran en la Figura 1. La mayoría de los aislamientos presentaron
perfiles de rep-PCR característicos, por lo que pueden considerarse cepas distintas. Se
obtuvieron 23 cepas diferentes, (r<90%), 5 representadas por más de un aislamiento. En
su mayoría, estos aislamientos fueron obtenidos de diferentes sitios de muestreo de una
misma localidad y podrían considerarse cepas hermanas, como es el caso de los
aislamientos AT32 y AT33 aislados de dos sitios muestreados de un mismo
establecimiento agropecuario y los aislamientos AT5 y AT9, aislados de dos sitios
diferentes de Santa Clara del Mar. Un caso particular es el de los aislamientos AT4 y
AT27 que tienen dos orígenes muy distantes entre sí, como Jujuy y Buenos Aires, pero
sin embargo presentaron perfiles de rep-PCR muy similares que indican una estrecha
relación genética.
A un nivel de similitud del 55% pueden definirse 5 grupos que incluyen a todas las
cepas aisladas menos a la cepa AT10, que ocupa una posición separada. La cepa A.
chroococcum BNM272 utilizada como referencia conforma el grupo I, el cual incluye al
48% de los aislamientos que fueron obtenidos de suelos de las provincias de Buenos
Aires, Entre Ríos, Jujuy y Chubut. El grupo II agrupa a los tres aislamientos
provenientes de diferentes muestras de un suelo agrícola de Córdoba (AT32, AT33 y
AT36) y el grupo III comprende a cinco aislamientos obtenidos de dos muestras de un
suelo de Santiago del Estero con perfiles muy similares, (AT1, AT2, AT16, AT17, AT18)
y a dos aislamientos de dos localidades de Salta (AT14 y AT19). El grupo IV está
conformado por dos aislamientos de dos muestras de distintas localidades de la
provincia de Chubut (AT42 de Puerto Madryn y AT29 de Villa Ameghino), mientras que
el grupo V agrupa a un aislamiento de un suelo de Jujuy, y dos aislamientos a dos
profundidades diferentes de un mismo suelo de Santa Fe (AT37 y AT38).
23
Figura 1. Dendrograma (Pearson/UPGMA) del análisis de los perfiles de
rep-PCR con los cebadores BOXA1R de los aislamientos obtenidos de
diferentes suelos.
24
ARDRA
Se realizó la identificación taxonómica de los aislamientos a nivel de género y especie
mediante el análisis de restricción del gen ribosomal 16S (ARDRA). Solo se analizaron
cepas representativas de todos los aislamientos, incluyendo una o más cepas de cada
grupo de rep-PCR. Las cepas seleccionadas fueron: AT4, AT9, AT10, AT12, AT14,
AT18, AT19, AT25, AT27, AT28, AT29, AT30, AT31, AT33, AT37, AT38, AT42 y AT43.
Este criterio fue adoptado debido a que existe una alta correlación entre los
agrupamientos que se obtienen con las técnicas de rep-PCR y los valores de homología
DNA-DNA (Rademaker et al. 2000), el criterio principal para el delineamiento de
especies en bacteriología.
El análisis de restricción con la enzima RsaI generó un único patrón de bandas en todos
los aislamientos analizados, coincidente con el de la cepa de referencia A. chrooccocum
BNM272 (datos no mostrados). Este perfil de restricción de 5 bandas es característico
del género Azotobacter y también de la especie Azomonas macrocytogenes. En el
análisis con la enzima HhaI se obtuvieron 5 perfiles diferentes, los cuales según el
análisis de agrupamiento (Dice/UPGMA) pueden dividirse en 4 grupos principales
definidos a un nivel de similitud mayor al 80% (Figura 2). Las cepas del grupo I
presentaron un perfil idéntico al de la cepa BNM272, característico de la especie A.
chroococcum. La cepa AT33 presentó un perfil de bandas característico de la especie A.
armeniacus. El grupo IV quedó conformado por las cepas de referencia de A.vinelandii,
las cuales presentaron el perfil de restricción esperado para la especie. En el grupo III se
incluyen tres perfiles muy similares entre sí, pero ninguno coincidió con los publicados
por Aquilanti et al. (2004a, b). Por lo tanto dichos perfiles fueron comparados con el
perfil generado con la restricción virtual de las cepas tipo de A. nigricans y A.
salinestris, especies que Aquilanti et al. (2004a, b) no incluyeron en sus trabajos.
25
Figura 2. Dendrograma (Dice/UPGMA) basado en el análisis de los
patrones de restricción obtenidos con HhaI del ADNr 16S de las
cepas seleccionadas. Los grupos se definieron a SD>80 %.
Los tamaños de los fragmentos obtenidos en el ARDRA con la enzima HhaI de las
cepas del grupo III (AT10, AT12, AT14, AT18, AT19, AT29, AT37, AT38, AT42) son
similares a los generados en la restricción virtual del ADNr 16S de la cepa A. salinestris
ATCC 49674, por lo cual podrían ser asignadas a la especie A. salinestris.
Secuenciación parcial del gen ribosomal 16S
Las secuencias parciales del gen ribosomal 16S obtenidas (290 pb aprox.) se
depositaron en la base de datos GenBank bajo los siguientes números de acceso: AT18:
HQ541448; AT19: HQ591467; AT25: HQ623180; AT31:HQ623181; AT33:
HQ623182; AT37: HQ62378 y AT42: HQ623179.
Cuando se alinearon las secuencias parciales del gen ARNr16S de las cepas del
grupo I, AT25 y AT31, presentaron un 99% de identidad de secuencia entre ellas. Las
26
secuencias parciales del ADNr 16S de las cepas AT18, AT19 y AT42 del grupo II
resultaron idénticas entre sí según lo observado en el alineamiento de las mismas. La
secuencia de la cepa AT37, también del grupo II, tuvo un 99 % de identidad con las
mismas.
Las secuencias parciales del ADNr 16S obtenidas fueron comparadas con las
secuencias de nucleótidos depositadas en el GenBank. Las cepas AT25 y AT31
presentaron 100% y 99% de identidad de secuencia, respectivamente, con A.
chroococcum. Las cepas AT18, AT19 y AT42 mostraron una identidad de secuencia del
100 % y la cepa AT37 del 99 %, con la cepa tipo de A. salinestris. La cepa AT33 tuvo un
99 % de identidad de secuencia con las especies A. nigricans y A. armeniacus. Sin
embargo, en base a los resultados obtenidos en el ARDRA, se decidió clasificar a la
cepa AT33 como A. armeniacus. Además, A. nigricans es una especie con células no
móviles (Thompson y Skerman 1979), y la cepa AT33, al igual que el resto de los
aislamientos caracterizados en este trabajo, evidenció tener movilidad (ver apartado
sobre movilidad más adelante)
Según los resultados de los análisis del rep-PCR, ARDRA y de la secuenciación
parcial el gen ribosomal 16S, pueden clasificarse a los 15 aislamientos del grupo I del
rep-PCR como A. chroococcum, los 13 aislamientos incluidos en los grupos III, IV y V
como A. salinestris y los 3 aislamientos del grupo III como A. armeniacus (Figuras 1 y
2).
Caracterización microbiológica clásica
Para esta caracterización se seleccionaron uno o más aislamientos de cada grupo
de rep-PCR como representativas. Los aislamientos elegidos fueron: AT4, AT9, AT10,
AT11, AT12, AT13, AT14, AT18, AT19, AT22, AT25, AT28, AT29, AT30, AT31, AT33,
AT36, AT37, AT38, AT39, AT42.
Morfología y tamaño de las colonias
Luego de una semana de incubación, las 21 cepas evaluadas produjeron colonias
amarillas con diferentes tonalidades, de forma circular a irregular, la mayoría brillantes,
mucosas, con bordes y superficies lisos. El diámetro de las colonias varió entre 1 a 8
mm. Las cepas AT10 y AT42 formaron colonias particularmente opacas y secas,
mientras que por otro lado la cepa AT36 produjo colonias muy mucosas. (Cuadro3,
Figura3). La mayoría de los aislamientos identificados como A. salinestris presentaron
colonias relativamente secas en relación a los aislamientos de las otras dos especies, con
excepción de las cepas AT37 y AT38.
27
Cuadro 2. Morfología de las colonias de los aislamientos de Azotobacter crecidas en medio
LG luego de 7 días.
Especie
Tamaño
Forma
AT4
ACa
Medianod
Circular
Liso
Cabezuela
Lisa
AT9
AC
Grandec
Circular
Liso
Cabezuela
Lisa
Pequeñoe
Lobado
Esparcida
Lisa
Grande
Circular
o
irregular
Circular
Liso
Pulvinada
Lisa
AT12 AS
Mediano
Circular
Liso o
lobado
Esparcida
Lisa
AT13 AC
Mediano
Circular
Liso
Esparcida
o
pulvinada
Lisa
AT14 AS
Mediano
Lobado
Esparcida
Rugosa
AT18 AS
Pequeño
Lobado
Esparcida
Lisa
AT19 AS
Mediano
Lobado
Esparcida
Rugosa
AT22 AC
Mediano
Circular
o
irregular
Circular
o
irregular
Circular
o
irregular
Circular
Lobado
Pulvinada
Lisa
AT25 AC
Grande
Circular
o
irregular
Ondulado
Esparcida
Lisa
AT10 ASb
AT11
a
AC
Borde
Elevación
Sup.f
Cepa
Características
físicas
Amarilla,
brillante,
mucosa
Amarilla,
brillante,
mucosa
Amarilla, borde
más oscuro,
mate, seca
Amarilla,
brillante,
mucosa
Amarilla, borde
más claro,
brillante
Amarilla, borde
más claro,
brillante,
mucosa
Amarilla, borde
más claro,
semi-mate
Amarilla,
brillante, seca
Amarilla,l borde
más claro,
semi-mate
Amarilla,
brillante,
mucosa
Amarilla, mate
AA: A. chroococcum, b AS: A. salinestris, cAA: A. armeniacus. cGrande: 6-8 mm de
diámetro.; d mediano: 4-6 mm de diámetro, e Pequeño: 1-4 mm de diámetro. f Sup:
Superficie. gEI: Estructura interna, hhomogénea, iheterogénea.
EIg
Hom.h
Hom
Hom
Hom
Hom
Hom
Heti
Hom
Hom
Het
Hom
28
Cuadro 2. Continuación
Cepa
Especie Tamaño
AT28 AC
Grande
AT29 AC
Pequeño
AT30 AC
Mediano
AT31 AC
Forma
Borde
Circular Liso
o
irregular
Circular Liso
Elevación Sup.f Características EIg
físicas
Esparcida Lisa Amarilla
Het
brillante,
aguachenta
Elevada
Lisa Amarilla,
Hom
brillante
Esparcida
Lisa
Mediano
Circular Lobado
o
irregular
Circular Liso
Convexa
Lisa
c
AT33 AA
Mediano
Circular
Liso
Pulvinada
Lisa
AT36 AA
Grande
Circular
Liso
Elevada
Lisa
AT37 AS
Grande
Circular
Liso
Esparcida
Lisa
AT38 AS
Grande
Circular Liso
o
irregular
Esparcida
Lisa
AT39 AC
Pequeño
Circular
Esparcida
Lisa
AT42 AS
Mediano
Circular Ondulado Esparcida
o
irregular
Lisa
Liso
Amarilla
brillante,
mucosa
Amarilla,
brillante,
mucosa
Amarilla, borde
más claro,
brillante,
mucosa
Amarilla,
borde más claro
, brillante,
mucosa
Amarillo
intenso,
brillante,
mucosa
Amarillo
intenso,
brillante,
mucosa
Amarilla,
semi-mate
Amarilla, mate,
seca
Hom
Hom
Hom
Hom
Hom
Hom
Hom
Hom
.a AA: A. chroococcum, b AS: A. salinestris, cAA: A. armeniacus. cGrande: 6-8 mm de
diámetro.; d mediano: 4-6 mm de diámetro, e Pequeño: 1-4 mm de diámetro. f Sup:
Superficie. gEI: Estructura interna, hhomogénea, iheterogénea.
29
AT9
AT10
AT
AT12
AT14
AT22
AT25
AT28
8
AT29
AT31
AT37
AT39
AT42
Figura 3. Colonias de aislamientos Azotobacter sp. desarrolladas en medio LG
luego de 7 días de crecimiento.
30
Tinción de Gram
Las 21 cepas resultaron gramnegativas. En la mayoría de las cepas se presentaron tres
tipos diferentes de morfologías celulares en el mismo preparado: bacilos rectos con
bordes redondeados, bacilo ovoides y en menor proporción, cocos (Figura 4). Los
bacilos se ubicaban solos o de a pares y en algunas cepas se evidenció la formación de
cadenas (cepas AT4, AT13, AT14, AT29 y AT33). Las cepas AT4, AT11 y AT9 poseían
bacilos relativamente grandes respecto al resto, por el contrario las cepas AT10 y AT19
presentaron bacilos más pequeños.
AT10
AT4
10 µm
AT25
AT19
Figura 4. Tinción de Gram observada con microscopio óptico de cultivos puros
de cepas Azotobacter sp. luego de 48 h de crecimiento en medio LG sólido. La
barra de escala 10 µm se aplica a todas las fotos.
Movilidad
Se observó movilidad en todas las cepas.
31
Producción de pigmentos difusibles
No se observó la formación de pigmentos difusibles ni fluorescentes en ninguna de las
cepas evaluadas. Todas las cepas produjeron pigmentos no difusibles color marrón cuya
intensidad aumentaba a medida que envejecía el cultivo, característica común en el
género Azotobacter (Becking 2006, Kennedy et al. 2005, Thompson y Skerman, 1979).
Las cepas AT12, AT18 y AT28 presentaron un color particularmente claro (Figura 5)
AT10
AT12
AT18
AT19
AT22
AT28
AT29
AT30
AT31
AT33
AT36
AT37
Figura 5. Producción de pigmentos no difusibles de cepas de Azotobacter sp. en
medio de Norris y Jensen luego de 10 días.
32
Producción de quistes
Todos los aislamientos analizados presentaron formación de quistes en medio con
butanol. La formación de quistes es una característica fenotípica que permite diferenciar
Azotobacter de Azomonas, género taxonómicamente relacionado. En la Figura 6 se
muestran los quistes formados por cuatro cepas.
AT9
AT13
5 µm
5 µm
a
)
AT19
b
)
AT30
5 µm
5 µm
c)
d
)
Figura 6. Tinciones de Gram observadas con microscopio óptico de los quistes
producidos por cepas de Azotobacter sp. luego de 7 días de incubación en medio
Burk con 0,3% de butanol como fuente de carbono. Barra de escala, 5 µm.
33
DISCUSIÓN
______________________________________________________________________
El análisis del rep-PCR permitió evidenciar una notable diversidad entre los
aislamientos de Azotobacter analizados lo cual confirma la hipótesis planteada El medio
LG resultó ser muy útil para la identificación preliminar de los aislamientos del género
Azotobacter ya que la totalidad de los aislamientos clasificados preliminarmente como
Azotobacter sp. en base a las características morfológicas de sus colonias, fueron luego
confirmados como pertenecientes al género mediante las técnicas moleculares
empleadas. Estos resultados concuerdan con lo informado por Aquilanti et al. (2004a)
quienes empleando el mismo medio para aislar Azotobacter y Azomonas de suelos de
Italia y utilizando ARDRA para confirmar sus resultados preliminares, determinaron
que 40 de los 49 aislamientos pertenecían a dichos géneros.
La falta de aislamientos de cepas de Azotobacter en suelos de pH menor a 6
coindice con lo informado en otros estudios sobre la distribución de este género
principalmente en suelos de pH neutro a alcalino (Kole et al. 1988, Martiniuk y
Martiniuk 2003, Barnes et al. 2007).
A. chroococcum es la especie del género Azotobacter aislada más
frecuentemente de los suelos (Aquilanti et al. 2004a, Kennedy et al. 2005, Tejera y
Lluch 2005,). Los resultados obtenidos en este trabajo concuerdan con esto ya que esta
especie estuvo representada por el 48 % de los aislamientos. Sin embargo, además de
esta especie, se aislaron varias cepas de A. salinestris y 2 cepas de A. armeniacus. La
importancia de este resultado radica en la baja frecuencia de aislamientos de esta
especie. Prácticamente no existen reportes del aislamiento de A. armeniacus, más allá
de cuatro aislamientos de suelos de Armenia, sobre la base de los cuales fue propuesto
A. armeniacus como una nueva especie (Thompson y Skerman, 1979).
Si bien el objetivo de este trabajo no fue estudiar la ecología de Azotobacter en
los suelos analizados, es posible hacer algunas consideraciones al respecto. Se detectó la
presencia de Azotobacter spp. en 37 % de las 84 muestras analizadas, las cuales
correspondieron a diferentes suelos de la Argentina. Además, se encontró un gran
contraste entre el menor porcentaje deAzotobacter en suelos agrícolas (27%) comparado
al mayor porcentaje en los suelos no agrícolas (57%). Desafortunadamente, estos
resultados no pueden ser comparados con los informados en la literatura ya que Kole et
al. (1988) aisló Azotobacter del 89 % de 202 muestras de suelo estudiadas, tomadas en
su mayoría de suelos del este de Canadá, mientras que Martiniuk y Martiniuk (2003)
estudiaron la distribución de Azotobacter en 31 suelos polacos, y detectaron su
presencia en el 50% de los suelos, sin embargo, en ninguno de esos trabajos se informó
el uso de esos suelos. Hace muchos años, numerosos estudios sugirieron que
Azotobacter podía ser usado como un indicador de deficiencias de diferentes nutrientes
del suelo (Zemiecka 1932, Jones 1932, Halversen y Hoge, 1941). Sin embargo, el
empleo de dicho método fue criticado por varios autores dada su baja reproducibilidad y
poca practicidad. (Fuller y Hanks, 1982). Dado estos antecedentes, podría ser que la
ausencia de Azotobacter en algunas de las muestras de suelos agrícolas se deba a niveles
relativamente bajos de algún nutriente.
No se encontró ningún rasgo fenotípico, de los evaluados en la caracterización
microbiológica clásica, que se pueda asociar de manera clara a alguna de las especies
definidas en este trabajo. La morfología celular observada en todos los aislamientos
analizados es coincidente con la descripta en la bibliografía (Thompson y Skerman
1979,
Kennedy
et
al.
2005,
Becking
2006).
33
CAPÍTULO 2: “EVALUACIÓN IN VITRO DE CARACTERÍSTICAS DE
AZOTOBACTER
RELACIONADAS
CON
LA
PROMOCIÓN
DEL
CRECIMIENTO VEGETAL”
______________________________________________________________________
35
37
INTRODUCCIÓN
______________________________________________________________________
La producción de hormonas y sideróforos, la solubilización de fosfatos y la fijación
biológica de nitrógeno, son los principales mecanismos que se han asociado con la
estimulación del crecimiento producida por Azotobacter en las plantas (Kumar y Narula
1999, Mrkovacki y Milic 2001, Behl 2006). No obstante, son pocos los trabajos en los
que realmente se ha demostrado de manera fehaciente que algunas de las cualidades
mencionadas son responsables de las respuestas positivas observadas en las plantas
inoculadas.
Producción de fitohormonas
Algunos trabajos, la mayoría publicados hace más de 20 años, han sugerido que
la producción de fitohormonas por Azotobacter podría estar implicada en la respuesta
observada en los vegetales (Jackson et al. 1964, Azcón y Barea 1975, Nieto y
Frankenberger 1990). Por ejemplo, Nieto y Frankenberger (1990 y 1991) demostraron
que la adición de dos precursores de citoquininas junto con la inoculación con una cepa
de A. chroococcum productora de citoquininas, incrementó el rendimiento y el
crecimiento de rábano y maíz en comparación con la aplicación de los precursores o de
la bacteria por separado. González-López et al. (1986), reportaron que la cepa A.
vinelandii ATCC12837 produce auxinas, giberelinas y citoquininas en medio
químicamente definido. Azcón y Barea (1975) detectaron auxinas, citoquininas y
giberelinas en los sobrenadantes de una cepa de A. beijerinckii y otra de A.
chroococcum. Por su parte, Brown y Burlingham (1968) informaron la producción de
ácido giberélico en una cepa de A. chroococcum. En los tres trabajos mencionados las
determinaciones se hicieron por cromatografía en papel y bioensayos mientras que,
Nieto y Frankenberger (1989) detectaron la producción de citoquininas en
sobrenadantes de cultivos de A. chroococcum, A. beijerinckii y A. vinelandii empleando
HPLC. Hasta el momento no existen trabajos publicados en los cuales se haya
determinado la producción de citoquininas y giberelinas por parte de Azotobacter a
través de metodologías más confiables y precisas como cromatografía gaseosa o líquida
acoplada a espectrometría de masa.
Auxinas
El ácido 3-indolacético (AIA) es la principal auxina de las plantas y es una de las
fitohormonas de mayor relevancia dado que regula muchos aspectos del crecimiento y
desarrollo vegetal como la división, elongación y diferenciación celular (Zaho 2010).
En algunas PGPR se ha demostrado que la síntesis de AIA bacteriano estimula el
crecimiento de las plantas (Xie et al. 1996, Dobbelaere et al. 1999, Idris et al. 2007,
Patten y Glick 2002). Por ejemplo, la inoculación con una mutante de Pseudomonas
putida de reducida capacidad de producción de auxinas, mostró una menor capacidad de
estimular el desarrollo de la raíz de colza canola en relación a la cepa salvaje (Patten y
Glick, 2002).
El AIA puede ser sintetizado por una o más rutas biosintéticas, tanto en plantas
como en bacterias. El aminoácido triptófano es el principal precursor en las vías de
síntesis del AIA y se han descripto 5 vías de síntesis de AIA bacteriano que emplean al
triptófano como precursor (Baca y Elmerich 2007). También existen rutas de síntesis de
38
AIA que no requieren del triptófano como precursor, por ejemplo en Azospirillum
brasilense se han descripto tres vías de síntesis de AIA, dos dependientes de triptófano y
una que no lo es. Una de las vías dependientes de triptófano, la vía del acido-3indolpirúvico (AIP) es considerada la vía más importante en Azospirillum y en otras
bacterias PGPR (Spaepen et al. 2007, Dodd et al. 2010). La enzima clave de esta vía es
la ácido 3-indolpirúvico descarboxilasa. Un mutante con el gen inactivado para la
síntesis de esta enzima (gen ipdC), produce sólo el 10% del AIA producido por una cepa
salvaje de A. brasilense (Van de Broeck et al. 2005). Similares resultados se obtuvieron
con mutantes en Bacillus amyloliquefaciens (Idris et al. 2007). Hasta el momento no se
han aislado u obtenido mutantes de Azotobacter sp. con capacidad alterada en la
producción de auxinas, que permitan establecer cuál es la ruta principal para la
biosíntesis de AIA.
En varios trabajos se ha estimado la capacidad de Azotobacter sp. y de otros
géneros bacterianos de producir auxinas con el reactivo de Salkowsky (Ahmad et al.
2005b, Zahir et al. 2005, Ahmad et al. 2008). Es un método colorimétrico simple,
rápido, económico y ampliamente empleado para estimar la producción in vitro de
auxinas (Dodd et al. 2010). Este reactivo no sólo detecta AIA, sino también ácido
indolpirúvico e indolacetamida, por lo que debe tenerse en cuenta al interpretar los datos
obtenidos en las determinaciones (Glickman y Dessaux, 1995). Por ello, es conveniente
confirmar la producción de auxinas con métodos más específicos como la cromatografía
líquida a alta presión (HPLC) o la cromatografía gaseosa (GC) o líquida (LC), acoplada
a espectrometría de masa (MS).
Producción de sideróforos
A pesar de la abundancia del hierro en los suelos, su disponibilidad para los
microorganismos y las plantas es muy baja dado que se encuentra presente en formas
minerales difíciles de solubilizar. Por esta razón, la mayoría de los microorganismos han
desarrollado sistemas específicos de adquisición de hierro basados en el empleo de
sustancias quelantes de bajo peso molecular, llamados sideróforos (Kraepiel et al.
2009). Los sideróforos son secretados al ambiente, capturan los iones férricos y luego el
complejo sideróforo-Fe+3 es absorbido por las células bacterianas tras un
reconocimiento específico llevado a cabo por proteínas de membrana (Hofte y Baker
2007). La adquisición de hierro mediada por sideróforos juega un rol fundamental en la
habilidad de los microorganismos para colonizar las raíces e interviene en las
interacciones que se establecen entre los microorganismos en la rizósfera. La
competencia por hierro a través de la producción de sideróforos es uno de los
mecanismos observado en algunas bacterias capaces de controlar patógenos del suelo
(Lugtenberg y Kamilova 2009). Además, la producción de sideróforos por bacterias
colonizadoras de la raíz puede desencadenar también una mejora del sistema de defensa
de la planta de manera sistémica, fenómeno denominado resistencia sistémica inducida
(ISR) (Hofte y Baker 2007). A pesar del gran número de trabajos sobre el tema, no está
claro aún si los sideróforos microbianos pueden ser empleados por los vegetales como
fuente significativa de hierro para su nutrición (Crowles 2006, Dobbelaere et al. 2003).
Los sideróforos producidos por al menos tres especies del género Azotobacter,
A. crhoococcum, A. vinelandii y A. salinestris se han identificado desde el punto de
vista estructural y funcional (Kennedy et al. 2005). Recientemente se han publicado
trabajos en los cuales se estudió la capacidad de los sideróforos de A. vinelandii para
ligarse con Mo y V, cofactores de la enzima nitrogenasa (Kraepiel et al. 2009, Wichard
39
et al. 2009). A bajas concentraciones de Mo, V o Fe, los complejos formados entre estos
elementos y los sideróforos son absorbidos por la bacteria. A altas concentraciones de
Mo o V, casi en el umbral de toxicidad, la producción de sideróforos se incrementa
notablemente acomplejando estos elementos, mientras que el sistema de transporte al
interior de la célula se inactiva. La producción de sideróforos en esta situación podría
considerarse como un mecanismo de detoxificación (Wichard et al. 2009, Bellenger
2008).
Solubilización de fosfatos
El fósforo es uno de los principales nutrientes que limitan el crecimiento de las
plantas. Una gran proporción del fósforo del suelo se encuentra bajo formas insolubles y
por lo tanto, no disponible para las plantas (Rodríguez et al. 2007). Ciertos
microorganismos del suelo tienen la capacidad de convertir el fósforo insoluble en el
suelo a formas solubles y asimilables por los vegetales a través de la mineralización de
fosfatos orgánicos o de la solubilización de fosfatos inorgánicos. En trabajos donde se
observó la promoción del crecimiento vegetal al inocular con cepas de Azotobacter
capaces de solubilizar fosfatos, no fue posible asociar inequívocamente esa cualidad con
el efecto positivo sobre la planta. Por un lado porque la solubilización de fósforo in vitro
no está necesariamente asociada a la capacidad de promover el crecimiento vegetal, tal
como lo demostraron Collavino et al. (2010) con aislamientos de diferentes especies
bacterianas. Y por otro lado, porque además de solubilizar fosfatos las cepas de
Azotobacter también exhibían otros mecanismos de promoción del crecimiento (Narula
et al. 2000). Por lo tanto, los efectos positivos de la inoculación sobre la absorción de
nitrógeno, fósforo y potasio y la producción de biomasa radical respecto a los controles
sin inocular no pudieron adjudicarse a una propiedad microbiana en particular. Sin
embargo, con otros géneros bacterianos fue posible demostrar el rol importante de la
solubilización microbiana de fosfatos en la promoción del crecimiento vegetal. Lifshitz
et al. (1987) observaron que al inocular semillas de canola con una cepa de
Pseudomonas putida, de reconocida capacidad solubilizadora de fósforo, se incrementó
la absorción de fósforo marcado (32P) y además, se estimuló la elongación del tallo de
plántulas crecidas en un suelo estéril. Por lo tanto, sería posible estimular el crecimiento
vegetal a través de la inoculación con cepas bacterianas solubilizadoras de fósforo que
posibiliten un aumento en la disponibilidad y absorción de este elemento por las plantas.
Fijación biológica de nitrógeno
Inicialmente la fijación de nitrógeno fue considerada el principal mecanismo por
el cual Azotobacter estimulaba el crecimiento de las plantas. El incremento en el
contenido de N en las plantas inoculadas, así como la reducción en la necesidad de
aplicación de fertilizantes nitrogenados son considerados frecuentemente evidencia de
este mecanismo (Verma et al. 2010) Sin embargo, los pocos estudios realizados con 15N
no pudieron demostrar que Azotobacter aporte N fijado a las plantas de sorgo y moha
inoculadas (Behl 2006). Shabaev et al. (1999) inocularon plantas de avena con
Azotobacter en suelo fertilizado con 15N y aunque el balance de N en el suelo resultó
positivo, indicando que el N fijado se habría acumulado en el suelo, éste no fue
utilizado por las plantas. Es probable que el nitrógeno fijado por los microorganismos
no simbióticos quede inmovilizado en la biomasa microbiana del suelo o en la materia
40
orgánica y por lo tanto no esté disponible inmediatamente para ser usado por las plantas
(Shabaev et al. 1999). Además, la observación de respuestas positivas a la inoculación
en condiciones de alta disponibilidad de nitrógeno en el suelo y el descubrimiento de
otros mecanismos como la producción de fitohormonas hizo que la fijación de N deje de
ser considerado como un mecanismo principal de estimulación del crecimiento vegetal
en Azotobacter y en otros fijadores libres de nitrógeno. En contraposición, estudios
recientes hechos en Azospirillum, en los cuales se comprobó el aporte significativo a las
plantas del nitrógeno fijado por la bacteria, sugieren que la fijación debe ser considerada
como un mecanismo más de las PGPR (Bashan y de Bashan 2010).
La fijación de nitrógeno microbiana puede ser medida a través de varias
metodologías. Una de ellas es la técnica de reducción de acetileno que se basa en la
capacidad que tiene la enzima nitrogenasa de reducir sustratos con triple enlace y entre
ellos, el acetileno a etileno. Es una técnica muy útil debido a su simplicidad, la cual
permite comparar microorganismos asilados o sistemas microorganismo-planta por su
capacidad potencial de fijar N (Dalton y Kramer 2006). El resultado se considera un
indicador cualitativo de la capacidad de fijación de nitrógeno. Empleando esta técnica
Rodelas et al. (1999), Kizilkaya (2009) y Lu y Huang (2010) encontraron una gran
variabilidad en la capacidad de fijar N entre diferentes aislamientos de Azotobacter
Por lo expuesto en los párrafos anteriores, en el presente capítulo se determinará
la capacidad de las cepas nativas de Azotobacter de producir sideróforos y de solubilizar
fosfatos. Además se determinará el nivel de producción de auxinas, citoquininas y
giberelinas y la capacidad de fijar nitrógeno de cepas seleccionadas.
OBJETIVOS
 Caracterizar el crecimiento y evaluar la producción de fitohormonas, la
capacidad de producir sideróforos, solubilizar fosfatos y fijar nitrógeno de cepas
nativas de Azotobacter spp.
 Seleccionar cepas de Azotobacter con diferente capacidad de producción de
auxinas.
HIPÓTESIS

Las cepas nativas de Azotobacter tienen capacidad para producir auxinas in vitro
y pueden caracterizarse según los niveles de producción.

Algunas de las cepas nativas de Azotobacter producen sideróforos y solubilizan
fosfatos in vitro.

Las cepas seleccionadas difieren en la producción de ácido 3-indolacético, ácido
giberélico y zeatina y en la capacidad de fijación de nitrógeno in vitro.
41
MATERIALES Y MÉTODOS
______________________________________________________________________
Se evaluó la capacidad de producir sideróforos y solubilizar fosfatos de los 21
aislamientos que habían sido seleccionados en el capítulo anterior en función del
análisis de rep-PCR. La caracterización del crecimiento y producción de compuestos
auxínicos fue realizada en 18 de los 21 aislamientos, debido a la contaminación de tres
de ellos tal como se indica en los resultados.
Caracterización del crecimiento y producción de auxinas
Se caracterizó el crecimiento y la producción de auxinas de los aislamientos en
un medio de cultivo conteniendo peptona de harina de soja como fuente de triptófano.
Se inocularon tubos de ensayo conteniendo 4 ml de medio A (en g.l-1 : Sacarosa 10,
K2HPO4 1,2, KH2PO4 0,4 , CaSO4.H2 O 0,02, MgSO4.7H2 O 0,4, NaMoO4 .2 H2.O 0,002,
FeSO4 .7H2O 0,006, peptona de harina de soja 5, pH 7.1) con 0,4 ml de cultivo stock
almacenado a -70ºC y se incubaron a 28ºC en agitación durante 48 hs. Luego, con 1 ml
de este cultivo se inocularon erlenmeyers de 125 ml de capacidad que contenían 25 ml
de medio A y se incubaron en agitación a 28°C durante 8 días. Durante este período se
tomaron 2,5 ml de caldo de cultivo de todas las cepas a las 17, 41, 65, 113, 137 y 185 h.
Parte de las muestras se emplearon para determinar el número de unidades formadoras
de colonia por unidad de volumen (ufc.ml-1) y su densidad óptica, excepto en las
muestras tomadas a las 137 y 185 hs. Se realizaron diluciones seriadas en microplacas y
se empleó el método de la microgota (Miles y Misra, 1938) para determinar las ufc.ml-1
del cultivo bacteriano. La densidad óptica se midió en espectrofotómetro a 600 nm. El
resto de la muestra fue centrifugado a 10000 rpm durante 15 minutos y 1,5 ml del
sobrenadante se guardó en microtubos a -20 ºC para la posterior determinación de
auxinas.
Se empleó la técnica colorimétrica de Salkowsky para la determinación de
auxinas (Glickman y Dessaux 1995). El método se basa en la oxidación que produce el
ácido sulfúrico en la molécula de indol, generando una coloración rojiza. Para ello, 1 ml
de sobrenadante del cultivo bacteriano se mezcló con igual volumen de reactivo de
Salkowsky (19,98 g.l-1 de FeCl36H2O en 7,9 M de H2SO4). Luego de dejar la muestra
30 minutos en oscuridad, se registró la absorbancia en espectrofotómetro a 530 nm. Se
realizó una curva patrón empleando soluciones de diferentes concentraciones de AIA
(Sigma) (0, 2, 4, 6, 8, 10, 15 y 20 µg.ml-1). Posteriormente, se determinó la ecuación de
la recta que permitió calcular la concentración de auxinas presente en los sobrenadantes.
Se realizaron dos repeticiones por cepa, excepto en las muestras tomadas a las 137 h y
185 h donde se realizó una sola determinación por cepa. Se comparó la producción de
auxinas y el log (ufc.ml-1) a las 113 hs de cultivo de las cepas mediante un análisis de la
varianza (ANOVA) y comparación de medias por el test DGC, utilizando el paquete
estadístico INFOSTAT (Di Rienzo et al. 2010).
Con el objetivo de evaluar posteriormente el efecto de la producción de auxinas
sobre el crecimiento temprano de trigo (Capítulo 3), se seleccionaron cepas con valores
contrastantes de producción de auxinas. Se eligieron tres cepas con baja producción de
auxinas y tres cepas de alta producción de tales compuestos. Además, al seleccionar las
cepas, se tuvo en cuenta que estén distanciadas genéticamente en función del rep-PCR
(Capítulo1). Con la finalidad de caracterizar el crecimiento de Azotobacter más
42
detalladamente, se realizó la curva de crecimiento de estas 6 cepas tomando muestras
para determinar el número de células viables y la densidad óptica a las 0, 4, 7,5 y 11 h
de cultivo. Se realizaron dos repeticiones por cepa. Se calculó también el tiempo de
generación, la velocidad específica de crecimiento (Brock 2000) y la producción de
auxinas a las 185 hs de cultivo.
Producción de sideróforos
La producción de sideróforos se evaluó empleando tres metodologías que se
basan en el uso de un medio de cultivo denominado CAS del inglés Chrome Azurol S,
desarrollado por Schwyn y Neilands (1987). Este medio contiene Fe (III) y el colorante
cromo-azurol S formando un complejo. Si el hierro es removido por un sideróforo, se
produce un cambio de color del complejo, que cambia de azul a naranja o púrpura. En
primer lugar, la producción de sideróforos fue evaluada por el método tradicional de
Schwyn y Neilands (Rosas y Schroder, 1992), en el cual las bacterias fueron inoculadas
sobre el medio CAS agarizado. Luego se utilizó la misma metodología pero se modificó
la composición del medio de manera que contenga los mismos nutrientes y la misma
concentración que el medio Burk, en el cual Azotobacter crece mejor. El resto de los
componentes del medio CAS, fundamentales para la formación del complejo entre el
hierro y el colorante cromo-azurol S, no fueron alterados. Finalmente, se empleó la
metodología descripta por Pérez-Miranda et al. (2007), denominada por los mismos
autores método O-CAS (O de “overlaid”). Para ello las cepas fueron sembradas por
punción con palillos estériles en placas de Petri conteniendo medio Burk sin hierro
adicionado. Luego de 4 días las colonias ya crecidas fueron recubiertas con una capa de
medio CAS fundido y enfriado. El medio CAS se preparó sin la presencia de nutrientes
y con la adición de 9 g.l-1 de agar. Luego de 20 horas las placas fueron examinadas para
registrar la formación de un halo naranja o púrpura alrededor de las colonias, lo cual
indicó la excreción de sideróforos. Se realizaron tres experimentos independientes con
tres repeticiones para cada cepa en cada uno de ellos. Con el objetivo de descartar falsos
positivos, las cepas fueron también sembradas en medio Burk suplementado con 2 ml.l-1
de una solución 1,64% de Fe-EDTA, en el cual no debería producirse cambió de color.
Se incluyó la cepa Pseudomonas fluorescens BNM 233, provista por el Banco Nacional
de Microorganismos de la FAUBA, como control positivo.
Solubilización de fosfatos.
La capacidad de solubilizar fosfatos se evaluó empleando tres medios de
composición diferente: Pikovskaya (Pikovskaya 1948) y NBRIP cuya fuente de fosfatos
insolubles fue fosfato tricálcico (Nautiyal 1999) y el medio Burk (Kennedy et al. 2005)
modificado por la omisión de fuentes solubles de fosfatos y conteniendo fosfato
tricálcico cómo única fuente del elemento Se inocularon 4 µl (1 gota) del cultivo
bacteriano puro en placa de Petri y luego de 14 días de incubación a 28ºC se observó la
presencia del halo de solubilización de fosfatos (zona clara) formado alrededor de cada
colonia. Como control positivo se incluyó la cepa de P. fluorescens BNM 233, con
reconocida capacidad de solubilizar fosfato, Se realizaron tres experimentos
independientes, y en cada uno de ellos cada cepa fue evaluada por triplicado.
43
Producción de fitohormonas
Se determinó la producción de ácido 3-indolacético (AIA), ácido giberélico
(GA3) y zeatina (Z) de las seis cepas seleccionadas anteriormente en función de su
producción de auxinas. Las cepas fueron cultivadas de la misma manera descripta
anteriormente al evaluar la producción de auxinas por el método de Salkowski. Con la
finalidad de obtener cultivos con similares títulos para las seis cepas se tuvieron en
cuenta los resultados de las curvas de crecimiento realizadas en cada caso. Para las
cepas AT18 y AT42 el tiempo de cultivo fue de 5 días, mientras que las restantes cepas
se cultivaron durante 8 días. Transcurrido el período de cultivo, las células se
centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 min, los sobrenadantes se acidificaron a pH 3
con HCl 1N, se filtraron (0.22µm) y se conservaron a -20ºC. Estos sobrenadantes fueron
enviados al Laboratorio de Fisiología Vegetal, de la Facultad de Ciencias Exactas,
Físico-Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Río Cuarto para la
determinación de fitohormonas. La cuantificación se realizó mediante un sistema de
cromatografía líquida y espectrometría de masas en tandem (LC-MS-MS) (Apéndice1).
Los datos se expresaron en µg de cada metabolito.ml-1 del sobrenadante.
Fijación de nitrógeno
La capacidad de fijar N2 de las cepas seleccionadas de Azotobacter sp. se estimó
a través de la medición de la actividad nitrogenasa por la técnica de reducción de
acetileno en cultivos puros. Para el preinóculo, se inocularon tubos de ensayo
conteniendo 4 ml de medio Burk con 0,4 ml de cultivo bacteriano almacenado a -70ºC y
se incubaron a 28ºC en agitación durante 24 hs. Luego, con 1 ml de este cultivo se
inocularon tubos de ensayo con medio fresco y se incubaron durante 24 hs en agitación.
A partir de este último cultivo se inoculó 1ml en 5 ml de medio Burk sólido contenido
en viales de 15 ml de capacidad cerrados con tapón de algodón, los cuales se incubaron
24 hs a 28ºC. Posteriormente, los viales fueron sellados herméticamente con tapones de
goma, se inyectó un 10 % de acetileno en la atmósfera del vial y se incubaron otras 24
hs a 30ºC. Los viales se enviaron al Laboratorio de Servicios Analíticos Especiales
(FAUBA) para la cuantificación del etileno (C4H2) producido por la actividad de la
enzima nitrogenasa, a través de cromatografía gaseosa. Los cultivos bacterianos que
crecieron en los viales se resuspendieron en 1 ml de agua destilada estéril a fin de
remover las células del medio de cultivo y se determinó el contenido de proteínas con el
kit DC Protein Assay (Biorad). La actividad nitrogenasa se expresó en nmoles de C4H2.
mg de proteína-1 por 24h. Se realizaron tres repeticiones para cada cepa. Los resultados
se analizaron mediante un ANOVA y las medias se compararon con el test DGC con el
paquete estadístico INFOSTAT (Di Rienzo et al. 2010).
44
RESULTADOS
______________________________________________________________________
Caracterización de la producción de auxinas del crecimiento y en cepas nativas de
Azotobacter.
Se caracterizó la producción de auxinas y el crecimiento en 18 cepas de
Azotobacter nativas de nuestro país. En experimentos preliminares se había evaluado la
capacidad de producción de auxinas en el medio mineral Burk; sin embargo, las
cantidad de tales compuestos a los 5 días desde la inoculación fueron extremadamente
bajas (menores a 1,5 µg.ml-1) y se observó una alta variabilidad entre las repeticiones.
Por lo tanto, se incorporó al medio la peptona de harina de soja, que resultó ser una
fuente adecuada de triptófano para la síntesis de auxinas. En los resultados descriptos a
continuación no se incluyeron a las cepas AT4, AT36 y AT38 ya que se observó que sus
cultivos estaban contaminados. Las cepas se agruparon de acuerdo al nivel de
producción de auxinas. A las 17 h de cultivo la producción de auxinas fue menor a 3
µg.ml-1 en todas las cepas. Después de las 17 h, en general, todas las cepas mostraron un
aumento en la concentración de auxinas, aunque con variaciones de acuerdo a la cepa y
a su nivel de producción final. Las cepas de baja producción mostraron un aumento de
poca magnitud a lo largo de todo el período evaluado (Figura 7 a), mientras que en
muchos casos la producción llegó a una meseta a las 65 h (Figura 7 b y c). Luego, hasta
las 113 h no se verificaron cambios destacables y a partir de allí, la producción aumentó
de nuevo sin alcanzarse una nueva meseta. La mayor acumulación de auxinas en el
medio de cultivo se obtuvo, en general, durante la etapa de crecimiento estacionario o
de muerte en algunas cepas, como por ejemplo en las cepas de A. chroococcum AT11 y
AT13 (Figura 7 b).
45
Figura 7 a. Producción de auxinas y logaritmo del número de unidades
formadoras de colonia por ml de cultivo (ufc.ml-1) de cepas de Azotobacter
crecidas en cultivos líquidos, en función del tiempo. Las muestras fueron
tomadas a las 17, 41, 65 y 113 h. Para la medición del contenido de auxinas
se tomaron muestras adicionales a las 137 y 185 horas. Cada punto es el
promedio de dos experimentos, a excepción de los datos correspondientes a
las 137 y 185 h que corresponden a una única determinación. Las barras
indican el error estándar.
46
Figura 7 b. Producción de auxinas y logaritmo del número de unidades formadoras
de colonia por ml de cultivo (ufc.ml-1) de cepas de Azotobacter crecidas en cultivos
líquidos, en función del tiempo. Las muestras fueron tomadas a las 17, 41, 65 y 113
h. Para la medición del contenido de auxinas se tomaron muestras adicionales a las
137 y 185 horas. Cada punto es el promedio de dos experimentos, a excepción de
los datos correspondientes a las 137 y 185 h que corresponden a una única
determinación. Las barras indican el error estándar.
47
Figura 7 c. Logaritmo del número de unidades formadoras de colonia por ml
de cultivo (ufc.ml-1) y producción de auxinas en cepas de Azotobacter crecidas
en cultivos líquidos, en función del tiempo. Las muestras fueron tomadas a las
17, 41, 65 y 113 h. Para la medición del contenido de auxinas se tomaron
muestras adicionales a las 137 y 185 horas. Cada punto es el promedio de dos
experimentos, a excepción de los datos correspondientes a las 137 y 185 h que
corresponden a una única determinación. Las barras indican el error estándar.
48
Se observaron diferencias (p<0.0001) en la producción de auxinas entre las
cepas a las 113 h de cultivo. La cepa A. salinestris AT18 produjo la menor cantidad de
auxinas (1.4 µg.ml-1.) y se diferenció de manera significativa del resto, mientras que las
cepas A. choroococcum AT9 y A. salinestris AT10, AT37 y AT42 produjeron entre 2 y 7
µg.ml-1 de auxinas, y también se diferenciaron del resto de las cepas las cuales
produjeron entre 9 y 20 µg.ml-1 de auxinas.
Respecto a las ufc.ml-1 se observaron diferencias (p=0,0007) a las 113 h de
incubación. Las cepas AT11, AT13, AT18, AT25, AT28, AT29, AT39 y AT42 presentaron
valores entre 2 x 107 y 1,5 x 108 ufc.ml-1, mientras que las cepas restantes tuvieron
títulos que variaron entre 2,4 x 108 y 7,5 x 108 ufc.ml-1. No se observó ninguna relación
entre la producción de auxinas y el número de células en el medio de cultivo. Hubo
cepas que alcanzaron títulos altos, por ejemplo la cepa AT37, pero la producción de
auxinas fue baja (Figura 7 a), mientras que otras como la AT25 alcanzaron un título
bajo, pero la producción de auxinas fue alta (Figura 7 c).
Durante los ensayos las cepas AT10, AT12, AT19 y AT42 presentaron dos tipos
de colonias diferentes en medio A sólido. Uno de los fenotipos fueron colonias claras y
más secas y el otro, por el contrario colonias oscuras y brillantes. Para establecer si las
dos variantes se trataban de la misma cepa, las mismas fueron analizadas por rep-PCR y
se compararon con el cultivo original. Las cepas AT10, A19 y AT42 y sus dos variantes,
así como el cultivo original resultaron tener el mismo perfil de rep-PCR. Sin embargo,
uno de los fenotipos de la cepa AT12 resultó ser diferente a la cepa original. Por esta
razón se decidió no continuar trabajando con la cepa AT12.
Producción de sideróforos
Inicialmente, se evaluó la capacidad de producir sideróforos de las cepas de
Azotobacter en el medio de Schwyn y Neilands (1987), ampliamente utilizado para tal
fin en la bibliografía; sin embargo, el crecimiento de las cepas en dicho medio fue
escaso o nulo. Por el contrario, la cepa control P. fluorescens BNM 233 creció
adecuadamente y puso en evidencia la producción de sideróforos (Figura 8d). Bajo la
hipótesis de que la composición del medio de cultivo original no fuera la óptima para
Azotobacter se probó otra metodología en la que se modificaron los nutrientes para
favorecer el crecimiento de esta bacteria; sin embargo, las cepas aisladas en este trabajo
tampoco mostraron un buen crecimiento bajo estas nuevas condiciones. Por esta razón
se decidió emplear el método O-CAS (Pérez-Miranda et al. 2007). Con esta técnica,
todas las cepas evaluadas produjeron un cambio de color del medio de azul a naranja,
indicativo de la producción de sideróforos (Figura 8 a y b). Cómo se esperaba, teniendo
en cuenta que la presencia de hierro en el medio de cultivo debería inhibir la producción
de sideróforos, no hubo formación de halo cuando las cepas fueron inoculadas en el
medio suplementado con Fe-EDTA (Figura 8c).
49
AT31
AT9
AT30
AT4
AT38
AT37
a)
AT11
AT11
b)
AT30
AT9
AT29
AT28
AT4
AT37
AT42
AT11
AT10
AT10
AT10
AT33
AT31
AT39
AT38
BNM23
c)
d)
Figura 8. Ensayos de producción de sideróforos a), b) y c) con el método OCas. En c) se adicionó Fe al medio de cultivo d) Método tradicional propuesto
por Schwyn y Neilands (1987).
Solubilización de fosfatos
La capacidad de solubilizar fosfatos de las cepas de Azotobacter aisladas de
suelos de Argentina se evaluó en tres medios de cultivo diferentes; sin embargo,
ninguna de las cepas produjo halo de solubilización en los medios NBRIP, Pikovskaya
y Burk modificado, conteniendo fosfato tricálcico cómo única fuente de fósforo.
Alrededor de las colonias de algunas de las cepas, en algunas repeticiones de los
ensayos, se evidenció una leve aclaración del medio, aunque sin llegar a formarse un
halo transparente (Figura 9b). Por su parte, la cepa control de P. fluorescens BNM 233
produjo halo de solubilización en los tres medios empleados (Figura 9a).
50
AT29
AT39
AT31
BNM233
AT25
AT38
AT9
AT37
AT30
AT33
a)
b)
b)
Figura 9. Ensayos de solubilización de fosfatos. a) Cepas crecidas en medio Burk sin
fosfatos solubles. b) Cepas crecidas en medio NBRIP.
Selección de cepas de Azotobacter para su uso como PGPR en trigo y
caracterización de su crecimiento en medio de cultivo.
Se seleccionaron tres cepas con alta producción de auxinas, A. salinestris AT19,
A. chroococcum AT25 y AT31 y tres cepas con baja producción de tales sustancias, las
cepas de A. salinestris AT18, AT37 y AT42, en función de lo producido a los 5 días de
incubación y la tendencia observada más allá de ese tiempo (Figura 7 a, b y c). Además,
se caracterizó el crecimiento de las 6 cepas seleccionadas en las primeras horas de
iniciado el cultivo. En los muestreos a 0, 4 y 7,5 h de iniciado el cultivo, no fue posible
determinar las ufc.ml-1 en la cepa AT37 debido al crecimiento confluente de las colonias.
En el resto de las cepas, la concentración celular en el tiempo inicial varió entre 1 x 106
a 4 x 106 ufc.ml-1 (Cuadro 3). Durante las primeras 11 hs de cultivo el incremento en la
densidad óptica acompañó al incremento en el número de ufc.ml-1 (datos no mostrados).
A las 11 h de cultivo las cepas AT18, AT19 y AT31 presentaron los títulos más altos (1,9
a 2,5 x 108 ufc.ml-1). Las cepas AT25 y AT42 presentaron títulos intermedios, 3,3 x 107 y
8,7 x 107 ufc.ml-1, mientras que la cepa AT37 presentó el título más bajo, 6,0 x 106
ufc.ml-1. La cepa AT42 presentó la mayor velocidad específica de crecimiento y
consecuentemente el menor tiempo de generación. Por el contrario, la cepa AT31 fue la
de menor velocidad específica de crecimiento.
51
Cuadro 3. Velocidad específica de crecimiento (µ), tiempo de generación
(g), ufc.ml-1 a las 11 y 185 h de crecimiento y producción de auxinas (A) por
parte de cepas de Azotobacter. Cada valor representa el promedio de dos
repeticiones ± su desvío estándar.
Cepa
µh
g (h)
AT18
AT19
AT25
AT31
AT37
AT42
0,35 ± 0,23
0,27± 0,05
0,19 ± 0,02
0,16 ± 0,01
nd
0,37 ± 0,15
1,1 ± 0,72
1,14 ± 0,22
1,61 ± 0,17
1,89 ± 0,06
nd
0,88 ± 0,36
a
ufc.ml-1
11 horas
ufc.ml-1
185 h
2,5 x 108 ± 3,5 x 107
4,9 x 107a
8
8
1,9 x 10 ± 1,1 x 10 3,0 x 108 ± 2,6 x 108
3,3 x 107 ± 3,8 x 106 1,5x108 ± 7,3x108
2,5 x 108 ±7,5 x 107 5,4 x 108 ± 1,5 x 108
6,0 x 106 ± 8,5 x 105 1,2 x 108 ± 1,4 x 108
8,7 x 107± 9,5 x 106
2,0 x 107*
A(µg.ml-1)
185 h
3,4 ± 0,70
30,5 ± 0,70
23,1 ± 0,70
23,6 ± 0,70
5,7 ± 0,70
9,3 ± 0,17
Corresponden a una única determinación.
Luego de 185 h de cultivo (aprox. 8 días), las cepas AT37, AT19 y AT25 y AT31
presentaron títulos mayores a 1,2 x 108 y de hasta 5,4 x 108 ufc.ml-1. Las cepas AT18 y
AT42 tuvieron valores más bajos, de 4,9 x 10 7 y 2,0 x 107 respectivamente. En general
el crecimiento se caracterizó por un aumento del título bacteriano entre las 11 y las 185
h excepto para las cepas AT18 y AT42, en las cuales se observó un descenso del número
de células en el mismo período. Los valores de auxinas determinados a las 185 h fueron
similares a los obtenidos en la determinación realizada anteriormente (Figura 7, a, b, c).
Producción de fitohormonas y fijación biológica de nitrógeno en las cepas
seleccionadas
Las seis cepas seleccionadas produjeron diferentes niveles AIA, GA3 y Z y
demostraron diferencias en la actividad de la enzima nitrogenasa como indicadora del
proceso de fijación biológica de nitrógeno. Las cepas A. salinestris AT19, A.
chroococcum AT25 y A. chroococcum AT31 fueron las que produjeron la mayor
cantidad de ácido indol-3-acético (AIA), 18,1; 15,2 y 14 µg.ml-1 respectivamente,
mientras que la cepa A. salinestris AT42 produjo un valor intermedio (8.5 µg.ml-1) y las
cepas de A. salinestris AT18 y AT37 produjeron 2 y 2,6 µg.ml-1 de AIA,
respectivamente (Cuadro 5). La producción de ácido giberélico (GA3) estuvo en el
rango de 0,3 a 0,7 µg.ml-1, siendo las mayores productoras las cepas AT18 y AT37 y las
de menor producción fueron AT19 y AT31. La producción de zeatina (Z) varió de 0,5 a
1,2 µg.ml-1, siendo las mayores productoras las AT18 y AT31 y la de menor producción
la cepa AT37.
52
Cuadro 4. Producción de ácido-3-indolacético (AIA), ácido giberélico
(GA3) y zeatina (Z), luego de 5 días (cepas AT18 y AT42) u 8 días de
crecimiento (cepas AT19, AT25, AT31 y AT37).
Cepa
AT18
AT19
AT25
AT31
AT37
AT42
AIA(µg.ml-1)
2,0
18,1
15,2
14,0
2,6
8,5
GA3(µg.ml-1)
0,7
0,3
0,6
0,4
0,7
0,5
Z(µg.ml-1)
1,2
0,8
0,9
1,2
0,5
0,8
Los títulos de las cepas fueron los siguientes: 2,6 x 108, 5,8 x 108 , 2,2 x 107, 4,5
x 108, 1,4 x 108 y 1,5 x 108 ufc.ml1 para las cepas AT18, AT19, AT25, AT31,
AT37 y AT42, respectivamente.
En la mayoría de las cepas, las concentraciones de auxinas obtenidas con la
metodología propuesta por Salkowsky resultaron levemente superiores a los valores de
AIA determinados por LC-MS (Figura10).
25,0
AIA (mg m -1)
20,0
Colorimetría
LC-MS
15,0
10,0
5,0
0,0
AT18
AT19
AT25
AT31
AT37
AT42
Figura 10. Comparación entre la producción de AIA
determinada por LC-MS y la producción de auxinas
medida por colorimetría (Salkowsky) para los mismos
cultivos
53
Las seis cepas demostraron capacidad potencial para fijar N2, observándose
diferencias significativas entre las cepas (p<0.0001). Las cepas A. chroococcum AT31 y
A. salinestris AT42 fueron las de mayor actividad nitrogenasa, A. chroococcum AT25 y
A. salinestris AT37 presentaron valores intermedios, mientras que A. salinestris AT18 y
A. salinestris AT19 presentaron los valores más bajos de actividad nitrogenasa (Figura
11).
nmoles C2H2 .mg de proteína-1.24h -1
16000
c
c
14000
12000
10000
b
8000
b
6000
4000
a
a
2000
0
AT18
AT19
AT25
AT31
AT37
AT42
Figura 11. Actividad de nitrogenasa por la técnica de reducción de
acetileno de cepas de Azotobacter. Cada valor representa el promedio de
tres repeticiones. Letras diferentes indican diferencias significativas
según test DGC (α=0.05)
54
DISCUSIÓN
______________________________________________________________________
Los resultados de este capítulo sugieren que las cepas evaluadas son capaces de
producir auxinas y que las diferencias en los niveles de producción permiten
clasificarlas en altas, medias y bajas productoras lo cual corrobora una de las hipótesis
planteadas inicialmente. La producción de sideróforos fue una característica compartida
por todas las cepas, en tanto que no pudimos verificar la capacidad de solubilizar
fosfatos. Además, las cepas seleccionadas producen giberelinas y citoquininas, y fijan
nitrógeno con diferencias marcadas entre ellas.
De las curvas de crecimiento, se deduce que a excepción de las cepas de A.
salinestris AT37 y AT42, a las 17 h todas de las bacterias se encontraban ya en la fase
estacionaria de su crecimiento. Esto permitiría explicar el por qué no se observó una
relación lineal entre la densidad óptica y el crecimiento expresado con log (ufc.ml-1) con
ninguna de las cepas y los valores de absorbancia no pudieron ser usados como
estimadores del crecimiento. Además, durante la incubación de las cepas se observó la
producción de pigmentos oscuros y de agregados (flóculos) de diferentes formas y
tamaños que afectaron los valores de absorbancia registrados. Tampoco se observó una
relación clara entre densidad óptica de los cultivos y la producción de auxinas que
permita proponer un patrón general para todas las cepas.
En nuestro trabajo, la dinámica en la producción de auxinas de las cepas fue
similar a lo reportado por otros autores siendo típica de todo producto resultante del
metabolismo secundario. Para la mayoría de las cepas la concentración de auxinas en el
medio de cultivo aumentó con el tiempo de cultivo hasta los 8 días, excepto en las cepas
de A. salinestris AT18 y AT37, en las cuales no se observó incrementos en la
concentración de auxinas más allá de las 65 hs de incubación. El rango de producción
de auxinas de los aislamientos evaluados fue similar a lo reportado por otros autores
para Azotobacter Correa et al. (2008) determinaron la producción de auxinas de las
cepas de A.chroococcum BNM272 y BNM273 en un medio similar al empleado en el
presente trabajo, y encontraron que la cepa BNM272 produjo 8,6 µg.ml-1 de auxinas,
tanto a los 2 como a los 5 días de cultivo, mientras que la cepa BNM273 produjo 8,6
µg.ml-1 y 13,8 µg.ml-1 a los 2 y 5 días, respectivamente. En Azotobacter no se han
estudiado las rutas de producción de auxinas, sin embargo, por los resultados obtenidos
y en coincidencia con lo reportado por otros autores en otras especies bacterianas, las
rutas dependientes de triptófano serían las predominantes. Amhad et al. (2005b)
informaron que el rango de producción de 10 aislamientos de Azotobacter fue de 2,7 a
10,8 µg.ml-1 de auxinas luego de 15 días de cultivo en un medio sin triptófano y sin
nitrógeno, mientras que con el agregado de 5 mg.ml-1 de triptófano, la producción varió
entre 7,3 y 32,8 µg.ml-1. García-Tabares et al. (1987) informaron que en A. vinelandii
DSM382 la producción de AIA fue una función lineal de la concentración de triptófano
en el medio de cultivo, en el rango de 0 a 0,05%. Bautista y Gallardo (2008) observaron
un aumento lineal en la producción de auxinas hasta el sexto día de crecimiento en
cultivos de A. vinelandii ATCC12518 empleando un medio con triptona como fuente de
triptófano, al igual que lo que observamos con nuestras cepas.
La producción de sideróforos por parte de todas las cepas analizadas no resulta
sorprendente si tenemos en cuenta que la síntesis de sideróforos ha sido ampliamente
estudiada en varias especies del género Azotobacter (Page 1987, Kennedy et al. 2005,
Page y von Tigerstrom 1988, Fekette et al.1989). En contraposición, Joseph et al.
(2007) empleando la metodología universal de Schwyn y Neilands (1987) no
observaron producción de sideróforos en ninguno de los 40 aislamientos rizosféricos de
55
Azotobacter que estudiaron. Ahmad et al. (2008), con la misma metodología, detectaron
la producción de sideróforos en el 16 % de un total de 42 aislamientos. Sin embargo,
según nuestros resultados, la metodología tradicional de Schwyn y Neilands no sería
adecuada para determinar la producción de sideróforos en cepas del género Azotobacter.
El crecimiento de las bacterias en el medio de cultivo resultó muy escaso o nulo, y los
resultados fueron variables entre repeticiones y experimentos. Sólo la cepa de
Pseudomonas fluorescens BNM233 creció adecuadamente y expresó la producción de
sideróforos con la metodología tradicional. El medio de cultivo de esta técnica contiene
bromuro de hexadecyltrimetilamonio (HDTMA), un detergente que puede ser tóxico
para ciertas bacterias y hongos (Alexander y Zuberer, 1991, Pérez Miranda et al. 2007).
En cambio, con el método O-CAS, las bacterias crecen en un medio más favorable y
una vez crecidas las colonias se agrega el medio CAS, no interfiriendo de esta manera
con el crecimiento bacteriano.
Nuestros resultados de solubilización de fosfatos coinciden con los informados
en otros trabajos. Correa et al. (2008) tampoco detectaron solubilización de fosfatos con
las cepas BNM272 y BNM273 de A. chroococcum. Por el contrario, Ahmad et al.
(2008) utilizando el medio de Pikovskaya agarizado reportaron solubilización de
fosfatos en el 74 % de los aislamientos de Azotobacter (de un total de 47 aislamientos)
obtenidos de suelo. Además, es importante aclarar que se ha comprobado que muchos
aislamientos de microorganismos que no producen halo de solubilización en medios
agarizados, sí son capaces de solubilizar fosfatos insolubles en medio líquido (Nautiyal
1999). Por lo tanto no se debe descartar la capacidad de solubilizar fosfatos de las cepas
de Azotobacter aisladas en este trabajo. Estudios empleando otras metodologías podrían
ayudar a confirmar o rechazar estos resultados preliminares.
Debido a las diferentes metodologías empleadas y las diferentes condiciones de
cultivo resulta difícil comparar los valores de producción de fitohormonas de este
estudio con los obtenidos en otros trabajos con Azotobacter. Según lo reportado en la
literatura, la producción de sustancias del tipo giberelinas por diferentes especies de
Azotobacter determinada por cromatografía en papel en conjunto con bioensayos, varió
entre 0,03 µg.ml-1 a 4,3 µg.ml-1 (Azcón y Barea 1975, Brown y Burlingham 1968,
Martínez Toledo et al. 1986), mientras que la producción de sustancias del tipo
citoquininas, determinada por cromatografía en papel o HPLC estuvo entre 0,05 y 5,2
g.ml-1 (Azcón y Barea 1975, González López et al. 1986, Martínez-Toledo et al. 1988,
Nieto y Frankenberger 1989, Taller y Wong 1989). Por otro lado, la producción de
sustancias del tipo auxinas, con las mismas técnicas estuvo en el rango de 0,2 a 25
µg.ml-1 (Martínez-Toledo et al. 1988, González López et al. 1986, García-Tabares et al.
1987). Con metodologías más precisas que las anteriores, y salvando las diferencias en
cuanto a la especie y condiciones de cultivo, los valores de hormonas que observamos
en las cepas de Azotobacter están dentro del rango obtenido por otros autores para
Azospirillum (Perrig et al. 2007).
La técnica colorimétrica resultó una herramienta adecuada para estimar la
concentración de AIA de los sobrenadantes bacterianos, mostrando una buena
correlación con la metodología de LC-MS. Como se mencionó anteriormente, la técnica
de Salkowsky no es específica para AIA, sino que también detecta ácido 3-indolpirúvico
(AIP) e indol-3-acetamida (IAM). Las escasas diferencias entre los resultados de ambas
metodologías sugieren que las cepas evaluadas no produjeron niveles importantes de
otras auxinas además de AIA, con excepción de la cepa AT37. Por el contrario, Ali et al.
(2009) encontraron concentraciones muy superiores de AIA empleando el reactivo de
Salkowsky en relación al AIA determinado por GC-MS en aislamientos de varios
géneros bacterianos. Por su parte, Loper y Schroth (1986), analizando la producción
56
AIA de 14 cepas rizosféricas, observó que en 4 de esas cepas, la producción de auxinas
medida por la técnica de Salkowsky fue superior al AIA medido por HPLC, mientras
que en las cepas restantes no se encontraron diferencias entre ambas metodologías.
En los siguientes capítulos, la producción de fitohormonas, particularmente de
auxinas será el mecanismo que se someterá a prueba como la causa principal de la
promoción del crecimiento vegetal por parte de las cepas seleccionadas de Azotobacter.
CAPÍTULO 3: “EFECTO DE AZOTOBACTER SOBRE LA GERMINACIÓN Y
CRECIMIENTO TEMPRANO DE PLANTAS DE TRIGO”
_____________________________________________________________________
57
59
INTRODUCCIÓN
______________________________________________________________________
Para comprobar el efecto del AIA producido por bacterias sobre el crecimiento y
desarrollo de las plantas se han empleado diferentes estrategias o abordajes en el
laboratorio, tales como el empleo de cepas mutantes alteradas en su capacidad de
producir AIA (Spaepen et al. 2008); combinar la inoculación con la aplicación de
precursores de la síntesis de AIA (Ahmad et al. 2005b); correlacionar la producción
bacteriana de AIA con el contenido endógeno de la hormona en las plantas inoculadas
(Ali et al. 2009) y el empleo de plantas mutantes alteradas en la síntesis o sensibilidad a
estas fitohormonas (Ortiz Castro et al. 2009). Por ejemplo, en Azospirillum sp. en base a
numerosos estudios, algunos realizados con mutantes deficientes en la síntesis de AIA
(Barbieri y Galli 1991, Dobbelaere et al. 1999), se considera que la producción de AIA,
es la principal explicación de los efectos producidos por su inoculación en diferentes
especies vegetales. El AIA altera el metabolismo y la morfología de las raíces,
resultando en una mayor absorción de agua y nutrientes y como consecuencia, mayores
rendimientos (Bashan y de Bashan 2010)
En Azotobacter son escasos los estudios realizados al respecto. Trabajos en trigo
y maíz reportaron que la inoculación con una cepa nativa de Azotobacter seleccionada
por su producción de auxinas in vitro, incrementó el crecimiento, el rendimiento y la
absorción de nitrógeno, y que la aplicación combinada con triptófano produjo
incrementos en el crecimiento aún más pronunciados (Zahir et al. 2005, Khalid et al.
1999); sin embargo, la síntesis de AIA por sí sola no explicaría por completo los efectos
de promoción del crecimiento observados con la inoculación con bacterias productoras
de auxinas (Spaepen et al. 2007, Xie et al. 1996). La existencia de mecanismos
múltiples como la producción de otras fitohormonas capaces de inducir respuestas
fisiológicas en las plantas, dificultan la compresión de la expresión de un carácter en
particular (Ribaudo et al. 2006). Por otra parte, las fitohormonas operan en un complejo
sistema incluyendo cross-talk y feedback, por lo cual es muy difícil establecer el rol que
una hormona en particular tiene en la respuesta vegetal (Dodd et al. 2010).
El aumento en la tasa y el porcentaje de germinación como respuesta a la
inoculación con ciertas bacterias se ha asociado positivamente también con la síntesis de
fitohormonas (Kaymak, 2010) Aislamientos de Azotobacter sp. y Azospirillum sp.
incrementaron la germinación de Catharanthus roseus, siendo los porcentajes de
germinación de los tratamientos control e inoculado de 35% y 70% respectivamente
(Karthikeyan et al. 2007). Sin embargo, los autores no determinaron de manera
inequívoca la producción de fitohormonas de los aislamientos que utilizaron.
En función de lo expuesto hasta aquí, es probable que la producción de auxinas
explique gran parte de los efectos producidos por Azotobacter sp. en la germinación y el
crecimiento temprano de plantas de trigo. Por lo tanto, en este capítulo se evaluará la
respuesta del trigo a la inoculación con diferentes cepas de Azotobacter sp. con
contrastante producción de auxinas in vitro. Los ensayos se llevarán a cabo bajo
condiciones axénicas y controladas con el fin de determinar el potencial que tiene cada
cepa para estimular la germinación y el crecimiento de trigo en las etapas tempranas de
desarrollo.
60
OBJETIVO
 Evaluar el efecto que sobre la germinación y el crecimiento temprano de plantas
de trigo tiene la inoculación con cepas nativas de Azotobacter con diferente capacidad
de producir compuestos del tipo de las auxinas.
HIPÓTESIS
 La producción de auxinas y otras fitohormonas in vitro por cepas nativas de
Azotobacter se correlaciona positivamente con la capacidad de estimular la germinación
y el crecimiento temprano en plántulas de trigo.
61
MATERIALES Y MÉTODOS
______________________________________________________________________
Se llevaron a cabo tres ensayos diferentes. El primero tuvo como objetivo
evaluar el efecto de Azotobacter sobre la germinación, el segundo ensayo se realizó para
evaluar el efecto de la bacteria sobre el crecimiento de plántulas de trigo a los 8 días
después de la inoculación, inoculando semillas pre-germinadas y por último, el tercer
ensayo tuvo el mismo objetivo que el anterior pero su duración fue de 18 días.
Material vegetal
Se utilizaron semillas de la variedad de trigo Baguette Premium 13 (Nidera).
Antes de realizar las experiencias se evaluó su energía y poder germinativo de acuerdo a
las normas de la International Seed Test Asociation (ISTA) (Peretti 1994). Las semillas
se desinfectaron superficialmente sumergiéndolas en hipoclorito de sodio comercial al
20% (v/v) durante 3 minutos en agitación. Luego, se las enjuagó varias veces con agua
destilada estéril y se dejaron secar bajo flujo laminar para su utilización.
Cultivos bacterianos
Para estos experimentos se emplearon las cepas de A. salinestris AT18, AT37 y
AT42 consideradas de baja producción de auxinas y las cepa de A. salinestris AT19, y
de A. chroococcum AT25 y AT31 consideradas de alta producción. Se utilizaron cultivos
bacterianos de 5 y 8 días de crecimiento, preparados según lo descripto en el capítulo 2.
Además, se determinó la producción de auxinas y las ufc.ml-1 de cultivo.
Efecto de Azotobacter sobre la germinación
La inoculación se realizó sumergiendo las semillas en el caldo bacteriano
durante 40 minutos, en agitación y a temperatura ambiente. Se incluyó un tratamiento
testigo por inmersión de las semillas en agua destilada. Luego las semillas se dejaron
secar a temperatura ambiente durante 1-2 h y se sembraron a razón de 50 semillas por
bandeja plástica (15 cm x 25 cm de capacidad), conteniendo dos toallas de papel
humedecidas con 15 ml de agua destilada estéril. Las semillas se cubrieron con una
toalla de papel, el cual se humedeció con 10 ml de agua destilada estéril. Se empleó un
diseño completamente aleatorizado con tres repeticiones por tratamiento, donde cada
bandeja fue la unidad experimental. Se realizaron 3 experimentos independientes. Para
mantener la humedad de las semillas, las bandejas fueron colocadas dentro de bolsas de
polietileno transparente y se incubaron en una cámara de cultivo con 16 hs de luz y 8 de
oscuridad, a 24°-27°C, bajo una intensidad lumínica de 100 µmol.m-1.s-1. Se registró el
número de plántulas normales con raíces mayores a 3 mm a los 1, 2, 3, 4, y 8 días luego
de siembra y se calculó el porcentaje de germinación a los 4 y 8 días y la velocidad
germinativa (Peretti, 1994). La velocidad germinativa se determinó como la sumatoria
de los cocientes entre el número de plántulas nuevas registradas en cada recuento y el
número de días desde la siembra en que se realizó dicho recuento.
62
Efecto de Azotobacter sobre el crecimiento temprano.
Ensayo en bandejas (8 días)
Se pre-germinaron semillas de trigo durante 24 hs de la manera descripta
anteriormente. Al cabo de ese tiempo se seleccionaron semillas con longitud homogénea
de radícula (mayor a 0.5 cm) y se colocaron a razón de 15 por bandeja de plástico, sobre
dos toallas de papel humedecidas con 15 ml de agua destilada estéril. Cada semilla se
inoculó con 100 µl del caldo bacteriano. Se incluyó un tratamiento de inoculación con
agua destilada estéril como control. Luego, las semillas fueron cubiertas con otra toalla
de papel y se aplicaron 10 ml de agua destilada estéril. Luego de 8 días en cámara de
cultivo bajo las mismas condiciones descriptas anteriormente, se evaluó la longitud y el
peso seco del tallo y de la raíz, el número de raíces seminales y la colonización radical.
Para determinar la colonización radical, las raíces de dos plantas se trituraron en un
mortero adicionando 2 ml de agua destilada estéril. Posteriormente, se hicieron
diluciones seriadas, las que se sembraron sobre la superficie de placas con medio A,
modificado por la omisión de la peptona de harina de soja, con el objetivo de reducir el
crecimiento de microorganismos diferentes a Azotobacter. Al cabo de 2-3 días se contó
el número de colonias con características similares a Azotobacter y se expresó la
colonización radical como ufc.raíz-1. Se empleó el mismo diseño que en el ensayo
anterior y se realizaron dos experimentos independientes.
Ensayo en macetas (18 días)
Semillas pre-germinadas e inoculadas de igual forma que en el ensayo anterior
se incubaron en bandejas, bajo las mismas condiciones previamente descriptas, durante
24 hs. Luego, las plántulas se plantaron en macetas plásticas de 1.4 litros de capacidad
conteniendo vermiculita estéril y se incubaron bajo las mismas condiciones descriptas.
Las macetas se regaron con solución de Hoagland 0,25x (Hoagland y Arnon 1950). Se
empleo un diseño completamente aleatorizado, con 5 repeticiones por tratamiento,
consistiendo cada repetición de una maceta con 5 plántulas. Al cabo de 18 días se
determinaron la longitud y el peso seco de la raíz y del tallo y el número de raíces por
planta. Se realizaron dos experimentos independientes.
Análisis estadístico
Los resultados se analizaron mediante ANOVA y las medias se compararon con
el test DGC utilizando el paquete estadístico INFOSTAT (Di Rienzo et al. 2010).
63
RESULTADOS
______________________________________________________________________
La densidad bacteriana y la concentración de auxinas de los cultivos bacterianos
empleados en los ensayos fueron similares a los valores obtenidos en ensayos anteriores
(Capítulo 2). Las cepas A. salinestris AT18, A. salinestris AT19, A. chroococcum AT25,
A. chroococcum AT31, A. salinestris AT37 y A. salinestris AT42 tuvieron títulos de 8,8 x
10 7, 6,0 x 108, 1,3 x 108, 4,4 x 108, 1,8 x 108 y 1,2 x 108 ufc ml-1, respectivamente. Las
cepas AT18, AT37, y AT42 de baja producción de auxinas presentaron concentraciones
de AIA en el caldo bacteriano de 2,2, 5,3 y 9,3 µg.ml-1 de auxinas, respectivamente. Las
cepas AT19, AT25 y AT31, seleccionadas por su alta producción de AIA, produjeron
26,3, 21,8 y 21,9 µg.ml-1 de auxinas, respectivamente.
La inoculación no afectó la germinación, a los 4 días se alcanzó el máximo
porcentaje de germinación, cuyo promedio para todo el ensayo fue del 97,3%. Sin
embargo, la velocidad germinativa disminuyó significativamente con la inoculación,
excepto con la cepa AT18 (Figura 12).
Velocidad germinativa (planta.día-1)
50
40
a
a
b
b
b
b
b
AT42
AT19
AT25
AT31
30
20
10
0
T
AT18
AT37
Figura 12. Velocidad germinativa de plántulas de trigo inoculadas con cepas
de Azotobacter de baja (AT18 y AT37, AT42) y de alta producción de
auxinas (AT19, AT25 y AT31). T: sin inocular. Los valores representan el
promedio de 3 experimentos independientes con tres repeticiones cada uno.
Letras diferentes indican diferencias significativas (α=0,05).
La inoculación de semillas pre-germinadas de trigo con todas las cepas
incrementó (p<0,0001) el número de raíces seminales de las plántulas a los 8 días
(Figura 13). Dichos incrementos fueron del 17, 20, 23 y 24 % para las cepas AT42,
AT25, AT31 y AT19, altas productoras de AIA in vitro, mientras que el aumento en el
número de raíces seminales generado por las cepas AT18 y AT37, fue de menor
magnitud, 8 y 9 %, respectivamente. La cepa AT42 si bien en principio fue clasificada
como baja productora de auxinas, tanto en este ensayo como en anteriores produjo más
del doble de auxinas que las cepas AT18 y AT37.
64
6
c
c
c
AT19
AT25
AT31
Nº de raíce s se minales
c
b
b
AT18
AT37
a
4
2
0
T
AT42
Figura 13. Número de raíces seminales de plántulas de trigo a los 8
días de la inoculación con cepas de Azotobacter de baja (AT18, AT37 y
AT42) y de alta producción de auxinas (AT19, AT25 y AT31). T: sin
inocular. Los valores representan el promedio de 2 experimentos
independientes con tres repeticiones cada uno. Letras diferentes indican
diferencias significativas (α=0,05). DGC.
El peso seco de la raíz se incrementó con la inoculación de todas las cepas de
Azotobacter aunque las diferencias no resultaron significativas (p=0,055) (Figura 14a).
Dichos incrementos variaron entre un 11% y un 20,3% para las cepas AT42 y AT19,
respectivamente. El peso seco del tallo se incrementó entre un 13 % y un 29,5 % con la
inoculación, siendo las cepas AT19 y AT25 las que más aumentaron este parámetro
(Figura 14b), aunque estas diferencias tampoco resultaron significativas (p=0,1).
Tampoco la longitud de la raíz (p=0,67) y del tallo (p= 0,16) se vieron afectados por la
inoculación (datos no mostrados).
10
15
a
a
a
a
a
a
a
5
0
Pe so se co del tallo (mg)
Pe so se co de raíz (mg)
15
a
a
a
a
a
a
a
10
5
0
T
AT18 AT37 AT42 AT19 AT25 AT31
T
AT18 AT37 AT42 AT19 AT25 AT31
Figura 14. Peso seco de la raíz y del tallo de plántulas de trigo a los 8 de la
inoculación con cepas de Azotobacter de baja producción de auxinas (AT18
AT37 y AT42), y de alta producción de auxinas (AT19, AT25 y AT31). Los
valores representan el promedio de 2 experimentos independientes con tres
repeticiones cada uno y las barras el error estándar de las medias.
65
En el ensayo en bandejas se evaluó la colonización de las raíces por parte de las
6 cepas de Azotobacter. Se observaron diferencias significativas (p=0,0001) entre las
cepas en la colonización de las raíces (Figura 15). Las plántulas inoculadas con las
cepas AT19 y AT25 presentaron 4,9 x 106 y 2,3 x 10 6 ufc.raíz-1 respectivamente, valores
superiores al hallado en las plantas inoculadas con las cepas AT31 y AT37, que tuvieron
igual cantidad de ufc.raíz-1 ,1 x 106, mientras que las plantas inoculadas con las cepas
AT18 y AT42, resultaron ser las de menor colonización radical, con valores de 7,6 x 104
y 1 x 10 5 ufc.raíz-1 respectivamente.
8
c
Colonización radical
(log ufc.ml-1)
7
b
6
5
c
b
a
a
4
3
2
1
0
AT18
AT37
AT42
AT19
AT25
AT31
Figura 15. Unidades formadoras de colonia por raíz de trigo, a los
8 días de la inoculación con cepas de Azotobacter. Cada barra
representa el promedio de 3 repeticiones de 1 experimento. Letras
diferentes indican diferencias significativas.
Al analizar el ensayo en macetas, se observó que la inoculación de semillas pregerminadas de trigo con Azotobacter sp. no afectó de manera significativa a ninguno de
los parámetros de crecimiento, tales como la longitud y peso seco del vástago, el
número de raíces y el peso seco de la raíz, luego de 18 días desde la inoculación (datos
no mostrados). Las evaluaciones de la longitud radical no fueron consideradas debido a
que se produjo mucho error en su medición a causa de roturas de la raíces al descalzar
las plantas de las macetas con vermiculita.
Con el objetivo de verificar si la falta de respuesta a la inoculación observada a
los 18 días podría estar relacionada con la colonización de la raíz, se llevó a cabo un
ensayo adicional en macetas, que fue realizado con las cepas AT18, AT19 y AT25, las
cuales habían demostrado diferencias en la colonización radical a los 8 días desde la
inoculación. A los 18 días se determinó la colonización de la superficie radical. Para
ello la raíz de cada planta se sacudió para eliminar los restos menos adheridos de
vermiculita y luego se puso en agitación en un erlenmeyer con 100 ml de agua destilada
estéril. Se realizaron diluciones seriadas y se determinó las ufc.raíz-1, con el mismo
procedimiento que el empleado para el ensayo en bandejas. Además, se determinó el
peso seco de la raíz y del tallo. Los resultados se analizaron mediante un ANOVA y el
test DGC. No se observaron efectos significativos en el peso seco del la raíz (p=0,67) y
del tallo (p=0,32). Sin embargo, se observaron diferencias (p=0,001) entre la tres cepas
66
en la colonización de la superficie radical. El número de bacteria por raíz fue de 1,7x
10 4, 1,9x 106 y 3,6 x 106 para las plantas inoculadas con las cepas AT18, AT25 y AT19,
respectivamente.
67
DISCUSIÓN
______________________________________________________________________
Los resultados de este capítulo nos permiten corroborar solo parcialmente la
hipótesis planteada. Las cepas de Azotobacter que produjeron más auxinas fueron las
que indujeron un aumento mayor en el número de raíces seminales de trigo. En otros
parámetros del crecimiento no se observó una respuesta significativa. Sin embargo, la
magnitud de las diferencias observadas permite sugerir que la inoculación con
Azotobacter afectó positivamente el peso seco del tallo y de la raíz de plántulas de trigo
a los 8 días desde la inoculación.
Las raíces seminales emergen de los nudos del hipocótilo embrionario de las
semillas en germinación, en trigo su número varía de 3 a 6 y constituyen 1-14% del
sistema completo de la raíz. El sistema de raíces seminales es muy importante para el
establecimiento de las plántulas de trigo. Ellas crecen y funcionan durante toda la vida
de la planta, y penetran en el suelo más tempranamente y a mayor profundidad que las
raíces adventicias, las cuales emergen de los nudos del coleóptilo o de los macollos
(Manske y Vlek 2002). Más aún, bajo condiciones de humedad limitada del suelo es
posible que las raíces adventicias no se desarrollen o que su crecimiento se vea limitado.
Por lo tanto, en esos casos, las plantas alcanzan su madurez dependiendo principalmente
de las raíces seminales (Sanguinetti et al. 2007). Esto último destaca la importancia de
nuestros resultados de inoculación con Azotobacter ya que las plantas con mayor
número de raíces seminales estarán en mejores condiciones para soportar situaciones de
estrés hídrico, al menos, en etapas tempranas de su crecimiento, aumentando las
chances de tener un buen stand de plantas logradas a campo.
El retraso en la germinación observado con la inoculación con Azotobacter no
fue un resultado sorprendente ya que ese efecto negativo sobre la germinación ya había
sido informado (Harper y Lynch 1979). Estos autores observaron una disminución en el
porcentaje de germinación cuando inocularon semillas de cebada con cultivos
completos (bacterias + sobrenadante) de A. chroococcum. Sin embargo, este efecto no
se produjo al tratar las semillas con el sobrenadante libre de células. Estos autores
sugieren que la inhibición en la germinación se debe a una competencia entre la bacteria
y la semilla por el oxígeno disponible. El retraso en la germinación que observamos es
posible que se deba, en parte, a un exceso en el número de células en los cultivos
utilizados. Apoya esta hipótesis el hecho de que la cepa AT18, cuyo título fue
considerablemente menor al del resto de las cepas, no afectó negativamente a la
velocidad germinativa. Por otra parte, García-González et al. (2005) reportaron que la
aplicación de sobrenadantes libres de células de Azotobacter beijerinckii, Azospirillum
brasilense y Azospirillum lipoferum acortó el tiempo de germinación de semillas de
trigo respecto al tratamiento con agua, y que la aplicación de una solución de AIA de 50
µg.ml-1 produjo el mismo efecto. Sin embargo, los autores no mencionan la
concentración de auxinas presente en el sobrenadante, ni el volumen aplicado.
Es un hecho conocido que la concentración bacteriana es un factor a considerar
cuando se desarrolla un estudio con PGPR, y su efecto se ha demostrado que depende
de la especie y variedad vegetal inoculada. Kurdish et al. (2008) observaron que la
inoculación de pimiento, tomate, zapallo y remolacha, sumergiendo las semillas en
caldos bacterianos de A. vinelandii con concentraciones de 1 x 108 a 9 x 10 8 ufc.ml-1
aumentaron el porcentaje de germinación, mientras que la inoculación de trigo inhibió
su germinación en un 13 % respecto al testigo. Sin embargo, al inocular con el mismo
caldo bacteriano diluido 50 veces, el porcentaje de germinación se incrementó en un
20%. Así mismo, Somova et al. (2001), observaron que la inoculación con
68
Pseudomonas putida y P. fluorescens podía estimular o inhibir la germinación de
semillas de trigo en función de la concentración bacteriana del inóculo, y que la
concentración óptima era distinta para diferentes variedades de trigo. Por lo expuesto
precedentemente, los resultados que obtuvimos para la germinación podrían deberse no
solo al título bacteriano, sino también a la variedad de trigo utilizada.
La capacidad de fijar nitrógeno in vitro, estimada en el Capítulo 2 (Figura 11) no
parece tener relación con la promoción del crecimiento observada, ya que por ejemplo
las cepas AT18 y AT19 con valores similares de actividad nitrogenasa generaron
diferentes tipos de respuesta en las plantas inoculadas (Figuras 11 y 12). Nuestros
resultados, coinciden con los observador por Rodelas et al. (1999) quienes al coinocular
plántulas de Vicia faba L. con Rhizobium y cepas de Azotobacter con diferente
capacidad de reducción de acetileno in vitro tampoco encontraron una relación entre
esta característica y la estimulación del crecimiento de las plantas. Más aún, una de las
cepas con mayor actividad nitrogenasa redujo el crecimiento de las plantas. Barbieri et
al. (1986) empleando un mutante nif- (incapaz de fijar nitrógeno) de A. brasilense sp6,
productor de auxinas, encontró respuestas en la estimulación del crecimiento de trigo
similares a las observadas con la inoculación con la cepa salvaje. Además, teniendo en
cuenta que la fijación de nitrógeno es un proceso con altos requerimientos energéticos,
en los ensayos realizados es probable que la plántula de trigo no excrete cantidades
suficientes de sustancias carbonadas que puedan ser empleadas por la bacteria para fijar
nitrógeno (Bashan y de Bashan 2010).
La falta de estimulación del crecimiento de las plantas a los 18 días de la
inoculación resultó sorprendente dada la mayor producción de raíces seminales
observada a los 8 días y a la tendencia observada en los otros parámetros. Sin embargo,
otros autores tuvieron resultados similares. Ribas et al. (2009) inocularon semillas y
plántulas de trigo, maíz y soja con cultivos de A. brasilense Az39 y observaron que la
magnitud de la respuesta observada a los 8 días desde la inoculación en ciertos
parámetros del crecimiento era mayor que la observada a los 14 días. Es posible que
nuestros resultados se deban a una baja colonización radical, valor que podría estar por
debajo del óptimo requerido para observar una respuesta sostenible en el tiempo.
Desafortunadamente, existen pocos trabajos en la bibliografía internacional sobre
valores de colonización radical de Azotobacter sp. en trigo, por lo tanto no podemos
saber si la cantidad de bacterias detectadas en las raíces está fuera del rango óptimo para
estimular el crecimiento del trigo. Otros autores han indicado que, con la excepción de
la asociación entre A. paspali con Paspalum notatum, Azotobacter no es un buen
colonizador de las raíces de las plantas (Kennedy y Tchan 1992). Específicamente, en
plantas de trigo, Rovira (1963) informó que Azotobacter sp. es un pobre colonizador de
las raíces, sugiriendo que ello se debía a la incapacidad de la bacteria para utilizar los
exudados radicales (Rovira et al. 1965). Sin embargo, esos estudios no son comparables
con el nuestro debido a que las plantas crecieron tubos de ensayo con arena. Por otra
parte, Narula et al. (2007), mediante microscopia de inmunofluorescencia, demostraron
que A. chroococcum cepa Mac27 colonizó las raíces de trigo en un sistema hidropónico.
Además, en un ensayo en invernáculo con suelo sin esterilizar, lo autores observaron
que la misma cepa colonizó en igual magnitud las raíces de trigo y el suelo e incrementó
el crecimiento de las plantas luego de 60 desde la inoculación. Por el contrario, Rovira
(1963) en un ensayo similar observó también a los 60 días una estimulación el
crecimiento de las plantas, a pesar de que la presencia de Azotobacter sp. en las raíces
fue insignificante. De modo que la interacción de múltiples factores, tales como las
condiciones físico-químicas del sustrato, la competencia con otros microorganismos, así
como la composición de los exudados radicales, determinada principalmente por la
69
variedad de trigo, podrían estar implicados en la falta de respuesta que hemos
observado. Además, es posible que la respuesta que se observó en las plántulas a los 8
de la inoculación se deba solo a la acción de las fitohormonas presentes en el caldo
bacteriano al momento de la inoculación, de modo que si la concentración de las
mismas no se mantiene en el tiempo ese efecto estimulador podría perderse a los 18 días
desde la inoculación.
CAPÍTULO 4: “LA PRODUCCIÓN DE AUXINAS POR AZOTOBACTER COMO
MECANISMO RESPONSABLE DE LA PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO
TEMPRANO EN TRIGO”.
______________________________________________________________________
71
73
INTRODUCCIÓN
______________________________________________________________________
Los resultados del capítulo anterior sugieren que las auxinas producidas por
Azotobacter tienen un rol importante en modificar la morfología radical de las plántulas
de trigo inoculadas. Además, con algunas cepas también se observó estimulación del
crecimiento de la parte aérea. No hemos encontrado en la literatura referencias sobre la
relación entre la producción de auxinas y la estimulación del crecimiento radical de
plantas de trigo inoculadas con Azotobacter ; sin embargo, con otros géneros de PGPR
se demostró que la proliferación del sistema radical de trigo es causada principalmente
por la producción de AIA (Sapaepen et al. 2008). En tal sentido, una cepa mutante de A.
brasilense, con reducida capacidad de producir AIA, redujo el número y la longitud de
la raíces laterales así como el desarrollo de pelos radicales de plántulas de trigo, en
relación con la cepa salvaje (Barbieri et al 1991).También se demostró en Azospirillum
sp. que la promoción o inhibición del crecimiento radical dependía de la concentración
celular del inóculo de manera análoga a lo que ocurre con la aplicación exógena de AIA,
la cual estimula el crecimiento de la raíz a bajas concentraciones y lo inhibe en altas
(Baca y Elmerich 2007). De manera similar, sobrenadantes libres de células, con altos
contenido de AIA de A. brasilense y Klebsiella pneumoniae generaron diferentes tipos
de respuestas en el sistema radical de plántulas de arroz en función de la concentración
del sobrenadante aplicada en un sistema hidropónico.
En base a lo expuesto anteriormente, en este capítulo se propuso evaluar el
efecto de Azotobacter sobre el crecimiento de plántulas de trigo y fundamentalmente a
nivel de la morfología radical y comparar esta respuesta con aquella obtenida cuando se
aplica AIA de manera exógena. Además se analizó si la presencia de la bacteria es
necesaria para producir dicha respuesta a la inoculación.
OBJETIVO
 Evaluar el efecto de la producción de auxinas por Azotobacter sp. sobre el
crecimiento vegetativo de plántulas de trigo y el desarrollo de pelos radicales.
HIPÓTESIS
 La producción de auxinas en el medio de cultivo por Azotobacter sp. es el
mecanismo principal que participa en la promoción temprana del crecimiento de las
plántulas de trigo y en la alteración de la morfología radical.
 No se requiere la presencia de la bacteria para observar esos efectos tempranos
debidos a la inoculación.
74
MATERIALES Y MÉTODOS
______________________________________________________________________
En un primer ensayo se evaluó el efecto de las auxinas producidas por cepas de
Azotobacter sp. sobre el crecimiento temprano, mientras que en un segundo ensayo se
determinó el efecto sobre la morfología radical. En el primer ensayo se emplearon las
cepas AT18, de baja producción de auxinas y las cepas AT19 y AT25 de alta producción,
mientras que en el segundo se usaron solamente las cepas AT18 y AT19. La preparación
y la determinación de las auxinas y las ufc.ml-1 de los cultivos bacterianos, así como la
obtención de las semillas pre-germinadas se realizaron de igual manera que en el
capítulo anterior. Los sobrenadantes libres de células se obtuvieron por centrifugación
de los cultivos bacterianos a 10000 rpm durante 15 min y se filtraron (0.22 µm).
Efecto sobre el crecimiento temprano
Los tratamientos consistieron en la aplicación de 100 µl por semilla del cultivo
bacteriano completo, del sobrenadante libre de células o de diferentes concentraciones
de ácido indol-3 acético (AIA) puro (Sigma). Se emplearon tres concentraciones de
AIA: una alta (AIAa) similar a la concentración de auxinas determinada en los
sobrenadantes de las cepas de mayor producción (AT19 y AT25), otra similar a la
concentración de auxinas del sobrenadante de la cepa AT18 de baja producción (AIAb)
y una concentración intermedia (AIAm). Además se incluyó como control un
tratamiento con 100 µl de agua destilada. Al cabo de 8 días desde la aplicación de los
tratamientos, se midió la longitud y el peso seco del tallo y de la raíz y el número de
raíces seminales.
Efecto sobre la morfología radical
Se colocaron 5 semillas de trigo pre-germinadas sobre agar-agua al 0,7% en placas de
Petri. Cada semilla fue inoculada con 200 µl del sobrenadante de las cepas AT18 y AT19
o con 200 µl de 3 soluciones de AIA con tres concentraciones diferentes, de manera
similar que en el ensayo anterior. Los controles se inocularon con agua destilada estéril.
Las placas se incubaron en la oscuridad durante 3 días a 25 ºC. Al finalizar el
experimento se sumergieron las raíces de las plántulas en una solución de cristal violeta
(0,075 % en alcohol 70º) (Dobbelaere et al. 1999) y se enjuagaron con agua destilada.
Luego las raíces se colocaron en una placa de Petri con agua, se observaron con lupa
(25x) y se tomaron fotografías.
75
RESULTADOS
______________________________________________________________________
Los títulos de los cultivos bacterianos de las cepas A. salinestris AT18, A.
salinestris AT19 y A. chroococcum AT25 empleados en la presente experiencia fueron
3,7 x 108, 6,8 x108 y 4,7 x 10 7 cfu.ml-1, respectivamente. La concentración de auxinas en
los sobrenadantes fueron 1,6; 23,8 y 20 µg.ml-1 para las cepas AT18, AT19 y AT25,
respectivamente.
Efecto sobre el crecimiento temprano
En ninguno de los parámetros evaluados se observó diferencias entre la
aplicación del cultivo bacteriano completo y del sobrenadante de cada cepa. A los 8
desde la inoculación el peso seco de la raíz no resultó afectado por la aplicación de los
diferentes tratamientos (p=0,25) (datos no mostrados), pero sí lo hizo la longitud de la
raíz (p=0,0009). La aplicación de la cepa AT18 produjo un incremento del 7-8 % en la
longitud de la raíz respecto al testigo y a los otros tratamientos (Figura 16).
Longitud de la raíz (cm)
20
a
b
b
a
a
a
a
a
a
a
10
0
T
18C
18S
19C
19S
25C
25S AIAb AIAm AIAa
Figura 16. Longitud del la raíz (cm) de plántulas de trigo luego de 8 días de
la aplicación de cultivos bacterianos completos (C) y sobrenadantes (S) de
cepas de Azotobacter de alta (AT19 y AT25), de baja producción de auxinas
(AT18) y de soluciones de AIA de baja (AIAb), media (AIAm) y alta (AIAa)
concentración. T: sin inocular y sin AIA sintético. Los valores representan el
promedio de 2 experimentos independientes con tres repeticiones cada uno.
Letras diferentes indican diferencias significativas.
76
En general, tanto la longitud (p=0,0005) como el peso seco del tallo (p=0,0001)
fueron positivamente afectados por los cultivos completos y los sobrenadantes
bacterianos (Figura 17). Las cepas AT18 y AT25 incrementaron la longitud y el peso
seco del tallo, mientras que la cepa AT19 aumentó sólo el peso seco del tallo respecto al
resto de los tratamientos. Tanto el sobrenadante como el cultivo completo de la cepa
AT18 incrementaron el peso seco del tallo respecto al testigo, un 14,2 y 20,6 %,
respectivamente. Los incrementos en el peso seco del tallo con la cepa AT25 fueron de
23 y 20 % para el cultivo completo y el sobrenadante, respectivamente, mientras que
con la cepa AT19 el incremento fue de un 11% (sobrenadante y cultivo completo). Por
el contrario, ninguna de las soluciones de AIA mostraron efectos sobre el crecimiento de
la parte aérea.
Longitud del tallo (cm)
20
15
b
b
a
a
a
b
b
b
b
a
a
a
a
a
10
5
0
15
Peso se co de tallo (mg)
b
b
b
a
b
a
10
5
0
T
18C
18S
19C
19S
25C
25S AIAb AIAm AIAa
Figura 17. Longitud y peso seco del tallo de plantas de trigo luego de 8 días de
la aplicación de cultivos bacterianos completos (C) o sobrenadantes libres de
células (S) del cultivo de cepas de Azotobacter de alta (AT19 y AT25) y baja
producción de AIA (AT18) y de soluciones AIA de concentraciones baja
(AIAb), media (AIAm) y alta (AIAa). T: sin inocular y sin AIA sintético. Los
valores representan el promedio de 2 experimentos independientes con tres
repeticiones cada uno. Letras diferentes indican diferencias significativas.
77
Las plantas tratadas con las cepas de mayor producción de auxina in vitro AT25
y AT19, así como aquéllas tratadas con las soluciones de concentraciones media y alta
de AIA, desarrollaron un mayor número de raíces seminales respecto al testigo (T) y a
las plantas tratadas con el sobrenadante y el cultivo completo de la cepa AT18 baja
productora de auxinas.
Nº de raíce s se minales
6
b
b
b
a
a
a
T
18C
b
a
b
b
4
2
0
18S
19C
19S
25C
25S AIAb AIAm AIAa
Figura 18. Número de raíces seminales de plántulas de trigo
cuyas semillas se trataron con cultivos bacterianos completos (C)
o sobrenadantes libres de células (S) del cultivo de cepas de
Azotobacter de alta producción de AIA (AT19 y AT25), de baja
producción (AT18) y de soluciones AIA de baja (AIAb), media
(AIAm) y alta (AIAa) concentración T, sin inocular y sin AIA
sintético. Los valores representan el promedio de 2 experimentos
independientes con tres repeticiones cada uno. Letras diferentes
indican diferencias significativas según el test de DGC. (α=0,05).
Efecto sobre la morfología radical
En el ensayo en bandejas a las 24 hs se observaron diferencias entre los
tratamientos en la morfología de las raíces (Figura 19). Las plántulas tratadas con las
cepas AT19 y AT25 y con las soluciones de AIAa y AIAm tuvieron raíces más cortas
que el resto de los tratamientos. La aplicación de la solución AIAb redujo levemente la
longitud de las raíces en relación al control y al tratamiento con la cepa AT18.
78
T
AIAb
AIAm
AIAa
AT18C
AT18S
AT19C
AT19S
AT25S
AT25C
Figura 19. Plántulas de trigo a las 24 h del tratamiento con cultivos
completos (C) o sobrenadantes (S) de las cepas AT19, AT18 y AT25 o con
soluciones de 2 µg.ml-1 (AIAb), 14 µg.ml-1 (AIAm) y 26 µg.ml-1 (AIAa).
Tanto la aplicación de las soluciones de AIA así como del sobrenadante de la
cepa AT 19 tuvieron un marcado efecto sobre la morfología de las raíces de las plántulas
de trigo de 4 días (Figuras 20 y 21) comparado con las plantas testigo. Las soluciones de
AIAm, AIAa y el sobrenadante de la cepa AT19 redujeron notablemente el largo de la
raíz y estimularon la formación de pelos radicales. La solución de AIAb redujo
levemente la longitud radical respecto del testigo y del sobrenadante de la cepa AT18. El
desarrollo de los pelos radicales no se vio afectado por la solución de AIAb ni por la
cepa AT18.
T
AIAb
AIAm
AIAa
AT18
AT19
Figura 20. Plántulas de trigo de 4 días tratadas con soluciones de 2
µ.ml-1 (AIAb), 14 µ.ml-1 (AIAb) y 26 µ.ml-1 (AIAa) y con
sobrenadantes del cultivo de las cepas AT18 y AT19. Las raíces
tiñieron con una solución de cristal violeta.
79
T
AIAb
AIAm
AIAa
AT18
AT19
Figura 21. Raíces de plántulas de trigo de 4 días tratadas con
soluciones de 2 µ.ml-1 (AIAb), 14 µ.ml-1 (AIAb) y 26 µ.ml-1 (AIAa) y
con sobrenadantes del cultivo de las cepas AT18 y AT19. Las raíces
tiñeron con una solución de cristal violeta.
80
DISCUSIÓN
_____________________________________________________________________
La aplicación de AIA comercial logró simular el incremento en el número de
raíces seminales producido por las cepas AT19 y AT25, permitiendo confirmar que el
AIA producido por Azotobacter sería el principal mecanismo involucrado en la
estimulación del desarrollo de raíces seminales de plántulas de trigo, tal como lo
sugerían los resultados del capítulo anterior. De manera similar, la adición de
concentraciones AIA en el medio de germinación de semillas de Phaseolus vulgaris
incrementó el número de raíces basales luego de 4 días (Remans et al. 2008). Por otra
parte, la mayor estimulación del crecimiento aéreo por parte de la cepa AT18, baja
productora de auxinas, sugiere que es otro el mecanismo que participa en la generación
de esta respuesta. El efecto observado podría deberse a la mayor concentración de GA3
que produce esta bacteria. Esta hipótesis se apoya en el hecho de que la cepa AT19, la
cual produjo la mitad de GA3 comparada con las cepas AT18 y AT25, incrementó en
menor proporción el peso seco y la longitud del tallo. Además, el GA3 producido por
AT18 podría también ser responsable de la estimulación de la longitud radical generada
por la inoculación con dicha cepa. El crecimiento de la raíz primaria también se ve
influenciado fuertemente por las giberelinas. Plantas mutantes de Pisum sativum,
deficientes en la producción de ácido giberélico, tuvieron raíces más cortas respecto al
fenotipo salvaje (Yaxley et al. 2001). Se ha demostrado además que la adición de GA3
en un amplio rango de concentraciones a raíces intactas de Vicia y Lepidium estimuló la
elongación de la raíz primaria (El-Antably and Larsen, 1974).
Si bien se conoce que concentraciones bajas de auxinas estimulan la elongación
radical (Patten y Glick 2002, Dodd et al. 2010), la concentración de AIA presente en el
sobrenadante de la cepa de baja producción así como en la solución de menor
concentración de AIA sería aún demasiado alta como para estimular la elongación de la
raíz de las plántulas de trigo de nuestro estudio.
Los resultados de este capítulo sobre la necesidad de la presencia o no de la
bacteria para promover el crecimiento de trigo coinciden con lo postulado por Cassán et
al. (2009), quienes sugieren que la estimulación del crecimiento por parte de
Azospirillum sp. y Bradyrhizobium sp. en los estadíos tempranos en soja y maíz se
debería a la presencia de reguladores del crecimiento en el caldo de cultivo y que no
dependería de la presencia de la bacteria en lo que se define como el efecto
fitohormonal de la inoculación. También El-Khawas y Adachi (1999) reportaron
incrementos significativos en la longitud, peso y área de la raíz de plántulas de arroz al
aplicar sobrenadantes de cultivos de cepas A. brasilense y K. pneumoniae productoras
de AIA.
Los efectos observados en la morfología radical de las plántulas cuyas semillas
fueron tratadas con los sobrenadantes bacterianos pudieron ser reproducidos con la
aplicación de soluciones de AIA comercial. Este resultado permitiría asignarle a la
producción de auxinas el rol principal en la modificación de la morfología radical de las
plantas de trigo; sin embargo, el sobrenadante de la cepa AT18, no redujo la longitud de
la raíz como sí lo hizo la solución AIAb, de similar concentración. Por lo tanto otros
mecanismos, además de la producción de AIA, estarían implicados en la respuesta
observada con esa cepa. Algunos de los mecanismos propuestos fueron discutidos al
analizar los resultados del ensayo en bandejas.
Los resultados que obtuvimos concuerdan con los de otros estudios en los que se
utilizaron células separadas del caldo bacteriano y resuspendidas en una solución buffer
(Dobbelaere et al. 1999) o de sobrenadantes libres de células (El-Khawas y Adachi
81
1999). La inoculación con concentraciones crecientes de células de las cepas A.
brasilense Sp7 y A. brasilense sp245 produjo una disminución de la longitud y
superficie radical y un aumento en la densidad y longitud de pelos radicales en plántulas
de trigo a los 5 días desde la siembra (Dobbelaere et al. 1999). Por el contrario, al
inocular semillas de trigo con concentraciones crecientes de una mutante ipdc, que
produce sólo un 10% del AIA de las cepas salvajes, no se redujo la longitud radical,
mientras que la densidad y longitud de los pelos radicales aumento levemente
(Dobbelaere et al. 1999). El-Khawas y Adachi (1999), en un sistema hidropónico,
observaron que a medida que se aumentaba la concentración del sobrenadante de cepas
de A. brasillense y K. pneuomaniae productoras de auxinas, se incrementaba el número
de raíces laterales y pelos radicales y se reducía la longitud de la raíz de plántulas de
arroz a los 21desde la siembra.
En el ensayo en bandejas de este capítulo se registraron más efectos de promoción del
crecimiento significativos que en el ensayo en bandejas del capítulo 3. En ambos
ensayos se observaron incrementos en el peso seco del tallo con las cepas AT18, AT19 y
AT25, así como un incremento en la longitud radical con la cepa AT18. La baja
reproducibilidad en los experimentos con cepas de PGPR es un hecho frecuente tanto en
laboratorio como a campo (Brown 1974, Babalola 2010). Harper y Lynch (1979)
reportaron que los efectos de estimulación del crecimiento radical de plantas de cebada
inoculadas con A. chrocooccum, en ensayos en placas de Petri, no se pudieron repetir de
manera consistente. La consistencia de los efectos positivos sobre el crecimiento vegetal
en sucesivos ensayos es un hecho que debe tenerse en cuenta al momento de seleccionar
una cepa para el desarrollo de un inoculante. Así, Kloepper et al. (1988) al seleccionar
en invernáculo cepas promotoras del crecimiento vegetal pusieron mayor énfasis en la
repetición de la respuesta observada que en la magnitud de la misma, repitiendo los
ensayos como mínimo 3 veces y con algunas cepas hasta 11 veces. En el mencionado
trabajo, sólo las cepas con los resultados más consistentes en invernáculo, fueron
posteriormente evaluadas a campo.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES FINALES
______________________________________________________________________
83
85
El conocimiento y relevamiento de la diversidad microbiana de los suelos es un
tema que ha recibido poca atención en nuestro país; sin embargo, no debería ignorarse
ya que forma parte del patrimonio nacional y sería una forma de defenderlo y
preservarlo. En el mundo desarrollado nos ven como fuente de germoplasma, ellos han
degradado sus recursos y los nuestros son muy vastos y diversos. La diversidad nativa
de Azotobacter sp. es en particular importante debido a su uso actual y futuro como
PGPR y como recurso biotecnológico. Como aporte al conocimiento y al potencial uso
de esta bacteria, en este trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la caracterización
genotípica y fenotípica de cepas de Azotobacter de diferentes suelos de la Argentina. En
este trabajo pusimos en evidencia la diversidad genotípica de Azotobacter que existe en
nuestros suelos e identificamos los aislamientos al nivel de especie, a través de
metodologías moleculares. En lo que respecta a nuestro conocimiento, es la primera vez
que se aíslan A. salinestris y A. armeniacus de suelos argentinos, siendo A. armeniacus
una especie con muy baja frecuencia de aparición a nivel internacional.
A pesar de los numerosos estudios que mencionan el aislamiento de Azotobacter
de diferentes ambientes, nuestro aporte es original ya que son muy pocos los trabajos de
caracterización genotípica de aislamientos de este género bacteriano. La antigua
caracterización fenotípica puede generar confusiones y llevar a conclusiones erróneas
sobre la distribución de Azotobacter en los suelos y sobre sus cualidades en relación a
la promoción del crecimiento vegetal. En ninguno de los trabajos citados en la
bibliografía internacional, en los que se determinó la capacidad de producir sideróforos,
solubilizar fosfatos, y producir auxinas de aislamientos clasificados como Azotobacter
se confirmó la asignación a nivel de género por métodos genotípicos. Por lo tanto, es
posible que esa sea una de las razones por la que todas las cepas que evaluamos
produjeron sideróforos, mientras que por el contrario en otros trabajos los autores no
informaron dicha capacidad en ninguno o en muy pocos de sus aislamientos. Un
ejemplo de clasificación errónea, y posteriormente corregida, es la de Cavaglieri et al.
(2004a, b y 2005a) quiénes observaron que aislamientos de suelo clasificados como A.
armeniacus en función la caracterización microbiológica clásica, tenían una importante
acción de biocontrol contra el hongo fitopatógeno Fusarium verticilloides; sin embargo,
en un trabajo posterior Cavaglieri et al. (2005b) informaron que según estudios de
secuenciación del gen ribosomal 16S, los aislamientos que anteriormente habían
clasificado como A. armeniacus pertenecían en realidad a la especie Microbacterium
oleovorans.
Este trabajo es un aporte original al estudio de los mecanismos responsables de
las respuestas observadas en las plantas con la inoculación con Azotobacter Como se
planteó anteriormente, existe escaso conocimiento sobre los mecanismos que operan en
el género Azotobacter responsables de la estimulación del crecimiento de las plantas. En
general, los estudios que informan sobre la producción de fitohormonas por parte de
Azotobacter datan de hace más de diez años, y en los mismos se emplearon
metodologías consideradas actualmente como poco precisas. En este trabajo
demostramos la capacidad de producir ácido gibérelico, zeatina y ácido3-indolacético
de seis cepas nativa Azotobacter con una metodología más precisa y confiable. Además,
nunca antes se había determinado la capacidad de producir fitohormonas de cepas de la
especie A. salinestris, siendo éste otro aporte original del trabajo que aquí presentamos.
Nuestros resultados demuestran la importancia de la producción de AIA por
parte de Azotobacter para la estimulación del crecimiento temprano de plántulas de
trigo. Las cepas que produjeron mayor cantidad de auxinas in vitro estimularon en
mayor proporción el desarrollo de raíces seminales y pelos radicales respecto a las
demás cepas, y esas respuestas pudieron ser reproducidas con la aplicación exógena de
86
AIA comercial. Sin embargo, en el crecimiento de la parte aérea se observaron efectos
positivos que no pudieron ser atribuidos a la producción de auxinas, dado que fueron
observados con cepas de baja producción de AIA y no fueron reproducidos por la
aplicación de AIA comercial. Por lo tanto, es necesario seguir investigando a qué otros
mecanismos pueden atribuirse dichos efectos. Además, demostramos que no se necesita
de la presencia de la bacteria para estimular la producción de raíces seminales. Este es
un resultado interesante ya que se podría pensar en la utilización biotecnológica de
productos comerciales sin la bacteria para estimular el enraizamiento de plantas en
esquemas de micropropagación.
En resumen, los resultados obtenidos nos permiten confirmar en gran medida las
hipótesis planteadas al demostrar que existe una gran diversidad genética de
Azotobacter en suelos argentinos, que las cepas nativas evaluadas presentan
características que han sido relacionadas con la capacidad de estimular el crecimiento
vegetal en otros géneros bacterianos y que la producción de auxinas sería el principal
mecanismos de acción de las cepas de Azotobacter para estimular el crecimiento
temprano de las plántulas de trigo; sin embargo, son necesarios estudios básicos más
profundos que permitan relacionar de manera más directa la producción de
fitohormonas por parte de Azotobacter con las respuestas observadas en las plantas.
Para ello sería importante la obtención de mutantes con reducida o atenuada capacidad
de producción de fitohormonas, los cuales hasta el momento no están disponibles y cuya
obtención excede los objetivos de este trabajo.
BIBLIOGRAFÍA
______________________________________________________________________
87
89
Ahmad I, Shiekh MY, Ahmad F (2005a) Microbial diversity of rhizospheric soil with
special reference to plant growth promoting isolates of Azotobacter. Biosc
Biotech Res Asia. 3(2):51-58
Ahmad F, Ahmad I, Khan M. (2005b) Indole Acetic Acid Production by the Indigenous
Isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in the Presence and
Absence of Tryptophan. Turk J Biol 29:29-34
Ahmad F, Ahmad I, Khan, MS (2008) Screening of free-living rhizospheric bacteria for
their multiple plant growth promoting activities. Microbiol Res 163:173-181
Alexander B, Zuberer DA (1991) Use of chrome azurol S reagents to evaluate
siderophore productionby rhizosphere bacteria. Biol Fertil Soils 12:39-45
Ali B, Sabri AN, Ljung K, Hasnain S (2009) Auxin production by plant associated
bacteria: impact on endogenous IAA content and growth of Triticum aestivum L.
Lett Appl Microbiol 48(5):542-547
Altschul S, Stephen F, Madden T, Schäffer A, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman D
(1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs. Nucleic Acids Res 25:3389-3402
Amor Asunción MJ, Cusato M, Saubidet MI (1983) Aislamiento ecológico de
Azotobacter. Ciencia e Investigación. 40:1-12
Aquilanti L, Favilli F, Clementi F. (2004a). Comparison of different strategies for
isolation and preliminar identification of Azotobacter from soil samples. Soil
Biol Biochem 36:1475-1483
Aquilanti L, Mannazzu I, Papa R, Cavalca L, Clementi F (2004b). ARDRA (Amplified
Ribosomal DNA Restriction Analysis) characterization of Azotobacteraceae: a
contribution to the study of these free-living nitrogen-fixing bacteria. J
Microbiol Meth 57:197-206
Azcon R, Barea JM (1975) Synthesis of auxins, gibberellins and cytokinins by
Azotobacter vinelandii and Azotobacter beijerinckii related to effects produced
on tomato plants. Plant Soil 43:609-619
Babalola OO (2010) Beneficial bacteria of agricultural importance. Biotechnol Lett
32(11):1559-1570
Baca BE, Elmerich C (2007) Microbial production of plant hormones. En: Elmerich C,
Newton WE (eds) Associative and endophytic nitrogen-fixing bacteria and
cyanobacterial associations. Springer, Dordrecht, pp 113-143
Bahrani A, Pourreza J, Hagh Joo M (2010) Response of Winter Wheat to CoInoculation with Azotobacter and Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) under
different sources of nitrogen fertilizer. Amer-Eurasian J Agric Environ Sci
8(1):95-103
Barbieri P, Baggio C, Bazzicalupo M, Galli E, Zanetti G, Nuti M (1991) Azospirillumgramineae interaction: effect on indole-3-acetic acid. Dev. Plant Soil Sci.
48:161-168
Barbieri P, Zanelli T, Galli E, Zanetti G (1986) Inoculation with Azospirillum brasilense
Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid
production. FEMS Microbiol Lett 36:87-90
Barnes RJ, Baxter SJ, Lark RM (2007) Spatial covariation of Azotobacter abundance
and soil properties: A case study using the wavelet transform. Soil Biol Biochem
39(1):295-310
Bashan Y, de-Bashan LE (2010) How the plant growth promoting bacterium
Azospirillum promotes plant growth-A critical assessment. Adv Agron 108:77136
Becking JH (2006) The family Azotobacteraceae. En Dworkin M, Falkow S (eds.) The
90
Prokaryotes: a handbook on the biology of bacteria. Springer, Nueva York, pp
759-783
Behl RK, Narula N, Vasudeva M, Sato A, Shinano T, Osaki M (2006) Harnessing wheat
genotype x Azotobacter strain interactions for sustainable wheat production in
semi arid tropics. Tropics 15(1):121-133
Bellenger J-P, Wichard T, Kustka AB, Kraepiel AML (2008) Nitrogen fixing soil
bacterium uses catechol siderophores for molybdenum and vanadium
acquisition. Nat Geo Sci 1:243-246
Bhatia R, Ruppel S, Narula N (2009) NifH-based studies on azotobacterial diversity in
cotton soils of India. Arch Microbiol 191:807-813
Biari A, Gholami A, Rahmani HA (2008) Growth promotion and enhanced nutrient
uptake of maize (Zea mays L.) by application of plant growth promoting
rhizobacteria in Arid region of Iran. J Boil Sci 8:1015-1020
Brown ME, Burlingham SK, Jackson, RM (1962) Studies on Azotobacter species in
soil. I. Comparison of media and techniques for counting Azotobacter in soil.
Plant and Soil 17:309-319
Brown ME, Burlingham SK (1968) Production of plant growth substances by
Azotobacter chroococcum. J Gen Microbiol 53:135-144
Brown ME (1974) Seed and root bacterization. Annu Rev PhytopathoL 12:181-197
Cassan F, Perrig D, Sgroy V, Masciarelli O, Penna C, Luna V (2009) Azospirillum
brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in
combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea
mays L.) and soybean (Glycine max L.). Eur J Soil Biol 45:28-35
Cavaglieri L, Passone A, Etcheverry (2004a) Screening procedures to select
rhizobacteria with biocontrol activity upon Fusarium verticillioides growth and
fumonisin B1 production. Res Microbiol 155:747-754
Cavaglieri L, Passone A, Etcheverry M (2004b) Correlation between screening
procedures to select root endophytes for biological control of Fusarium
verticillioides in Zea mays L. Biol Control 31:259-267
Cavaglieri L, Andrés L, Ibáñez M, Etcheverry M (2005a) Rhizobacteria and their
potential to control Fusarium verticillioides: effect of maize bacterization and
inoculum density. Antonie Van Leeuwenhoek 87:179-187
Cavaglieri L, Orlando J, Etcheverry M (2005b) In vitro influence of bacterial mixtures
on Fusarium verticillioides growth and fumonisin B1 production: effect of seeds
treatment on maize root colonization. Lett Appl Microbiol 41:390-396
Celis Bautista LX, Gallardo IR (2008). Estandarización de métodos de detección para
promotores de crecimiento vegetal (ácido indolacético y giberelinas) en cultivos
microbianos. Disertación, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá
Chenoll E, Macián MC, Aznar R (2003) Identification of Carnobacterium,
Lactobacillus, Leuconostoc and Pediococcus by rDNA-based techniques. Syst
Appl Microbiol 26:546-556
Clegg CD (2006) Impact of cattle grazing and inorganic fertiliser additions to managed
grassland on the microbial community composition of soils. Appl Soil Ecol 31:
73-86
Collavino M M, Sansberro PA Mroginski LA, Aguilar OM (2010) Comparison of in
vitro solubilization activity of diversephosphate-solubilizing bacteria native to
acid soiland their ability to promote Phaseolus vulgaris growth. Biol Fertil Soils
46:727-738
Colwell RR (1997) Microbial diversity: the importance of exploration and
Conservation. J Ind Microbiol Biotech 18:302-307
91
Correa OS, Berti MF, Montecchia MS y Villalba Villasboa DE (2008) Uso de
Azotobacter chroococcum como inoculante en soja. XXI Congreso argentino de
la ciencia del suelo. 13 al 16 de mayo de 2008. Potrero de los Funes, San Luis,
Argentina.
Crowles DE (2006) Chapter 8: Microbial Siderophores in The Plant Rhizosphere. En:
Barton L y Abadía J (eds.) Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric
Microorganisms. Springer, Netherlands, pp 169-198
Dalton D, Kramer S (2006) Nitrogen-Fixing Bacteria In Non-Legumess. En
Gnanamanickam S (ed) Plant-Associated Bacteria. Springer, Netherlands,
pp.105-130
Degens BP, Schipper LA, Sparling GP, Duncan LC (2001) Is the microbial community
in a soil with reduced catabolic diversity less resistant to stress or disturbance?
Soil Biol Biochem 33:1143-1153
Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, Gonzalez L, Tablada M, Robledo CW (2010)
InfoStat versión 2010. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina. URL http://www.infostat.com.ar
Díaz-Zorita M, Fernández-Canigia M V (2009) Field performance of a liquid
formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity. Eur J Soil
Biol 45:3-11
Dobbelaere S, Croonenborghs A, Thys A, Vande Broek A, Vanderleyden J (1999)
Phytostimulatory effect of Azospirillum brasilense wild type and mutant strains
altered in IAA production on wheat. Plant Soil 212:155-164.
Dobbelaere S, Vanderleyden J, Okon Y (2003) Plant growth promoting effects of
diazotrophs in the rhizosphere. CRC Crit Rev Plant Sci 22:107-149
Döbereiner JV, Baldani LD, Baldani JL (1995) Como isolar e identificar bacterias
diazotróficas de plantas nao-leguminosas. MAARA-EMBRAPA-CNPAB,
Brasilia, Brazil.
Dodd IC, Zinovkina NY, Safronova WI, Belimov AA (2010) Rhizobacterial mediation
of plant hormone status. Ann Appl Biol 157:361-380
Doetsch N (1981) Determinative methods of light microscopy. En: Manual of Methods
for General Microbiology.Gerhardt P (ed), American Society of Microbiology,
Washington, pp 21-33
El-Antably HMM, Larsen P (1974) Distribution of gibberellins and abscisic acid in
geotropically stimulated Vicia faba roots. Physiol Plant 32:322-329
El-Khawas H, Adachi K (1999) Identification and quantification of auxins in culture
media of Azospirillum and Klebsiella and their effect on rice roots. Biol Fertil
Soils 28:377-381
Fekete FA, Lanzi RA, Beaulieu JB, Longcope DC, Sulya AW, Hayes RN, Mabbott GA
(1989) Isolation and preliminary characterization of hydroxamic acids formed by
nitrogen-fixing Azotobacter chroococcurn B-8. Appl Environ Microbiol 55:298305
Franchini JC, Crispino CC, Souza RA, Torres E, Hungria M (2007) Microbiological
parameters as indicators of soil quality under various soil management and crop
rotation systems in southern Brazil. Soil Tillage Res 92 (1-2):18-29
Fuentes-Ramírez LE, Caballero- Mellado J (2005) Bacterial biofertilizers. En Siddiqui
ZA (ed.). PGPR: Biocontrol and Biofertilization. Springer, Netherlands, pp.143172
Fuller WH, Hanks K (1982) Distribution of Azotobacter in arid soils. Plant
Soil. 64: 355-361
García-González MM, Farías-Rodríguez R, Peña-Cabriales JJ, Sánchez-Yáñez JM
92
(2005) Inoculación del Trigo var. Pavón con Azospirillum spp y Azotobacter
beijerinckii. Terra Latinoam 23:65-72
Garcia-Tabares T, Herraiz-Tomico T, Amat-Guerri F, Bilbao JLG (1987) Production of
3-indoleacetic acid and 3-indolelactic acid in Azotobacter vinelandii cultures
supplemented with tryptophan. Appl Microbiol Biotechnol 25:502-506
Ghida-Daza
C
(2010)
Análisis
económico
del
cultivo
de
trigo
http://www.inta.gov.ar/mjuarez/info/documentos/economia/ectrigo10.pdf.
Consultado noviembre de 2010
Glick BR (1995) The enhancement of plant growth by free living bacteria. Can J
Microbiol 41:109-114
Glickmann E, Dessaux Y (1995) A Critical Examination of the Specificity of the
Salkowski Reagent for Indolic Compounds Produced by Phytopathogenic
Bacteria. Appl Environ Microbiol 61(2):793-796
González-López J, Salmerón V, Martínez-Toledo MV, Ballesteros F, y RamosCormenzana A (1986) Production of auxins, gibberellins and cytokinins by
Azotobacter vinelandi ATCC 12837 in chemically defined media and dialysed
soil media. Soil Biol Biochem 18:119-120
Gustafson P, Raskina O, Ma X, Nevo E (2009) Wheat Evolution, Domestication, and
Improvement. En: Carver B F (ed) Wheat Science and Trade. Wiley-Blackwell,
Oxford, pp 5-30
Halversen WV, Hoge WG (1941) The Azotobacter Plaque Test as Applied to the
Determination of Phosphate Deficiency in Idaho Soils. Agron J 34 (6): 503–512
Häne BG, Jäger K, Drexler H. (1993) The Pearson product moment correlation
coefficient is better suited for identification of DNA fingerprint profiles than
band matching algorithms. Electrophoresis. 14: 967-972
Harper HT, Lynch JM (1979) Effects of Azotobacter chroococcum on barley seed
germination and seedling development. J Gen Microbiol 112:45-51
Haynes RJ, Graham MH (2005) Catabolic diversity of soil microbial communities under
sugarcane and other land uses estimated by Biolog and substrate-induced
respiration methods. Appl Soil Ecol 29(2):155-164
Heyndrickx M, Vauterin L, Vandamme P, Kersters K, De Vos P (1996)
Applicability
of combined amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) patterns in
bacterial phylogeny and taxonomy. J Microbiol Methods 26:247-259.
Hoagland, DR, Arnon DI (1950) The water-culture method for growing plants without
soil. California Agricultural Experiment Station Circular 347:1-32.
Höfte M y Bakker P (2007) Competition for Iron and Induced Systemic Resistance by
Siderophores of Plant Growth Promoting Rhizobacteria. En Varma A,
Chincholkar SB (eds) Soil Biology, Volume 12, Microbial Siderophores.
Springer-Verlag, Berlin, pp 121-133
Hussain A, Arshad M, Hussain A, Hussain F (1987) Response of maize (Zea mays) to
Azotobacter inoculation under fertilizedand unfertilized conditions. Biol Fertil
Soil 4:73-77
Idris EE, Iglesias EJ, Talon M, Borriss R (2007) Tryptophan-dependent production of
indole-3-acetic acid (IAA) affects level of plant growth promotion by Bacillus
amyloliquefaciens FZB42. Mol Plant Microbe Interact 20:619-626
Jackson RM, Brown ME, Burlinghum SK (1964) Similar effects on tomato Plants of
Azotobacter inoculation and application of gibberellins. Nature 203:851-852
Jensen, H L (1965) Non-symbiotic nitrogen fixation. En Bartholomew WV, Clark FE
(ed.) Soil nitrogen, Monograph 10. American Society of Agronomy, Wisconsin,
pp 436-480
93
Jones D II(1932) The soil plaque Azotobacter test for soil deficiency. Scientific Agr
12:716-726
Joseph B, Ranjan Patra R, Lawrence R (2007) Characterization of plant growth
promoting rhizobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.) Int J
Plant Prod 2:141-152
Joshi P, Juwarkar AA (2009) In-vivo studies to Elucidate the Role of Extracellular
Polymeric Substances from Azotobacter in immobilization of heavy metals.
Environ Sci Technol 43(15):5884-5889
Kannaiyan S, Govindarajan K, Lewin HD (1980) Effect of foliar spray of Azotobacter
chroococcum on rice crop. Plant Soil 56:487-490
Karthikeyan B, Jaleel CA, Gopi R, Deiveekasundaram M (2007) Alterations in seedling
vigour and antioxidant enzyme activities in Catharanthus roseus under seed
priming with native diazotrophs. J Zhejiang Univ Sci B 8:453-457
Kaymak, H (2010) Potential of PGPR in Agricultural Innovations. En: Maheshwari DK
(ed) Plant Growth and Health Promoting Bacteria. Microbiology Monographs
Vol 18 Springer, Berlin, pp 45-79
Kenneddy C, Rudnick P, MacDonald M, Melton T (2005) Genus III: Azotobacter. En:
Garrity GM (ed) Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology. Second edition.
Vol. Two. The Proteobacteria. Part B. The Gammaproteobacteria. Springer, New
York, pp 384-402
Kennedy IR, Tchan YT (1992) Biological nitrogen fixation in non-leguminous field
crops: Recent advances. Plant Soil 141:93-118
Kennedy IR, Islam N (2001) The current and potential contribution of asymbiotic
nitrogen fixation to nitrogen requirements on farms: A review. Aust J Exp
41:447-457
Kennedy IR, Choudhury ATMA, Kecskés ML (2004) Non-symbiotic bacterial
diazotrophs in crop-farming systems: can their potential for plant growth
promotion be better exploited? Soil Biol Biochem 36:1229-1244
Khalid M, Zahir ZA, Waseem A, Arshad M (1999) Azotobacter and L-tryptophan
application for improving wheat yield. Pak J Biol Sci 2:739-742
Khan MS, Zaidi S (2007) Synergistic Effects of the Inoculation with Plant GrowthPromoting Rhizobacteria and an Arbuscular Mycorrhizal Fungus on the
Performance of Wheat. Turk J Agric For 31:355-362
Khanafari A, Sepahi AA, Mogharab M (2006) Production and recovery of poly (3hydroxybutyrate from whey degradation by Azotobacter. Iranian J Environ Healt
Sci Eng 3 (3):193-198
Khanafari A, Sepahei A (2007) Alginate biopolymer production by Azotobacter
chroococcum from whey degradation. Int J Environ Sci Tech 4(4):427-32
Kizilkaya R (2008) Yield response and nitrogen concentrations of spring wheat
(Triticum aestivum) inoculated with Azotobacter chroococcum strains. Ecol Eng
33:150-156
Kizilkaya R (2009) Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp. strains isolated from
soils in different ecosystems and relationship between them and the
microbiological properties of soils. J Environ Biol 30: 73-82
Kloepper JW, Schroth NM, Miller TD (1980) Effects of rhizosphere colonization by
plant growth promoting rhizobacteria on potato plant development and yield.
Phytopathology 70:1078-1082
Kloepper JW, Hume DJ, Scher FM, Singleton C, Tipping B, Aliberte MI, Frauley K,
Kutchaw T, Simonson C, Lifshitz R, ZaleskaI, Lee L (1988) Plant growthpromoting rhizobacteria on canola (rapeseed). Plant Dis 72:42-46
94
Kole MM, Altosaar I (1988) Distribution of Azotobacter in Eastern Canadian soils and
in association with plant rhizospheres. Can J Microbiol 34:815-817
Kraepiel AML, Bellenger J-P, Wichard T, Morel FMM (2009) Multiple roles of
siderophores in free-living nitrogen-fixing bacteria. Biometals 22(4):573-81.
Kumar V, Narula N (1999) Solubilization of inorganic phosphates and growth
emergence of wheat as affected by Azotobacter chroococcum mutants. Biol
Fertil Soils 28:301-305
Kurdish IK, Bega ZT, Gordienko AS, Dyrenko DI (2008) The effect of Azotobacter
vinelandii on plant seed germination and adhesion of these bacteria to cucumber
roots Appl Biochem Microbiol 44 (4):400-404
Lifshitz R, Kloepper JW, Kozlowski M, Simonson C, Carlson J, Tipping EM, Zalesca I
(1987) Growth promotion of canola (rapeseed) seedlings by a strain of
Psedomonas putida under gnotobiotic conditions. Can J Microbiol 33:390-395
Loper JE, Schroth MN (1986) Influence of bacterial sources of indole-2-acetic acid on
root elongation of sugar beet. Phytopathology 76:386-389
Louws FJ, Fulbright DW, Stephens CT, de Bruijn FJ (1994) Specific genomic
fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and
strains generated with repetitive sequences and PCR. Appl Environ Microbiol
60:2286-2295
Lü C, Huang B (2010) Isolation and characterization of Azotobacteria from pine
rhizosphere Afr J Microbiol Res 4(12):1299-1306
Lugtenberg B, Kamilova F (2009) Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev
Microbiol 63:541-556
Lupski JR, Weinstock GM (1992) Short, interspersed repetitive DNA sequences in
prokaryotic genomes. J Bacteriol 174:4525-4529
Nannipieri P, Badalucco L. (2003) Biological processes. En: Benbi DK, Nieder R(Eds),
Handbook of Processes and Modelling in the Soil–Plant System. Haworth Press,
Binghamton, New York, pp. 57-82.
MAGyP (2010) Informe semanal al 9/12/10. Ministerio de Agricultura Ganadería y
Pesca,
Presidencia
de
la
Nación.
http://www.siia.gov.ar/estimaciones_agricolas/01semanal/_archivo/100000_2010/001200_Diciembre/101209%20Informe%20se
manal%20al%2009-Dic-10.pdf. Consultado en diciembre de 2010
Manske GGB, Vlek PLG (2002) Root architecture – wheat as a model plant. En: Waisel
Y, Eshel A, Kafkafi U (eds) Plant Roots: The Hidden Half, 3 era edn. Marcel
Dekker, New York, pp 249-259
Martinez-Toledo MV, J. Gonzalez-Lopez J, de la Rubia T, Moreno J, RamosCormenzana A (1988) Grain yield response of Zea mays (hybrid AE 703) to
Azotobacter chroococcum H23. Biol Fertil Soils 6:352-353
Martinez-Toledo MV, Moreno J, De la Rubia T, González López J (1988) Root exudates
of Zea mays and production of auxins, gibberellins and cytokinins by
Azotobacter chroococcum. Plant Soil 110:149-152
Martyniuk S, Martyniuk M (2003) Occurrence of Azotobacter Spp. in Some Polish
Soils. Pol J Environ Stud 12( 3):371-374
Miles AA, Misra SA (1938) The estimation of the bactericidal power of blood. J
Hyg 38:732-737
Miralles DJ, González FG (2009) El trigo en Argentina: Perspectivas ecofisiológicas del
pasado,
presente
y
futuro
para
aumentar
el
rendimiento.
http://agro.fauba.info/files/miralles_aapresid.pdf. Consultado en noviembre de
2010
95
Mishustin EN (1970) The importance of non-symbiotic nitrogen fixing micro-organisms
in agriculture. Plant Soil 32:545-554
Mrkovacki N, Milic Y (2001) Use of Azotobacter chroococcum as potentially useful in
agricultural application. Ann Microbiol 51:145-158.
Narula N, Kumar V, Behl RK, Deubel A, Gransee A, Merbach W (2000) Effect of
Psolubilizing Azotobacter chroococcum on N, P, K uptake in P-responsive wheat
genotypes grown under greenhouse conditions. J Plant Nutr Soil Sci 163:393398
Narula N, Remus R, Deubel A, Granse A, Dudeja SS, Behl RK, Merbach W (2007)
Comparison of the effectiveness of wheat roots colonization by Azotobacter
chroococcum and Pantoea agglomerans using serological techniques. Plant Soil
Environ 53:167-176
Nautiyal CS (1999) An efficient microbiological growth medium for screening
phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiol Lett 170:265-270
Nieto KF, Frankenberger WTJr (1989) Biosynthesis of cytokinins byAzotobacter
chroococcum. Soil Biol Biochem 21:967-972
Nieto KF, Frankenberger, WTJr (1990) Influence of adenine, isopentyl alcohol and
Azotobacter chroococcum on the growth of Raphanus sativus (radish). Plant and
Soil 127:147-156
Nieto KF, Frankenberger WT (1991) Influence of adenine, isopentyl alcohol and
Azotobacter chroococcum on the vegetative growth of Zea mays. Plant Soil
135:213-221.
Oda Y, Wanders W, Huisman LA, Meijer WG, Gottschal JC, Forney LJ (2002)
Genotypic and phenotypic diversity within species of purple nonsulfur bacteria
isolated from aquatic sediments. Appl Environ Microbiol 68:3467–3477
Okon Y, Kapulnik Y (1986) Development and function of Azospirillum-Inoculated
roots. Plant Soil 90:3-16
Ortiz-Castro R, Contreras-Cornejo HA, Macias-Rodriguez L, Lopez-Bucio J (2009) The
role of microbial signals in plant growth and development. Plant Signal Behav
4:701-712
Page WJ (1987) Iron-dependent production of hydroxamate by sodium-dependent
Azotobacter chroococucum. Appl Environ Microbiol 53:1418-1424
Page WJ, von Tigerstrom M (1988) Aminochelin, a catecholamine siderophore
produced by Azotobacter vinelandii. J Gen Microbiol 134:453-460
Page WJ, Shivprasad S (1991) Azotobacter salinestris sp. nov., asodium-dependent,
microaerophilic, and aeroadaptive nitrogen-fxing bacterium. Int J Syst Bacteriol
41:369-376
Pandey A, Sharma ES, Palni LM (1998) Influence of bacterial inoculation on maize in
upland farming systems of the Sikkim Himalaya. Soil Biol Biochem 30: 379384.
Patten CL, Glick BR (2002) The role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in the
development of the host plant root system. Appl Environ Microb 68:3795-3801
Peretti A (1994) Manual para Análisis de Semillas. Editorial Hemisferio Sur, Buenos
Aires
Pérez-Miranda S, Cabirol N, George-Téllez R, Zamudio-Rivera LS, Fernández FJ
(2007) O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection J
Microbiol Methods 70(1):127-131
Perrig D, Boiero L, Masciarelli O, Penna C, Cassán F, Luna V (2007) Plant growth
promoting compounds produced by two agronomically important strains of
Azospirillum brasilense, and their implications for inoculant formulation. Appl
96
Microbiol Biotechnol 75:1143-1150
Perticari A, Puente ML, García JE (2010) Consideraciones finales. En: Puente ML,
García JE, Perticari A (eds) Uso Actual y Potencial de Microorganismos para
Mejorar la Nutrición y el Desarrollo en Trigo y Maíz. INTA, CABA, pp 77-81
Pikovskaya RI (1948) Mobilization of phosphorus in soil connection with the vital
activity of some microbial species. Microbiologiya 17:362–370
Pinton, R., Z. Varanini, and P. Nannipieri. 2000. The Rhizosphere. Marcel Dekker, New
York.
Plassé C (2007) Molecular and phenotypic diversity of wheat (Triticum aestivum L.) for
winter hardiness. Disertación, Zurich
Pochon J (1954) Manuel technique d’analyse microbiologique du sol, Masson, Paris.
Rademaker JLW, Hoste B, Louws FJ, Kersters K, Swings J, Vauterin L, Vauterin P, de
Bruijin FJ (2000) Comparison of AFLP and rep-PCR genomic fingerprinting
with DNA-DNA homology studies: Xanthomonas as a model system. Int J Syst
Evol Microbiol 50:665-677
Rai SN, Gaur AC (1988) Characterization of Azotobacter spp. and effect of Azotobacter
and Azospirillum as inoculant on the yield and N-uptake of wheat crop. Plant
Soil 109: 131-134
Remans R, Beebe S, Blair M, Manrique G, Tovar E, Rao I, Croonenborghs A, TorresGutierrez R, El-Howeity M, Michiels J, Vanderleyden J (2008) Physiological
and genetic analysis of root responsivenessto auxin-producing plant growthpromoting bacteria incommon bean (Phaseolus vulgaris L.). Plant Soil 302:149161
Ribas A, Torres D, Penna C, Luna V, Cassán FD (2009) Inoculación de semillas de
trigo, maíz y soja concultivos en fase exponencial o estacionaria de a. brasilense
az39 y su relación con la producción de fitohormonas y la promoción del
crecimiento vegetal. Reunión Nacional de Biología de Suelos y Encuentro sobre
Fijación Biológica de Nitrógeno, Tucumán. Libro de Resúmenes, pp 91-106
Ribaudo C, Krumpholz E, Cassán F, Bottini R, Cantore M, Curá A (2006) Azospirillum
sp. promotes root hair development in tomato plants through a mechanism that
involves ethylene. J Plant Growth Regul 24:175-185
Rodelas B, González-López J, Pozo C, Salmerón, V, Martínez-Toledo, MV (1999)
Response of faba bean (Vicia faba L.) to combined inoculation with Azotobacter
and Rhizobium leguminosarum bv. viceae. Appl Soil Ecol 12:51-59
Rodicio M, Mendoza MC (2004) Identificación bacteriana mediante secuenciación del
ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica.
Enferm Infecc Microbiol Clin 22:238-245
Rodríguez H, Fraga R, Gonzalez T, Bashan Y (2007) Genetics of phosphate
solubilization and its potential applications for improving plant growthpromoting bacteria. En: First International Meeting on Microbial Phosphate
Solubilization. Velazquez-Perez E, Rodriguez-Barrueco C (eds) Series:
Developments in Plant and Soil Sciences, Vol. 102. Springer, Dordrecht, pp. 1521
Rosas S y Schroder E (1992) Informe UNESCO. Short Time Fellowships in
Biotechnology
Rovira AD (1963) Microbial inoculation of plants. I. Establishment of free living
nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere and their effects on maize, tomato,
and wheat. Plant Soil 19:304-14
Rovira AD (1965) Interactions between plant roots and soil microorganisms. Ann Rev
Microbiol 19:241-266
97
Salantur A, Ozturk A, Akten S (2006) Growth and yield response of spring wheat
(Triticum aestivum L.) to inoculation with rhizobacteria. Plant Soil Environ
52(3):111–118
Sanguineti MC, Li S, Maccaferri M, Corneti S, Rotondo F, Chiari T, Tuberosa R
(2007) Dissection of genetic variability for root architecture in elite durum wheat
germplasm. Ann Appl Biol 151:291-305
Schwyn B, Neilands JB (1987) Universal chemical assay for the detection and
determination of siderophores. Anal Biochem 160:47-56
Setubal JC, dos Santos P, Goldman BS, Ertesvag H, Espin G, Rubio LM, Valla S,
Almeida NF, Balasubramanian D, Cromes L, Curatti L, Du Z, Godsy E, Goodner
B, Hellner-Burris K, Hernandez JA, Houmiel K, Imperial J, Kennedy C, Larson
TJ, Latreille P, Ligon LS, Lu J, Maerk M, Miller NM, Norton S, O'Carroll IP,
Paulsen I, Raulfs EC, Roemer R. et al. (2009) Genome sequence of Azotobacter
vinelandii, an obligate aerobe specialized to support diverse anaerobic metabolic
processes. J Bacteriol 191(14):4534-4545
Shabaev VP, Smolin VY, Strekozova VI (1991) The effect of Azospirillum brasilense
Sp. 7 and Azotobacter chroococcum on nitrogen - balance in soil under cropping
with oats (Avena sativa L.). Biol Fert Soils 10:290-292
Singh R, Behl RK, Singh KP, Jain P, Narula N (2004) Performance and gene effects for
wheat yield under inoculation of arbuscular mycorrhiza fungi and Azotobacter
chroococcum. Plant Soil Environ 50:409-415
Sneath PHA, Sokal RR (1973) Numerical Taxonomy. Freeman, San Francisco.
Socolofsky MD, Wyss O (1961) Cysts of Azotobacter. J Bacteriol 81:946-954
Somova LA, Pechurkin NS, Sarangova AB, Pisman TI (2001) Effect of bacterial
population density on germination wheat seeds and dynamics of simple artificial
ecosystems. Adv Space Res 27(9):1611-1615
Spaepen S, Vanderleyden J, Remans R. (2007) Indole-3-acetic acid in microbial and
microorganism–plant signaling. FEMS Microbiol Rev 31:425-448
Spaepen S, Dobbelaere S, Croonenborghs A, Vanderleyden J (2008) Effects of
Azospirillum brasilense indole-3-acetic acid production on inoculated wheat
plants. Plant Soil 312:15:23.
Taller BJ, Wong TY (1989) Cytokinins in Azotobacter vinelandii. Appl Environ
Microbiol 55:266-267
Tejera N, Lluch C, Martínez-Toledo MV, González-López J (2005) Isolation and
characterization of Azotobacter and Azospirillum strains from the sugarcane
rhizosphere. Plant Soil 270(1-2):223-232
Thavasi R, Subramanyam Nambaru VRM, Jayalakshmi S, Balasubramanian T, Banat
IM (2009) Biosurfactant Production by Azotobacter chroococcum Isolated from
the Marine Environment. Mar Biotechnol 11:551-556
Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997) The
CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequences
alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 25:4876-4882
Thompson JP, Skerman VBD (1979) Azotobacteraceae: the taxonomy and ecology of
the aerobic nitrogen-fixing bacteria. Academic Press, Inc., London.
Vande Broek A, Gysegom P, Ona O, Hendrickx N, Prinsen E, Van Impe J, Vanderleyden
J (2005) Transcriptional analysis of the Azospirillum brasilense indole-3pyruvate decarboxylase gene and identification of a cis-acting sequence involved
in auxin responsive expression. Mol Plant-Microbe Interact 18:311-323
Verma JP, Janardan Y, Tiwari KN, Lavakush, Singh V (2010) Impact of plant growth
promoting rhizobacteria on crop production. Int J Agr Res 5(11):954-983.
98
Verna LC (1945) Técnicas generales y experimentación bacteriológica. El Ateneo,
Buenos Aires, pp 293-303
Versalovic J, Koeuth T, Lupski JS. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in
eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucl Acids
Res, 24:6823-6831
Versalovic J, Schneider M, de Bruijn FJ, Lupski JR (1994) Genomic fingerprinting of
bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth Mol
Cell Biol 5: 25-40
Vidal de Latina MC, Jaime MA y Clúa A (2009) Bacterias fijadoras libres de nitrógeno
atmosférico en raíz de Nerium Oleander, L., laurel de jardín en TucumánArgentina. Reunión Nacional de Biología de Suelos y Encuentro sobre Fijación
Biológica de Nitrógeno, Tucumán, Libro de Resúmenes, pp 4-7
Wichard T, Bellenger JB, Morel, FMM, Kraepiel AML (2009) Role of the siderophore
azotobactin in the bacterial acquisition of nitrogenase metal cofactors. Environ
Sci Technol 43:7218-7224
Xie H, Pasternak JJ, Glick BR (1996) Isolation and characterization of mutants of the
plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 that
overproduce indoleacetic acid. Curr Microbiol 32:67-71
Yasari E, Patwardhan AM (2007) Effects of (Azotobacter and Azospirillum) inoculants
and chemical fertilizers on growth and productivity of canola (Brassica napus
L.). Asian J Plant Sci 6(1):77-82
Yaxley JR, Ross JJ, Sherriff LJ, Reid JB (2001) Gibberellin biosynthesis mutations and
root development in pea. Plant Physiol 125:627-633
Young JPW. Downer HL, Eardly BD (1991) Phylogeny of the phototrophic Rhizobium
strain BTAil by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA
gene segment. J Bacteriol 173: 2271-2277
Zahir ZA, Asghar HN, Akhtar MJ, Arshad M (2005) Precursor (L-tryptophan)-inoculum
(Azotobacter) interaction for improving yields and nitrogen uptake of maize. J
Plant Nutr 28:805-817
Zambre MA, Konde BK, Sonar KR (1984) Effect of Azotobacter chroococcum and
Azospirillum brasiliense inoculation under graded levels of nitrogen on growth
and yield of wheat. Plant Soil 79:61-67
Zhao Y (2010) Auxin Biosynthesis and Its Role in Plant Development. Annu Rev Plant
Biol 61:49-64
Ziemiecka J (1932) The Azotobacter test of soil fertility applied to the classical fields at
Rothamsted. J Agric Sci 22: 797-810
APÉNDICE
______________________________________________________________________
99
101
1. Metodología LC-MS para determinación de fithormonas.
Las muestras (10 ml) fueron suplementadas con 10 ng de cada uno de los
estándares internos de cada hormona (AIA y GA3) y se dejaron estabilizar por 30
minutos en heladera. Luego se procedió a particionar por duplicado los sobrenadantes
acidificados y tratados exógenamente con estándares con igual volumen de acetato de
etilo (10 ml). Se colectaron las fracciones orgánicas en balones y se evaporaron a
sequedad total en evaporador rotatorio orbital a 35° C. Las muestras se resuspendieron
en un volumen final de 1.5 ml de metanol puro, se filtraron (0,22 µm), se recolectaron
en tubos plásticos tipo eppendorff y evaporaron por completo en sistema de vacío y a
temperatura ambiente. Las muestras fueron resuspendidas en 100 µl de metanol puro y
se colocaron en viales específicos, conteniendo insertos de 150 µl de capacidad.
Finalmente fue inyectado un volumen de 10 µl de cada muestra en un sistema de
cromatografía líquida y espectrometría de masas en tandem (LC-MS MS). El contenido
endógeno de cada hormona (AIA y GA3) se calculó mediante la aplicación de la
ecuación que relaciona el área del pico y el tiempo de retención obtenido por cada
compuesto presente en la muestra, con respecto al obtenido para su correspondiente
estándar. En el caso de la Z el contenido se calculó mediante la relación del área del
pico y el tiempo de retención obtenido para una muestra de la hormona pura, con
respecto al obtenido en la muestra procesada.