micro general guía 2011 de tp
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1 GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS MICROBIOLOGÍA GENERAL ÁREA MICOLOGÍA AÑO 2011 2 TRABAJO PRÁCTICO N° 1 Tema: Elementos a utilizar en el laboratorio de Micología Técnicas de siembra y aislamiento. Objetivos Aislar hongos por los siguientes métodos: siembra espontánea, agotamiento en superficie, técnica del anzuelo queratinoso, diluciones sucesivas y plaqueo directo de granos. Materiales Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Driglasky. Tubos de ensayo estériles. Tubos de centrífuga estériles. Pipetas estériles. Agua destilada y solución fisiológica estériles. Tween 80 estéril. Cloranfenicol (5% P/V en alcohol etílico). Rosa de bengala (1/150). Embudo y gasa. Acido cítrico al 10%. Ansa calibrada. Pelos de caballo estériles. Tubos con Sabouraud glucosa en plano inclinado y en columna. Tubos con Sabouraud glucosa cloranfenicol en columna. Erlenmeyers estériles. Tubos con Agar Papa Dextrosa (APD) en plano inclinado y en columna. Placas de Petri estériles. Granos, materia fecal, tierra. Técnicas 1) Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontánea: Se prepararan placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Se colocan las placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos se cierran las placas y se incuban a 28°C durante una semana. Obse rvar. Efectuar una resiembra (repique) de las colonias de interés en tubos con agar inclinado para obtener un cultivo puro. 3 2) Aislamiento y recuento de levaduras por agotamiento en superficie: Se siembran 10µl de orina completa, previamente agitada, en la superficie de placas conteniendo medios de Sabouraud-glucosa y Sabouraud-glucosacloranfenicol. Se incuba a 28°C durante una semana, realizando el recuento de colonias y el aislamiento para la posterior identificación de las cepas de interés. Factor para recuento: 100 3) Aislamiento de hongos queratinofílicos por la técnica del anzuelo queratinoso: En una placa de Petri estéril se coloca una capa gruesa de la tierra en estudio, sobre ella se depositan pelos de caballo estériles y se humecta. Se incuba a 28°C durante 15 a 30 días, aislándose lueg o los hongos de interés. 4) Aislamiento y recuento de hongos de suelo y alimentos por diluciones sucesivas: Se colocan 10 g de suelo cuya población fúngica se desea estudiar en un erlenmeyer estéril, se agregan a 90 ml de agua destilada y se agita, obteniendo luego una serie progresiva de diluciones (1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000). En placas de petri estériles se mezclan 10 ml de APD con 0,1 ml de rosa de bengala y 0,1 ml de cloranfenicol y se deja solidificar. Sobre las mismas se siembran 0,1 ml de las diluciones 1/1000, 1/10000, 1/100000, dispersándolas con espátula de Driglasky. Se incuba a 28°C durante una semana. Se realiza el recuento de colonias (en aquellas placas que contengan entre 30 y 300 colonias) y el aislamiento de las cepas de interés. Esta técnica puede emplearse también para alimento finamente molido sembrando las diluciones correspondientes en medio DRBC y DG18. 5) Plaqueo directo de alimentos particulados: Para el aislamiento de cepas fúngicas a partir de alimentos particulados (granos, semillas, trozos de alimentos) se emplea la técnica de plaqueo directo. Los granos son desinfectados superficialmente sumergiéndolos 2 minutos en una solución de hipoclorito de sodio (0.4 % de cloro activo – dilución 1/10 de lavandina de uso doméstico). Después de escurrirlas, las partículas son colocadas utilizando una pinza estéril, a razón de 8-10 granos por placa, directamente sobre placas de medio DRBC (diclorán-rosa de bengalacloranfenicol-agar) y DG18 (diclorán 18 %-cloranfenicol-agar) que se incuban a 25 ºC durante 5 días. 4 TRABAJO PRÁCTICO N° 2 Tema: Macromorfología de las colonias fúngicas Micromorfología del desarrollo fúngico vegetativo Técnicas de siembra de cepas fúngicas Objetivos Describir macromorfológicamente las colonias fúngicas. Sembrar hongos para obtener colonias adultas, repicar cepas como parte del estudio taxonómico. Identificar estructuras micromorfológicas básicas del desarrollo fúngico. Aplicar la técnica de cultivo de adhesión. Materiales Caja de trabajo. Placas de Petri con desarrollos de hongos filamentosos y levaduriformes crecidos en distintos medios de cultivo sólido. Placas de Petri estériles. Placas de Petri con medio de cultivo Sabouraud. Soportes en V. Agua destilada estéril. Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de montar para observación de su micromorfología. Técnicas 1) Siembra de cepas fúngicas para obtención de colonias adultas: Preparar placas de Petri con medio Agar Papa Dextrosa u otros medios adecuados. Sembrar por un toque en el centro de la placa la cepa fúngica (a partir de un cultivo puro). Incubar a 28°C entre 5 – 7 días. Observar. Describir. 2) Descripción macromorfológica de colonias fúngicas: Observar distintas colonias fúngicas ya desarrolladas en los medios de cultivo apropiados. Describir sus características macromorfológicas como color, forma, aspecto, consistencia, velocidad de crecimiento, etc. como parte del estudio taxonómico de un hongo. 5 3) Observación microscópica de desarrollos fúngicos: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de desarrollos vegetativos de hongos levaduriformes y filamentosos (tabicados y no tabicados) hialinos y dematiáceos. Relacionar las características micromofológicas con la macromorfología que presentan las colonias fúngicas. 2) Cultivo de adhesión: En una placa de petri estéril, colocar un soporte en V y un portaobjetos previamente flameados. Depositar sobre el portaobjetos 3 cuadrados de 1 cm de lado de un medio de cultivo apropiado. Sembrar los medios con el hongo en estudio y cubrir con cubreobjetos previamente flameados y enfriados. Colocar sobre la base de la caja de Petri agua destilada estéril e incubar a 28°C el tiempo necesario. Para su observación retirar el cubreobjetos y colocarlo sobre un portaobjetos limpio en el que previamente se ha depositado una gota del líquido de montaje adecuado. 6 CARACTERÍSTICAS MACROMORFOLOGICAS DE COLONIAS FÚNGICAS COLOR • • ANVERSO REVERSO producción de pigmento difusible SUPERFICIE • • • • • • LISA ACUMINADA CRATERIFORME RADIADA UMBILICADA CEREBRIFORME BORDE • • • • LISO RADIADO FESTONEADO LOBULADO CONSISTENCIA • • • • BLANDA FILANTE ADHERENTE LEÑOSA ASPECTO • • • • • • CREMOSO YESOSO CEREBRIFORME ALGODONOSO AFELPADO ATERCIOPELADO DESARROLLO • • • . POBRE REGULAR ABUNDANTE 7 TRABAJO PRÁCTICO N° 3 Tema: Reproducción asexual. Conidiogénesis tálica. Objetivos Reconocer micromorfológicamente las formaciones de esporas asexuales y conidios más comunes de la reproducción asexuada tálica Observar la micromorfología de levaduras utilizando el medio de agar harina de maíz. Materiales Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maíz). Caja de trabajo. Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de montar para observación de su micromorfología. Técnicas 1) Observación microscópica de elementos de conidiación tálica: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de esporas asexuales y elementos de reproducción tálica: clamidoconidios, macroconidios, microconidios, artroconidios (holo y enteroártricas), tratando de caracterizar los elementos observados de acuerdo a los criterios de clasificación. 8 TRABAJO PRÁCTICO N° 4 Tema: Reproducción asexual. Conidiogénesis blástica. Objetivos Reconocer micromorfológicamente las formaciones de conidios más comunes de la reproducción asexuada blástica. Materiales Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maíz) Caja de trabajo Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de montar para observación de su micromorfología Técnicas 1) Observación microscópica de elementos de conidiación blástica: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de elementos de reproducción blástica: holo o enteroblásticas a partir de células conidiogénicas determinadas o indeterminadas, tratando de caracterizar los elementos observados de acuerdo a los criterios de clasificación. 2) Siembra de levaduras en AHM: Dividir una placa de Petri conteniendo medio de cultivo AHM en cuatro secciones. En cada cuadrante sembrar con ansa una levadura a partir de un cultivo puro. Efectuar la siembra realizando tres estrías paralelas, con una separación de 5mm aproximadamente y con un largo mayor a 20 mm. Colocar sobre ellas un cubreobjetos previamente flameado y enfriado. A las 48 hs. observar las caracteristicas micromorfológicas del desarrollo. 9 TRABAJO PRÁCTICO N° 5 Tema: Reproducción sexuada. Objetivos Reconocer sexuada micromorfológicamente las estructuras de reproducción Materiales Caja de trabajo Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de montar para observación de su micromorfología Técnicas 1) Observación microscópica de elementos de reproducción sexuada: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de elementos de reproducción sexuada: cleistotecios, peritecios, apotecios, ascos desnudos. 10 TRABAJO PRÁCTICO N° 6 Tema: Dimorfismo fúngico Objetivos Reconocer las características macro y micromorfológicas de algunas hongos dimórficos. Materiales Caja de trabajo Tubos de hemólisis con suero estéril Colonias y preparados de cultivos de diferentes hongos dimórficos Técnicas 1) Producción de tubos germinativos Inocular 0,5 ml de suero estéril con una pequeña cantidad de levadura con aguja. Incubar a 37°C, observar microscópicamente u na gota de la suspensión cada 30 minutos, hasta las 3 horas. La presencia de tubos germinativos permite la identificación rápida de Candida albicans y Candida dubliniensis. 2) Observación macro y micromorfológica de cultivos de hongos dimórficos: Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum 11 LÍQUIDOS DE MONTAJE DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS COLORANTE GUEGUÉN (Azul de algodón) Ácido láctico.............................................100 g Sudán III..................................................0.10 g Azul de algodón.......................................0.10 g Solución alcohólica de Yodo..............10-20 gotas. LÍQUIDO DE MONTAR Glicerina....................................................40 g Ácido láctico..............................................20 g Fenol cristalizado......................................20 g Agua destilada..........................................20 ml MEDIOS DE CULTIVO AGAR SABOURAUD GLUCOSA Medio utilizado para el aislamiento, identificación y mantenimiento de la gran mayoría de los hongos patógenos Peptona......................................................10 g Glucosa......................................................20 g Agar-agar...................................................20 g Agua destilada........................................1000 ml Ajustar el pH a 5.6. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. Para preparar Sabouraud Glucosa Cloranfenicol agregar a la preparación anterior 100 ml de solución de cloromicetina (cloranfenicol) 0.5 %P/V (en etanol) antes de esterilizar. AGAR PAPA DEXTROSA Extracto de papa......................................500 ml Glucosa......................................................20 g Carbonato de calcio..................................0.2 g Sulfato de magnesio heptahidratado........0.2 g Agar-agar...................................................15 g Agua destilada.........................................500 ml 12 Extracto de papa: Pelar la papa y cortarla en trozos pequeños. Poner a hervir con 500 ml de agua destilada. Filtrar a través de una gasa y reponer el volumen anterior. Añadir los otros componentes. Disolver por calentamiento. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. DICLORAN – ROSA DE BENGALA – CLORANFENICOL – AGAR (DRBC) Glucosa.....................................................10 g Peptona.......................................................5 g KH2PO4...................................................…..1 g MgSO4.7H2O.............................................0.5 g Agar-agar…................................................15 g Rosa de Bengala......................................25 mg (soluc. 5% p/v en agua, 0.5 ml) Diclorán.......................................................2 mg (soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml) Cloranfenicol............................................100 mg Agua destilada..............................................1 l Después de agregar todos los ingredientes, esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos. PH final entre 5.5 – 5.8. Al macenar el medio ya preparado lejos de la luz ya que fotoproductos del rosa de bengala son altamente inhibitorios de algunos hongos, especialmente levaduras. En la oscuridad el medio es estable por más de un mes a 1-4 °C. Las soluciones stock de rosa de bengala y cloranfenicol no necesitan esterilización y también son estables por largos períodos. DICLORAN 18% GLICEROL AGAR (DG18) Glucosa.....................................................10 g Peptona.......................................................5 g KH2PO4...................................................…..1 g MgSO4.7H2O.............................................0.5 g Agar-agar…................................................15 g Glicerol......................................................220 g Diclorán.......................................................2 mg (soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml) Cloranfenicol............................................100 mg Agua destilada..............................................1 l Agregar los componentes minoritarios y el agar a aproximadamente 800 ml de agua destilada. Calentar para disolver el agar y completar a 1 litro con agua 13 destilada. Agregar el glicerol. Notar que la concentración final del glicerol es 18% p/p. Esterilizar por autoclavado a 121 °C duran te 15 minutos. PH final 5.5 – 5.8, Aw: 0.955. AGAR HARINA DE MAÍZ Harina de maíz amarillo.............................40 g Agar-agar...................................................15 g Agua destilada........................................1000 ml Disolver la harina de maíz en 500 ml de agua destilada. Calentar hasta disolución completa. Filtrar a través de gasa y reconstituir el volumen anterior. Añadir el agar disuelto en los 500 ml de agua destilada restantes. Volver a calentar hasta disolver todos los componentes. Filtrar hasta obtener un líquido transparente. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. AGAR SEMILLAS DE GIRASOL Extracto de semillas de girasol...............200 ml Glucosa.....................................................10 g Agar-agar..................................................20 g Agua destilada........................................800 ml Autoclavar 15 minutos a 121 °C. Preparación de extracto de semillas de girasol: Moler a polvo 70 g de semillas de girasol con cáscara, agregar 350 ml de agua destilada. Autoclavar 15 minutos a 121 °C y filtrar a través de gasa estéril .
