cuantificación de proteínas, método de biuret.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS, MÉTODO DE BIURET.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas
constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los
procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de
moléculas (Berg et al, 2008).
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica
de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína
concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros
propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos
de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes (Segal, 2005).
La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de
un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un
enlace peptidico, como las proteinas (Cambell et al, 2006):
Figura 1: Reacción de Biuret.
La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la
concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de
elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en
principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los
enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración).
Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se
produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática
que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema
y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene
la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede
cuantificarse y, empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la
muestra problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)
OBJETIVO GENERAL
Aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en
una muestra problema.
OBJETIVOS PARTICULARES
-
Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en los métodos
colorimétricos.
-
Aprender el empleo de una curva patrón para la determinación de la
cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de
proteínas.
-
Determinar la concentración de proteínas en una muestra de leche,
utilizando el método de Biuret.
HIPÓTESIS
Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada con el reactivo de
Biuret ésta será proporcional a la concentración de proteína de dicha muestra.
MATERIAL Y MÉTODO
Primero, se dispuso a tomar la caseína y macerar con ayuda de un mortero con
pistilo, después se peso para ocupar 0.1g
para una solución de 1:10, al no
disolverse bien se le agregaron gotas de hidróxido de sodio hasta llegar a la
homogenación deseada, también se realizo la solución de leche 0.05ml para una
solución 1:20 y se disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua hasta
llegar a una temperatura de 500C a 550C.
A continuación, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12 “A y B” los
seis primeros se utilizaron para obtener la curva patrón y los otros seis para
obtener la curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocupó como
blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5 0.8ml, al 6 1.0ml de albumina
sérica bovina (BSA) con concentración de 10 mg/ml, respectivamente.
En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de caseína, el 9 con 0.25ml y el
10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con 0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche
diluida, (todo esto obtenido en la práctica anterior); a todos los tubos se les agrego
Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de 2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al
4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6. Para tener una solución de 3ml y reactivo de Biuret con la
misma cantidad de 3 ml, así logramos una solución de 6ml, se homogenizo la
solución por medio de un agitado tipo vortex. (Solamente al tubo 1 se le agregaron
3 ml de reactivo de biuret y 3 ml de NaCl)
Después de tener todos los tubos con la solución se colocaron en un vaso de
precipitados de 1000 ml con agua caliente y se dejaron durante 10 minutos
aproximadamente (hasta lograr tonalidades de azul cielo a violeta), al termino del
tiempo se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que se enfriara
la solución.
Posteriormente se realizo la cuantificación de la solución por medio de un
espectrofotómetro a 540 nm de los tubos A y B, entre cada medición se lavaban
las celdas; al tener todas las mediciones se dispuso a realizar la curva obtenida.
RESULTADOS
Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro a 540 nm para
cada una de las 12 soluciones se muestran a continuación (solamente se
muestran los tubos A y no los duplicados):
Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.
Absorbancia
a 540 nm
3 ml NaCl,
0
Blanco
0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl
1
0.034
0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl
2
0.071
0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl
4
0.142
0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl
8
0.277
1 ml BSA y 2 ml NaCl
10
0.345
0.25 ml caseína y 2.75 ml NaCl
¿?
0.079
0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl
¿?
0.198
0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl
¿?
0.221
0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl
¿?
0.240
0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl
¿?
0.044
0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl
¿?
0.068
*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.
Tubo No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Solución *
Proteína (mg)
Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se realizó la gráfica 1, de la
curva patrón de proteína, obtenida por el método de regresión lineal de mínimos
cuadrados; donde las abscisas (x) representan la concentración en mg de
proteína, y las ordenadas (y) los valores de la absorbancia de cada concentración.
0.35
Absorbancia a 540 nm
0.3
y = 0.0344x + 0.0017
R² = 0.9998
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Proteina (mg)
Figura 2: Curva patrón de proteína.
La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema, tubos siete
a doce, se obtuvo con el valor de la absorbancia obtenida por el espectrofotómetro
para cada muestra (tabla 1), mediante la interpolación de estos valores en la curva
patrón (figura 3) y despejado los valores respectivos de x de la ecuación de la
recta (y= mx + b) tal como se muestra a continuación (tabla 2):
Figura 3: interpolación de los valores de absorbancia de las muestras problemas
en la curva patrón.
De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de proteína en las
muestras problema, de la siete a la doce, seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9, 1.05 y 1.9 mg,
respectivamente.
La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema despejando
los valores de “x” de la ecuación de la recta (y = 0.0344X +0.0017) quedaría:
𝑥=
𝑦 − 0.0017
0.0344
Tabla 2: determinación de la cantidad de proteína utilizando
la ecuación de recta.
Tubo No. Absorbancia (y) a 540 nm Proteína (mg)
7
8
9
10
11
12
0.079
0.198
0.221
0.240
0.044
0.068
2.218
5.706
6.375
6.927
1.229
1.927
Tomando en cuenta los factores de disolución, por cada mililitro de muestra se
obtiene la siguiente tabla:
Tabla 3: Concentración de proteína en las muestras problema.
Tubo No. Proteína (mg) Factor de disolución Proteína (mg/ml)
7
8
9
10
11
12
2.218
5.706
6.375
6.927
1.229
1.927
4x100
2x100
4x10
2x10
4x20
2x20
887.2
1141.2
225
138.54
98.32
77.08
A continuación se resumen los resultados finales en la siguiente tabla:
Tabla 4: resultados finales de la concentración de proteína
Tubo
Proteína Proteína
Solución *
No.
(mg)
(mg/ml)
3 ml NaCl,
1
0
0
0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl
2
1
10
0.2
ml
BSA
y
2.8
ml
NaCl
3
2
10
0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl
4
4
10
0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl
5
8
10
1 ml BSA y 2 ml NaCl
6
10
10
0.25 ml caseína y 2.75 ml NaCl
887.2
7
2.218
0.5
ml
caseína
y
2.5
ml
NaCl
1141.2
8
5.706
0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl
225
9
6.375
0.5
ml
sobrenadantey
2.5
ml
NaCl
138.54
10
6.927
98.32
11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl
1.229
77.08
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl
1.927
*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.
Absorbancia
a 540 nm
Blanco
0.034
0.071
0.142
0.277
0.345
0.079
0.198
0.221
0.240
0.044
0.068
DISCUSIÓN
De acuerdo a los resultados finales (tabla 4) obtenidos en la determinación de la
concentración de proteína en las muestras de caseína, sobrenadante y leche
diluida, que aunque no son los esperados, pues, la concentración de proteínas
tendría que ser mayor en la leche diluida que en el sobrenadante y los valores de
la concentración de cada muestra problema iguales entre sí, no se descarta este
método de cuantificación de proteínas, pero es recomendable utilizar los
materiales de laboratorio correctos para hacer las diluciones y ser precisos, mas
aun exactos, en la medición de volúmenes.
El sobrenadante consiste en una suspensión a la cual se le ha eliminado la mayor
cantidad de proteínas contenidas en la leche, por lo que su concentración de
proteína tendría que ser mejor que el de la leche pura.
CONCLUSIÓN
Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración
de proteína en una o varias muestras problema, que resultan al interpolar los
valores de absorbancia en una curva patrón originada a partir de concentración de
proteína conocida.
BIBLIOGRAFÍA
Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.
Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial
publidisia.
Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioquímica ilustrada:
bioquímica y biología molecular en la era posgenómica. Masson, España.
Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman.
ANEXO (CUESTIONARIO)
1.- describa que es el espectrofotómetro y para que sirve.
Sirve para calcular las concentraciones de las distintas sustancias en función de la
absorción del color. Técnicas de bioquímica y biología moleculas.freifelder David.
Editorial reverte.2003
2.- mencione que es un espectro de absorción y las diferentes longitudes de onda
del espectro.
La espectroscopia de absorción es la medida de la cantidad de luz absorbida por
un compuesto en función de la longitud de onda de la luz. En general, se irradia
una muestra con una fuente de luz y se mide la cantidad de luz transmitida a
varias longitudes de onda, utilizando un detector y registrando el fenómeno en una
grafica. Técnicas de bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial
reverte.2003
3.- defina con sus propias palabras que es una curva patrón.
Son las medidas conocidas en orden ascendente que sirven de guía para ajustar
una solución problema.
4.- cuales son las ventajas y las desventajas, de emplear los reactivos de biuret
para cuantificar proteínas explique.
Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es que es bastante específico para
proteínas, muestra pocas interferencias y es barato. Y la desventaja es que es
poco sensible.
5.- mencione cual es la razón de que en el método de biuret la absorbancia de una
proteína se lea a una longitud de 540 nm.
El color violeta característico se presenta a esa longitud la cual se da por la
coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo
se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el
cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los
pares de electrones libres de los átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido.
Técnicas
de
bioquímica
y
biología
moleculas.freifelder
David.
Editorial
reverte.2003
6.- explique si una curva patrón puede ser empleada para cuantificar sustancias
diferentes a las proteínas y cual seria la diferencia con estas.
7.- ¿Cuál es la finalidad de utilizar un tubo como blanco? Mencione si siempre se
utiliza agua como blanco.
Tomar la medida de la cual parte la curva patrón, no siempre se utiliza agua como
blanco, si no una mezcla concentrada de la sustancia con la cual se esta
trabajando. Técnicas de bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial
reverte.2003
8.-realice una curva patrón con los datos de absorbancia y proteína obtenidos en
una determinación hipotética:
Se realizo una solución estándar de albúmina (10mg/ml).
Los valores de absorbancia referidos se determinaron por duplicado.
9.-con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determina la ecuación de la
recta que representa la curva patrón.
10.- basándose en la curva patrón y la ecuación de la línea recta, determine la
cantidad de proteína en MG/ml de las siguientes muestras, cuyos valores de
absorbancia se indican
11.- elabore una lista de 5 compuestos que se podrían cuantificar empleando una
curva patrón, y menciona que importancia tiene determinar la cantidad de dichos
compuestos.
a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunológico
b) hemoglobina. Una concentración baja produce anemia.
c) insulina. Una concentración baja produce diabetes.
d) fibrilinas. La falta de esta produce deformación en los huesos.
e) seroalbumina. Su falta produce deformaciones.
Bioquimica.berg Jeremy.editorial reverte.2008