Guia de TP curso optativo 2013 - Blog de Química Biológica

Universidad Nacional de San Luis
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia
Departamento de Bioquímica y Cs. Biológicas
Carrera: Licenciatura en Bioquímica
Curso: Técnicas Moleculares aplicadas a Bioquímica Clínica
E-mail: [email protected]
Blog: http://qbpatologica.wordpress.com
Año: 2013
GUIA DE
TRABAJOS PRACTICOS
Equipo del Curso:
Dra. Silvia M. Varas
Dra. María G. Lacoste
Dra. Mariana L. Ferramola
Bqco. José L. Arias
1
CRONOGRAMA RESUMIDO:
JUNIO: 24-28
Horario del curso:
8,30-12,30 hs
14- 18 hs
24 - Extracción de sangre
AM - Teórico 1: Genoma Humano.Proyecto Genoma Humano. Controversias Éticas.
Mutaciones más comunes según Human Gene Mutation Database. Deleciones y
Mutaciones puntuales. Estrategias de laboratorio. Material usado en un
laboratorio de biología molecular
-Teórico 2: PCR; bases. Componentes. Templado o sustrato. Enzimas. Primers o
iniciadores: diseño y concentración. Magnesio y NTPs. Eficiencia de una PCR
(especificidad, rendimiento y fidelidad). Variaciones. Puesta a punto de una PCR.
PM Extracción de ADN.
Determinación de Pureza
25 PCRI: Alelo Duarte
AM - Teórico 3: Técnicas usadas para la determinación de deleciones e inserciones.
Otras variantes de PCR: SSCP, RFLP-PCR, RT-PCR.
PM PCR II: Mutagénesis
- Teórico 4: Diseño Oligos
26 PCRI: Alelo Duarte – Corte Enzima Restricción- Corrida de Geles de Agarosa
AM Seminario 1
PM PCRII: Preparación geles de PAGE y corrida. Análisis resultados.
Seminario 2
27 PCR III: MAS-PCR
AM Seminario 3
Seminario 4
PM PCRIII: Armado de geles y corrida
Teórico 5: Técnicas usadas para la determinación de mutaciones puntuales. MASPCR, ARMS, mutagénesis mediada por PCR y Dot blot.
Seminario 5
Seminario 6
28 Teórico 5: Nuevas plataformas diagnósticas.
Resumen gral. Discusión de Resultados e Informes
Evaluación final
2
I- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL A PARTIR DE
MUESTRA SANGUINEAS
Introducción:
La extracción de ADN a partir de una muestra constituye la etapa previa de todo
análisis genético. Obtener ADN puro y amplificable resulta fundamental para
los posteriores usos a los que será destinado.
En general, los métodos de extracción de ADN tienen una serie de pasos
básicos:
1-disrupción celular con ruptura de la bicapa lipídica de las membranas
celulares por tratamiento con detergentes y agentes quelantes que secuestran
cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+.
2-eliminación de las proteínas que constituyen
los principales
contaminantes del extracto,
3-concentración del ADN que un medio con alta concentración de sales
precipita con alcoholes,
4-lavado para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la
Taq polimerasa y
5- resuspensión
Para las muestras de sangre en particular, se han descritos distintos protocolos.
En el siguiente práctico se aplicará un método que aprovecha el cambio de
solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a
modificaciones en la concentración salina del medio.
En resumen:
Triton X-100 y SDS: son detergentes.
EDTA: quelante de cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+, sobre todo de este
ultimo ya que existen en el medio enzimas que degradan los ácidos nucleicos
(nucleasas- magnesio dependientes), es decir que son enzimas que solo actúan
en presencia de este catión.
Perclorato de sodio (NaClO4): se utiliza para desproteinizar las preparaciones de
ADN. A altas concentraciones, el perclorato de sodio elimina el SDS y las
proteínas asociadas con él, además, previene la precipitación de las proteínas
con el ácido nucleico en el paso final de precipitación con etanol.
3
Etanol 70%: solución de lavado para eliminar, primordialmente, restos de SDS
que es un inhibidor especifico de Taq polimerasa.
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1
EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL MEDIANTE LA TÉCNICA
DE SALTING OUT MEJORADO
Objetivos: 1-Conocer los fundamentos de los pasos químicos utilizados para lograr el
aislamiento de ADN a partir de una muestra biológica.
2-Determinar la eficiencia del proceso de purificación mediante el uso de índices de
pureza.
3-Cuantificar el ADN extraído y preparar la muestra para su utilización en las
técnicas posteriores.
Fundamento del método
En presencia de altas concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas
disminuye y terminan por precipitar (salting out). El perclorato de sodio se
utiliza para desproteinizar las preparaciones de ADN. A altas concentraciones,
el perclorato de sodio elimina el SDS y las proteínas asociadas con él, además,
previene la precipitación de las proteínas con el ácido nucleico en el paso final
con etanol.
Reactivos:
1) Buffer de Lisis I (lisis de glóbulos rojos)
Concentración final:
Sacarosa…………………...0.32 M
Tris-HCl (pH 7.6) ……. 10 mM
MgCl2 ………………………………… 5 mM
Tritón X-100 .............. 1 %
Almacenar a 4 ºC en oscuridad (mantener en frío hasta su uso)
Preparación:
Sacarosa 10,26 gr
Tris-HCl 1 M (pH 7.6) 1 ml
MgCl2 1M 0,5 ml
H2O milliQ c.s.p 100 ml
Esterilizar la solución por autoclavado
Luego agregar 1 ml de Triton X-100
4
Preparación de la solución madre de Tris-HCl 1 M (pH=7,6)
Disolver 12,11 g de Tris base en 80 ml de H2O. Ajustar el pH por el agregado de 6 ml HCl (c).
Ajustar el volumen a 100ml. Esterilizar por autoclavado.
2) Buffer de Lisis II (lisis de glóbulos blancos)
Concentración Final:
EDTA pH=8,0 ……………………….. 25 mM
NaCl ……………………………………... 75 mM
Preparación:
EDTA 0,5M pH=8 5 ml
NaCl 5M 4 ml
H2O milliQ c.s.p 100 ml
Esterilizar la solución por autoclavado.
3) SDS 10%
Preparación:
0,5 g 5ml de H2O(d)
4) Perclorato de sodio (NaClO4) 5M
Preparación:
1,4 g 2ml de H2O(d)
5) NaCl 5M
Preparación:
29,22 g 100 ml de H2O(d)
PROTOCOLO
1) Colocar 300 µl de la muestra de sangre total en un tubo Eppendorf de 1,5
ml.
2) Agregar 1,2 ml de Buffer de Lisis I frío, mezclar y centrifugar 15 min a
2400 g (4°C).
3) Tirar el SN y agregar 350 µl de Buffer de Lisis I, mezclar y volver a
centrifugar.
4) Tirar el SN y resuspender el pellet en: 135 µl de Buffer de Lisis II + 3,8 µl
de SDS 10% + 33 µl de Perclorato de sodio. Agitar vigorosamente 10
segundos a temperatura ambiente.
5) Agregar 60 µl de NaCl 5 M y agitar vigorosamente 15 segundos.
Centrifugar 10 minutos a 1500 g a temperatura ambiente.
5
6) Pasar el SN a un tubo limpio y agregar 210 µl de isopropanol frío (-20°C).
Tapar y mezclar suavemente (se observa el ovillo).
7) Sacar el ADN con un tip (no aspirar) y colocarlo en 100 µl de etanol 70%.
CUIDADO: el ADN es muy pegajoso, fijarse que no quede pegado en el
tip.
8) Centrifugar 5 minutos a 1500 g. Descartar el etanol 70% y volver a lavar
con 100 µl una vez mas.
9) Dejar secar el etanol.
10) Disolver el ADN en 30-50 µl de H2O mQ.
11) Incubar a 55°C 10-20 min para disolver. Observar a contraluz la
disolución del ADN.
Preparación de la dilución de las muestras de ADN
En la preparación de la master mix se necesita que 400ng de ADN estén
contenidos en 5µl de agua bidestilada estéril. A partir de la cuantificación de
ADN. Complete esta tabla con sus datos, muestras 1-15:
Muestra
A260
Ejemplo:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
0,028
Acido Nucléico
µg/ml
(A260.50.100)
140
0,4 µg están
en… (n µl)
µl de H2O
(5-n)
2,85 µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
(5µl -2,85µl) = 2,15
6
II-RFLP-PCR:
DETERMINACION
DEL
ALELO
DUARTE
EN
GALACTOSEMICOS: MUTACIÓN N314D EN EL EXÓN 10 DEL
GEN GALT (GALACTOSA 1-FOSFATO URIDIL TRANSFERASA)
Introducción
Alelo Duarte: La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT, que
da como resultado que la enzima presente una actividad alterada. Este
polimorfismo es común en la población y puede pasar clínicamente
desapercibido.
En la mutación N314D hay una sustitución (c.940 A>G), que genera un cambio
del aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico (Asp, D). El cambio
N314D está asociado con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de
GALT alterada, pero con fenotipos subclínicos diferentes:
1- En la variante D1, además del polimorfismo N314D se encuentra la mutación
L218L (c.652C>T) que es una sustitución silenciosa. A los alelos que llevan
tanto N314D como L218L se los conoce como alelo Los Angeles (LA) o alelo
Duarte1 (D1). Estos alelos LA/D1 presentan actividad GALT normal o incluso
superior a la normal (110-130% de lo normal).
2- La variante D2 está asociada con una disminución de la actividad de GALT e
incluye N314D junto con tres cambios de nucleótidos dentro de los intrones.
Para los alelos D2, el polimorfismo N314D es un desequilibrio de ligamiento con
3 sustituciones intrónicas (IVS-4 nt-27g>c; IVS-5 nt-24g>a y IVS-5 nt+62g>a) y
una deleción de 4 pb en el promotor de GALT (las bases 116 a 119, corriente
arriba del codón de iniciación metionina). Se ha sugerido que esta deleción de
4pb (-119delGTCA) en la región promotora 5’ del gen de GALT
esta
específicamente relacionada a una actividad reducida de la enzima.
La combinación de estas dos variantes distingue Duarte 1 (D1) con una actividad
relativamente normal de GALT, del genotipo Duarte 2 (D2) con actividad
reducida de GALT. Para la genotipificación, varios autores consideran como
genotipo D2 a los individuos con al menos una copia de N314D y al menos una
copia de la deleción de 4 pb y con el genotipo D1 al individuo que presente al
menos una copia de N314D y ausencia de la deleción de 4 pb.
7
La frecuencia total (D1+D2) de la mutación N314D en todo el mundo es de
aproximadamente el 8-10%. Estudios realizados en gran escala (Suzuki y col.,
2001) para los alelos de GALT estimaron que las frecuencias de los alelos D1 es
de 2,7% y D2 es de 5,1%.
Como se mencionó previamente, el alelo N314D es una mutación puntual de
un cambio A por G, (cA940G) que determina un cambio de codón AAC por
GAC, que codifica un cambio del aminoácido Asparagina (N) por Acido
Aspártico (D) en el exón 10 del gen galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT).
Este polimorfismo genera un cambio de bases que determina un sitio de corte
para la enzima de restricción AvaII.
AvaII
GG (A/T) CC
Figura 1: Exón 10 del gen GALT humano. En negrita se detalla el exón 10 del gen GALT, la
flecha roja indica la mutación y la flecha negra pequeña, el sitio de corte con la enzima de
restricción. Con corchetes y subrayado se indica la zona de hibridación de los primers F y R.
En la secuencia de reconocimiento de corte W indica A ó T.
Por PCR se obtiene un producto final de 166 pb y luego del corte con la enzima de
restricción Ava II, el alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 pb, mientras que el
alelo normal tiene un fragmento de 166pb (ausencia de corte).
8
Figura 2: Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea 4:
homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y líneas 3 y 7 al 10:
homocigotas para el alelo normal.
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
DETERMINACION DEL ALELO DUARTE (MUTACIÓN N134D) PARA
EL GEN GALT UTILIZANDO PCR Y POLIMORFISMOS DE
LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION (PCR-RFLP)
Objetivos: 1-Establecer los conceptos básicos de la técnica de RFLP-PCR.
2- Detectar por PCR seguida con digestión con enzima de restricción (AvaII) la
mutación N314D en el exón 10 del gen GALT.
Fundamento del método: La mutación N314D genera un sitio de corte para la
enzima Ava II en el exón 10 del gen GALT. Se amplificará un fragmento de 166 pb y
luego se procederá a un corte con la enzima de restricción AvaII.
PROTOCOLO
1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR
será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5
µl a la muestra de ADN. Necesita 400 ng de ADN genómico para esta reacción
de PCR. Calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,4 µg.
2.- Rotular todos los tubos con el número de muestra que le corresponde.
3.-Identificar cuatro tubos de PCR M1, M2 y M3 y al restante con el signo (-),
ya que será su Control Negativo.
9
4.- El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para
preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el
número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los
volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1
(para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).
En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique
entonces, todo por cinco.
Composición de la Master Mix:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
H2O (csp 20µl)................................ 14,75µl...
.............57 µl
Buffer 10X.......................................... 2,5 µl...
.....…... 12,5 µl
Mg Cl2 50 mM…..…..…....................... 1 µl ......
............ 5 µl
dNTPs 2,5 mM............................... 2,0µl ...... x 5 ............ 10 µl
Primer Galt-10-S (25 pM/µl)....….......1 µl……...
..………... 5 µl
Primer Galt-10-AS (25 pM/µl)….…..1 µl……......
….………..5 µl
Taq pol. (5 U/µl)………………………….0,25 µl …..
………… 1,25 µl
ADN ...........................400ng/5µl
5.- Preparación de la master mix.
Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen
decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La
Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo
fuera del freezer.
PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo.
NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar
contaminaciones.
6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP anterior. En
el tubo de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un
spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.
Programa de ciclado:
92°C ..............1 minuto
59°C ..............1 minuto
40 ciclos
72°C ..............1 minuto
Extensión final: 72°C ................ 10 minutos
10
7.- Digestión con la enzima de restricción AvaII:
En un tubo estéril agregar los siguientes reactivos en el orden indicado:
H2O (csp 20 µl) 16,3 µl
Buffer AvaII 10X
2 µl
BSA Acetilada (10 µg/µl) 0,2 µl
Producto de PCR 10 µl
Mezclar suavemente con la pipeta, centrifugar por unos pocos segundos y
agregar:
AvaII (10 U/µl) o,5 µl
Incubar a 37 ºC por 1 hora.
De los 20 µl del producto de PCR: 10 µl son el producto de PCR sin corte y 10µl
son usados para la digestión con la ER. Al sembrar en el gel de cada muestra se
sembrará por duplicado: sin corte y con corte.
Los fragmentos resultantes de la digestión se separarán en geles de agarosa al
2,5%.
Electroforesis en geles de agarosa:
1-Preparar 75 ml de agarosa al 2,5 %, (1,9 g en 75 ml de buffer TAE 1X).
2-Disolver la agarosa en el horno de microondas.
3-Dejar enfriar la solución a 50ºC y agregar 3 µl de una solución stock de
GelRed 10.000X (Para una concentración final de 1X).
4-Volcar en la gelera preparada con el peine.
5-Dejar solidificar.
6- Extraer el peine.
7- Agregar buffer de corrida (TBE 0,5X) en la gelera.
8- Siembra: colocar en un tubo para sembrar:
11
Producto de PCR
Buffer de siembra
M sin corte (-) AvaII
10 µl
3 µl
M con corte (+) AvaII
10 µl
3µl
9-Realizar un spin en la centrifuga y sembrar los 13 µl por inmersión. En uno de
los pocillos sembrar 5 µl de patrones de peso molecular.
10-Electroforesis:
-Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder.
-Aplicar un voltaje constante, a razón de 4V/ cm.
-Dejar correr hasta ≅ unos 4-5 cm por lo menos desde el lugar de siembra.
-Desconectar la fuente de poder.
-Retirar el gel y llevarlo al cuarto oscuro para observar la fluorescencia emitida
en el transiluminador.
Reactivos utilizados:
Buffer de corrida: TBE 0,5X
Solución Madre de TBE 5X, pH=8:
Tris Base …….............54 g
Ac. Bórico …….......…27,5g
EDTA 0,5M pH=8 .... 20 ml
H2O csp …..…......…. 1000 ml
Solución Stock de GelRed: 10.000X en agua.
Buffer de siembra 6 X: 30% glicerol ( v/v en H2O ).
0,25 % azul de bromo fenol.
Observación e interpretación de los Resultados
Bibliografía:
Chike Item, Brian P. Hagerty, Adolf Mühl, Susanne Greber-Platzer, Sylvia
Stöckler-Ipsiroglu, and Wolfgang Strobl. 2002. Mutations at the Galactose-1-PUridyltransferase Gene in Infants with a Positive Galactosemia Newborn Screening Test.
Pediatric Research. Vol. 51, No. 4, 511-516.
12
III- MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Introducción
En esta técnica se basa en la inserción artificial de un sitio de corte para una
enzima de restricción introducida por una modificación de un nucleótido en un
cebador o primer. Específicamente, en esta técnica se utiliza un cebador
forward (F) con un cambio puntual (GC) en la base 433 () del exón 10 del
gen del CFTR. Dicho cambio artificial es vecino al sitio de mutación dF508
(recordemos que en dicha mutación hay una pérdida del triplete CTT que
codifica para el aminoácido fenilalanina).
La enzima MboI reconoce la secuencia (↓GATC). El cambio introducido genera
un sitio de corte para la enzima MboI en el alelo sano, pero no aparece en el
alelo con la deleción dF508, ya que debido a la ausencia del triplete no se puede
completar la secuencia de reconocimiento para el corte de la enzima.
En el alelo normal hay corte con la ER (+) mientras que en el alelo mutado no
hay corte (-).
GEN: Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
(CFTR) gene, exon 10.
ACCESSION GENEBANK: M55115
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=306520)
1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc
61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact
121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt
181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat
241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta
301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat
361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggc[[accat
]ctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa
421 taaagaaaat atcat]
481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac
541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat
601
661
721
781
ttatgtttcc
tgctttaaga
catttgatca
gacaaacgtc
tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgacc[[ta
agcttgca]]aa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt
caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga
tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t
Figura 3: Exón 10 del gen del CFTR humano, con gris se detalla la deleción de tres pares de
bases que codifica para el aminoácido fenilalanina y con flechas el sitio de corte con la
enzima de restricción. Con corchetes y subrayado se indica la zona de hibridación de los
primers F y R. El tamaño del producto de amplificación será 262 pb para el alelo normal y
de 259 pb para el mutado.
13
Además, se eligió un cebador reverse (R) que permitiera la inclusión de un sitio
de corte constitutivo para la enzima MboI, a efectos de servir como control
interno de la actividad de la enzima de restricción (posición 634). Ver figura3.
Luego del corte con la enzima, se observan los siguientes fragmentos para el
alelo normal (N): 17 pb, 201 pb y 44 pb y para el alelo mutado (M): 215 pb y 44
pb.
Sin corte con la enzima de restricción:
Figura 4a: Fragmentos obtenidos luego de la reacción de PCR. Línea 1, 3 y 8 heterocigotas,
7 marcador de peso molecular
14
Con corte con la enzima de restricción:
Figura 4b: Fragmentos obtenidos luego de la reacción de PCR después del tratamiento con
la enzima MboI. Linea 1, 2, 5 y 6 heterocigotas, 3 homocigota normal y 4 homocigota
(df508/df 508)
TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
DETERMINACION DE PORTADORES PARA LA MUTACION ∆F508
DEL GEN CFTR USANDO MUTAGENESIS MEDIADA POR PCR (MMPCR)
Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la MM-PCR
2- Utilizar la técnica para determinar la mutación mas frecuente en pacientes
con fibrosis cística.
3- Determinar la frecuencia de portadores de la mutación dF508
Fundamento del método: esta técnica se basa en la inserción artificial de un
sitio de corte para una enzima de restricción en un alelo específico, a través de la
modificación de un nucleótido en uno de los cebadores.
PROTOCOLO
1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR
será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos.
Conclusión: el ADN de la muestra debe estar contenido en 5 µl. A partir de los
15
datos de concentración de su ADN muestra, obtenidos en el práctico anterior,
calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 1 µg. En el caso de que este
volumen sea menor a 5 µl, llevar a volumen con agua destilada estéril.
2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde.
3.-Identificar cuatro de los tubos de PCR con una M1, M2 y M3 y al restante con
el signo (-), ya que será su Control Negativo.
4.- El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para
preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el
número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los
volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1
(para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).
En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique
entonces, todo por cinco.
Composición de la Master Mix:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
H2O (csp 20µl)............ 11,25µl.......
.............57 µl
Buffer 10X..................... 2,5 µl......
.......….. 12,5 µl
Mg Cl2 50 mM…..…..… 1 µl .........
............ 5 µl
dNTPs 2,5 mM............. 2,0µl ....... x 5 ............ 10 µl
Primer S (25 pM/µl).... 1 µl…….....
……....... 5µl
Primer S (25 pM/µl)…. 1 µl………..
….….…. 5 µl
Taq pol. (5 U/µl)………….0,25 µl …..
..……….. 1,25 µl
ADN ...............................5µl
(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para)
5.- Preparación de la master mix.
Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen
decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La
Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo
fuera del freezer.
PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo.
NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar
contaminaciones.
6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo
de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin
(centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.
16
Programa de ciclado:
Preciclo: 94°C ............. 3 minutos.
95°C ..............1 minutos
50°C ..............2 minutos
72°C ..............1 minuto
35 ciclos
Extensión final: 72°C ................ 5 minutos.
IV- ARMADO Y CORRIDA DE GELES DE POLIACRILAMIDA NO
DESNATURALIZANTES. TINCION DE GELES. OBSERVACION
DE RESULTADOS E INFORME.
Introducción
La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para la resolución de
secuencias de ADN de bajo peso molecular (entre 40 pb y 200 pb) cuya
observación se dificulta en geles de menor resolución, como por ejemplo, los
geles de agarosa.
La técnica consiste en la elaboración de una capa fina de gel de poliacrilamida
por la cual migra el ADN. Al igual que en los geles de agarosa, la migración
responde a la carga negativa neta de la molécula de ADN y a la concentración
del gel. Las secuencias de ADN más pequeñas migran a mayor velocidad
mientras que las más grandes quedan retrasadas.
En resumen, la migración del ADN a través de los geles de poliacrilamida
dependerá
de: el tamaño molecular del ADN, la concentración de
poliacrilamida, la conformación espacial del ADN y la corriente aplicada.
La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con un
colorante fluorescente, como por ejemplo, el GelRed. El GelRed fue diseñado
como un colorante de reemplazo del Bromuro de Etidio en la tinción de ADN
doble cadena (ds), ADN simple cadena (ss) o ARN. Este colorante posee las
ventajas de ser extremadamente estable en el tiempo, NO ES MUTAGENICO
NI CITOTOXICO y es seguro para el medio ambiente. Ver anexo
17
TRABAJO PRÁCTICO Nº 3
ARMADO, CORRIDA E INTERPRETACION DE GELES DE
POLIACRILAMIDA PARA LA DETERMINACION DE PORTADORES
PARA LA MUTACION ∆F508 DEL GEN CFTR POR MM-PCR
Objetivos: 1-Conocer el fundamento y las aplicaciones de los geles de poliacrilamida para la
separación de ADN.
2- Llevar a cabo los procedimientos de preparación, corrida y tinción de geles
de poliacrilamida
3- Aplicar la técnica para el análisis de productos obtenidos por MM-PCR
PROTOCOLO
Los productos de amplificación obtenidos por MM-PCR se separarán por
corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 12%.
La preparación de los geles se llevará a cabo utilizando SIEMPRE guantes, ya
que la acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe por la piel.
1- Se utilizará una cuba vertical para el armado de los geles. Limpiar los vidrios
con detergente no iónico, enjuagar con agua común, etanol y finalmente con
agua destilada. Secar.
2- Armar la cuba vertical.
3- Preparación del gel poliacrilamida al 12%:
En un tubo Falcon de 15 ml medir los siguientes reactivos para la preparación
de un gel de poliacrilamida:
Reactivos ↓ / Concentración de poliacrilamida →
12 %
Acrilamida (30%)
4 ml
Agua
3,93 ml
TBE 5X
2 ml
Persulfato de amonio (25%)
70 µl
TEMED
3,5 µl
Rango de separación
40-200 pb
18
4- Cargar la solución del gel con una jeringa, colocar el peine y esperar
aproximadamente 40 minutos a que el mismo polimerice.
Buffer de corrida para electroforesis: TBE 0,5 X, pH 8.
Preparación de las muestras a sembrar:
1.- Enumerar tantos tubos como muestras haya (incluido el control negativo).
2.- Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2 µl de buffer de siembra. El
Buffer de Siembra contiene azul de bromofenol como marcador del frente de
corrida (en un gel de poliacrilamida al 12%, el colorante se ubica en la posición
de 20 pb).
3.- Realizar un spin.
4.- Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical, tratando de no romper
los pocillos. En uno de los pocillos sembrar 2 µl de patrones de peso molecular.
5.- Correr a 100 V aproximadamente.
6.- Terminada la corrida, sacar el gel y teñir aproximadamente 10 minutos en
una solución 1X de GelRed
7.- Visualizar en el transiluminador las bandas amplificadas.
8.- Interpretación de los resultados.
19
V- MAS-PCR
Introducción
La PCR Múltiple Alelo Especifica (MAS-PCR) es la amplificación, en un único
tubo, de múltiples fragmentos de una determinada secuencia. Esta estrategia
involucra la elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a
fragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmente resueltos en una
única línea de corrida de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta
técnica se ha usado con éxito en el diagnostico de enfermedades como la
distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, beta talasemia y el screnning de
4 de las mutaciones más comunes para fibrosis cistica (dF508, G542X, G551D y
N1303K).
TRABAJO PRÁCTICO Nº 6
DETERMINACION DE LAS MUTACIONES dF508 y G542X POR PCR
MULTIPLE ALELO ESPECÍFICA (MAS-PCR)
Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la técnica MAS-PCR.
2- Utilizar la técnica para la determinación de las mutaciones dF508 y G542X.
Fundamento del método: En el TP se realizara el diagnóstico de las
mutaciones dF508 y G542X. Cada muestra se amplifica en dos tubos: en el
primer tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos normales
(cebadores F: CF-W1468-N y R: CF-508 RP para la mutación dF508 y
cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-N para la mutación G542X). En el segundo
tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos mutados (cebadores F:
dF 508 y R: CF-508 RP para la mutación dF508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R:
G542X-M para la mutación G542X).
Primers
CF-W1468-N
CF-508 RP
∆F 508
Secuencia
5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’
5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’
5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’
5’IVS-11
G542X-N
G542X-M
5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’
5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’
5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’
Tipo
F1
R1
F2
F3
R3
R4
20
Figura 5: Exón 10 del gen CFTR humano, se detalla con corchetes y subrayado la zona de
hibridización de los primers F (alelos específicos) y R (común) para la detección de la
mutación dF508.
Figura 6: Exón 11 del gen CFTR humano, se detalla con corchetes y subrayado la zona de
hibridización del primers F (común) y R (alelos específicos) para la detección de la
mutación G542X.
Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para
el alelo normal de dF508, 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb
para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X (Figura 5
y 6).
21
Figura 7: Análisis de las mutaciones dF508 y G542X en el gen CFTR humano. Pacientes P1
a P4: homocigotas para los alelos normales, P5: Homocigota para el alelo normal de G542X
y homocigota para la mutación dF508 y P6: Homocigota para el alelo normal de G542X y
heterocigota para la mutación dF508.
PROTOCOLO
1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR
será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5
µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN
muestra, obtenidos en el primer práctico, calcule qué volumen de ADN debe
tomar para tener 0,1 µg.
2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde.
3.-Identificar ocho de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1N, M1M,
M2N, M2M, M3N y M3M y a los dos restantes con el signo (-N) y (-M).
4.- Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX
A y la Master MIX B. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número
de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS
los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n +
1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).
En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique
entonces, todo por cinco.
22
Entonces se hacen dos MIX:
Composición de la Master Mix NORMAL:
1. H2O (csp 20 µl).................................. 11,4 µl..........
2. Buffer 10X...............................………….. 2,5 µl............
57 µl
.............
……...… 12,5 µl
3. Mg Cl2 50 mM………………………………..
1 µl .........
...........
5 µl
4. dNTPs 2,5 mM.....................................
2 µl ......... x 5 .............
10 µl
5. Primer CF-W1468-N (25 pM/µl) .......... 0,6 µl………..
………...
3 µl
6. Primer CF-508-RP (25 pM/µl)............. 0,6 µl………..
…….……
3 µl
…….……..
4 µl
7. Primer G-542-N (25 pM/µl)............... 0,8 µl………..
8. Primer 5´IVS-11 (25 pM/µl) …...............0,8 µl ………..
...............
4 µl
9. Taq pol. (5U/µl).............…………............0,3 µl …...…
…...………
1,5 µl
10. ADN ……...............................................5µl
Composición de la Master Mix MUTANTE:
11. H2O (csp 20 µl).................................. 11,4 µl.........
........... 57 µl
12. Buffer 10X...............................………….. 2,5 µl..........
……...… 12,5 µl
13. Mg Cl2 50 mM……………………………….. 1 µl ..............
............. 5 µl
14. dNTPs 2,5 mM..................................... 2 µl ............. x 5 ............ 10 µl
15. Primer dF508 (25 pM/µl) .................... 0,6 µl………..
….…....
3 µl
16. Primer CF-508-RP (25 pM/µl)............. 0,6 µl……….
….……
3 µl
17. Primer G-542-M (25 pM/µl)...............…0,8 µl……
18. Primer 5´IVS-11 (25 pM/µl) …...............0,8 µl ………
19. Taq pol. (5U/µl).............………….............0,3 µl …...…
.……..
4 µl
............. 4 µl
………… 1,5 µl
20. ADN ……...............................................5µl
5.- Preparación de la master mix
Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen
decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La
Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo
fuera del freezer.
PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo.
NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar
contaminaciones.
23
6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo
de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin
(centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.
Programa de ciclado:
Preciclo:
95°C ............. 5 minutos
95°C ..............1 minuto
60°C ............. 1 minuto
30 ciclos
72°C .............. 1 minuto
Extensión final: 72°C ................ 5 minutos
Los fragmentos resultantes de la digestión se separan en geles de agarosa al 3%.
Observación e interpretación de los Resultados
VI- ARMS-PCR: GENOTIPIFICACION DE APO E
Introducción
APOPROTEÍNA E: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
Gen
El gen de la Apo E se localiza en el cromosoma 19 (19q13.2) y tiene una longitud
de 3,7 Kb. Esta agrupado con los genes de las apolipoproteínas CI, CII y CIV, y
comprende cuatro exones y tres intrones. Se trata de un gen polimórfico con
tres alelos codominantes (ε2, ε3, ε4), que dan lugar a seis posibles genotipos:
ε2ε2, ε2ε4, ε3ε2, ε3ε3, ε3ε4, ε4ε4. Las tres isoformas que se originan a partir de
los tres alelos se diferencian entre sí en 1 ó 2 aminoácidos. Los polimorfismos
del gen de la Apo E, que se localizan en el exón 4, consisten en diferencias de
una base en las posiciones 112 y/ó 158 (cambio de una citosina por una timina),
que supone un cambio de Arginina por Cisteína. La isoforma E2 tiene una
Cisteína en posición 112 y 158, E3 tiene Cisteína en posición 112 y Arginina en
posición 158 y E4 tiene una Arginina en ambas posiciones, 112 y 158.
24
El ARNm tiene 1164 nt, el transcripto primario tiene 317 aminoácidos con un
péptido señal de 18 aminoácidos sobre el extremo N-terminal. La apo E madura
es secretada como una proteína de 299 aminoácidos.
Proteína
Se ha encontrado expresión de Apo E en hígado, cerebro, bazo, pulmón,
glándula adrenal, ovario, riñón y músculo. La mayor producción es en hígado.
Modelo de la estructura de Apo E libre de lípidos: El dominio N-terminal
consiste de un manojo de 4 hélices (hélice 1, rojo; hélice 2, azul; hélice 3, verde;
hélice 4, amarillo). Ver figura 8. El dominio N-terminal contiene la región de
unión al receptor de LDL (R-LDL) en la hélice 4. La región de alta afinidad al RLDL requiere también la Arg172 en la región bisagra que conecta los dominios
N- y C terminal. El dominio N-terminal contiene 2 posiciones polimorficas en
posición 112 y 158 que distingue las 3 isoformas de Apo E. El dominio Cterminal (gris) contiene los principales elementos de unión a lipoproteínas.
Figura 8: Estructura de la proteína de Apo E.
25
Tabla 1: Frecuencia de los alelos de Apo E humanas y sus diferencias
Alelo
Frecuencia
Variación de aminoácido en
Afinidad
Preferencia de
Desordenes
alélica (%)
posición:
al RLDL
unión a LP
Asociados
112
158
Apo E2
7
Cys
Cys
Baja
HDL
HLP tipo III
Apo E3
78
Cys
Arg
Alta
HDL
Desconocidos
Apo E4
15
Arg
Arg
Alta
VLDL, LDL
Alzheimer,
aterosclerosis
Figura 9: Secuencia del exón 4 del gen de Apo E. Se denota el codón 112 y 158 que genera los
polimorfismos que determinan los distintos alelos de Apo E. Se denota con corchetes el
primer reverse común para los 4 primers forward ARMS.
ARMS-PCR (Amplification refractory mutation system-PCR)
El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación (ARMS) por PCR usado
para detección de mutaciones ha demostrado ser una herramienta de gran
utilidad en la identificación de portadores y en el diagnostico prenatal de
enfermedades hereditarias, puesto que permite la detección de mutaciones
puntuales, deleciones, inserciones, polimorfismos y otras variaciones conocidas
del ADN.
26
La PCR-ARMS se fundamenta en que la amplificación del ADN será ineficiente
o completamente refractaria si hay un error de apareamiento (mismatch) entre
el nucleótido del extremo terminal 3´ del cebador y su correspondiente
nucleótido en ADN molde. Debido a que la Taq ADN polimerasa carece de
actividad exonucleasa 3´ a 5´correctora, no puede corregir el error en el
extremo 3´del cebador. Por lo tanto, se requiere un apareamiento de bases
complementario en el extremo 3´del cebador para que la Taq ADN polimerasa
pueda amplificar eficientemente el fragmento de ADN deseado, permitiendo
mayor especificidad y discriminación por parte de la enzima.
De esta manera, el método ARMS permite la amplificación de alelos específicos
usando cebadores especiales que se hibridan completamente al alelo deseado y
no lo hacen al otro alelo debido al cambio de una base en el nucleótido 3’
terminal de los mismos. De este modo, el alelo deseado es amplificado
fácilmente mientras que el otro no es amplificado o lo es escasamente.
Un ensayo típico de ARMS comprende dos reacciones de PCR, donde se utilizan
el mismo ADN sustrato y tres cebadores. Ambas reacciones contienen un
cebador común, complementario para los dos alelos de interés, que se alinea
con una secuencia invariable del ADN próxima a la mutación que va a ser
detectada. El extremo 3’ del cebador común se orienta hacia la mutación. Los
otros dos cebadores restantes son alelo específicos, en una de las reacciones se
coloca el cebador específico para el alelo normal (WT) y en la otra se incluye el
cebador específico para el alelo mutado (M).
- Si solo se obtiene producto con la reacción que contiene el cebador para el
alelo WTse trata de un paciente homocigoto normal.
- Si hay productos con los dos cebadores (tubo WT y tubo M) se trata de un
paciente heterocigoto.
- Si solo se obtiene producto con la reacción que contiene el cebador para el
alelo Mse trata de un paciente homocigoto para la mutación (Figura 10).
27
Figura 10: Fundamento de ARMS-PCR. Se preparan dos mezclas de reacción separadas para
PCR, una para cada mezcla de cebadores: Mezcla A: cebador para el alelo normal (color
amrillo) con el cebador común (color rosa) y Mezcla B: cebador para el alelo mutado (color
gris) con el cebador común (color rosa).
Para incrementar la especificidad propia de los cebadores por cada alelo,
además se introduce en ellos un cambio de una base adicional en el segundo al
cuarto (2º-4º) nucleótido del extremo 3’, de este modo se asegura que cada
cebador permita únicamente la amplificación del alelo para el que su nucleótido
3’ terminal es complementario (Figura 11).
Figura 11: Especificidad de los iniciadores o primers ARMS con un cambio de base adicional
en el segundo a cuarto nucleótido de su extremo 3’. La doble cadena de ADN se representa
con líneas azules; en una de las cadenas se hibrida el iniciador común (en rosa) y en la otra
se alinea uno de los iniciadores ARMS (línea gris con el nucleótido de su extremo 3’ en
verde) con o sin cambio de base adicional (letras rojas y negras), de lo que dependerá que se
obtenga sólo el producto de amplificación deseado.
Si la prueba de ARMS se usa para detectar una deleción o inserción no se
requiere introducir ningún cambio de base adicional, ya que la mutación por si
misma provee diferencia suficiente entre un iniciador y el alelo no
28
correspondiente. Por otra parte, varios iniciadores ARMS pueden ser
combinados en los mismos tubos de reacción para detectar varias mutaciones o
polimorfismos simultáneamente; esta modificación del método ARMS se
denomina ARMS múltiple.
Ventajas del método: El procedimiento tiene la ventaja de no ser radiactivo y
requiere menos de 5 horas para su realización. Es una técnica sencilla, exacta,
rápida y reproducible. Una desventaja del método es que solo es posible detectar
mutaciones puntuales previamente conocidas para de esta manera poder
diseñar los cebadores correspondientes.
TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
GENOTIPIFICACION DE APO E UTILIZANDO EL SISTEMA DE
MUTACIÓN REFRACTARIO A LA AMPLIFICACION POR PCR
(ARMS-PCR)
Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la técnica ARMS-PCR.
2- Utilizar la técnica para determinar cada uno de los alelos de apo E y el
genotipo de la muestras.
3- Determinar la frecuencia del alelo Apo E2, el cual
está asociado a la
presencia de disbetaliproteinemia (hiperlipoproteinemia tipo III), en muestras
de la población universitaria.
Fundamento del método: En el presente TP hemos aplicado el concepto de
ARMS-PCR para la genotipificación de Apo E. Para asegurar la especificidad de
los primers, se ha introducido deliberadamente un error de apareamiento
adyacente al nucleotido 3’ terminal, donde se han cambiado las G señalizadas
por T (Figura 12).
29
Figura 12: Secuencia de los cebadores forward ARMS para la genotipificación de Apo E. El
último nucleótido marcado en negrita denota los polimorfismos par el gen de Apo E; el
penúltimo nucleótido (G) es el nucleótido que se cambia por T para aumentar la
especificidad del método. El primer reverse es común a todos ellos.
En las reacciones de amplificación se incorporan dos cebadores de un gen que
actúa como CONTROL POSITIVO INTERNO, en nuestro caso es el gen α1antitripsina (AAT) que genera un fragmento de 360 pb. Este fragmento, que es
co-amplificado con los fragmentos correspondientes a los alelos específicos,
debe estar presente en todos los tubos con las muestras de pacientes.
Cada muestra será procesada por duplicado (Tubo A y Tubo B). En ambos tubos
se colocarán los cebadores F y R del gen control (F-AAT y R-AAT)) y el cebador
R común para todos los alelos de apo E (R-ApoE). Además, el tubo A contendrá
los 2 cebadores ARMS Cys: Cys 112 y Cys 158 y el tubo B contendrá los 2
cebadores ARMS Arg: Arg 112 y Arg 158.
- Para el Alelo Apo E2: habrá amplificación en el tubo A de un fragmento de 588
pb ARMSCys112 y uno de 451 pb ARMSCys158. No hay amplificación en el tubo B.
- Para el Alelo Apo E3: hay amplificación en el tubo A de un fragmento de 588
pb del ARMSCys112 y en el tubo B uno de 451pb del ARMSArg158.
- Para el Alelo Apo E4: hay amplificación en el tubo B de un fragmento de 588
pb del ARMSArg112 y uno de 451pb ARMSArg158. No hay amplificación en el tubo
A.
Ver Figura 13 y Tabla 2 para la interpretación de los distintos genotipos que
surjan de la combinación de estos 3 alelos.
30
Figura 13: Productos de amplificación correspondientes a los seis genotipos ApoE posibles
obtenidos por ARMS-PCR. (A) y (B): es el producto de amplificación del tubo A y B,
respectivamente.
Tabla Nº 2:
MASTER MIX A
MASTER MIX B
GENOTIPO
Cys 112
Cys 158
Arg 112
Arg 158
Primer Forward
588 pb
451pb
588 pb
451 pb
Tamaño del
(ARMS)
producto de
amplificación
+
+
-
-
2/2
+
-
-
+
3/3
-
-
+
+
4/4
+
+
+
+
2/4
-
-
+
+
3/4
+
+
-
+
2/3
R-Apo E común
R-Apo E común
Primer Reverse
31
Primers
Secuencia (le cambiamos las G señaladas por T)
nt
Cys 112
5’-CGC GGA CAT GGA GGA CGT GT-3’
20
Cys 158
5’-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AGT-3’
21
Arg 112
5’-CGC GGA CAT GGA GGA CGT GC-3’
20
Arg 158
5’-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AGC-3’
21
R-ApoE
5’-GTT CAG TGA TTG TCG CTG GGC A-3’
22
F- AAT
5’-CCC ACC TTC CCC TCT CTC CAG GCA AAT GGG-3’
30
R- AAT
5’-GGG CCT CAG TCC CAA CAT GGC TAA GAG GTG-3’
30
PROTOCOLO
1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR
será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5
µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN
muestra, obtenidos en el primer práctico, calcule qué volumen de ADN debe
tomar para tener 0,25 µg.
2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde.
3.-Identificar ocho (tres chicos por comisión y dos tubos por cada uno más dos
negativo uno por cada mix) de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1A,
M1B, M2A, M2B, M3A y M3B y a los dos restantes con el signo (-A) y (-B).
4.- Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX
A y la Master MIX B. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número
de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS
los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n +
1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).
En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique
entonces, todo por cinco.
Entonces se hacen dos MIX
32
Composición de la Master Mix TUBO A:
1. H2O (csp 20 µl)........................ 12,45 µl...........
............. 62,25 µl
2. Buffer 10X....................………….. 2,5 µl............
……...… 12,5 µl
3. Mg Cl2 50 mM…………………… 0,75 µl ...........
............... 3,75 µl
4. dNTPs 10 mM.......................... 0,5 µl ........... x 5 .............. 2,5 µl
5. Primer Cys 158 (50 pM/µl) ....... 0,4 µl………..
.....…........ 2
µl
6. Primer Cys 112 (50 pM/µl)........ 0,2 µl……….. .
…….…… 1
µl
7. Primer R-Apo E (50 pM/µl)…. 0,4 µl………....
…….…….. 2
µl
8. Primer F-AAT (0,5 pM/µl) …....0,4 µl ………...
............... 2
µl
9. Primer R-AAT (0,5 pM/µl) ….....0,4 µl ………..
............... 2
µl
10. DMSO……………………………….… 1,8 µl.............
................ 9
µl
11. Taq pol. (5U/µl).............…………...0,2 µl ………
…………
1
µl
12. ADN .....................................5µl
Composición de la Master Mix TUBO B:
1. H2O (csp 20 µl)........................ 12,45 µl...........
............. 62,25 µl
2. Buffer 10X....................………….. 2,5 µl............
……...… 12,5 µl
3. Mg Cl2 50 mM……………………....0,75 µl ...........
............... 3,75 µl
4. dNTPs 10 mM............................0,5 µl ........... x 5 .............. 2,5 µl
5. Primer Arg 158 (50 pM/µl) ....... 0,4 µl………..
…….…... 2 µl
6. Primer Arg 112 (50 pM/µl)........ 0,2 µl………..
…….……
7. Primer R-Apo E (50 pM/µl)….. 0,4 µl………..
…….…….. 2 µl
8. Primer F-AAT (0,5 pM/µl) …....0,4 µl ………..
............... 2 µl
9. Primer R-AAT (0,5 pM/µl) ….....0,4 µl ………..
............... 2 µl
10. DMSO……………………………….… 1,8 µl...........
................ 9 µl
11. Taq pol. (5U/µl).............………….0,2 µl ……
…………… 1 µl
1 µl
12. ADN ......................................5µl
5.- Preparación de la master mix: Idem a las anteriores
6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo
de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin
(centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.
33
Programa de ciclado:
Preciclo:
95°C ............. 4 minutos
96°C ..............45 segundos
66°C ..............45 segundos
35 ciclos
72°C ..............45 segundos
Extensión final: 72°C ................ 5 minutos
Los fragmentos resultantes de la digestión se separan en geles de agarosa al
2,5%.
Observación e interpretación de los Resultados
34