Introducción

Introducción
La PCR o o la reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica bioquímica que puede generar
millones de copias de una cadena molde de ADN. La técnica se basa en las mismas enzimas que
utilizan las células para replicar el ADN, sin embargo, se realiza en un tubo de ensayo sencillo
utilizando ciclos controlados de calentamiento y enfriamiento. La PCR ha revolucionado el campo de
la biotecnología, por la rápidez y económia para replicar, o amplificar, segmentos específicos de ADN.
El PCR ha hecho posible llevar a cabo la secuenciación del ADN y determinar el orden de los
nucleótidos en los genes individuales. Las técnicas de PCR se aplican en muchas áreas de la
biotecnología, incluyendo la ingeniería de proteínas, la clonación, la medicina forense (huella de
ADN) y para el análisis de muestras medioambientales.
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Materiales para la PCR

Plantilla de ADN (genómico, plásmido, cósmido, bacteriano / de levadura, etc)

Cebador directo (F)

cebador inverso (R)

Buffer (Aproximadamente 10 X, por lo general se vende con la polimerasa Taq)

MgCl2 (50 mM es conveniente)

Taq ADN polimerasa

dNTP mix

estéril ddH20

Máquina de termociclado
MÉTODO PARA LA PCR
1. Agite en el Vortex todas las soluciones para una buena mezcla.
2. Añada agua libre de nucleasas a un tubo de PCR.
3. Añada la solución tampón de enzima Taq polimerasa.
4. Añada la mezcla de dNTP.
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El dNTP (desoxirribonucleótido trifosfato) Mix es una disolución premezclada que contiene
sales de sodio de los siguientes compuestos
i. dATP,
ii. dCTP,
iii. dGTP
iv. y dTTP
5. . Añada la plantilla de ADN.
6. Añada
a. Cebador directo (F)
b. y cebador inverso (R).
i. Un cebador es una cadena de ácido nucleico que sirve como un punto de partida para
la síntesis de ADN.
7.
Añada MgCl2.
Este compuesto facilita la unión del cebador (y el ADN diana posterior) al molde de ADN.
8.
Añada enzima ADN Taq polimerasa.
La enzima Taq polimerasa, es una enzima aislada originalmente de las bacteria
Thermus aquaticus.
Esta ADN polimerasa enzimáticamente ensambla una nueva hebra de ADN a partir de
bloques de construcción de ADN, los nucleótidos, mediante el uso de ADN de cadena
simple como plantilla y oligonucleótidos de ADN.
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9.
Colocar el tubo de mezcla preparada en el termociclador para el inicio del ciclo.
10. Configuración del programa de PCR:
11.
a. Etapa de inicialización: Esta etapa consiste en calentar la reacción a una temperatura
de 94 - 96 ° C, que se mantiene durante 1-9 minutos.
b. Etapa de desnaturalización: Este paso es el primer ciclo regular y consiste en calentar
la reacción a 94-98 ° C durante 20-30 segundos. Esto proboca la fusión de la plantilla de
ADN mediante la interrupción de los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias,
produciendo moléculas monocatenarias de ADN.
c. Hibridacion: La temperatura de reacción se reduce a 50-65 ° C durante 20-40 segundos
permitiendo la hibridación de los cebadores a la plantilla de ADN de cadena sencilla.
d. Extensión / alargamiento: La temperatura en esta etapa depende de la ADN
polimerasa usada; la Taq polimerasa tiene su temperatura de actividad óptima a 75-80 °
C, y comúnmente se utiliza una temperatura de 72 ° C con esta enzima.
i. En este paso la ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementaria a la hebra molde de ADN mediante la adición de dNTPs que
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son complementarios a la plantilla en 5 'a 3', condensando el grupo 5'-fosfato
de los dNTPs con el grupo 3'-hidroxilo al final de la cadena de ADN naciente
(ampliación).
e. Paso Final consiste en el mantenimiento de la reacción a 4-15 ° C durante un tiempo
indefinido se puede emplear para almacenamiento a corto plazo de la reacción.
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