Laboratorio de Fisiología - Fisiología Animal (Sangre)

GUÍA 7: ESTUDIO DE LAS DETERMINACIONES HEMATOLÓGICAS EN SANGRE
Objetivos
1. Conocer y determinar algunos parámetros hemáticos representativos.
2. Interpretar los resultados experimentales.
3. Estudiar diferentes tipos de anemia.
4. Comprobar si el hematocrito tiene relación con el volumen ocupado por los eritrocitos.
El estudio de las determinaciones hematológicas en sangre consta de dos bloques:
1. Parámetros e índices hematimétricos: para determinar los valores más
representativos de la sangre.
2. El eritrocito como osmómetro: para detectar la susceptibilidad de los eritrocitos frente a
pequeñas variaciones de la concentración osmótica del medio.
Introducción
Principios fisiológicos
La sangre de vertebrados constituye una especialización del medio interno; su volumen varía
según la especie, y en el hombre representa el 8% del peso corporal. La sangre es un líquido
complejo con un peso específico de 1,055 g/ml.
Las células sanguíneas realizan dos funciones importantes: transporte de gases respiratorios (O2 y
CO2) y protección inmunológica frente a agentes extraños. La primera la llevan a término los
eritrocitos (también llamados hematíes o glóbulos rojos), células muy especializadas. Si bien en
casi todos los grupos de vertebrados los eritrocitos son nucleados, biconvexos y generalmente
elípticos, en los mamíferos (aparte de los camélidos) son enucleados y discoidales.
Los eritrocitos contienen un pigmento proteico en concentración elevada, la hemoglobina, la cual se
combina reversiblemente (en relación con la presión parcial del gas) con el O2 y el CO2. Cada
hemoglobina está formada por cuatro subunidades, cada una con un grupo hemo (responsable del
color rojo y al cual se une una molécula de O2) y una globina (responsable de las interacciones
alostéricas que modifican la afinidad al O2 y a la cual se fija el CO2).
La función de transporte de oxigeno por la sangre vendrá condicionada, en primer lugar, por la
cantidad de hemoglobina circulante, la cual dependerá del número de eritrocitos y de la
concentración eritrocítica del pigmento.
Protocolo Experimental
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Se hará una determinación de los índices más representativos de la sangre: contaje globular,
hematocrito, y hemoglobina con método manual y método automático.
A partir de estos valores se calcularán los índices hematimétricos: Volumen corpuscular medio
(VCM), Hemoglobina corpuscular media (HbCM) y Concentración de hemoglobina corpuscular
media (CHbCM).
Se valorarán los cambios provocados en el volumen celular por efecto de disoluciones de diferente
concentración osmótica.
Metodología
Pararámetros e índices hematimétricos
Sacar sangre por punción venosa a un perro o gato
Guardar en tubo heparinizado en nevera a 4ºC
Antes de analizar cada parámetro, resuspender la sangre con agitador de rodillo
Contaje Globular
Esta medida se realiza mediante una cámara de Thoma o de Neubauer que presenta una
cuadrícula especial (ver figura 1). El contaje se expresa en millones de glóbulos por mm3 de sangre.
La disminución del número indica una anemia y el aumento, una policitemia.
Hematocrito
Expresa el volumen de eritrocitos que hay en 100 ml de sangre. Normalmente los leucocitos y las
plaquetas contribuyen al hematocrito en un grado ínfimo, referido al tanto por ciento de volumen de
sangre. El valor del hematocrito varía con la especie y en relación con el número y el tamaño de
los eritrocitos así como con el volumen de plasma. Un hematocrito reducido puede ser un indicador
de anemia y un valor elevado (65%) se observa en casos de deshidratación, como el cólera (a
causa de las considerables pérdidas de líquido en la defecación, con la consiguiente reducción del
volumen plasmático). El valor del hematocrito constituye un índice indirecto de la capacidad de
transporte de oxígeno de la sangre y es un parámetro importante para detectar una anemia o una
policitemia.
Índices hematimétricos
La relación entre los valores hemáticos de hematocrito o Htc (volumen celular × 100/volumen de
sangre), contaje o Rc (millones de eritrocitos/mm3) y concentración de hemoglobina o Hb (g Hb/100
ml sangre) permiten calcular los índices hematimétricos. Tienen interés porque presentan variaciones
entre los diferentes vertebrados y permiten interpretar alteraciones patológicas, como por ejemplo las
anemias.
Volumen corpuscular medio
El volumen corpuscular medio (VCM) es el volumen medio de los eritrocitos y viene dado por
la expresión: VCM = (Htc × 10) / Rc donde Rc representa el número de eritrocitos en millones
por mm3 de sangre.
Hemoglobina corpuscular media
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Hemoglobina corpuscular media (HbCM) es la cantidad media de Hb por eritrocito. Se expresa en
picogramos y se puede calcular siguiendo la expresión: HbCM = (Hb × 10) / Rc donde Hb es la
concentración de hemoglobina en g/100 ml sangre y Rc los millones de eritrocitos por mm3 de
sangre.
Concentración de hemoglobina corpuscular media
Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHbCM) es la concentración media de
hemoglobina de los eritrocitos, es decir, la cantidad (en g) que hay en 100 ml de glóbulos; viene
dada por la expresión: CHbCM = Hb / (Htc / 100) = Hb × (100 / Htc)
El eritrocito como osmómetro
A causa de la marcada susceptibilidad de los eritrocitos frente a las pequeñas variaciones de la
concentración de partículas osmóticamente activas en el medio que las rodea, el eritrocito pierde o
gana líquido con relativa facilidad. Los cambios provocados en el volumen celular por efecto de
disoluciones de diferente concentración osmótica pueden comprobarse fácilmente mediante la
determinación del hematocrito. Esta prueba pone de manifiesto la necesidad de controlar
cuidadosamente los factores o elementos que puedan modificar la composición del medio con el
cual se ponen en contacte los eritrocitos, para evitar errores o variaciones importantes a la hora de
determinar el hematocrito de una muestra de sangre.
Material
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Centrífuga
microhematocrito
Espectrofotómetro
Contador hematológico
Microscopio
Pipetas automáticas
Pipeta cuentaglóbulos
Cámara de Thoma o Neubauer
Contaje globular
A.
Método manual
Dilución de la sangre:
— Se introduce la punta de la pipeta cuenta glóbulos, colocándola en posición casi horizontal, y se
aspira para hacer subir la sangre hasta al señal 0,5 de la pipeta. Si la sangre pasa de la señal,
puede hacerse retroceder tocando el extremo de la pipeta con un papel de filtro, para eliminar el
volumen excedente. Es importante no pasarse de la marca 0,5.
— Es importante limpiar de sangre la superficie de la pipeta con papel de filtro y vigilar de no
perder muestra del interior.
— Con la punta de la lengua se ha de tapar el tubo de goma, sumergir la punta de la pipeta en el
líquido de dilución (suero fisiológico al 0,9 %) y aspirar hasta que este líquido llegue a la señal 101.
Al sumergir la punta, hay que aspirar al principio con rapidez para evitar que parte de la sangre de
la pipeta pase al líquido. Es importante no pasarse.
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— Se ha de tapar con el dedo la punta de la pipeta, quitar el tubo de goma y tapar el otro extremo
con el índice (o a la inversa, como sea más cómodo). Se ha de girar la pipeta, así sostenida,
diversas veces para mezclar el contenido. Así, la sangre se ha diluido en 0,5/100 o 1/200.
Aplicación sobre la cámara de Thoma o de Neubauer (ver la fig. 1)
— Se ha de desengrasar la cámara y un cubreobjetos, el cual se colocará sobre la zona de
contaje.
— Se hace tocar la punta de la pipeta diversas veces con un papel de filtro para eliminar el líquido
contenido en el capilar, ya que contiene sólo diluyente. Es importante que antes de este paso se
vuelva a mezclar el contenido girando la pipeta diversas veces, ya que durante la preparación de la
cámara los glóbulos pueden haberse sedimentado parcialmente.
— A continuación se hace tocar la punta de la pipeta con el lado del cubreobjetos (sobre la
elevación longitudinal central, entre los dos zócalos de la cámara). La suspensión de eritrocitos no
habría de sobrepasar el zócalo transversal central (si hay). Alternativamente, se puede depositar
una pequeña gota y después colocar encima el cubreobjetos (aunque este sistema es menos
fiable).
— Después de unos minutos, para que sedimenten las células, se observa al microscopio con un
objetivo de aumento mediano.
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Contaje (ver la fig. 1):
— La cámara de Thoma o de Neubauer consta de una cuadrícula central (1 mm2) con 16 cuadros
grandes (4 × 4), separados por líneas divisorias. Cada uno de estos cuadrados está dividido en
16 cuadraditos pequeños de 1/400 mm2 de superficie.
— Si los eritrocitos se han repartido homogéneamente por toda la cuadrícula, se procede al
contaje (en caso contrario tendría que repetirse la aplicación a la cámara). Para esto se
cuentan los eritrocitos en cinco cuadritos de cada uno de los cuadros grandes. En cada
cuadradito se consideran dentro 10 de las células que estén sobre las líneas inferior y
derecha, pero no se tienen en cuenta las que estén sobre las otras líneas. En total se habrán
contado 5 × 16 = 80 cuadraditos.
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Cálculo
El volumen de líquido de la parte de la cámara donde se realiza el contaje es: 1/400 mm2
(área de un cuadradito) × 80 (número de cuadraditos) × 0,1 mm
(profundidad de cámara) = 0,02 mm3.
El número de células por mm3 de suspensión diluida será:
número contado / 0,02 = número contado × 50.
La dilución en la pipeta es de 1/200; por tanto, el número de eritrocitos por mm3 de sangre será:
número contado × 50 (factor dependiente de volumen) × 200 (factor de dilución).
Para expresarlo en millones de eritrocitos por mm3, lo único que tendrá que hacerse es dividir el
número contado por 100.
B.
Utilizando un contador de partículas
Los contadores de partículas utilizan el sistema Coulter, que es un sistema no óptico en qué una
suspensión de células sanguíneas circula a través de una abertura al mismo tiempo que pasa un
corriente eléctrica. El paso de cada célula produce un cambio de impedancia (resistencia) en la
abertura según el tamaño de la célula. El contador relaciona el tamaño con el tipo de célula. El
número de células contadas es unas 100 veces superior a las contadas en los recuentos
microscópicos (manuales), con lo que se reduce el error.
El número de pulsos eléctricos indica el número de partículas que pasan por la abertura, y la
medida de los pulsos es proporcional al volumen de las partículas.
Los contadores Coulter hacen el recuento de eritrocitos, leucocitos y plaquetas por triplicado.
Los contadores de partículas disponen de dos baños, uno de eritrocitos con una abertura de 50 µm
y otro de leucocitos con una abertura de 100 µm.
Contaje de eritrocitos
En el baño de eritrocitos, estos son identificados como partículas de medida igual o superior a 36 fl.
En este baño también se llevan a cabo el recuento de plaquetas (volumen entre 2 y 20 fl).
Contaje leucocitos
A continuación las células son diluidas con diluente isotónico y pasan al baño de leucocitos, donde
se aplica un agente que lisa los eritrocitos y leucocitos, de manera que quedan los núcleos de los
leucocitos intactos (los eritrocitos no tienen núcleo) y las partículas con un volumen de 35 fl o más
son contadas como leucocitos.
Valoración de Hb
Para la valoración de la Hb, el agente lisante reacciona con la hemoglobina libre y el color
resultante se lee a 525 nm.
A partir de estos valores el contador tiene capacidad para calcular: Hc, VCM, HCM, CHCM
Hematocrito (Hc)
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1. Resuspender células por inversión
2. Sumergir el capilar en la sangre por uno de sus extremos. Para favorecer la entrada de sangre
conviene mantener el capilar casi horizontal.
3. Cuando falte medio centímetro para el llenado del capilar. Obturar el extremo con plastilina y
limpiar sangre exterior.
4. Colocar los capilares en la centrífuga de micro hematocrito de forma que el extremo
5. con la plastilina esté en contacto con la goma de la rendija.
6. Ajustar bien la primera cubierta de la centrífuga.
7. Cerrar la centrífuga. Centrifugar durante 5-6 minutos.
El eritrocito como osmómetro
En diferentes tubos de ensayo es colocar 1 ml de cada cuna de las disoluciones siguientes
de NaCl:
50 mM
150 mM
400 mM
A continuación, se añade 1 ml de sangre, mantenida incoagulada, a cada uno de los tres tubos y se
deja en reposo durante 1 minuto. Hay que agitar los tubos invirtiéndolos suavemente. Por
capilaridad, se transfiere una muestra de cada sangre a los tubos capilares de micro hematocrito y
se valora el hematocrito en cada caso, relacionando el valor obtenido con la concentración
osmótica del medio en el cual se ha puesto en contacto la muestra inicial de sangre.
Resultados
Tipos principales de anemias
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