Caracterización-de-la-actividad-del-potencial-de-campo-local-en

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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA
CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL POTENCIAL
DE CAMPO LOCAL EN EL BULBO OLFATORIO DE LA RATA
CHRISTIAN ANTONIO MAZÚ LEIVA
Memoria para optar al Título
Profesional
de Médico Veterinario
Departamento de Ciencias Biológicas
Animales
PROFESOR GUÍA: Dra. MARÍA DE LA LUZ AYLWIN OSTALÉ
PROYECTO MILENIO ICM P01-007 F
SANTIAGO-CHILE
2005
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA
CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL POTENCIAL
DE CAMPO LOCAL EN EL BULBO OLFATORIO DE LA RATA
CHRISTIAN ANTONIO MAZÚ LEIVA
Memoria para optar al Título
Profesional
de Médico Veterinario
Departamento de Ciencias Biológicas
Animales
PROFESOR GUÍA: Dra. MARÍA DE LA LUZ AYLWIN OSTALÉ
PROYECTO MILENIO ICM P01-007 F
SANTIAGO-CHILE
2005
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA
CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL POTENCIAL
DE CAMPO LOCAL EN EL BULBO OLFATORIO DE LA RATA
CHRISTIAN ANTONIO MAZÚ LEIVA
NOTA FINAL: ..........................
NOTA
FIRMA
Profesor guía:
Dra. María de la Luz Aylwin Ostalé
...................
....................
Profesor consejero:
Dr. Luis Adaro Aravena
...................
....................
Profesor consejero:
Dr. Rigoberto Solís Muñoz
...................
....................
SANTIAGO-CHILE
2005
A mi Abuelo, Dima Leiva.
A mi Amigo, Francisco Contreras.
Agradecimientos
En primer lugar, quiero agradecer a las personas que participaron activamente en
el desarrollo de esta memoria, a la Dra. Marilu Aylwin, mi profesora guía, puesto que el
amor que imprime en su trabajo resulta un ejemplo a seguir, por su amistad,
comprensión, apoyo y por supuesto, por los conocimientos que nos abre a todos los que
hemos tenido el honor de pasar por su laboratorio.
A mis compañeros de “lab” Ximena García, Verónica Lastra, Guillermo Aguilar
y Christian Lopez que siempre están ahí cuando los necesito y que se han convertido en
amigos de verdad.
Al laboratorio del Dr. Pedro Maldonado, sus ayudantes y alumnos (Rómulo, Pepe, Ceci,
Paul y Marcelo), en donde la neurociencia se HACE a mano.
Quiero agradecer a mi familia por ser incondicionales en su amor y por haberme
dado las herramientas que me permiten hoy patentar logros, por darme las fuerzas para
enfrentar sin miedo el futuro.
A mis compañeros y amigos, de curso y de trabajo, que en diferentes
oportunidades hicieron sacrificios para ayudarme en este proceso. Por los turnos, las
ausencias, los retrasos. A todos los que les diserté, leí párrafos o les hice digerir mi
memoria.
Y en especial, a Paulina Caroca, por su apoyo infinito, su paciencia sin límites y
todo su amor que me ha hecho ser mejor cada día, por lo feliz que me hace estar a su
lado y por estar junto a mí en este camino nuevo que ahora comienza, en el cual espero
siempre poder tenerla a mi lado.
IV
TABLA DE CONTENIDOS
Página
Calificaciones
II
Dedicatoria
III
Agradecimientos
IV
Indice de ilustraciones y tablas
VIII
Resumen
IX
Sumary
X
1 Introducción
1
2. Revisión bibliográfica
2
2.1 Generalidades del sistema sensorial olfatorio
2
2.2 Sistema olfatorio principal
3
2.3 Sistema olfatorio accesorio
4
2.4 Anatomía del sistema olfatorio principal
6
2.4.1 Epitelio olfatorio
6
2.4.2 Neurona receptora olfatoria
7
2.5 Transducción y codificación de las señales olfatorias
2.5.1 Transducción
9
2.5.2 Codificación
12
2.6 Generalidades del bulbo olfatorio
12
2.7 Anatomía del bulbo olfatorio
14
2.8 Fisiología del bulbo olfatorio
16
2.9 Electrofisiología del bulbo olfatorio
19
3. Objetivos
26
3.1 Objetivo general
26
3.2 Objetivos específicos
26
4. Materiales y método
V
8
27
4.1 Animales
27
4.2 Equipos y montaje
27
4.2.1 Micromanipulador
27
4.3 Equipos de monitoreo y mantención
28
4.4 Equipos de registro
29
4.4.1 Tétrodos
29
4.4.2 Preamplificador
30
4.4.3 Amplificador con filtro de banda
30
4.4.4 Osciloscopio
31
4.4.5 Tarjetas análogo digitales
31
4.5 Metodología
31
4.5.1 Diseño experimental
31
4.5.2 Técnica anestésica
32
4.5.3 Técnica quirurgica
33
4.5.3.1 Material quirúrgico
33
4.5.3.2 Procedimiento quirúrgico
33
4.5.3.3 Registro electrofisiológico y adquisición de datos
34
4.5.3.3.1 Adquisición
34
4.6 1 Procesamiento del registro de los pot. De acción
35
4.6.2 Procesamiento del registro de los LFP
36
4.7 Análisis de datos
36
4.7.1 Análisis del LFP en relación a sus diferentes profundidades
de registro con respecto al LFP en las células mitrales y en penacho.
4.7.2 Análisis del LFP asociado al ciclo respiratorio
5 Resultados
37
38
39
5.1 Implementación de los instrumentos y procedimientos necesarios
para el desarrollo adecuado de los experimentos.
VI
39
5.1.1 Procedimientos
39
5.1.2 Instrumentos
39
5.1.3 Reformulación del protocolo anestésico
40
5.1.4 Registro electrofisiológico
42
5.2 Análisis del comportamiento del potencial de campo local
en las distintas capas del bulbo olfatorio en ausencia de estímulo
42
5.3 Análisis del potencial de campo local en las distintas capas
del bulbo olfatorio en ausencia de estímulo a partir del registro
asociado al ciclo respiratorio al momento del registro.
6 Discusión
52
55
6.1 Análisis del comportamiento del potencial de campo local en las distintas
capas del bulbo olfatorio en ausencia de estímulo
55
6.2 Análisis del potencial de campo local en las distintas capas del
bulbo olfatorio en ausencia de estímulo a partir del registro
asociado al ciclo respiratorio al momento del registro.
60
7 Conclusiones
62
8 Referencias
65
VII
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES Y TABLAS
Página
Figura Nº 1
4
Figura Nº 2
5
Figura Nº 3
10
Figura Nº 4
11
Figura Nº 5
14
Figura Nº 6
28
Figura Nº 7
30
Figura Nº 8
35
Figura Nº 9
44
Figura Nº 10
45
Figura Nº 11
53
Figura Nº 12
57
Tabla Nº 1
41
Tabla Nº 2
43
Tabla Nº 3
47
Tabla Nº 4
50
Tabla Nº 5
51
Tabla Nº 6
54
VIII
RESUMEN
El bulbo olfatorio (BO) es el primer centro de integración de la actividad
neuronal gatillada por la presencia de odorantes en el medio ambiente. Esta integración
dentro del BO juega un rol importante en la detección y discriminación. Se ha propuesto
que la actividad eléctrica oscilatoria del BO sustenta los procesos de discriminación y
aprendizaje de odorantes. Sin embargo, toda la evidencia disponible apunta al efecto de
los odorantes sobre la actividad del BO sin considerar el estado “basal” del BO en
ausencia de odorantes. Los estímulos olfatorios inducen a una activación particular de
las neuronas receptoras olfatorias, la cual modificará esta actividad basal del BO
iniciando los procesos subyacentes a la detección, discriminación y percepción olfatoria.
El objetivo de esta memoria fue caracterizar la actividad eléctrica oscilatoria del
potencial de campo eléctrico local en ausencia de odorantes en las diferentes capas del
BO. Se registro el potencial de campo eléctrico local simultaneamente con 2 tétrodos (n
=10 ratas), uno fijo (capa mitral) y otro móvil (distintas capas del BO) y el ciclo
respiratorio utilizando una termocupla. Mediante la transformación rápida de Fourier
(FFT) se obtuvo la frecuencia y amplitud de la oscilacion predominante en forma
independiente del ciclo respiratorio. Por otra parte, utilizando un espectrograma se
determinó la frecuencia de la oscilación predominante en función del ciclo respiratorio.
Encontramos que en ausencia de un estímulo olfatorio sólo un 30% de los
registros (móviles y fijos) mostraron una actividad oscilatoria significativa
correspondiente al rango de frecuencia gamma (30 – 100 Hz.), y que la potencia de esta
oscilación aumenta a medida que el electrodo se mueve desde la capa glomerular a la
capa granular. Más aún, esta oscilación es dependiente del ciclo respiratorio, mostrando
un aumento de su potencia durante la fase inspiratoria del ciclo en ausencia de
odorantes.
Se concluye que hay una actividad oscilatoria gamma espontánea en al menos
algunas regiones del BO en ausencia de odorantes. Más aún, estos resultados sugieren
que la actividad eléctrica neuronal espontánea en el BO tiene una estructura temporal y
IX
que depende del ciclo respiratorio, indicando que este ciclo es una parte intrínseca de la
codificación olfatoria y que todo estímulo inducido debe ser integrado en esta actividad
oscilatoria.
SUMMARY
The olfactory bulb (OB) is the first center in the olfactory pathway where the
neuronal activity triggered by the odorants present in the environment is integrated. This
integration within the OB plays an important role in odorant detection and
discrimination. The oscillatory electrical activity in the OB has been proposed as a
mechanism that sustains discrimination and learning of odorants. However, all the
available evidence has been concerned with the effect of odorants in the OB activity and
no detailed studies have characterized the OB “ongoing” oscillatory activity in the
absence of odorants. The olfactory stimulus induces a particular activation of the
olfactory receptor neurons that will in turn modify this OB “ongoing” activity initiating
the processes that underlie olfactory detection, discrimination and perception.
The objective of this thesis was to characterize the oscillatory local electrical
field potential in the absence of odorants all through the different layers of the OB. We
registered simultaneously the local field potential in two locations using 2 tetrods (n =
10 rats), one was fix in the mitral cell layer and the other was mobile (through different
OB layers). We also recorded the olfactory cycle by means of a thermocouple located in
one nostril. Using the Fast Fourier Transform (FFT), we obtained the frequency and
power of the predominant oscillation during the experiment. We also calculated the
average spectrogram for the respiratory cycle and determined if the oscillations were
modulated by respiration.
We found that in the absence of an olfactory stimulus, only 30 % of the recording
sites (mobile and fix), showed a significant oscillation in the gamma range (30 -100 Hz)
and that the power of this oscillation increases as the electrode moves from the
glomerular to the granular layer. Furthermore, the power of this oscillation increases
X
during the inspiratory phase of the respiratory cycle, indicating that it is modulated by
the respiration in the absence of odorants.
We conclude that there is a spontaneous gamma oscillation in at least some
regions of the OB in the absence of odorants. Furthermore, these results suggests that the
spontaneous electrical neuronal activity in the OB has a temporal structure that depends
on the respiratory cycle indicating that this cycle is an intrinsic part of the olfactory
coding for odorant stimulus as all olfactory stimulus induced activity should be
integrated to this “ongoing” activity.
XI
1. INTRODUCCIÓN
El sistema olfatorio es el encargado de entregarnos información acerca del
universo molecular de nuestro entorno y permite el desarrollo de actividades tales como
la búsqueda de alimentos, la actividad reproductiva y el reconocimiento de las crías. Es
la consecuencia evolutiva de los primeros sistemas sensoriales de los organismos más
básicos existentes, puesto que persiste la necesidad de un receptor al cual se acople de
manera específica a una molécula en particular. Este sistema tiene la capacidad de
reconocer sustancias individuales, pero también agrupar un conjunto de éstas dentro de
un mismo precepto.
El sistema olfatorio consta de un conjunto de receptores ubicados en la cavidad
nasal, constituido en un epitelio olfatorio, el cual para poder contactar las moléculas
odorantes depende de la actividad respiratoria y su influjo de aire generado en la
inspiración. La información detectada por los receptores es directa, es decir, cada célula
receptora que se estimula, envía un potencial de acción a través de su axón hacia una
estructura de relevo, desde la cual salen los axones neuronales que llevarán la
información procesada hasta los centros superiores de respuesta. Esta estructura de
relevo, denominada bulbo olfatorio, estaría encargada de la modulación de la
información proveniente de los receptores y sería quien envía estos estímulos al resto de
la corteza olfatoria.
El bulbo olfatorio presenta una actividad eléctrica registrada a nivel celular de
manera conjunta (potencial de campo local) o individual, la cual tiene un patrón
oscilatorio en presencia de estímulo. Es posible que esta actividad oscilatoria sea la
encargada de la modulación y también de la codificación de la información olfatoria.
Pero esta oscilación no se produce solo en presencia de estímulos, es posible que exista
un patrón de actividad basal, sobre el cual los estímulos olfatorios se integran. Pero
nunca se ha registrado esta actividad de manera directa ni menos caracterizado en
ausencia de estímulos olfatorios.
1
Por esta razón, el propósito de esta memoria es realizar una caracterización de los
potenciales de campo local dentro de las diferentes capas del bulbo olfatorio en ausencia
de estímulos.
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. GENERALIDADES DEL SISTEMA SENSORIAL OLFATORIO
El sistema olfatorio tiene como función la detección, identificación y
discriminación de las sustancias químicas volátiles del ambiente y junto al gusto y el
sistema sensitivo trigeminal, conforman los sentidos químicos. El sistema sensorial
olfatorio proporciona información que es utilizada por los animales y participa en la
generación de una serie de conductas de gran importancia para su supervivencia, entre
los que se encuentran el reconocimiento de los individuos de la misma especie,
búsqueda de fuentes de alimento y detección de potenciales depredadores. La capacidad
de detectar estímulos químicos desde el medio ambiente constituye el sistema sensorial
más antiguo, ya que la detección de sustancias disueltas en el medio circundante a través
de la unión de estas partículas a receptores específicos está presente desde los primeros
organismos unicelulares. Por otra parte, considerando los sistemas sensoriales clásicos,
evolutivamente el sistema olfatorio es el sistema sensorial más antiguo y a la vez, uno de
los más desconocidos en cuanto a su funcionamiento (Purves et al., 1997).
Los odorantes, compuestos químicos de carácter volátil presentes en el medio
ambiente, interactúan con células receptoras especializadas localizadas en el epitelio
olfatorio, que finalmente transducen las señales químicas en señales neuronales que
viajan hasta el sistema nervioso central donde se integra con la información proveniente
de otros sistemas sensoriales dando origen a respuestas a los estímulos (Buck, 1991).
La presencia de diversos receptores para odorantes particulares y el
reconocimiento de mezclas de diversas moléculas odorantes como provenientes de un
2
mismo objeto hablan de la enorme capacidad de detectar, discriminar e identificar del
sistema olfatorio, los cuales pueden ser captadas incluso en concentraciones muy bajas
(Purves et al., 1997). La percepción de los odorantes comienza con la muestra tomada en
la fase inspiratoria durante cada ciclo respiratorio. Este proceso le confiere un aspecto
intermitente, es decir, la intensidad de los estímulos varía en el tiempo producto del ciclo
respiratorio, estableciéndose así una dimensión espacial y otra temporal de los odorantes
(Finger et al., 2000).
La percepción de compuestos volátiles se realiza mediante dos sistemas que
poseen estructuras similares, pero funciones diferentes. Uno, es el sistema olfatorio
principal, el cual detecta, discrimina e identifica odorantes volátiles del medio ambiente,
que permite al individuo desarrollar funciones básicas como la detección de su alimento.
El otro sistema esta
conformado por vías exclusivas asociadas a la conducta
reproductiva del individuo, es decir, la detección de las sustancias feromonales para el
proceso de apareamiento, el reconocimiento de sus crías y de organismos de la misma
especie (Buck, 1991; Purves et al., 1997). Cada uno de estos sistemas, posee estructuras
y vías definidas a los centros de integración superior asociados directamente con su
función (Buck, 1991; Purves et al., 1997; Finger et al., 2000).
2.2. SISTEMA OLFATORIO PRINCIPAL
El sistema olfatorio principal esta conformado por el epitelio receptor ubicado en
la pared de las fosas nasales, el cual está conformado por las células receptoras
olfatorias, células sustentaculares o de apoyo y las células madres que dan origen a las
células receptoras olfatorias. Los axones de las células receptoras conforman el nervio
olfatorio, cruzan la lámina cribosa del hueso etmoides y llegan hasta el bulbo olfatorio,
la primera estructura de integración del sistema olfatorio. Desde el bulbo olfatorio, los
axones de las células de proyección forman el tracto olfatorio que se proyecta a las
diferentes cortezas olfatorias, donde se integra la información olfatoria dando origen a
3
las distintas conductas mediadas por el sistema olfatorio (Buck, 1991; Purves et al.,
1997). (Figura Nº 1)
FIGURA Nº 1 : Estructura de las células receptoras olfatorias organizadas en su epitelio
y su asoociación con el bulbo olfatorio. (Buck, 1991)
2.3. SISTEMA OLFATORIO ACCESORIO
El sistema olfatorio accesorio tiene como función detectar las moléculas de
feromonas (Purves et al., 1997; Finger et al., 2000). Este sistema esta compuesto por un
epitelio olfatorio accesorio que forma parte del órgano vomeronasal, el cual corresponde
a una estructura tubular que se abre a la cavidad nasal por medio de un conducto
4
localizado en su polo anterior. El epitelio posee características similares al epitelio del
sistema olfatorio principal (Finger et al., 2000).
La feromonas alcanzan las células receptoras del epitelio del órgano vomeronasal
mediante un bombeo generado por cambios en el volumen local que hacen variar el
diámetro luminal. Los axones de las neuronas receptoras de esta estructura también
forman parte del
nervio olfatorio, atraviesan la lámina cribosa del etmoides y se
proyectan hacia una región distinta denominada bulbo olfatorio accesorio localizado en
la región dorsal y posterior del bulbo olfatorio (Finger et al., 2000). Los axones de las
células de proyección del bulbo olfatorio accesorio se proyectan hacia regiones como la
amígdala, y de ésta al hipotálamo, tálamo y corteza frontal (Figura Nº 2).
FIGURA Nº 2 : Esquema de la organización cortical de las vías de información olfatoria.
(Buck, 1991)
5
2.4. ANATOMÍA DEL SISTEMA OLFATORIO PRINCIPAL
El sistema olfatorio principal detecta las sustancias químicas volátiles del medio
ambiente por células receptoras olfatorias ubicadas en el epitelio olfatorio, estructura
que recubre la cara interna de la cavidad nasal, Desde el punto de vista anatómico, el
órgano sensorial olfatorio está compuesto por la nariz, las cavidades nasales, los cornetes
nasales y el epitelio olfatorio. En la mayoría de los mamíferos terrestres, las cavidades
nasales conforman dos fosas irregulares situadas por encima de la cavidad bucal, y que
están separadas entre sí por un delgado tabique sagital. El techo de la cavidad nasal, está
formado por el hueso frontal y atravesando la lámina cribosa del hueso etmoides
descansa el bulbo olfatorio, en la fosa craneal anterior (Rouvière et al., 1994). A cada
lado del tabique nasal, en las paredes laterales, existe un conjunto de masas óseas, las
conchas o cornetes nasales. Estos laberintos óseos permiten la adecuada conducción del
aire y de las moléculas odorantes a su paso por la cavidad nasal. Además, estas
estructuras dejan entre ellos espacios o meatos que son lugares de paso del aire inspirado
cuya función consiste en calentar el aire (Gartner y Hiatt, 1997).
En los mamíferos terrestres, el epitelio olfatorio está ubicado en la cara interna de
la cavidad nasal y posee una superficie variable según la especie, siendo de 10 cm² en el
humano promedio (70 Kg) y de 20 cm² en el gato (3kg) (Buck, 1991).
2.4.1. EPITELIO OLFATORIO
La cavidad nasal ósea se encuentra tapizada, por al menos, tres tipos de epitelios
de revestimiento, creando distintos tipos de mucosa en distintas zonas, siendo todas ellas
muy vascularizadas. Así, encontramos en la parte rostral, revistiendo la porción
cartilaginosa de la nariz, la mucosa nasal, que posee un epitelio pluriestratificado plano,
no cornificado con abundantes glándulas serosas y mucosas, que se continúa con el
epitelio queratinizado de la piel. Los dos tercios inferiores de la cavidad nasal
propiamente tal, se encuentran revestidos por mucosa respiratoria muy vascularizada de
6
color rojizo, caracterizada por un epitelio seudo-estratificado cilíndrico con cilios y
numerosas células caliciformes, productoras de mucus (Gartner y Hiatt, 1997).
Finalmente, distribuido en una pequeña área ubicada en el techo de la cavidad nasal se
ubica el epitelio olfatorio, el cual está formado por una delgada capa celular de color
amarillento, constituido por neuronas receptoras olfatorias (Purves et al., 1997).
El epitelio olfatorio esta formado por varios tipos celulares. La neurona receptora
olfatoria de tipo bipolar que da origen en su superficie basal a un axón amielínico por el
cual viajan los potenciales de acción hacia el bulbo olfatorio conformando el nervio
olfatorio, que corresponde al primer nervio craneano. En su superficie apical genera una
protrusión con forma de botón que posee micro vellosidades denominadas cilios
olfatorios, donde se encuentran las proteínas receptoras para las moléculas olfatorias.
Los cilios de las células receptoras están embebidos en un mucus secretado por
las glándulas de Bowman que regula el medio iónico, además de otorgar protección
mecánica e inmunológica. Existen además otros dos tipos de células en el epitelio
olfatorio, las células basales que dan origen a nuevas células receptoras olfatorias y
reemplazan el epitelio en una periodicidad de entre 6 a 8 semanas y las células
sustentaculares, encargadas del catabolismo de sustancias extrañas que ingresan al
epitelio (Purves et al., 1997). En ratas se renueva completamente la población celular de
receptores en aproximadamente 6 a 8 semanas y este proceso continúa durante toda la
vida del individuo (Purves, 1999).
2.4.2. NEURONA RECEPTORA OLFATORIA
En los mamíferos, se ha descrito la presencia de alrededor de 1.000 genes
distintos que codifican para las proteínas receptoras a odorantes, los cuales se expresan
en la membrana de las células receptoras olfatorias (Mori et al., 1999, Ressler et al.,
1994; Buck, 1996). Cada célula receptora expresa un único gen para un receptor
específico y éste es capaz de reconocer odorantes con regiones moleculares particulares,
lo cual les permite interactuar con varios tipos de moléculas químicas que comparten un
grupo químico particular. Existen receptores con mayor especificidad que se expresan en
7
el órgano vomeronasal del sistema olfatorio accesorio que está involucrado en las
conductas asociadas a la actividad conductual y reproductiva (Laurent, 1999, Finger et
al., 2000 ).
Los receptores olfatorios pertenecen a la familia de proteínas ligadas a proteína
G, poseen 7 dominios hidrofóbicos que atraviesan la membrana, sitios de unión a
odorantes en el dominio extracelular de la proteína y la capacidad de interactuar con la
proteína G en la región carboxilo de su dominio citoplasmático. La respuesta de las
neuronas receptoras olfatorias frente a un estímulo odorante es una modulación de la
frecuencia de potenciales de acción que es dependiente de la intensidad y permanencia
del estímulo, además de la identidad molecular de los odorantes considerados (Purves et
al., 1997).
La mayoría de las respuestas de las células receptoras olfatorias frente a un
estímulo químico es un aumento de la frecuencia de descarga de potenciales de acción.
Si un estímulo químico permanece por largos períodos, se produce desensibilización o
adaptación a los estímulos por una reducción de la frecuencia de descarga de las
neuronas receptoras. El proceso de adaptación se debe al aumento progresivo del calcio
intracelular por el estímulo prolongado que modula la probabilidad de apertura de los
canales activados por cAMP (Duchamp-Viret et al., 1999).
2.5. TRANSDUCCIÓN Y CODIFICACIÓN DE LAS SEÑALES OLFATORIAS
Los odorantes se encuentran en el espacio formado por los distintos compuestos
químicos en los cuales se distinguen grupos particulares como son los aldehídos,
alcoholes, ácidos carboxílicos, etc. Los odorantes, a diferencia de lo que ocurre con el
sistema visual o auditivo donde las energías físicas constituyen espacios continuos, son
estímulos discretos conformados por moléculas de distintos tipos a diferentes
concentraciones. El proceso de discriminación olfatoria comienza con la unión de una
molécula odorante a uno o varios tipos de receptores distintos ubicados en la membrana
de una célula receptora olfatoria (Finger et al., 2000).
8
Se ha postulado que el sistema olfatorio genera una “representación interna” de
cada estímulo específico producido por un patrón de actividad del sistema en su
totalidad, más que una descomposición del estímulo en sus constituyentes. Esta
representación interna debe ser capaz de separar compuestos de estructura química
similar como estéreo isómeros en percepciones distintas y a la vez, lo suficientemente
inclusivo para permitir reconocer odorantes químicamente parecidos como un mismo
objeto perceptual (Buck, 1991).
El sistema olfatorio, debe informar a los centros de integración de lo que ocurre
en el medio externo, este patrón de actividad originada a partir de los receptores
olfatorios genera un código de actividad que está determinado por dos características
generales: un patrón espacial de activación de las neuronas y un patrón temporal de
actividad de éstas, proceso en el cual se observa sincronía entre las diferentes células
activadas. La actividad espacial de grupos celulares estaría asociada a la identificación
particular de un odorante como un olor particular, y el patrón temporal, más bien se
define como elemento adicional que podría colaborar en la identificación de los
odorantes (Laurent, 1999).
2.5.1. TRANSDUCCIÓN
Para lograr la detección de un odorante presente en el ambiente, es necesario que
la molécula tome contacto en el epitelio olfatorio con las neuronas receptoras olfatorias,
en este nivel, la molécula odorante se unirá a un receptor ubicado en la membrana de las
células receptoras que lo expresan generando un cambio del potencial a través de la
membrana de la neurona receptora olfatoria. Se han descrito dos vías de segundos
mensajeros que median el proceso. La primera vía consiste en una proteína G específica
de las células receptoras olfatorias(Golf), la cual activa a la enzima adenilato ciclasa,
específica para este sistema. Esta enzima cataliza la transformación de ATP en AMP
cíclico (AMPc) aumentando éste, lo que a su vez activa canales catiónicos no selectivos
en la membrana de las neuronas receptoras olfatorias (NRO), permitiendo el ingreso de
sodio y calcio a la célula, despolarizando así la NRO (Breer, 2003). Esta despolarización
9
de la neurona es amplificada por la apertura de canales de cloruro dependientes de calcio
ubicados en el soma de estas NRO, lo que provoca una corriente de salida de iones
cloruro, despolarizando aún más la neurona (Purves et al., 1997; Breer, 2003).
La otra vía de segundos mensajeros estaría mediada por una proteína G diferente,
la cual a su vez activa a la fosfolipasa C produciendo aumento de Inositoltrifosfato (IP3),
el cual induce aumento de la concentración de calcio intracelular, generando finalmente
una despolarización de la membrana. Se ha descrito una hiperpolarización de algunas de
las NRO, tras la unión con determinadas dosis de odorantes, sin embargo este
mecanismo no ha sido apropiadamente respaldado por investigaciones más recientes
(Duchamp-Viret et al., 1999) (Figura Nº 3).
FIGURA Nº 3 : Transducción olfatoria. ( Purves et al., 2001)
10
Finalmente, la despolarización de la membrana inducida por los odorantes es
conducida pasivamente desde los cilios hasta la región del cono axónico de la NRO,
donde modula la frecuencia de los potenciales de acción de las NRO (Laurent, 1996).
Estos potenciales de acción, viajan por los axones de las NRO, que en conjunto forman
los nervios olfatorios (primer par craneano), atravesando la lámina cribosa del hueso
etmoides, hasta llegar al BO. Es aquí donde ocurre la primera sinápsis de esta vía
sensorial, entre los terminales axónicos de las NRO y las dendritas apicales de las
neuronas mitrales o en penacho, en estructuras denominadas glomérulos (Purves et al.,
2001). En los vertebrados cada NRO se proyecta solo a un par de glomérulos en cada
bulbo olfatorio (Laurent, 1999; Ressler et al., 1994; Vassar et al., 1994) (Figura Nº 4).
FIGURA Nº 4 : Los glomérulos reciben axones de un conjunto de receptores olfatorios
del epitelio que codifican una misma molécula receptora. La coloración es generada por
un gen señalador acoplado al receptor específico (Purves et al., 1997).
Desde el glomérulo y a través de los axones de las neuronas de proyección el
potencial de acción sale del bulbo olfatorio formando en conjunto el tracto olfatorio
lateral (LOT), el cual se proyecta por la parte inferior del lóbulo frontal hacia distintos
lugares del encéfalo, incluyendo diversos núcleos y estructuras como son i) el núcleo
olfatorio anterior, el cual conecta ambos bulbos a través de una porción de la comisura
11
anterior, ii) el tubérculo olfatorio, iii) la corteza piriforme, iv) la amígdala, y v) parte de
la corteza entorrinal; Desde donde la información es relevada a la corteza orbito-frontal
vía tálamo, desde la amígdala al hipotálamo y desde el área entorrinal al hipocampo. Se
piensa que las vías aferentes que se dirigen a través del tálamo a la corteza orbitofrontal
son las responsables de la percepción y discriminación de los olores y las vías que llegan
a la amígdala e hipotálamo mediarían la respuesta emocional y motivacional como
también mucho de los efectos conductuales y fisiológicos de los olores ( Buck, 1991)
(Figura Nº 2).
2.5.2. CODIFICACIÓN
Todas las neuronas receptoras olfatorias que expresan la misma proteína
receptora y convergen en un mismo par de glomérulos en el BO permitirían elevar la
sensibilidad y asegurar la detección de los compuestos, además de elevar el promedio
de la señal por sobre el ruido, es decir de los olores ambientales en que uno particular
está inmerso (Laurent, 1999).
La respuesta al estímulo transmitida desde los receptores olfatorios sinapta con
las células de proyección del bulbo olfatorio, en una estructura denominada glomérulo.
En esta estructura, se realizan sinapsis recíprocas con otras neuronas inhibitorias
denominadas periglomerulares y que, junto con las neuronas granulares a nivel de la
capa plexiforme externa del bulbo olfatorio, tendrían una función moduladora de la
intensidad del estímulo y generarían patrones temporales de actividad, los cuales serían
la clave de la codificación de la señal olfatoria que posteriormente se dirige a los centros
superiores corticales (Shepherd, 1992; Mori et al., 1999; Purves et al., 1997).
2.6. GENERALIDADES DEL BULBO OLFATORIO
El bulbo olfatorio es la estructura en donde ocurre la primera sinapsis del
sistema, donde llega el nervio olfatorio. Su función no está del todo clara, es posible que
actúe como una estructura moduladora de la información olfatoria, el órgano que
12
permitiría la discriminación e identificación de diferentes odorantes por medio de su
asociación particular de neuronas exito-inhibitorias y su actividad oscilatoria basal, que
es proyectada a otras estructuras superiores del sistema. Se sugiere que el bulbo olfatorio
sería la unidad codificadora fundamental en la olfación, estaría a cargo de organizar el
espacio neural envuelto en los estados tempranos del procesamiento olfatorio (Shepherd,
1992).
La capa glomerular, la cual está confinada a la superficie del bulbo olfatorio, está
compuesta de una serie de estructuras llamadas glomérulos, que conforman la sinapsis
entre los axones de las neuronas receptoras olfatorias y las neuronas de proyección.
Existe la teoría de que en la capa gomerular existe una topografía funcional, es decir,
tipos de odorantes de características similares se ubican en una misma región bulbar,
similar a lo que se plantea en el epitelio olfatorio. La manera en que estas estructuras se
disponen y a que receptores sinaptan es desconocida, aunque la proteína receptora podría
tener un rol en la determinación en la organización de la circuitería neuronal hacia el
bulbo (Mombaerts et al., 1996). Los estudios de segmentación de la topografía del
epitelio olfatorio se han realizado con pocos glomérulos, por lo que esta teoría sólo es
parcialmente cierta (Ressler et al., 1993).
A nivel de la capa glomerular y de la capa plexiforme externa, el bulbo olfatorio
posee un sistema de sinapsis éxito-inhibitorias de las células de proyección con células
bulbares locales, que modifican la descarga de las células de proyección que se dirigen a
los centros superiores corticales (Finger et al., 2000).
Este sistema de sinapsis recíprocas es posiblemente el causal de las oscilaciones
eléctricas observadas en el bulbo es decir, la red éxito-inhibitoria colaboraría con la
presencia de una descarga temporal de las células bulbares. Esta actividad temporal
sumada, genera un patrón oscilatorio que puede ser registrado de manera local y se
denomina potencial de campo local (LFP). Por ejemplo, en insectos a este nivel se
observan descargas que generan un LFP oscilatorio en el orden de los 20 a 35 Hz de
frecuencia (Laurent, 1996) .
13
Esta actividad oscilatoria que modifica la respuesta generada por las células M/T
hace que la información llevada a los centros superiores sea más refinada o modulada
que la original proveniente de las neuronas receptoras olfatorias (Mori y Shepherd,
1994) (Figura Nº 5).
FIGURA Nº 5 : Esquema de las relaciones sinápticas del bulbo olfatorio.
2.7. ANATOMIA DEL BULBO OLFATORIO
El BO está localizado en el área ventro-anterior del telencéfalo homo lateral
(Purves et al., 1997). Posee tamaños muy variables con respecto al resto de la masa
cerebral según la especie, posee 6 capas histológicamente diferenciables:
Nervio olfatorio: Conforma la primera y más superficial, rodea al bulbo desde su
cara anterior y corresponde al conjunto de axones de las neuronas receptoras olfatorias.
14
Capa Glomerular: corresponde a la segunda capa, en ella se encuentran las
estructuras llamadas glomérulos (alrededor de 1.800 en las ratas), que corresponden a
neuropilos esféricos de aproximadamente 10-150 µm de diámetro. En estos ocurre
sinapsis entre las neuronas receptoras olfatorias, que expresan un mismo receptor
específico (convergen alrededor de 25.000 por glomérulo), con las dendritas de las
células mitrales, en penacho (células M/T) y periglomerulares. Las células mitrales, son
neuronas de forma piramidal, de un tamaño aproximado de tamaño de 40 µm. Con un
área de extensión dendrítica de alrededor de 400 µm. (Rall y Shepherd, 1968). Las
células en penacho son células de morfología muy similar a las células mitrales, pero
que en general sus somas se encuentran más desplazados y por lo tanto no agrupados
exactamente en la capa mitral (Nagayama et al., 2004) estos dos tipos celulares del
bulbo olfatorio conforman las denominadas neuronas de proyección, es decir, poseen
axones que se dirigen a los centros de integración encefálicos.
Dentro de esta segunda capa, además existe otro grupo celular, las células
periglomerulares, células de 6 a 8 µm en diámetro (Shepherd, 1998), que se encuentran
asociadas a las células de proyección generando sinapsis reciprocas. La tercera capa, la
capa plexiforme externa, está formada por procesos dendríticos ramificados
profusamente de células granulares que sinaptan con las dendritas secundarias de las
células mitrales y en penacho (Rall y Shepherd, 1968).
La tercera capa, corresponde a la capa plexiforme externa, que está compuesta
por la asociación sináptica de las dendritas de las neuronas de proyección y las dendritas
de las células granulares. En este nivel se realiza la sinápsis recíproca entre estos grupos
celulares modificando por última vez en el bulbo la señal generada en los receptores
olfatorios.
La cuarta capa en consideración corresponde a la capa mitral, donde se alojan los
cuerpos neuronales de las células mitrales, cuyos axones se proyectan luego a centros de
integración de la respuesta olfatoria en el cerebro.
La quinta capa histológica, corresponde a la capa granular, formada por un
conjunto de células pequeñas, de alrededor de 6 a 8 µm denominadas células granulares,
15
cuyas dendritas se extienden hacia la capa plexiforme externa, relacionándose
sinápticamente con las células mitrales y en penacho extendiendo sus dendritas
lateralmente entre 50 y 200 µm. Una particularidad de estas células es la carencia de
axón. (Shepherd, 1998).
La manera en que los receptores olfatorios dirigen sus axones al bulbo olfatorio
ofrece dos teorías generales; la teoría de la proyección zona a zona y la de convergencia
glomerular (Mori et al., 1999). La primera teoría, divide a los receptores olfatorios en 4
categorías de acuerdo a su expresión en el epitelio olfatorio, el receptor se expresa en
una zona en particular del epitelio olfatorio, en la que las
características de los
odorantes que son recepcionados en esta área son similares (Mori et al., 1999). Y así se
mantiene también esta correlación en torno a los glomérulos, los que se agruparán en
zonas particulares de la superficie del bulbo generando un mapa de la transducción de
los odorantes en el bulbo (Lagier et al., 2004). La segunda teoría, propone que existe un
glomérulo específico a donde se dirigen las neuronas que expresan un receptor en
particular, es decir, el mismo receptor converge en un mismo glomérulo (Mori et al.,
1999).
2.8. FISIOLOGÍA DEL BULBO OLFATORIO
Los axones de las células receptoras olfatorias que expresan un mismo receptor
en su membrana convergen a sólo un par de glomérulos en el bulbo olfatorio generando
un mapa especular simétrico (Laurent, 1999; Ressler et al., 1994; Vassar et al., 1994).
Cada célula receptora olfatoria es capaz de detectar un conjunto de odorantes que
contienen la estructura molecular que calza con su odotopo o molécula receptora
olfatoria, por lo que cada neurona receptora posee un grupo de odorantes a los cuales
responde y que conforman lo que se define por “rango receptivo molecular”(Shepherd,
1998; Mori et al., 1999). La manera en que esta conectividad se establece, como se
regenera o altera su conformación de manera dinámica, lo que se define como
plasticidad, constituye un tema por explorar. Se han realizado estudios en que se sugiere
que la convergencia glomerular y en general el origen de la circuitería neuronal hacia y
16
desde el bulbo estaría determinada en parte por el receptor que se expresa (Belluscio et
al., 2002), que la experiencia no es requerida para el establecimiento de patrones
precisos de innervación aferente en el bulbo olfatorio. Más aún, en ausencia de
potenciales de acción en las NRO se genera la circuitería de manera normal y que la
plasticidad de la conectividad estaría determinada por la presencia de una actividad
espontánea basal de las neuronas receptoras olfatorias, junto con la relación de esta
actividad entre las distintas células receptoras (Yu et al., 2004). Además de esta
exclusividad objetiva de los receptores olfatorios, las dendritas de las neuronas de
proyección y células periglomerulares que sinaptan con los receptores olfatorios tienen
la particularidad de corresponderse sólo dentro de un glomérulo en cada bulbo (Vassar et
al., 1994), aproximadamente en un numero de 25 mitrales por cada uno (Purves, 1999).
Esta particularidad le otorga al bulbo un carácter de especificidad en torno a su respuesta
a un grupo particular de odorantes que estimulan un mismo tipo de receptor, el cual
estaría determinado por su conformación estereoquímica general de la cadena
hidrocarbonada además del tipo y posición del grupo principal (Mori et al., 1999). Esta
razón permite argumentar entonces que cada glomérulo presenta un rango receptivo
molecular diferente según la naturaleza del receptor olfatorio del cual provienen y que
funciona básicamente como una unidad de detección de caracteres (Mori et al., 1999;
Nagayama et al., 2004).
Asociadas a estas células de proyección del bulbo olfatorio, encontramos una red
celular local, la cual se asocia sinápticamente con las neuronas de proyección, estas
neuronas corresponden a las células periglomerulares y granulares principalmente, estas
asociaciones sinápticas son de dos tipos, por un lado, la asociación sináptica libera hacia
el espacio sináptico por parte de la neurona de proyección, glutamato, un
nerurotransmisor excitatorio y por parte de la neurona granular o periglomerular la
liberación de GABA, un neurotransmisor inhibitorio. Es decir, existe una sinapsis
dendrodendrítica excito-inhibitorias la cual tendría una función moduladora de la
actividad individual y de la descarga de las neuronas mitrales y en penacho entre
neuronas provenientes de glomérulos con rangos receptivos moleculares diferentes
17
(Mori et al., 1999; Purves et al., 1997; Halabisky y Strowbridge, 2003; Nagayama et al.,
2004; Finger et al., 2000).
Estos dos niveles de interacción mediarían una suerte de contraste entre los
diversos odorantes que se encuentran en sectores glomerulares vecinos (Lei et al., 2002),
lo que sugiere que el bulbo olfatorio juega un rol en el procesamiento de la información
olfatoria más que conformar solo una estación de relevo (Mori et al., 1999; Halabisky y
Strowbridge, 2003; Nagayama et al., 2004; Finger et al., 2000). Por estas razones
expuestas anteriormente, se puede asegurar que las neuronas de proyección olfatoria
responden más contrastadas o refinadas que las neuronas receptoras olfatorias (Mori y
Shepherd, 1994).
Además de esta modulación generada entre los diversos glomérulos del bulbo
olfatorio, las neuronas de proyección probablemente sincronizan sus descargas
individuales con neuronas de otros campos receptivos moleculares codificando entonces
no solo en una dimensión espacial, sino que además en una dimensión temporal
(Kashiwadani et al., 1999; Buck, 1991). Las células de proyección deben transportar
entonces información codificada en estas dos dimensiones, tiempo y espacio de manera
simultanea, para que sean leídas y decodificadas por núcleos posiblemente diferentes y
ubicados en distintas estructuras del cerebro (Laurent, 1999).
La actividad en la capa glomerular, en presencia de un estímulo olfatorio,
consiste en patrones espaciales de activación glomerular que se correlacionan con las
diferencias en concentración e identidad de los odorantes, los cuales son simétricos en
ambos bulbos y similar entre animales de una misma especie. Esto demuestra, que a
nivel de la capa glomerular los odorantes estarían codificados por la identidad y la
intensidad de los glomérulos activados (Rubin y Katz, 1999).
Pero este refinamiento no es obvio, porque el orden de respuesta no está
directamente asociado a la intensidad del estímulo e incluso el patrón temporal para el
mismo odorante a distintas concentraciones es distinto. (Cinelli et al., 1995) y también
esta variación de patrones temporales se observa con odorantes diferentes (Laurent,
1996). Las células mitrales se proyectan a múltiples áreas olfatorias como también a
18
múltiples locaciones dentro de la corteza piriforme, es decir existe un patrón divergente
desde la conectividad del bulbo olfatorio hacia los centros superiores (Finger et al.,
2000).
La corteza piriforme es la zona principal hacia donde llegan los axones de las
neuronas mitrales y en penacho, y es en donde se realiza la siguiente sinápsis del
sistema. La corteza piriforme posee 3 capas, una capa de neuropilo, una capa de células
piramidales y una capa profunda compuesta de células piramidales y no piramidales. Las
neuronas M/T llegan a través del tracto olfatorio lateral hasta la corteza piriforme
desarrollando sinapsis excitatorias con las células piramidales y a un grupo de células
activadas en retroalimentación (Finger et al., 2000). Además de proveer de las vías de
salida hacia la corteza, los axones colaterales de las células piramidales crean una
extensiva red de fibras asociadas excitatorias dentro de la corteza, estas células
piramidales, al igual que en el bulbo, contactan con un grupo de células inhibitorias que
inhiben a las propias células de proyección o a las células vecinas (Nagayama et al.,
2004; Finger et al., 2000). Un aspecto importante de este circuito son las velocidades de
conducción de los sistemas aferentes y de asociación. Se ha descrito que la alteración de
las velocidades de conducción podría alterar la dinámica oscilatoria lo que sería
relevante para el procesamiento en su dimensión temporal (Finger et al., 2000).
2.9. ELECTROFISIOLOGÍA DEL BULBO OLFATORIO
El primer electroencefalograma descrito en la historia corresponde a la
descripción de una actividad oscilatoria entre los 8 y 12 Hz y fue descrita por Berger en
1929. Desde ese momento, tenemos evidencias de la existencia de patrones oscilatorios
en la corteza cerebral. Estudios posteriores han ido desarrollando el postulado de que la
percepción, la memoria e incluso la conciencia resultan de la sincronía de redes neurales.
Convirtiéndose esta actividad en el punto medio entre la actividad de unitaria de células
neuronales y la conducta (Buzsaki y Draguhn, 2004).
19
El pionero en los estudios de la actividad electroencefalográfica del bulbo
olfatorio fue Adrian en el año 1950, que utilizó ratas anestesiadas con uretano para el
desarrollo de sus experimentos. El encontró que la estimulación generaba un incremento
en el rango de descarga de algunas neuronas bulbares y la generación de una actividad
sinusoidal de baja amplitud y relativamente alta frecuencia la cual denominó “actividad
intrínseca” (Freeman, 1977).
El sistema olfatorio de los mamíferos genera oscilaciones eléctricas del LFP en
el rango entre 30 y 100 Hz (rango gamma) presente también en otras partes del cerebro
como son el hipocampo, tálamo, corteza visual y corteza olfatoria (Nusser et al., 2001;
Lagier et al.,2004). Estas oscilaciones se presentan junto a otra oscilación de baja
frecuencia (1 a 7 Hz.) correspondiente con el ciclo respiratorio (Mori et al., 1999). Esta
actividad oscilatoria se puede dar incluso entre neuronas pertenecientes a distintos
glomérulos separados hasta por 500 µm. (Mori et al.,1999). Esta actividad oscilatoria
comienza poco después de iniciada la inspiración y termina al comenzar la espiración
(Freeman, 1977). Se ha propuesto que esta actividad es de origen local, puesto que no
existen neuronas que lleven señales al bulbo en este rango de frecuencias (Eeckmann y
Freeman, 1990; Mori et al., 1999). Además que se encuentran abolidas en la corteza
piriforme cuando el bulbo se remueve (Bressler y Freeman, 1980; Lagier et al., 2004).
Posteriormente, estudios revelaron una alta correlación del EEG con el ciclo respiratorio
(Freeman, 1977).
La actividad gamma del bulbo olfatorio ha sido estudiada por mas de 50 años y
la oscilación beta ha atraído la atención científica recientemente ya que su origen,
mecanismo y relación con gamma es desconocido. Se describe que ambas oscilaciones
pueden ser inducidas por odorantes en una manera dependiente de concentración. Las
dos oscilaciones son distintas y no relacionadas harmónicamente, indicando que
corresponden a oscilaciones de orígenes diferentes. La oscilación gamma se encuentra
sincrónica en algunos sitios y en otros no, desplazándose en fase en los diferentes sitios
(Neville y Haberly, 2003). Estas oscilaciones probablemente se originan en las
corrientes sinápticas de las células intermedias con respecto a las células de proyección.
20
El bulbo olfatorio emplea feedback inhibitorios laterales para distribuir la información
del estimulo a través de arreglos paralelos de células mitrales y granulares. El
acoplamiento eléctrico también ayuda a asegurar la coordinación apropiada de estos
patrones. Estos mecanismos proveen de numerosas opciones para modulación dinámica
y control de las señales en el bulbo olfatorio (Lowe, 2003). La oscilación gamma parece
tener un origen local en el bulbo olfatorio y la oscilación beta es posible que desarrolle
en alguna estructura posterior al tracto olfatorio lateral (TOL) puesto que al seccionar
esta estructura, la oscilación beta presente en el bulbo desaparece. El sitio probable de
origen se postula en la corteza piriforme. (Neville y Haberly, 2003). La función de estas
oscilaciones no está claramente establecida, pero se ha observado que en entrenamiento,
en los individuos estudiados se observa una disminución de la amplitud de la actividad
gamma y un débil pero significativo aumento de la actividad beta oscilatoria. Cuando el
entrenamiento alcanza su término, estos dos fenómenos son amplificados lo que sugiere
que la actividad beta tendría una función asociada con el aprendizaje (Martin et al.,
2004).
Al estimular y registrar simultáneamente en distintas profundidades del bulbo
olfatorio, se observa actividad oscilatoria en cada uno de los puntos de registro, esto
puede indicar que existe la presencia de tres generadores diferentes o que la oscilación
se expande a las diferentes capas. Las 3 señales tienen la misma dinámica en la
superposición del registro y al descomponer la señal sinusoidal en sus componentes
según frecuencia y magnitud (FFT, del inglés Fast Fourier Transform.) muestran que en
la capa glomerular (GL) la magnitud es consistentemente mas pequeña que en la capa
mitral y que la capa plexiforme externa, la cual posee los mayores valores de magnitud
en relación a las demás capas. Por esta razón se define que el origen de las oscilaciones
estarían generadas a partir de la capa plexiforme externa cerca de la capa mitral (Lagier
et al 2004).
Estudios posteriores demostraron que a través del bloqueo de la actividad
sináptica interneuronal al nivel de las células granulares y periglomerulares por medio
de antagonistas GABA, aumentan de manera manifiesta de la actividad de descarga
21
unitaria y una fuerte disminución de la actividad oscilatoria, otorgándole a estas células
un rol importante en la producción de estas oscilaciones (Nusser et al., 2001; Lagier et
al., 2004). Esta actividad oscilatoria se observa de manera mas evidente a nivel de la
capa plexiforme externa, lugar en donde se ramifican las dendritas secundarias de las
células granulares (Lagier et al 2004). Esta actividad sincrónica de neuronas permitiría
asociar temporalmente diferentes entradas sinápticas subumbrales distribuidas
espacialmente y generadas por un mismo estímulo dentro de potenciales de acción
resultando una potenciación de las células M/T durante la respuesta olfatoria. Cuando
dos glomérulos contiguos reciben estímulos de manera simultanea, las neuronas de
proyección (M/T) estarán determinadas en su actividad por las interacciones recíprocas e
interacciones inhibitorias interglomerulares (Lei et al., 2002).
Los odorantes generan un mapa de activación confinada a un
grupo de
glomérulos o a un glomérulo simple en el bulbo olfatorio, diferentes componentes
pueden conformar áreas de activación vecinas o incluso superpuestas según los
glomérulos que activan. Los estímulos se perciben como un solo objeto y no como sus
constituyentes por separado por lo que debe existir una vía de síntesis en el tratamiento
de la información distribuida. Esta síntesis ampliamente se logra por la sincronía de
áreas activadas en arreglos coherentes y es particularmente soportado por las
oscilaciones gamma. Además de esta actividad de relativa alta frecuencia en el bulbo
olfatorio (actividad dentro del rango gamma de frecuencia), se describe también un
patrón de actividad beta, es decir entre 15 y 40 Hz., que también se observa en otros
órganos sensoriales como es en la corteza visual asociándose a memoria de corto plazo.
La actividad del patrón gamma es relativamente estable en cada sector del bulbo
olfatorio, generando una especie de mapa, pero esta actividad puede variar según la
experiencia adquirida luego de la exposición repetida al odorante especifico que la
genera, asociando este patrón de actividad más a un sentido conductual que a una
clasificación cualitativa química del odorante. La actividad beta de oscilación también se
observa a nivel de la corteza piriforme y corteza entorrinal, observándose con mayor
importancia en presencia de odorantes conductualmente relevantes. La aparición de la
22
actividad gamma y beta parecen estar comandadas a diferentes momentos pues la
actividad beta se ve potenciada con la presentación de estímulos al mismo tiempo en que
se reduce la importancia de la actividad gamma de oscilación (Ravel et al., 2003). Esta
diferencia temporal entre las dos bandas, permiten dividir la actividad en torno al ciclo
respiratorio en 3 fases, una de iniciación, una de entrada y la otra de afinamiento de la
red bulbar, las cuales ocurren en el momento de inhalación, periodo intermedio y
exhalación respectivamente (Buonviso et al., 2003).
A partir de estos argumentos se puede establecer que existe una asociación
directa entre el ciclo respiratorio y la actividad eléctrica bulbar, presentándose incluso un
ajuste de fase de patrones de frecuencia asociados a momentos particulares del ciclo
respiratorio.
Es importante destacar que con entrenamiento o exposición
anterior de un
odorante, se observa un claro aumento de la actividad beta en amplitud y duración frente
a una nueva exposición al estímulo (Ravel et al., 2003)
Una actividad eléctrica oscilatoria de la misma frecuencia se observa en el
núcleo olfatorio anterior y el núcleo amigdaloide y están altamente correlacionadas con
el EEG. La actividad del BO es relativamente independiente de los otros dos núcleos,
pero la oscilación en estos últimos aparentemente depende de la frecuencia observada en
el bulbo, por lo que se ha propuesto que el BO comandaría la actividad eléctrica
oscilatoria del núcleo olfatorio anterior y el núcleo amigdaloide (Bressler y Freeman,
1980; Lagier et al., 2004).
Los mecanismos celulares para la generación y mentenimiento de la actividad
oscilatoria bulbar aun están desconocidos, estudios previos sugieren distintos
mecanismos:
i) Retroalimentación rápida inhibitoria entre las células mitrales y en penacho (M/T) y
granulares (Mori y Takagi, 1977; Eeckman y Freeman, 1990; Nusser et al., 2001;
Friedman y Strowbridge, 2003).
ii) Propiedades de membrana intrínsecas de las celulas M/T (Desmaisons et al., 1999).
23
iii) Oscilaciones inducidas por odorantes en los receptores olfatorios (Lagier et al.,
2004).
iv) Acoplamientos eléctricos entre las interneuronas (Friedman and Strawbridge, 2003).
Las células M/T son la unica población neuronal que descarga espigas y oscila
subumbralmente en fase con el LFP generalmente en la fase descendente de la oscilación
a diferencia de las interneuronas que raramente sincronizan sus ciclos con el LFP. Se
presume que las oscilaciones requieren de la acción inhibitoria proveída por las células
interneuronales (granulares y periglomerulares) a través del procesamiento local, no
requiriendo potenciales de acción generados en su soma (Lagier et al., 2004).
La sinapsis recíproca entre células M/T y granulares y entre las células M/T y
células periglomerulares, cumpliría un rol importante en la sincronía de la descarga,
pudiendo facilitar la estimulación cortical, ya que hace más robusta la sumación
sináptica proveniente de la descarga simultánea de varias células mitrales en la corteza.
Esta actividad sincrónica podría estar determinada por la fuerza de las conexiones
sinápticas dendro-dendríticas recíprocas con las células granulares que hacen puente
entre dos células M/T. De ser así, las células granulares servirían de sustrato para la
mediación de las uniones temporales y funcionales de las señales de diferentes
receptores odorantes (Mori et al., 1999). La inhibición lateral por medio de las sinapsis
dendro-dendríticas con las células granulares podría acentuar el contraste y así afinar la
especificidad de células mitrales y en penacho a la respuesta a moléculas olorosas. Así,
las células mitrales y en penacho resultarían más afinadas que las células receptoras en
el epitelio olfatorio (Rall y Shepherd, 1968; Mori et al., 1999; Davison et al.,1999).
La actividad unitaria de las neuronas mitrales es de fácil detección por el gran
tamaño de estas células y las características generalmente invariables de sus espigas, que
son detectadas con electrodos extracelulares. La frecuencia de descarga de las células
mitrales varía en un rango de 0.1 a 3000 Hz. Las interneuronas locales inhibitorias son
de tamaño muy pequeño y no poseen axones, haciendo así muy difícil medir
directamente la actividad unitaria de estas células extracelularmente (Eeckmann y
Freeman, 1990).
24
En el BO encontramos que los patrones de descarga de neuronas individuales,
como también la sincronía de disparos de grupos de neuronas, son estímulo-específico.
Es decir, cada olor parece ser representado no sólo por medio de un ensamblaje de
neuronas sincrónicas, sino por una transformación progresiva y olor-específica del
ensamblaje. Así, cada neurona sincroniza con muchas otras durante la presentación de
un estímulo. Por esto se postula que en el sistema nervioso olfatorio la actividad se basa
en una mezcla entre un patrón espacial de neuronas activadas y uno temporal por el
momento en que estas se activan (Laurent, 1999).
Se ha postulado que la activación de una zona del cerebro por un cierto estímulo
sensorial puede producir dos tipos de fenómenos. Por una parte, clásicamente se ha
propuesto que cada región del cerebro posee una actividad basal unitaria similar en su
magnitud entre un momento de registro (prueba o muestreo) y otro. El estímulo produce
una activación, generalmente un aumento de la descarga de algunas neuronas. La
actividad basal azarosa en el LFP o EEG al ser un valor común y constante, se
promedia y desaparece al superponer los distintos registros mientras que la señal
generada por el estímulo que se encuentra siempre en la misma fase temporal con
respecto al estímulo se suma (stimulus lock). Por otra parte, se ha postulado que la
actividad basal refleja el estado del sistema nervioso y el estímulo modifica esa actividad
basal reordenando la descarga sin necesariamente aumentar la energía total de la
descarga basal (Makeig et al., 2002). En términos prácticos, al promediar muchos
registros en presencia del estímulo, si la descarga basal se ordena con respecto al
estímulo, entonces aumenta la amplitud relativa de la actividad gatillada por el estímulo,
pero disminuye la actividad basal porque es azarosa.
La capacidad de identificación y discriminación de los estímulos odoríferos por
parte del BO está sustentada en la presencia de la actividad oscilatoria basal proveniente
de las neuronas que lo conforman, la cual, alterada (independientemente del
mecanismo), por el estímulo olfatorio, participa en los procesos de discriminación e
identificación de los estímulos odorantes (Brody y Hopfield, 2003). La caracterización
simultánea del LFP y de la actividad unitaria de las células en distintas capas del BO en
25
ausencia de estímulo, permitirá determinar el grado de sincronía y actividad oscilatoria
basal y realizar comparaciones de fase de la actividad oscilatoria intrínseca de las
distintas capas del BO y determinar cual es su relación con la descarga unitaria
espontánea de células mitrales y en penacho. Además, posiblemente contribuirá a la
determinación relativa del origen de estas oscilaciones. Finalmente, generará un patrón
base para la comparación posterior con la actividad desarrollada en el bulbo en presencia
de estímulo.
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar el potencial de campo local en las diferentes capas del bulbo olfatorio
en ausencia de estímulo.
3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Comparar el potencial de campo local (LFP), registrado simultáneamente en dos capas
distintas del bulbo olfatorio en ausencia de estímulo.
•
Caracterizar la actividad del LFP en ausencia de estímulo con relación al ciclo
respiratorio en las diferentes capas del bulbo olfatorio.
•
Caracterizar la actividad unitaria de las células de la capa mitral en relación con el LFP
registrados simultáneamente en ausencia de estímulos.
26
4. MATERIALES Y MÉTODO
4.1. ANIMALES
Para el desarrollo de la investigación, se utilizaron ratas de la cepa Sprague Dawley
machos y hembras indistintamente de pesos entre 240 y 320 g. Se decidió la utilización
de esta especie por su desarrollo notable del bulbo olfatorio. Todos los ejemplares
fueron obtenidos desde el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad de
Chile.
4.2. EQUIPOS Y MONTAJE
Con el fin de desarrollar el registro de manera exacta, se utilizó un instrumento
estereotáxico, el cual mantiene fija la cabeza de la rata para el registro. En este
instrumento va montado un tornillo de precisión que posee carriles de precisión para su
desplazamiento en los 3 ejes dimensionales, el cual se acopla a un micromanipulador.
4.2.1. MICROMANIPULADOR
Para poder lograr el descenso mesurado del electrodo de control y del electrodo
móvil de manera exacta fue necesario diseñar y construir este instrumento que consistió
en un cilindro de acrílico el cual en su superficie superior llevó montado dos tornillos de
precisión. Por dentro, contó con dos ascensores de acrílico los cuales se desplazaban
cada uno por dos rieles de acero e iban sujetos a la superficie superior por medio de
bandas elásticas de ortodoncia, las que permitieron que el ascensor haya sido capaz de
volver a su posición original. Cada uno de estos ascensores soportó un tétrodo por medio
de un perno que los sujetó por dentro del orificio por el que pasaban. Los electrodos se
introdujeron desde la superficie superior del cilindro, pasando por el ascensor que los
sujetó y finalmente llegaba hasta una boquilla tubular metálica de 2 mm. en
la
superficie basal del cilindro por el cual salía cada uno envuelto en un tubo de plástico
que les permitió no pegarse entre ellos ni desplazarse lateralmente. Con este instrumento
27
preciso fué posible la manipulación independiente de los tetrodos en su desplazamiento
por el eje z (Figura 6.b).
6.a
6.b
6.c
FIGURA Nº 6 Esquema de 3 vistas de un tétrodo de registro (a), micromanipulador (b),
y una fotografía ampliada de la punta de un tétrodo (c).
4.3. EQUIPOS DE MONITOREO Y MANTENCIÓN
Las ratas fueron monitoreadas durante el proceso de registro a través de los
siguientes instrumentos:
Monitor EEG el cual permitió registrar la frecuencia cardiaca y sus variaciones durante
el ejercicio de registro. La derivación II fue utilizada para el monitoreo. No se utilizó
con fines de análisis del registro EEG por la incapacidad técnica del análisis en línea
debido a la rapidez en la frecuencia promedio de esta especie, que oscila entre los 350 +40 latidos por minuto.
Termocupla, la cual detecta las variaciones en la temperatura que lo rodea por medio de
la variación de la impedancia una resistencia eléctrica termo sensible, y por lo tanto
resulta útil para el registro de la actividad respiratoria al poner este instrumento al lado
28
de uno de los ollares de la nariz de la rata, registrando las fluctuaciones de inspiración y
espiración, permitiendo el registro de los ciclos respiratorios.
Para la mantención de la temperatura corporal, el paciente fue posicionado sobre
una manta eléctrica calefactora que mantuvo al individuo sobre los 36° C de temperatura
durante todo el procedimiento. La temperatura de la rata fue monitoreada en línea por
medio de un termómetro rectal digital conectado a la pantalla de monitoreo
electrocardiográfico.
4.4. EQUIPOS DE REGISTRO
El equipo de registro consta de los siguientes instrumentos
Tétrodos
Tétrodos
Preamplificador
Amplificador con filtro
Tarjeta análoga digital
Computadores de registro
4.4.1. TÉTRODO
Corresponde a una estructura formada de 4 electrodos de 12 µm de diámetro,
formados de alambres recubiertos formados por una aleación de Tungsteno y Cromo
entrelazados en forma de espiral con el objeto de dar mayor resistencia a la penetración
del bulbo olfatorio y permitir además el certero aislamiento de las espigas generadas de
2 o más células diferentes. Estos alambres están descubiertos en uno de sus extremos
(extremo receptor de la señal) y por el otro están conectados a un enchufe que les
permitirá acoplarse al cable condutor que lleva las fluctuaciones eléctricas registradas
primeramente a un amplificador y desde éste hacia la capturadora análogo digital del
computador de registro.
29
(Figuras Nº 6.a y 6.c)
ESTEREOTÁXICO
AMPLIFICADOR
FILTRO DE BANDAS
AMPLIFICADOR + FILTRO
OSCILOSCOPIO
COMPUTADORES
FIGURA Nº 7 : Instrumentos de registro electrofisiológico y estereotáxico.
4.4.2. PREAMPLIFICADOR
La señal detectada por cada tétrodo, es llevada por un cable corto hasta un
preamplificador, de tal manera que el recorrido por este cable no altere el registro por la
contaminación con ruidos anexos. Este preamplificador, es un instrumento que
magnifica la señal en 10 veces.
4.4.3. AMPLIFICADOR CON FILTRO DE BANDA
Posteriormente la señal pasa a un amplificador que la aumenta en 10000 veces
(10K) y la filtra, separándola en dos bandas de señal, una señal baja que tiene un rango
desde 0 a 300 HZ y una banda alta que filtra la señal entre los 300 y los 3000 HZ de
frecuencia.
30
4.4.4. OSCILOSCOPIO
Posteriormente, la señal pasa a un Osciloscopio que permite visualizar la señal
filtrada en línea, y permite detectar la presencia de espigas, fenómeno observado cuando
el electrodo se posiciona dentro de la capa mitral del bulbo olfatorio.
4.4.5. TARJETAS ANÁLOGO-DIGITALES
Las señales de alta y baja frecuencia son pasadas respectivamente a una tarjeta
análogo digital cada una, lo cual permite registrar la señal en 2 computadores diferentes.
Simultáneamente a este proceso, la rata se encuentra conectada a una termocupla,
instrumento que permite detectar variaciones de temperatura lo cual permite obtener los
ciclos respiratorios de la rata en experimentación almacenándolos a través de otra tarjeta
análogo-digital en un tercer computador, el cual además es el gatillo para los otros dos
computadores y es el computador que permite dar paso al registro simultáneo en los tres
computadores (Figura Nº 7).
4.5. METODOLOGÍA
4.5.1. DISEÑO EXPERIMENTAL
Se realizará el registro electrofisiológico a través de 2 electrodos cuádruples
(tétrodos) dentro del bulbo olfatorio, uno de los cuales registrará un patrón de referencia
dentro de la capa mitral del bulbo olfatorio y el otro registrará la actividad cada 200 µm
en un eje vertical desde superficie a profundidad tratando de cubrir todas las capas del
bulbo olfatorio.
31
4.5.2. TÉCNICA ANESTÉSICA
La rata es premedicada con una asociación de acepromazina y atropina, con una
inducción anestésica de ketamina, y posteriormente una mantención anestésica con
uretano.
Ketamina
= 40 mg/K
Atropina
= 0.75 mg/K
Acepromazina
= 0.1 mg/K
Uretano
= 1.2-1.5 g/K
Estándares quirúrgicos aprobados por el comité de bioética de la facultad de
Medicina de la Universidad de Chile Protocolo CBA#079 FMUCH.
Para poder realizar la cirugía de trepanación de la bóveda craneana, y exposición
del bulbo olfatorio, es necesario alcanzar un plano anestésico quirúrgico en las ratas.
Para esto, se utilizó una premedicación de acepromazina y atropina en dosis de
0.1mg/Kg IP y 0.75 mg/Kg. IP respectivamente, esperando un lapso de 15 minutos para
la aplicación de ketamina, que fue utilizada para la inducción anestésica. El signo
esperado para el comienzo de la anestesia de mantención fue la pérdida del reflejo del
dolor profundo, medida a través de la aplicación de presión con una pinza en una de las
articulaciones interfalángicas. Posteriormente, se inyectó Uretano, en dosis de (0.6
g/Kg., a diferencia de la dosis estipulada por Fish, 1997, ya que en dosis de 1.2g a
1.5g/Kg., la depresión respiratoria y cardiaca fue demasiado profunda, incluso a niveles
en que los especímenes murieron por sobredosis aproximadamente 30 minutos luego de
la inyección intraperitoneal. La diferencia obtenida se observa en la menor depresión de
las constantes respiratorias y cardiacas, pero el plano anestésico se mantiene solo por
alrededor de 3 horas, a diferencia de lo estipulado por Fish, quien asegura 6 horas de
plano anestésico con la dosis por él sugerida. Por lo que es necesario volver a inyectar
un volumen similar de anestésico cada 2.5 a 3 horas.
32
4.5.3. TÉCNICA QUIRÚRGICA
4.5.3.1. MATERIAL QUIRÚRGICO
Para poder desarrollar la cirugía de trepanación de la bóveda craneana, se utilizó
tijeras serratex-mayo curva, bisturí, 2 pinzas hemostáticas kelly curvas, blefarostato,
cureta, taladro dremel®, pinzas style 7, pinzas style 5,Agujas de 23G como bisturí
(Miltex Instrument Company).
4.5.3.2. PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO
Una vez obtenido el plano quirúrgico, la rata se conecta al instrumento estereotáxico,
que fija su cabeza desde el maxilar superior por medio de una prensa puesta por detrás
de los dientes incisivos y por sobre el hueso nasal y desde los conductos auditivos
externos por medio de dos estiletes romos, logrando posicionar la cabeza de manera
simétrica y sin riesgo de que se mueva durante la cirugía y el registro.
Posteriormente se realiza una incisión por la línea media longitudinal de la
superficie superior de la cabeza desde 5 mm. atrás del morro nasal hasta la cisura
parieto-occipital con la tijera y el bisturí. Luego se realiza la debridación del tejido
muscular subcutáneo utilizando la tijera, la cureta y la pinza style 5. Una vez descubierto
el tejido óseo, se fija la piel hacia los lados por medio de las pinzas kelly. Posteriormente
se realiza la trepanación de la bóveda craneana utilizando el dremel® realizando un
orificio circular de aproximadamente 5 mm. A cada lado de la cisura craneana
longitudinal. Para sacar los trozos de hueso liberados por el dremel® se utiliza la pinza
style curva. Posteriormente, para poder introducir los electrodos, es necesario realizar
una incisión de la duramadre sin dañar el bulbo olfatorio expuesto. Para esto se utilizó
un bisturí fabricado con una aguja de 23G doblada en su punta en bisel de manera de
gancho cortante. Una vez realizado el procedimiento quirúrgico, se realiza el montaje
del micromanipulador sobre la superficie del bulbo olfatorio expuesto.
Con la ayuda de un micromanipulador se posicionaron en la superficie del bulbo
olfatorio los dos electrodos y posteriormente se cubrieron con una solución de agar tibio
33
el cual sella el sitio de penetración aislándolo del medio externo evitando así la
desecación del tejido bulbar y además sirve como soporte mecánico para la introducción
de los electrodos.
Finalizada la sesión de registros, todas las ratas fueron eutanasiadas mediante una
inyección de 2cc de tiopental sódico al 2% intratecal lo que generó un inmediato paro
respiratorio y posterior muerte del animal. Estos procedimientos fueron aprobados por la
comisión de bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile código
CBA#079 FMUCH.
4.5.3.3. REGISTRO ELECTROFISIOLÓGICO Y ADQUISICIÓN DE DATOS
4.5.3.3.1. ADQUISICIÓN
Para realizar la adquisición, es necesario primero la amplificación de la señal
procedimiento que se realiza en 2 etapas.La amplificación de la señal eléctrica se realiza
primero a través de un preamplificador, el cual transforma las variaciones de corriente
en voltaje y lo magnifica 10 veces en una región cercana al animal para impedir que el
ruido interfiera con la señal biológica, para este objetivo, el tétrodo es conectado hasta el
preamplificador por un cable. Luego la señal es amplificada 1000 veces y filtrada en
forma paralela entre 30 y 300 Hz. para obtener la señal de potencial de campo local y
entre 300 a 1000 Hz. para aislar la actividad de célula única. Esta señal entrará
simultáneamente a 2 computadores para su adquisición y a un osciloscopio para la
visualización en línea. Los registros de actividad unitaria se realizarán simultáneamente
en los dos tétrodos en cada filamento teniendo en total 8 canales de registro. El
osciloscopio permitirá la visualización del potencial de campo y de las espigas en un
alambre de tétrodo en particular.
Los registros de potencial de campo se realizarán tomando como referencia la
capa mitral, el tétrodo se desplazará a diferentes profundidades del bulbo olfatorio
tomando registros cada 200µm, estos registros corresponderán a las capas glomerular,
plexiforme externa, mitral y granular (Figura Nº 8).
34
FIGURA Nº 8 : Esquema de registro electrofisiológico. La secuencia de puntos
verticales es un ejemplo de los registro que realiza el electrodo móvil, el electrodo fijo
siempre registra en el mismo punto.
4.6.1. PROCESAMIENTO DEL REGISTRO DE LOS POTENCIALES DE
ACCIÓN
Los potenciales de acción se adquieren desde la banda filtrada entre los 300 y los 3000
Hz. de frecuencia del espectro total por una tarjeta análogo digital, la cual permite
archivar la señal a través de un programa diseñado en C++ el cual permite registrar cada
canal individualmente en una ventana de tiempo que en el caso particular de estos
experimento fue establecida en 2 seg. Con una frecuencia de muestreo de 29070 Hz.
35
4.6.2. PROCESAMIENTO DEL REGISTRO DEL LFP
La adquisición se realizará con una tarjeta análogo digital la cual captura el
espectro filtrado entre los 30 y 300 Hz de frecuencia. Y que registra con una frecuencia
de 2000 Hz.
El registro obtenido es procesado por otro programa el cual permite determinar
los componentes de frecuencia del LFP y EEG en relación a una magnitud relativa, lo
que se logra a través de una transformación rápida de Fourier (FFT), la cual consiste en
un algoritmo que descompone la onda sinusoidal en sus ondas componentes y las gráfica
en frecuencia versus magnitud.
4.7. ANÁLISIS DE DATOS
El análisis de los registros se compone de dos etapas:
Análisis del LFP registrado por el electrodo posicionado en la capa mitral
(control) versus cada registro realizado por el otro electrodo a medida que se adentra en
la profundidad del bulbo cada 200µm. En relación a sus componentes según frecuencia
obtenidos por la transformación rápida de Fourier filtrada a 50 Hz (frecuencia de la
corriente alterna domiciliaria en Chile).
El análisis de la actividad del LFP asociado al ritmo respiratorio en relación a sus
componentes según frecuencia y momentos de aparición.
36
4.7.1.
ANÁLISIS
DEL
LFP
EN
RELACIÓN
A
SUS
DIFERENTES
PROFUNDIDADES DE REGISTRO CON RESPECTO AL LFP EN LAS
CÉLULAS MITRALES Y EN PENACHO
El registro del LFP consta de 40 observaciones de una duración de 2 seg. cada
una. Primero, al obtener el registro de cada momento de análisis, estos valores, son
procesados por la Transformación Rápida de Fourier (FFT), la cual descompone a la
oscilación en sus componentes según frecuencia, a los cuales les da valores en un grado
de magnitud relativa a cada observación. Estos valores obtenidos (40 por cada registro)
son promediados y filtrados entre una frecuencia de 20 a 100Hz. Debido a que se
estableció como valores relevantes para este estudio solo aquellos que pertenezcan a los
rangos Beta y Gamma del espectro, todo valor que sobrepase al promedio por sobre 2
desviaciones estándar se considera como un valor significativo (95.4% de significancia),
es decir, que existe una actividad oscilatoria importante en esa frecuencia en ausencia de
estímulo y por lo tanto espontánea.
Los registros promediados de las FFT, se pueden analizar dentro del mismo
electrodo pues son generadas en las mismas condiciones. Para el análisis de estos
registros, se obtuvo cada valor de magnitud relativa de la FFT de cada profundidad
registrada en su máximo de actividad dentro de la banda gamma, la cual corresponde a
un promedio de 40 ensayos y con estos valores se generó una gráfica. Esta gráfica se
comparará con la recta obtenida como control, el cual se estableció como el valor de
magnitud para cada promedio pero en la banda beta, a los 20Hz. Estas rectas se
compararon por medio de las regresiones lineales y mostrarán si existen o no diferencias
en la progresión de estos valores a medida que se desplazan por las diferentes capas del
bulbo olfatorio.
Para verificar que los valores que componen la recta de las magnitudes promedio
a la frecuencia deseada corresponden a una variable dependiente de la profundidad, se
realizará un análisis de varianza en el cual se asumirá que las diferencias son
significativas si P resulta menor o igual a 0.05. Es decir, que la tendencia de las
37
magnitudes de frecuencia con respecto a la profundidad tiene una pendiente distinta de
cero, es decir, existe una variación en la magnitud de esa frecuencia a medida que la
profundidad varía. Se tomarán como registros adecuados para análisis posteriores solo
los que no sean significativos en el electrodo fijo, tengan o no pendientes significativas
en el electrodo móvil.
Los registros seleccionados serán analizados por medio de un análisis de varianza
para muestras repetidas no paramétrico, esta vez tomando cada valor de magnitud para
cada prueba de registro agrupándolos de acuerdo a profundidad. De ser significativas las
diferencias entre grupos, se realizará un análisis post ANOVA para muestras no
paramétricas de Tukey, el cual determinará entre que profundidades las diferencias son
significativas. Las diferencias se asociarán con la caracterización cualitativa de los
registros que determina en que capa del bulbo se encuentran. Esto permitirá observar si
existen diferencias significativas de magnitud entre las diferentes profundidades del
bulbo olfatorio.
4.7.2. ANÁLISIS DEL LFP ASOCIADO AL CICLO RESPIRATORIO.
Para este análisis es necesario el desarrollo del FFT en relación al tiempo, por lo
tanto el FFT se desarrollará en ventanas pequeñas de 213 mseg. de registro, las cuales se
desplazan cada 10 mseg. Obteniendo una gráfica del comportamiento de las frecuencias
de oscilación con respecto al tiempo mostradas en un espectrograma. Para este objetivo
se utilizará un programa desarrollado en un formato para Matlab® el cual arrojará los
archivos del espectrograma. Posteriormente, otro programa, desarrollado en lenguaje
C++ tomando en cuenta el momento del desarrollo de un ciclo respiratorio, superpondrá
esta misma ventana de tiempo de la grafica de los FFT, mostrando así el espectrograma
superpuesto al ciclo respiratorio. De esta manera será posible determinar si existe o no
un comportamiento de frecuenta específica en ausencia de estímulo relacionada con
algún punto del ciclo respiratorio en las diferentes capas del bulbo olfatorio.
38
5. RESULTADOS
5.1. IMPLEMENTACIÓN DE LOS INSTRUMENTOS Y PROCEDIMIENTOS
NECESARIOS PARA EL DESARROLLO ADECUADO DE LOS
EXPERIMENTOS.
5.1.1. PROCEDIMIENTOS
La realización de los experimentos de registro requirió del desarrollo de diversos
aspectos claves para el éxito de la investigación. Por un lado, fue necesario perfeccionar
la técnica anestésica que permitió finalmente llevar a cabo el procedimiento quirúrgico
junto con el registro, sin producir sufrimiento alguno a la rata y manteniéndola estable
en sus constantes fisiológicas.
5.1.2. INSTRUMENTOS
Para realizar los experimentos propuestos, fue necesario fabricar los tétrodos y
desarrollar el diseño y materialización del micromanipulador. La manufactura de los
tétrodos requirió que los cuatro electrodos fueran similares en su impedancia.
Posteriormente, se fabricó un modelo de manipulador conformado por un cilindro de
acrílico que contiene en su interior dos ascensores, compuestos por una base que
sustenta el tétrodo por medio de pernos y rieles tubulares de acero y bandas elásticas
para ortodoncia como mecanismo de reposicionamiento de la base en su nivel inicial.
Con el objeto de descender en la profundidad del tejido bulbar, al manipulador se le
conectó en su cara dorsal dos tornillos de precisión, uno para cada base, los cuales
dieron una libertad de movimiento mínimo de 10 µ.
39
5.1.3. REFORMULACIÓN DEL PROTOCOLO ANESTÉSICO
Producto de la alta tasa de mortalidad de los especímenes observada tras la
aplicación del protocolo anestésico obtenido desde la bibliografía, se reformuló la
dosificación de las soluciones pre-anestésicas y anestésicas. Como resultado, los
experimentos exitosos, se basaron en una dosificación preanestésica de 0.1 mg/Kg de
atropina IP o SC y 0.75 mg/Kg de acepromazina IP. Posteriormente, se requirió aplicar
una dosis de ketamina correspondiente al 200% de lo estimado según la bibliografía
señalada, es decir un total de 60 mg/Kg I.P. para lograr un plano anestésico adecuado.
Luego, se aplicó una dosis de uretano en un 33% menor a la sugerida en la bibliografía,
es decir una dosis de 0.9 g/Kg IP, pero con la diferencia de que esta dosis sólo permitió
un estado profundo de anestesia de alrededor de 3 a 4 horas siendo necesario redosificar
con 0.3 g/Kg. IP con lo que se logró extender el plano anestésico alrededor de 2 horas
más. (Tabla Nº 1)
La eutanasia realizada a los ejemplares se desarrolló de acuerdo al protocolo de
bioética aprobado por el consejo de bioética de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Chile código CBA#079 FMUCH.
40
Tabla Nº 1 : Tabla resumen de las dosificaciones efectivas utilizadas con éxito en los
experimentos.
41
5.1.4 REGISTRO ELECTROFISIOLÓGICO
Para este estudio, se utilizó un total de 30 ratas, de las cuales 10 se utilizaron
durante el desarrollo y prueba del manipulador y como también el perfeccionamiento de
la técnica anestésica y quirúrgicaDe las 20 ratas restantes, fue posible obtener registros
con los 2 tétrodos de manera adecuada para el análisis en solo 10 ejemplares, es decir, en
10 ratas se logró la obtención de al menos un registro completo de las capas del bulbo
olfatorio. Estos registros completos, están compuestos de un registro de LFP, un registro
de la respiración y un registro de la actividad de neurona única.
De los 28 registros
realizados sobre el tejido bulbar, 16 sitios corresponden a registros de la zona dorsal del
bulbo, es decir con una disposición desde glomérulos hacia células granulares y 12
registros se realizaron en la zona ventral, es decir desde células granulares hacia
glomérulos.
El análisis del LFP se realizó mediante la transformación rápida de Fourier, en 2
niveles. En el primero se intentó caracterizar el comportamiento del registro oscilatorio a
través del desarrollo de la FFT en los 2 segundos de registro. Utilizando este método, se
describió la banda de frecuencia predominante y al mismo tiempo se determinaron
diferencias significativas entre los patrones del LFP en las distintas capas del bulbo
olfatorio. En el segundo nivel se realizó el análisis de la actividad oscilatoria asociada a
un ciclo respiratorio, para evaluar una posible correlación de fase de alguna banda de
frecuencia en particular con alguna fase del ciclo respiratorio natural.
5.2 ANÁLISIS DEL COMPORTAMIENTO DEL LFP EN LAS DISTINTAS
CAPAS DEL BO EN AUSENCIA DE ESTÍMULO
La Transformación Rápida de Fourier (FFT, del inglés Fast Fourier Transform)
es un proceso mediante el cual, la señal de campo local se descompone en sus distintas
frecuencias y magnitud relativa. Este proceso se realizó para todas las pruebas, de cada
una de las mediciones en cada registro, para ambos tétrodos. Se logró obtener así, un
42
total de 28 registros exitosos de experimentos con tetrodos. Posteriormente, los registros
de cada profundidad fueron sumados, promediados y graficados en una sola tabla con el
objeto de simplificar la cantidad de datos obtenidos. (Tabla Nº 2)
TABLA Nº 2 : Resumen de registros y la presencia de actividad oscilatoria según banda
de frecuencia para el electrodo fijo y móvil.
43
Al analizar las curvas graficadas, se obtiene un total de 25 registros en que algún
electrodo sobrepasa el umbral de 2 desviaciones estándar sobre el promedio en algún
punto de la banda gamma y un total de 8 registros sobrepasan este umbral en algún
punto de la curva correspondiente a la banda beta.
Estos valores se consideran
significativos con un nivel de confianza de 96.5%. (figura Nº 9)
FIGURA Nº 9 : Ejemplo de graficos de la transformación rápida de Fourier con
oscilaciones máximas en la banda gamma.
Dentro de las gráficas obtenidas, observamos 4 patrones generales de
comportamiento de las curvas superpuestas para un mismo electrodo en las diferentes
profundidades de capas. Estos patrones se muestran en la figura número 10. En donde se
observa un patrón plano sin variaciones de magnitud al avanzar en profundidad
denominado patrón 1, (Figura 10.a), un patrón con máximo, pero sin variaciones de
44
magnitud entre las profundidades (patrón 2, Figura 10.b), un patrón plano, pero con
variación en la magnitud (patrón 3, Figura 10.c) y por último, un patrón con máximo y
variación de magnitud (patrón 4, Figura 10.d).
GRAFICA TIPO 2
1000
5000
820
4000
MAGNITUD RELATIVA
MAGNITUD RELATIVA
GRAFICA TIPO 1
640
460
280
3000
2000
1000
100
0
12
34
56
78
100
12
34
FRECUENCIA
78
100
GRAFICA TIPO 4
GRAFICO TIPO 3
1000
1000
820
820
MAGNITUD RELATIVA
MAGNITUD RELATIVA
56
FRECUENCIA
640
460
280
640
460
280
100
100
12
34
56
FRECUENCIA
78
100
12
34
56
78
100
FRECUENCIA
FIGURA Nº 10 : Esquema de los diferentesd tipos de patrones expresados en las
gráficas de las FFT, fueron catalogadas como tipo I (10.a), II (10.b), III (10.c) y IV
(10.d).
45
Como lo muestra la tabla Nº 2, de los 28 registros fijos, 20 resultaron tener un
patrón plano, es decir sin máximo y 8 mostraron máximo, ninguno variando la magnitud
relativa a medida que el electrodo móvil aumentaba su profundidad recorriendo las
distintas capas del bulbo olfatorio. Para el caso de los registros móviles, 4
permanecieron estables en cuanto a su magnitud, haciendo que las curvas se
superpusieran sin mostrar un máximo de frecuencia evidente, 5 registros mostraron
máximo sin alterar su magnitud frente al movimiento, 10 alteraron su magnitud sin
máximo evidente y 9 mostraron una variación consistente con el cambio de profundidad
al mismo tiempo que mostraron un máximo evidente dentro de la banda gamma.
Para poder determinar si esta diferencia gradual de magnitud observada en la
gráfica de la FFT es significativa en una banda de frecuencia con respecto a las otras, y
si existe una diferencia notable entre el electrodo fijo y el móvil, se extrajeron los
valores de magnitud para una frecuencia dentro de la banda beta (19.5 Hz) y se
compararon con las magnitudes en cada profundidad en la banda gamma en la
frecuencia en donde se encontraba el máximo de magnitud, cuando este se presenta o
bien a 95 Hz. cuando no se observaba un máximo en la banda gamma. De esta manera,
para cada electrodo se obtuvo 2 columnas de datos, una a baja frecuencia y otra de alta
frecuencia, las cuales, en caso de que las observaciones resultaren en un aumento o
disminución gradual de la magnitud relativa, se asemejarán a una recta. Para
compararlas, se calcularon las regresiones lineales y los coeficientes de determinación
de cada recta y se realizó un ANOVA entre la recta obtenida y el eje x, a fin de
determinar si las diferencias de magnitud corresponden a una pendiente diferente del eje
x, es decir, se compararon con una pendiente 0. Como los registros se tomaron
indistintamente hacia profundidad o hacia superficie, el valor de la regresión se
consideró como valor absoluto, debido a que para los fines de las comparaciones, el
signo de dirección es irrelevante.
De esta manera, y de acuerdo al criterio de selección ya indicado en materiales y
métodos, se obtuvo los siguientes resultados resumidos en la tabla Nº 3.
46
TABLA Nº 3 Resumen de las pruebas de regresión lineal y ANOVA para seleccionar los
registros aptos para el análisis posterior.
47
48
De los 28 registros obtenidos completos, 16 registros cumplieron con las
condiciones para el análisis. Estos se procesaron con el objeto de determinar si existen
diferencias significativas entre los grupos de pruebas para la frecuencia máxima en las
diferentes profundidades. Los resultados se consideraron significativos con un p < 0.05.
Al analizar los resultados según banda de frecuencia, se observa que 12 de los
registros en la banda beta son significativos a medida que se altera la profundidad dentro
de las capas del bulbo olfatorio y en la banda gamma, 15 registros de 16 resultaron
significativos. Se observaron 4 registros que no presentaron diferencias según
profundidad en el bulbo olfatorio en la banda beta y en la banda gamma. Estos
resultados se resumen en la tabla Nº 4.
49
TABLA Nº 4 Resumen de los análisis de TUKEY para los ANOVA significativos según
las capas usando de referencia el electrodo posicionado en la capa mitral.
50
A partir de estas significancias, se realizó una comparación de las diferencias
significativas observadas estadisticamente y la clasificación visual de la diferenciación
por capas realizada visualmente en el momento de la adquisición de los registros. Un
ejemplo de esta clasificación se muestra en la tabla Nº 5.
TABLA Nº 5 : Ejemplo de registros en los que se asocia el análisis estadístico entre las
diferentes profundidades y que se contrarrestan con el análisis visual al momento del
registro.
En rojo, los registros estadísticamente significativos con relación a la capa mitral.
51
5.3 ANÁLISIS DEL LFP EN LAS DISTINTAS CAPAS DEL BO EN AUSENCIA
DE ESTÍMULO A PARTIR DEL REGISTRO OBTENIDO PROCESADO EN
VENTANAS PEQUEÑAS DE FFT ASOCIADAS AL CICLO RESPIRATORIO
AL MOMENTO DEL REGISTRO.
Este análisis realizado sobre el LFP registrado en ausencia de estímulo, se realizó
persiguiendo posibles asociaciones de frecuencias de actividad oscilatoria del LFP y el
ciclo respiratorio. Para este objetivo, se descompuso el registro oscilatorio a través de la
FFT, pero esta vez en ventanas de tiempo de 213 mseg. a diferencia de las anteriores que
median 2 segundos. Con una superposición de ventanas corriendo el segmento de
registro cada 10 mseg. La gráfica de la FFT esta vez se realizó por medio de un código
de colores que indican el valor de la magnitud relativa, otorgándole al rojo el valor más
alto decayendo hacia el amarillo, verde, azul y por último negro. Con estos valores se
generó una matriz gráfica de 3 dimensiones, que tiene como abscisa al tiempo y como
ordenada a la frecuencia y un valor de intensidad representada por un código de colores.
En la figura 9 se observan ejemplos de espectrogramas con modulación (Fig.
11a) y sin modulación ni máximo de actividad (Fig. 11b).
52
ESPECTROGRAMA CON
MODULACIÓN
RESPIRATORIA
ESPECTROGRAMA SIN
MODULACIÓN
RESPIRATORIA
FIGURA Nº 11 : Ejemplo de espectrogramas con y sin modulación respiratoria.
De esta manera se realizó las observaciones de este tipo de gráficas obtenidas
generando la tabla Nº 6.
A partir de estos resultados, se observa que 29 de los 56 registros de LFP
generados mediante tétrodos presentaron una actividad modulada por el ciclo
respiratorio en la banda gamma, a nivel del periodo que se establece entre el comienzo
de la inspiración y el inicio de la espiración (90º y 180º del ciclo respiratorio), el
intervalo de frecuencias observado en la banda gamma va desde los 48 a los 98 Hz. La
banda beta de frecuencia no se observa significativa de manera consistente en el tiempo.
53
TABLA Nº 6 : Resumen de los espectrogramas según frecuencias predominantes y
momento del ciclo respiratorio en donde se observa la modulación.
54
6 DISCUSIÓN
6.1 ANÁLISIS DEL COMPORTAMIENTO DEL LFP EN LAS DISTINTAS
CAPAS DEL BULBO OLFATORIO EN AUSENCIA DE ESTÍMULO
En la figura, se observa que al realizar una descomposición del patrón
oscilográfico en sus componentes de magnitud y frecuencia, existe un claro patrón en la
mayoría de los registros el cual consiste en una distribución en la cual hay un máximo,
que varía en función de la frecuencia, pero que es superior en magnitud al doble de la
desviación estándar sobre el promedio de las magnitudes. Según este criterio, el máximo
es significativo con una probabilidad de 0.035.
Es interesante mencionar que estas gráficas se obtuvieron a partir de
transformaciones de Fourier en ventanas temporales de 2 segundos, y posteriormente
promediadas entre las registradas en el mismo sitio, es decir, lo que observamos en cada
uno de estos gráficos consiste en un promedio general de 40 registros seriados en un
mismo sitio. Cuando la distribución en el universo de frecuencias es azaroso, al sumar
una gran cantidad de registros y luego promediarlos, el registro tiende a ser plano, a
diferencia de estos, en los cuales hay una distribución que por su magnitud, se hace
estable independiente de la ventana temporal en la cual se observe.
Estos resultados coinciden con las observaciones de Ravel et al., 2003 y Neville
y Haberly, 2003, que muestran un patrón de actividad en la banda gamma, pero es
importante destacar que este patrón sólo se describe en presencia de un estímulo
olfatorio, y en ausencia de odorantes no hay oscilaciones significativas. Los registros
que estadísticamente muestran significancias en la actividad de la banda beta son
registros que en las gráficas no muestran máximos notables, sólo se observa el registro
plano, que muestra sólo ruido sin relevancia de frecuencias, por lo que la actividad
estadísticamente significativa se debe a que la sumatoria de la media más 2 desviaciones
estándar resulta un valor bajo y muy cercano al promedio por la escasa variabilidad.
55
Es importante destacar que se observaron 5 registros con patrones de máximo
duales, es decir, con registros con máximos estadísticos en las dos bandas, pero
nuevamente se refieren a registros planos en donde el orden de magnitud de la
desviación estándar es muy bajo. Aunque de ser este tipo de patrones igualmente
válidos, la presencia simultánea de un máximo en ambas frecuencias no sería
contradictorio con las observaciones de Ravel et al., 2002, puesto que estos patrones no
necesariamente coexisten en el tiempo, es importante recordar que estos registros
oscilatorios muestran un promedio de 40 pruebas de 2 segundos de duración, y que la
frecuencia respiratoria de las ratas anestesiadas es alrededor de 2 a 5 ciclos por segundo.
Otra característica de estos resultados, consiste en el patrón variable en magnitud
para cada punto de profundidad registrado. Al realizar un análisis de esta variación de
magnitud por medio de la elección de una frecuencia comparativa en la banda beta (20
Hz) asociada al conjunto de valores dados por el máximo de magnitud en la banda
gamma, relacionándolos a través de una prueba de regresión lineal, se observa que en los
16 registros aptos para análisis, existe un patrón consistente en su variación de magnitud
en la medida en que el electrodo avanza. Esto nos muestra que existe un patrón de
magnitud que va en aumento como se observa en la tabla Nº 4. Este patrón es altamente
correlacionado cuando se analiza cualitativamente en forma visual (a través de la
actividad de espigas en la capa mitral por ejemplo) con la significancia estadística
mostrada en la tabla Nº 5. Que muestra que este aumento estaría asociado al nivel de
cercanía del electrodo de registro con la capa granular y que la frecuencia de actividad a
este nivel puede ser variable, pero que por lo general oscila entre los 70 y 95 Hz de
frecuencia (Tabla Nº 6).
56
La diferencia entre las magnitudes relativas entre las diferentes profundidades
puede sugerirse como un estimador de la actividad sincrónica celular en los diversos
sitios de registro. A mayor cantidad de células reclutadas en el proceso de manera
sincronizada, mayor resultan las variaciones del medio extracelular, es decir las
corrientes extracelulares producto de la activación de las neuronas cercanas y por tanto,
más predominante se hace esa frecuencia de descarga en particular, expresándose en una
mayor magnitud para esa frecuencia en la transformación rápida de Fourier. Esto es fácil
de entender utilizando la Figura Nº 12 del modelo esquemático de la asociación
creciente en número de células observada, de manera radial en el bulbo olfatorio desde
los glomérulos hasta las células granulares ( Rall y Shepherd, 1968).
FIGURA Nº 12 : Distribución radial de la estructura de las capas internas del bulbo
olfatorio (Rall y Shepherd, 1968)
Esta diferencia de magnitud dista con las observaciones de Lagier et al., 2004,
quienes observaron una actividad comparativamente mayor en magnitud en la capa
plexiforme externa en relación a la capa granular y glomerular encontrando en esta
última la más baja magnitud (Lagier et al., 2004). Hay que destacar que las
observaciones de Lagier et al., se realizaron en registros en rebanadas de tejido y
57
estimuladas con potenciales eléctricos por medio de descargas y que en estas
condiciones no observaron actividad rítmica en las células mitrales y en penacho, lo cual
es debido probablemente a que esta actividad es estimulada posiblemente por la
actividad respiratoria y no necesariamente a los estímulos. Lagier et al., 2004 sugieren
que el generador de la actividad oscilatoria se gesta bajo dos posibles condiciones, por
un lado debido a la existencia de generadores locales independientes y por otro, un
generador único debido a que el grado de sincronía de las oscilaciones en las diferentes
capas es muy alto y en este caso estaría ubicado en donde la magnitud de la oscilación es
mayor, en la capa plexiforme externa, por lo que sugiere que se generaría a partir de la
actividad oscilatoria producida por la red de interneuronas de dicha capa.
Con respecto a los registros de electrodos fijos, se seleccionaron aquellos sitios
que en que se observo estabilidad del registro indicando que el electrodo no se había
movido durante la manipulación del electrodo movible. Estos registros fijos presentan
actividad gamma constante durante el registro en la capa mitral, debido al criterio de
selección de los electrodos viables para el análisis.
La actividad beta en los patrones obtenidos por medio de la transformación de
Fourier, sugieren que en ausencia de estímulos, no existe una actividad beta persistente,
aunque, como el valor del magnitud relativa de la transformación de Fourier se realiza
en relación al valor mas alto, es posible que, de haber actividad beta, esta podría estar
siendo enmascarada por la actividad gamma. Para este objetivo sería necesario filtrar la
señal para la banda beta de manera individual, procesos que se escapan de los objetivos
de esta tesis. Sin embargo, podemos concluir que en ausencia de estímulo, la amplitud
de las oscilaciones en la banda beta nunca sobrepasa a lo observado en la banda gama.
La actividad beta estaría presente en estados de entrenamiento de las ratas, en los
cuales se observa un aumento de la amplitud de la actividad beta a medida que los
animales son entrenados a reconocer odorantes y ésta actividad nunca se superpone con
la actividad gamma de manera temporal (Ravel et al., 2002).
Si observamos el detalle de las significancias generadas a través de la prueba de
Tukey (post ANOVA de muestras repetidas) entre las diferentes capas, observamos que
58
existe una agrupación de los registros según grupos de profundidades, es decir, un grupo
de registros sucesivos que poseen valores de magnitud no significativos entre sí, pero
que a su vez son significativos para un grupo distinto. Al relacionar y cotejar estos
resultados con los observados en la clasificación visual de las capas en un sitio, a partir
de la presencia de espigas o actividad unitaria de células mitrales a alta frecuencia, se
observa consistencia, lo que, además de corroborar la acuciosidad de las clasificaciones
visuales en el momento del registro experimental, sugiere una sectorización en capas de
la magnitud de la amplitud de las oscilaciones. Estos resultados parecen consistentes
tanto para la banda gamma como para la banda beta, pero es importante recordar que en
la banda beta, no se advierten observaciones que posean valores de magnitud relativa
mayores al promedio más dos desviaciones estándar y por tanto significativas. Por esta
razón, se establece que existe una dominancia de la banda gamma, la cual es mayor
significativamente en amplitud a medida que el electrodo móvil registra en capas más
cercanas a la capa granular, lo cual es consistente con la clasificación visual que
establece a la presencia de la actividad unitaria de células mitrales como punto de
referencia. Esto puede observarse en los ejemplos de la tabla Nº 5 que muestra dos casos
en que se superpone la caracterizacion visual de los registros con la respuesta al análisis
post ANOVA de Tukey que determina cuales registros resultan significativos con
respecto al primer registro tomado en superficie.
59
6.2 ANÁLISIS DEL LFP EN LAS DISTINTAS CAPAS DEL BO EN AUSENCIA
DE ESTÍMULO A PARTIR DEL REGISTRO OBTENIDO PROCESADO EN
VENTANAS PEQUEÑAS DE FFTS ASOCIADAS AL CICLO RESPIRATORIO
AL MOMENTO DEL REGISTRO.
Al observar los patrones de las gráficas de las ventanas de los FFT, se
clasificaron estas ventanas por la existencia o no de un patrón modulado de actividad
oscilatoria en una frecuencia en particular del registro o su inexistencia. Con respecto a
la dinámica de la banda gamma presente en las observaciones, en el electrodo fijo, sólo 5
observaciones permanecieron con este patrón observable de manera constante y en el
caso del electrodo móvil, sólo 3. Las demás observaciones muestran que el patrón
aparece y reaparece al desplazarse a través de las capas del bulbo. Resta determinar si
existe un patrón de oscilación en la banda gamma asociable a las diferentes capas del
bulbo olfatorio. Las frecuencias en que se ubica el patrón de actividad gamma
corresponden al rango entre 46 y 98 Hz, es decir, la frecuencia de actividad
predominante pertenece a un rango que va desde los 78 a 98 Hz. lo que se aleja de lo
observado en las FFT de 2 seg., en que el rango de frecuencias es menor. Por otra parte,
no se observan oscilaciones en la banda beta en forma consistente en las distintas capas
del BO, siempre aparece de manera esporádica y raramente significativa, centrándose en
todos los casos a los 16 hz (Figura Nº 5).
Otro punto importante de describir en este nivel, es la ubicación dentro del ciclo
respiratorio en que se encuentran estos patrones de actividad modulada. En el caso de la
banda gamma, se observa casi en la totalidad de los casos (n=15) entre los 90° y 180°
del ciclo respiratorio, es decir, en el periodo del ciclo correspondiente al registro de la
inspiración de la rata, llegando a desplazarse hasta los 270° (n=2), e incluso permanecer
como una banda continua durante todo el ciclo (n=1) (Figura Nº 5). Este patrón asociado
al ciclo respiratorio corrobora las observaciones realizadas por Buonviso et al., 2003,
que describen la presencia de oscilaciones en la banda gamma durante la inspiración en
el ciclo respiratorio. Ellos también describieron la actividad oscilatoria en la banda beta
60
desplazada de la actividad gamma y que se establece en la parte del ciclo
correspondiente a la espiración. Es importante destacar que sus registros se realizaron
bajo la presencia de estímulos odoríferos, que son los responsables de la expresión de
actividad beta y que explicaría la ausencia de oscilaciones en la banda beta en los
experimentos correspondientes a esta tesis, puesto que fueron realizados en ausencia de
odorantes y en ratas sin entrenamiento. Por otro lado, en la banda gamma, la actividad
modulada se encuentra en todos los casos en los 270° del ciclo respiratorio, excepto en
un caso, en que se ubica en el segmento 270° a 360° y en otro, en que la mayor amplitud
se ubica entre los 0° y los 90°. Al observar los 3 registros de posición en 3 electrodos
distintos en que se encuentran beta y gamma presentes simultáneamente, es posible
observar que nunca estas dos bandas se encuentran de manera simultánea, lo que
concuerda con las observaciones de Buonviso et al., 2003. En las observaciones en que
se encontraba una actividad máxima en la banda gamma de manera modulada, no fue
posible observar si esta actividad aumentaba entre las diferentes profundidades del
registro debido a que el programa sólo genera el patrón de colores de acuerdo a su nivel
individual de significancia, por lo que entre ellos no son comparables y por lo tanto,
habiendo actividad significativa modulada, en los registros que la mantengan, se
observaran los espectrogramas de una manera muy similar.
Los registros que expresaron una actividad oscilatoria en una frecuencia en
particular de manera constante en el ciclo respiratorio se consideraron como registros
con ruido o con actividad artefactual, esto se produce por ejemplo cuando no se es capaz
de filtrar la actividad oscilatoria del ruido generado por la corriente de la red
domiciliaria que posee un patrón de oscilación de 50 Hz.
Las diferencias de máximo de frecuencia de los registros de LFP en ventanas de
2 segundos y estos registros de ventanas más acotadas, probablemente se debe a la
influencia de ruido externo al sistema de registro, que por permanecer de manera
constante en el momento del experimento, aparece como significativamente promediado
cuando no se realiza una filtración por el ciclo respiratorio. Por esta razón algunos
registros descartados de esta experiencia, mostraban una actividad oscilatoria que estaba
61
magnificada, a nivel de los 50 Hz debido a la actividad oscilatoria de la red eléctrica
domiciliaria.
7. CONCLUSIONES
A partir de los análisis de los potenciales de campo en las distintas capas del
bulbo olfatorio de la rata, se puede concluir que existe una actividad oscilatoria en la
banda gamma, la cual sufre un aumento gradual y significativo de su magnitud en el
LFP entre las diferentes capas del bulbo olfatorio desde la capa glomerular a medida que
se acerca el electrodo hacia la capa granular. Este aumento de la magnitud podría ser
generado debido a una mayor sincronía de las células en esta región a una frecuencia de
oscilación basal y espontánea que se traduce en una mayor intensidad de oscilación en
relación a las demás capas del Bulbo olfatorio.
La oscilación basal corresponde a frecuencias variables en los diferentes registros
analizados, pero siempre dentro de la banda gamma del espectro comprobándose esta
aseveración revisando las observaciones realizadas con anterioridad en el bulbo olfatorio
por (Ravel et al., 2002; Neville y Haberly, 2003)
Las oscilaciones en la banda gamma se observan acopladas al ciclo respiratorio
generándose en el periodo de inspiración de la rata, lo que las diferencia, temporalmente,
con lo registrado para la banda beta, que según estudios recientes, se presentan durante
la espiración. Esta actividad beta, no fue registrada de manera consistente ni
estadísticamente significativa, por lo tanto en ausencia de odorantes concluimos que no
hay oscilaciones en esta banda en animales no entrenados.
Se sugiere que la asociación entre inspiración y oscilación gamma podría servir
como base “en espera” para la generación de una respuesta al estímulo que proviene
desde los receptores olfatorios hacia el bulbo, con el objetivo de facilitar la codificación
de los distintos estímulos olfatorios. La generación de esta actividad gamma podría ser
generada por dos mecanismos: por medio de la activación espontánea y sincrónica de las
células granulares, teoría que se apoya en la presencia de un patrón de alta magnitud a la
62
descomposición de la oscilación por medio del FFT en esta capa, y por otro lado, se
podría generar por medio de factores mecánicos o de otro tipo originados en las fosas
nasales debido al roce de los receptores olfatorios con el aire de entrada.
La oscilación espontánea del bulbo olfatorio sugiere que por acción de las células
granulares, este sistema permitiría también la regulación de la intensidad a través de la
inhibición de algunos grupos celulares asociados sinápticamente a glomérulos inactivos.
Es decir, la oscilación espontánea del bulbo olfatorio podría tener una función
potenciadora de la señal olfatoria, generando un patrón oscilatorio sobre el cual la
actividad sináptica se monta permitiendo una ordenación de la señal proveniente de la
superficie sensorial.
La mayor intensidad de la oscilación correspondiente a la capa glomerular podría
sugerir que el origen de las oscilaciones es interno y que se gesta en esta capa,
acentuándose a niveles umbrales al momento de realizar la inspiración, potenciada por
factores externos como la tracción de los receptores olfatorios debido al flujo de aire
inspirado. Por otra parte, la actividad en la banda beta, no resulta significativa en
magnitud en individuos no entrenados y respirando aire limpio (sin odorantes), por lo
que se sugiere que la presencia de actividad beta estaría asociada a la estimulación por
odorantes, probablemente de manera experiencial.
El registro de espigas permite realizar de manera visual y en vivo una
clasificación acertada de la posición en que se encuentra un electrodo en el bulbo
olfatorio, permitiendo la exploración electrofisiológica sin necesidad de realizar cortes
del tejido en todos los experimentos que se realicen. La ubicación del electrodo dentro
del tejido bulbar resulta eficiente si se utiliza este criterio como se demuestra a través de
la alta asertividad que posee al relacionarla con los resultados del nivel de significancia
estadística del análisis de Tukey.
Existe una clara concordancia de actividad gamma en el LFP con relación a la
presencia de espigas espontáneas en la capa mitral de manera radial a nivel del bulbo
olfatorio. Así mismo existe una concordancia frente a la ausencia de actividad de las
células mitrales y en penacho con ausencia de un patrón modulado o incluso relevante
63
de actividad gamma en las diferentes capas del bulbo olfatorio. Esta relación sugiere que
la red de asociación sináptica se arboriza a partir de los glomérulos hasta la capa de
células granulares, y que por esta razón, en los experimentos realizados, el hallazgo de
actividad gamma se logró, gracias a la utilización de punto de referencia a la presencia
de actividad celular mitral.
La inhibición cortical producida por el anestésico permite sugerir que la actividad
de la banda gamma dentro del bulbo olfatorio se gesta de manera local o anterior,
descartándose su origen en centros superiores corticales.
La técnica anestésica por medio de la mantención con uretano, resulta un
protocolo adecuado y suficiente para su utilización en ratas para experimentación en
neurofisiología por su duración en plano quirúrgico y sus beneficiosos efectos a nivel
nervioso, convirtiéndose el protocolo corregido en esta tesis una herramienta que se
sugiere para experimentos posteriores.
64
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