manual de laboratorio de microbiología

MANUAL DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
TEXTO GUÍA PARA EL ALUMNO
Carrera de Medicina
MEDI 4032
UNIVERSIDAD PEDRO DE VALDIVIA
Carlos Ivovic Oddo
Tecnólogo Médico
Profesor de Microbiología
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
Manual de Laboratorio de Microbiología
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Tema
UNIDAD 1:
Página
BIOSEGURIDAD
Definiciones
Simbología
Categorías del Riesgo
Gestión de Riesgos
Normas de Bioseguridad
Bioseguridad en la Práctica Médica
Origen de las Amenazas en Bioseguridad Médica
Disminución de Riesgos en Bioseguridad
Precauciones Universales
Medidas de Contención
Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología
Niveles de Bioseguridad
Accidentes de Bioseguridad en Microbiología
Ejercicios de aplicación de contenidos (bioseguridad)
Actividad de laboratorio n° 1 y 2 (bioseguridad)
Desinfección y antisepsia
El efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos
Efecto de factores físicos sobre los microrganismos: calor
Efecto de las radiaciones, Luz Ultravioleta
Efecto de las radiaciones, Radiación Gamma
Esterilización
Ejercicios de aplicación de contenidos (antisepsia, desinfección y esterilización)
Actividad de Laboratorio n°3 al 5 (aislamiento de bacterias)
Actividad de Laboratorio n°6: observación macroscópica de cultivos
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34-37
38-39
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Manual de Laboratorio de Microbiología
UNIDAD 1
BIOSEGURIDAD
Definiciones y simbologías
Podemos definir la BIOSEGURIDAD como el conjunto de las medidas, normas y procedimientos
fijados por una organización para minimizar y/o controlar el riesgo de ocurrencia de un accidente
con agentes biológicos.
De acuerdo a esta definición, se hace necesario precisar que el RIESGO es el grado de
vulnerabilidad de lo que nos interesa proteger, en otras palabras implica la existencia de una
posibilidad de que le ocurra un daño a lo que debemos proteger.
El riesgo de accidentes con cualquier agente (químico, físico o biológico) está siempre
presente, pero se hace cuantitativamente menor o mayor dependiendo del grado de control de las
circunstancias que determinan la ocurrencia del accidente. Para dar una dimensión objetiva al
riesgo, podemos darle una categoría de valor bajo, medio o alto.
La existencia de estos distintos agentes, o los acontecimientos que los liberan o desencadenan son
llamados AMENAZAS.
De acuerdo a las condiciones de ocurrencia que desencadenan a las amenazas, podemos
distinguir dos clases:
1. Amenazas Dirigidas: aquellas que actúan por INTENCIÓN, es decir actos
premeditados y dirigidos con el objeto de causar daño.
2. Amenazas No Dirigidas: son las que ocurren en forma aleatoria, impredecible o
accidental.
El grado de daño que una determinada Amenaza es capaz de infligir sobre lo protegido
puede ser categorizado (como magnitud) y medido (como probabilidad). A la asociación de estas
categorías de magnitud y probabilidad la llamaremos PELIGRO.
Este es el símbolo internacional que indica la existencia de un
agente peligroso (amenaza), que tiene la posibilidad de causarnos daño
severo o mortal. No se especifica cuál es la amenaza, pero si el nivel de
daño que no puede causar. Lo podemos observar en las etiquetas de los
reactivos químicos, a veces asociados a otros símbolos.
Ejemplos:
Cianuro de Potasio.
Acetato de Talio (veneno rodenticida)
Fluoruro de Sodio (anticoagulante usado para la toma de muestras para medición de
niveles de glucosa).
Oxido de Etileno (agente esterilizante).
Formaldehído (agente conservador de tejidos y esterilizante).
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Los agentes que representan una amenaza para la bioseguridad
se identifican internacionalmente con este símbolo, el que debe
considerarse como una ADVERTENCIA:
En este caso no se hace mención al nivel de peligro, por
lo que el daño causado por el supuesto agente puede ser de cualquier
magnitud.
No se especifica el tipo de agente biológico, este puede ser
una muestra para análisis de laboratorio, una sustancia
contaminada con agentes biológicos, un extracto de origen biológico, un agente biológico aislado
desconocido, o un agente biológico aislado. La simbología no hace distinción entre tipos de
agentes: virus, bacterias, hongos, parásitos, su estado estructural ni respecto de su actividad vital.
Es posible observar este símbolo en contenedores de transporte de muestras para análisis:
orina, sangre, secreciones, deposiciones, biopsias o partes para estudio anatomopatológico sin
tratamiento con fijadores. Contenedores con deshechos quirúrgicos, de salas de hospitalización o
de laboratorios clínicos, muestras o cultivos en tránsito, partes de seres vivos o seres de
naturaleza no bien comprendida deben rotularse con este símbolo, además de las etiquetas que
especifiquen contenido.
Existe una detallada descripción de las especificaciones aceptadas internacionalmente
para el transporte de sustancias biológicas que implican riesgo de bioseguridad. En nuestro país
esta actividad esta regulada por el Instituto de Salud Pública de Chile, puedes consultar la
normativa vigente en www.ispch.cl/sites/default/.../normativa_Transp_Sust_Infecciosas.pdf
Otros símbolos de advertencia de riesgos son:
Sustancia Inflamable
Sustancia Nociva, irritante
Material Explosivo
Material radiactivo
Sustancia Corrosiva
Sustancia dañina
para el ambiente
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Categorías de Riesgo:
Una forma práctica de objetivar el nivel de riesgo y a la vez establecer un criterio común
de valor entre las personas que ven expuestas a diversas amenazas es asignar categorías de riesgo.
Para categorizar el riesgo en bioseguridad (y en otros ámbitos) deben establecerse
mediante consenso valores arbitrarios para las probabilidades de que se manifiesten las amenazas
presentes y los peligros latentes que éstas implican. Para esto es necesario previamente constituir
grupos de profesionales idóneos y realizar un análisis de riesgo, el que arrojaría un resultado
semejante a este:
Valores arbitrarios para la probabilidad de amenaza o para el daño resultante en la
exposición:
1.- amenaza insignificante, ningún daño o daño insignificante.
2.- Nivel bajo o menor.
3.- Nivel medio
4.- Nivel alto
Como ahora tenemos asignados valores a las amenazas y sus correspondientes daños,
podemos asociarlos mediante una matriz de numérica, que representa una relación matemática
entre el nivel de la amenaza y su daño resultante (peligrosidad)
Categoría de Riesgo:
MAGNITUD DEL DAÑO X PROBABILIDAD DE AMENAZA
Valores 1 a 6: riesgo bajo
Valores 8 a 9: riesgo medio
Valores 12 a 16 riesgo alto
Una vez establecidas estas categorías es posible efectuar MANEJO O GESTION DE RIESGO a
nivel institucional.
Gestión de Riesgos:
La Gestión de Riesgos es un proceso analítico, multidisciplinario y dinámico que tiende a
conocer el estado de control de amenazas de un sistema, en otras palabras a determinar la
probabilidad de ocurrencia de daños y sus causas.
La gestión de riesgos es una de las herramientas más eficaces en la contención de
amenazas, apreciación de fortalezas y debilidades, mediadas de reducción y control de riesgos y
reducción de costos implícitos en problemas de bioseguridad. De la gestión de riesgos emana
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como resultado el conjunto de NORMAS DE BIOSEGURIDAD, que cada institución adopta para la
seguridad de sus profesionales (equipo médico) y trabajadores, de las personas beneficiarias de la
organización (pacientes), y del medio en el que está inserta (ambiente y sociedad).
En el proceso de Gestión de Riesgos se describen varias etapas que lo componen, y se
suceden en forma cíclica o se implementan según la necesidad:
•
•
•
•
1.- Evaluación del Riesgo:
- constituir el grupo de estudio
- definición de amenazas
- definición de daños por exposición a las amenazas
- definición de prioridades
- recopilación de información
2.- Clasificación de Riesgos según categorías.
- Asignar valores arbitrarios a las amenazas identificadas
- Asignar valores arbitrarios a los daños resultantes
- Categorizar el riesgo en alto – medio – bajo – nulo.
3.- Determinar medidas de reducción de riesgos
- Desplazamiento de personas
- Capacitación
- Modificación de la planta física del establecimiento
- Programas de mantenimiento
- Disposición de desechos hospitalarios
- Instalación de Servicio de esterilización
- Uso de medidas de barrera
4.- Control de riesgos
- Formación de Comité de Infección Intrahospitalaria
- Vigilancia epidemiológica
- Control de vectores
- Auditorías de cumplimiento de normativas
- Análisis de fallos en cumplimientos de normas.
Normas de Bioseguridad
Las Normas de Bioseguridad son el conjunto de disposiciones establecidas mediante el
proceso de Gestión de Riesgos, que tienen como finalidad PROTEGER AL INDIVIDUO, LA
COMUNIDAD Y EL AMBIENTE, del contacto con agentes biológicos potencialmente nocivos.
En general, estas normas permiten establecer mecanismos de barrera que impidan la
propagación de todo tipo de agentes biológicos en ámbitos tan diversos como la atención de
salud, la producción industrial de alimentos, medicamentos, biotecnologías, la investigación
científica o policial forense, y la protección del medio ambiente.
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Cada institución donde se manejen sustancias potencialmente infecciosas, seres vivos o
derivados de estos, es responsable de fijar sus propias normas de bioseguridad,
independientemente del deber de cumplir con las disposiciones que la Autoridad Sanitaria
determine para este efecto. En nuestro país estas normas son establecidas por el Instituto de
Salud Pública de Chile como organismo técnico del Ministerio de Salud, y el Instituto Nacional de
Normalización (INN).
Existen muchas normas de bioseguridad disponibles, algunas de alcance muy específico
relacionadas con el manejo de agentes como el Virus HANTA, Micobacterium tuberculosis, Virus
de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), etc.
A modo de ejemplo puedes consultar el Manual de Normas de Bioseguridad de Conicyt
2008 en Investigación.uach.cl/archivos/manual_bioseguridad_2008.pdf
Bioseguridad en la práctica de la Medicina:
Los accidentes biológicos en la práctica de la Medicina tienen directa relación con la
exposición a agentes infecciosos mediante la atención de pacientes o por contacto con sus fluidos
y tejidos. Este contacto origina una contaminación que puede tener como consecuencia:
•
•
•
Contagio: la instalación de agente biológico que
Implica un proceso infeccioso en el profesional
Estado de portador sano
Simple transmisión del agente, sea directa o indirecta
La ocurrencia de una infección por contacto accidental va a
depender de la concomitancia de varios factores, además de las medidas
de barrera que el profesional debe emplear, en esto debemos considerar
el grado de susceptibilidad del infectado, las puertas de entrada y el mecanismo de infección, la
cantidad de microrganismo infectante y sus características biológicas (mecanismos de patogenia).
El ambiente también puede condicionar la ocurrencia de la infección (humedad, ventilación,
temperatura ambiental).
Como en cualquier proceso infeccioso, ocurre una alteración del equilibrio de la Tríada
Ecológica en la que se relaciona AMBIENTE – AGENTE – HOSPEDERO.
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Origen de las Amenazas a la Bioseguridad en Medicina:
Las fuentes de amenazas en los ambientes médicos están vinculadas a acciones del público
que recibe atención, sus acompañantes, servicios de apoyo interno o externo, servicios informales,
acciones del equipo de salud y personal administrativo. La alta concurrencia al servicio hospitalario
y la gran variedad de acciones que allí se verifican especialmente cuando existe desorganización y
falta de medidas de control facilitan la ocurrencia de amenazas a la bioseguridad.
En este caso, las fuentes de amenazas podemos categorizarlas como:
•
GENERADORES: Todo individuo que mediante acciones, condición
de salud, ejecutante de técnicas o misiones, puede generar,
transmitir o eliminar agentes biológicos potencialmente
peligrosos al ambiente hospitalario. Un generador puede ser
considerado además RESERVORIO de agentes infecciosos.
•
TRANSMISORES: Todo individuo que forma parte de una cadena
de acciones en la que se manipulan objetos contaminados o
muestras de pacientes que pueden contener agentes infecciosos.
De esta forma, los pacientes con estados infecciosos y la disposición de residuos biológicos
representan una importante fuente de amenazas a la bioseguridad.
Entre los residuos biológicos peligrosos derivados de la atención médica destacan:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Residuos provenientes de zonas de aislamiento.
Cultivos de agentes infecciosos.
Sangre humana, sus derivados y objetos que la contengan.
Residuos orgánicos diversos (orina, deposiciones, secreciones)
Residuos materiales contaminados provenientes de cirugía y autopsias.
Residuos materiales contaminados de laboratorio.
Instrumentos cortopunzantes usados.
Residuos de unidades de diálisis.
Cadáveres de animales de laboratorio.
Residuos provenientes de Establecimientos geriátricos.
Residuos Provenientes de Comunidades terapéuticas o Centros de Rehabilitación
psicofísica donde se realice el tratamiento de adicciones.
La forma adecuada de mantener estas amenazas bajo control es una adecuada Gestión de Riesgos.
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Reducción de Riesgos en Bioseguridad:
El proceso exitoso de Gestión de Riesgos debe tener como resultado la generación de
Normas de Bioseguridad y Medidas de Control. En este sentido la dirección del establecimiento de
salud, o las respectivas jefaturas de servicio pueden determinar una gran variedad de normas y
medidas destinadas a disminuir el riesgo de accidentes relacionados con la bioseguridad, como
pueden ser:
• Programas de capacitación del personal
• Vigilancia de la adecuada aplicación de técnicas médicas
• Uso de medidas de barrera
• Vigilancia epidemiológica
• Organización del desplazamiento de personas
• Programas de mantenimiento permanente de la planta física
• Gestión de Riesgos permanente
• Inmunizaciones, cuando la naturaleza del agente lo determine
• Control del estado de salud del personal médico y administrativo
• Control de manipuladores de alimentos
• Control de vectores
• CONCIENCIA DEL RIESGO Y RESPONSABILIDAD PERSONAL
La responsabilidad y el AUTOCUIDADO son los pilares fundamentales del control de riesgos
en bioseguridad. El compromiso personal de cada integrante del equipo de salud en mantener su
integridad y en observar las normas de bioseguridad es la mejor forma de garantizar la
disminución de riesgos. De lo contrario, cualquier esfuerzo en este sentido puede ser estéril.
Las medidas de autocuidado pueden verse reflejadas en documentos como las
“PRECAUCIONES UNIVERSALES” o “PRECAUCIONES STANDARD”, normas de consenso para el
trabajo con pacientes y sus fluidos corporales destinadas a minimizar el riesgo de transmisión de
infecciones entre pacientes y el personal y vice-versa, por contacto con fluidos de alto riesgo,
especialmente la sangre y sus derivados.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Se consideran fluidos de alto riesgo en bioseguridad:
Sangre
Semen
Secreciones Vaginales
Leche Materna
Líquido de cavidades cerradas
Líquido Cefalorraquídeo
Líquido Pleural
Líquido Sinovial
Y todos los otros fluidos que tengan sangre visible
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Todas las muestras o fluidos corporales provenientes de pacientes deben considerarse
siempre como potencialmente infectantes, independiente del motivo de consulta o de diagnóstico
de ingreso, por lo que su manipulación implica la observación permanente de las Precauciones
Universales.
Puedes revisar documentos relacionados a estas Precauciones Universales en:
http://www.enfermeriajw.cl/pdf/GUIACLINICAIIHPrevenciondeExposicionesaSangreymanejoPostexposicion_RES_793_06_09_04.pdf
www.ssvaldivia.cl/hospital/acredita/...iih/04%20NORMA%206.doc
En todo caso, el LAVADO DE MANOS antes de la jornada,
entre pacientes, y al final de la jornada, representa el mejor
ejemplo de una efectiva y sencilla medida de barrera de transmisión
de enfermedades.
Medidas de Contención
Corresponden a la aplicación de las medidas resultantes de la etapa 3ª. Y 4ª. De la Gestión
de Riesgos, es decir las Normas de Bioseguridad y Medidas de Control mencionadas anteriormente
en la página 6.
Podemos clasificar las Medidas de Contención en dos grandes grupos dependiendo del
objetivo de aplicación:
•
Medidas de Contención Primaria: están dirigidas al accionar de las personas, en
ámbitos como la protección de la salud, el manejo adecuado de pacientes y las
condiciones del ambiente de trabajo en el establecimiento de salud. En este grupo
podemos mencionar (entre otras) la acción del Comité de Infección
Intrahospitalaria, la adecuada gestión de abastecimiento en insumos de seguridad,
capacitación específica en bioseguridad, etc.
•
Medidas de Contención Secundarias: están dirigidas a la protección del ambiente,
y se relacionan con el diseño y la calidad de la planta física del establecimiento, y
de la prestación de servicios externos (extracción de basuras, disposición de
residuos hospitalarios).
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Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología
El Laboratorio Clínico, y especialmente la Sección de Microbiología es una importante
fuente generadora de amenazas, debido a la actividad propia de esta unidad asistencial. Por esta
razón, la adecuada capacitación del personal, la descripción de métodos y procedimientos, la
auditoría de normas, los protocolos de acción frente a accidentes, y el diseño de la planta física
son de vital importancia en el control de amenazas.
Al interior de un Laboratorio de Microbiología podemos observar varias medidas de
contención primaria, como lo son:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
los insumos de seguridad personal (pecheras, guantes, antiparras, mascarillas)
soluciones de desinfección
contenedores de material cortopunzante
protocolos de reacción frente a accidentes
filtros de aire de alta eficiencia (HEPA)
lámparas de luz UVC
mechero
tapas de contención de aerosoles (centrífugas)
gabinetes de bioseguridad
o CLASE I: otorga protección para el ambiente y equipos
o CLASE II: otorga protección para el ambiente, equipos y muestras
o CLASE III: protección de alto nivel, aislamiento para el trabajo con agentes
altamente peligrosos.
Niveles de Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología:
El conjunto de medidas de contención primarias y secundarias que se han implementado
en un Laboratorio de Microbiología determinan el NIVEL DE BIOSEGURIDAD de esta dependencia,
es decir el grado de seguridad instalada para el trabajo con agentes biológicos. A mayor peligro
representado por los agentes, mayor nivel de bioseguridad.
Podemos distinguir cuatro niveles de bioseguridad para un laboratorio de microbiología:
•
NIVEL 1:
Instalaciones adecuadas para trabajar con agentes no infecciosos o
que no afectan a personas adultas sanas. Corresponden a laboratorios de
docencia, laboratorios clínicos de baja complejidad o de instalaciones básicas.
Pueden manejarse microrganismos como Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Streptococcus viridans por ejemplo.
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•
NIVEL 2:
Las instalaciones deben poseer gabinetes de bioseguridad de
acuerdo al tipo de agentes que se pretende manejar. Debe existir control de
acceso. Se hace necesario el
contar con protocolos y
aparatos necesarios para la
descontaminación. Corresponde
al diseño de laboratorios de
microbiología clínica o de
investigación, donde se trabaja
con muestras de origen humano,
animal o ambiental, donde es
posible manipular agentes
como Salmonella, Vibrio,
Neisseria gonorrhoeae, muestras para serología viral (Hepatitis B, VIH, Virus
Hepstein Barr).
•
NIVEL 3:
Estos laboratorios están preparados para el trabajo con
microrganismos transmisibles por vía aérea, y tienen potencial para causar
enfermedades graves. Las barreras de contención deben ser suficientemente
fuertes para proteger a los trabajadores al interior, en áreas contiguas, ambiente y
comunidad. Es necesaria la instalación de lámparas UVC, filtros HEPA y gabinetes
de bioseguridad clase II o III. Las instalaciones deben estar preparadas para el
trabajo con agentes como Micobacterias y Micoplasmas.
•
NIVEL 4:
Las instalaciones del laboratorio están preparadas para el trabajo
con agentes extremadamente peligrosos, para los que no existen tratamientos o
vacunas disponibles. Todo tipo de trabajo se realiza al interior de gabinetes de
bioseguridad de Clase III, con ropas o trajes de aislamiento. La planta física tiene
aislamiento total del ambiente y el acceso alto nivel de control. Los agentes que
allí se manejan son generalmente virales (virus de fiebres hemorrágicas).
Podemos plantear la existencia de un quinto nivel de bioseguridad para el
almacenamiento y estudio de agentes creados por la ingeniería genética, agentes biológicos
destinados a uso bélico, agentes de biología desconocida o agentes que han sido erradicados de la
vida libre, para los cuales no se han descrito tratamientos de ningún tipo y que podrían tener
efectos catastróficos en la humanidad.
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Accidentes de bioseguridad en el laboratorio de microbiología:
Los accidentes de bioseguridad que originan contaminación del ambiente o de nuestro
cuerpo pueden ocurrir generalmente por falta de conocimiento o destreza, no usar medidas de
barrera, mantenimiento deficiente de aparatos o gabinetes, falta de capacitación, y relajación en
las medidas de control.
Las vías de infección en este tipo de accidentes son por inhalación, ingestión o percutánea.
Acciones como el trabajar sin guantes al manipular muestras o cultivos, pipeterar directamente
con la boca, olfatear cultivos, no usar mechero para generar un área protegida, pasarse los
guantes usados por la piel, el pelo o la ropa, comer en el laboratorio, no lavarse las manos al
terminar la actividad, constituyen un riesgo de contaminación y eventualmente de infección con
agentes biológicos, tanto para el alumno como para la comunidad.
En el caso de ocurrir cualquiera de estos accidentes que implique contacto con agentes
biológicos, el alumno DEBE AVISAR DE INMEDIATO AL PROFESOR. NO ACTUAR POR INICIATIVA
PROPIA.
Ejercicios de Aplicación de Contenidos
1.- Un sujeto liberó el contenido de un frasco con caldo de cultivo de Vibrio cholerae en un
canal de regadío de hortalizas. Responde lo siguiente:
Señala dos amenazas evidentes en este hecho:
¿Qué clases de amenazas son, de acuerdo a los hechos?
2.- La cepa de Vibrio cholerae resultó no poseer el gen que codifica la enterotoxina. De
acuerdo a los hechos y antecedentes, asigna un valor objetivo y una categoría al riesgo (alto,
medio, bajo). Da dos fundamentos para tu respuesta:
3.- El profesor le entregó a los alumnos del ramo de microbiología unas placas de cultivo
con Escherichia coli, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis.
Averigua respecto del potencial patógeno de estos agentes y ordénalos según peligro de la
amenaza, de menor a mayor.
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4.- Aparte de los microrganismos, hay otras amenazas latentes en el enunciado, discútelas
con otros alumnos y responde cuáles son.
5.- ¿Cuál es la categoría de riesgo que asignarías a un grupo de escolares que tiene a un
compañero de curso con meningitis meningocócica, el que ha sido diagnosticado como caso
índice?
Anota tus fundamentos.
6.- La cepa de Neisseria meningitidis del caso anterior ha sido aislada y referida al Instituto
de Salud Pública (ISP) mediante protocolo de notificación obligatoria. ¿Cuál será la categoría de
riesgo para el microbiólogo del ISP que trabaja con esta cepa, si está en un laboratorio de Nivel III?
Dale valor numérico al riesgo y fundamenta.
7.- Averigua un poco antes de responder, luego propone un nivel de bioseguridad para
trabajar con los siguientes agentes o muestras:
- Determinación de anticuerpos anti VIH
- Urocultivo
- Micobacterium avium
- Vibrio cholerae biotipo El Tor
- Virus EBOLA
- Bacillus pumilus
- Variola virus
- Alternaria solani
8.- Hoy recibiste el honor de ser nombrado Jefe del Comité de Infección Intrahospitalaria.
La Enfermera Jefe del establecimiento te ha solicitado una medida urgente para evitar los
desplazamientos innecesarios del público dentro del establecimiento por el riesgo de introducción
de agentes infecciosos. ¿Qué medida propones, cómo la implementas? Seguramente ya estuviste
en algún hospital y viste la aplicación, trata de acordarte.
Soy una amenaza permanente, no lo olvides.
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Ejercicios de Laboratorio
Actividad n°1:
El ambiente y las personas como generadores de riesgo biológico
Objetivos:
Observar la existencia de agentes microbianos en el ambiente
Determinar la importancia de la manipulación en la transmisión de
agentes infecciosos
Valorar el lavado de manos como medida de barrera
Determinar la importancia de la mascarilla como medida de
barrera.
Material y Método:
36 Placas Petri con Agar Sangre en Base Columbia, mascarillas, jabón y agua.
Trabajar en tres grupos de cinco personas.
El método de trabajo es por simple exposición de material estéril o mediante contacto
con material estéril.
Grupo 1: Exponer una placa de agar al ambiente, sobre el mesón, durante diez
minutos. Colocar los dedos suavemente sobre el agar durante 30 segundos. Cerrar y
rotular.
Grupo 2: Dos alumnos deben realizar lo siguiente: manipular objetos durante tres
minutos, luego colocar suavemente los dedos sobre el agar.
En seguida, el mismo deberá lavarse las manos con el jabón disponible durante tres
minutos, luego debe dejar secar al aire. Colocar suavemente los dedos sobre el agar.
Cerrar y rotular.
Grupo 3: Un alumno deberá leer un texto en voz alta frente a una placa abierta,
durante dos minutos. Otro repetirá lo mismo utilizando mascarilla.
Cerrar y rotular.
Incubar 48 hrs a 30°C, atmósfera aerobia. Refrigerar y observar los resultados en el
paso práctico siguiente.
Discute los resultados con el profesor y tus compañeros.
Anota tus conclusiones:
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Actividad n°2:
Las manos, una eficaz forma de transmitir enfermedades.
Objetivos:
Evaluar la cantidad de bacterias que portamos en nuestras manos.
Comprender el riesgo de transmisión de microrganismos mediante
manipulación.
Valorar el lavado de las manos como medida de barrera.
Material y Método:
500 mL de Caldo Peptonado estéril, envasado en recipientes de boca ancha.
Pipetas estériles
Placas Petri estériles, sin medio de cultivo
Agar Nutritivo standard, envasado en tubos para fundir.
Gradillas.
El método de trabajo consiste en obtener una muestra de un enjuague de manos y
realizar un recuento de las bacterias aeróbicas mesófilas viables, luego calcular el número
total de bacterias en la mano.
Cada grupo de cinco alumnos trabaja de la siguiente forma:
1. Introducir toda la mano en el recipiente de Caldo
Peptonado estéril, realizar fricción con los dedos durante 1 minuto. Retirar
"Todo lo que aquí se
la mano y dejar esta preparación en reposo por 10 minutos al ambiente,
hace me parece muy
inútil; los
con el recipiente tapado.
fallecimientos se
suceden de la forma
2. Fundir dos tubos con Agar Nutritivo Standard en un
más simple. Se
vaso
de
pp.
con
agua corriente mediante ebullición. Una vez fundido,
continúa operando,
sin embargo, sin
retirar del calor y esperar a que se tempere a la temperatura que soporta
tratar de saber
verdaderamente por
la mano (40° a 45°C).
qué tal enfermo
3. Con una pipeta estéril, tomar una muestra de 0,5 mL
sucumbe antes que
otros en casos
del
Caldo
Peptonado
en que hicimos el lavado de manos, y colocarlo en el
idénticos".
centro de la placa de Petri. Repite en otra placa.
Ignacio Felipe
4. Agregar cuidadosamente a las dos placas el Agar
Semmelweis
(1818 -1865)
Nutritivo fundido y mezclar con las muestras mediante movimientos
rotarios suaves. Dejar solidificar en la superficie del mesón sin mover.
5. Una vez sólido rotular e incubar por 48 hrs. a
temperatura ambiente. Refrigerar hasta el paso práctico siguiente.
6. Con un lápiz marcador permanente, dividir las placas
en cuatro cuadrantes por el lado del agar. Contar el número de colonias
presentes en todos los cuadrantes. Cuenta la otra placa y promedia. Esto
representa la cantidad de bacterias vivas en la muestra de 0,5 mL.
7. Calcula ahora la cantidad de bacterias en la mano, plantea una fórmula
matemática de estimación del total y discútela con tus compañeros.
8. Registra tus resultados, plantea un debate con estas observaciones.
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Desinfección y Antisepsia
Bien lo estableció Ignacio Semmelwies (1818-1865) al observar que el uso de ciertos
agentes químicos para sanitizar las manos podía reducir las tasas de infecciones asociadas a la
atención médica, en tanto que Joseph Lister (1827-1912) demuestra que el tratamiento térmico
aplicado a instrumentales es una medida eficaz para disminuir las infecciones post quirúrgicas. En
esta época, Louis Pasteur (1822-1895) recién está demostrando la presencia de microrganismos en
el ambiente, capaces de producir putrefacción y asociándolos a la ocurrencia de enfermedades
infecciosas.
Queda claro entonces, que la acción de agentes físicos y químicos es útil en la contención
de las enfermedades infecciosas. De esta afirmación se desprenden los conceptos de
DESINFECCION Y ANTISEPSIA.
Llamaremos DESINFECCIÓN a la simple descontaminación de un objeto o superficie de
algo, de la que eliminaremos casi todas las formas vegetativas. Es importante recordar que
pueden existir microrganismos con diversos grados de resistencia a los agentes químicos
empleados, que el efecto de estos dependerá de factores como la concentración, el tiempo de
exposición, la naturaleza química del agente, la temperatura, y finalmente la existencia de
mecanismos de latencia en los microrganismos (esporas bacterianas).
ANTISEPSIA son todos los procedimientos encaminados a reducir al máximo la presencia
de microrganismos sobre los tejidos vivos (piel, algunas mucosas) que están en contacto con el
ambiente, aplicando métodos físicos o químicos. El propósito de la antisepsia es conseguir la
ASEPSIA, o ausencia de microrganismos.
Los métodos físicos o químicos empleados para la desinfección y antisepsia tienen
diferencias fundamentales: el daño estructural (en los métodos físicos) y la toxicidad (en los
métodos químicos). Un antiséptico no debe ser tóxico ni dañar la integridad de los tejidos.
Los efectos de los Desinfectantes y Antisépticos pueden ser de dos tipos:
• Bacteriostáticos:
si sólo detienen la proliferación microbiana,
• Bactericidas:
si producen la muerte de los microrganismos.
De acuerdo a los efectos observados, podemos clasificar a estos agentes químicos como de ALTO
NIVEL, NIVEL INTERMEDIO O BAJO NIVEL.
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Los microrganismos presentan distintos grados de resistencia a estos agentes, siendo los
más resistentes Priones y los más susceptibles Virus con manto o envoltura.
El efecto de cualquier
antiséptico o desinfectante puede
verse alterado por la presencia de
suciedad o restos orgánicos. Es
imprescindible retirar todo exceso
de suciedad antes de la aplicación.
La persistencia de tierra,
restos de alimentos, sangre, pus,
secreciones puede implicar el
aumento de la concentración o del
tiempo de exposición al agente
químico.
La elección del desinfectante a usar tiene relación con el objeto que nos interesa
tratar. Existe una categorización de los objetos de uso clínico de acuerdo al riesgo de transmitir
una infección mediante su uso.
El efecto desinfectante
deberá ser mayor cuando se aplique a
objetos críticos, al punto de lograr la
esterilización.
Los agentes químicos
Que pueden ser usados con efecto
esterilizante sobre objetos críticos son
por ejemplo:
GLUTARALDEHIDO AL 2%
GAS OXIDO DE ETILENO
PEROXIDO DE HIDROGENO
ACIDO PER ACETICO AL 2%
El uso de los materiales tratados con estos agentes químicos no puede ser
inmediato debido a su elevada toxicidad, por lo que el proceso de preparación considera un
tiempo de disipación.
18
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Manual de Laboratorio de Microbiología
El efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos:
Los agentes químicos empleados con fines de desinfección y antisepsia, como también los
empleados con fines terapéuticos (antimicrobianos), actúan sobre los micro organismos con la
finalidad de producir una disminución de la carga bacteriana mediante la eliminación de las formas
vegetativas (bactericidas), impidiendo la multiplicación bacteriana (bacteriostáticos) o
definitivamente eliminando toda tipo de forma de vida microbiana (esterilizantes).
El efecto bactericida, bacteriostático o esterilizante dependerá de los siguientes factores:
•
Tipo de agente químico empleado:
o Alcoholes: etanol o isopropanol al 70%
o Alquilantes: Formaldehído, óxido de etileno
o Halogenantes: Hipoclorito, Yoduros
o Surfactantes: compuestos de amonio cuaternario, jabones, triclosán.
o Oxidantes: óxido de etileno, peróxido de hidrógeno, ácido peracético.
o Compuestos fenólicos:
Hexaclorofeno, Clorhexidina.
•
Concentración y Tiempo de acción:
o La eficacia de un agente químico
aumenta con la concentración y el
tiempo de exposición.
•
Naturaleza del microrganismo:
o Los virus sin envoltura son más resistentes que los con envoltura.
o Los micro organismos Gram negativos tienden a ser más resistentes que
los Gram positivos a los agentes químicos,
o Son especialmente resistentes las bacterias que forman endosporas.
o A mayor cantidad de micro organismo, mayor necesidad de concentración
o tiempo de exposición del agente químico.
•
Objeto u objetivo de aplicación:
o Los desinfectantes se pueden aplicar sobre objetos o superficies
inanimadas, la concentración y el tiempo de exposición dependerán de la
resistencia al efecto corrosivo.
o Los antisépticos son por definición de baja toxicidad, y se aplican sobre
tejidos vivos (piel y algunas mucosas) en concentraciones bajas y por
tiempo limitado.
19
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Manual de Laboratorio de Microbiología
•
•
•
Temperatura de aplicación
o En general, los efectos sobre una población microbiana aumenta con la
temperatura
pH de la solución
o El pH adecuado dependerá de la naturaleza aniónica o catiónica del
agente químico. En general, el efecto del pH se relaciona con la capacidad
de ionización tanto del agente químico como de las envolturas celulares
de los micro organismos, por facilitación del transporte de iones en
solución acuosa a través de las estructuras de envoltura.
Presencia de sustancias interferentes:
o Los desinfectantes pueden perder su eficacia por contacto con materia
orgánica contaminante: sangre, secreciones, deposiciones, restos de
alimentos, óxidos.
o Los antisépticos también pierden eficacia si se aplican sobre la piel sucia.
Los efectos de estos agentes químicos se verifican sobre las estructuras de las proteínas
funcionales y estructurales de los microrganismos, y sobre los ácidos nucleicos. Lo anterior implica
alteraciones en la función metabólica, en la estructura y permeabilidad de la membrana celular, y
en la replicación del material genético.
De acuerdo a su eficacia,
podemos categorizar a estos
agentes químicos en tres niveles de
acción.
Los agentes de bajo nivel
tienen efecto limitado, y no
garantizan
una
adecuada
sanitización. Pueden encontrarse al
alcance del público como jabones o
soluciones germicidas de venta
libre.
Los agentes de nivel intermedio tienen mejor efecto, pero no logran la eliminación de
esporas. Se encuentran en este grupo a los alcoholes, los derivados fenólicos, los halogenantes
como el cloro y yodo, y el peróxido de hidrógeno en baja concentración.
Los agentes químicos de alto nivel son muy tóxicos, por lo que no se usan como
antisépticos sino como desinfectantes o esterilizantes dependiendo de su concentración o
toxicidad. En este grupo podemos citar al glutaraldehido, ácido peracético, óxido de etileno,
plasma de peróxido de hidrógeno.
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“Caballeros, yo pudiera señalar a ese líquido [estéril] y decirles: He tomado mi
gota de agua de la inmensidad de la creación, y la he tomado llena de los
elementos convenientes para el desarrollo de seres inferiores. Y espero, observo,
inquiero de ella, suplicándole que comience de nuevo para mí el hermoso
espectáculo de la primera creación. Pero está muda... muda desde el mismo
comienzo de estos experimentos hace varios años; está muda porque la he
mantenido alejada de la única cosa que el hombre no puede producir —de los
gérmenes que se alimentan en el aire— de la vida, porque la vida es un germen y
un germen es vida. Nunca se recobrará la doctrina de la generación espontánea
del golpe mortal de este sencillo experimento.”
Louis Pasteur. 18221822-1895
Efectos de factores de orden físico sobre los microrganismos
La actividad biológica también puede verse alterada por efecto de factores de orden físico.
La simple acción mecánica de arrastre, la abrasión, la desecación y el efecto de la luz solar actúan
en forma natural sobre los microrganismos.
No obstante lo anterior, la humanidad ha desarrollado tecnologías que permiten manejar
los factores físicos para aprovecharlos con el objeto de descontaminar y esterilizar. En este
sentido, son conocidas las aplicaciones de temperaturas (especialmente calor), presión y
radiaciones (luz ultravioleta de onda corta, radiación gamma).
Los factores de orden físico tienen los siguientes efectos sobre los microrganismos:
1.- Efecto de la temperatura:
El frío por lo general tiene efecto bacteriostático, por lo que muchas bacterias pueden
recuperar su actividad si se les regresa a su temperatura vital óptima. En muchas de las especies
bacterianas se observa alguna capacidad de tolerar el congelamiento, resistiendo a la formación
de cristales de hielo en el citoplasma. Esta capacidad de resistencia aumenta cuando estos
organismos se encuentran en un medio rico en proteínas o carbohidratos.
Por el contrario, los efectos del calor pueden ser bactericidas ya que se verifican sobre las
proteínas estructurales o funcionales de los microrganismos. En la medida que aumentamos la
exposición al calor por sobre los rangos de tolerancia vital de una especie bacteriana, comienza a
ocurrir alteración irreversible de la arquitectura proteica, lo que implica un colapso estructural y
funcional. En las bacterias de importancia médica las formas vegetativas, es decir, las que son
aptas para el metabolismo y reproducción resultan destruidas con la exposición a temperaturas
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cercanas al punto de ebullición del agua, condición que solo pueden resistir las esporas
bacterianas.
Efecto del aumento de la temperatura sobre una
población bacteriana.
El aumento de la temperatura por sobre el óptimo
necesario para actividad vital (rango térmico)
conduce a un rápido colapso biológico.
Diferentes bacterias a distintas temperaturas:
A través de la evolución las bacterias han desarrollado adaptaciones para la vida a diversas
temperaturas, por lo que podemos clasificarlas como:
• Bacterias mésófilas, si su actividad vital se desarrolla a temperaturas entre 25° y
45°C, lo que incluye a las patógenas para el ser humano.
• Bacterias psicrófilas, si mantienen actividad entre los 0° y 20°C. En este grupo se
encuentran microrganismos capaces de descomponer alimentos durante la
refrigeración. Algunos patógenos mesófilos pueden tolerar este rango de
temperatura (Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes). Un subgrupo
capaz de tolerar temperaturas algo mas altas son denominadas psicrotrofas.
• Bacterias termófilas, si viven entre 50° y 70°C. Un subgrupo denominado
hipertermófilas es capaz de sobrevivir a temperaturas tan altas como 70° a 110°C.
De acuerdo a esta clasificación, cada especie bacteriana es capaz de vivir en un margen de
temperatura denominado RANGO TÉRMICO, que tiene una amplitud cercana a 35°C.
Margen de crecimiento para distintos
grupos bacterianos
En Staphylococcus aureus y Listeria
monocytogenes estos márgenes tienen
mayor amplitud.
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El tiempo en el que se verifica el efecto letal del calor sobre una población bacteriana
tiene relación inversa con la cantidad de calor aplicada. En otras palabras, para un efecto más
rápido se requiere mayor temperatura.
A este valor de tiempo se le llama TIEMPO DE
REDUCCIÓN DECIMAL (D), y corresponde al tiempo
necesario para dejar solo el 10% de sobrevivientes de
una especie bacteriana al aplicarle un tratamiento
bactericida físico o químico.
En este gráfico, para una especie bacteriana “x”,
se logra dejar el 10% viable en 12 minutos a 60°C. Si se
continúa a la misma temperatura, el 0,1% sobrevive a
los 40 minutos.
Si fijamos la temperatura, el valor D es dependiente de la especie bacteriana: Si tratamos
a una especie bacteriana “x” a 60°C obtenemos un valor D de 12 minutos, si aplico el mismo
tratamiento a la bacteria “y” puedo obtener un valor D diferente.
Esto introduce dos nuevas definiciones:
TIEMPO TÉRMICO MORTAL, que es el tiempo mínimo necesario para inactivar el 100% de
una población bacteriana dada a una temperatura constante.
PUNTO TÉRMICO MORTAL, que es la temperatura mínima necesaria para inactivar
totalmente una población bacteriana en un tiempo fijo de 10 minutos.
Con estos tres conceptos se definen las condiciones ideales para la esterilización mediante
calor, o del tratamiento de alimentos para la máxima reducción de la carga bacteriana sin
alteración de sus propiedades.
Si nos fijamos en el cuadro anterior, existen especies bacterianas que requieren
tratamientos térmicos por sobre la temperatura de ebullición del agua, ya que poseen esporas. La
mejor forma de lograr el efecto de inactivación de estos microrganismos sin alterar los materiales
es combinar calor, agua y presión, en un sistema cerrado y controlado que conocemos como
AUTOCLAVE.
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La aplicación calor y vapor bajo
presión realizada en el autoclave es uno
de los procedimientos de esterilización
más utilizados en la preparación de
materiales para la medicina, ya que
asegura en forma eficiente la eliminación
de formas vegetativas y de resistencia
(esporas) de todo tipo de microrganismos,
a la vez que destruye virus y priones.
Este proceso es fácil de controlar, es rápido
y eficaz.
Esporas de Bacillus anthracis, Tinción de Gram 1500x
En general, los materiales a tratar mediante autoclavado se exponen durante 15 minutos a
121°C, sin embargo este standard puede variar en función del volumen de materiales a tratar o de
la naturaleza de estos, de modo que siempre se debe considerar el tiempo necesario para que el
núcleo de los paquetes de materiales alcance la exposición necesaria, o para que los agentes
microbianos alcancen el tiempo térmico mortal.
2.- Efectos de las radiaciones:
La radiación es una propagación de energía en forma de ondas electromagnéticas de
distinta longitud. Llamaremos longitud de onda λ a la distancia que hay entre dos puntos máximos
o mínimos de ella (ver figura). De acuerdo a las distintas longitudes de onda de las radiaciones,
estas se agrupan en el ESPECTRO ELECTROMAGNETICO de emisión/absorción.
En este ordenamiento podemos situar en
el extremo de ondas más largas a la
radiación infrarroja caracterizada por la
emisión
de
calor,
y
en
el
extremo de ondas más cortas a los rayos
cósmicos. Entre este amplio rango de
frecuencias podemos encontrar a la luz
visible, los rayos X y los rayos gamma.
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Amplitud del espectro electromagnético
La aplicación de calor con fines bactericidas es esencialmente una forma de aplicación de
radiación, no obstante tenemos otras alternativas de aplicaciones bactericidas de las ondas
electromagnéticas, tales como la luz ultravioleta (UV) de onda corta (Luz UVC) y la radiación
gamma.
La cantidad de energía transmitida por la onda es directamente proporcional a su longitud,
y esta cantidad de energía es capaz de producir cambios en los cuerpos que la absorben. De esta
forma, las ondas de baja energía como la luz visible y UV provocan cambios químicos NO
IONIZANTES. En la medida que aumentamos la energía en la radiación esta se hace más
penetrante y los efectos se tornan IONIZANTES, capaces de causar la muerte celular.
La Luz Ultravioleta (UV):
Con una longitud de onda un poco más corta que la luz visible, se sitúa en este espectro a
la luz ultravioleta (UV). Todos hemos sentido los efectos de la luz UV de onda larga UVA cuando
nuestra piel se expone a la luz solar y se broncea; con algo más de energía la luz UVB la exposición
prolongada es capaz de causarnos daño en la piel, y eventualmente alteraciones celulares.
Afortunadamente la atmósfera con su capa de ozono nos protege de los mortales rayos de la luz
UVC que proviene del sol, ya que estos poseen una mayor capacidad de penetración y de daño por
ionización.
Todos los compuestos químicos tienen la propiedad de absorber energía en forma de
alguna determinada longitud de onda relacionada con su estructura molecular. Este principio
permite utilizar a la luz UVC con fines bactericidas debido a que la longitud de onda de esta luz
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(283 a 200 nm) es coincidente con el máximo de absorción de la molécula de ADN y ARN (260 nm)
y con los máximos de absorción de las proteínas (280 y 230 nm).
Los fotones de alta energía emitidos por una
fuente de luz UVC son capaces de romper enlaces de
las bases nitrogenadas pirimídicas (Citosina C, y Timina
T) del ADN bacteriano, generando FOTOPRODUCTOS
químicos que imposibilitan la correcta replicación o
transcripción de la información genética, por ejemplo,
dímeros anómalos de T-T o C-C.
En las proteínas, estos fotoproductos se originan por la alteración de aminoácidos
aromáticos (Triptofano, fenilalanina, tirosina), o por ruptura de los enlaces peptídicos. Ambos
efectos causan alteraciones de la estructura y funcionalidad proteica.
De esta forma, la energía de los fotones UVC causa efectos mutagénicos secundarios o
efectos letales por inactivación del material genético. A pesar de esto, existen bacterias con la
capacidad de reparar los efectos de la luz UVC mediante mecanismos enzimáticos inducibles.
Aplicaciones de la Luz UVC:
La luz UVC tiene aplicaciones bactericidas eficaces en la esterilización del aire, agua y
superficies, siempre y cuando la dosis de energía que reciben las bacterias sea la adecuada.
Debemos recordar que la cantidad de energía disminuye con respecto al cuadrado de la distancia
de la fuente de emisión, y que la cantidad de energía emitida depende de la potencia de la fuente.
Una lámpara UVC de Hg de 40 W de potencia es eficaz a un metro de distancia, en tiempos de
exposición de segundos, inactivando cerca del 99% de las formas vegetativas bacterianas.
Dosis de energía de Luz UVC para efecto letal en algunos agentes infecciosos
Microorganismo
Esporas de Bacillus subtilis
Legionella pneumophyla
Virus de la Hepatitis A
Salmonella typhi
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Virus de la Influenza
Streptococcus sp.
Dosis letal en µW/cm²
22.000
12.300
8.000
7.000
6.600
6.600
6.600
3.800
Podemos instalar una fuente de emisión de luz UVC asociada a sistemas de purificación de
agua, o de purificación de aire filtrado o acondicionado, como medida de barrera para mejorar la
calidad sanitaria del ambiente. Ejemplo de esto es la aplicación de luz UVC para la inactivación de
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Legionella pneumophila en sistemas de acondicionamiento de aire, ya que este patógeno tiene
como reservorio el agua de condensación que se forma en estos equipos.
La luz UVC es invisible al ojo humano, las
fuentes de emisión UVC se ven iluminadas
con una luz celeste a o “luz parásita” de
mayor λ que corresponde a solo el 2 a 5%
de la emisión.
Equipo de aire acondicionado con trampa de Luz UVC
Por lo anterior, las fuentes de emisión UVC
son peligrosas, capaces de provocar
quemaduras en la piel y daño irreversible
en los ojos.
La Radiación Gamma:
La radiación gamma es un tipo de energía electromagnética caracterizada por la emisión
de fotones producto de la desintegración de elementos radiactivos (isotopos) como Co60 y Cs137.
Esta radiación es muy penetrante debido a su alto nivel de energía, y sus efectos son IONIZANTES.
La radiación gamma realiza su acción mediante el choque de los fotones de alta energía
con los átomos del material que los recibe.
Los efectos de la ionización de la radiación gamma pueden alterar significativamente el
material genético, causando la muerte celular. Estos efectos pueden ser de tres tipos:
•
•
•
Efecto letal directo: ruptura de enlaces de bases nitrogenadas y entrecruzamiento
de las hebras de ADN. Ocurre con exposición a altas dosis de radiación.
Efecto letal indirecto, por ionización de las moléculas de agua (radiolisis del agua).
Este efecto libera grandes cantidades de H+ y grupos hidroxilo OH-. Los radicales
OH- pueden combinarse con el ADN o con el oxígeno libre para generar peróxidos
(H2O2) que actúan oxidando los componentes de la estructura bacteriana.
Efecto mutagénico: causado por dosis menores de radiación, genera alteraciones
en el ordenamiento del ADN bacteriano y originando replicaciones y
transcripciones alteradas.
Los efectos serán mayores dependiendo del aumento de la dosis de radiación. La radiación
absorbida se mide en unidades RADS o Gigaray (Gy). La capacidad de las bacterias para soportar la
radiación puede ser muy variable, pero bastante mayor que la del ser humano. La dosis letal de
radiación para un humano adulto es cercana a los 10 Gy, en tanto que para las bacterias varía
entre 200 Gy y 3000 Gy. Existen especies bacterianas capaces de soportar niveles de radiación de
5000 o más Gy (5000 Gy es 5 kGy).
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Esterilización:
Como ya hemos visto, existen varios procesos que pueden afectar la viabilidad de los
microrganismos. Podemos distinguir aquellos destinados a disminuir la carga microbiana como lo
son la desinfección o antisepsia si es por métodos químicos, y la pasteurización si es por métodos
físicos mediante tratamiento térmico. La esterilización en cambio tiene efectos letales sobre toda
forma de vida.
Se entiende por esterilización todos los procesos físicos, químicos (o combinaciones de
éstos) que tienen como propósito erradicar toda forma de vida, incluyendo esporas, virus y
priones. La esterilización es esencialmente un concepto radical.
Cualquiera sea el proceso que elijamos para tratar nuestros materiales, debe tener como
requisito la eliminación de las formas más resistentes de vida (ver pgs. 18-23-27), sin alterar la
estructura o las propiedades de los materiales. Por lo tanto, la esterilización es el RESULTADO
FINAL DEL PROCESO, y no la mera exposición a los agentes químicos o físicos. En este proceso se
cuentan además una serie de etapas previas tendientes a asegurar el éxito, tales como
descontaminación, inspección, preparación y empaque de materiales, exposición al proceso,
almacenaje y despacho de estos.
Procesos químicos de esterilización:
Consisten en la aplicación de agentes químicos como gas Oxido de etileno (ETO), vapores
de formaldehido, o gas-plasma de peróxido de hidrógeno asociados a bajas temperaturas (50°a
60°C) en una cámara de tratamiento de control automático. Los objetos a tratar son plásticos con
capacidad de resistir algo de temperatura, látex, gomas o polímeros, o instrumentos sensibles a
altas temperaturas y humedad. Ejemplos de materiales a tratar son: sondas, endoscopios diversos.
Parámetros de esterilización para Gas de ETO:
Temperatura
35°C
55°C
Tiempo una vez alcanzada la temperatura, humedad
sobre el 40% y presión del gas entre 450 y 740 mg./lt.
5 hrs.
2,5 hrs.
Algunos agentes químicos pueden aplicarse como solución. El glutaraldehido al 2%
aplicado durante 20 a 30 minutos y el ácido peracético al 0.2% durante 15 minutos a 55°C, luego
de enjuagado con agua estéril permite la esterilización de plásticos y gomas termosensibles, y
metales sensibles al calor.
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Procesos físicos de esterilización:
Estos procesos emplean factores como la exposición a calor o radiaciones.
Destaca en este tipo de procesos el AUTOCLAVADO, tratamiento de materiales resistentes
al calor mediante la exposición a vapor a alta presión. Los materiales que pueden someterse a este
proceso son por ejemplo: ropas, gasas, vendas, plásticos resistentes al calor, instrumental
quirúrgico, vidrio, y algunas soluciones.
El standard de tratamiento es de 15 minutos a 121°C, pero puede variar en función de la
carga de materiales en el autoclave, de la naturaleza de éstos y del tamaño de los paquetes. Un
paquete de gran volumen requiere mayor tiempo de exposición para lograr que el núcleo del
material alcance la temperatura durante el tiempo necesario. Es posible reducir el tiempo de
tratamiento aumentando la temperatura en el proceso. Observa la tabla siguiente, que relaciona
tiempo, temperatura y presión:
Tiempo desde que alcanza temperatura y
presión
15 minutos
10 minutos
3 minutos
Temperatura
Presión
121°C
126°C
134°C
1,5 Atm.
2,0 Atm.
2,9 Atm.
En la siguiente tabla podrás observar distintas modalidades de procesos de esterilización:
Material
Líquidos
Algodones
Artículos de goma
o látex
Algodón y gasas
Siliconas
Plásticos
Acero inoxidable
Aluminio
Maderas
Vidrios
Aceites y
petrolatos
Método de
esterilización
Parámetros de
esterilización
Autoclave
Autoclave
Autoclave
134 o 135° C
134 o 135° C
121°C
Autoclave
Autoclave
Oxido de etileno
Plasma Formaldehído
Formaldehído
134 o 135° C
121°C
37° - 55°C
50°C
Autoclave
Estufa por calor seco
Autoclave
Estufa por calor seco
Autoclave
Autoclave
Estufa por calor seco
Estufa a calor seco
50 – 60°C
134 o 135°C
180°C
134 o 135°C
180°C
134 o 135°C
134°C
160 – 180°C
180°C
Consideraciones
Equipo con ciclo de líquidos
De preferencia utilizar
soluciones estériles de
fábrica
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La esterilización mediante vapor a alta presión es un proceso seguro y rápido, que además
implica menor consumo de energía.
Otra alternativa de tratamiento térmico para lograr la esterilización es la exposición a calor
seco, para lo que se utiliza el equipo comúnmente conocido como PUPINEL, que puede funcionar
mediante convección de aire caliente, sea de tipo gravitatoria o mecánica. En este tipo de equipo,
el standard de aplicación del proceso consiste en elevar la temperatura de la cámara hasta 180°C,
luego un período de exposición mínimo de 30 minutos y finalmente un tiempo de enfriado. Con
todo, este proceso puede tener un ciclo total de unas tres horas y consume gran cantidad de
energía eléctrica. Igualmente, el tiempo de exposición es dependiente de la temperatura:
Temperatura
180ºC
170ºC
Tiempo desde que se alcanza la
temperatura
30 minutos
60 minutos
160ºC
150ºC
140ºC
121ºC
120 minutos
150 minutos
180 minutos
360 minutos
Los materiales que pueden esterilizarse mediante calor seco son polvos (talco), aceites,
petrolato, vaselina, los que no son aptos para tratamiento en autoclave. Este tipo de tratamiento
daña el templado del acero quirúrgico y puede provocar carbonización en textiles.
Control de los procesos y aseguramiento de calidad:
Desde el punto de vista de la bioseguridad, los procesos de esterilización deben ser sujetos
de certificación. Esta condición implica poder auditar y trazar toda la aplicación del proceso, desde
la recepción de los materiales hasta el usuario final, de modo de poder garantizar la inocuidad de
los materiales sometidos a esterilización.
Para efecto del control del proceso, se aplican INDICADORES DE ESTERILIZACIÓN:
Indicadores Físicos
En cada ciclo de Esterilización
Indicadores Químicos
Indicadores Biológicos
En cada paquete a esterilizar.
1.- Semanal en todos los equipos de
esterilización
2.- En todas las cargas que contienen
implantes
3.- Después de cada reparación del
equipo
Los indicadores físicos son los manómetros, termómetros, higrómetros y registros
emanados de los equipos, y no están a la vista del usuario final de los materiales.
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Los Indicadores químicos pueden observarse en todos los paquetes de materiales
sometidos a esterilización, deben estar siempre a la vista del usuario quién debe observar el viraje
del indicador a modo de control visual.
Estos indicadores son sustancias que
cambiarán de color cuando se alcance la
temperatura de tratamiento, o la concentración
del agente esterilizante. En ningún caso garantizan
el cumplimiento del proceso completo.
Los indicadores biológicos son la garantía más segura
de la eficacia del proceso, ya que consisten en dispositivos que
contienen bacterias vivas seleccionadas para el control de
esterilización, las que deben resultar inactivadas. El usuario de
materiales estériles no tendrá a la vista este tipo de controles,
pero puede consultar la validación del proceso mediante certificados.
Como conducta segura antes de utilizar un material supuestamente estéril, debemos
observar que el envoltorio (envase) esté siempre indemne, que tenga la fecha de aplicación del
proceso y de vencimiento, y que el viraje de los indicadores químicos sea categórico.
Ernst von Bergmann
(1836 -1907)
En 1896, el cirujano alemán Ernst von
Bergmann, creador del concepto de asepsia
quirúrgica, introduce el uso del autoclave,
aparato que utilizó en forma permanente para
aplicar calor bajo presión en el tratamiento de
la ropa para cirugía.
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Elección del proceso adecuado:
Como hemos visto, existe una gran variedad de procesos posibles para lograr la
esterilización, la elección del más adecuado dependerá del tipo de materiales a tratar, de la
toxicidad residual, de la eficacia del proceso y de la economía de su aplicación. A modo de guía
comparativa puedes observar la siguiente tabla (se excluye la radiación ionizante):
Ventajas y limitaciones de los distintos métodos de esterilización
Método
Autoclave a vapor
Calor seco
Ventajas
Ciclos más cortos.
Menor costo de operación.
Efectivo frente a la eliminación
de priones.
No presenta toxicidad para el
personal ni para el ambiente.
Certificable.
Equipamiento de menor costo
que el autoclave
Facilidad de operación de los
equipos
Oxido de etileno
Permite la esterilización de
material termosensible
Certificable
Buena penetración
Plasma
Baja temperatura.
Ciclos de corta duración.
No tóxico para las personas ni
para el ambiente.
No requiere instalaciones
especiales
Rápido
Efectivo en la esterilización
de endoscopios y
laparoscopios
Equipo automático
estandarizado
No contamina al medio
ambiente
Baja temperatura.
Ciclos de corta duración.
Certificable
Acido peracético
líquido
Formaldehído
Limitaciones
Método no compatible con
Material termosensible.
No elimina pirógenos.
No esteriliza sustancias oleosas ni polvos.
Daño del material por exposición a
temperaturas elevadas.
Tiempos de exposición prolongados en
comparación con la esterilización a vapor.
Dificultad en la certificación del método.
Costos de operación elevados.
No hay información respecto a su
efectividad contra priones
Requieren períodos prolongados de
proceso y aireación.
No es un método efectivo contra priones
Tóxico para el personal, pacientes y
ambiente
Incompatibilidad con algunos materiales.
Controversia respecto a su utilización en
artículos con lúmenes largos entre 1 y 2 mt.
y angostos (entre 1 y 3mm).
No elimina priones
Sólo puede ser utilizado para material
sumergible
Esteriliza un solo contenedor por ciclo por
lo que no puede ser utilizado para
cantidades mayores de material
No elimina priones
Debe ser utilizado en forma inmediata
Incompatibilidad con algunos materiales.
Método no aprobado para su utilización en
USA
No elimina priones
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Puedes obtener mayor información en:
www.enfermeraspabellonyesterilizacion.cl/trabajos/plasma.pdf
juridico1.minsal.cl/RESOLUCION_1665_01.doc
Ejercicios de Aplicación de Contenidos
1.- Si para el lavado de manos usas un jabón germicida con amonio cuaternario, ¿Qué nivel
de acción germicida tiene?
2.- Dado el uso médico del objeto y su riesgo de transmitir agentes infecciosos, ¿Cómo
clasificas a un termómetro?, ¿Cómo lo desinfectas?
3.- ¿Qué agente químico utilizarías para desinfectar un endoscopio?, ¿Qué nivel de
desinfección debe obtenerse?
4.- Un trabajador agrícola debe someterse a hidratación parenteral urgente. ¿Cuál sería la
secuencia de acciones más correcta al instalar el tratamiento? Nombra los agentes químicos a
usar.
5.- ¿Qué precauciones deben tomarse antes de usar objetos esterilizados con óxido de
etileno?
6.- ¿Qué método de esterilización físico es adecuado aplicar a materiales plásticos
sensibles al calor?
7.- En un evento de intoxicación alimentaria se determinó la presencia de Staphylococcus
aureus en una partida de queso que se mantenía en una vitrina refrigerada de un supermercado.
Si la cadena de frio es adecuada, ¿Cuál puede ser el “generador” o reservorio en este evento?,
¿Qué características especiales tiene Staphylococcus aureus?
8.- Describe por qué razón el tratamiento standard de esterilización por vapor bajo presión
considera una exposición de materiales durante 15 minutos a 121°C y 15 lb de presión.
9.- Explica como la acción de los rayos gamma sobre las moléculas de agua afecta
indirectamente a las bacterias.
10.- Explica cuál sería tu método de elección para la esterilización de ropa quirúrgica de
algodón.
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Ejercicios de Laboratorio
Actividad n°3:
Objetivos:
Aislamiento de bacterias a partir de muestras médicas I.
Practicar la toma de muestra faríngea.
Practicar la metodología de siembra de muestras microbiológicas
en medios de cultivo sólidos.
Reconocer materiales y estrategias de cultivo.
Practicar juego de roles médico – paciente.
Materiales y método: Toma de muestras y siembra de secreción faríngea sobre Agar
Sangre en base Columbia.
Disponer de tórulas estériles para toma de muestras, baja lenguas,
guantes, portaobjetos, placas de agar sangre Columbia.
Formar un grupo de trabajo de cinco alumnos.
Toma de muestras:
Explique a su paciente que procedimiento le va a hacer. Use
guantes.
Pídale que abra bien la cavidad bucal y saque la lengua.
Deprima la lengua con un baja lenguas y observe el estado de la
cavidad oro faríngea. Busque sitios con signos inflamatorios o la
presencia de pus, especialmente cerca de las amígdalas.
Mientras mantiene la boca abierta y la lengua deprimida, con una
tórula estéril tome una muestra de secreción faríngea en forma
rápida y precisa, sin dañar a su paciente. El procedimiento puede
ser algo molesto.
Siembra:
Disponga de una placa de Agar Sangre Columbia y rote la tórula en
un punto periférico. Luego dibuje una estría sobre el agar con la
misma tórula. Descarte la tórula en un recipiente con solución
clorada. Identifique la siembra con el nombre de su paciente y
luego incube a 35 a 37°C por 24 horas.
Observe el desarrollo de distintas colonias bacterianas, ponga
atención a los efectos del desarrollo bacteriano sobre la sangre.
Examen directo:
Este procedimiento es parte integral del examen microbiológico de
la faringe y es de mucha utilidad, ya que le permitirá mediante Tinción de Gram y evaluar
el estado inflamatorio y la presencia de bacterias patógenas. Tome otra muestra faríngea
de acuerdo a lo descrito y colóquela en el centro de un portaobjetos limpio, mediante
rotación suave. Reserve para realizar la actividad n° 7.
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Ejercicios de Laboratorio
Actividad n°4:
Objetivos:
Aislamiento de bacterias a partir de muestras médicas II.
Practicar la metodología de siembra de muestras microbiológicas
en medios de cultivo sólidos.
Reconocer materiales y estrategias de cultivo.
Practicar juego de roles médico – paciente.
Intentar el diagnóstico del estado de portador nasal de
Staphylococcus aureus.
Materiales y método: Toma de muestras y siembra de secreción nasal sobre Agar Sangre
en base Columbia. Los materiales son los mismos de la actividad
n°3.
Toma de Muestras:
Explique a su paciente el procedimiento. Use guantes.
Pida al paciente que incline la cabeza ligeramente hacia atrás.
Con una tórula estéril frote el piso y las paredes de la ventana
nasal. Prepare una lámina para el examen directo.
Siembra:
Tome otra muestra nasal y siembre una placa de Agar sangre
Columbia de acuerdo a lo descrito en la actividad n°3. Identifique
con el nombre del paciente y luego incube por 24 horas a 35 –
37°C
Observe el desarrollo de distintas colonias bacterianas, ponga
atención a los efectos del desarrollo bacteriano sobre la sangre,
especialmente aquellas que presentan pigmento dorado y que
causan aclaramiento (hemolisis) alrededor.
Actividad
hemolítica
(beta
hemolisina)
Staphylococcus aureus sobre Agar sangre Columbia.
de
Los agares sangre sin otros aditivos son
medios de cultivo nutritivos de uso general, y
permiten el desarrollo de la mayoría de las
bacterias que no tienen requerimientos
nutricionales especiales. Soportan bién el
crecimiento de las bacterias de la microbiota
normal y de la gran mayoría de los patógenos para
el ser humano. Son ejemplos:
Agar sangre en base Columbia
Agar sangre en base Soya – Tripticasa
Agar sangre en base Infusión.
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Ejercicios de Laboratorio
Actividad n°5:
Objetivos:
Aislamiento de bacterias a partir de muestras médicas III.
Practicar la metodología de siembra de muestras de deposiciones
sobre medios de cultivo sólidos.
Reconocer materiales y estrategias de cultivo.
Observar el desarrollo de enterobacterias y su actividad
metabólica.
Materiales y método: Toma de muestras en medio de transporte y siembra de
deposiciones sobre Agar MacConkey o Agar XLD (Xilosa-LisinaDesoxicolato).
Toma de muestras:
Siembra:
Use guantes. Tome una muestra de deposiciones con tórula estéril
y luego introdúzcala en un medio de transporte Cary – Blair.
Siembre con la tórula un punto periférico sobre Agar MacConkey o
Agar XLD. Vuelva la tórula a su envase.
Prepare una lámina para el examen directo, según lo descrito en la
actividad 3. Cuide de no contaminar.
Esterilice un asa de siembra por incineración. Espere a que se
enfríe y luego realice la siembra SUAVEMENTE de acuerdo a la
figura de la actividad 3.
Identifique con el nombre del paciente e incube 24 horas a 3537°C. Después observe el desarrollo de colonias y comente.
Cultivo de Escherichia coli sobre Agar
MacConkey. Las colonias se observan
rosadas por efecto de la fermentación de
la lactosa contenida en el medio de cultivo.
El halo de precipitación que rodea las
colonias se forma por efecto del pH ácido
sobre las sales biliares que contiene la
fórmula.
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Cultivo de Escherichia coli sobre Agar XLD.
Las colonias se observan amarillas por
efecto de la fermentación de la Xilosa,
lactosa y sacarosa. El halo de precipitación
ocurre por acción del pH ácido sobre el
desoxicolato.
Se observan cuatro colonias negras,
productoras de H2S, que pueden
corresponder Proteus sp.
Salmonella typhimurium sobre Agar XLD.
Las colonias se observan negras por la producción de H2S.
Las especies de Salmonella degradan el aminoácido Lisina
(Lisina decarboxilasa), por lo que se produce elevación del
pH y viraje hacia el rojo.
Los Medios de cultivo Agar MacConkey y Agar XLD son selectivos
para enterobacterias, (Gram negativas que habitan en el intestino)
ya que su composición contiene sales biliares que inhiben el desarrollo
de bacterias Gram positivas. El Agar XLD tiene mayor concentración de sales biliares, por lo que su
efecto inhibidor es mayor, y permite una mejor recuperación selectiva de enteropatógenos como
lo son Salmonella sp. y Shigella sp.
Existen muchas fórmulas de medios de cultivo selectivos, la mayoría tiene por objeto
facilitar la recuperación de agentes patógenos por inhibición de la flora acompañante, por lo que
pueden usarse para la siembra primaria, es decir directamente de la muestra.
Algunos ejemplos de medios selectivos son:
Agar TCBS:
Agar SS:
Agar Thayer Martin:
Agar Baird Parker:
cultivo de Vibrio cholerae
cultivo de Salmonellas y Shigellas
cultivo de Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis
cultivo de Staphylococcus aureus
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Ejercicios de Laboratorio
Actividad n°6:
Objetivos:
Observación macroscópica de un cultivo y aislamiento de cepas.
Observar la morfología colonial.
Observar los efectos del desarrollo bacteriano sobre el medio de cultivo
(bioquímica, acción de hemolisinas).
Apreciar la diversidad de la microbiota y sus diferencias.
Practicar el aislamiento a partir de un cultivo de fase sólida, mediante asa.
Materiales y método: Use sus cultivos de la actividad n°5.
Placas de Agar sangre (cualquier fórmula base)
Asas de siembra.
Bioseguridad:
Trabaja con bacterias no identificadas aisladas de humanos, no está
descartada la presencia de patógenos en los cultivos.
No olfatear los cultivos.
Use guantes, mechero encendido.
No exponga los cultivos innecesariamente.
Desarrollo:
- Observe atentamente el cultivo y registre las características según la
tabla adjunta.
- Con un lápiz marcador, divida en dos con una línea central una placa de
agar sangre.
- En su cultivo, elija dos colonias diferentes que le parezcan interesantes.
- Con el asa estéril y fría, toque una de ellas y luego siembre un sector del
agar sangre. Esterilice el asa, enfríe, y repita con la otra colonia en el otro
sector. Incubar 24 horas entre 35° y 37°C. Identifique siempre sus cultivos.
Morfología colonial bacteriana
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MORFOLOGÍA COLONIAL
ASPECTO DE LA COLONIA COLONIA 1 COLONIA 2
Tamaño:
Grande
Mediano
Pequeño
Superficie:
Plana
Planoconvexa
Convexa
Acuminada
Umbilicada
Papilada
Lisa
Rugosa
Forma:
Puntiforme
Circular
Filamentosa
Irregular
Rizoide
Fusiforme
Cerebriforme
Borde:
redondeado (entero)
Ondulado
Lobulado
Espiculado
Filamentoso
Rizoide
Brillo:
Opaco
Brillante
Consistencia:
Húmeda
Seca
Cremosa
Pigmento (Color):
Propio
Difusible
Hemolisinas:
Alfa hemolítica
Beta hemolítica
Gamma hemolítica
La observación de la morfología colonial es
el primer paso orientativo a la identificación de
especies bacterianas.
En la medida que el bacteriólogo adquiere
experiencia, esta etapa del cultivo le permite
tomar decisiones respecto de la marcha de
identificación, a la vez que apreciar las
proporciones en las que se desarrollan las
distintas especies, y la carga microbiana de la
muestra.
La presencia de colonias pigmentadas es
orientativa de algunos patógenos como
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas
aeruginosas, Serratia rubidea y el anaerobio
Prevotella melaninogenica.
La acción de las hemolisinas también es un
índice de mecanismos de acción patógena.
Muchas cepas de Staphylococcus aureus son beta
hemolíticas (Hemolisis total), así como también
Streptococcus pyogenes (Streptococcus beta
hemolítico del grupo B).
La consistencia cremosa nos orienta hacia
levaduras, como Candida albicans. Si la colonia
tiene una consistencia mucosa, con tendencia a
escurrir o a filamentar, podemos estar en
presencia de alguna bacteria capsulada, como
Klebsiella pneumoniae.
Los hongos miceliados producen grandes
colonias filamentosas, con centros pigmentados de verde, negro o café, debido a la presencia de
sus mecanismos de reproducción asexuada (esporas fúngicas). Esta descripción es consistente con
especies de los géneros Penicillium, Aspergillus o Alternaria respectivamente.
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