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Acta Otorrinolaringol Esp 2005; 55: 143-146
INVESTIGACIÓN BÁSICA
Estudio por inmunohistoquímica de la expresión
de EGFR en carcinoma de células escamosas
de cabeza y cuello
X. Altuna Mariezkurrena1, J. Algaba Guimerá1, J. Wang Rodríguez2, R. Weisman3, W. Ongkeko3
1
Servicio de Otorrinolaringología, Hospital Donostia, San Sebastián, España. 2Department of Pathology, University of California, San Diego y
VA San Diego Healhcare System, San Diego, California, USA. 3Department of Surgery, Head and Neck division, University of California,
San Diego, San Diego, California, USA.
Resumen: EGFR es un receptor transmembrana miembro de
la familia de tirosín-kinasas que traduce señales tanto del
exterior como del interior de la célula y juega un papel importante en numerosos procesos que afectan a la evolución
del tumor, crecimiento, progresión, diferenciación, inhibición de apoptosis y al desarrollo de metástasis. Su expresión mediante inmunohistoquímica en carcinoma de células
escamosas varía entre el 40-80% y se le ha adjudicado un
valor pronóstico independiente en estos carcinomas. El objetivo del presente estudio es el de analizar por inmunohistoquímica la expresión de esta proteína en una serie de carcinomas epidermoides de cabeza y cuello y correlacionarlo
con parámetros clínico-patológicos y supervivencia. Se realiza inmunohistoquímica de 44 muestras en las que el 41% es
positivo. A pesar de no haber encontrado relación con el
pronóstico de estos pacientes, la presencia de EGFR es muy
importante por el hecho de que existen fármacos y agentes
químicos capaces de inhibir su actividad.
Palabras clave: Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello.
EGFR. Inmunohistoquímica.
Immunohistochemistry study of EGFR expression in
head and neck squamous cell carcinoma
Abstract: EGFR is an important transmembrane receptor
member of the family of tyrosine kinases, that translates
signals from both outside and inside the cell and plays a
key role in numerous proceses that affect tumour development, growth, progresion, differentiation, inhibition of
apoptosis and metastasis. Immunohistochemistry studies
have shown that 40-80% of head and neck squamous cell
carcinomas express EGFR and it has been suggested as a
Correspondencia: X. Altuna Mariezkurrena
Servicio de ORL. Hospital Donostia.
C/ Dr. Beguiristain, s/n. San Sebastián (Guipúzcoa)
Fecha de recepción: 26-10-2004
Fecha de aceptación: 8-2-2005
potential independent prognostic parameter. The objective
of this study is to evaluate by immunohistochemistry the
expresión of EGFR in a series of Head and Neck Squamous
Cell Carcinoma and correlate it to clinico-pathological features and prognostic significance. We investigated expression
of EGFR in 44 samples. There was a high expression in 41%
of the cases. Even if we have not found that the expression
of EGFR correlated with the prognosis of these patients the
presence of EGFR is very important because there are chemical agents or drugs that can inhibit its activity.
Key words: Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. EGFR.
Immunohistochemistry.
INTRODUCCIÓN
El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello
(CCECC) es el sexto tumor sólido más frecuente en el mundo y el tumor maligno más frecuente del tracto aéreo-digestivo superior. Las opciones terapéuticas son limitadas y alrededor de la mitad de los pacientes diagnosticados de un
carcinoma de cabeza y cuello muere antes de los 5 años a
pesar de estos tratamientos1,2. Hasta la fecha el pronóstico
de estos pacientes sólo podía preverse según la clasificación
TNM del tumor3.
En los últimos años se han descrito muchos marcadores biológicos en los tumores de cabeza y cuello. No obstante, en estudios recientes se ha sugerido valor pronóstico en
los siguientes marcadores: mutaciones del p534, sobre-expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR: epidermal growth factor receptor)5, sobre-expresión de
la ciclina D16 y del factor de crecimiento tumoral-α (TGF-α:
tumor growth factor-α)5.
EGFR es un receptor transmembrana miembro de la familia de tirosín-kinasas (TK). Al igual que otros receptores
TK, traduce señales tanto del exterior como del interior de
la célula y juega un papel importante en numerosos procesos que afectan a la evolución tumoral, crecimiento, progresión, diferenciación, inhibición de apoptosis y desarrollo de
metástasis7.
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X. ALTUNA ET AL.
Porta con
muestras
1
4
7
10
2
5
8
11
3
6
9
12
12 muestras por porta
1
Muestras
fijadas en
formalina
4
2
5
3
6
Bloque de parafina
Figura 1. Diagrama de un bloque y porta multi-muestra.
La presencia de EGFR es muy importante no sólo por su
valor pronóstico sino también por el hecho de que existen fármacos y agentes químicos capaces de inhibir su actividad7-9.
En este estudio hemos querido investigar la expresión
de EGFR en los CCECC así como observar si existe en nuestra muestra alguna relación entre su expresión y la localización del tumor, el grado histológico y la supervivencia.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestras estudiadas
Se han estudiado 44 casos de pacientes con diagnóstico
de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello
(CCECC) operados durante los años 1999-2003 en el Hospital Veterans Affair (VA) de San Diego, California, Estados
Unidos. Todas las muestras fueron procesadas en el Departamento de Anatomía Patológica y Servicio de Laboratorio
del VA de San Diego. El tiempo de seguimiento medio ha
sido de 18 meses (rango 1-72 meses). Las secciones teñidas
con hematoxilina-eosina fueron revisadas por uno de los
autores (JWR) y se realizaron bloques con seis tejidos para
facilitar la eficacia de las inmuno-tinciones (Figura 1).
Los casos incluyeron 23 carcinomas faríngeos, 18 laríngeos y 3 casos fueron metástasis ganglionares sin primario
conocido. Los carcinomas faríngeos incluían base de lengua14, suelo de boca8 y paladar blando1.
Los datos clínicos y de seguimiento fueron revisados a
partir de las historias clínicas de los pacientes y se prestó
especial interés a la edad, estadio tumoral, localización del
tumor primario, grado de diferenciación histológica, tratamiento adyuvante post-cirugía así como supervivencia libre
de enfermedad y supervivencia global del paciente. Para
poder realizar el estudio con los tejidos y con las historias
clínicas se solicitó la aprobación de la Institución para la revisión de datos humanos (021076X).
Figura 2. Fotografía en la que se observa una muestra de carcinoma
epidermoide laríngeo positivo para EGFR.
El anticuerpo se usó diluido 1:100 en PBS. Como controles positivos se emplearon muestras de carcinomas de
mama. Los controles negativos se realizaron con el mismo
tejido de CCECC pero sin anticuerpo. Como controles normales se usaron tejido amigdalar, tejido de úvula y de mucosa laríngea.
Inmunohistoquímica (IHQ)
Las muestras de tejido se fijaron en solución de formaldehído tamponado al 4% y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 5 micras a partir de los bloques y se montaron en portaobjetos de 3-aminopropyltriethoxysilane
especialmente preparados para tinción IHQ. Se incubaron
durante una hora a 60º, se desparafinizaron en xileno y rehidrataron con etanol de diferentes grados sucesivamente.
Se realizó la amplificación antigénica incubando las muestras en una olla a la máxima presión con la solución de DAKO Target Retrieval. La peroxidasa endógena se retiró con
H2O2 al 3%. Con el fin de evitar uniones no específicas se
incubaron las muestras en una solución para bloquear la
unión no específica de biotina-avidina durante 30 minutos
(Protein Block Serum-Free, DAKO, Carpinteria, CA, USA).
La tinción de fondo se redujo incubándolo con suero de cabra (1:20) durante 60 minutos. Se colocó el anticuerpo primario y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiental.
Posteriormente se usó el anticuerpo secundario conjugado
con Strptadivine/HRP (LSAB2, DAKO, Carpinteria, CA,
USA). La contratinción se realizó con hematoxilina de Gill
II.
Evaluación de la tinción
Anticuerpos
Los estudios inmunohistoquímicos se realizaron usando el anticuerpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) IgG de conejo contra EGFR.
144
Los casos se consideraron como positivos si la tinción
era al menos 2 veces más (2+) en una escala de 1 al 4 + y si
el 10% o más de las células tumorales estaban teñidas sobre
el trasfondo sano o sobre el control negativo. Se evaluaron
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EGFR EN CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE CABEZA Y CUELLO
Tabla 1: Datos demográficos de los pacientes
Pacientes (n = 44)
Edad media
Localización
Estadio
Tabla 2: Expresión del receptor EGFR
según la localización del tumor
N (%)
64,6 (rango 64-85)
Faringe
Laringe
Primario desconocido
In situ
I
II
III
IV
G1
G2
G3
23 (52%)
18 (41%)
3 (7%)
1 (2,2%)
5 (11,4%)
3 (6,9%)
14 (31,8%)
21 (47,7%)
14 (31,8%)
17 (38,6%)
13 (29,5%)
EGFR (+)
Faringe (n=21)
Laringe (n=16)
Valor de p
9 (43%)
6 (37%)
No significativo
Todos los análisis estadísticos se hicieron con el programa Stat View v.5.0.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC,
USA). Para la comparación de variables cualitativas se
empleó la prueba de chi cuadrado o el Test exacto de Fisher dependiendo del tamaño de la muestra. Para la comparación de variables numéricas cuantitativas se empleó
el Test de Student. El análisis de supervivencia se hizó
usando las curvas de Kaplan-Meier. La significación se
determinó con el test de log-rank. Para el análisis multivariante se empleó el modelo de regresión de Cox.
EGFR resultó estar sobre-expresado en el 41% de los
casos, es decir, 16 de los 39 casos mostraron una inmunotinción positiva y dicha inmunotinción fue clasificada en todos
los casos salvo en cuatro como "intensamente positivo" (4+).
Esta positividad se repartió de la siguiente manera: 9 de los
21 casos de localización faríngea mostraron una inmunotinción positiva (42,9%), 6 de los 16 casos de localización laríngea fueron positivos (37,5%) y uno de los dos casos de localización ganglionar (Tabla 2). No existió diferencia
significativa entre la expresión de EGFR y la localización
del tumor (p = ns).
En los casos de tinción positiva podía observarse la
tinción citoplasmática con una acentuación en la membrana
plasmática de las células carcinomatosas.
No encontramos correlación entre la expresión de
EGFR y el grado histológico ni tampoco lo hicimos con el
estadio tumoral.
Cuando estudiamos la correlación que pudiera existir
con la supervivencia global o con la supervivencia libre de
enfermedad encontramos que en nuestra muestra EGFR no
se correlacionó con ninguno de los dos parámetros. El 43%
de los pacientes con carcinoma faríngeo y el 33% con carcinoma laríngeo murieron por su enfermedad (p = ns) durante el período estudiado. La supervivencia media global fue
de 15,4 meses para los enfermos con afectación faríngea y
16,2 para los de enfermedad laríngea (p = ns). No obstante,
en el presente estudio, tampoco el grado histológico ni el
estadio se correlacionaron con la supervivencia libre de enfermedad o supervivencia global.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
En la Tabla 1 se resumen los datos demográficos de
los pacientes. Debido al tipo de hospital (Veterans Affair,
Hospital de Veteranos), todos los pacientes eran varones.
No había diferencias en cuanto a la distribución por
edad cuando se comparaba con la localización del tumor
primario. Esta cohorte tenía un mayor número de pacientes en estadios avanzados, III y IV (35/44) que estadios precoces, I y II (8/44). Esto se cumplía especialmente en el caso de tumores faríngeos en los cuales había
menos casos de estadios precoces I y II (2/8) que tardíos
III y IV (21/35, p = 0,05). No obstante, el grado histológico de bien diferenciado (G1) a pobremente diferenciado (G3) tenía una distribución homogénea, casi un tercio
en cada grupo. En cuanto al tratamiento adyuvante, más
del 80% de los pacientes recibieron radioterapia postoperatoria.
Todas las muestras salvo 5 (n = 39) fueron teñidas satisfactoriamente con EGFR.
Las tirosín-kinasas (TK) son proteínas entre las que se
engloban receptores y no receptores. EGFR es una glicoproteína transmembrana de 170 kD cuyo gen está localizado en
el brazo corto del cromosoma humano 7p1210. Tiene diferentes ligandos extracelulares entre los que se encuentra TGF-α
y EGF. Una vez activado produce la fosforilación de numerosos efectores involucrados en las vías del PI3K/Akt (11),
PLC-γ y la PK ras/raf-1. La activación de estas cascadas
produce a su vez la transcripción de otros genes responsables de la coordinación del crecimiento celular.
La sobreexpresión de EGFR se ha observado en un
40% a un 80% de cánceres de cabeza y cuello10. La naturaleza de esta sobreexpresión parece radicar en un aumento
de la transcripción de EGFR12,13 aunque su amplificación
también se ha observado 14. Numerosos trabajos dan a
EGFR un valor pronóstico independiente negativo y hablan de una mayor probabilidad de recidiva post-tratamiento y una menor supervivencia si EGFR está presen-
Grado histológico
sólo las áreas alejadas de los bordes que no estuvieran cauterizadas ni artefactadas ni excesivamente arrugadas.
Las tinciones negativas eran equivalentes a los controles negativos. Todos los casos positivos mostraron tinción citoplasmática con acentuación membranosa en la
mayoría de los casos intensamente teñidos. Las muestras
se evaluaron como positivo o negativo por la misma patóloga (JWR).
Análisis estadístico
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X. ALTUNA ET AL.
te5,14-18. En este estudio, la expresión de EGFR es del 41%,
entre los valores más bajos descritos en la literatura para
los cánceres de cabeza y cuello. Asimismo, y al contrario
de lo descrito anteriormente, en nuestros pacientes, la expresión de EGFR no se correlacionó con una menor supervivencia global ni una menor supervivencia libre de
enfermedad. Debemos decir que en la muestra estudiada,
ni el TNM ni el grado histológico se relacionaron con una
peor supervivencia. Esto puede tener relación en primer
lugar con el hecho de que la mayor parte de los pacientes
estudiados en nuestra muestra correspondían a estadios
evolutivos avanzados y no había un reparto homogéneo
por grupos. En segundo lugar, creemos que éste es un
grupo reducido de pacientes por lo que creemos que dichos resultados deben interpretarse con cautela.
En los últimos tiempos ha existido un interés especial
en esta proteína no sólo por su posible valor pronóstico sino
también porque es diana de algunos agentes terapéuticos
cuya eficacia ha sido demostrada en determinados tipos de
cáncer.
Dichos fármacos pueden ser de diferentes familias: ligandos-toxina conjugadas, anticuerpos monoclonales antiEGFR, inhibidores específicos de TKs o inhibidores del propio RNAm9. Entre los más conocidos está el Cetuximab®
(anticuerpo anti-EGFR) que ha mostrado in vitro inhibir el
crecimiento de CCECC19 y ha dado buenos resultados en los
ensayos clínicos realizados con pacientes con CCECC en estado avanzado20. Otros ejemplos de anticuerpos que se están
empleando son EMD 72000, hR3 o ABX-EGF.
Entre los inhibidores específicos se encuentra el Iressa®
que inhibe específicamente la fosforilación del dominio catalítico del receptor. La ventaja de este fármaco es su posibilidad de administración oral y existen numerosos ensayos
clínicos al respecto21. Otros ejemplos de fármacos inhibidores de EGFR son SU5416, PKI166, OSI-744 Tarceva® o CI1033.
Algunos de estos fármacos ya han sido aprobados por
la agencia FDA americana para el tratamiento del cáncer de
pulmón.
CONCLUSIONES
Este estudio muestra la expresión del receptor transmembrana TK EGFR en el carcinoma de células escamosas
de cabeza y cuello. A pesar del valor pronóstico que se le ha
dado en otros estudios, el presente trabajo no encuentra relación con la supervivencia y tampoco lo hace con el grado
histológico; sin embargo la muestra estudiada y el tiempo
de seguimiento puede ser insuficiente para extraer conclusiones de este tipo.
Recientemente, se están desarrollando muchos agentes
que tienen como diana la proteína EGFR y que están demostrando ser eficaces en la inhibición de la proliferación
de células tumorales que expresan dicha proteína, por lo
que deberían realizarse más ensayos clínicos en pacientes
146
con carcinomas en estadios avanzados donde su pronóstico,
dadas las limitadas opciones terapéuticas que hay, es tan
pobre.
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