M-CCBA-LB-03

Código: M-CCBA-LB-03
Revisión: 01
Fecha de emisión: 19/04/10
Página: 1 de 23
Manual de pruebas bioquímicas
CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS
NIVEL DE
SECCIÓN
REVISIÓN Y/O PÁGINA
01
DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN
Y MEJORA
FECHA DE
MODIFICACIÓN
Actualización de las firmas
Octubre 2012
1
02
03
04
05
Elaboró
Revisó
Aprobó
QFB Ana María Sofía Rejón Magaña
Responsable del laboratorio
Coordinador de la Unidad de
Diagnóstico
Coordinador de la Unidad de
Diagnóstico
1.-OBJETIVO
Describir las pruebas bioquímicas que se utilizan en el análisis de muestras biológicas de
origen animal, para la identificación de agentes bacterianos.
2.- ALCANCE
Aplica a todo el personal que realice alguna técnica de pruebas bioquímicas, para la
identificación de agentes bacterianos.
3.- POLITICAS
Todo el personal debe:
Realizar las pruebas bioquímicas de acuerdo a las técnicas descritas en este manual.
2
INDICE
Pruebas bioquímicas primarias …………………………………………...…………………
5
Oxidasa ………………………………...………………………………………………………. 5
Catalasa …………………………………………...…...………………………………...……. 6
Hidróxido de potasio al 3% ……………………………………………..…………………….
6
Movilidad en gota suspendida ………………………………………………..……………… 7
Prueba de la coagulasa en placa ……………………………………………...………...….. 7
Prueba de la coagulasa en tubo …………………………………………...…………...…… 8
Pruebas bioquímicas secundarias ………………………………………………………….
9
Kliger (Kliger-Hierro-Agar)KIA ………………………………………………………..……… 9
Producción de sulfuro de hidrogeno …………………………………………….………….
11
Agar de Hierro y tres azúcares (TSI) …………………………………………….………….
11
Citrato de Simmons ……………………………………………...……………………..……..
12
Lisina Hierro Agar (LIA) ……………………………………………...…………………….....
12
Sulfuro Hierro Indol- Motilidad (SIM) ……………………………………………………....
13
Leche Tornasolada ……………………………………………...……………....................... 14
3
Cloruro de sodio al 6.5% (NaCL 6.5%) ……………………………………………….…….
14
Rojo de Metilo ………………………..…………………………………………………..……. 15
Voges Proskauer …………………………….…………………………………………..……. 15
Reducción de Nitratos ……………………………………………...………………...………. 16
Fermentación de Carbohidratos ………………………………………………...…………... 17
Hidrólisis de Esculina ………………………………………………...……………………..... 17
CAMP- Esculina …………………………………………………...……………….………….
18
Gelatina ………………………………………………………...………………………..……..
18
Caldo de Urea …………………………………………………...……………………..……...
19
Hidrólisis del Almidón (Agar Almidón) …………………………………….………………...
19
Hidrólisis del Hipurato ………………………………………...………………..……………..
20
Producción de H2S en el medio de LIOR …………………………………………….…….
20
Referencias ……………………………………………...……………………..………………
21
4
PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS
Estas pruebas se deben realizar a partir de colonias obtenidas
individualmente o de un cultivo puro y después de realizar la tinción de Gram.
OXIDASA
Esta prueba deberá realizarse en todos los bacilos Gram negativos.
Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa (indolfenoloxidasa), que cuando se encuentra en presencia de oxígeno atmosférico,
citocromo c, y un reactivo oxidasa, oxidan al reactivo para formar un compuesto
coloreado, indo fenol.
Reactivo
Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (denominado también Ndimetil-p-fenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina).
Preparación del reactivo
En una caja de Petri chica se colocan algunos cristales del reactivo y se le
añade un poco de agua destilada, aquí mismo se deja caer un pedazo de papel
filtro. Esta preparación es para uso inmediato.
Procedimiento
Con una pipeta Pasteur o bien con un aplicador de madera se toma una
colonia bacteriana y se prueba en el papel filtro humedecido con el reactivo. Se
puede observar al microscopio estereoscópico.
Interpretación
Prueba positiva: la colonia toma un color púrpura.
Prueba negativa: la colonia no cambia de color o toma un color diferente al
purpúra.
Esta es una forma rápida de esta prueba y no se desperdicia reactivo ya
que este se oxida muy rápidamente y es difícil de conservar.
Contribuye a la identificación de Neisseria y Aeromonas
Pseudomonadales (generalmente +), y Enterobacteriaceae (-).
(+),
5
CATALASA
Esta prueba comprueba la presencia de la enzima catalasa.
Reactivo
Se utiliza como reactivo el peróxido de hidrógeno al 3%.
Reacción
2 H2O2 ------> 2 H2O + O2
Procedimiento
Sobre un porta-objetos se coloca una gota de H202 y con una pipeta
Pasteur o aplicador de madera se pica una colonia del cultivo y se suspende en la
gota de H2O2.
Interpretación
Prueba positiva: se observa la formación de burbujas.
Prueba negativa: No se forman burbujas.
La reacción es inmediata y no debe realizarse de colonias que crecen en
Agar Sangre ya que los eritrocitos dan catalasa positiva, a menos que se realice
con mucho cuidado tomando del centro de la colonia sin picar el medio de cultivo.
Esta prueba frecuentemente -es usada para diferenciar Estafilococos (+) de
Estreptococos (-).
HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 3%
Esta prueba es para confirmar la tinción de Gram.
Procedimiento
Mezclar bien una colonia con una gota de KOH al 3% en un porta-objetos.
Interpretación
Gram positivas: No se observa viscosidad.
Gram negativas: Si la colonia se transforma viscosa o gelatinosa en 5 a 60
segundos. "Elástico”
6
MOVILIDAD EN GOTA SUSPENDIDA
Sirve para demostrar en forma rápida la movilidad en los cultivos puros
(ideal a partir de caldos). Algunas cepas muestran poca movilidad cuando se
aíslan por primera vez.
Procedimiento
En un porta-objetos excavado colocar alrededor de la excavación un poco
de vaselina.
En un cubre-objetos colocar una gota de suspensión de la colonia
bacteriana o de caldo de cultivo y colocarlo con la gota suspendida hacia la
excavación de la gota suspendida hacia la excavación del porta-objetos.
Examinar rápidamente al microscopio al seco débil y seco fuerte. Realizar
este paso con cuidado de no romper el cubre-objetos con el objetivo del
microscopio. Observar con luz reducida.
Interpretación
Positivo: Movimiento activo, independiente, en contra de la "corriente".
Negativo: No se observa movimiento activo.
PRUEBA DE LA COAGULASA EN PLACA
Esta prueba detecta la presencia de la enzima coagulasa, producida por
una cepa de Staphylococcus aureus sobre el plasma sanguíneo.
Reactivo
Plasma de conejo o plasma humano.
Procedimiento
Una colonia característica de Estafilococo es emulsionada en una gota de plasma
de conejo sobre un porta-objetos.
Interpretación
La formación de pequeños coágulos o grumos en un tiempo de 2 minutos
indica la presencia de coagulasa y constituye un resultado positivo. Una
excepción de falsa negativa es cuando hay cepas de Estafilococos meticilina
resistentes, en estos casos hay que realizar la prueba de coagulasa en tubo.
7
PRUEBA DE LA COAGULASA EN TUBO
Esta prueba detecta la presencia de la enzima coagulasa.
La coagulasa aumenta la velocidad de coagulación del plasma; el
resultado final es la formación de un coágulo de fibrina.
La concentración de la coagulasa influye sobre la velocidad de la
coagulación del plasma, cuanto más alta la concentración más rápidamente se
formará el coágulo.
Reactivo
Plasma de conejo o plasma humano.
Procedimiento
Tres colonias características de Estafilococos se emulsionan en un tubo
conteniendo 0.1ml del plasma más 0.3ml de Solución Salina Fisiológica, incubar a
37° C24 horas.
Interpretación
Positiva: Formación de un coágulo en el fondo del tubo.
Negativa: No se forma coágulo.
En esta prueba puede hacerse una primera lectura a las 4 horas de
incubación ya que algunas cepas de Estafilococos son altamente positivas.
8
PRUEBAS BIOQUÍMICAS SECUNDARIAS
Con estas pruebas se puede indicar el grupo mayor (Género) al cual
probablemente pertenece un microorganismo. Se emplean medios que contienen
varios sustratos.
KLIGER (KLIGER-HIERRO-AGAR)(KIA)
Permite identificar en forma presuntiva bacterias Gram negativas. Se basa
en que estos microorganismos, pueden ser diferenciados sobre la base de la
fermentación ácida de azucares, (glucosa y lactosa) producción de sulfuro de
hidrógeno y la producción de gas.
Fermentación de los carbohidratos y formación de gas.
El medio contiene dos hidratos de carbono: lactosa, con concentración de
1%, y glucosa en concentración de 0.1%. Este medio puede sustituirse por TSI
(Triple Azúcar Hierro); la diferencia fundamental es el agregado de un tercer
hidrato de carbono, sacarosa en concentración de 1%, los fundamentos
bioquímicos son los mismos que para Kliger.
El medio en los tubos adopta la forma de "pico de flauta".
La fermentación se produce aeróbica (en el pico de flauta) y ah
aeróbicamente (en la capa inferior del cultivo).
La fermentación es un procedo metabólico de oxidación-reducción
anaeróbico en el cual un sustrato orgánico sirve como aceptor final de electrones
en vez del oxígeno.
El tipo de productos finales producidos por la fermentación de los
carbohidratos depende principalmente del tipo de organismo que lleva a cabo el
proceso de fermentación, pero en general son: hidrógeno, CO2, algunos ácidos,
algunos alcoholes y una cetona.
Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa, otras la oxidan, algunos
pueden metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras son incapaces de
utilizarla. No todos los monosacáridos son degradados por todas las especies
bacterianas; y el mismo monosacárido puede ser metabolizado por diferentes
vías, dando como resultados diferentes productos finales. Esto permite la
identificación del grupo, género y especie. La fermentación ácido-mixta es
característica de las enterobacterias, y produce los siguientes productos finales:
ácido fórmico, acético, láctico y succínico, etanol y dos gases (CO2 e H2). La
ácidez hace que el indicador rojo de fenol vire a amarillo.
9
Los organismos que fermentan la glucosa pero no la lactosa, dan lugar
rápidamente (8-12 h) a una reacción ácida (amarilla) de todo el medio. A medida
que es utilizada la dextrosa, la reacción ácida de la zona aeróbica(pendiente)
revierte por amoníaco generado durante la degradación de las peptonas, y se
vuelve alcalina (rojo) a las 18-24 horas).
Bajo condiciones anaeróbicas, en el fondo (picadura) del tubo, no puede
llevarse a cabo la desaminación oxidativa, por lo que permanece ácido (amarillo).
Si la bacteria fuera capaz de utilizar la lactosa, que se encuentra en cantidades
10 veces mayor que la glucosa, entonces el ácido generado superaría la
reacción alcalina producida por la pendiente, y todo el tubo tendría condiciones
ácidas (amarillo).
Principio de formación de H2S
Al reducirse en condiciones de acidez el azufre de los aminoácidos
azufrados y del tiosulfato de sodio se genera H2S,que en presencia del hierro del
sulfato ferroso forma un precipitado negro de sulfato ferroso.
Método de siembra
Se toma la colonia a probar con un asa recta y se inocula el medio por picadura
hasta el fondo y estrías en la superficie.
Interpretación
Lectura después de 18-24 horas de incubación.
Formas de fermentación básica:
1.- Fondo: Fermentación de la glucosa, amarillo.
Superficie (pico de flauta): No fermentación de la lactosa, rosado.
Reacción: Ácido/Alcalino
Shigella
2.- Fondo: No fermentación de la glucosa, rosado.
Superficie: No fermentación de la lactosa, rosado.
Reacción: Alcalino/Alcalino
3.- Fondo: Fermentación de la glucosa, amarillo.
Superficie: Fermentación de la lactosa, amarilla.
Reacción: Acida/Acida.
E.coli , Klebsiella, Enterobacter
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PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIDRÓGENO (H2S).
El medio además de los carbohidratos contiene una sal, citrato férrico de
amonio y una sustancia química el tiosulfato de sodio, que algunos
microorganismos tienen la capacidad de reducir a sulfuro de hidrógeno (gas
incoloro) que al reaccionar con el citrato férrico se hace visible su producción
dando un precipitado negro insoluble.
Producción de gas
Como producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono puede
producirse gas, la bacteria en este caso se denomina aerogénica y se observan
en el medio burbujas o desplazamiento total del medio del fondo del tubo dejando
un área clara, o una ligera muesca en el medio en el costado del tubo. Las
bacterias que no producen gas se denominan anaerogénicas, los gases
producidos son anhídrido carbónico e hidrógeno.
AGAR DE HIERRO Y TRES AZÚCARES (TSI)
En este medio se observa la fermentación de la glucosa, la lactosa y la
sacarosa, la producción de ácido sulfhídrico y de gas.
Su principio es muy similar al del KIA, con la salvedad de que posee
además Sacarosa. Esto ayuda a investigar la presencia de especies de
Salmonella y Shigella, ya que ninguna de éstas utiliza la lactosa o sacarosa. Por
lo tanto, cualquier reacción A/A en TSI excluye a estos dos patógenos.
La siembra se realiza como en KIA.
Interpretación
Amarillo todo el medio (A/A): Fermentación de la glucosa y de la lactosa o
sacarosa
Rojo todo el medio (K/K): No fermentación de glucosa, lactosa y
sacarosa.
Roja la pendiente, amarillo el fondo (K/A): no fermentación de la lactosa o
sacarosa-fermentación de glucosa.
Precipitado negro en el medio: Producción de ácido sulfhídrico.
Desplazamiento del medio, burbujas, muesca en la pared del tubo:
producción de gas a partir de glucosa.
Color
Reacción
Abreviatura
Amarillo
Rojo
Ácida Alcalina
A
K
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CITRATO DE SIMMONS
Determina si un organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente
de carbono para el metabolismo provocando alcalinidad.
Las bacterias al utilizar el citrato, liberan residuos de sodio, que al unirse
con radicales OH alcalinizan el medio. Bajo estas condiciones el indicador de pH
cambia de color verde a color azul. El medio que se utiliza es un agar que
contiene 2% de citrato de sodio, al cual se le adiciona un indicador de pH, (azul
de bromotimol) es envasado en tubos y queda con superficie inclinada.
Método de siembra
El medio se siembra por estría. La incubación se realiza a 37°C/24-48
horas y en ocasiones es necesario prolongar este período hasta 7 días.
Interpretación
Prueba positiva: Cambio del medio a color azul.
Prueba negativa: El medio permanece verde.
LISINA HIERRO AGAR (LIA)
Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un
aminoácido (lisina) para formar una amina (cadaverina) y anhídrido carbónico con
la consiguiente alcalinidad. En este medio se puede observar la producción de
H2S (por la presencia en el medio de tiosulfato de sodio y citrato férrico amónico
como en el Kliger). El medio en los tubos adopta la forma de pico de "flauta".
Método de siembra
Por picadura en el fondo del tubo y estría continua en la superficie. Se
incuba a 37°C/24 hrs.
Interpretación
Prueba positiva:color púrpura turbio o púrpura amarillento apagado
(producido por la cadaverina).
Prueba negativa:color amarillo claro y brillante (solamente fermentación de
la glucosa).
Producción de hierro:precipitado negro en el fondo del tubo.
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SULFURO HIERRO-INDOL- MOTILIDAD (SIM)
En este medio se puede determinar la capacidad de un microorganismo de
producir ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos sulfurados o de sales como
tiosulfato de sodio.
También se puede observar la capacidad que tienen
microorganismos para producir triptofanasa y oxidar el triptofano a indol.
otros
Y se puede determinar si un organismo es móvil o inmóvil.
Método de siembra
El medio de SIM es semisólido y se siembra por picadura. Se incuba a
37°C/ 24 hrs.
Interpretación
Para H2S
Prueba positiva: precipitado negro a lo largo de la picadura.
Prueba negativa: no se observa precipitado.
Indol
Se adicionan al medio unas tres gotas del reactivo de Kovac's.
Prueba positiva: anillo rojo en la superficie.
Prueba negativa: anillo de color anaranjado.
Motilidad
Prueba positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se
difunden en el medio provocando turbidez.
Prueba negativa: (Sin motilidad) crecimiento bacteriano no acentuado
siguiendo la línea de siembra; el medio circundante se mantiene claro.
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LECHE TORNASOLADA
Determina la capacidad de un organismo de precipitar la caseína y
fermentar la lactosa en la leche, asi como de la digestión de la caseína y
producción de reductasas que eliminan O2, el medio es líquido de color azul
grisáceo.
Método de siembra
anotar cualquier cambio que se presente.
Interpretación
Acidificación: color rosado
Grumos ácidos: coágulo firme color rosa no retraído y que se disuelve al
agregar un alcalí.
Alcalinización: color azul intenso o morado.
Reducción: color blanco.
CLORURO DE SODIO AL 6.5% (NACL 6.5%)
Determina la capacidad de las bacterias de desarrollar en una
concentración de 6.5% de NaCl.
Se utiliza un caldo nutritivo adicionado de NaCl 6.5% en concentración
final.
Método de siembra
Por agitación del asa bacteriológica. Incubación a 37°C / 24hrs.
Interpretación
Prueba positiva: la presencia de turbidez indica el crecimiento bacteriano.
Prueba negativa: sin turbidez, lo cual indica la ausencia de crecimiento
bacteriano.
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ROJO DE METILO
El rojo de metilo es una prueba que determina la capacidad de las
bacterias de producir ácido a partir de la glucosa de tal forma que el valor del pH
del medio desciende a menos 4.4, esta distinción puede hacerse visible mediante
la adición de un indicador como el rojo de metilo.
Si la acidez es mínima, ésta se neutraliza por la acción de la solución
amortiguadora del medio.
Se utiliza un medio líquido a base de peptonas, dextrosa y fosfatos.
Método de siembra
Inoculación de la bacteria con asa recta en el caldo RM.
Se incuba a 37°C / 24hrs.
Interpretación
Separar asépticamente 1 ml del medio inoculado, agregar 2 gotas del
indicador rojo de metilo.
Prueba positiva: color rojo.
Prueba negativa: coloración amarilla.
VOGES PROSKAUER
Determina la fermentación de la glucosa por parte de las bacterias para
producir acetilmetilcarbinol (acetoína), se utiliza el mismo medio que para RM.
Método de siembra
Por agitación del asa bacteriológica. Se incuba 35°C o 37°C por 24 a 48
hrs. puede necesitarse una incubación más prolongada, hasta de 10 dias.
Interpretación
Se separa 1ml aproximadamente en otro tubo en condiciones asépticas
para realizar la prueba de RM; el resto se puede incubar otras 24 hrs.
Para realizar la lectura en el momento adecuado se agregan los siguientes
reactivos:
1.- 0.6 ml de una solución de alfa naftol al 5%.
2.- 0.2 ml de una solución de KOH o NaOH al 40 %.
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3.- Agitar suavemente para exponer el medio al óxigeno atmosférico a fin de
oxidar la acetoína y obtener una reacción de color.
4.- Dejar descansar el tubo en posición inclinada por lo menos durante 10 a 15
minutos antes de intentar la interpretación del color.
Prueba positiva: color rojo rosado en la superficie del medio (presencia de
acetoína).
Prueba negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color
del reactivo).
Si se forma un color cobrizo la reacción siempre es negativa. Es
importante el orden de adicionar los reactivos.
REDUCCIÓN DE NITRATOS
Determina la capacidad que tienen algunos microorganismos para reducir
nitratos a nitritos o un desdoblamiento mayor de este último.
Se utiliza un caldo Peptonado con 0.1% de nitrato de potasio, algunas
bacterias poseen la enzima nitratasa que reduce los nitratos (N03) a nitritos (N02)
o a otros productos de reducción como hiponitritos, hidroxilaminas, amoníaco,
óxido nitroso o nitrógeno gaseoso.
Método de siembra
hrs., si no hay crecimiento aparente incubar hasta 5 dias, obteniendo
asépticamente 1 ml cada 24 hrs. para efectuar la lectura.
Interpretación
Añadir 5 gotas de Solución A (Ácido Sulfanílico 0.8%).
Añadir 5 gotas de Solución B (Dimetil alfa naftilamina 0.6%).
Mezclar y leer después de 1 a 2 minutos.
Positivo: color rosado o rojo intenso (presencia de nitritos). Negativo: sin
cambio de color (ausencia de nitritos).
Si la prueba es negativa es posible que la reacción de reducción haya
continuado hasta otros productos; en este caso es necesario adicionar una pizca
de polvo de zinc para confirmar la ausencia de nitratos.
Ausencia de nitratos sin cambio de color.
Presencia de nitratos coloración rojo intenso.
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FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Determina la utilización de los carbohidratos por las bacterias produciendo
ácido o ácido y gas (cuando se utiliza campana de Durham). Además pueden
incluirse entre estos algunos glucósidos y alcoholes polihídricos en las
concentraciones adecuadas para realizar pruebas de fermentación. La
concentración de carbohidratos para pruebas de fermentación y oxidación es por
lo general el 1% ya que a esta concentración es menos posible de que ocurra una
reversión de la reacción. Algunas soluciones de carbohidratos pueden
esterilizarse en la autoclave pero otras es posible que sufran descomposición.
A estos medios se les adiciona un indicador generalmente rojo de metilo
para dar evidente un cambio de pH que ocurre durante el crecimiento de las
bacterias. Algunas veces es necesario adicionar suero para pruebas especiales
con microorganismos exigentes.
Método de siembra
Agitación del asa bacteriológica. Se incuba a 37°C / 18-24 hrs.
Interpretación
Prueba positiva: color amarillo.
Prueba negativa: color rosado o no cambia de color.
Cuando se utiliza con campana de Durham una prueba positiva es cuando
se forma una burbuja dentro del tubo y en una prueba negativa no hay formación
de burbujas.
HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA
Determina la capacidad de una bacteria de hidrolizar el carbohidrato
esculina a esculetina y glucosa. Se utiliza un medio a base de caldo peptonado,
esculina y citrato férrico.
Si la bacteria utiliza la esculina se liberará 6,7 dihidroxicumarina que
reacciona con el hierro del medio dando una coloración café obscura o negra.
Método de siembra
Por agitación del asa bacteriológica. Se incuba de 1 a 7 dias a 37°C.
Interpretación
Prueba positiva: coloración café obscura o negra.
Prueba negativa: sin cambio de color.
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CAMP-ESCULINA
La prueba de CAMP, utiliza los fenómenos líticos de los estreptococos del
grupo Beta de Lancefield en presencia de toxina estafilocócica beta, es
suficientemente exacta para la identificación presuntiva sistemática de
Streptococcus agalactiae. Puede realizarse al mismo tiempo la prueba de
hidrólisis de la esculina en medio sólido.
Método de siembra
Se utiliza Agar Sangre con Esculina.
1.- Se inocula una cepa de Staphylococcus beta hemolítico en el centro de una
placa.
2.- Las cepas de Estreptococcus a probar se inoculan cerca de la estría del
Estafilococo a los lados, identificando cada una si se utilizan varios inóculos de
Estreptococcus. Utilizar un control positivo.
Interpretación
Prueba de CAMP positiva: si se forma una especie de flecha transparente en la
región donde se encuentran el inóculo de Estreptococo a probar con el
Estafilococo.
Prueba de CAMP negativa: no se completa la hemólisis del Estreptococo en
prueba.
Prueba de Esculina Positiva: un halo negro alrededor de las colonias.
Prueba de Esculina Negativa: no se forma ningún halo.
GELATINA
Demuestra la capacidad de un organismo para producir la enzima
gelatinasa. Se utiliza caldo nutritivo adicionado con 12 a 15 % de gelatina o el
medio gelatina nutritiva. Las bacterias al producir la enzima gelatinasa hidrolizan
la gelatina la cual a su vez pierde la capacidad de formar gel.
Método de siembra
Es un medio semisólido, se envasa en tubos y se siembra por picadura
con asa recta. Se incuba a 37°C/ 1 a 5 días.
Interpretación
Después de la incubación refrigerar durante 15 a 30 minutos y a
continuación hacer la lectura.
Prueba positiva: el medio muestra consistencia líquida.
Prueba negativa: el medio muestra consistencia semisólida o sólida.
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CALDO DE UREA
Determina la habilidad de las bacterias de producir la enzima ureasa que
desdobla la urea a amoníaco.
Se utiliza un medio bufferado neutral de sales minerales conteniendo 2%
de urea y rojo de fenol como indicador.
Puede utilizarse un medio sólido en tubo (con pico de flauta).
Método de siembra
Mediante la agitación del asa bacteriológica. Se incuba 18 a 24 hrs a 37°C.
Interpretación
Prueba positiva: color morado.
Prueba negativa: color rosado.
HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN (AGAR ALMIDON)
Determina la capacidad de las bacterias de hidrolizar el almidón,
produciendo una exoenzima y convirtiéndolo en maltosa y glucosa.
El medio se prepara en cajas de petri.
Método de siembra
Realizar una sola estría del inóculo a probar sobre el agar cerca de uno de
los bordes de la caja. En el otro borde hacer una estría con un control positivo.
Incubar a 37°C/48 hrs.
Interpretación
Añadir una solución de Lugol a la superficie de la caja.
Prueba positiva: ningún cambio.
Prueba negativa: color obscuro.
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HIDRÓLISIS DEL HIPURATO
Se basa en la acción de la enzima hipuricasa sobre el hipurato de sodio lo
que produce glicina y ácido benzoico. La reacción del reactivo (ninhidrina)
produce una coloración azul- violeta en contacto con la glicina.
Método de siembra
Suspender una ansada de la cepa en 400 microlitros de una solución de
hipurato de sodio al 1%. Luego de incubar a 37°C durante 2 horas, se le agrega
200 microlitros de la solución de ninhidrina al 3.5 % en acetona-butanol 1:1 por
la pared del tubo y se deja reposar a 37°C observándolo a los 10 min.
Interpretación
La aparición de una coloración azul violeta indica una reacción positiva
que revela la presencia de la glicina, producto final de la hidrólisis del hipurato.
PRODUCCIÓN DE H2S EN EL MEDIO DE LIOR (Para campylobacter)
La reacción se basa en la liberación de ácido sulfhídrico por la acción de
la enzima cisteína desulfhidrasa sobre los aminoácidos que contienen azufre. Se
pone en evidencia por indicadores como sulfato ferroso, tiosulfato de sodio etc.
Método de siembra
Se determina depositando una ansada grande en el centro de la columna
del tubo del medio para H2S (medio de LIOR). Los tubos se incuban en baño
María a 37°C por 2 horas.
Interpretación
La aparición de una coloración negra alrededor del inóculo indica una
reacción positiva. En caso de dudas, la incubación puede prolongarse a
temperatura ambiente o a 37°.
Una alternativa consiste en usar el medio de cultivo TSI o KLIGER
incubando en microaroilia, aunque los resultados pueden no ser constantes.
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REFERENCIAS
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