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UNIVERSIDAD DE LA HABANA
INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS
TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO
DE MASTER EN TECNOLOGÍA Y
CONTROL DE MEDICAMENTOS
OBTENCIÓN DE UN GEL A
PARTIR DE LA TINTURA DE
Murraya paniculata (L.)
(DROGA SECA)
Autor: Lic. Wendy Sánchez Martínez
La Habana
2015
UNIVERSIDAD DE LA HABANA
INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS
TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO
DE MASTER EN TECNOLOGÍA Y
CONTROL DE MEDICAMENTOS
OBTENCIÓN DE UN GEL A
PARTIR DE LA TINTURA DE
Murraya paniculata (L.)
(DROGA SECA)
Autor: Lic. Wendy Sánchez Martínez
Tutoras: Dra C. Yamilet I. Gutiérrez Gaitén
MC. Celia M. Casado Martín
Dra C. Viviana García Mir
Asesores: Dr C. Adonis Bello Alarcón
MC. Adalberto Izquierdo Castro
MC. Noel Varona Torres
Lic. Arturo Sánchez Fariña
La Habana
2015
DEDICATORIA
A mis padres
Mi ejemplo y mi compromiso.
A mi esposo
Mi apoyo, comprensión y confianza.
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
Agradecimientos
“El agradecimiento es el deber que más obliga”. Marco Tulio Cicerón.
La gratitud es una de las virtudes que ninguna persona, por difíciles que sean
las circunstancias, debe olvidar.
Hoy es un día muy importante para mí pues he logrado vencer una meta más
en mi vida. Si los resultados han sido gratificantes no solo son atribuibles a mi
esfuerzo, sino también a la ayuda y apoyo incondicional de muchas personas.
A mis tutores Dr.C. Viviana García Mir, Dr.C. Celia M. Casado Martín y Dr.C.
Yamilet Gutiérrez, les agradezco cada uno de sus consejos, orientaciones y
enseñanzas. Son excelentes profesionales capaces de hacer ciencia y más
aún de inculcar el amor por la ciencia. Para ustedes gracias por su amistad, su
comprensión y ayuda, sobre todo en esos momentos en que todo lo veía
imposible por los momentos difíciles que me he enfrentado a la vida.
Agradezco a la Dr.C. Irela Pérez Sánchez que de igual forma aceptó ser mi
oponente, gracias por el tiempo dedicado a revisar la tesis, así como por las
sugerencias y señalamientos realizados.
Agradezco también a Dr.C. Adonis Bello Alarcón por su amistad y siempre
disposición para ayudar, que de una forma u otra se ha ocupado y preocupado
por mi superación. Indudablemente no olvidé mencionar a Arturo, quien ha sido
mi compañero en esta contienda, el cual colaboró en gran parte de la obtención
de los resultados en esta investigación.
Finalmente el agradecimiento eterno a toda mi familia. No por ser el último es el
menos importante, sino porque es constante, imperecedero e incondicional. A
mis padres, el mayor tesoro que me ha dado la vida y con los que gracias a
Dios puedo seguir contando. Gracias por su tiempo, por soportarme y por
quererme. Quiero que sepan que su presencia me da las fuerzas necesarias
para seguir adelante, para luchar por cada meta u obstáculo que la vida me ha
Agradecimientos
puesto, en lo profesional y lo personal, y que para mí son todo un ejemplo de
valores.
En más de una ocasión flaquee, titubee y si hoy he llegado aquí en gran parte
se lo agradezco a mis padres. Hoy me siento complacida, sé que este trabajo
no ha sido un milagro sino el fruto de mi empeño y de la ayuda de muchos.
A mi esposo Manuel que aunque está muy alejado de esta actividad siempre
tiene lista la palabra adelante.
A mi hermana, a mis 2 bellas sobrinas, a mis tíos, mi primo y a mis compañeros
de batalla, pues aún de los que están lejos he tenido el apoyo espiritual.
A los que ahora empiezan solo les digo que no se dejen vencer, que todo
resultado lleva un sacrificio y todo esfuerzo es un éxito.
Agradezco a todos los aquí presentes, a los que por algún descuido
imperdonable olvidé mencionar y espero se sientan tan felices como yo. A
todos, muchas gracias.
RESUMEN
Resumen
RESUMEN
Murraya paniculata L. (Jack) es reconocida tradicionalmente por sus
propiedades astringentes, estimulantes, analgésicas, antiinflamatorias, entre
otras. El uso tradicional dado a esta especie vegetal en Cuba, implica el
empleo de la droga vegetal fresca, lo que limita la extensión de su uso, ya que
no se cuenta con estudios que avalen la factibilidad del empleo de la droga
seca con garantía de su calidad, seguridad y eficacia. En este sentido y
teniendo en cuenta la amplia distribución en nuestra zona geográfica de la
especie, en el presente trabajo se informan por vez primera los resultados de
los parámetros farmacognósticos de control de la calidad de la droga cruda y
su preparado galénico (tintura), fueron evaluados sus índices físico-químicos ,
control microbiológico, tamizaje fitoquímico, cromatografía en capa delgada y
análisis por cromatografía líquida de alta resolución, así como, un estudio de
estabilidad en estante por un periodo de un año, lográndose buena estabilidad.
Se elaboró un gel utilizando como ingrediente farmacéutico activo la tintura
al 20 % (elaborada con mezcla hidroalcohólica al 80 %) obtenida del material
vegetal seco. Se evaluaron parámetros físico-químicos y tecnológicos durante
12 meses, lográndose buena estabilidad. A la formulación se le realizó una
prueba de preferencia utilizando una escala hedónica de cinco puntos y la
misma fue aceptada por los cuatro atributos evaluados (olor, color, frescura y
apariencia. Finalmente desde el punto de vista preclínico se demostró que la
tintura y el gel no evidencian signos de toxicidad aguda dérmica en los
animales de experimentación, asimismo, pudo demostrarse una inhibición de la
inflamación de ambos productos bajo las condiciones ensayadas.
ÍNDICE
Índice
ÍNDICE
Pág.
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………....
1
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………………...
4
I.1. Murraya paniculata (L.) Jack.
4
I.1.1. Clasificación taxonómica y descripción botánica……………....
4
I.1.2. Habitat y distribución……………………………………………..
5
I.2.3. Usos atribuidos………………………………………………..…..
5
I.2.4. Fotoquímica, farmacología y toxicología…..………………...….
6
I.2. Medicamentos herbarios. Generalidades...…………………………………
8
I.3. Geles………………………………………………………………………....…..
10
I.3.1. Generalidades………………………………….…………….........
10
I.3.2. Clasificación de los geles.………………………………………..
11
I.3.3. Aplicaciones médico-farmacéuticas de los geles……………...
13
I.4. Pruebas de preferencia y aceptación…………………………………………
13
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………..
15
II.1. Recolección y selección del material vegetal……………………..………...
15
II.2.
Parámetros
de
calidad
del
material
vegetal
de
Murraya
paniculata…………………………………………………………………………..
II.1.1. Estudio de secado……….………………………………………..
II.3.2. Parámetros físico-químicos de la droga cruda de M.
paniculata...….…………………………………………………...……….
15
15
15
II.2.3. Estabilidad de la droga cruda de M. paniculata………………..
18
II.2.3.1. Parámetros físico-químicos…………………...………..
18
II.2.3. 2. Estudio químico-cualitativo…………………………….
19
II.2.3.3. Control microbiológico..………………………………...
19
II.3. Obtención de la tintura de M. paniculata …….……………………………...
19
II.4. Parámetros de calidad de la tintura de M. paniculata……………………
20
II.4.1. Parámetros físico-químicos………….…………………………….
20
II.4.2. Control microbiológico…...………………………………………...
22
Índice
II.4.3. Estudio fitoquímico de la tintura…………………………………..
22
II.4.3.1. Tamizaje fitoquímico……………………………………
22
II.4.3.2. Cromatografía en capa delgada ..….……….…………
23
II.4.3.3. Análisis por cromatografía líquida de alta resolución
(CLAR)…………………………………………………..…………
23
II.4.4. Estabilidad de la tintura de M. paniculata .……………….……
24
II.5. Obtención del gel a partir de la tintura de M. paniculata .……….…………
25
II.5.1. Evaluación de los parámetros físico-químicos y tecnológicos
del gel…………………………………………………………………....
II.5.2. Estudio fitoquímico del gel de M. paniculata………………….
II.5.2.1. Cromatografía en capa delgada………………………
II.5.2.2. Análisis por cromatografía
líquida de alta
resolución (CLAR)…………………………………………..…
26
27
27
27
II.5.3. Control microbiológico del gel de M. paniculata………………
28
II.5.4. Prueba de preferencia o aceptación de la formulación……….
28
II.5.5. Estabilidad integral de la formulación…………………………..
28
II.6. Evaluación preclínica de la tintura de M. paniculata y el gel…………...…
29
II.6.1. Ensayo de toxicidad aguda dérmica de la tintura de M.
paniculata y el gel……………………………………………………
II.6.2. Evaluación del efecto antiinflamatorio de la tintura de M.
paniculata y el gel…………………………………………………..……
29
29
II.7. Análisis estadístico…………………………………………..…………………
30
CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………
31
III.1. Establecimiento de los parámetros de calidad del material vegetal de
Murraya paniculata L………………………………………………………………..
III.1.1. Estudio de secado………………………..……………………..
III.1.2. Parámetros físico-químicos de la droga cruda de M.
paniculata…………………………….………………………………..…
31
31
33
III.1.3. Estabilidad de la droga cruda de M. paniculata….……………
35
III.1.3.1 Parámetros físico-químicos…………………………..
35
III.1.3.2. Estudio químico cualitativo…………………………..
36
Índice
III.1.3.3. Control microbiológico……………………………..
37
III.2. Obtención de la tintura de M. paniculata………………………….………...
39
III.3. Parámetros de calidad de la tintura de M. paniculata………….…….…..
39
III.3.1. Parámetros físico-químicos………………………………………
39
III.3.2. Control microbiológico……………………………………………
42
III.3.3. Estudio fitoquímico de la tintura…………………………………
43
III.3.3.1. Tamizaje fitoquímico…………………………………..
43
III.3.3.2. Cromatografía en capa delgada……………………..
45
III.3.3.3.
Análisis
por
cromatografía
líquida
de
alta
resolución (CLAR)………………………………………………..
46
III.3.5. Estabilidad de la tintura de M. paniculata…………………….
49
III.4. Obtención del gel a partir de la tintura de M. paniculata….……………..
51
III.4.1. Evaluación de los parámetros físico-químicos y tecnológicos
del gel……………………………………………………………………....
III.4.2. Estudio fitoquímico del gel de M. paniculata………………...
III.4.2.1. Cromatografía en capa delgada………………..…..
III.4.2.2.
Análisis
por
cromatografía
líquida
de
alta
resolución (CLAR)……………………………………………..
53
54
54
55
III.4.3. Control microbiológico del gel de M. paniculata……………….
56
III.4.4. Prueba de preferencia o aceptación de la formulación……….
57
III.4.5. Estabilidad integral de la formulación……………………..……
58
III.5. Evaluación preclínica de la tintura de M. paniculata y el gel……………..
60
III.5.1. Ensayo de toxicidad aguda dérmica de la tintura de M.
paniculata y el gel………………………………………………………..
III.5.2. Evaluación del efecto antiinflamatorio de la tintura de M.
paniculata y el gel……………………………………………….………..
60
61
III.6. Discusión general……………………………………………………………...
63
CONCLUSIONES……………………………………………………………………
65
RECOMENDACIONES…………………………………………………………….
66
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXOS
INTRODUCCIÓN
Introducción
INTRODUCCIÓN
El tema de las plantas medicinales es quizás tan antiguo como el hombre
mismo, sin embargo, los conocimientos al respecto siempre han estado
diseminados. A pesar de la invasión farmacológica mundial, las personas
siguen recurriendo a los remedios vegetales para aliviar sus enfermedades
comunes, por ello un esfuerzo por regresar a los productos naturales
representa un aporte muy significativo ya que son un recurso que debe
conocerse, usarse y cuidarse como parte del rico patrimonio natural de cada
país (Quesada, 2008).
Uno de los aspectos importantes en la investigación con plantas medicinales es
la disminución en el costo de la terapéutica medicamentosa y la puesta al
alcance de la población de diferentes conocimientos prácticos para el tratamiento con plantas, las cuales deben estar debidamente autentificadas y
caracterizadas para asegurar la reproducibilidad en la fabricación del producto
final (Neeraj y Bhupinder, 2011).
La comercialización y uso de plantas medicinales y fitofármacos ha mostrado
un crecimiento sostenido en las últimas décadas, pero solo en los últimos años
ha sido reconocida la importancia de la estandarización a todo lo largo del
proceso de diseño y desarrollo de fitomedicamentos. El valor de la etapa
agrotécnica, así como de la obtención de extractos de calidad es indiscutible,
pero la única forma de asegurar calidad, efectividad y seguridad óptimas, es
garantizando el adecuado cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación,
de acuerdo con el control de uno o más marcadores bioactivos presentes en el
producto de interés. Solo una garantía de calidad que asegure la composición
química adecuada y la actividad farmacológica esperada, permitirán contar
entre nuestros arsenales terapéuticos con productos fitoterapéuticos seguros y
eficaces, que contribuyan a la salud de la población y aumenten la confianza en
esta alternativa terapéutica.
Ante esta situación, los gobiernos de algunos países, han reconocido la
necesidad de regular los aspectos básicos de las plantas medicinales y los
productos derivados de ellas. Existen normas de estricto cumplimiento con el
1
Introducción
fin de
garantizar la calidad y uniformidad para cada preparado de un
laboratorio, vigentes en los diferentes países e incluso a nivel internacional.
Estas directrices están plasmadas en Farmacopeas y regidas por la
Organización Mundial de la Salud, quien ha dictado diferentes lineamientos
(WHO, 1998, 2000a, 2000b, 2003, 2005).
La diversidad vegetal cubana, así como la alta aceptación de la medicina
natural, constituyen uno de los pilares para el marcado interés que las
universidades y la industria farmacéutica están mostrando en el desarrollo de
fitoterápicos. En este sentido y teniendo en cuenta la amplia distribución en
nuestra zona geográfica de Murraya paniculata L. Jack (Rutaceae), es que
se considera de suma importancia el estudio y su introducción en el arsenal
fitoterapéutico de la comunidad, como una alternativa viable, a tener en cuenta
dentro de nuestra Medicina Natural y Tradicional, para tratar los síntomas y
signos de inflamación y dolor asociados a enfermedades osteomioarticulares.
M. paniculata es conocida por los sinónimos de Chalcas paniculata L., M.
exótica y por los nombres comunes de naranjo de jazmín, jazmín de Persia,
mirto, murallera y café de la india. También es reconocida tradicionalmente por
sus propiedades astringentes, estimulantes, analgésicas, antiinflamatorias,
entre otras (Roig, 1988; Ghani, 2003; Dash y cols., 2004; Rahman y cols.,
2010; Narkhede, 2012). El uso tradicional dado a esta especie vegetal en
Cuba, implica el empleo de la droga vegetal fresca, lo que limita la extensión de
su uso, considerando que el secado es uno de los procesos vitales en el
trabajo con la mayoría de las plantas medicinales.
Es importante destacar que la etapa más influyente del procesamiento poscosecha de las drogas vegetales es, sin lugar a dudas, el secado. La industria
utiliza plantas secas, lo cual facilita su almacenamiento y transportación por
periodos de tiempo prolongados y sin riesgos de deterioro (Álvarez y col.,
2008). Las excepciones son las plantas que son utilizadas para obtener aceites
esenciales, tinturas homeopáticas y algunos pocos extractos. El secado
interrumpe los procesos de degradación causados por enzimas o fermentos,
impide el desarrollo de microorganismos y las reacciones de oxidación y de
hidrólisis. Sin embargo, este proceso involucra calor por lo que las plantas que
2
Introducción
contienen aceites esenciales o sustancias volátiles, es recomendable secarlas
con temperaturas inferiores a 40 oC y con una adecuada circulación de aire
(Sharapin, 2000; Acosta y Rodríguez, 2006).
Tomando en consideración los elementos expuestos, se establece como
problema científico para esta investigación:
La tintura de M. paniculata y sus fricciones, se encuentran reportadas en el
Formulario Nacional de Fitofármacos y Apifármacos del Ministerio de Salud
Pública de Cuba, con una norma provisional que contempla algunos
parámetros físico-químicos y referencias que avalan su actividad biológica,
sobre la base del empleo de la droga vegetal en estado fresco, lo que limita la
extensión de su utilización, ya que no se cuenta con estudios que avalen la
factibilidad del empleo de la droga seca con garantía de su calidad, seguridad y
eficacia.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, se plantea la hipótesis siguiente:
La calidad de la droga seca de M. paniculata y su tintura, permite obtener un
fitomedicamento con garantías de seguridad y eficacia.
Para demostrar dicha hipótesis se proponen como objetivos de trabajo:
OBJETIVO GENERAL:
Obtener un gel a partir de la tintura M. paniculata (droga seca).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
 Evaluar la calidad y estabilidad de la droga seca de M. paniculata y su
tintura a través de la determinación de sus índices físico-químicos.
 Elaborar un gel a partir de la tintura de M. paniculata, garantizando su
calidad, aceptabilidad y estabilidad.
 Estimar desde el punto de vista preclínico, la seguridad y efectividad de
la tintura y la formulación obtenida.
3
CAPÍTULO I
REVISIÓN
BIBLIOGRÁFICA
Revisión Bibliográfica
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.1. Murraya paniculata (L.) Jack
I.1.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Y DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
M. paniculata presenta la clasificación taxonómica siguiente (Wikipedia, 2009;
Casado y col., 2011; Varona, 2013):
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta (planta vascular)
Superdivisión: Spermatophyta (planta con semillas)
División: Magnoliophyta (plantas con flores)
Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas)
Subclase: Rosidae
Orden: Sapindales
Familia: Rutaceae (Comprende plantas leñosas o raramente herbáceas,
provistas de glándulas secretoras oleíferas).
Subfamilia: Citroideae
Tribu:Clauseneae
Género: Murraya (comprende alrededor de 35 especies de plantas con flores)
Especie: Murraya paniculata (L.) Jack
La especie es conocida también por los sinónimos de Chalcas paniculata L.,
M. exótica y por los nombres comunes de naranjo de jazmín, jazmín de Persia,
mirto (Puerto Rico), murallera (Cuba), café de la india (Roig, 1988). Es un
precioso arbusto o árbol ornamental (figura 1A) con un tamaño promedio de 2 a
3 m de altura (Bhatterjee, 2000). Las hojas (figura 1B) son de color verde
oscuro, enteras, alternas o subopuestas. Foliolos de 3 a 9, aovados o a veces
rómbico-aovados, de 1,5-5 cm de largo y de 0,7-2,3 cm de ancho, obtusos u
obtusamente acuminados y con frecuencia emargindas en el ápice,
cuneiformes en la base, cortamente pecioladas. Las flores (figura 1C) son
acampanadas, fragantes, de 1,3-2 cm de ancho, sépalos triangulares, obtusos,
4
Revisión Bibliográfica
pétalos de 1-2,5 cm; los frutos (figura 1D) son de color rojo, subglobosos, de 11,6cm (Roig, 1988).
A
B
C
D
Figura 1: Detalles macromorfológicos de M. paniculata
A: Arbusto; B: Hojas; C: Flores; D: Frutos
I.1.2. HABITAT Y DISTRIBUCIÓN
M. paniculata es nativa de China, India, Sri Lanka, Viet Nam, Laos, Noreste de
Australia y Taiwán, adicionalmente, puede adaptarse a países tropicales
(Parrotta 2001). Es una de las plantas más comunes en patios y jardines, muy
empleada para formar setos y podarlas. A causa de su fácil propagación por
semillas, se ha hecho espontánea en muchos lugares, cultivándose en las
Antillas y en América tropical continental (Roig, 1988).
Esta especie se adapta a un amplio rango de condiciones. Crece en lugares
desde el nivel del mar, hasta elevaciones de 1300m. Se desarrolla en suelos
bien drenados, sedimentarios. Resiste temperaturas de -4
o
C y puede
desarrollarse tanto a la sombra como en sitios iluminados (Desert-Tropicals,
2002; Pacific Island Ecosystems at Risk, 2002; Casado y col., 2011). En
cultivos “in vitro” de la especie, se han encontrado diferencias notables en las
características de las hojas y flores respecto a las cultivadas naturalmente (Mat
y Wat, 2008).
I.1.3. USOS ATRIBUIDOS
Se ha usado tradicionalmente para formar guardarrayas en los jardines y para
adornos florales. Las hojas, cortezas y raíces de esta planta han sido
5
Revisión Bibliográfica
empleadas para el tratamiento de diarrea, disentería, reumatismo, erupciones
en la piel y picazón. Las flores son empleadas en la fabricación de cosméticos
(Roig, 1988; Ghani, 2003; Rout y col., 2007; Casado y col., 2011).
I.1.4. FITOQUÍMICA, FARMACOLOGÍA Y TOXICOLOGÍA
Datos de la literatura referentes a estudios fitoquímicos revelan la presencia en
esta especie de alcaloides indólicos como el yuehchukeno y el paniculol en las
raíces (Kong y col., 1985; Ito y Furikawa, 1990); en las hojas han sido
encontrados isoflavonoides (Lapcik y col., 2004), flavonas e flavanonas (o
chalconas) polimetoxiladas (Zhang y col., 2011). En la corteza y pulpa de los
frutos frescos fueron encontrados los flavonoides siguientes: 5,7,3',4',5'pentametoxiflavanonol,
heptametoxiflavona,
heptametoxiflavona,
pentametoxiflavona,
5,6,7,3',4',5'-hexametoxiflavona,
5,7,8,3',4',5'-hexametoxiflavona,
3,5,7,8,3',4'-hexametoxiflavona,
3,5,6,7,3',4',5'3,5,7,8,3',4',5'-
5-hidróxi-3,7,8,3',4'-
5-hidróxi-3,7,8,3',4',5'-hexametoxiflavona
y
8-hidróxi-
3,5,7,3',4',5'-hexametoxiflavona (Ferracin y col., 1998). De las partes aéreas de
la planta fueron aisladas las coumarinas 1',2'-O-isopropilideno murrangatina
(Saied y col., 2008), onfamurrayina (Kinoshita y Shimada, 2002), murramarina
A y bismurragantina (Negi y col., 2005).
La especie también contiene aceites esenciales, cuya composición varía
dependiendo del órgano de la planta y el origen geográfico. Flores de la India
tienen como principales componentes a δ-elemeno, β-cariofileno, germacreno
D, nerolidol, benzoato de benzilo, benzoato de feniletilo y manol (Rout y col.,
2007). El aceite esencial de las hojas y frutos de plantas que crecen en Nigeria
es rico en sesquiterpenoides y los principales compuestos de las hojas son βciclocitral, salicilato de metilo, trans-nerolidiol, α- y β-cubebeno, cubenol y
isogermacreno; los frutos contienen β-cariofileno, zingibereno, germacreno D,
α-copaeno y α-humuleno (Olawore y col., 2005). Especies de Bangladesh
contienen aceites esenciales ricos en óxido de cariofileno, β-cariofileno,
espatulenol, β-elemeno, germacreno D, y 4-metileno-6-(1-propenilideno)cicloctano (Chowdhury y col., 2008; Mesquita y col., 2008). Un estudio del
6
Revisión Bibliográfica
aceite esencial obtenido a partir de las hojas de la especie, cultivada en zonas
montañosas del centro de Cuba, mostró la presencia de β-cariofileno, βcubebeno, δ-cadineno e germacreno D, entre otros (Jorge y col., 2012).
Desde el punto de vista de las actividades biológicas, el aceite esencial de M.
paniculata demostró actividad insecticida (Qing y col., 2010), antibacteriana
contra Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella typha, Enterobacter
aerogenes y Shigella flexineri, así como propiedades antifúngicas (Sundaram y
col., 2011), antiinflamatoria y analgésica (Dash y col., 2004). Otros estudios
revelan la actividad antioxidante de un extracto etanólico obtenido a partir de la
planta (Sundaram y col., 2011), antinociceptiva, antiinflamatoria (Narkhede y
col., 2012; Rodanant y col., 2012), y antidiarreica (Rahman y col., 2010).
Mientras tanto, Kumar y col. (2011) demostraron la acción analgésica del
extracto de éter de petróleo/acetato de etilo/metanol (1:1:1), de la corteza del
tallo de la especie. El extracto clorofórmico de las hojas presentó acción contra
Entamoeba histolytica (Sawangjaroen y col., 2006).
Los estudios preliminares del extracto etanólico de las hojas de la especie, en
plantas que crecen en la región occidental de Cuba, han mostrado desde el
punto de vista fitoquímico la presencia, entre otros compuestos, de copaeno, βcubebeno, β-cariofileno, germacreno B, ostol, 6-fenil izoquinolina, sitosterol, Lprolina, ácido ferúlico y mio-inositol, para los cuales están descritas en la
literatura propiedades antiinflamatorias y analgésicas. Adicionalmente, la
evaluación preclínica inicial de los extractos, no mostró ninguna evidencia de
toxicidad cutánea aguda en los animales de ensayo, presentó potencial
antioxidante y corroboró el efecto antiinflamatorio (modelo de edema auricular),
tradicionalmente reconocido, con resultados próximos a los encontrados para el
tratamiento con benzidamina, en las condiciones testadas (Varona, 2013).
Resultados publicados en 2014 sugieren que los flavonoides totales extraídos
de las hojas de M. paniculata tienen un efecto protector contra la lesión renal
en la nefropatía diabética (Jingtao y col., 2014). Por otro lado, el efecto
7
Revisión Bibliográfica
vasorelajante de la fracción clorofórmica del extracto metanólico de la planta
también fue demostrado. Dos coumarinas fueron aisladas a partir de esta
fracción: la nueva sustancia kimcuongina y la ya conocida murracarpina, ambas
mostraron actividad vasorelajante con valores de CI50 de 37,7 µM e 139,3 µM,
respectivamente (Nguyen y col., 2014). Otro estudio fitoquímico llevó al
aislamiento del alcaloide isomurrayafolina B, que mostro actividad analgésica
profunda en modelos de dolor periférico y central (Fazal y col., 2014). Es
también muy importante realzar la presencia de trigonelina en esta especie
vegetal. Además de las semillas de las leguminosas y el café (Coffea arabica
L.), apenas algunas pocas especies acumulan altas concentraciones de
trigonelina y resultados recientes muestran a M. paniculata entre estas. La
trigonelina fue encontrada en todas las partes de la planta y más del 70 % del
total, se encontraba en las hojas (Ashihara y Watanabe, 2014). Este compuesto
bioactivo tiene actividad hipoglucémica, hipolipidémica, neuroprotectora,
sedativa, contribuye a la mejora de la memoria y también presenta actividad
antibacteriana, antiviral y antitumoral, y demostró reducir a neuropatía diabética
auditiva y la agregación plaquetaria (Zhou y col., 2012).
Gautam y col. (2012) en estudios de toxicidad aguda y sub-aguda por vía oral,
de un extracto etanólico al 50% obtenido de las hojas de M. paniculata,
demostraron que dicho extracto era seguro, al no encontrar signos de toxicidad
por esta vía en los animales de experimentación.
I.2. MEDICAMENTOS HERBARIOS. GENERALIDADES
El concepto de medicamentos herbarios abarca hierbas, material herbario,
preparaciones herbarias y productos herbarios acabados, que contienen como
principios activos partes de plantas, u otros materiales vegetales, o
combinaciones de esos elementos (WHO, 2000a; 200b; Morales M. y Morales
J., 2009; Neeraj y Bhupinder, 2011).
En los medicamentos herbarios se reúne el conocimiento ancestral
etnobotánico y etnomédico, así como, los aspectos farmacológicos preclínico y
clínico. De esta forma, se continúa el uso de la planta medicinal, ahora en
forma de extracto estandarizado y con el respaldo de toda la tecnología
8
Revisión Bibliográfica
farmacéutica actual, lográndose un medicamento que no guarda diferencia en
su aspecto y calidad con los medicamentos alopáticos, pero presenta
generalmente un elevado rango terapéutico, es decir, condiciones de mayor
seguridad que hacen confiable su uso (Morales M. y Morales J., 2009).
Los medicamentos herbarios tienen una considerable importancia en el
comercio internacional. Sigue en aumento el reconocimiento de su valor clínico,
farmacéutico y económico, pero solo una cantidad relativamente pequeña de
especies de plantas han sido estudiadas para posibles aplicaciones médicas y
los datos sobre seguridad y eficacia están disponibles para un número reducido
de ellas en algunas farmacopeas; este inconveniente limita el desarrollo,
producción y comercialización de fitomedicamentos, tanto en los mercados
nacionales como internacionales. Por ello, se hace necesario enfatizar en la
necesidad de garantizar su control de la calidad, con la aplicación de técnicas
modernas y el empleo de patrones apropiados (Busse, 2000; Osorio, 2009;
Neeraj y Bhupinder, 2011).
La calidad de un producto herbario es un estado determinado por su identidad,
pureza,
volumen,
marcadores
químicos,
propiedades
físico-químicas,
propiedades biológicas o por el proceso industrial. Al ser mezclas de varios
compuestos químicos son difíciles de caracterizar, siendo esencial una
definición científica clara del material crudo (Ahmad y col., 2006), para lo cual
se hace necesario garantizar un correcto control del material vegetal desde la
recolección, tener conocimiento de la especie en cuanto a la organografía y
fisiología de la misma, del lugar donde se realiza la colecta y saber las
variaciones que puede sufrir la composición de las plantas en las diferentes
épocas y fases de su vida. (Sharapin y col. 2000; HMPWG, 2001; WHO, 2003).
Todo lo que en cuanto a control de calidad pueda ser garantizado durante el
proceso de investigación y desarrollo de medicamentos herbarios contribuirá a
una adecuada estandarización, palabra de orden en la actualidad en el campo
de los productos naturales y que comprende información y controles totales
9
Revisión Bibliográfica
para, esencialmente, garantizar una composición consistente de todas las
drogas vegetales, incluyendo operaciones analíticas para sus marcadores de
identificación y ensayos para sus principios activos. El control de calidad al
producto terminado debe conducir a la producción de formulaciones herbarias
estandarizadas y terapéuticamente efectivas. Cada país necesita explorar sus
plantas medicinales más relevantes, pero esto solo podrá lograrse si los
medicamentos herbarios son evaluados y analizados usando técnicas
modernas de estandarización (Choudhary y Singh, 2011; Garg y col., 2012).
I.3. GELES
I.3.1. GENERALIDADES
Los geles son sistemas dispersos, por lo general transparentes o traslúcidos,
formados por líquidos (hidrófilos o hidrófobos) a los que se adicionan
sustancias de naturaleza coloidal capaces de formar una estructura continua,
cuya naturaleza y características definen las propiedades reológicas del
conjunto. Otro modo de definir los geles es a partir de su método de obtención;
en este sentido, éstos se obtienen a partir de soluciones coloidales que, por
diferentes modificaciones en su entorno, adquieren una estructura ordenada
tridimensional que fija las partículas de soluto alrededor de las del coloide (Juvé
y col., 2007).
Es importante destacar que los geles con el tiempo pierden su condición y su
estructura puede llegar a romperse, su estabilidad depende en gran medida de
una correcta formulación, por lo que deben tomarse en consideración en este
proceso las incompatibilidades que se puedan presentar, en la forma
farmacéutica en sí y otras específicas del polímero utilizado. Igualmente es
preciso considerar algunos factores desencadenantes de su inestabilidad como
son la temperatura, los cambios de pH, la agitación violenta, la presencia de
electrólitos, etc. (Le Hir, 1995).
10
Revisión Bibliográfica
I.3.2. CLASIFICACIÓN DE LOS GELES
Existen diferentes criterios de clasificación de los geles, considerados como
forma de aplicación tópica. En función de su consistencia y propiedades
reológicas, algunos de ellos pueden acondicionarse en aplicadores (barras) o
bien en tubos. Algunos autores consideran también dentro de esta forma de
aplicación a preparaciones líquidas viscosas de diferente naturaleza. Los
criterios más comunes de clasificación son (Juvé y col., 2007):
 Dependiendo de su comportamiento frente al agua:
-
Geles hidrófilos o hidrogeles: constituidos por agua, glicerina,
propilenglicol u otros líquidos hidrofílicos. Gelificados por sustancias de
tipo poliméricas, goma tragacanto, almidón, derivados de la celulosa,
polímeros carboxílicos o silicatos de aluminio y magnesio.
-
Geles hidrófobos o lipogeles (oleogeles): constituidos por parafina
líquida adicionada de polietileno o por aceites grasos gelificados por
anhídrido silícico coloidal o por jabones de aluminio y zinc.
 Según el número de fases en que están constituidos:
-
Geles monofásicos: el medio líquido lo constituye una sola fase o
líquidos miscibles; agua-alcohol, solución hidroalcohólica, aceite, etc.
-
Geles bifásicos: constituidos por dos fases líquidas inmiscibles,
formándose una estructura transparente con propiedades de semisólido.
Se pueden dividir en dos grupos:
 TOW geles (Transparent Oil in Water emulsions): son geles
bifásicos transparentes, obtenidos mediante solubilización micelar de
la parte oleosa de la fórmula, un emulgente que se comporta como
agente solubilizante. Se presentan en forma de un sistema de
cristales líquidos, transparentes y viscosos que pueden incorporar
activos tanto liposolubles como hidrosolubles. Suelen ser simples en
cuanto a ejecución y componentes, integran uno o varios emulgentes
11
Revisión Bibliográfica
hidrófilos, capaces de formar micelas, un cosolvente que facilita la
micelación del lípido y un lípido (o mezcla de lípidos fluidos y agua).
 TAS geles (Transparents Aqua Silicone emulsions): son geles
transparentes basados en emulsiones de siliconas. Se consideran
como cremas transparentes de agua en silicona. Para prepararlos se
incorpora la fase acuosa sobre la fase oleosa lentamente y con
agitación media-alta. Se elaboran en frío y pueden incorporar
diferentes activos cosméticos tales como clorhidrato de aluminio,
filtros solares, etcétera.
 Según su viscosidad:
-
Geles fluidos
-
Geles semisólidos
-
Geles sólidos (formulación de los stikcs, desodorantes y colonias
sólidas)
 Según su estructura:
-
Geles elásticos: Un gel típico elástico es el de gelatina. Se obtiene por
enfriamiento del sol liófilo que resulta cuando se calienta esta sustancia
con agua. Otros soles dan geles elásticos, por ejemplo: agar, almidón,
pectina, siempre que no sean demasiado diluidos. El gel elástico por
hidratación se regenera. Cuando un gel elástico ha tomado mucho
líquido, por ejemplo agua, de la fase vapor, todavía puede adsorber
cantidades considerables cuando se lo coloca en el líquido, aumentando
notablemente el volumen del gel; este fenómeno se llama imbibición o
hinchamiento o sweeling.
-
Geles no elásticos: El gel no elástico más conocido es del ácido silícico
o gel de sílice. Se obtiene mezclando soluciones de silicato de sodio con
ácido clorhídrico en concentraciones apropiadas. Un gel no elástico
(sílice) se hace vítreo o se pulveriza y pierde su elasticidad por secado.
Los geles no elásticos no tienen imbibición o hinchamiento, pueden
tomar líquido sin cambio de volumen.
12
Revisión Bibliográfica
 Según la naturaleza de la fase interna:
-
Inorgánicos: como el magma de la bentonita.
-
Orgánicos:
 Naturales: como la goma arábica y la gelatina.
 Sintéticos:
como
la
carboximetílcelulosa
sódica
e
hidroxipropílcelulosa.
I.3.3. APLICACIONES MÉDICO - FARMACÉUTICAS DE LOS GELES
Los geles pueden ser usados como lubricantes, analgésicos musculares, en
electrocardiografía, como geles dentales de fluoruros, geles nasales, como
excipientes para tratamiento dental, dérmico y de modo intravaginal, entre
otros. Esta forma farmacéutica acrecienta la adhesividad y así es capaz de
mantener durante más tiempo en contacto al principio activo con la piel o las
mucosas (nasales, vaginales, etc.). Son usados como lubricantes y
acarreadores de espermicidas vaginales, otra virtud de los geles es que tienen
un amplio rango de humectación, por lo tanto su evaporación y la absorción de
sus principios activos pueden ser ampliamente manipuladas (Farmacopea de
Estados Unidos Mexicanos, 1994).
Ser bien tolerados, fácilmente lavables y producir frescor, pueden considerarse
las principales ventajas de esta forma farmacéutica, aunque no deben dejar de
tomarse en consideración sus desventajas entre las que se destacan su
incompatibilidad con numerosos principios activos, su tendencia a la
desecación y su bajo poder de penetración, lo que los hace ser indicados
fundamentalmente para tratamientos superficiales (Remington, 1998).
I.4. PRUEBAS DE PREFERENCIA Y ACEPTACIÓN
La industria farmacéutica y nutracéutica que se encargan de desarrollar
productos beneficiosos para la salud encuentra una oportunidad en el mercado
debido a la creciente demanda de los consumidores por el cuidado de su salud.
En este sentido, aplicar el análisis sensorial en el desarrollo de productos,
especialmente estas pruebas de tipo afectivas, puede implicar importantes
ventajas, pues hoy en día los consumidores valoran que los productos tengan
unas características sensoriales aceptables. Por ello, la relación entre la
13
Revisión Bibliográfica
conformidad del producto y unas características sensoriales aceptables es
cada vez más importante a la hora de desarrollar un producto. Por ejemplo, en
el caso de los productos farmacéuticos los consumidores se ven obligados a
tomar un medicamento o aplicar algunos por vía externa y soportar
características tales como: sabores amargos, una sensación astringente, o el
excesivo tamaño de las cápsulas o tabletas que dificultan la ingesta, así como
una textura arenosa en la piel, entre otras (Ainia, 2011).
En tal sentido, la aceptación y la preferencia son medidas usadas por los
profesionales del campo del análisis sensorial y del consumidor, en especial
para los productos que se encuentran en sus primeras etapas de desarrollo.
Ambas medidas ofrecen información sobre el nivel de agrado o rechazo que
causa un producto, pero la aceptación y la preferencia aportan datos diferentes
que no deberían considerarse intercambiables. Adicionalmente existen
diferentes riesgos, como por ejemplo en la interpretación de los resultados,
cuando se usan estas medidas en pruebas de bienes de consumo (Rothman,
2011).
En estas pruebas, también conocidas como afectivas, el panelista expresa el
nivel de agrado, aceptación y preferencia por un producto alimenticio, para lo
cual se emplean escalas de calificación de las muestras. Particularmente las
pruebas de preferencia se utilizan para definir el grado de aceptación y
preferencia de un producto determinado por parte del consumidor. Para estas
pruebas se requiere de un grupo bastante numeroso de panelistas los cuales
no necesariamente tienen que ser entrenados y en el caso de las pruebas de
aceptación permiten medir además del grado de preferencia, la actitud del
panelista o catador hacia el producto, es decir se le pregunta al consumidor si
estaría dispuesto a adquirirlo y por ende su gusto o disgusto frente al producto
catado. Estas últimas son de mucha utilidad en el desarrollo de nuevos
productos, ante el cambio de tecnologías, la mejora de productos, reducción de
costos, la determinación de la vida útil de los productos, etc. (Carreto, 2012).
14
CAPÍTULO II
MATERIALES Y
MÉTODOS
Materiales y Métodos
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1. RECOLECCIÓN Y SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
La especie vegetal utilizada para la realización del trabajo fue Murraya
paniculata (L.) Jack, recolectada en la Finca “La Quirubina”, localidad de
Ceiba del Agua, municipio Caimito del Guayabal, provincia Artemisa,
correspondiendo a plantas adultas.
Se trabajaron cuatro lotes de plantas: Febrero/2013 (estado fenológico
vegetativo), Enero/2014 (estado de fructificación), Abril/2014 (floración),
Octubre/2014 (estado vegetativo). La especie fue recolectada por el campesino
Bienvenido Lazo de la Vega, herborizada y registrada en el Jardín Botánico
Nacional con el código de identificación HFC 85589 (HAJB).
De las colectas realizadas solo se emplearon las hojas y tallos finos (follaje),
previamente lavados con agua potable, los cuales fueron cortados en trozos
pequeños con ayuda de tijeras, para facilitar el proceso de secado.
II.2. PARÁMETROS DE CALIDAD DEL MATERIAL VEGETAL DE M.
paniculata
II.2.1. ESTUDIO DE SECADO
El secado se realizó a 38 ºC, en estufa con recirculación de aire, marca AISET,
modelo YLD-6000 de fabricación China. En el estudio se utilizaron 200 g de
muestra por cada réplica. Se tuvo en cuenta el número de días que demoraba
la droga en alcanzar peso constante (tiempo de secado) y el porcentaje de la
pérdida en peso de agua (con una frecuencia de 12 h) (NRSP 309, 1992;
Miranda y Cuéllar 2000).
III.2.2. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA DROGA CRUDA DE M.
paniculata
Los diferentes ensayos se realizaron según la metodología descrita por la
NRSP 309 (1992) y Miranda y Cuéllar (2000), los cuales se señalan a
continuación:
15
Materiales y Métodos
a) Humedad residual
Se empleó el método azeotrópico por triplicado, a partir de 10 g de muestra, se
utilizó tolueno como disolvente, un equipo Dean Star, una plancha de
calentamiento eléctrica marca IKA-C-MAG-HP7, de fabricación China y para las
pesadas se usó una balanza analítica marca Sartorius.
Los resultados se obtuvieron a partir de la expresión:
Hr =
Vf
-
Vi
M
x 100
Donde:
Hr: humedad residual (%)
Vf: volumen final de agua (mL)
Vi: volumen inicial de agua (mL)
M: masa de la muestra (g)
100: factor matemático para el cálculo.
b) Sustancias solubles o extraíbles
Este ensayo se llevó a cabo por triplicado, a partir de 5 g de droga. Se utilizó
como disolvente una mezcla hidroalcohólica al 80 %. Las muestras se agitaron
en una zaranda modelo BIOZARD- 2013 por un tiempo de 6 horas.
Los cálculos se realizaron según:
Ss =
R.500.100
M (100-H)
Donde:
Ss: sustancias solubles (%)
R: residuo de la muestra (g)
M: masa de la muestra (g)
H: humedad residual (%)
500 y 100: factores matemáticos para el cálculo.
16
Materiales y Métodos
c) Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido
clorhídrico al 10 %
Para las determinaciones se empleó una mufla modelo MLW VEB
ELEKTROBAD FRANKENHAUSEN. Las pesadas se realizaron en balanza
analítica marca SARTORIUS. Cada determinación se efectuó 6 veces a partir
de 2 g de material.
Cenizas totales
Los cálculos se efectuaron por la expresión siguiente:
CT =
M2 - M
x 100
M1 - M
Donde:
Ct: cenizas totales (%)
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa del crisol con la muestra (g)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
100: factor matemático para el cálculo.
Cenizas solubles en agua
Las determinaciones se llevaron a cabo a partir de las cenizas totales, luego de
disolver las mismas con agua destilada. Los cálculos se realizaron mediante la
expresión siguiente:
Ca =
M2 - Ma
x 100
M1 - M
Donde:
Ca: cenizas solubles en agua en base hidratada (%)
M2: masa del crisol con las cenizas totales (g)
Ma: masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g)
M1: masa del crisol con la muestra de ensayo (g)
M: masa del crisol vacío (g)
100: factor matemático para el cálculo.
17
Materiales y Métodos
Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %
Se determinaron a partir de las cenizas totales, después de tratar las mismas
con ácido clorhídrico al 10 %. Los resultados se obtuvieron por la fórmula
siguiente:
B=
M2 - M
x 100
M1 - M
Donde:
B: cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada (%)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa del crisol con la porción de ensayo (g)
100: factor matemático para el cálculo.
II.2.3. ESTABILIDAD DE LA DROGA CRUDA DE M. paniculata
El estudio de estabilidad de la droga cruda, follaje de M. paniculata, fue
desarrollado al lote procedente de la colecta de Febrero de 2013, envasado en
bolsas de polietileno de baja densidad (de uso muy difundido por su bajo
costo), durante un periodo de un año en estante, a temperatura ambiente (T=
30 oC ± 2 oC, Humedad relativa de 70 % ± 5 %). La frecuencia de los análisis
fue determinada a partir de la Regulación No. 23 – 2000 del CECMED, que
establece los requerimientos de los estudios de estabilidad para el registro de
productos farmacéuticos nuevos y conocidos, y fue de 0, 3, 6, 9 y 12 meses.
II.2.3.1. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
Se evaluaron parámetros físico-químicos como propiedades organolépticas,
humedad residual, sustancias solubles en etanol al 80 %, cenizas totales,
cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %. (ya
referidos en el acápite II.2.2).
18
Materiales y Métodos
II.2.3.2. ESTUDIO QUÍMICO CUALITATIVO
Se realizó un análisis por cromatografía en capa delgada dirigido a la detección
de L-prolina, uno de los marcadores químicos de la planta. Se usaron placas
de gel de sílice (F 254 nm de la Merck) de 10 x 5 cm sobre soporte de vidrio.
Se empleó como sustancia de referencia L-prolina (99 % pureza, procedente
de la Merck). El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente. Las
condiciones de trabajo fueron las siguientes:
 Fase móvil: n-butanol: ácido acético: agua (4:1:1)
 Revelado: Rociado con solución de ninhidrina modificada (0,2 g de
ninhidrina en 5 mL de ácido acético y 95 mL de n-butanol) y calor hasta
la aparición de manchas.
II.2.3.3. CONTROL MICROBIOLÓGICO
Este estudio se llevó a cabo en los Laboratorios MEDSOL. Se realizó un conteo
total de aerobios mesófilos, hongos, levaduras y patógenos (Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa), considerando las normativas descritas en
la USP 35 - NF 30 (2012) para los productos de Categoría 2, entre los que se
incluye el producto en investigación.
II.3. OBTENCIÓN DE LA TINTURA DE M. paniculata
A partir del material vegetal seco, se elaboraron cuatro lotes de tinturas al 20
%, con una dimensión de 2 L cada uno. Fue utilizado el método de maceración,
por un período de 7 días, a una temperatura de 30 ºC ± 2 ºC, empleándose
como menstruo una mezcla hidroalcohólica al 80 %. Se siguió el procedimiento
descrito por la NRSP 312, 1992 y Miranda y Cuéllar, 2000.
19
Materiales y Métodos
II.4. PARÁMETROS DE CALIDAD DE LA TINTURA DE M. paniculata
II.4.1. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
Para las determinaciones de calidad se siguió el procedimiento descrito en la
NRSP 312, 1992 y por Miranda y Cuéllar, 2000, se realizaron cinco réplicas
para cada experimento, siendo evaluados los parámetros siguientes:
a) Requisitos organolépticos
a.1) Determinación del olor. Se toma una tira de papel secante de
aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de longitud y se introduce un
extremo en la muestra de ensayo. Se huele y se determina si corresponde con
la característica del producto.
a.2) Determinación del color. Se toma un tubo para ensayos, bien limpio y
seco, se llena hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se
observa el color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en
capas. Se informa el resultado.
b) pH
Para la determinación del pH se utilizó un pH-metro modelo Basic 20 Crizon,
previamente ajustado con soluciones buffer a pH = 4,01 y 7.
c) Sólidos totales
Se empleó una balanza de peso seco marca Sartorious. Los sólidos totales St
(%) se calcularon mediante la fórmula siguiente:
St 
Pr  P
 100
V
Donde:
Pr = masa de la cápsula más el residuo (g)
P = masa de la cápsula vacía (g)
V = volumen de la porción de ensayo (mL)
100 = factor matemático
20
Materiales y Métodos
d) Densidad relativa
Se realizó por picnometría y se utilizó una balanza analítica monoplato marca
Metttler H10T. De la muestra de ensayo se tomó la cantidad necesaria de
acuerdo con la capacidad del picnómetro y se enfrió a 25 oC.
La densidad relativa a 25 oC se calculó mediante la fórmula siguiente:
D25
=
M1 - M
M2 - M
Donde:
M = masa del picnómetro vacío (g)
M1= masa del picnómetro con la muestra de ensayo (g)
M2= masa del picnómetro con agua (g)
D= densidad relativa (g/mL)
e) Índice de refracción
Se utilizó un refractómetro ABBE de la marca Carlzeiss Jena.
f) Contenido alcohólico
Se desarrolló mediante un proceso de destilación a partir de 25 mL de la
muestra de análisis, hasta garantizar que todo el alcohol presente en la misma
fuera arrastrado hacia el destilado. Con la posterior determinación del peso
específico de dicho destilado se obtuvo el porcentaje de alcohol de la muestra
según datos tabulados (NRSP 312, 1992 y Miranda, 2000).
P.E = M 1 - M
M2 - M
21
Materiales y Métodos
Donde:
M1 = peso del picnómetro con la muestra a 20 ºC (g)
M2 = peso del picnómetro con agua a 20 ºC (g)
M = peso del picnómetro vacío (g)
P.E= Peso específico (g/mL)
g) Análisis capilar
Este ensayo se desarrolló según lo descrito en la NRSP 312, 1992, empleando
papel Whatman # 1. Para el análisis e interpretación de la imagen se tuvieron
en cuenta los aspectos siguientes:
 Color
 Altura
 Descripción de las diferentes partes
 Examen bajo la luz ultravioleta
 Cambios de coloración con vapores de amoníaco
II.4.2. CONTROL MICROBIOLÓGICO
Se siguió el mismo procedimiento referido en el acápite II.2.3.3.
II.4.3. ESTUDIO FITOQUÍMICO DE LA TINTURA
II.4.3.1. TAMIZAJE FITOQUÍMICO
Las tinturas obtenidas fueron sometidas a diferentes ensayos (figura 2), según
lo establecido en la NRSP 312, 1992 y por Miranda y Cuéllar, 2000, para
extractos alcohólicos.
22
Materiales y Métodos
EXTRACTO ALCOHÓLICO
O TINTURA
Dividir en fracciones
ENSAYO
BALJET
(Lactonas y
Coumarinas)
ENSAYO
RESINAS
(Resinas)
ENSAYO
FEHLING
(Sustancias reductoras)
ENSAYOS
ENSAYO
TRICLORURO
FÉRRICO
(Fenoles)
ENSAYO
ESPUMA
(Saponinas)
DRAGENDORFF
MAYER
(Alcaloides)
ENSAYO
NINHIDRINA
(Aminoácidos)
ENSAYO
LIEBERMANN-BURCHARD
(Triterpenos y/o esteroides)
ENSAYO
SHINODA
(Flavonoides)
ENSAYO
BORNTRAGER
(Quinonas)
ENSAYO
ANTOCIANIDINAS
(Antocianidinas)
Figura 2. Ensayos de tamizaje fitoquímico efectuados a la tintura de
M. paniculata
II.4.3.2. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
Se siguió el mismo procedimiento referido en el acápite II.2.3.2
II.4.3.3. ANÁLISIS POR
RESOLUCIÓN (CLAR)
CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA
DE
ALTA
Las muestras fueron filtradas por membrana de teflón y se introdujeron
directamente en el equipo. Se utilizó como sustancia de referencia el
aminoácido L-prolina (99 % de pureza, procedente de la Merck) a la
concentración de 200 µg/mL y el mismo se solubilizó en metanol grado CLAR.
Para el estudio se utilizó un cromatógrafo líquido Smartline (Knauer, Alemania)
compuesto por una interfase Manager 5000, una bomba cuaternaria S-1000,
horno para columnas (KNAUER), autoinyector Marathon 3800(Knauer),
detector UV-2500 todo integrado al programa ClarityChrom v 2.4 para la
adquisición, procesamiento y reporte de datos (Knauer, Alemania). Las
condiciones cromatográficas más adecuadas de trabajo fueron las siguientes:
23
Materiales y Métodos
 Fase móvil: Solución buffer fosfato pH=2,4: acetonitrilo (70:30)
 Detector UV: 440 nm
 Flujo: 0,6 mL/min., modo isocrático
 Volumen de inyección: 20 µL
 Columna: C-18 No. de parte UP5ODB-150/046, No de serie 1105333,
lote A-5-7130, fabricante (Interchim, FRANCIA).
 Temperatura de la columna: 25 ºC
En la determinación cualitativa se tuvo en cuenta el tiempo de retención del
estándar y las muestras, considerándose como positivas para la presencia de
L-prolina el valor que se encontraba en el rango promedio de su tiempo de
retención.
La determinación cuantitativa se realizó mediante una curva de calibración
elaborada con diferentes concentraciones de la sustancia de referencia Lprolina (30, 50, 200, 300 y 350 µg/mL) y la estimación de la concentración de
dicho compuesto en las muestras analizadas, las cuales constituyeron las
tinturas. Se valoró el pico positivo para el patrón ensayado y el valor de área
que correspondía al mismo.
Con los valores de áreas obtenidos a partir del estándar de trabajo se elaboró
la curva de calibración: Área (y) vs Concentración teórica (x). Se realizó un
análisis de regresión lineal y se obtuvo la ecuación lineal (y=a+bx) y el valor de
correlación (r).
En la ecuación lineal obtenida se reemplazó el valor de Y por cada una de las
cuentas de área de las muestras y sus réplicas. Este resultado correspondió a
la concentración del compuesto de interés (aminoácido prolina) expresada en
µg/mL de muestra.
II.4.4. ESTABILIDAD DE LA TINTURA DE M. paniculata
Para evaluar la estabilidad integral de la tintura se escogió el lote obtenido de la
colecta de Febrero/2013. La tintura se mantuvo almacenada en frascos de
cristal ámbar, de 120 mL de capacidad, con tapas de baquelita o propileno,
ranuradas o estriadas, aptas
para contener productos de uso humano, a
temperatura ambiente (T= 30 oC ± 2 oC, Humedad relativa de 70 % ± 5 %).
24
Materiales y Métodos
Se dio seguimiento al comportamiento de los parámetros físico-químicos de
calidad, determinación del contenido de L-prolina por CLAR y control
microbiológico, reflejados en los acápites II.4.1, II.4.3.3 y II.2.3.3.
La frecuencia de los análisis fue determinada a partir de la Regulación No. 23 2000 del CECMED, que establece los requerimientos de los estudios de
estabilidad para el registro de productos farmacéuticos nuevos y conocidos, y
fue de 0, 3, 6, 9 y 12 meses.
II.5. OBTENCIÓN DEL GEL A PARTIR DE LA TINTURA DE M. paniculata
Se prepararon tres lotes de las formulaciones en el laboratorio, siguiendo la
técnica de incorporación (figura 3). Las formulaciones se envasaron en frascos
de cristal color ámbar, de 200 g de capacidad, con tapas de baquelita o
propileno, aptas para contener productos de uso humano y fueron evaluados
los parámetros físicos-químicos y tecnológicos, que permiten establecer la
calidad de la formulación.
Carbopol
Agua (50 mL)
(Baño ultrasónico)
Vaso precipitado (250mL)
Tintura
Mentol
Propilenglicol
Metilparabeno
Propilparabeno
Agitación manual
Completar volumen con
agua
Figura 3. Diagrama de flujo para la elaboración del gel de M. paniculata
25
Materiales y Métodos
Se empleó la tintura al 20 % de M. paniculata (droga seca) como ingrediente
farmacéutico activo y la misma se utilizó al 30 % en la formulación. El resto de
los componentes fueron de calidad farmacéutica y se listan a continuación:
 Mentol
 Propilenglicol
 Carbopol 940
 NaOH al 10 %
 Metilparabeno
 Propilparabeno
 Agua destilada
II.5.1.
EVALUACIÓN
DE
LOS
PARÁMETROS
FÍSICO-QUÍMICOS
Y
TECNOLÓGICOS DEL GEL
Se realizaron las mediciones de los parámetros por triplicado, calculándose sus
valores promedios y sus respectivas desviaciones estándar (n=3, / s).
a) Determinación de las propiedades organolépticas
Para este análisis se tomó en cuenta, de forma general, el olor, color, brillo y
apariencia de los geles.
b) Determinación del pH
Se determinó el pH de cada una de las muestras utilizando un pH-metro
modelo Basic 20 Crizon, previamente ajustado con soluciones buffer a pH =
4,01 y 7. Para hacer la medición se transfirieron aproximadamente 20 g de
muestra a un vaso de precipitados de 50 mL.
c) Determinación del área de extensibilidad
Se tomaron dos láminas de vidrio de 12 x 15 cm, colocando una de ellas sobre
papel milimetrado. Se añadieron 2 g de preparación pesado en balanza técnica
digital Sartorius MC 1, en el centro de la placa antes señalada y se colocó
26
Materiales y Métodos
cuidadosamente la otra lámina de vidrio; esta última con un peso de 250 g.
Transcurridos 5 minutos, se determinó la distancia desde el punto de aplicación
hasta donde se extendió el semisólido. Se midió la extensibilidad en cuatro
direcciones perpendiculares entre sí (PNO-LAB 12-002, 2002; Pérez y col.,
2013).
Se calculó el área de la circunferencia formada aplicando la fórmula siguiente:
Donde:
A: área de la circunferencia formada (cm2)
d1 y d2: diámetros perpendiculares a la circunferencia formada (cm)
E: extensibilidad del producto (cm2)
d) Propiedades viscoelásticas
La firmeza (N), la consistencia (g/s), la cohesividad (N), y el índice de
viscosidad (m.pa.s) fueron determinadas mediante el empleo de un analizador
de textura (textureanalyzerTA HD plusStable Microsystems), utilizando 50 g de
muestra y las condiciones de trabajo siguientes: diámetro del vástago 18,8 mm,
modo de prueba compresión, velocidad de pre-test y
test: 1,00 mm/s,
velocidad post test 10 mm/s y distancia de penetración 30,0 mm.
II.5.2. ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL GEL DE M. paniculata
II.5.2.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
El análisis estuvo encaminado a la detección del aminoácido L-prolina, para lo
cual se se pesó 1 g de gel, se redispersó en etanol al 80 % en un baño
ultrasónico por 10 minutos y posteriormente se filtró. Al filtrado se le realizó el
análisis por cromatografía en capa delgada, siguiendo el mismo procedimiento
descrito en el acápite II.2.3.2.
27
Materiales y Métodos
II.5.2.2. ANÁLISIS POR
RESOLUCIÓN (CLAR)
CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA
DE
ALTA
Para el análisis se pesó 1 g de gel, se redispersó en metanol grado CLAR en
un baño ultrasónico por 10 minutos y posteriormente se filtró. Las muestras
fueron filtradas por membrana de teflón y se introdujeron directamente en el
equipo, siguiendo las mismas condiciones cromatográficas que se detallan en
el acápite II.4.3.3.
II.5.3. CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL GEL DE M. paniculata
Se siguió el mismo procedimiento referido en el acápite II.2.3.3.
II.5.4. PRUEBA DE PREFERENCIA O ACEPTACIÓN DE LA FORMULACIÓN
Para la realización de esta prueba se utilizó una escala hedónica de cinco
puntos la cual se muestra a continuación:
 Me gusta mucho (5 puntos)
 Me gusta moderadamente (4 puntos)
 No me gusta ni me disgusta (3 puntos)
 Me disgusta moderadamente (2 puntos)
 Me disgusta mucho (1 punto)
El estudio se llevó a cabo con 50 jueces no adiestrados, en un local
acondicionado al efecto. En anexo 1 se muestra la boleta de evaluación
sensorial de la
formulación con los diferentes atributos analizados. La
metodología empleada para llevar a cabo esta prueba se basó en lo reportado
por Arcila y col. (2006), Acevedo y col. (2009) y Castañeda y col. (2009).
II.5.5. ESTABILIDAD INTEGRAL DE LA FORMULACIÓN
El estudio de estabilidad del gel de M. paniculata, fue desarrollado durante un
periodo de un año, en condiciones de estante (temperatura de 30 oC ± 2 oC,
Humedad relativa de 70 % ± 5 %), durante el cual fueron evaluados sus
parámetros físico-químicos de calidad, determinación del contenido de L-
28
Materiales y Métodos
prolina por CLAR y control microbiológico. Se seguió la misma metodología
descrita en los acápites II.5.1, II.5.2.2 y II.2.3.3.
II.6. EVALUACIÓN PRECLÍNICA DE LA TINTURA DE M. paniculata Y EL
GEL
II.6.1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA DÉRMICA DE LA TINTURA DE M.
paniculata Y EL GEL
Se desarrolló la metodología descrita en la OECD # 402, 1987. Para ello se
emplearon ratas procedentes del CENPALAB (Centro Nacional para la
Producción de Animales de Laboratorio), se confeccionaron dos grupos,
compuestos por cinco animales, que recibieron los productos en estudio (tintura
de M. paniculata de Febrero/2013 y gel). El ensayo tuvo una duración de 19
días (5 de aclimatación y 14 de ensayo). Se aplicaron 4 mL por 200 mg de
peso corporal de las ratas, por vía dérmica y se evaluaron en ellos, signos
clínicos y conductuales, así como, la ganancia de peso, entre otros elementos.
II.6.2. EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO DE LA TINTURA
DE M. paniculata Y EL GEL
Para el experimento antiinflamatorio se indujo la inflamación por aceite de
croton en la oreja del ratón, por vía tópica. Se emplearon ratones de la línea
OF1, machos, procedentes del CENPALAB, cuyo peso variaba de 25 a 30 g.
La comida y el acceso al agua fue "ad libitum”, las condiciones de luz y
humedad fueron las descritas en la norma CYTED (1996). Para el estudio se
confeccionaron grupos de 5 animales cada uno, a saber, grupo control (tratado
con aceite de croton), grupo control positivo (tratado con indometacina) y dos
grupos tratados (Tintura de M. paniculata y gel). En cada caso fue aplicado 25
μL de la muestra por cada cara del pabellón auditivo de la especie roedora. Las
orejas control y tratadas fueron pesadas y se determinó el porcentaje de
inhibición de la inflamación. La tintura y el gel se administraron en la oreja
derecha de forma tópica, inmediatamente después del agente irritante, de
modo que se lograra una capa fina en la zona afectada. Se sacrificaron a los
ratones, después de 30 min. de la aplicación de la solución y se procedió a
29
Materiales y Métodos
cortar las orejas a través de las aristas. El porcentaje de inhibición fue
calculado por la ecuación siguiente:
% Inhibición =100- [(Peso de la oreja tratada/Peso de la oreja control)100]
II.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados correspondientes al control de calidad de los lotes de droga
cruda y las tinturas de M. paniculata, así como la comparación estadística de
las formulaciones ensayadas, fueron procesados por el programa Statgraphics
Plus, versión 5.0, llevándose a cabo un análisis de varianza de clasificación
simple a través de ANOVA-1, para un nivel de confianza del 95 %. Para la
comparación de las medias se utilizó el test de Rangos Múltiples de Duncan.
30
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Resultados y Discusión
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1. ESTABLECIMIENTO DE LOS PARÁMETROS DE CALIDAD DEL
MATERIAL VEGETAL DE Murraya paniculata L
El establecimiento de los parámetros físico-químicos de una droga vegetal es
indispensable para proponer índices de calidad que puedan garantizar su
eficacia y seguridad. El estudio fue desarrollado en varias épocas de colectas
con el propósito de poder determinar la influencia de este factor en las
características físico-químicas de la planta.
El análisis se efectuó con cuatro lotes de la especie colectados en los meses
de Febrero/2013, Enero/2014, Abril/2014 y Octubre/2014.
III.1.1. ESTUDIO DE SECADO
El secado es un aspecto fundamental dentro de los estudios farmacognósticos
encaminados a establecer la calidad de una droga, por lo que aplicar un
método de secado apropiado evita que se activen procesos enzimáticos
(fermentativos) que modifiquen la estructura de los posibles principios activos
(Miranda y Cuéllar, 2001; Acosta y Rodríguez, 2006).
Se conoce que el secado artificial es el más recomendado en todos los casos.
Se empleó la estufa porque, para la mayoría de las especies vegetales, es el
método más eficiente y rápido para eliminar el alto contenido de agua que se
acumula en los materiales naturales. En este sentido, resulta conveniente
estudiar el tiempo que demora en secar el material bajo esas condiciones, la
pérdida en peso de agua del material vegetal y el contenido de humedad
residual, aspectos imprescindibles a la hora de definir las condiciones de
secado de la planta.
Con relación a la temperatura de secado hay que señalar que su control es
fundamental y constituye una seria limitante en el proceso; temperaturas
demasiado altas descomponen los metabolitos responsables de la acción
terapéutica de las plantas medicinales y muy bajas hacen más largo y costoso
el proceso, además de ocasionar daños en el material por el desarrollo de
hongos. Por regla general la temperatura de secado no debe exceder los 40 oC
31
Resultados y Discusión
(Acosta y Rodríguez, 2006). En cuanto al tiempo de secado influyen numerosos
factores, entre ellos están la consistencia de la planta o del órgano vegetal
cosechado donde la relación masa fresca: masa seca es sumamente variable
(pérdida en peso de agua), la humedad relativa, la cantidad de agua
acumulada en la planta antes del proceso de colecta, entre otros factores. Los
resultados del estudio se exponen en la tabla I.
Tabla I. Resultados del estudio de secado en estufa del material vegetal
de M. paniculata
_
Parámetros X /S
Lotes
Pérdida por desecación (%)
Tiempo de secado (días)
Febrero/2013
34,40/0,18a
7,0/0,9a
Enero/2014
34,60/0,23a
8,0/0,6b
Abril/2014
34,51/0,11a
7,0/0,2a
Octubre/2014
34,89/0,60a
7,0/0,6a
Leyenda:
_
X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
Al someter la muestra a un secado en estufa (con recirculación de aire,
temperatura de 38
o
C) se pudo constatar que el material vegetal secó
completamente entre los 7 y 8 días (168 y 192 horas respectivamente),
lográndose valores de pérdidas en peso entre 34,40 y 34,89 %.
Al comparar los resultados para cada parámetro entre muestras de diferentes
meses de colecta, se demostró que existían diferencias significativas
solamente en los días de secado, lo cual pudiera atribuirse a las condiciones
climáticas (humedad relativa) durante los días en que se realizó el estudio, así
como a la cantidad de agua acumulada en la planta antes del proceso de
recolección, que puede variar en dependencia de la época de recolección.
32
Resultados y Discusión
III.1.2. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA DROGA CRUDA DE M.
paniculata
Dentro del estudio farmacognóstico de una droga se encuentra la
determinación de un conjunto de parámetros físico-químicos, los cuales son
indispensables para garantizar su calidad y pureza, lo que se traduce en el
valor intrínseco de la misma. A continuación se muestran en la tabla II algunos
de los parámetros que le fueron evaluados a los cuatro lotes de M. paniculata.
Tabla II. Parámetros físico-químicos de la droga cruda de M. paniculata
Resultados
_
X /S
Parámetros (%)
Febrero/2013
Enero/2014
Abril/2014
Octubre/2014
Humedad Residual
8,2/0,02a
8, 3/0,10a
8,5/0,20a
8,5/0,10a
Sustancias solubles
en etanol 80%
45,13/0,15b
40,33/0,10c
54,02/0,06d
49,23/0,12e
Cenizas totales
7,31/0,06f
7,39/0,09f
7,33/0,16f
7,37/0,06f
Cenizas solubles en
agua
1,87/0,07g
1,82/0,21g
1,85/0,14g
1,80/0,01g
Cenizas insolubles
en HCL al 10%
0,93/0,05h
0,98/0,08h
0,99/0,03h
0,96/0,02h
Leyenda:
_
X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
El primer parámetro evaluado fue el contenido de humedad residual. Un exceso
de agua en la droga puede ocasionar la proliferación de microorganismos e
insectos, seguido de la hidrólisis de principios activos, especialmente de
metabolitos glicosilados, y por consiguiente el deterioro del material vegetal.
(Miranda y Cuéllar, 2001). En la literatura se describen diversos métodos para
determinar el contenido de humedad, pero el seleccionado en nuestra
experiencia fue el método azeotrópico.
Generalmente, las normas y farmacopeas establecen un contenido de
humedad residual entre el 8 % y el 14 %, en dependencia del material vegetal
33
Resultados y Discusión
(Lou-Zhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuéllar, 2001). En el estudio
efectuado a la planta, no se presentaron diferencias significativas entre las
cuatro muestras y el promedio de las determinaciones estuvo dentro del
intervalo exigido, o sea, se alcanzaron valores del 8,2 al 8,5 %, lo que demostró
la eficiencia del proceso de secado (estufa de recirculación de aire a 38 ºC).
La determinación de sustancias extraíbles o solubles es uno de los índices
numéricos más importantes para seleccionar los mejores disolventes en el
proceso de extracción. En la experiencia realizada se utilizó una mezcla
hidroalcohólica al 80 % considerando los resultados de estudios anteriores
donde se utiliza el mismo menstruo para la obtención de la tintura a partir del
material vegetal en estado fresco. El análisis estadístico de los resultados
mostró con un nivel de confianza del 95 %, que existen diferencias
significativas entre los lotes evaluados, siendo mayor el rendimiento de
sustancias extraíbles en la muestra procedente de la colecta de Abril/2014. Las
diferencias pudieran estar relacionadas con una mayor disponibilidad de
metabolitos por parte de la planta para favorecer algún proceso fisiológico que
estuviese ocurriendo en ese momento (estado fenológico) o con las
condiciones climatológicas o ambas.
Las cenizas totales se definen como residuos que se obtienen al incinerar una
droga y su determinación está incluida dentro de los parámetros de calidad de
interés a evaluar para el análisis de un material vegetal. Además, constituyen
una base para juzgar la pureza e identidad de este, brindando información
relativa a la posible adulteración con materias inorgánicas o cuerpos extraños
que posea la misma, o la cantidad de estos en su contenido (Miranda y Cuéllar,
2001).
Las Farmacopeas plantean un índice de cenizas totales hasta el 5 % (Lou-Zhicen, 1980; WHO, 1998), aunque los valores pueden variar significativamente
en dependencia del material vegetal y lugar de colecta. En la experiencia
realizada los valores obtenidos fueron algo elevados (entre 7,31 y 7,37 %),
aunque pueden ser característicos de esta planta. No se observaron
diferencias significativas entre las muestras evaluadas, aspecto lógico de
34
Resultados y Discusión
esperar pues las colectas a pesar de realizarse en épocas o estados
fenológicos diferentes, el lugar de recolección siempre fue el mismo.
La cantidad
de
cenizas solubles
en agua
y
las
insolubles en ácido
clorhídrico al 10 %, son también parámetros que ayudan a evaluar la pureza
de la droga. En ambas determinaciones los valores fueron pequeños y están
dentro de los límites establecidos (alrededor del 2 % para plantas medicinales)
(Lou- Zhi-cen, 1980; WHO, 1998). Tampoco se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre los valores obtenidos.
III.1.3. ESTABILIDAD DE LA DROGA CRUDA DE M. paniculata
El estudio de estabilidad de la droga cruda, follaje de M. paniculata, fue
desarrollado al lote procedente de la colecta de Febrero de 2013, envasado en
bolsas de polietileno de baja densidad (de uso muy difundido por su bajo
costo), durante un periodo de un año en estante, a temperatura ambiente (T=
30 oC ± 2 oC, Humedad relativa de 70 % ± 5 %).
III.1.3.1 PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
Se evaluaron parámetros físico-químicos como propiedades organolépticas,
humedad residual, sustancias solubles en etanol al 80 %, cenizas totales,
cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %. Los
índices numéricos determinados se muestran en la tabla III.
35
Resultados y Discusión
TABLA III. Parámetros físico-químicos determinados en el estudio de
estabilidad en estante de la droga cruda de M. paniculata de Febrero/2013
Parámetros
(%)
_
X/S
Tiempo
Humedad
(meses)
Residual
Sustancias
solubles en
etanol al 80%
Cenizas
totales
Cenizas
solubles
en agua
Cenizas
insolubles en
HCL al 10%
0
8,20 /0,02a
45,13/0,15d
7,51/0,06e
2,27/0,07f
0,97/0,05g
3
8,32 /0,01a
45,10/ 0,20d
7,53/0,03e
2,25/0,01f
0,97/0,02g
6
8,45 /0,02a
45,17/ 1,18d
7,60/ 0,06e
2,25/0,02f
0,94/0,09g
9
9,26/0,02b
45,24/1,22d
7,55/0,08e
2,20/0,01f
0,97/0,03g
12
10,58 /0,06c
45,22/1,35d
7,55/0,01e
2,25/0,09f
0,90/0,01g
_
Leyenda: X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
Desde el punto de vista organoléptico la droga vegetal presentó un color verde
y olor característico, los cuales permanecieron inalterables durante los 12
meses de estudio. El análisis estadístico de los resultados del resto de los
parámetros, mostró un comportamiento estable de la droga objeto de estudio
en el periodo, al no ponerse de manifiesto diferencias estadísticamente
significativas entre los valores encontrados para la mayoría de las
cuantificaciones realizadas. Solo en el caso de la humedad residual fueron
encontradas diferencias significativas, que se considera deberán estar
relacionadas con la absorción a partir de la humedad relativa medio ambiental,
teniendo en cuenta además, que el envase utilizado para su almacenamiento
fue bolsas de polietileno, no obstante, los valores encontrados estuvieron muy
por debajo del límite máximo permisible (14 %).
III.1.3.2. ESTUDIO QUÍMICO CUALITATIVO
Desde el punto de vista químico cualitativo pudo corroborarse, la estabilidad de
la droga cruda, al ser encontrados resultados muy similares para las
determinaciones realizadas en cuanto a la detección por cromatografía en capa
delgada de L-prolina. Este aminoácido es un componente estructural del
36
Resultados y Discusión
colágeno, que presenta efecto antiinflamatorio y es importante para restaurar la
fluidez en las junturas, tendones y huesos. Sus beneficios como suplemento
dietético están dirigidos fundamentalmente a la estructura y mantenimiento del
cuerpo, siendo fundamental en el tratamiento de la osteoartritis (Doulgkeris y
col., 2006; Méndez, 2010). Todas estas propiedades están en concordancia
con las propiedades analgésicas y antiinflamatorias referidas para la especie
M. paniculata (Kumar y col., 2011; Narkhede y col., 2012; Rodanant y col.,
2012).
En la figura 4 puede observarse el comportamiento cromatográfico similar de
los extractos hidroalcohólicos al 80 %, en su evaluación inicial (Ms t0) y al
concluir el estudio (Ms t12), pudiendo apreciar en ambos casos la presencia
del aminoácido L-prolina bajo las condiciones de trabajo ensayadas; el mismo
se mostró de color amarillo con un valor de Rf de 0,26, una vez asperjada la
cromatoplaca con ninhidrina y expuesta a una temperatura de 105 oC.
Figura 4. Cromatografía en capa delgada de la droga seca de M.
paniculata en el estudio de estabilidad
Soporte: Gel de sílice sobre soporte de vidrio, Fase móvil: n-butanol: ácido acético: agua
(4:1:1), Revelador: solución de ninhidrina/calor.
Leyenda: Ms t0: M. paniculata droga seca tiempo cero; Ms t12: M. paniculata droga seca 12
meses;
P: L-prolina (sustancia de referencia)
III.1.3.3. CONTROL MICROBIOLÓGICO
Desde el punto de vista microbiológico es importante destacar que cuando una
especie vegetal es cosechada, la misma transporta del suelo bacterias y tierra,
como consecuencia pueden aparecer en la microflora de estas plantas, siendo
37
Resultados y Discusión
predominantes las especies aeróbicas. Por otra parte, la posterior manipulación
y producción, son también causas adicionales de contaminación microbiana,
siendo la presencia de aflatoxinas, provocadas por hongos contaminantes,
altamente peligrosa, de ahí que se hace necesario, en el control de calidad de
una droga, determinar la presencia de microorganismos. (Miranda y Cuéllar,
2001)
Los límites establecidos para la contaminación microbiana, están de acuerdo al
uso para el que será destinado el material. En nuestro caso la droga objeto de
estudio (follaje de M. paniculata) será pretratada, o sea, a partir de la misma
se elaborará una tintura para ser empleada en una formulación por vía tópica.
Los límites máximos admisibles por gramo, establecidos por la literatura, así
como los resultados del estudio se muestran en la tabla IV.
Tabla IV. Resultados del análisis microbiológico de la droga cruda
M. paniculata durante el estudio de estabilidad en estante
Análisis
Límites
Microbiológicos
Permisibles
(UFC/g)
Resultados (UFC/g)
Tiempo (meses)
0
6
Conteo total
de aerobios mesófilos
≤ 100
Ausencia
Conteo total
de hongos y levaduras
≤ 10
Ausencia
Staphylococcus aureus
Ausencia
Ausencia
Pseudomona aeruginosa
Ausencia
Ausencia
12
Al efectuar un análisis de los resultados obtenidos para el estudio
microbiológico del material vegetal de M. paniculata, se observó que los
mismos están enmarcados dentro de los límites indicados por la literatura, no
existiendo proliferación microbiológica durante los 12 meses de estudio, por lo
que la droga puede considerarse apta para el uso, desde el punto de vista
microbiológico.
Los resultados permiten inferir que hasta un año (tiempo de análisis), el
material vegetal de M. paniculata puede ser conservado fragmentado en
38
Resultados y Discusión
bolsas de polietileno, sin que se produzcan alteraciones en su apariencia,
parámetros farmacognósticos, químico cualitativos y microbiológicos.
III.2. OBTENCIÓN DE LA TINTURA DE M. paniculata
A partir del material vegetal de M. paniculata en estado seco, se elaboraron
tinturas al 20 %
con un menstruo hidroalcohólico al 80 %. El método de
extracción utilizado fue la maceración por ser uno de los más empleados en el
campo de los productos naturales, incluso para la elaboración de extractos y
tinturas, y menos agresivo para el material vegetal.
Respecto al menstruo, la Guía Terapéutica Dispensarial de Fitofármacos y
Apifármacos (1992) plantea la mezcla hidroalcohólica al 70%, como igualmente
fue sugerido para la inclusión en el Formulario Nacional de Fitofármacos y
Apifármacos (2010), por nuestro grupo de trabajo, a partir de resultados
anteriores de nuestra investigación. No obstante, este aspecto fue variado en la
experiencia realizada debido a estudios previos realizados por Varona (2013)
donde se percibió una disminución considerable del contenido alcohólico y
precipitación de los fitoconstituyentes. Al aumentar el porcentaje de alcohol
(mezcla
hidroalcohólica
al 80 %) se pudo demostrar que el contenido
alcohólico de la tintura se mantenía en rangos adecuados, sin ocurrir
precipitación de los componentes presentes (Varona, 2013).
El material vegetal se usó en estado seco con el propósito de aumentar el
margen de utilización del producto y la factibilidad de poderlo extender a los
centros de producciones locales. Por otra parte, no se cuenta con estudios que
avalen la factibilidad del empleo de la droga seca con garantía de su calidad,
seguridad y eficacia.
III.3. PARÁMETROS DE CALIDAD DE LA TINTURA DE M. paniculata
III.3.1. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
Con el propósito de obtener la tintura de M. paniculata estandarizada y que
pudiera ser empleada como fitomedicamento, se procedió al análisis de los
parámetros
físico-químicos
de
cuatro
39
lotes
para
establecer
sus
Resultados y Discusión
especificaciones de calidad. Fueron considerados los aspectos siguientes:
propiedades organolépticas (olor y color), análisis del pH, densidad relativa,
sólidos totales, índice de refracción, contenido alcohólico y análisis capilar. Los
resultados se presentan en la tabla V.
Desde el punto de vista organoléptico todas las muestras ensayadas
presentaron un color verde intenso, traslúcido con un olor aromático
característico.
El pH mostró valores débilmente ácidos (entre 6,09 y 6,40), los que pudieran
estar relacionados con la presencia de compuestos de naturaleza fenólica. Se
observaron diferencias significativas entre lotes, atribuibles fundamentalmente,
a la composición química de dichos preparados.
Tabla V. Parámetros físico-químicos de calidad determinados a los lotes
de tinturas de M. paniculata
Resultados
_
X /S
Parámetros
Febrero/2013
Propiedades
organolépticas
Enero/2014
Abril/2014
Octubre/2014
Líquido de color verde intenso, traslúcido y olor característico
aromático
pH
6,35/0,01a
6,40/0,01a
6,22/0,03b
6,09/0,01c
Sólidos totales (%)
2,06/0,03d
1,75/0,19e
2,67/0,08f
2,16/0,02g
Densidad Relativa
(g/mL)
0,874/0,001h
0,875/0,001h
0,876/0,001h
0,878/0,002h
Índice de
refracción
1,360/0,001i
1,361/0,003i
1,360/0,002i
1,362/0,001i
Contenido
Alcohólico (%)
76,9/0,18j
76,5/0,23j
76,5/0,12j
76,6/0,09j
Altura de la imagen
capilar (cm)
10,0/0,10k
10,1/0,06k
10,1/0,12k
10,0/0,10k
Leyenda:
_
X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
Otro parámetro medido de gran importancia fue el contenido de sólidos totales,
los cuales brindan información sobre la cantidad de constituyentes no volátiles
40
Resultados y Discusión
presentes en un extracto o tintura, además de servir de referencia para los
ajustes de dosis en ensayos farmacológicos y toxicológicos, cuando no se
conoce la concentración del principio activo que ejerce la acción. Al hacer una
comparación entre lotes se constataron diferencias significativas, donde el
mayor porcentaje correspondió a la muestra de Abril/2014 (2,67 %) y el menor
valor para la tintura obtenida de la colecta de Enero/2014 (1,75 %). Los
resultados pueden estar relacionados con la época de recolección de la planta,
donde la disponibilidad de metabolitos puede variar según el proceso fisiológico
que estuviese ocurriendo en ese momento, o con las condiciones
climatológicas, o ambas.
La densidad relativa y el índice de refracción son característicos de cada
extracto o tintura, el primero da criterio del peso específico de los mismos y el
segundo parámetro representa la relación entre el seno del ángulo de
incidencia de la luz y el seno del ángulo de refracción cuando la luz pasa
oblicuamente a través de un medio (Miranda y Cuéllar, 2000). El análisis de
ambos parámetros no evidenció diferencias significativas entre lotes.
El contenido alcohólico tampoco manifestó diferencias significativas entre lotes.
Este resultado es lógico de esperar si se tiene en consideración que se trabajó
con material vegetal seco de un contenido de humedad residual similar,
aspecto este que no propició disminución significativa del contenido alcohólico
de las preparaciones aunque
porcentajes
obtenidos
(entre
correspondieran a colectas diferentes.
Los
76,5 y 76,9 %) estuvieron cercanos al
porcentaje de etanol con que fueron elaboradas las tinturas (mezcla
hidroalcohólica al 80 %).
El análisis capilar permite observar el corrimiento de los diferentes
componentes de un extracto o tintura a través de una tirilla de papel de filtro y
brinda información importante sobre los posibles cambios por alcalinidad,
cuando se expone la muestra a vapores de amoníaco, y la presencia de
compuestos con características fluorescentes, cuando la misma se analiza a la
luz UV. La altura de la imagen capilar en todos los casos fue alta (mayor de 8
cm) sin manifestar diferencias significativas entre lotes.
41
Resultados y Discusión
Respecto a las otras características de la imagen capilar (figura 5), las cuatro
muestras de tinturas mostraron una apariencia similar. En términos generales
manifestaron una imagen vivamente coloreada, con
franja dentada, sub-
franja de color crema, variando en intensidad, banda con diferentes tonalidades
que oscilaron desde el verde claro, verde amarillento-verde oscuro hasta
carmelita verdoso y la sub-banda se mostró verde amarillenta. Frente a los
vapores de amoníaco la imagen se tornó amarilla, lo cual es indicativo de
metabolitos con características ácidas y bajo la exposición a la luz ultravioleta
se observó fluorescencia en la franja y en la banda.
Figura 5. Análisis capilar de los lotes de tintura de M. paniculata
III.3.2. CONTROL MICROBIOLÓGICO
En el caso de los extractos o tinturas, los límites establecidos para la
contaminación microbiana también están definidos de acuerdo al uso para el
que serán destinados. En el caso de la experiencia realizada, la tintura será
empleada por vía tópica. Los límites máximos admisibles establecidos por la
literatura, así como los resultados del estudio se muestran en la tabla VI. Los
cuatro lotes de tinturas evaluados no mostraron proliferación microbiológica.
42
Resultados y Discusión
Tabla VI. Resultados del análisis microbiológico de las tinturas de
M. paniculata
Análisis
Límites
Resultados (UFC/g)
Microbiológicos
Tiempo (meses)
Permisibles
(UFC/g)
Feb.
Ene.
Abr.
Oct.
2013
2014
2014
2014
Conteo total
de aerobios mesófilos
≤ 100
Conteo total
Ausencia
NR
Ausencia
NR
de hongos y levaduras
≤ 10
Staphylococcus aureus
Ausencia
Ausencia
NR
Pseudomona aeruginosa
Ausencia
Ausencia
NR
Leyenda: NR: ensayos no realizados
III.3.3. ESTUDIO FITOQUÍMICO DE LA TINTURA
Como parte del estudio de los parámetros de calidad de la tintura, se realizó
una evaluación química de tipo cualitativa que contempló: tamizaje fitoquímico,
cromatografía en capa delgada y un análisis por cromatografía líquida de alta
resolución.
III.3.3.1. TAMIZAJE FITOQUÍMICO
Al efectuar los análisis correspondientes al tamizaje fitoquímico a los cuatro
lotes, se evidenciaron resultados positivos para sustancias reductoras, lactonas
y coumarinas, saponinas, núcleos triterpénicos y esteroidales, compuestos
fenólicos (taninos pirocatecólicos) y aminoácidos, siendo dudosa la presencia
de quinonas y negativos los ensayos para flavonoides, antocianidinas y
alcaloides. En la tabla VII se reflejan los resultados.
43
Resultados y Discusión
Tabla VII. Resultados del tamizaje fitoquímico efectuado a los lotes de
tintura de M. paniculata
Resultados
Ensayos
Metabolitos
Febrero
2013
Enero
2014
Abril
2014
Octubre
2014
Resina
Resinas
-
-
-
-
Fehling
Sustancias reductoras
++
++
++
++
Baljet
Lactonas y
coumarinas
+
+
++
+
Espuma
Saponinas
+
+
+
+
Lieberman
burchard
Triterpenos y/o
esteroides
+
+
++
+
Tricloruro
Férrico
Compuestos fenólicos
+
+
++
+
Ninhidrina
Aminoácidos
++
++
++
++
Borntrager
Quinonas
±
±
±
±
Shinoda
Flavonoides
-
-
-
-
Antocianidina
Antocianidinas
-
-
-
-
Dragendorff
Alcaloides
-
-
-
-
Mayer
Alcaloides
-
-
-
-
Leyenda: +: Ensayo positivo, ++: muy positivo, ±: Ensayo dudoso, -: Ensayo negativo
Es importante destacar que no se apreciaron diferencias en la composición
química determinada por tamizaje fitoquímico en las muestras evaluadas, pero
si en las intensidades de color de algunos ensayos (Baljet, Lieberman-Burchard
y Ninhidrina).
En estudios fitoquímicos efectuados a la especie M. paniculata se revelan la
presencia
de alcaloides, flavonoides, coumarinas, carotenoides, aceite
esencial rico en cariofileno, nerolidiol, germacreno, entre otros. Algunos de
estos metabolitos no pueden ser detectados a través de reacciones de tamizaje
fitoquímico, pero otros confirman de manera tentativa algunos compuestos
como coumarinas referidos por Rout (2007). Sin embargo, no se detectaron
alcaloides ni flavonoides, lo cual puede ser atribuido esencialmente a las
características ecológico-geográficas donde se desarrolló la especie objeto de
estudio.
44
Resultados y Discusión
III.3.3.2. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
Se decidió realizar la cromatografía en capa delgada de aminoácidos,
considerando los resultados del tamizaje fitoquímico, donde estos ofrecieron
resultados muy positivos en las muestras ensayadas. Por otro lado, se utilizó
como sustancia de referencia el aminoácido L-prolina, considerando los
estudios efectuados a la tintura a partir de la droga fresca (Varona, 2013),
donde el mismo fue propuesto como uno de los biomarcadores de la planta, por
las propiedades antiinflamatoria y analgésica, referidas anteriormente en el
acápite III.1.3.2, las cuales pudieran correlacionarse con las descritas para la
especie vegetal objeto de estudio, también señaladas en ese acápite.
Se llevó a cabo la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción
de la ninhidrina, con la cual se pueden identificar los aminoácidos por la tinción
color magenta o morado que se presenta en ellos, excepto con la L-prolina, la
cual da un tono amarillo al reaccionar con dicho reactivo debido a que no
presenta el grupo amino libre, aspecto importante a la hora de diferenciarla del
resto de los aminoácidos presentes (Lehninger, 2000).
El análisis cromatográfico (figura 6) permitió apreciar en todas las muestras la
presencia del aminoácido L-prolina (mancha número 1) bajo las condiciones de
trabajo ensayadas, el mismo se mostró de color amarillo con un valor de Rf de
0,26, una vez asperjada la cromatoplaca con ninhidrina y expuesta a una
temperatura de 105 oC. Fue evidente también, la presencia de otras manchas
de color entre magenta y morado, las cuales variaron en intensidad y que
pudieran estar relacionadas con la presencia de aminoácidos con grupos amino
libres.
45
Resultados y Discusión
Figura 6. Cromatografía en capa delgada de los lotes de tintura de
M. paniculata y L-prolina
Soporte: Gel de sílice sobre soporte de aluminio, Fase móvil: n-butanol: ácido acético: agua
(4:1:1), Revelador: solución de ninhidrina/calor.
Leyenda: P: L-prolina (sustancia de referencia), TF: tintura Febrero/2013, TE: tintura
Enero/2014,
TA: tintura Abril/2014, TO: tintura Octubre/2014
III.3.3.3. ANÁLISIS POR
RESOLUCIÓN (CLAR)
CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA
DE
ALTA
La cromatografía líquida de alta resolución es muy utilizada en la industria
farmacéutica y laboratorios analíticos debido a su alta resolución, sensibilidad y
rápido tiempo analítico. Una de las principales ventajas de esta técnica
cromatográfica es que puede acoplarse con la espectroscopia ultravioleta con
arreglo de diodos, espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear,
entre otras, los cuales brindan mayores posibilidades de detección de los
diferentes constituyentes, tanto de forma cualitativa como cuantitativa
(Chimezie y col., 2008; Rao y Anna, 2009; Kartik y col., 2010; Saravanan y col.,
2010; Neeraj, 2011). La mayor parte de los trabajos realizados sobre análisis
de aminoácidos, se ha llevado a cabo en columnas de fase reversa, y las fases
móviles más utilizadas son mezclas de agua y un disolvente orgánico (metanol,
acetonitrilo, o tetrahidrofurano).
Este análisis se realizó a las tinturas de Febrero/2013, Enero/2014, Abril/2014 y
Octubre/2014, y el mismo estuvo encaminado a identificar el aminoácido Lprolina, a partir de los antecedentes de su presencia evidente en las muestras
46
Resultados y Discusión
ensayadas por cromatografía en capa delgada, y por ser uno de los
compuestos que pudieran estar relacionados con las propiedades analgésicas
y antiinflamatorias atribuidas a la planta.
En la prueba de detección cualitativa se inyectó primeramente la sustancia de
referencia L-prolina a la concentración de 200 µg/mL y se estableció un tiempo
de retención promedio de 2,72 minutos (figura 7). Al inyectar las muestras de
tintura de M. paniculata se pudo constatar la presencia de L-prolina, por
similitud de los tiempos de retención. En la tabla VIII se presentan los tiempos
de retención y los valores de áreas promedios obtenidos en el estudio.
Tabla VIII. Resultados del análisis por CLAR del patrón
L-prolina y las muestras de tinturas de M. paniculata
Resultados
_
X /S
Muestras
Tiempos de retención
(min.)
Áreas (mAV.s)
L-prolina
2,72/0,08
164,84/6,23
Tintura de Febrero/2013
2,72/0,10
122,75/3,08
Tintura de Enero/2014
2,71/0,10
152,90/8,46
Tintura de Abril/2014
2,72/0,11
187,30/2,31
Tintura de Octubre/2014
2,73/0,06
109,54/2,19
Al observar los cromatogramas (figura 7) se pudo constatar una adecuada
separación del compuesto de interés del resto de los constituyentes presentes
en cada muestra de tintura analizada.
47
Resultados y Discusión
Figura 7: Cromatogramas del análisis por CLAR del patrón L-prolina y las
tinturas de M. paniculata
Leyenda: P: prolina
Para corroborar la presencia de este compuesto se efectuó una inyección de
las muestras con el patrón y se obtuvo como resultado un incremento en los
valores de áreas (Tabla IX).
Tabla IX. Resultados del análisis por CLAR de la inyección de las
muestras de tinturas con el patrón L-prolina
Resultados/S
Muestras
Tiempos de retención
(min.)
Áreas (mAV.s)
Tintura de Febrero/2013
2,73/0,05
142,07/1,23
Tintura de Enero/2014
2,74/0,12
179,13/3,85
Tintura de Abril/2014
2,72/0,14
206,12/1,83
Tintura de Octubre/2014
2,74/0,09
128,61/4,90
48
Resultados y Discusión
En la determinación cuantitativa del compuesto de interés en las tinturas, se
analizó aquel pico positivo para L-prolina y se consideró el área que
correspondía a la misma, se confeccionó una curva de calibración de
concentración contra áreas y se obtuvieron las concentraciones que se
muestran en la tabla X. Se evidenciaron diferencias significativas entre los lotes
evaluados, correspondiendo el mayor valor para la tintura de Abril/2014 y la
menor concentración para la de Octubre/2014, lo cual pudiera estar relacionado
con la época de recolección de la planta. Es importante señalar que los bajos
valores de prolina detectados en el mes de Octubre de 2014, están en
correspondencia con los obtenidos en la tintura a partir del material vegetal
fresco, a un lote elaborado a partir de una colecta efectuada en el mismo mes
pero del año 2010 (Varona, 2013).
Tabla X. Concentración de L-prolina en las muestras de tinturas
Muestras
Resultados (µg/mL)
_
X /S
Tintura de Febrero/2013
215,62/6,05a
Tintura de Enero/2014
247,24/10,50b
Tintura de Abril/2014
296,25/3,16c
Tintura de Octubre/2014
196,71/2,86d
Leyenda: Leyenda:
_
X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
III.3.5. ESTABILIDAD DE LA TINTURA DE M. paniculata
El estudio de estabilidad de la tintura de M. paniculata, fue desarrollado con el
lote obtenido de la colecta de Febrero/2013, durante un periodo de 12 meses,
en condiciones de estante (Temperatura de 30 oC ± 2 oC, Humedad relativa
de 70 % ± 5 %), durante el cual fueron evaluados sus parámetros físicoquímicos de calidad, determinación del contenido de L-prolina por CLAR y
control microbiológico. Los resultados de los mismos se discuten a
continuación.
49
Resultados y Discusión
El análisis estadístico de los resultados de las determinaciones físico-químicas
(tabla XI), manifestó un comportamiento estable de la tintura, al no encontrarse
diferencias estadísticamente significativas en la mayoría de los parámetros
evaluados, a excepción del contenido alcohólico que mostró una ligera
disminución en el tiempo, aunque el mismo se mantuvo cercano al porcentaje
hidroalcohólico original de la tintura (80 %), no afectándose los demás
parámetros.
Tabla XI. Parámetros físico-químicos de calidad determinados en el
estudio de estabilidad de la tintura de M. paniculata de Febrero/2013
Parámetros
_
X /S
Tiempo (meses)
0
3
a
6,35/0,02
9
a
6,36/0,08
12
a
6,39/0,02a
pH
6,35/0,01
Sólidos
totales (%)
2,06/0,03b
2,05/0,01b
2,04/0,00b
2,08/0,06b
2,08/0,03b
Densidad
Relativa
(g/mL)
0,874/0,001c
0,874/0,001c
0,875/0,002c
0,875/0,00c
0,875/0,001c
Índice de
refracción
1,360/0,001d
1,361/0,00d
1,361/0,002d
1,362/0,002d
1,362/0,00d
Contenido
Alcohólico (%)
76,90/0,18e
75,90/0,13 f
75,82/0,10 f
75,65/0,30f
75,27/0,11g
Altura de la
imagen capilar
(cm)
10,0/0,10h
10,0/0,20h
10,0/0,10h
10,0/0,20h
10,1/0,20h
Concentración
de L-prolina
(µg/mL)
215,62/6,05a
-
213,24/1,87a
-
212,96/5,12a
Leyenda:
6,38/0,03
6
a
_
X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
Desde el punto de vista microbiológico también pudo corroborarse la
estabilidad de la muestra, al no hallarse proliferación de microorganismos
durante los 12 meses de estudio.
50
Resultados y Discusión
Con relación al contenido de L-prolina determinado por CLAR (tabla XI), se
confirmó una vez más la estabilidad de la preparación, al no constatarse
diferencias significativas en los análisis a tiempo cero y a los 12 meses de
estudio.
III.4. OBTENCIÓN DEL GEL A PARTIR DE LA TINTURA DE M. paniculata
El uso de plantas medicinales en el desarrollo de formulaciones resulta cada
vez más interesante. Muchos fitoconstituyentes como compuestos fenólicos,
algunos aminoácidos como la L-prolina, entre otros, proporcionan actividades
antiinflamatorias y analgésicas, siendo fundamental en el tratamiento de la
osteoartritis (Doulgkeris y col., 2006; Méndez, 2010).
Considerando que M. paniculata presenta entre sus marcadores químicos el
aminoácido L-prolina y basados en las propiedades antiinflamatorias de su
tintura (al 20 % elaborada con mezcla hidroalcohólica al 80 %), demostradas
por Varona (2013) y su uso en enfermedades osteomioarticulares, reportado en
el Formulario Nacional de Fitofármacos y Apifarmacos (2010, 2014), se decidió
elaborar un gel a partir de este preparado galénico obtenido del material
vegetal en estado seco, con el propósito de extender su utilización a los centros
de producciones locales.
En el formulario aparece el empleo de las fricciones de M. paniculata,
utilizando droga fresca, sin embargo, se consideró la posibilidad de diversificar
este tipo de preparación mediante el desarrollo de un gel con similares
potencialidades
empleando
este
producto
natural
como
ingrediente
farmacológico activo.
Para el desarrollo de la formulación se consideraron los resultados del estudio
desarrollado por Sánchez (2014), donde se diseñó un gel antiinflamatorio a
partir de la tintura obtenida de las hojas frescas de esta especie vegetal. La
optimización de los componentes del gel, fue llevada a cabo mediante el
empleo de un diseño D-optimal de tres componentes con restricciones,
evaluando como variables respuesta, diferentes parámetros como pH,
extensibilidad, fuerza de gel, firmeza, cohesividad, viscosidad relativa y
51
Resultados y Discusión
consistencia, obteniendo ecuaciones matemáticas que permitieron optimizar los
componentes. Finalmente se obtuvo una formulación óptima, la cual sirvió de
base para la realización de este trabajo.
A partir de los resultados obtenidos se procedió a preparar tres lotes de gel a
escala de laboratorio. Durante el proceso de elaboración no se presentaron
dificultades que incidieran de forma negativa en la calidad del producto final. La
cantidad de tintura en la formulación (30 %) se determinó a partir de los
resultados establecidos por Sánchez (2014) y los referidos por Varona (2013).
Se escogió como base, un gel de carbopol 940 (polímero del ácido acrílico)
debido al alto contenido alcohólico (80 %) de la tintura. El resto de los
componentes se seleccionaron de acuerdo a los excipientes más frecuentes en
este tipo de preparación farmacéutica. Otras materias primas empleadas se
discuten a continuación:
Se incorporó el mentol al 1 % en la preparación, a partir del análisis de las
experiencias positivas de su empleo en las fricciones de M. paniculata que
aparecen reportadas en el Formulario Nacional de Fitofármacos y Apifármacos
(2010, 2014), además de ser un excipiente farmacéutico con utilidad como
coadyuvante de la penetración cutánea, así como agente terapéutico que
puede ser empleado en concentraciones entre 0,05 y 10 % en formulaciones
tópicas, según Pharmaceutical Excipients v 1.0 (2000).
El propilenglicol fue utilizado como humectante en la formulación a una
proporción del 10 %. Es un líquido viscoso, higroscópico, miscible con agua y
con etanol al 96 % (Real Farmacopea Española, 2005) y es muy empleado en
productos farmacéuticos, cosméticos, alimentarios, entre otros. (Diccionario de
Ingredientes Cosméticos, 2009).
Como preservos se utilizaron los ésteres del ácido para-hidroxibenzoico, por
presentar estabilidad química en el rango neutral de pH, ser no tóxicos, no
irritantes y no alergénicos, además de presentar amplio espectro de acción
antimicrobiana tanto en hongos como bacterias, y ser adecuadamente solubles
(Von y col., 1999; Soni y col., 2005). Son muy utilizados en las industrias
52
Resultados y Discusión
farmacéutica y cosmética. La mezcla de parabenos estuvo en la combinación
clásica de 0,18 - 0,02 % de metil y propilparabenos, respectivamente.
El hidróxido de sodio se utilizó en una proporción del 0,8 %. Su utilización tiene
como finalidad, estabilizar el pH de la formulación. El mismo, conjuntamente
con otras bases orgánicas o inorgánicas puede influir en el tacto y en la
transparencia del preparado. La cantidad de base requerida debe incorporarse
a la dispersión del gelificante, determinando constantemente el pH que adopta
el preparado, hasta obtener aquel en el que se considera que la correlación
entre la consistencia adquirida y el pH deseado (lo más próximo posible al pH
de la piel) es idónea (Juvé y col., 2007).
III.4.1.
EVALUACIÓN
DE
LOS
PARÁMETROS
FÍSICO-QUÍMICOS
Y
TECNOLÓGICOS DEL GEL
Los tres lotes de geles elaborados fueron sometidos a una serie de
evaluaciones de calidad que según su forma farmacéutica, se encuentran
preestablecidas. Los resultados obtenidos se analizan a continuación y se
muestran en la tabla XII.
Desde el punto de vista organolético las preparaciones presentaron un color
verde, olor a mentol y un aspecto homeogéneo con brillo.
Tabla XII. Parámetros físico-químicos determinados a los tres lotes de geles
Lotes
Resultados
pH
_
X /S
1
5,38/
0,01a
Firmeza
(N)
0,399/0,
006b
Consistencia
(g/s)
830,16/
6,65c
Cohesividad
(N)
60,58/0,70d
Viscosidad
(m.Pa.s)
8066/57,70e
Extensibilidad
(cm2)
234,06/2,55f
2
5,37/
0,02a
0,398/0,
004b
832,30/
3,63c
60,76/0,45d
8051/71,01e
236,23/2,05f
3
5,37/
0,01a
0,396/0,
002b
830,33/
0,57c
60,54/0,42d
8059/57,73e
235,70/0,47f
Leyenda:
_
X / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
53
Resultados y Discusión
El pH obtenido en cada formulación, se encontró en el rango entre 5,37 y 5,38,
valores cercanos a la acidez característica de la piel. Según la literatura
consultada, el valor del pH de la piel es variable, según la zona del cuerpo, la
edad, e incluso algunos autores incluyen la raza. La superficie tiene un pH
ácido y oscila entre 4 y 6 (Gil y Howard, 1996; Schmid-Wendtner y Korting,
2006). No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre los
tres lotes de geles, al aplicar ANOVA-1 para un 95 % de confianza.
La caracterización reológica es fundamental en la investigación y desarrollo de
formas farmacéuticas semisólidas como los geles, debido a que las
propiedades reológicas tienen una gran influencia en la estabilidad y en la
textura de estos productos (Signorelli e Isla, 2005). Son válidos varios
procedimientos. En este estudio se consideran las determinaciones de firmeza,
consistencia, cohesividad, índice de viscosidad y la extensibilidad, debido a la
relación existente entre estos parámetros para definir dicho comportamiento.
Es importante destacar que la prueba de extensibilidad proporciona una
medida del umbral de deformación del sistema, y es inversamente proporcional
a la consistencia de las muestras (Signorelli e Isla, 2005). En la experiencia
realizada no se observaron diferencias significativas entre lotes para cada
parámetro ensayado.
III.4.2. ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL GEL DE M. paniculata
Como parte del estudio de los parámetros de calidad del gel, se realizó una
evaluación fitoquímica que contempló la cromatografía en capa delgada y un
análisis por cromatografía líquida de alta resolución, ambas destinadas a
detectar uno de los marcadores químicos de la planta, el aminoácido L-prolina.
III.4.2.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
El análisis por cromatografía en placa delgada del gel elaborado permitió
visualizar el aminoácido L-prolina, al compararlo con la sustancia de referencia
y la tintura de partida, con un valor de Rf de 0,26 (mancha 1). En la figura 8 se
representa el cromatograma.
54
Resultados y Discusión
Figura 8. Cromatografía en capa delgada del gel de M. paniculata, Lprolina y la tintura de Febrero 2013 (TF)
Soporte: Gel de sílice sobre soporte de aluminio, Fase móvil: n-butanol: ácido acético: agua
(4:1:1), Revelador: solución de ninhidrina/calor.
III.4.2.2. ANÁLISIS POR
RESOLUCIÓN (CLAR)
CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA
DE
ALTA
El análisis por CLAR (figura 9) también permitió visualizar en el cromatograma
la L-prolina, con tiempo de retención de 2, 72 min, similar al obtenido para la
sustancia de referencia utilizada (ver figura 7). Importante destacar que el
comportamiento cromatográfico de la formulación fue similar al de la tintura de
partida (lote de Febrero 2013), a excepción de un pico que aparece a 10,78
min. que pudiera estar relacionado con algún componente de la formulación.
Figura 9: Cromatograma del análisis por CLAR del gel de M. paniculata
Leyenda: P: prolina
55
Resultados y Discusión
La determinación cuantitativa del marcador químico no mostró diferencias
estadísticamente significativas entre los tres lotes ensayados. En la tabla XIII
se muestran los resultados del estudio.
Tabla XIII. Concentración de L-prolina determinada a los tres lotes de geles
Lotes
Resultados (µg/mL)
_
X /S
1
67,34/2,13a
2
67,29/2,03a
3
67,21/1,89a
_
X
Leyenda: / S: valor medio/ desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
III.4.3. CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL GEL DE M. paniculata
Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a las formas
farmacéuticas no estériles, para protegerlas del desarrollo microbiano o de
microorganismos que se introducen sin ser advertidos durante el proceso de
fabricación o después de éste. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al
producto o producida por la adición de un preservo, debe ser demostrada,
principalmente cuando las formas farmacéuticas son multidosis orales y tópicas
(USP 35- NF 30, 2012).
En el caso particular del trabajo se realizó la evaluación antimicrobiana al gel
de M. paniculata (droga seca), donde los conservantes o preservos utilizados
fueron los ésteres del ácido para-hidroxibenzoico, en la combinación clásica de
0,18-0,02 % de metil y propilparabenos, respectivamente.
Los límites establecidos para la contaminación microbiana también están
definidos de acuerdo al uso para el que serán destinadas las preparaciones. En
la experiencia realizada, el gel será empleado por vía tópica. Los límites
máximos admisibles establecidos por la literatura, así como los resultados del
56
Resultados y Discusión
estudio se muestran en la tabla XIV. Los lotes evaluados no mostraron
proliferación microbiológica.
Tabla XIV. Resultados del control microbiológico de los lotes de gel de
M. paniculata
Límites
Microbiológicos
Permisibles
(UFC/g)
Resultados (UFC/g)
Conteo total de bacterias
≤ 100
Ausencia
Conteo total enterobacterias
≤ 10
Ausencia
Conteo total de hongos
≤ 10
Ausencia
Staphylococcus aureus
Ausencia
Ausencia
Pseudomona aeruginosa
Ausencia
Ausencia
Análisis
Lotes de gel
1
2
3
III.4.4. PRUEBA DE PREFERENCIA O ACEPTACIÓN DE LA FORMULACIÓN
Dada la importancia que el paciente le concede a las características
organolépticas de una formulación y para tener una idea de la preferencia, o
no, de la forma farmacéutica elaborada, se realizó una prueba de preferencia o
aceptación a 50 jueces no adiestrados, donde se evaluaron como atributos el
olor, color, frescor y apariencia. Los resultados del estudio se visualizan en la
tabla XV.
Tabla XV. Resultados de la prueba de preferencia o aceptación del gel de
M. paniculata
Puntaje
Criterios
Número de individuos
Atributos
Olor Color Frescor Apariencia
5
Me gusta mucho
2
0
15
4
4
Me gusta moderadamente
44
16
23
37
3
No me gusta ni me disgusta
4
25
12
8
2
Me disgusta moderadamente
0
9
0
1
1
Me disgusta mucho
0
0
0
0
Media (puntos) /desviación estándar 3,96/ 3,14/
4,06/
3,88/
0,34
0,70
0,73
0,55
57
Resultados y Discusión
Como se puede observar, se alcanzan valores medios entre 3,14 y 4,06
puntos, los cuales se pueden ubicar entre las opciones “me gusta
moderadamente” y “no me gusta ni me disgusta”, por tanto puede ser aceptada
la formulación, pues se alcanzan valores superiores a los 3 puntos.
La figura 10 muestra una representación gráfica más detallada de
los
resultados de la tabla anterior según la distribución del número de jueces
(expresado en porciento) y los diferentes criterios de aceptación por cada
atributo evaluado. Se observa como a los panelistas les gusta moderadamente
la formulación por su olor (88 %) y apariencia (74 %). Respecto al color, la
mayor cantidad de jueces (50 %) se inclinaron hacia la opción no me gusta ni
me disgusta. El atributo frescor tuvo el mayor porcentaje de jueces (46 %) en la
opción me gusta moderadamente.
ME GUSTA MUCHO
100
80
ME GUSTA MODERADAMENTE
60
40
NO ME GUSTA NI ME DISGUSTA
20
ME DISGUSTA MODERADAMENTE
0
OLOR
COLOR
FRESCOR APARIENCIA
ME DISGUSTA MUCHO
Figura 10. Representación gráfica de los resultados de la prueba de
preferencia o aceptación del gel M. paniculata
En términos generales se puede plantear que los cuatro atributos evaluados,
ostentan del mismo modo, resultados adecuados (se encuentran entre las
opciones me gusta moderadamente y no me gusta ni me disgusta), aspecto
este que habla a favor de la formulación.
III.4.5. ESTABILIDAD INTEGRAL DE LA FORMULACIÓN
El estudio de estabilidad del gel de M. paniculata, fue desarrollado durante un
periodo de un año, en condiciones de estante (Temperatura de 30 oC ± 2 oC,
Humedad relativa de 70 % ± 5 %), durante el cual fueron evaluados sus
parámetros físico-químicos de calidad, determinación del contenido de L58
Resultados y Discusión
prolina por CLAR y control microbiológico. Los resultados de los mismos se
discuten a continuación y un resumen de ellos se muestra en la tabla XVI.
El análisis estadístico de los resultados a los parámetros evaluados durante el
estudio de estabilidad, mostró un comportamiento estable de la formulación en
el periodo, al no ponerse de manifiesto diferencias estadísticamente
significativas entre los valores obtenidos.
Tabla XVI. Parámetros físico-químicos de calidad determinados en el
estudio de estabilidad de los lotes de geles de M. paniculata
Parámetros
_
X /S
Tiempo (meses)
0
3
6
9
12
1
5,38/0,01a
5,38/0,04a
5,37/0,01a
5,37/0,09a
5,36/0,06a
2
5,37/0,02a
5,37/0,01a
5,37/0,30a
5,35/0,06a
5,35/0,01a
3
5,37/0,01a
5,37/0,00a
5,36/0,08a
5,36/0,50a
5,35/0,03a
1
0,399/0,006b
-
0,396/0,02b
0,395/0,001b
0,396/0,007b
2
0,398/0,004b
-
-
-
0,395/0,009b
3
0,396/0,002b
-
-
-
0,393/0,005b
1
830,16/6,65c
-
829,10/4,15c
829,01/3,30c
828,11/1,25c
2
832,30/3,63c
-
-
-
830,13/2,10c
3
830,33/0,57c
-
-
-
828,00/4,39c
1
60,58/0,70d
-
61,18/0,20d
60,23/0,18d
60,10/0,50d
2
60,76/0,45d
-
-
-
60,24/0,33d
3
60,54/0,42d
-
-
-
60,00/0,01d
1
8066/57,70e
-
8059/63,10e
8059/42,18e
8060/37,12e
2
8051/71,01e
-
-
-
8047/23,06e
3
8059/57,73e
-
-
-
8050/35,23e
1
234,06/2,55f
234,24/0,34f
235,86/3,25f
235,27/1,35f
234,98/2,01f
Extensibilidad
(cm2)
2
236,23/2,05f
237,10/0,12f
236,32/2,17f
236,05/2,67f
236,73/3,06f
3
235,70/0,47f
235,42/0,24f
235,21/4,83f
236,41/2,90f
235,19/1,21f
Concentración
de L-prolina
(µg/mL)
1
67,34/2,13g
-
67,13/3,15g
-
66,18/2,11g
2
67,29/2,03g
-
-
-
66,36/1,87g
3
67,21/1,89g
-
-
-
66,24/2,31g
pH
Firmeza (N)
Consistencia
(g/s)
Cohesividad
(N)
Viscosidad
(m.Pa.s)
_
X
Leyenda: / S: valor medio/ desviación estándar
- ensayo no realizado
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza.
59
Resultados y Discusión
Igualmente pudo corroborarse, desde el punto de vista organoléptico, y
microbiológico, la estabilidad de la misma, al ser encontrados resultados muy
similares para las determinaciones realizadas (las preparaciones presentaron
un color verde, olor a mentol y un aspecto homogéneo con brillo) y la ausencia
de microorganismos durante el año de estudio.
III.5. EVALUACIÓN PRECLÍNICA DE LA TINTURA DE M. paniculata Y EL
GEL
III.5.1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA DÉRMICA DE LA TINTURA DE M.
paniculata Y EL GEL
En el estudio toxicológico efectuado se tuvo en cuenta en primer lugar el peso
corporal de los animales donde se evidencia una ganancia del peso de los
mismos como un aspecto indicativo de la no toxicidad (tabla XVII).
Tabla XVII. Variación en el peso corporal (g) de los animales en el ensayo
de toxicidad aguda dérmica de la tintura de M. paniculata (Febrero/2013) y
el gel
Valor promedio/ Desviación estándar
GRUPO
Machos (ratas)
TIEMPO (días)
1
7
a
Tintura de M. paniculata
188,20/ 7,24
Gel de M. paniculata
180,40/4,65d
197,20 / 16,02
14
b
189,34/10,67e
209,0 / 12,16c
200,75/16,01f
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza
También fueron evaluados los signos clínicos (ojo, mucosa, piel y otros
conductuales), no evidenciándose durante los 14 días de estudio manifestación
alguna y por último, una vez sacrificado el animal, se examinaron durante las
autopsias algunos órganos (pulmón, corazón, bazo, riñones, estómago) sin
afectaciones. Por lo anteriormente planteado y bajo las condiciones
experimentales evaluadas se evidencia que la administración de forma aguda
de la Tintura de M. paniculata y el gel obtenido de la misma, por vía tópica, no
produce efectos tóxicos en los animales de experimentación. En la tabla XVIII
se presentan los resultados.
60
Resultados y Discusión
Tabla XVIII. Observaciones realizadas durante el ensayo de toxicidad
aguda dérmica a la tintura de M. paniculata (Febrero/2013) y al gel
Días
Signos clínicos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Ojos
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mucosa
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Sist. Respiratorio
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Circulatorio
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Autónomo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nerv. Central
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mudanza de pelo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Temblores
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Convulsiones
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Salivación
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Piel
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Sedación
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Somnolencia
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Muerte
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
III.5.2. EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO DE LA TINTURA
DE M. paniculata y el gel
La evaluación del efecto antiinflamatorio brindó evidencias de la efectividad de
la tintura de M. paniculata y el gel en este sentido. En la tabla XIX se muestran
los resultados de los pesos medios
de las orejas derecha (tratadas) e
izquierdas (controles) de los diferentes grupos de animales sometidos al
ensayo. Se pudo constatar una disminución significativa en el peso de las
orejas una vez tratadas con el control positivo, la tintura y el gel.
Los mejores resultados del efecto antiinflamatorio se presentaron para los
animales tratados con la Indometacina con respecto al control, o sea, los
animales tratados con el aceite de croton solo, sin embargo, la tintura de M.
paniculata y el gel obtenido de la misma, mostraron también evidencias como
antiinflamatorios.
61
Resultados y Discusión
Tabla XIX: Resultados de los pesos medios de las orejas en el ensayo del
efecto antiinflamatorio de la tintura de M. paniculata (Febrero/2013) y el
gel
Peso medio de las orejas (mg)/ S
GRUPO
IZQUIERDA
DERECHA
Control (Croton)
9,81/0,23a
22,14/1,21e
Control positivo (Indometacina)
6,85/0,27b
12,37/1,19f
Tintura de M. paniculata
7,28 /1,57c
14,14/0,67g
Gel de M. paniculata
7,92/1,02c
15,24/1,31h
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza
S: desviación estándar
En la tabla XX se muestran los resultados para el porcentaje de inhibición de la
inflamación, comparado con el aceite de croton. A pesar de encontrar
diferencias significativas entre la Indometacina, la tintura de M. paniculata y el
gel, la inhibición de la inflamación de la tintura estuvo cercana a la del control
positivo, por lo que puede considerarse un efecto antiinflamatorio, bajo las
condiciones ensayadas. El gel aunque fue el que manifestó menor porcentaje
de inhibición de la inflamación, su valor estuvo próximo al de la tintura de
partida, siendo capaz de disminuir el efecto irritante que produce el aceite de
croton en las orejas de los animales.
Tabla XX: Porcentajes de inhibición de la inflamación en el ensayo del
efecto antiinflamatorio de la tintura de M. paniculata (Febrero/2013) y el
gel
Grupos
Porcentaje de inhibición
Control (Croton)
-
Control positivo (Indometacina)
44,12a
Tintura de M. paniculata
36,13b
Gel de M. paniculata
31,16c
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si
existen diferencias significativas para un 95 % de confianza
Los estudios de estandarización en los últimos años están encaminados a
correlacionar la concentración y estabilidad de los marcadores químicos
conocidos, con la actividad biológica, proporcionando un protocolo viable para
62
Resultados y Discusión
el análisis de cualquier producto herbario (Mosihuzzaman y Choudhary, 2008;
Venil,
2010). En
la
experiencia
realizada,
fue
determinada
la
concentración de L-.prolina, uno de los compuestos asociados con la actividad
farmacológica referida para la planta, y se demostró que la tintura procedente
de la colecta de Febrero/2013 y el gel obtenido de la misma, con una
concentración de 215,62 µg/mL y 67,34 µg/mL de dicho aminoácido produce
efecto antiinflamatorio en los animales de experimentación.
No obstante, se prevé para estudios futuros analizar otros lotes de tintura
desde el punto de vista antiinflamatorio y analgésico, y establecer métodos de
análisis que permitan cuantificar y determinar la estabilidad de otros
compuestos ya identificados por CG-EM en estudios efectuados por Varona
(2013), pues es por todos conocidos que esta determinación no da un cuadro
completo del producto herbario, porque muchas veces los efectos terapéuticos
están condicionados por la acción múltiple de un conjunto de constituyentes
químicos.
III.6. DISCUSIÓN GENERAL
La calidad de un producto herbario es un estado determinado por su identidad,
pureza,
volumen,
marcadores
químicos,
propiedades
físico-químicas,
propiedades biológicas o por el proceso industrial. Al ser mezclas de varios
compuestos químicos son difíciles de caracterizar, siendo esencial una
definición científica clara del material crudo (Ahmad y col., 2006), para lo cual
se hace necesario garantizar un correcto control del material vegetal desde la
recolección, tener conocimiento de la especie en cuanto a la organografía y
fisiología de la misma, del lugar donde se realiza la colecta y saber las
variaciones que puede sufrir la composición de las plantas en las diferentes
épocas y fases de su vida. (Sharapin y cols., 2000; HMPWG, 2001; WHO,
2003).
Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae), es empleada tradicionalmente en
algunas provincias de nuestro país para el alivio del dolor y la inflamación
asociados a enfermedades osteomioarticulares, a pesar de esto no se cuenta
63
Resultados y Discusión
en los Centros de Producción Local, ni en los Laboratorios de Control de
Calidad, subordinados a las Empresas de Medicamentos, con procedimientos
homogéneos, ni parámetros de calidad que permitan la estandarización del
material vegetal seco y su tintura (al 20 % elaborada con mezcla
hidroalcohólica al 80%) y los consiguientes controles de calidad y estudios de
estabilidad de las preparaciones, que de ella se derivan.
El trabajo que se presenta hace un aporte importante en este sentido ya que se
establecieron por vez primera los parámetros de calidad para la droga cruda
de M. paniculata (material vegetal en estado seco) y su tintura, los cuales se
mantuvieron estables durante un año de estudio. Así mismo, se propone una
formulación a partir de la tintura, con buena estabilidad físico-química y
tecnológica, como alternativa a tener en cuenta dentro de nuestra Medicina
Natural y Tradicional.
Desde el punto de vista preclínico se demostró que la tintura y el gel no
evidencian signos de toxicidad aguda dérmica en los animales de
experimentación y pudo demostrarse una inhibición de la inflamación de ambos
productos bajo las condiciones ensayadas. Estos estudios también representan
un aporte al estudio de la especie que crece en Cuba.
Los resultados obtenidos en esta experiencia, nos permiten avalar la
factibilidad del uso de la droga seca de M. paniculata, lo que basado en los
beneficios económicos que ofrecería a la industria de fitomedicamentos,
permitirá la extensión de su uso, aún más cuando se cuenta con evidencias
farmacognósticas, fitoquímicas y preclínicas que garantizan su calidad,
seguridad y eficacia.
64
CONCLUSIONES
Conclusiones
CONCLUSIONES
1. El estudio farmacognóstico de la droga seca de M. paniculata y su
tintura permitió establecer sus principales parámetros de calidad y la
composición química a través del análisis de diferentes lotes. También
se demostró que las muestras eran estables durante un año bajo las
condiciones ensayadas.
2. Se elaboró un gel a partir de la tintura, el cual fue aceptado por sus
atributos de olor, color, frescura y apariencia, y mantuvo buena
estabilidad físico-química y tecnológica, en las condiciones de envase y
almacenamiento ensayadas durante un periodo de un año.
3. Desde el punto de vista preclínico se demostró que la tintura y el gel no
evidenciaron signos de toxicidad aguda dérmica en los animales de
experimentación. Así mismo, pudo demostrarse el efecto antiinflamatorio
de ambas muestras, aunque los mejores resultados se presentaron para
los animales tratados con la Indometacina.
65
RECOMENDACIONES
Recomendaciones
RECOMENDACIONES
1. Evaluar desde el punto de vista físico-químico otros lotes de droga seca
y tintura con el propósito de establecer los límites de calidad.
2. Continuar con los estudios de estabilidad de las muestras estudiadas
(droga seca, tintura y gel).
3. Evaluar la toxicidad crónica y subcrónica de la tintura de M. paniculata y
el gel, así como el efecto analgésico de ambos.
66
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ANEXOS
Anexos
Anexo 1. Boleta de evaluación sensorial del gel de M. paniculata
Usted probará como consumidor un gel antiinflamatorio con tintura de Murraya
paniculata. Exprese su criterio marcando con una X donde crea apropiado
dentro de las escalas que se ofrecen.
Criterios
Olor
Me gusta mucho
Me gusta
moderadamente
No me gusta ni me
disgusta
Me disgusta
moderadamente
Me disgusta
mucho
Atributos
Color
Frescor
Apariencia