proceso para la preparacion de vectores geneticos para la

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
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kInt. Cl. : C12N 15/18
11 Número de publicación:
2 173 856
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ESPAÑA
C12P 21/02
A61K 38/18
C12N 5/10
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 90121961.8
kFecha de presentación: 16.11.1990
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 432 510
kFecha de publicación de la solicitud: 19.06.1991
T3
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k
54 Tı́tulo: Proceso para la preparación de vectores genéticos para la expresión del factor de crecimiento
nervioso en células eucariotas.
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73 Titular/es: FIDIA S.p.A.
k
72 Inventor/es: Della Valle, Francesco;
30 Prioridad: 16.11.1989 IT 4856489
Via Ponte della Fabbrica 3-A
35031 Abano Terme, Padova, IT
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.11.2002
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45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 173 856 T3
01.11.2002
Aviso:
k
k
Callegaro, Lanfranco y
Negro, Alessandro
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74 Agente: Durán Moya, Carlos
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 173 856 T3
DESCRIPCION
Proceso para la preparación de vectores genéticos para la expresión del factor de crecimiento nervioso
en células eucariotas.
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Esta invención se refiere a un proceso para obtener el polipéptido denominado factor de crecimiento
nervioso (β-NGF) a partir de células transformadas, y más especı́ficamente se refiere al proceso para
obtener la forma madura humana activa biológicamente (subunidad β) mediante tecnologı́a de ADN recombinante utilizando construcciones genéticas insertables en lı́neas celulares eucariotas adecuadas.
A. Factor de Crecimiento Nervioso (NGF)
El factor de crecimiento nervioso (NGF) se descubrió en primer lugar en tumores de sarcoma de ratón
(publicación Levi-Montalcini, R. y otros, J. Exp. Zool. 116:321, 1951) y posteriormente se purificó y
homogenizó a partir de glándulas submaxilares salivares de ratón macho (publicación Varon, S. y otros,
Biochemistry 6:2202, 1967) y a partir de veneno de serpiente (publicación Angeletti, R. H., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 65:668, 1970). Se han indicado muchas otras fuentes relativamente ricas de NGF, incluyendo próstata de cobaya (publicación Harper, G.P. y otros, Nature 279:160, 1979) y placenta humana
(publicaciones Goldstein, L.D. y otros, Neurochem. Res. 3:175, 1978, Walker, P. y otros, Life Science
26:195, 1980, Patente de Fidia 47745A88). Se han encontrado pequeñas cantidades de NGF en otros
tejidos, tales como, por ejemplo, el sistema nervioso central de los mamı́feros (publicaciones Varon, S.,
Discussions in Neuroscience, volumen II, Número 3, 1985; Hefti, F. y otros, Neuroscience 14:55, 1985).
La relación fisiológica entre estas fuentes potenciales de NGF y los sitios de acción aparentes no está muy
clara, aunque generalmente se supone que el NGF es secretado por varios tejidos periféricos que requieren
la inervación a partir de las células que responden al NGF.
El NGF obtenido de las glándulas submaxilares de ratón es el que más se utiliza para los estudios
de actividad del NGF in vitro e in vivo. El rango de actividad biológica in vitro del NGF se determinó
en células nerviosas primarias y en lı́neas celulares clonadas. Entre las células nerviosas primarias que
respondı́an al NGF in vitro se encuentran las neuronas sensoriales fetales (dı́a 8-12 del feto) de las raı́ces
de los ganglios espinales, las neuronas fetales noradrenérgicas autónomas de los ganglios simpáticos, las
neuronas fetales colinérgicas de las células suprarrenales de cromafı́n y de septo durante el desarrollo.
Mientras que las neuronas sensoriales y simpáticas dependen del NGF para sobrevivir y desarrollarse, parece que las neuronas colinérgicas no requieren el NGF para sobrevivir, sino que únicamente lo necesitan
para su diferenciación, es decir, para la expresión de las caracterı́sticas fenotı́picas unidas al neurotransmisor. La adición de NGF a las células suprarrenales de cromafı́n (que provienen de la cresta neural)
durante la primera fase de su desarrollo produce la expresión de fenotipos de nervio. Entre las lı́neas
celulares que responden al NGF in vitro, tal como se describe en la literatura, se incluyen células suprarrenales de cromafı́n que provienen de tumores de la cresta neural, denominadas células de feocromocitoma
(PC12) y células humanas de neuroblastoma. Después del tratamiento con β-NGF, estas células cambian
su comportamiento, pasando de una fase altamente proliferativa a un estado postmitótico.
El factor de crecimiento nervioso obtenido de la glándula submaxilar de ratón es el más caracterizado, tanto desde un perfil quı́mico como inmunoquı́mico. El NGF de glándulas múridas actúa como un
complejo de proteı́na del tipo 7S (peso molecular aproximadamente de 140.000 daltons) constituido por
tres subunidades (α, β, γ) que coordinan un átomo de Zn+ .
La parte más interesante de la molécula 7S, con relación a su actividad biológica, está constituida por
dos cadenas de polipéptidos, donde cada una tiene un peso molecular de 13.250 y está formada por 118
aminoácidos. Cada cadena o monómero tiene tres puentes sulfuro que forman enlaces covalentes entre dos
residuos de cisteı́na, lo que le confiere a la estructura tridimensional de la proteı́na una elevada estabilidad. Los dos monómeros de NGF unidos entre sı́ mediante enlaces débiles forman un dı́mero con un peso
molecular de 26.500. Se ha observado que la actividad biológica está asociada con el dı́mero denominado
2.5S o, de forma convencional, subunidad β. No se sabe si también está presente en el monómero.
Las técnicas de ingenierı́a genética han hecho posible identificar el gen que codifica la subunidad β
del NGF (β-NGF) (publicaciones Scott, J. y otros, Nature 302:538, 1983; Ullrich, A. y otros, Nature
302:821, 1983; Publicación de Patente EP N◦ 0 121 338). El gen humano que codifica la molécula está
localizado en el brazo corto del cromosoma I y codifica la sı́ntesis de una molécula mucho mayor que
la de peso molecular de 26.500 que constituye la molécula activa biológicamente. Por lo tanto, el gen
inicialmente instruye la sı́ntesis de un precursor de NGF, o pro-NGF, de un tamaño mayor. También se
ha observado que el gen que codifica la subunidad β del NGF se encuentra muy conservado en diferentes
especies, desde pájaros hasta el hombre (publicación Meier, R. y otros, EMBO J. 5:1489, 1986).
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La elucidación de las secuencias de nucleótidos del β-NGF múrido, humano, bovino y de pollo ha hecho que sea posible comparar los sitios conservados y los no conservados de estas moléculas y determinar
su relación con la actividad biológica y la antigenicidad. La conservación global del β-NGF durante la
evolución es sorprendentemente elevada. De los 118 aminoácidos de la forma madura del NGF purificado
de las glándulas submaxilares salivares de ratón macho, únicamente 16 aminoácidos son diferentes en el
β-NGF bovino, 19 en el β-NGF de pollo y 11 en el β-NGF humano, y únicamente hay 6 aminoácidos de
diferencia entre el β-NGF humano y bovino. Todos los residuos de cisteı́na están rigurosamente conservados en todas las especies. La reducción de los tres puentes S-S del β-NGF produce la pérdida completa
de su actividad biológica. La discrepancia aparente entre el elevado nivel de conservación global de las secuencias de aminoácido y la baja reactividad cruzada de tipo inmunoquı́mico es debida a que los cambios
de aminoácidos entre las especies están localizados en “grupos” (“clusters”) especı́ficos. Con estudios
hidropáticos es posible demostrar que estos cambios se producen casi totalmente en sitios hidrofı́licos
considerados determinantes antigénicos potenciales. Se observó que únicamente una región hidrofı́lica se
encontraba estrictamente conservada en las moléculas de NGF para todas las especies estudiadas hasta
la fecha.
B. Tecnologı́a de ADN Recombinante
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La tecnologı́a de ADN recombinante hace que sea posible construir una serie de vectores que son
capaces de expresar proteı́nas de interés en grandes cantidades. Esta tecnologı́a permite a los biólogos
moleculares ensamblar secuencias de ADN para crear moléculas hı́bridas capaces de producir una proteı́na
de interés. Los métodos utilizan varias reacciones, tales como el corte con enzimas de restricción, la unión
de los fragmentos obtenidos de este modo con ligasa, la sı́ntesis quı́mica de oligonucleótidos para su posterior ensamblaje y otras metodologı́as disponibles de diferentes laboratorios en el sector (publicación
Mariatis, T. y otros, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Laboratory NY, 1982). Para obtener niveles de expresión elevados, los elementos de ADN que se
ensamblan deben presentar una información esencial. Por ejemplo, un origen de replicación, una selección
por antibióticos, un promotor de la expresión, activadores de la transcripción del gen de interés y otras
caracterı́sticas conocidas por las personas que utilizan este material. La combinación de estos elementos
en un modo adecuado produce un plásmido, si el gen de interés se inserta de forma natural con respecto a
las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción y el plásmido resultante tiene una expresión
definida. De este modo, el plásmido o vector de expresión es capaz de expresar la proteı́na en células
huésped. A continuación se puede obtener la proteı́na mediante un sistema de purificación. Los elementos (promotores) que controlan de forma natural la expresión de muchos genes, tales como, por ejemplo,
los factores de crecimiento, no tienen una expresión muy fuerte y únicamente se activan en condiciones
adecuadas naturales que frecuentemente se desconocen. Por este motivo, se utilizan promotores de actividad conocida, por ejemplo los virus de la serie de papovavirus, u otras secuencias génicas promotoras
conocidas. Por lo tanto, los elementos que se utilizan para obtener unos elevados niveles de expresión
son una combinación de ADN de varios orı́genes (eucariota, bacteriano, vı́rico, etc.) constituida en el
extremo de diferentes partes de genes que se encuentran unidas para formar un hı́brido. La actividad
de transcripción y de traducción de un gen depende de las distancias adecuadas entre las secuencias
reguladoras y codificantes.
Después de explicar esta introducción, uno de los mejores modos para trabajar de forma adecuada
con secuencias reguladoras es aquél en el que el gen introducido se coloca en la misma posición que el gen
natural. Uno de los sistemas empleados es aquél en el que las secuencias reguladoras también comprenden
algunos aminoácidos de las secuencias codificantes. De este modo, la unión con el gen introducido tiene
como resultado una proteı́na de fusión. Si, por otro lado, se elimina la parte fusionada, es posible obtener
valores biológicos superiores. Si no se utiliza la técnica de proteı́nas de fusión, las tecnologı́as convencionales para la obtención de genes localizados en la proximidad cercana de las secuencias reguladoras
dependen de la existencia de sitios de restricción adecuados que permitan su clonación. Si no existen
sitios compatibles en las proximidades, sino que se encuentran en sitios diferentes, es posible obtener la
unión de los segmentos con la sı́ntesis de un oligonucleótido o ligador que contenga el sitio de restricción
deseado. Si no existen sitios de restricción en la proximidad que permitan el uso del ligador, entonces se
utiliza la técnica de la supresión del ADN con Bal 31 o S1. Esta posibilidad no permite una supresión
precisa y siempre es necesario comprobar mediante secuenciación los diferentes clones para ver cual es el
más adecuado. Estos sistemas son muy restrictivos para los biólogos moleculares y, como consecuencia,
es necesario desarrollar estrategias alternativas en función de la aparición de nuevas tecnologı́as, tal como
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (publicaciones Saiki y otros, Science 239:487, 1988; Scharf,
S.J., Science 233:1076, 1986).
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Con esta técnica es posible amplificar un segmento de gen hasta 106 . El principio se basa en el uso
de dos oligonucleótidos, donde cada uno se puede aparear, respectivamente, con una de las hebras de
ADN que se debe amplificar. La distancia que hay entre los dos oligonucleótidos respecto a la secuencia
del gen examinado determina las dimensiones de la molécula a producir. Estos dos oligonucleótidos se
construyen de modo que dentro de su secuencia haya un sitio de restricción que permita su posterior
clonación. Este sitio de restricción está presente de forma natural o se construye ad hoc mediante la degeneración del número mı́nimo de bases. Esta estrategia, que se puede definir como mutagénesis dirigida
de sitio, hace que sea posible producir sitios de restricción en posiciones determinadas teóricamente por
los biólogos moleculares. Por un lado, la producción de sitios compatibles con otros segmentos génicos
permite una fácil clonación, aunque especialmente abre la posibilidad de unir varios segmentos génicos de
un modo deseado. Esta técnica se puede definir como clonación por mutagénesis dirigida. En la práctica,
mediante tecnologı́a de ADN recombinante es posible expresar polipéptidos heterólogos completos mediante expresión directa o, alternativamente, se puede expresar el polipéptido heterólogo fusionado con
una parte de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido similar. En general, los productos obtenidos
de este modo no son activos biológicamente (Publicación de Solicitud de Patente Británica N◦ 2007676A;
publicación Wenzel, American Scientist 68, 664, 1980).
La capacidad de aislar el gen humano de la subunidad β del factor de crecimiento nervioso proporciona una importante posibilidad. Es posible, mediante tecnologı́a de ADN recombinante, producir una
cantidad suficiente de esta proteı́na poco frecuente. De hecho, la proteı́na de crecimiento nervioso se
puede aceptar para uso clı́nico en el tratamiento de varias enfermedades neurodegenerativas. En este
sentido, existe documentación relativa a la obtención de la subunidad β del NGF mediante tecnologı́a
de ADN recombinante (Publicación de Patente Europea N◦ 0121388; publicaciones Bruce, G. y otros,
Neurobiology of Aging 10:89, 1989; Hu, G. y otros, Nucleic Acid Research 70:57, 1988; Edwards, R. H.,
Mol. Cell. Biol. 8:2456, 1988; Emfors, P., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:4756, 1989). Para la producción,
se seleccionan células de mamı́fero en lugar de bacterias únicamente en los casos en los que la expresión
menos costosa en células microbianas no es viable. De hecho, es mucho más económico producir determinadas proteı́nas en lı́neas bacterianas tal como E. coli, aunque generalmente este sistema huésped/vector
únicamente reproduce con exactitud la secuencia lineal de los aminoácidos que constituyen la proteı́na,
obteniendo una especie de masa insoluble en la bacteria. Asumiendo que se puede preparar un producto
dado a partir de este material de un modo económicamente ventajoso, E. coli podrı́a ser el sistema de
elección, como sucede en el caso de determinadas moléculas pequeñas, tales como los interferones y algunas proteı́nas de crecimiento animal, en las que es posible un plegamiento correcto de la molécula in vitro.
Estos sistemas son más productivos en los casos que tienen que ver de forma general con las proteı́nas
con un único enlace disulfuro y con los péptidos o proteı́nas cuyo uso (como antı́genos de diagnóstico o
componentes de vacunas) no requiere una conformación bien definida.
Las proteı́nas terapéuticas, a las que pertenece el factor de crecimiento nervioso (β-NGF), requieren
una conformación correcta para ser activas y que se puedan utilizar, y también requieren que no tengan
respuesta antigénica. El proceso de preparación podrı́a comprender, para la proteı́na obtenida a partir
de ADN recombinante, glicosilación, la formación de enlaces disulfuro correctos y otras modificaciones
post-transduccionales. La lı́nea bacteriana E. coli no puede cumplir estos requisitos, mientras que las
células eucariotas de mamı́fero y las levaduras sı́ son capaces. La aplicación potencial del β-NGF humano
como agente farmacéutico, obtenido mediante biotecnologı́a, deberı́a tener en cuenta estos problemas.
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Se ha observado que la actividad del NGF depende de la forma dimérica, es decir, del ensamblaje de
dos polipéptidos similares de 118 aminoácidos. La reducción con mercaptoetanol hace que la actividad
biológica se reduzca prácticamente a cero. Los intentos de renaturalizar los tres puentes disulfuro, mediante un reensamblaje de las cisteı́nas, han producido una molécula con una estructura correcta e igual
a la correspondiente a la molécula natural con una probabilidad, desde un punto de vista estadı́stico, de
1 de cada 15. Como consecuencia, la obtención de la molécula en E. coli no garantiza la homologı́a de la
estructura y su aplicación como agente farmacéutico en humanos. De hecho, después de purificarse hasta
la homogeneidad, el NGF humano producido de E. coli muestra en un ensayo de inmunotransferencia,
con anticuerpos policlonales especı́ficos para el β-NGF múrido, una serie de bandas que no son atribuibles
a la forma dimérica activa biológicamente. Además, la actividad biológica de esta mezcla de estructuras
y formas se ha observado que es 10 veces inferior a la de la forma humana similar purificada de fuentes
naturales, tal como tejido de placenta.
Esta estrategia de clonación y obtención del factor de crecimiento nervioso en E. coli, si bien produce
unos niveles de expresión elevados de la proteı́na de interés, genera una serie de moléculas inexactas
que, al administrarse in vivo, podrı́an producir efectos secundarios, por ejemplo, anticuerpos que reconocerı́an y bloquearı́an la actividad biológica de la molécula presente de forma natural. Al mismo
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tiempo, la clonación de la molécula madura en E. coli presenta una metionina inicial no eliminable que
es inequı́vocamente inmunogénica, debido a que se encuentra en una parte expuesta de la molécula.
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Otra estrategia se refiere a la clonación del prepro NGF en células eucariotas, y consiste en aprovechar
el ataque de las peptidasas especı́ficas presentes de forma natural en las células eucariotas para obtener
la molécula madura. En particular, la clonación se realiza en células de ovario de hámster chino (CHO).
A partir de la literatura actual, la clonación genómica total del NGF humano no se ha secuenciado todavı́a, aunque se ha observado que el gen se extiende por más de 10 kda (publicación Ullrich, A. y otros,
Nature 303: 821, 1983). El gen extendido de este modo no permite una clonación convencional a partir
de esta secuencia genómica total. La estrategia consiste en clonar una parte del ADNc que contiene
únicamente las partes codificantes de la proteı́na. Actualmente, el ADNc completo del NGF humano no
se ha aislado todavı́a (faltan algunas secuencias en la posición 5’), aunque se tiene mucha información
de los mensajeros del NGF de otro origen (ratón, bovino, pollo, etc.) (publicaciones Meier, R. y otros,
EMBO J. 51489, 1986; Selby, H.J., J of Neuron Research 18:293, 1987) que puede conducir a deducciones
interesantes. El gen del NGF de ratón está presente en una única copia y produce, como mı́nimo, cuatro
mensajeros diferentes de diferentes dimensiones (publicación Selby, M.J. y otros, Mol. Cell. Biol. 7:3057,
1987). Estas dimensiones diferentes se reflejan especialmente en el diferente codón AUG de inicio, las más
importantes se encuentran en las posiciones -187 y -121 respecto a la proteı́na madura. Estos mensajeros
están presentes en una abundancia relativa diferente respecto a varios tejidos. Los que empiezan en -187
son 10 veces más abundantes en la glándula submaxilar en comparación con los que empiezan en -121.
Sin embargo, diferentes evidencias han mostrado que el porcentaje más consistente de mensajeros de
NGF expresados en el cerebro utiliza, precisamente, el AUG en -121.
Por lo tanto, la presenta invención se refiere a un vector de expresión replicable que codifica el β-NGF
humano para su expresión en células de mamı́fero adecuadas transformadas con dicho vector, donde el
vector comprende (a) una primera secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del β-NGF
humano desde la posición +1 hasta +118; (b) una segunda secuencia de ADN que codifica la secuencia
de aminoácidos del prepro β-NGF humano desde la posición -121 hasta -1 y que se encuentra fusionada
en el extremo 5’ de dicha primera secuencia de ADN; y (c) un elemento regulador promotor-potenciador
fusionado directamente en el extremo 5’ de dicha segunda secuencia de ADN, que hace posible que se
pueda obtener del medio de cultivo la forma madura de la subunidad β del factor de crecimiento nervioso
humano (hβ-NGF), en ausencia de uno o más aminoácidos fusionados al polipéptido y diferentes de los
que se encuentran presentes en su secuencia natural. El polipéptido obtenido de este modo presenta
actividad biológica cuando se utiliza en células diana adecuadas.
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El hβ-NGF descrito en esta invención se puede utilizar para el mantenimiento o la prevención de
la pérdida de la función nerviosa, para su recuperación en estados patológicos de tipo crónico o agudo,
en situaciones neurodegenerativas incluso en fases tardı́as de patologı́as agudas, tales como deficiencias
metabólicas, compresivas, inflamatorias, infectivas, cerebrovasculares, y en situaciones de modulación
del sistema inmune. Además, el polipéptido obtenido no tiene otras proteı́nas contaminantes de origen
humano que podrı́an presentar actividad biológica no deseada.
Además, la invención se refiere a construcciones genéticas que se pueden utilizar en transfecciones
celulares, incluyendo las que se pueden implantar in vivo. Algunas de estas construcciones pueden producir, a nivel local, especı́ficamente la forma activa del factor de crecimiento humano en función de una
dieta administrada, es decir, es posible mantener el gen bajo control.
Además, la invención se refiere a la lı́nea celular transformada que contiene dichos vectores, y a su
cultivo que produce el hβ-NGF.
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La figura 1 es un perfil de hidropaticidad del polipéptido del factor de crecimiento nervioso, subunidad
β, de origen humano.
La figura 2 es una representación esquemática de la construcción del vector de expresión pMSGphNGF.
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La figura 3 es una representación esquemática del vector de expresión pMSGphNGF.
La figura 4 es una representación esquemática de la construcción del vector de expresión
pSV40MTphNGF.
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La figura 5 es una representación esquemática del vector de expresión pSV40MTphNGF.
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La figura 6 es una representación esquemática de la construcción del vector de expresión pSV40phNGF.
La figura 7 es una representación esquemática del vector de expresión pSV40phNGF.
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La figura 8 es una representación esquemática de la construcción del vector de expresión pSV40hNGF.
A partir de estas evidencias, se clonó el β-NGF humano de la presente invención, empezando precisamente en la metionina -121. Los análisis del perfil de hidropaticidad mostraron que los aminoácidos
comprendidos entre -121 y -104 pueden funcionar como péptido lı́der, indicando que la proteı́na se puede
secretar. Este perfil se muestra en la figura 1, el perfil de hidropaticidad del polipéptido del factor
de crecimiento nervioso, subunidad, de origen humano, según el método descrito (publicación Hopp y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824, 1981). La posición indicada como -121/-104 identifica el
péptido lı́der, mientras que la posición indicada como +1/+118 indica la secuencia de aminoácidos del
polipéptido del factor de crecimiento nervioso, subunidad β, de origen humano (publicación Ullrich y
otros, Nature 303:821, 1983). Para obtener la proteı́na madura existe una peptidasa especı́fica que hace
que sea posible obtener la secuencia de aminoácidos desde +1 hasta +118, que corresponde al péptido
activo biológicamente. Esta peptidasa contenida en las células que normalmente sintetizan el NGF se
observó que también estaba contenida en las células AT-20. De hecho, estas células son capaces de secretar el NGF maduro introduciendo en las mismas un vector que consiste en un Virus Vacunal prepro
NGF de origen múrido, lo que hace que sea posible la producción de una molécula de 14 kda en gel bajo
condiciones desnaturalizantes y reductoras (publicación Edwards, R.H., Mol. Cell. Biol. 8:2456, 1988).
Como resultado de las experiencias previas en la obtención de la subunidad β del factor de crecimiento
nervioso, descritas anteriormente, los inventores compararon, de un modo innovador, la construcción de
uno o más vectores que se pueden utilizar en células eucariotas. Se utilizó la técnica de PCR para realizar
la clonación del prepro NGF, cuyos sitios se crearon para que fuesen compatibles con varios vectores de
expresión, y estos sitios de restricción estaban localizados de modo que se mantuviesen, de un modo tan
natural como fuese posible, las distancias entre las secuencias reguladoras y las secuencias codificantes,
una situación bastante diferente de las construcciones genéticas descritas con anterioridad en la literatura
para la expresión de la subunidad β-NGF. La parte del prepro NGF se unió a una secuencia modificada
de NGF humano maduro (hβ-NGF), adquirida de British Technology Ltd. (Oxford, Gran Bretaña), en
la que los sitios de restricción se han creado para permitir la mutagénesis posterior. Para el propósito
de la invención, la presencia de estos sitios de restricción no se deberı́a considerar limitante, del mismo
modo que el origen del gen tampoco no se deberı́a considerar limitante.
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Partiendo de esta suposición, los inventores clonaron el prepro hβ-NGF bajo el control de diferentes
promotores de SV40 (Virus de Simio 40), MTTV (Virus de Tumor Mamario de Ratón), hMTIIa (metalotioneı́na IIa humana). Estas secuencias genéticas introducidas en los plásmidos se transfectaron a
continuación en células CHO, mostrando que incluso estas células eran capaces de producir el polipéptido
h-NGF en su forma biológicamente activa en el medio de cultivo. Este prepro NGF se ha mostrado
esencial en el ensamblaje de la molécula, haciendo posible la expresión de únicamente la subunidad β y
mostrando que la construcción genética total se debı́a considerar correcta.
A. Métodos Generales Utilizados
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Los ataques en las cadenas de ADN con enzimas de restricción se realizan según las especificaciones
de las empresas productoras. En general, 1 µg del plásmido se corta con 1 U de enzima en 20 µl de
solución; la temperatura y el tiempo de incubación dependen del enzima utilizado, en general 1 hora a
37◦C. Después de la incubación, se purifican el plásmido y los segmentos genéticos en un gel de agarosa
LMP Agarose (BRL, Estados Unidos de América) en tris/HCl 40 mM, acetato sódico 20 mM, EDTA 1
mM y a continuación se eluyen de la agarosa con el conjunto (“kit”) GENECLEANT M (BIO 101 Inc.,
La Jolla, CA, Estados Unidos). Para las reacciones de copia en el extremo 5’, se trata el ADN durante
15 minutos a 15◦C con 10 U de polimerasa (Klenow). Para las ligasas, se utiliza la ligasa T4 a una
concentración de 1 U por 0,5 µg de ADN en una reacción de 20 µg a 13◦C durante 12 horas.
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Los análisis para confirmar las secuencias correctas en el plásmido se realizan transformando en células
HB101 y los transformantes seleccionados en placas de agarosa en medio LB (Luria Bertani) con 50 µg/ml
de antibiótico ampicilina. El plásmido contenido en las HB101 se cultiva en LB, 100 µg/ml de ampicilina
y se purifica, tanto para preparaciones grandes como pequeñas, con el conjunto de Quiagen (DIAGEN
GmbH, Düsseldorf, República Federal de Alemania). Los vectores de expresión se preparan a partir de
células bacterianas con el método Quiagen.
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El ADN para las reacciones de PCR se prepara del siguiente modo a partir de placenta humana en el
momento oportuno. Se trocea una pieza de 0,4 cm3 de vellosidades coriónicas con unas tijeras y se suspende en 700 µl de tris/HCl 50 mM pH 7,8, EDTA 100 mM, NaCl 100 mM, SDS al 1 %. A continuación
se añaden a ello 35 µl de proteinasa (K 100 µg/ml) y se incuba a 55◦C hasta el dı́a siguiente. Se añaden
20 µl de una solución a 13 µg/ml de ARNasa A y se incuba 2 horas más. Se realizan dos extracciones con
fenol y dos con cloroformo. A continuación se precipita el ADN en un vaso capilar de vidrio mediante
la adición de 1 volumen de isopropanol. En este punto se realizan algunos pases con etanol al 70 % y al
100 % y se seca. El ADN se disuelve en un tampón (tris/HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM), dejándolo
en agitación lenta en un tubo de ensayo. Después de algunas horas, el ADN disuelto está listo para la
amplificación genética. Normalmente, son suficientes 0,1 µg de ADN para realizar la PCR.
Se realiza la transfección en células CHO (CCL 61) y CHO modificadas por la ausencia del gen de la
deshidrofolato reductasa (DHFR-) con liposomas, siguiendo los procedimientos de la empresa productora
GIBCO, o con fosfato cálcico.
15
A.2 Transfección de Liposomas
20
Las células cultivadas en alfa-MEM con un 5 % de suero fetal de bovino se tripsinizan y se vuelven
a sembrar en placas el dı́a antes de la transfección, de modo que el siguiente dı́a hayan alcanzado un
70-80 % de confluencia. Se diluye el ADN plásmido a transfectar hasta una concentración de 10 µg de
ADN en 50 µl de H2 O, a lo que se añaden a continuación 50 µl de LipofectinT M (GIBCO), todo ello en un
tubo de poliestireno. Después de 15 minutos, se añade esta mezcla a las células previamente lavadas con
el medio OPTI-MEM (GIBCO). Las células se incuban de este modo durante 8 horas, y a continuación
se añade el medio normal que incluye suero fetal bovino para continuar el cultivo.
25
A.3 Método de Transfección Con Fosfato Cálcico para Obtener una Transformación Estable
30
35
40
Los tampones para la transfección en este método son los siguientes: BBS concentrado dos veces
(2 x BBS) y CaCl2 0,25 M. El 2 x BBS se prepara del siguiente modo: se disuelven 50 mM de ácido
N,N-bis-2-(hidroxietil)-2-amino etano sulfónico (Calbiochem); 280 mM de NaCl y 1,5 mM de Na2 HPO4
en agua, el pH se lleva a 6,5, y a continuación se filtra todo a 0,45 µm, mientras se prepara 10 x CaC2
como solución de CaCl2 2,5 M.
Se siembran las células a 5 x 105 células/10 cm de placa/10 ml de medio de cultivo y se incuban a
35◦C hasta el dı́a siguiente. Se mezclan 20 µg de plásmido con 0,5 µl de CaCl2 0,25 M y 0,5 ml de 2
x BBS; la mezcla se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se instila la
mezcla en el medio y todo ello se incuba hasta el dı́a siguiente a 35◦C en un 3 % de CO2 . Para obtener
células transformadas de forma estable con los vectores de la invención, se realiza una cotransfección
añadiendo al vector que expresaba el hβ-NGF el vector pSV2Neo en una proporción de 10 a 1. Dos
dı́as después de la transfección, se tripsinizan las células y se siembran en placas a una concentración
diez veces inferior en comparación con la transfección, e inmediatamente se empieza la selección de las
transformaciones estables con 1 mg/ml de sulfato de neomicina G418 (Gibco). A continuación se analizan
los transformantes en un ensayo de transferencia de tipo Southern para determinar la integración de la
construcción genética.
45
A.4 Expresión
50
Se conservaron todos los medios de las células para la expresión en Ham’s F12/DME H-21 con Hepes
15 mM y un 10 % de suero fetal de ternera. El medio se cambia cada tres dı́as y se sustituye con medio
nuevo sin suero para la purificación del hβ-NGF.
B. Realizaciones Preferentes
B.1 Descripción de la Construcción de Vectores de Expresión
55
60
Se producen tres vectores diferentes; el primero y el segundo son vectores en los que los elementos
reguladores, respectivamente MMTV (Virus de Tumor Mamario de Ratón) y hMTIIA (metalotioneı́na
IIa humana), se pueden inducir quı́micamente. De este modo es posible expresar de forma controlada el
gen de hβ-NGF. Por el contrario, en el tercer vector, el hβ-NGF se clona bajo el promotor SV40 (Virus
de Simio 40).
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B.2 Clonación en el Vector de Expresión pMSG
5
10
15
El vector pMSG se adquirió de Pharmacia (Uppsala, Suecia). Según las especificaciones de la empresa,
el gen a introducir se debe insertar en múltiples sitios de clonación entre los sitios de restricción Nhe I
y Sal I. El gen se traduce mediante su primer AUG; en este caso, el factor de crecimiento nervioso se
encuentra bajo el control del promotor del MMTVLTR (Repetición Terminal Larga de Virus de Tumor
Mamario de Ratón). La actividad de este promotor se puede inducir mediante la administración de
glucocorticoides, por ejemplo, dexametasona. En la transcripción, el corte y empalme (“splicing”) se
produce mediante el antı́geno t pequeño de SV40 y la poliadenilación mediante el antı́geno t grande de
SV40. Este plásmido también contiene el gen bacteriano de la xantina guanina fosforibosiltransferasa
(xgpt) que se utiliza para seleccionar las células CHO KI transformadas de forma estable.
Se utiliza la técnica de la PCR para permitir una clonación del prepro NGF en este plásmido, con la
que se crea un sitio de restricción justo antes del AUG inicial y, de este modo, se mantienen las distancias,
de una forma tan natural como es posible, entre las secuencias reguladoras y las secuencias codificantes
del prepro NGF. Se sintetizan dos oligonucleótidos: el primero, entre las bases 9122 y 9147 (publicación
Ullrich, A., Nature 303:821, 1983), deberı́a tener la siguiente secuencia:
Met Ser Met Leu Phe
20
5
0
GCATAGCGTA ATG TCC ATG TTG TTC T3
Las bases anteriores al AUG inicial, tal como se ha indicado anteriormente, se encuentran mutadas,
con lo que el oligo sintetizado tiene la siguiente secuencia:
25
Xbai Met Ser Met Leu Phe
5
30
0
TGT CTAG AGT ATG TCC ATG TTG TTC T3
Este oligonucleótido se denomina (XbaI). El segundo oligonucleótido, que comprende las bases entre 9521
y 9342 (publicación Ullrich, A., Nature 303:821, 1983), es complementario a esta secuencia para permitir
la PCR, y tiene la siguiente secuencia
ECORI
35
5
0
GGCGG AATT CTCGGTGGTGGAC3
Este oligonucleótido contiene en su interior el sitio ECORI para permitir la unión del prepro NGF al
NGF maduro. Este oligonucleótido se denominó (ECORI).
40
45
50
55
60
Los dos oligonucleótidos se sintetizan en un sintetizador de oligonucleótidos en fase sólida con el método
de fosforamiditas siguiendo los procedimientos estándar de un Sintetizador de ADN 330B (Applied Biosystems, Estados Unidos). Éstos son los siguientes: (a) tratar a 55◦ C durante 12 horas en NH3 ; (b) llevar a
sequedad en una centrifugadora de vacı́o; (c) resuspender en acetato de amonio 2,5 M; (d) precipitar con
3 volúmenes de etanol frı́o (-20◦C); y (e) volver a lavar con etanol frı́o al 80 % y resuspender en agua. Se
evaluaron las concentraciones de los dos oligonucleótidos con un espectrofotómetro. El procedimiento de
amplificación se realiza en un Amplificador de Ciclo Térmico de ADN Perkin Elmer Cetus y los reactivos
utilizados en la amplificación son los del conjunto relacionado DNAT M AMplyfer (Perki Elmer-Cetus).
En resumen, se utiliza una mezcla con 200 µM de cada oligonucleótido, 0,5 µM de cada oligonucleótido
de dATP, dTTP, dCTP, dGTP y 0,1 µg de ADN humano y tampón de reacción en una mezcla total de
100 µl con 0,5 U de TAQ polimerasa, todo ello cubierto con aceite de parafina para evitar la evaporación.
La reacción de amplificación se realiza operando el instrumento durante 35 ciclos en el caso de ADN
humano. El ciclo en ambos casos es el siguiente: 1 minuto a 94◦ C, 2 minutos a 45◦C, 3 minutos a 72◦ C.
El fragmento amplificado de 300 bp se purificó en un gel de Agarosa de Baja Fusión (NuSieve) utilizando
el conjunto GENECLEANT M (BIO 101 Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos) para disolver la agarosa.
El ADN se corta con los enzimas de restricción Xbai y EcoRI y se vuelve a purificar tal como se ha
descrito anteriormente. El fragmento purificado de este modo se clona en los sitios Xbai y EcoRI del
vector pGEM4 (Promega). El plásmido obtenido se denomina pGEM4Xba-NGF.
Este plásmido (pGEM4Xba-NGF) se corta en HindIII-EcoRI y el fragmento de 300 bp, cuando se
ha purificado, se clona en los sitios HindIII-EcoRI del vector pUC18BBG26 (British Biotechnology Ltd.
Oxford, Reino Unido). El pUC18BBG26 contiene el gen del hβ-NGF construido como un casete, es decir,
dentro de su secuencia se han creado sitios de restricción no naturales que, por lo tanto, hacen que sea
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posible la sustitución de determinados dominios, es decir, en otras palabras, permiten la mutagénesis.
El vector obtenido se denomina pUC18hNGFC. Este vector se corta con BamHI y la extensión se copia
a 5’ con polimerasa Klenow. Se corta en XbaI y el fragmento de 760 bp se purifica mediante un gel de
agarosa. Este fragmento se clona entre los sitios NheI y SmaI del vector de expresión pMSG. En la figura
2 se muestra el diagrama resumen para la obtención de este vector, denominado pMSGphNGF, mientras
que en la figura 3 se muestra la representación esquemática del mismo vector.
B.3 Clonación de NGF Bajo el Control de Metalotioneı́na
10
15
20
Se sintetiza este vector debido a que la metalotioneı́na IIa (MTIIa) se puede inducir con Zn++ o con
Cd++ o con otros iones metálicos pesados, con lo que se puede controlar su expresión. Además, para
potenciar la expresión de este promotor, se añade un potenciador SV40 en el extremo 5’ del promotor
de la MTIIa, mientras que siempre se utilizan el antı́geno t pequeño y el poliA de SV40 para el corte
y empalme y la poliadenilación. En primer lugar se une el promotor de la metalotioneı́na al prepro
hβ-NGF del siguiente modo: se aı́sla el promotor de la metalotioneı́na del plásmido (phMTIIA) cortando
con los enzimas de restricción HindIII y BamHI (publicación Karin, H., Nature 299:797, 1982), se clona
el fragmento de 841 bp que comprende el promotor en los sitios HindIII-BamHI del vector pGEM4
(Promega Madison, WI, Estados Unidos). Este vector se denomina pGEM4hMTIIa. Esta parte del
promotor se extiende hacia 3’ con algunos codones naturales, contiene el primer codón de la metionina
AUG e inmediatamente después se encuentra el sitio de restricción BamHI. Para permitir la clonación
del prepro hβ-NGF bajo este promotor utilizando la metionina inicial del promotor de la hMTIIa, se
construye un oligonucleótido entre las bases 9133 y 9160 (publicación Ullrich, A., Nature 303:821, 1983)
creando un sitio de restricción BamHI justo después del AUG inicial, que permite poner el gen en fase.
El oligonucleótido sintetizado, que tiene la siguiente secuencia:
25
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile
50
30
TG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG ATC AC3
se muta para formar la siguiente secuencia:
BamHI
5
0
TGG ATCC ATTGTTCTACACTCTGATCAC3
35
Este oligonucleótido se denomina BamHI. Las bases cambiadas también comprenden un cambio de la
secuencia de aminoácidos; de hecho, el segundo y el tercer aminoácidos cambian, respectivamente, de Ser
a Asp y de Met a Pro. Sin embargo, este cambio no tiene mucha influencia en el perfil de hidropaticidad
y la molécula se secreta normalmente.
40
Este oligonucleótido, junto con el oligonucleótido EcoRI, se utiliza para amplificar el prepro NGF tal
como se ha descrito anteriormente. El fragmento purificado se corta en BamHI y en EcoRI y a continuación se clona entre los sitios de restricción BamHI y EcoRI del vector pGEM4hMTIIa. El vector se
denomina pGhMTphNGF.
45
Para obtener el potenciador (activador) de SV40, este último se coge del plásmido PMSGphNGF del
siguiente modo: se corta el vector PMSGphNGF con BamHI y a continuación se copia la extensión en
5’ con polimerasa Klenow. A continuación se corta con HindIII y el fragmento de 500 bp se clona en
pGEM3 entre los sitios de restricción NaeI y HindIII. El vector obtenido se denominó pGSV40.
50
Para obtener el vector de expresión, se unen las piezas mencionadas anteriormente en una unión triple de fragmentos del siguiente modo: se corta el vector pMSGphNGF con los enzimas de restricción
EcoRI y BamHI y se purifica el fragmento de 1500 bp. Se corta el vector pGhHTphNGF con los enzimas
HindIII-EcoRI y se purifica el fragmento de 1100 bp. Estos dos fragmentos se clonan conjuntamente en
el vector pGSV40, entre los sitios de restricción HindIII y BamHI. En la figura 4 se muestra el diagrama
resumen para la obtención de este vector de expresión, denominado pSV40MTphNGF, mientras que en
la figura 5 se muestra la representación esquemática del mismo vector.
55
60
Este vector, pSV40MTphNGF, se introduce de forma estable en células CHO KI como una transfección
doble junto con el plásmido pSV2Neo, y se selecciona del mismo modo que se ha descrito anteriormente
con 1 mg/ml de neomicina G418 (GIBCO, BRL). Este plásmido se cotransfecta con el plásmido phMT
para obtener una selección de las colonias que contienen un elevado número de copias. En este caso,
las células CHO KI se exponen durante 24 horas en sulfato de cinc 50 mN para inducir la sı́ntesis de
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metalotioneı́na y se seleccionan con cloruro de cadmio con una concentración inicial de 2,5 µM hasta 20
µM. Las células que contienen un elevado número de copias del hNGF se utilizan para la expresión de la
molécula.
5
B.4 Clonación del NGF Bajo el Promotor Potenciador de SV40
10
El plásmido pGEM4XbaNF se corta con los enzimas de restricción HindIII y EcoRI y el fragmento
de 300 bp se sustituye en el vector pSV40 MT phNGF entre los sitios de restricción HindIII y EcoRI. En
la figura 6 se muestra el diagrama resumen para la obtención de este vector, denominado pSV40phNGF,
mientras que en la figura 7 se muestra una representación esquemática del mismo vector.
15
Éste es un vector constitutivo estándar en el que las secuencias reguladoras están asignadas a un
promotor/potenciador de SV40. Este vector se cotransfecta de forma estable en células CHO KI con
el plásmido pSV2Neo, y se analizan los clones que producen el polipéptido β del factor de crecimiento
nervioso.
Selección en las Células CHO KI dhfr
20
25
30
Para obtener la amplificación génica del vector anterior en las células CHO KI Dhfr-, dicho vector se
modifica a continuación clonando el gen de DHFR+ hacia arriba de la cadena a partir del gen del hNGF.
Se cortó el vector pSV2dhfr que codifica para DHFR+ en HindIII y a continuación se copia la extensión
en 5’ con polimerasa. Se corta en BamH y se clona el fragmento de 1800 bp en los sitios de restricción
XhoI, que se han vuelto romos con polimerasa tal como se ha indicado anteriormente, y BamHI en el
vector pSV40hNGF. De este modo se crea el plásmido de expresión-selección pSV40hNGF. En la figura
8 se muestra el diagrama resumen para la obtención de este vector.
Normalmente este plásmido se transfecta en células CHO KI en un medio alfa MEM sin nucleósidos
y con un 10 % de suero fetal de vaca. Después de dos dı́as, las células se tripsinizan, se llevan a 1/10 de
la concentración anterior y se empieza la amplificación con 10 µM de MTX (metotrexato) hasta 500 µM.
Las células que sobreviven a las concentraciones más elevadas de MTX se utilizan para la expresión de
hNGF.
Determinación de la Actividad Biológica
35
40
Se realizan estudios in vitro para determinar la actividad biológica en el medio de cultivo de la lı́nea
celular CHO después de la inserción de uno de los tres vectores descritos anteriormente, después de su
estabilización, en células fetales de cromafinoma PC-12 (publicación Greene L.A. y otros, Rev. Neurosci.
3:353, 1982). La especificidad de la reacción se comprueba utilizando un medio de cultivo en el que se
cultivan lı́neas CHO no transformadas o bloqueando la actividad del hβ-NGF presente en el medio de
cultivo con anticuerpos policlonales especı́ficos para el NGF de origen múrido o bovino. Las tres lı́neas
celulares transformadas y estabilizadas con los vectores individuales descritos anteriormente producen la
subunidad β del NGF humano en la forma biológicamente activa.
Composiciones Farmacéuticas
45
50
55
60
El hβ-NGF de la invención se puede formular según métodos conocidos para producir composiciones
útiles farmacéuticamente. La formulación de composiciones farmacéuticas que contienen la molécula NGF
humana (subunidad β) que proviene de ADN recombinante, descrita en este sentido sin gangliósidos y
fosfolı́pidos y posiblemente también con los mismos, comprende los métodos conocidos para la preparación
de composiciones que son aceptables desde un punto de vista farmacéutico y que se pueden administrar
a un paciente, que hacen que sea posible para una cantidad efectiva de la molécula de hNGF combinarse
en una mezcla con un vehı́culo aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Vehı́culos adecuados y su
formulación que comprende otras proteı́nas se describen, por ejemplo, en “Remington’s Pharmaceutical
Sciences” (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., Estados Unidos, 1985). Estos vehı́culos comprenden “formulaciones depósito” inyectables (“deposit formulations”).
En base a lo descrito anteriormente, la formulación farmacéutica comprende, aunque no de forma
exclusiva, soluciones de factor de crecimiento nervioso o sus polvos liofilizados en asociación con uno
o más vehı́culos o diluyentes aceptables desde un punto de vista farmacéutico, y que contienen medios
tamponados a un pH adecuado e isoosmóticos con los lı́quidos fisiológicos. En el caso de las preparaciones liofilizadas, se pueden utilizar excipientes de soporte, tales como, por ejemplo, aunque no de forma
exclusiva, manitol o glicina, y se producirán soluciones tamponadas adecuadas de volumen deseado para
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obtener soluciones tamponadas isotónicas adecuadas que tengan un pH deseado. Se pueden utilizar soluciones similares para las soluciones farmacéuticas para las composiciones farmacéuticas de la molécula
del factor de crecimiento nervioso obtenida de ADN recombinante en soluciones isotónicas de volumen
deseado, y éstas incluyen, aunque no de forma exclusiva, el uso de soluciones tamponadas fisiológicas
con fosfato o citrato en concentraciones adecuadas para obtener cada vez preparaciones farmacéuticas
isotónicas de pH deseado, por ejemplo, pH neutro.
Además, la formulación farmacéutica comprende, aunque sin limitarse a ello, supositorios para la
administración rectal con excipientes liofilizados, por ejemplo, solubles en agua, autoemulsionantes de
tipo glicogelatina u otros. En estas preparaciones, el factor de crecimiento nervioso obtenido del ADN
recombinante puede estar presente en cantidades que varı́an entre 0,01 % y 1/1 % en peso de todo el excipiente. Los supositorios pueden contener, sin limitarse a ello, cantidades adecuadas de acetilsalicilato.
Estas preparaciones farmacéuticas se pueden destinar a un uso oral, rectal, parenteral, local, inhalante,
intracerebral. Por lo tanto, se encuentran en forma sólida o semisólida, por ejemplo, grageas, comprimidos, opérculos gelatinosos, cápsulas, supositorios, cápsulas de gelatina blanda. Para uso parenteral e
intracerebral, se pueden utilizar formas destinadas para la administración intramuscular o subcutánea,
o que son adecuadas para inyecciones o infusiones intravenosas o intracerebrales y, por lo tanto, pueden
ser soluciones de compuestos activos y polvos liofilizados de los compuestos activos junto con uno o más
recipientes o diluyentes aceptables desde un punto de vista farmacéutico, adecuados para los usos mencionados anteriormente y con una osmolaridad compatible con los lı́quidos fisiológicos. Para uso local,
se consideran para uso tópico preparaciones en forma de cremas o ungüentos; para uso inhalante, se
consideran preparaciones en forma de pulverizador, por ejemplo, pulverizadores nasales.
Las preparaciones de la invención se pueden destinar a la administración a humanos o animales.
Preferentemente contienen entre 0,01 % y 10 % del componente activo en las soluciones, pulverizadores,
ungüentos y cremas, y entre 1 % y 100 % del compuesto activo, preferentemente entre 5 % y 50 %, en las
preparaciones en forma sólida. La dosis que se administra dependerá de la indicación, del efecto deseado
y del modo de administración seleccionado.
30
La invención también comprende el uso terapéutico de todos los nuevos complejos de gangliósidos o
derivados con la subunidad β del factor de crecimiento nervioso NGF para las indicaciones mencionadas
anteriormente. La dosis diaria en humanos por inyección (subcutánea o intramuscular o intracerebral)
varı́a entre 0,05 mg y 5 mg de sustancia activa por kg de peso corporal.
35
Tal como se ha descrito la invención, es evidente que estos métodos se pueden modificar de varios
modos. Estas modificaciones no se deben considerar desviaciones del espı́ritu y de las perspectivas de la
invención, y todas estas modificaciones, que son evidentes para las personas que tienen conocimientos de
esta técnica, están comprendidas en el ámbito de las siguientes reivindicaciones.
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REIVINDICACIONES
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1. Método para producir un vector de expresión replicable que codifica el β-NGF humano para su
expresión en células de mamı́fero adecuadas transformadas con dicho vector, comprendiendo dicho método
comprende insertar las siguientes secuencias en dicho vector:
(a) una primera secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del β-NGF humano desde
la posición +1 hasta +118;
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(b) una segunda secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del prepro β-NGF humano
desde la posición -121 hasta -1 y que se encuentra fusionada en el extremo 5’ de dicha primera
secuencia de ADN; y
(c) un elemento regulador promotor-potenciador fusionado directamente en el extremo 5’ de dicha
segunda secuencia de ADN.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que la segunda secuencia de ADN (b) contiene cambios en
las bases que producen cambios de aminoácidos en la posición -120, de Ser a Asp, y en la posición -119,
de Met a Pro.
20
25
3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho elemento regulador es el promotor del Virus
de Tumor Mamario de Ratón (MMTV).
4. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho elemento regulador es el promotor de la
metalotionina IIa humana.
5. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho elemento regulador es el promotor de SV40.
30
35
6. Método para producir un vector de expresión replicable que comprende insertar un fragmento de
ADN de aproximadamente 760 pares de bases y que codifica el prepro β-NGF humano desde la posición
-121 a la posición +118 en dicho vector, dicho fragmento de ADN consiste en
(a) un fragmento de ADN genómico humano de aproximadamente 300 pares de bases obtenido mediante
la amplificación de ADN genómico humano con la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los
cebadores que tienen la secuencia 5’-TGT CTAG ATG TCC ATG TTG TTC TTT-3’ y 5’GGCGG
AATT CTCGGTGGTGGACCC-3’;
(b) un fragmento EcoRI-BamHI de 460 pares de bases que codifica una parte del β-NGF humano y que
se encuentra fusionado directamente en el extremo 3’ del fragmento de 300 pares de bases (a);
40
en el que dicho fragmento de 760 pares de bases se inserta entre los sitios NheI y SmaI del plásmido
pMSG.
45
7. Método para producir un vector de expresión replicable que comprende insertar un fragmento de
ADN de aproximadamente 760 pares de bases y que codifica el prepro β-NGF humano desde la posición
-121 hasta la posición +118 en dicho vector, dicho fragmento de ADN consiste en:
50
(a) un fragmento de ADN genómico humano de aproximadamente 300 pares de bases obtenido mediante
la amplificación de ADN genómico humano con la reacción en cadena de la polimerasa utilizando
los cebadores que tienen la secuencia 5’-TGG ATCC ATTGTTCTACACTCTGATCACCC-3’ y
5’-GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3’;
(b) un fragmento EcoRI-BamHI de 460 pares de bases que codifica una parte del β-NGF humano y que
se encuentra fusionado directamente en el extremo 3’ del fragmento de 300 pares de bases (a);
55
(c) un fragmento BamHI-HindIII de 500 pares de bases que comprende un elemento potenciador de
SV40;
(d) un fragmento HindIII-BamHI de 841 pares de bases que comprende un promotor de un gen de
metalotionina IIa de ratón;
60
en el que el potenciador de SV40 (c) se encuentra unido de forma operable al extremo 5’ del promotor
de metalotionina IIa de ratón (d), cuyo extremo 3’ se encuentra, a su vez, unido de forma operable al
extremo 5’ del fragmento de ADN de 760 pares de bases que codifica el prepro β-NGF humano entre los
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sitios NaeI y BamHI de pGEM3.
5
8. Método para producir un vector de expresión replicable que comprende insertar un fragmento de
ADN de aproximadamente 760 pares de bases y que codifica el prepro β-NGF humano desde la posición
-121 hasta la posición +118 en dicho vector, dicho fragmento de ADN consiste en:
10
(a) un fragmento de ADN genómico humano de aproximadamente 300 pares de bases obtenido mediante
la amplificación de ADN genómico humano con la reacción en cadena de la polimerasa utilizando
los cebadores que tienen la secuencia 5’-TGG ATCC ATTGTTCTACAC TCT GAT CACCC-3’ y
5’-GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3’;
(b) un fragmento EcoRI-BamHI de 460 pares de bases que codifica una parte del β-NGF humano y que
se encuentra fusionado directamente en el extremo 3’ del fragmento de 300 pares de bases (a);
15
(c) un fragmento BamHI-HindIII de 500 pares de bases que comprende un elemento potenciador de
SV40;
(d) un fragmento HindIII-BamHI de 841 pares de bases que comprende un promotor y una metionina
iniciadora de un gen de metalotionina IIa de ratón;
20
en el que el potenciador de SV40 (c) se encuentra unido de forma operable al extremo 5’ del promotor
de metalotionina IIa de ratón (d), cuyo extremo 3’ se encuentra, a su vez, unido de forma operable al
extremo 5’ del fragmento de ADN de 760 pares de bases que codifica el prepro β-NGF humano entre los
sitios NaeI y BamHI de pGEM3.
25
9. Célula huésped recombinante transformada con el vector de expresión producido según un método
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Célula, según la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula de mamı́fero.
30
11. Célula, según la reivindicación 9, en la que dicha célula de mamı́fero es una célula CHO.
12. Proceso para la preparación de un vector de expresión que codifica el β-NGF humano que comprende:
35
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(a) preparar un oligonucleótido XbaI que tiene la secuencia 5’-TGG ATCC ATTGTTCTACACT
CTGATCACCC-3’ y un oligonucleótido EcoRI que tiene la secuencia 5’GGCGG AATT CTC
GGTGGTGGACCC-3’;
(b) amplificar un fragmento de ADN de 300 pares de bases mediante una reacción en cadena de la polimerasa utilizando dichos oligonucleótidos XbaI y EcoRI como cebadores y ADN genómico humano
como molde de ADN;
(c) clonar dicho fragmento de ADN de 300 pares de bases en los sitios XbaI y EcoRI del vector pGEM4
para producir un plásmido pGEM4Xba-NGF;
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50
(d) cortar dicho plásmido pGEM4Xba-NGF en HindIII y EcoRI para producir un primer fragmento de
300 bp;
(e) clonar dicho primer fragmento de 300 bp en los sitios HindIII-EcoRI de un plásmido pUC18BBG26
para producir pUC18hNGFc;
(f) cortar dicho pUC18hNGFc en BamHI y XbaI para producir un fragmento de 760 bp;
(g) clonar dicho fragmento de 760 bp en los sitios NheI y SmaI de un vector pMSG para producir un
plásmido pMSGphMGF;
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(h) aislar un fragmento que contiene el promotor de la metalotionina IIa (MTIIa) cortando phMTIIa
con HindIII y BamHI;
(i) clonar dicho fragmento que contiene el promotor MTIIa en un vector pGEM4 en los sitios HindIII
y BamHI para producir un vector pGEM4hMTIIa;
(j) cortar una secuencia de ADN prepro NGF con BamHI y EcoRI y clonar el fragmento resultante
entre los sitios de restricción BamHI y EcoRI de pGEM4hMTIIa para producir pGhMTphNGF;
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(k) cortar pMSGphNGF con BamHI, copiar la extensión 5’ con polimerasa Klenow, cortar con HindIII
y clonar el fragmento de 500 bp resultante entre los sitios NaeI y HindIII de pGEM3 para producir
PGSV40; y
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10
(l) cortar pGhMTphNGF con HindIII y EcoRI para producir un primer fragmento, cortar pMSGphNGF con EcoRI y BamHI para producir un segundo fragmento, y clonar dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento entre los sitios HindIII y BamHI de pGSV40 para producir
pSV40MTphNGF.
13. Proceso para producir β-NGF humano que comprende:
(i) transformar una célula de mamı́fero con el vector de expresión replicable según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8;
15
(ii) cultivar dicha célula transformada; y
(iii) recuperar el β-NGF humano producido en dicho cultivo.
14. Proceso, según la reivindicación 13, en el que dicha célula de mamı́fero es una célula CHO.
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15. Proceso, según las reivindicaciones 13 ó 14, en el que dicho vector de expresión replicable tiene la
estructura de pSV40MTphNGF, un vector que comprende un fragmento de ADN de aproximadamente
760 pares de bases y que codifica el prepro β-NGF humano desde la posición -121 hasta la posición +118,
que consiste en:
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(a) un fragmento de ADN genómico humano de aproximadamente 300 pares de bases obtenido mediante
la amplificación de ADN genómico humano con la reacción en cadena de la polimerasa utilizando
los cebadores que tienen la secuencia 5’-TGG ATCC ATTGTTCTACAC TCT GAT CACCC-3’ y
5’-GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3’;
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(b) un fragmento EcoRI-BamHI de 460 pares de bases que codifica una parte del β-NGF humano y que
se encuentra fusionado directamente en el extremo 3’ del fragmento de 300 pares de bases (a);
(c) un fragmento BamHI-HindIII de 500 pares de bases que comprende un elemento potenciador de
SV40;
35
40
(d) un fragmento HindIII-BamHI de 841 pares de bases que comprende un promotor y una metionina
iniciadora de un gen de metalotionina IIa de ratón;
en el que el potenciador de SV40 (c) se encuentra unido de forma operable al extremo 5’ del promotor
de metalotionina IIa de ratón (d), cuyo extremo 3’ se encuentra, a su vez, unido de forma operable al
extremo 5’ del fragmento de ADN de 760 pares de bases que codifica el prepro β-NGF humano entre los
sitios NaeI y BamHI de pGEM3.
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50
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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