Revista Cubana de PLANTAS MEDICINALES

Revista Cubana
de
PLANTAS MEDICINALES
Volumen 3 Número 2, 1999
Sumario
EDITORIAL / 53
ARTÍCULOS ORIGINALES
Contents
EDITORIAL / 53
ORIGINAL ARTICLES
Disminución del tránsito intestinal en ratones por tintura de
guayaba (Psidium guajava L.) oral / 54
Francisco Morón Rodríguez, María del C. Martínez
Torres y Déborah Morón Pinedo
Oral guava tincture (Psidium guajava L.) produces a
decrease in intestinal transit in mice. / 54
Francisco Morón Rodríguez, María del C. Martínez
Torres y Déborah Morón Pinedo
Ausencia de potencial genotóxico in vitro e in vivo de un
extracto fluido de Piper auritum H.K.B / 57
Angel Vizoso Parra, Arilia García López y Alberto Ramos Ruiz
Lack of in vitro and in vivo genotoxic potential of a fluid
extract from Piper auritum H.K.B / 57
Angel Vizoso Parra, Arilia García López y Alberto Ramos Ruiz
Evaluación farmacológica de Pluchea carolinensis Jacq.
(salvia de playa) en animales de experimentación / 65
Vivian del Pilar Rosales Clares, Milagros de la Caridad Gross Fernández, Reinaldo Alberto Rosales
Clares, Reyna de la Caridad García Díaz, Jorge Enrique León Sarabia y Mirtha Vidal
Pharmacologic evaluation of Pluchea carolinensis Jacq.
(salvia de playa) in experimental animals / 65
Vivian del Pilar Rosales Clares, Milagros de la Caridad Gross Fernández, Reinaldo Alberto Rosales
Clares, Reyna de la Caridad García Díaz, Jorge Enrique León Sarabia y Mirtha Vidal
Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng (orégano francés).
Estudio toxicogenético de un extracto fluido y del aceite
esencial / 68
Angel Vizoso Parra, Alberto Ramos Ruiz, Aymee Edreira
Armenteros, José Betancourt Badell y Mercedes Décalo
Michelena
Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng (orégano francés).
Toxicogenetic study of a fluid extract and of essential oil / 68
Efecto del Nerium oleander L. en modelo de corazón
aislado de cobayo / 74
Alfredo Céspedes Valcárcel, Aida Corral Salvadó,
Clara Díaz Olivera y Yanet Morales Fundora
Effect of Nerium oleander L. in a guinea pig isolated heart. / 74
Alfredo Céspedes Valcárcel, Aida Corral Salvadó,
Clara Díaz Olivera y Yanet Morales Fundora
Farmacognosia de la droga "flores de majagua" (Hibiscus
elatus Sw., familia Malvaceae). III. Estandarización de la
droga cruda. Alteraciones de la droga / 79
Rafael Milanés Santana, Dalyla Alonso Rodríguez y
Gerardo González Aguilar
Pharmacognosy of "flores de majagua" drug (Hibiscus
elatus Sw., Malvaceae family). III. Crude drug
standardization. Drug alterations./ 79
Rafael Milanés Santana, Dalyla Alonso Rodríguez y
Gerardo González Aguilar
Angel Vizoso Parra, Alberto Ramos Ruiz, Aymee Edreira
Armenteros, José Betancourt Badell y Mercedes Décalo
Michelena
51
Farmacognosia de la droga "flores de majagua" (Hibiscus
elatus Sw., familia Malvaceae). IV. Estandarización del
extracto fluido / 82
Rafael Milanés Santana, Dalyla Alonso Rodríguez y
Gerardo González Aguilar
Pharmacognosy of "flore de majagua" drug (Hibiscus
elatus Sw., (Malvaceae family). IV. Fluid extract
standardization / 82
Rafael Milanés Santana, Dalyla Alonso Rodríguez y
Gerardo González Aguilar
Toxicología aguda oral del Eucalyptus saligna Sm. por el
método de las clases / 87
María del Carmen León Padilla, Imilla Casado Alfonso, Jhoanet Jacas Molina, José Luis Cadenas
Freixas y Carmen López Gómez
Oral acute toxicology of Eucalyptus saligna Sm. by class
method / 87
María del Carmen León Padilla, Imilla Casado Alfonso, Jhoanet Jacas Molina, José Luis Cadenas
Freixas y Carmen López Gómez
52
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):53
EDITORIAL
El hombre desde la Edad Antigua utilizó plantas y algunos derivados de ellas para aplicar en las
heridas y para combatir las enfermedades. En China, las efedras se indicaban para tratar el asma, en
Babilonia, el opio para aliviar los dolores, y en Egipto, el aceite de ricino como purgante.
En Cuba, nuestros aborígenes también utilizaron plantas con el mismo fin pero esos conocimientos
se fueron perdiendo a medida que fueron exterminados por los colonizadores. La práctica de curar
con plantas medicinales fue introducida en el país por los españoles, los esclavos africanos y los
inmigrantes chinos durante la época colonial. Más tarde fue seguida por las siguientes generaciones
de cubanos. Con el decursar de los años el consumo de plantas como medicina popular por nuestro
pueblo se mantuvo estable, para luego disminuir a partir del triunfo de la Revolución Socialista
cuando toda la sociedad accedió a la posibilidad de comprar los fármacos que en gran parte producía
nuestra industria médico-farmacéutica.
Al inicio de la década del 90, con la desaparición del campo socialista y la agudización del bloqueo
norteamericano se produjo una gran crisis económica, la población cubana aumentó el consumo de
plantas medicinales a la vez que el Ministerio de Salud Pública incrementó la producción de
fitofármacos e impulsó la investigación de algunas plantas de interés que aún no tenían el aval
científico necesario para ser utilizadas como medicinales y así poder sustituir con los fitofármacos
que surgieran algunas de las formas farmacéuticas imposibles de adquirir.
La investigación científica con plantas incluye los ensayos clínicos con sus distintas fases, última
etapa a recorrer por los futuros productos herbarios, cuyos resultados de eficacia y eficiencia permiten pasar a la fase de generalización. Todo el proceso investigativo de plantas medicinales, tanto
preclínico como clínico es dirigido y controlado por el Ministerio de Salud Pública mediante una
comisión asesora, y sus trabajos, a medida que vayan concluyendo aparecerán en esta publicación
electrónica.
Dr. Mario González-Quevedo
53
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):54-6
Facultad de Ciencias Médicas "Dr. Salvador Allende"
Laboratorio Central de Farmacología
ARTÍCULOS ORIGINALES
DISMINUCIÓN DEL TRÁNSITO INTESTINAL EN RATONES
POR TINTURA DE GUAYABA (PSIDIUM GUAJAVA L.) ORAL
Dr. Francisco Morón Rodríguez, 1 Dra. María del C. Martínez Torres2 y Dra. Déborah Morón Pinedo 3
RESUMEN
Las hojas de guayaba (Psidium guajava L.) son empleadas tradicionalmente en nuestro país y en otros del continente americano para tratar
la diarrea aguda simple. No existe una validación preclínica del efecto antidiarreico de la tintura de hojas de guayaba al 20 % por lo cual
nos propusimos comprobar su actividad farmacológica como parte de los estudios preclínicos. Se empleó el modelo in vivo de tránsito
intestinal en ratones suizos (OF-1), machos de 18 semanas de edad, sin acceso a alimento las 6 h anteriores a comenzar el experimento, y
se formaron los grupos aleatoriamente. Se administró la tintura (200; 400 u 800 mg/kg pc), se emplearon como controles positivos:
papaverina (10; 40 ó 80 mg/kg. i.m.) y atropina (0,5; 1,0 ó 1,5 mg/kg. i.m.). Se encontró que todos los tratamientos disminuyeron
significativamente y de manera dosis dependiente el tránsito intestinal. Este resultado valida el efecto antidiarreico de la tintura de hojas de
guayaba al 20 %.
Descriptores DeCS: TRANSITO GASTROINTESTINAL/efectos de drogas; EXTRACTOS VEGETALES/farmacología; DIARREA/
/quimioterapia; PLANTAS MEDICINALES; RATONES.
ABSTRACT
For many years, guava leaves (Psidium guajava L.) are used in our country and in others ones of American continent, to treat simple acute
diarrhea. There isn’t a preclinical validation of anti-diarrheic effect of guava leaves tincture to 20 %, whereby our decision to confirm its
pharmacological activity, as part of preclinical studies. Authors used the in vivo intestinal transit model in male Suiss mice (OF-1) aged
18 weeks, without foods during 6 hours before to begin the experiment. Groups were randomly created. Tincture was aplied (200; 400 or
800 mg/kg of body weight). Papaverin (10;40 or 80 mg/kg intramusculary), and atropine (0.5; 1.0 or 1.5 mg/kg intramusculary) were used
as positive controls. We found that all treatment meaninfully and in a dose-dependent way, decreased the intestinal transit.
Subject headings: GASTROINTESTINAL TRANSIT/drug effects; PLANT EXTRACTS/pharmacology; DIARRHEA/drug therapy;
PLANTS, MEDICINAL; MICE.
En Cuba, la atención médica tiene una amplia cobertura, poseemos una rica flora como parte de nuestra
biodiversidad, con plantas medicinales o que potencialmente
lo son; y una tradición popular en su empleo para dar solución sobre todo a problemas primarios de salud. Debido a
ello se realizan notables esfuerzos para difundir el conocimiento de las especies útiles y para demostrar científicamente sus efectos beneficiosos.1
El Psidium guajava L. (guayaba) tiene diversos usos
tradicionales pero el más referido en los estudios etnomédicos
es el antidiarreico.2-4
1
2
3
54
Se conoce que en las hojas de esta planta hay un principio activo que es la quercetina que tiene efecto espasmolítico
y antagonista del calcio.4
La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda tratar la diarrea simple en todas las edades empleando
medidas higiénico-dietéticas y sales de rehidratación oral,
así como abstenerse de administrar cualquier otro medicamento por la dudosa o no demostrada eficacia y por el importante número y gravedad de efectos indeseables que pueden
frecuentemente producir una relación riesgo/beneficio desfavorable.
Doctor en Ciencias. Profesor Titular de Farmacología. Facultad de Medicina "Dr. Salvador Allende".
Especialista de I Grado en Farmacología. Profesora. Facultad de Medicina "Dr. Salvador Allende".
Médico General.
Sin embargo, tanto los médicos como los pacientes demandan disponer de algún recurso terapéutico para aliviar los cólicos, así como, reducir los restantes síntomas y el
tiempo de evolución de la enfermedad. Además, para todos
es conocido que hay una elevada tendencia a que los pacientes recurran al empleo de decocciones de alguna de las diversas plantas popularmente reconocidas para esa finalidad.
Es pues interesante plantearse la posibilidad de desarrollar tal tipo de medicamento a partir del uso tradicional de
plantas y a la vez poder recomendar tanto a los facultativos
como a la población los remedios tradicionales que tengan
eficacia y seguridad.
Lo anterior nos motivó a determinar el efecto de la tintura de guayaba en el tránsito intestinal de ratones y compararla con medicamentos conocidos que tienen esta acción.
MÉTODOS
PREPARACIÓN DE LA TINTURA
La tintura de hojas de Psidium guajava L. (guayaba) fue
elaborada según los procedimientos descritos en la norma
ramal del Ministerio de Salud Pública NRSP 3115 en el dispensario farmacéutico de plantas medicinales del Hospital
Docente "Dr. Salvador Allende".
Para hacer la tintura se empleó un menstruo de etanol al
70 % y hojas de guayaba (droga) procedentes de la Empresa
de Medicamentos No. 3 (Ciudad de La Habana) y se aplicó el
método de maceración para la elaboración.
MODELO EXPERIMENTAL
El tránsito intestinal en ratones fue utilizado como modelo in vivo para determinar el efecto de la tintura sobre la
movilidad intestinal.6
Se emplearon ratones de la línea Suiza (OF-1) procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de
Laboratorio (CENPALAB, La Habana), de ambos sexos y con
un peso corporal comprendido entre los 28 y 30 g. Fueron
privados de alimento (RatoninaR CENPALAB) y agua durante las 6 h previas al experimento. Se distribuyeron los animales al azar mediante una tabla de números aleatorios en 3 grupos de 10 ratones para cada dosis en los respectivos tratamientos como se muestra en la tabla 1.
El grupo control negativo estuvo formado por 10 animales tratados con agua destilada con el volumen de la ma-
TABLA 1. Dosis de los medicamentos evaluados
Grupo Medicamento
I
II
III
Tintura
Papaverina
Atropina
Dosis 1
mg/kg pc
Dosis 2
mg/kg i.m.
Dosis 3
mg/kg i.m.
200
10
0,5
400
40
1
800
60
1,5
Nota: Las dosis están expresadas en mg/kg y en el caso de la tintura de
guayaba referidas, a masa de droga contenida en el volumen de extracto administrado.
yor dosis empleada. Los tratamientos por vía oral fueron
mediante sonda orogástrica y transcurridos 60 min, se administró carbón activado al 10 % (0,1 mL/10 g de peso) por
igual vía a cada animal.
Pasados 30 min, se sacrificaron los ratones en una atmósfera de cloroformo y se les extrajo el tubo digestivo desde el cardias hasta la válvula ileocecal.
Se midió la distancia recorrida por el carbón activado
desde el píloro hasta el lugar más distal donde llegó esta
sustancia como marcadora. Se tomó como el 100 % el largo
total del intestino desde el píloro hasta la válvula ileocecal
de cada ratón para calcular porcentualmente el avance del
carbón en cada animal.6
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Una vez establecida la condición de distribución normal de la variable tránsito intestinal, se aplicó un análisis de
varianza modelo de clasificación simple y cuando este fue
significativo se realizó una prueba de comparación múltiple
de medias.7 Se consideró significativo una p menor que 0,05.
Todo el procedimiento se realizó con el programa
MICROSTAT, la determinación de la DE50 y el cálculo de la
actividad relativa se realizó por el método de Litchfield y
Wilcoxon.8
RESULTADOS
Todos los tratamientos (atropina, papaverina y la tintura
de hojas de Psiudium guajava L.) disminuyeron significativamente y de manera dependiente de la dosis, el tránsito intestinal en los ratones (tabla 2).
TABLA 2. Efecto de los diferentes tratamientos sobre el tránsito intestinal en ratones
Tratamiento
Control
Dosis 1
Atropina
Papaverina
Tintura
77,12±15,77
77,12±15,77
59,89±20,92
49,50±10,21
58,70±12,99
47,18±13,01
Dosis 2
44,50±10,21*
24,90±19,60*
32,75±16,46*
Dosis 3
38,90±10,71*
9,98±16,63*
23,56±13,95*
* p < 0,05
55
Las dosis estimadas que fueron capaces de reducir a la
mitad el tránsito intestinal del carbón activado en el 50 % de
los ratones (DE50) para cada uno de los tratamientos resultaron como se muestran en la tabla 3.
TABLA 3. Dosis efectiva media (DE50) de la atropina, papaverina
y tintura de P. guajava L. en el tránsito intestinal en ratones
Tratamiento
Atropina
Papaverina
Tintura de P. guajava L.
DE 50 (mg/kg)
1,91
23,09
430,05
DISCUSIÓN
La disminución del tránsito intestinal en ratones es un
modelo farmacológico preclínico9 que permite sustentar la
hipótesis de que el uso tradicional de las hojas de P. guajava
es de utilidad para tratar la diarrea simple. El efecto mostrado
de igual manera con la administración de papaverina y de
atropina, que tienen una acción espasmolítica o antimotílica
establecida, da fortaleza al resultado encontrado con la tintura.
La presencia de quercetina entre los metabolitos activos
presentes en esta planta y otros resultados en la literatura
internacional donde se han obtenido efectos similares al nuestro4 también contribuyen a respaldar nuestras conclusiones.
Las dosis efectivas medias (DE50) calculadas indican que
la atropina es más potente que la papaverina y ésta más que
la tintura cuando lo analizamos a partir de las dosis administradas. Sin embargo, las dos primeras son productos naturales que actualmente se obtienen como principios activos con
calidad farmacéutica, mientras que la dosis de guayaba está
referida a droga (hojas secas). Por consiguiente, sería ideal
determinar el contenido de quercetina y sobre esta base indicar la posología aplicada, lamentablemente no fue posible
que fuera un objetivo del presente trabajo.
56
En el laboratorio se realizó un estudio similar con un
extracto fluido de Piper auritum (caisimón de anís) y se encontró una DE50 809,54 mg/kg,9 lo cual nos sugiere que la
tintura de guayaba puede tener una actividad relativa superior como medicamento herbario para la acción farmacológica
estudiada.
CONCLUSIONES
1. La tintura de hojas de Psidium guajava L. reduce el tránsito intestinal experimental in vivo.
2. Existe una tendencia dependiente de la dosis a reducir la
motilidad intestinal de forma similar a la papaverina y la
atropina.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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médicas. En: Etnomedicina progresos italolatinoamericanos. Quito: Editorial Abya Yala, 1997;t2:249-64.
2. Roig JT. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. La
Habana: Editorial Científico-Técnica, 1988;t1:215.
3. Seoane Gallo J. El folklore médico de Cuba. La Habana: Editorial
Ciencias Sociales, 1984:153.
4. Gupta MP. 270 Plantas medicinales iberoamericanas. Santa Fe de
Bogotá: Editorial Presencia, 1995:413-20.
5. Cuba. Ministerio de Salud Pública. Normas ramales de medicamentos de origen vegetal. Tinturas y extractos fluidos. La Habana:
Editorial Ciencias Médicas, 1992:1-20.
6. Arbos J, Zegri A, López-Soriano FRJ, Argiles JMA. A simple method
for determining the rate of gastrointestinal transit in the rat. Arch
Int Physiol Biochim Biophys 1993;101:10-5.
7. Kawashima K, Yoshida N, Kodokama T. Pharmacological properties
of the novel antimuscarinic agent (SX-810). Arznei Forsch Drug
Res 1986;36(1):6-36.
8. Pharmacological experiments on isolated preparation. Edimburg:
ES Livingstone, 1970:58-70.
9. García AJ, Martínez MC, Morón F, Pinedo Z. Efecto
antiespasmódico del Piper auritum H.B.K. en el músculo liso intestinal. Rev Cubana Plant Med (en prensa).
Recibido: 5 de febrero de 1999. Aprobado: 17 de marzo de 1999.
Dr. Francisco Morón Rodríguez. Facultad de Ciencias Médicas.
" Dr. Salvador Allende ". Laboratorio Central de Farmacología. Carvajal s/n entre Agua Dulce y Cerro A. Cerro. Ciudad de La Habana, CP 12000, Cuba, E mail: moró[email protected].
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):57-64
Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos CIDEM
AUSENCIA DE POTENCIAL GENOTÓXICO IN VITRO E IN VIVO
DE UN EXTRACTO FLUIDO DE PIPER AURITUM H.K.B.
Lic. Angel Vizoso Parra,1 Lic. Arilia García López y Lic. Alberto Ramos Ruiz 3
RESUMEN
Se presentan los resultados obtenidos al evaluar el potencial genotóxico de un extracto fluido con un menstruo etanólico al 70 % de Piper
auritum H K.B. (caisimón de anís) en 3 sistemas de ensayo a corto plazo, 2 in vitro, empleando el ensayo de Ames y el sistema Aspergillus
nidulans D-30 (ensayo de segregación somática) y otro in vivo, utilizando la prueba de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón.
En el ensayo de Ames se evaluaron concentraciones en un rango de 50 a 5 000 µg/placa para las cepas TA-1535, TA-100 y TA-98 y para
la cepa TA-1537 de 500 a 5 000 µg/placa. En el ensayo de segregación somática se probaron concentraciones de 0,06 a 1,80 mg de sólidos
totales/mL. Para la prueba de inducción de micronúcleos se ensayaron un rango de dosis de 283,00 a 1 134,63 mg/kg de peso corporal (pc).
Los resultados obtenidos demuestran que el extracto fluido de Piper auritum H.K.B. fue moderadamente citotóxico en el sistema
Aspergillus nidulans D-30, no comportándose así en el ensayo de Ames, ni en la prueba de micronúcleos. No se observó respuesta
genotóxica en los 3 sistemas empleados.
Descriptores DeCS: PLANTAS MEDICINALES; TEST DE MICRONUCLEOS; ENSAYOS CLINICOS; ASPERGILLUS
NIDULANS; MEDULA OSEA/efectos de drogas; RATONES.
SUMMARY
We present results obtained in evaluation of genotoxic potential of a fluid extract, using ethanolic menstrum to 70 % from Piper auritum
H.K.B. (caisimón de anís) in three short term trial systems, two in vitro, using Ames trial, and D-30 Aspergillus nidulans system (somatic
segregation trial), and other in vitro, using micronuclei induction test in mouse bone marrow. In Ames trial, we evaluated concentrations
in a rank of 50 to 5 000 µg/plate to strains TA-1535, TA-100, and TA-98 as well as to strain TA-1537 of 500 to 5 000 µg/plate. In somatic
segregation trial, concentrations of 0,06 to 1,80 mg of total solids /mL, were analyzed. For micronuclei induction, a doserank of 283,00
to 1 134,63 mg/kg of body weight (B.W.) was assayed. Results obtained showed that fluid extract from Piper auritum H.K.B., was
moderately cytotoxic in D-30 Aspergillus nidulans system, but not in Ames trial, and in micronuclei test. There wasn’t genotoxic response
in all three systems used.
Subject headings: PLANTS, MEDICINAL; MICRONUCLEI TESTS; CLINICAL TRIALS; ASPERGILLUS NIDULANS; BONE
MARROW/drug effects; MICE.
Con el auge que en la actualidad tiene la Fitoterapia, la
Genética Toxicológica se ha puesto a su servicio, y se ha
comprobado que los medicamentos de origen vegetal con
una o más acciones terapéuticas pueden presentar sustancias
con actividad mutagénica relacionadas con procesos
carcinogénicos, alteraciones en la descendencia y desarrollo
1
2
3
de malformaciones congénitas.1-4 Dentro de nuestro proyecto de investigación se procedió a evaluar la posible actividad genotóxica de un extracto fluido con un menstruo
etanólico 70 % de Piper auritum H.K.B. planta perteneciente
a la familia Piperaceae originaria de México muy difundida en Cuba donde se le conoce como anisillo o caisimón
Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Auxiliar. CIDEM.
Licenciada en Microbiología. CIDEM.
Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar. CIDEM.
57
de anís. Además existe en otros países de América Central
y Colombia. 5
Sus hojas se emplean como emoliente y para aliviar el
dolor de cabeza. Se le ha empleado en el tratamiento de anginas, erisipela, fiebre, gota y reumatismo y se le ha atribuido
propiedades diaforéticas y estimulantes.5 Además se ha utilizado como abortivo.6
El caisimón de anís es una planta rica en alcaloides.7 En
sus hojas pueden encontrarse sesquiterpenos y monoterpenos
como borneol, canfor, cineol, otros como eugenol, safrol y
una amplia variedad de componentes bencénicos. 8-10
En sus raíces se ha detectado isoquinolonas y en sus
frutos, aminas, azúcares reductores, taninos y esteroidestriterpenos.11,12
Se ha comprobado farmacológicamente la actividad
antibacteriana de diferentes extractos de la planta, tanto de
sus hojas como de su tallo. Igualmente se demostró actividad
antifúngica frente a Candida albicans y Cladosporium sp
de extractos crudos de caisimón de anís.13,14 También diversos extractos de tallos y hojas de la planta demostraron acciones hipotensoras del músculo uterino y vasodilatador.15
Los ensayos genotóxicos se iniciaron con 2 ensayos in
vitro: la prueba de Ames que detecta de una forma rápida y
sencilla mutaciones puntuales.16,17 Y la prueba con el hongo
diploide Aspergillus nidulans D-30, la cual pone de manifiesto daño primario en el ADN. Este ensayo permite distinguir especialmente aquellos sectores segregantes que ocurren por recombinación mitótica, no disyunción cromosómica
(aneuploidia) y ciertos tipos de aberraciones cromosómicas
estructurales.18
Posteriormente se evaluó el extracto fluido del caisimón
de anís mediante un ensayo in vivo, seleccionándose la prueba de micronúcleos en médula ósea de ratón, que detecta
daño cromosómico en eritoblastos expuesto a agentes
aneugénicos y clastogénicos.19
El presente trabajo tiene como objetivo determinar la
posible acción citotóxica y genotóxica de un extracto fluido
de Piper auritum H.K.B. empleando los 3 sistemas de ensayos a corto plazo propuestos.
MÉTODOS
MATERIAL VEGETAL
La planta se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig", Güira de Melena,
Habana. A partir de sus hojas se preparó un extracto fluido
con un menstruo etanólico al 70 %, según la Norma Ramal Vigente.20 La muestra estudiada correspondía al lote
3/97, el cual contenía: etanol, 61,30 % v/v; sólidos totales, 10,94 %; índice de refracción, 1,382; pH, 6,3; aceite
esencial, 1,06 %. Un ejemplar de la planta se encuentra
depositado en el herbario de dicha estación con el número Roig 4622.
58
ENSAYO DE AMES
Se empleó el protocolo clásico de incorporación en placa descrito por Maron y Ames.16 Las cepas de Salmonella
typhimurium TA-1535, TA-1537, TA-98 fueron enviadas por
el Dr. Bruce N. Amos (Universidad de California, Berkeley) y
conservada a (-80 °C). El etanol del extracto se eliminó bajo
presión reducida y el sólido residual se disolvió en
dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de
50 mg/mL.
Se probaron 5 concentraciones de 50 a 5 000 µg de sólidos/placa para las cepas TA-1535, TA-98 y TA-100; para la
cepa TA-1537 se ensayaron concentraciones de 500 a
5000 mcg de sólidos/placa, realizándose un experimento
con 3 placas por concentración.21
La fracción microsomal de hígado de rata (S9), se preparó a partir de ratas Wistar de 200 g de peso tratadas con
fenobarbital y 5-6 benzoflavona.22 La metodología para obtener la fracción es descrita por Maron y Ames.
En el momento del ensayo se preparó la mezcla S9, que
contenía KCL, 33 mM; MgCl2, 8 mM; NADP, 4 mM; glucosa-6-fosfato, 5mM; un 4 % de fracción S9 y buffer fosfato de
sodio 100 mM pH, 7,1. La mezcla se mantuvo en baño de
hielo hasta su empleo. Como control negativo se empleó
DMSO, como los controles positivos lo recomendado por
Maron y Ames para cada cepa.
Las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h y al cabo
de ese tiempo se contaron manualmente el número de colonias revertantes por placa.
Para el análisis estadístico se siguieron las recomendaciones de Mahon.23 Para cada tratamiento se calculó el promedio y la desviación estándar de las lecturas. Se transformaron los datos (revertantes por placa) empleando la fórmula √x, y se procedió aplicar el método de Dunnett.
ENSAYO DE SEGREGACIÓN SOMÁTICA
Se empleó la cepa diploide de Aspergillus nidulans
D-30, 24 sintetizada vía ciclo parasexual empleando los
haploides FGSC A 593 (a) y FGSC A 594 (a) provenientes del
Fungal Genetics Stocks Center, Atlanta. Esta cepa es
heterocigótica para 4 marcadores recesivos del color de los
conidios. Las mutaciones presentes en la cepa son las siguientes (entre paréntesis el grupo de ligamiento del haploide
correspondiente): y A2 (la)= amarillo: w2A(IIb) = blanco;
fwA2 (VIIIa) = amarillo-carmelita; cha(VIIIb) = verde chartré.
La segregación espontánea o inducida de esos marcadores
recesivos en estado homocigóticos en forma de sectores, bandas o puntos coloreados producto de una recombinación
mitótica y la no-disyunción cromosómica, se hace fácilmente distinguible por simple inspección ocular sobre un fondo
de conidiación correspondiente a la cepa salvaje (verde-amarillo). El medio de cultivo empleado fue el medio completo
(MC).25
Los ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad se ejecutaron por el método de incorporación en placa, el cual permite una exposición crónica del compuesto con el micelio en
crecimiento.26
El extracto fluido de la planta se añadió al medio completo licuado a 45 °C. Se sembraron conidios del Aspergillus
nidulans D-30 en punto al centro de la placa a razón de una
colonia por placa y se incubó a 37 °C durante 72 h.27 Al cabo
de ese tiempo se procedió a medir el diámetro de las colonias. Como criterio de citotoxicidad (% IT), se consideró la
reducción del diámetro de las colonias en porciento, comparado con el control negativo (solvente).26 Para el ensayo de
genotoxicidad se sembraron 15 placas con conidios al centro de la placa con MC y se incubaron a 30 °C durante 6-10 d,
evaluándose el efecto genotóxico en términos de la Frecuencia de Sectores Segregantes de color de los conidios por colonias (FSC), observada para cada concentración ensayada y
el Índice de Segregación Mitótica Inducida (ISMI), el cual
representa el incremento de la FSC de los tratamientos con
respecto al control negativo.26,28 El experimento se repitió
3 veces.
Se ensayaron concentraciones hasta 1,80 mg de sólidos
totales/mL, porque a partir de ese valor se producen cambios
morfológicos en la conidiación y color de los conidios que
pueden impedir la visualización y conteo de los sectores
segregantes.
El control negativo fue el etanol al 61,30 % (v/v) a una
concentración final presente en la máxima concentración
ensayada (0,84 %). El control positivo utilizado fue
metilmetanosulfonato (MMS) 2,4 mM.
Para el análisis estadístico los datos primarios (FSC) se
normalizaron mediante la fórmula √(x +0,5), posteriormente
se aplicó un Anova de clasificación simple. Para la comparación del control negativo y espontáneo, se empleó el
estadígrafo Student. Los datos fueron procesados utilizando
el paquete estadístico MICROSTAT.
ENSAYO DE INDUCCIÓN DE MICRONÚCLEOS
Se emplearon ratones albinos de la línea no isogénica
Suizo procedentes del Laboratorio de Control Biológico del
CIDEM, con un peso promedio de 26,30 ± 3,0 g. Previo al
experimento, los animales se sometieron a un período de
adaptación de una semana en el bioterio de la Facultad de
Medicina "Dr. Salvador Allende" del ISCM-H.
La alimentación consistió en ratonina peletizada y agua
sin restricción.
Se preparó un esquema de trabajo de 5 grupos experimentales de 10 animales: 5 machos y 5 hembras, un control
negativo (etanol al 61,30 %), un control positivo
(ciclofosfamida, 20 mg/kg pc en dosis única, 24 h antes del
sacrificio), un control espontáneo (animales no tratados)
y 3 dosis.
Los animales se escogieron al azar separándose en jaulas independientes. La administración del extracto fluido del
caisimón de anís fue por vía oral a razón de 10 mL/kg de pc.
Las dosis se seleccionaron sobre la base de la DL 50 del producto, correspondiendo un valor 1 801 mg/kg pc (Tillán, J,
Laboratorio de Control Biológico del CIDEM) y como máximo una dosis equivalente al 80-50 % de la DL50.29 El resto de
las dosis correspodieron al 50 % y 25 % de la dosis máxima.
El esquema de tratamiento consistió en 2 administraciones separadas por un intervalo de 24 h y sacrificio por dislocación cervical 24 h después de la última aplicación y se
procedió a la extracción seguidamente de ambos fémures.30,31
Las muestras de médula ósea se recogieron en suero bovino libre de calostro (LABIOFARM) previamente inactivado
a 56 °C por 2 h, se fijaron con etanol al 95 % durante 5 min y
se secaron al aire por 24 h. Finalmente se tiñeron con Giemsa
(CLIND-D, Empresa de Producción de Biológicos C.J. Finlay)
al 5 % v/v en agua corriente durante 20 min.32
Se contaron al menos 2 000 eritrocitos prolicromáticos
(PCE) por animal (unidad experimental) y además los
eritrocitos normocromáticos (NCE) presentes por cada
250 PCE y la incidencia de micronúcleos se registró en
2 000 PCE/animal.32
Para el análisis estadístico se normalizaron los valores
de la relación PCE/NCE y el % mPCE (eritrocitos policromáticos micronucleados) mediante la fórmula √(x+1).
Los datos transformados se procesaron mediante un
Anova de clasificación doble, empleando un paquete estadístico MICROSTAT. Las comparaciones individuales entre
los controles y tratamientos se realizaron empleando el
estadígrafo de Students, y la prueba de Dunett. La existencia
de una posible relación dosis-efecto se verificó empleando
la prueba de Cochran-Armitage.33,34
RESULTADOS
ENSAYO DE AMES
En la tabla 1 se muestran los resultados del ensayo de
Ames frente al extracto seco de Piper auritum H.K.B. Como
puede observarse no existe un efecto citotóxico al no presentarse una disminución en el número de colonias revertantes
en dependencia de las concentraciones estudiadas, y la visualización del césped característico de las cepas de
Salmonella typhimurium. Tampoco se observó efecto
genotóxico, al no presentarse un incremento significativo
dosis dependiente en el número de colonias revertantes por
placa para ninguna de las cepas de Salmonella ensayadas, ni
concentración que duplique la frecuencia de reversión del
control negativo (DMSO), para concentraciones límites
de 5 000 µg/placa, valor máximo de exposición en este ensayo aceptado por las regulaciones internacionales cuando hay
toxicidad o que la sustancia ensayada sea insoluble.
59
TABLA 1. Resultados del ensayo de Ames frente al crudo de Piper auritum H.K.B.
Concentración
µg/placa
oa
50
150
500
1500
5000
Control positivo2
(-S9)
Colonias revertantes/placa ± DS
TA-100
(+S9)
(-S9)
TA-98
29 ± 4,72
31 ± 5,03
36 ± 3,54
31 ± 0,00
20 ± 1,00
21 ± 5,50
949± 326,24
Concentración
µg/placa
0a
50
150
500
1500
5000
Control positivob
Concentración
µg/placa
0a
500
100
1500
2500
5000
Control positivob
33 ± 2,52
36 ± 2,00
41 ± 4,58
34 ± 4,58
30 ± 4,04
30 ± 4,73
3 253± 605,75
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
36 ±
147 ± 3,00
150 ± 7,23
125 ± 5,09
133 ± 6,02
137 ± 6,08
121 ± 5,68
2 346 ± 33,0
4,50
1,41
2,38
4,96
5,45
5,80
9,88
(-S9)
34
33
28
29
32
31
292
Colonias revertantes placa ± DS
TA-1537
(-S9)
5
7
7
7
7
± 3,37
± 2,65
± 6,65
± 16,50
± 12,50
± 22,47
± 276,74
Colonias revertantes/pla ca ± DS
TA-1535
(-S9)
28
30
33
27
31
22
319
145
116
119
98
131
142
747
(+S9)
2,00
1,16
3,60
2,00
2,00
0,58
8,14
± 1,29
± 2,38
± 1,73
± 3,87
± 5,25
± 6,48
±67,71
(-S9)
11
11
10
12
13
9
51
± 2,08
± 3,60
± 3,22
± 1,73
± 1,73
± 4,04
±15,04
a Control negativo: Dimetilsulfóxido (DMS)
b
Control positivo:
TA-1535 (S9) óxido de sodio,1,5 µg/placa;(+59) ciclofosfamida, 500 µg/placa.
TA-1537 (-S9) ICR-170, 100 µg/placa; (+S9) 2-aminofluoreno, 10 µg/placa.
TA-98 (-S9) ácido picrolónico, 100 µg/placa: (+S9) 2-aminofluoreno, 10 µg/placa.
TA-100 (-S9) óxido de sodio, 1,5 µg/placa; (+S9), 2-aminofluoreno, 10 µg/placa.
El valor crítico de Ia0,01 = 3,42 (Dunett de una cola).
ENSAYO DE SEGREGACIÓN SOMÁTICA
En la tabla 2 se puede apreciar que el extracto fluido de
la planta estudiada resultó moderadamente citotóxico para
el hongo Aspergillus nidulans D-30, alcanzándose un 26,19 % de
inhibición del crecimiento lineal (IT) de las colonias a las 72 h
cuando se trabaja a concentraciones de 1,82 mg/mL de sóli60
dos totales. Sin embargo, no se observaron incrementos significativos en la FSC respecto al control negativo (p=0,979).
Tampoco se observó una duplicación del ISMI en relación al
mismo control. El análisis de regresión lineal no muestra ninguna relación dosis-efecto entre las concentraciones y la FSC
(p=0,438). Tampoco se observó diferencias significativas entre
el control negativo y el espontáneo (p=0,147).
TABLA 2. Resultados de la segregación somática en el hongo Aspergillus nidulans D-30 frente al extracto fluido de Piper auritum H.K.B.
Concentración
mg/mL
Colonias
Toxicidad a
(IT %)
Etanol 0,84 % b
No tratadas
0,06
0,11
0,30
0,50
0,80
1,11
1,80
MMS 2.4 Mmc
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
-2,38
2,38
4,76
4,76
7,14
11,90
14,90
26,19
38,09
Colonias
Sectores
segregantes
45
44
45
45
44
45
45
43
45
45
79
76
75
77
73
70
75
71
82
346
Reducción del diámetro de las colonias a las 72 horas de incubación respecto al control negativo;
control positivo (o metilmetanosulfonato); ** p<0,01.
Regresión lineal: Y=FSC (0,0350) + 1,6783 f=0,3212
p=0,438 **p<0,01
a
b
c
ENSAYO DE MICRONÚCLEOS
En las tablas 3 y 4 se demuestran los resultados obtenidos en el ensayo de inducción de micronúcleos para el extracto fluido de Piper auritum H.K.B. Como puede observarse no existe ninguna alteración en el índice de citotoxicidad
medular dado por la relación PCE/NCE en cuanto a sexo
(p=0,493) y dosis (p=0,459).
Genotoxicidad
FSC + DS
ISMI
1,75± 1,01
1,72± 1,06
1,66± 1,33
1,71± 1,23
1,65± 1,18
1,60± 1,33
1,69± 1,33
1,65± 1,38
1,82± 1,09
7,70± 3,41
1,00
0,98
0,95
0,98
0,94
0,91
0,97
0,94
1,04
4,40**
control negativo;
Para el indicador de efecto genotóxico (% mPCE), no se
obtuvieron resultados significativos ni para el sexo (p=0,694)
ni para las dosis (p=0,233). La prueba de Cochran-Armitage,
no mostró una relación dosis-dependiente lineal en el rango
de dosis ensayadas (p=0,257 machos; p=0,417 hembras).
Tampoco se encontraron diferencias significativas entre el
control negativo y los animales no tratados, en relación con
los valores de la relación PCE/NCE y el %mPCE (p=0,186;
p=0,407, respectivamente).
TABLA 3. Resultados del ensayo de inducción de micronúcleos en ratones machos tratados con un extracto fluido de Piper auritum H.K.B.
Animales
PCE/NCE±D.Sa
(IT)
PCE analizado
mPCE
Controles
Etanol 61,3 %c
No tratados
Ciclofosfamidad
5
5
5
1,39 + 0,06
1,35 ± 0,07
0,67 + 0,08**
10000
10000
10000
18
19
195
0,18 +0,06
0,19 ±0,10
1,97 + 0,23**
20 mg/kg/pc
Dosis mg/kg/pc
Piper auritum
H.K.B.
283,00
567,20
1134,63
5
5
5
1,31 + 0,05
1,41 ± 0,09
1,41 + 0,04
10000
10000
10000
14
21
20
0,16+0,08
0,21±0,05
0,20+0,08
PCA=0,257e
Tratamiento
a
IT (PCE/NCE) índice de citotoxicidad:
la regresión Cochran-Armitage.
* p<0,05; **p<0,01.
b
% de eritrocitos policromáticos micronucleados;
c
control negativo;
d
% m PCE»D.Sb
control positivo;
e
valor de P para
61
TABLA 4. Resultados del ensayo de inducción de micronúcleos en ratones hembras tratados con un extracto fluido de Piper auritum H.K.B.
Tratamiento
(IT)
Controles
Etanol 61,3 %c
No tratados
Ciclofosfamidad
20 mg/kg/pc
Dosis mg/kg/pc
Piper auritum
H.K.B.
283,00
567,20
1134,63
PCA=0,415e
Animales
PCE/NCE + D.S.a
mPCE
% m PCE + D.Sb
5
5
5
1,36± 0,09
1,38+0,02
0,67± 0,08**
10000
10000
10000
20
18
220
0,20 ±0,06
0,18+0,05
2,22 ±0,63**
5
5
5
1,41± 0,09
1,43+0,07
1,38± 0,02
10000
10000
10000
16
19
20
0,16 ±0,04
0,19+0,06
0,20 ±0,04
a
IT (PCE/NCE) índice de citotoxicidad:
la regresión Cochran-Armitage.
* P<0,05, **p<0,01
b
% de eritrocitos policromáticos micronucleados:
DISCUSIÓN
µ En el ensayo in vitro empleando la batería de cepas
de Salmonella typhimurium no se detectó ningún efecto
citotóxico ni genotóxico en nuestras condiciones de ensayos. No obstante se debe señalar que entre los componentes
químicos reportados en la literatura para el caisimón de anís,
se encuentra el safrol, sustancia débilmente hepatocarcinógena en ratas y ratones y reportada negativa en el
ensayo de Ames, pero positiva en varios sistemas genotóxicos
utilizando células de mamíferos, tales como aberraciones
cromosómicas e intercambio de cromátidas hermanas en líneas de Hamster chino.35 Los estudios realizados por estos
autores se llevaron a cabo empleando el safrol en estado puro
y por tanto los resultados obtenidos son muy evidentes. Sin
embargo, Wisclocki 3 6 y Swanson37 reportan q u e l o s
metabolitos del safrol, el 1-hidroxilsafrol y el 1-acetoxisafrol
producto de la acción enzimática del hígado de rata (fase I de
biotransformación) induce una respuesta positiva en el ensayo de Ames. Los resultados de este trabajo no concuerdan
con los reportados por dichos autores aún trabajando a concentraciones de 5 µg/placa del crudo del caisimón de anís
para esta prueba en células procarióticas.
Cuando se emplea la cepa diploide Aspergillus nidulans
D-30 se puede observar una citoxicidad moderada a concentraciones de 1,80 mg/mL de sólidos totales atribuida a los
componentes del extracto fluido de la planta y no al etanol,
pues éste se encuentra a una concentración final de 0,84 %
(v/v), valor permisible para este ensayo. A dosis mayores se
produjo un incremento escaso del micelio con un aclaramiento en la conidiación. Esta citoxicidad no parece estar
asociada con efectos adversos al material hereditario del organismo eucariótico empleado, sino a otros blancos celula62
PCE analizado
c
control negativo:
d
control positivo;
e
valor de P para
res de importancia y relacionado con el complejo proceso de
diferenciación celular que conducen al crecimiento y desarrollo micelial, pues no se observaron modificaciones en la
FSC. Esto ha sido bien fundamentado en el caso de otros
compuestos con actividad antifúngica (cicloheximida,
nistatín, carboxín, etc.), que influyen en el crecimiento y no
afectan el material hereditario.38
Se reportan 2 resultados empleando el mismo modelo
biológico, donde se evaluó un extracto acuoso de caisimón
de anís hasta una concentración de 400 mg/mL de sólidos
totales con resulados negativos (De la Torre, et al. 1993. Informe de resultados de investigación. Laboratorio Central
de Farmacología. ISM-CH. "Dr. Salvador Allende") y un extracto fluido de la planta con un contenido etanólico de un
45 % con resultados positivos hasta una concentración de
1,94 mg/mL de sólidos totales (Blanco, N. 1996. Evaluación
tóxica y genotóxica de los extractos fluidos de Ocimun
gratissimun L. y Piper auritum H.K.B. Trabajo de Terminación de Residencia. ISM-CH. "Dr. Salvador Allende").
Se sustentan los resultados obtenidos, partiendo del criterio de que en el extracto fluido de caisimón de anís analizado no están presentes la sustancia o sustancias inductoras de
efectos mutagénicos o que las mismas se encuentran en concentraciones tales que no puedan provocar un daño puntual,
un corrimiento del marco lectura de los nucleótidos del ADN
o un daño primario de dicha molécula en los modelos in
vitro empleados.
La ausencia de mutagenicidad in vitro pudiera deberse a
las características fisicoquímicas de los fitofármacos, así como
a la variedad, condiciones de cultivo, clima y factores
agronómicos asociados al crecimiento de la planta, los cuales pueden influir considerablemente en los procesos
biosintéticos de sus metabolitos y que una o varias sustancias determinadas pueden estar presentes o no al variar esos
parámetros.39 Pero además, estos preparados constituyen
mezclas complejas en las que se pueden encontrar compuestos con actividad antimutagénica, como la clorofila, eugenol,
monoterpenos, etc. los cuales pueden debilitar o inhibir el
efecto genotóxico potencial.40
Tampoco en el ensayo in vivo de inducción de
micronúcleos se observó una respuesta positiva. Al respecto, se sabe que el mamífero posee los sistemas detoxificadores
enzimáticos (fase II) presentes en el tracto gastrointestinal,
hígado y pulmones, responsables de la inactivación de sustancias genotóxicas en muchos casos.41
CONCLUSIONES
En las condiciones de ensayos descritas, el extracto fluido con un menstruo etanólico al 70 % de Piper auritum H.K.B.
no presentó actividad genotóxica ya que:
• No se observó un incremento significativo concentracióndependiente en el conteo de colonias revertantes por placa en el ensayo de Ames.
• El extracto fluido resultó moderadamente citotóxico frente
al hongo Aspergillus nidulans D-30 en el ensayo de segregación somática. No indujo un incremento significativo en la frecuencia de sectores por colonias en las concentraciones estudiadas, ni una relación dosis-efecto.
• No se comprobó en el ensayo in vivo de micronúcleos un
aumento significativo en la relación PCE/NCE, ni un efecto dosis-dependiente en la frecuencia de PCE
micronucleados.
• Se debe cuantificar el contenido de safrol en el extracto
fluido y evaluar el mismo en otros sistemas de ensayos in
vitro e in vivo.
• Valorar su empleo terapéutico, si se tiene presente la posibilidad de que el extracto pueda contener un compuesto
reportado moderadamente hepatocarcinógeno (safrol).
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64
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human carcinogen and mutagen. Mutat Res 1983;140:71-4.
Recibido: 10 de diciembre de 1998. Aprobado: 3 de marzo de 1999.
Lic. Angel Vizoso Parra. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Cerro y Boyeros, Plaza.
Ciudad de La Habana. CP 10600. Teléfono (537)810818, 810830 Fax
(537)33556. E-mail:cjdem@infomed, sld.cu.
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):65-7
Instituto Superior de Ciencias Médicas de Santiago de Cuba
EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA DE PLUCHEA CAROLINENSIS JACQ.
(SALVIA DE PLAYA) EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Dra. Vivian del Pilar Rosales Clares,1 Dra. Milagros de la Caridad Gross Fernández,2 Lic. Reinaldo
Alberto Rosales Clares,3 Lic. Reyna de la Caridad García Díaz, 4 Dr. Jorge Enrique León Sarabia,5
y Mirtha Vidal6
RESUMEN
Se evaluó la propiedad antiinflamatoria de la tintura de la Pluchea carolinensis Jacq. (salvia de playa) al 30 % en procesos agudos y
crónicos, luego de su administración por vía oral a ratas Wistar de uno y otro sexo. Se utilizaron modelos experimentales, como el edema
subplantar por carragenina para procesos agudos y granuloma inducido por algodón para procesos crónicos, incluidos en las recomendaciones. En ambos modelos los resultados se compararon con la indometacina, antiinflamatorio reconocido, así como el control negativo,
que fue con agua. Se calculó el porcentaje de inhibición para el producto en estudio en procesos agudos. Se comprobó por simple
inspección y confirmación estadística posterior, la existencia de propiedades antiinflamatorias de la tintura de salvia en el proceso agudo
con diferentes dosis empleadas; los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó 80 mg/kg. Igualmente se mostró la actividad
antiinflamatoria en la fase crónica, en el modelo de granuloma inducido por algodón con todas las dosis, siendo la más efectiva la de
80 mg/kg.
Descriptores DeCS: PLANTAS MEDICINALES; EVALUACION DE MEDICAMENTOS; AGENTES ANTIINFLAMATORIOS;
RATAS DE CEPAS CONSANGUINEAS .
SUMMARY
We made an evaluation of anti-inflammatory property of Pluchea carolinensis Jacq. (salvia de playa) to 30 % in acute and chronic
processes, after its per os administration to Wistar rats both sexes. Experimental models were used. e.g. carragenin subplantar edema to
acute processes, and cotton-induced granuloma to chronic processes, included in recomendations. In both models, results obtained were
compared to those of indomethacin, a well-known anti-inflammatory agent, as well as the negative control, using water. Induction
percentage was estimated to study product in acute processes. By simple visualization and posterior statistical confirmation, antiinflammatory
properties of salvia tincture were proved using different doses; the best results were obtained with a dose of 80 mg/kg. In cotton-induced
granuloma model, we observed an anti-inflammatory activity in chronic phase (all doses), where 80 mg/kg was the most effective one.
Subject headings: PLANTS, MEDICINAL; DRUG EVALUATION; ANTIINFLAMMATORY AGENTS; RATS, INBRED STRAINS.
En los últimos años las plantas medicinales han tomado
un notable auge, lo que ha representado un resurgimiento en
la medicina natural y tradicional, esto se debe en gran parte a
1
2
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4
5
6
la necesidad de buscar nuevos medicamentos que posean el
efecto terapeútico deseado fundamentalmente para dar soluciones a problemas de salud. Por lo que nos dimos a la tarea
Especialista de I Grado en Farmacología. Instructor.
Especialista de I Grado en Farmacología. Máster en Medicina Natural y Tradicional. Instructor.
Licenciado en Bioquímica. Aspirante a Investigador.
Especialista en Estadística y Computación. Instructor.
Especialista de I Grado en Coloproctología.
Asistente del Trabajo Docente.
65
de probar el posible efecto antiinflamatorio de Pluchea
carolinensis Jacq., conocida vulgarmente como salvia de
playa, la cual florece con gran intensidad entre los meses de
enero y agosto1 y ha sido empleada en la medicina popular
para el tratamiento de neumopatías, ronqueras y digestiones
lentas.2
MÉTODOS
Para evaluar la actividad antiinflamatoria de la salvia de
playa en procesos agudos y crónicos utilizamos 2 modelos
experimentales, para lo cual se emplearon animales de experimentación (ratas Wistar) de ambos sexos, cuyo peso fue
entre 125 ± 50 g y 180 ± 20 g respectivamente, todos procreados en la LABEX de Santiago de Cuba. Todos los roedores fueron mantenidos en una habitación con temperatura,
iluminación, humedad y alimentación según normas.
La planta se recolectó en el Jardín Botánico de Santiago
de Cuba y fue identificada por especialistas de dicho centro.
El producto empleado fue la tintura de salvia de playa al
30 %, la cual se obtuvo por el método de percolación según
NRSP 311,3 utilizando como menstruo alcohol al 75 %, luego
se realizó tamizaje fitoquímico y control de la calidad según
NRSP 312.4
Como medicamento de comparación se utilizó
indometacina, antiinflamatorio reconocido.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIINFLAMATORIA EN PROCESOS AGUDOS
Para evaluar la misma utilizamos el Edema subplantar
por carragenina, una de las técnicas más empleadas para la
búsqueda de nuevos antiinflamatorios no esteroides. Este
método consistió en medir la pata trasera derecha de la rata
con un pletismógrafo, después se le administró el preparado
por vía oral según grupos. Una hora más tarde se indujo el
edema inflamatorio mediante la inyección subplantar de
0,1 mL de carragenina (solución acuosa al 10 %). Este compuesto provocó el edema inflamatorio cuya medición se realizó a la hora de administrada la carragenina y a las 4 h cuando el edema había alcanzado su máximo desarrollo. La actividad antiinflamatoria se expresó en porcentaje de inhibición del edema; considerándose efectiva la reducción de éste
en más del 30 %.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIINFLAMATORIA EN PROCESOS
CRÓNICOS
Este método consistió en administrar una hora antes los
diferentes compuestos según series. Una hora más tarde se
anestesiaron los animales con dietiléter por vía inhalatoria;
66
luego se rasuró el lomo de éstas, previas medidas de asepsia
y antisepsia; se practicaron 2 incisiones en esta región con
una separación de 1 cm entre ambas, para introducir 2 pellets
de algodón de 10 mg de peso de cada uno previo decolamiento
de la piel, los que quedaron situados a 2 cm de la herida.
Posteriormente se suturaron las incisiones realizadas. Transcurridos 10 d los animales se sacrificaron y se procedió a la
exéresis de los granulomas, los que se pesaron en el momento de la extracción y posteriormente se llevó a peso constante en un horno a 80 °C de temperatura durante 2 h, donde se
determinó el contenido fibroacuoso (CFA) y el contenido
fibrogranuloso (CFG). Ambas variables se expresaron en
miligramos (mg).
RESULTADOS
Teniendo en cuenta los resultados de la acción
antiinflamatoria de Pluchea carolinensis Jacq. (salvia de playa) en procesos agudos (tabla 1); observamos que a medida
que aumentaban las dosificaciones del fitofármaco disminuía el edema, de manera que con 20 mg/kg de la tintura de
la planta el promedio de disminución fue 7,5 ± 1,64 mmHg;
con 40mg/kg, de 3,8 ±1,6 mmHg y decreció a 3,3 ± 0,52 mmHg
con 80 mg/kg; que aunque no alcanzó la magnitud observada con la indometacina (2,2 ± 0,4 mmHg) sí demuestra su
acción antiinflamatoria ya que son inferiores al promedio
alcanzado en el grupo control con diferencias altamente significativas.
En todas las dosis aplicadas se observa esta acción
antiinflamatoria por el porcentaje de inhibición, en este caso
está por encima de 50; sin embargo en la dosis 80 mg/kg el
porcentaje de inhibición fue de 80,4 muy similar a la
indometacina (86,9); por lo que podemos considerar que a
ésta dosis la tintura resulta la más efectiva.
Los resultados obtenidos con la técnica granuloma inducido por algodón (tabla 2) evidenciaron que tanto el CFA
como el CFG eran reducidos en las 3 dosis (20, 40 y 80 mg/kg)
ensayadas con relación al control, por lo que se observaron
diferencias altamente significativas.
TABLA 1. Acción antiinflamatoria de la Pluchea carolinensis Jacq.
(salvia de playa) en procesos agudos
Dosis
No.
X
S
20 mg/kg
40 mg/kg
80 mg/kg
Ind. 10 mg/kg
Control
6
6
6
6
6
7,5
3,8
3,3
2,2
16,8
1,64
1,6
0,52
0,4
1,17
N: Tamaño de muestra.
S: Desviación estándar.
X: Media aritmética.
% de Inhibición
55,3
77,3
80,4
86,9
p< 0,01
En la dosis de 80 mg/kg el peso del CFA fue de
346,7 ± 18,5 mg, similar al obtenido con la indometacina,
que fue de 227,6 ± 16,0 mg; al igual que sucede con el CFG,
que con 80 mg/kg fue de 63,9 ± 11,8 mg y la indometacina
de 66,4 ± 6,25 mg.
TABLA 2. Acción antiinflamatoria de la Pluchea carolinensis Jacq.
(salvia de playa) en proceso crónicos
CFA (miligramos)
X
S
Dosis
20 mg/Kg
40 mg/Kg
80 mg/Kg
Ind. 10 mg/Kg
Control
412,7
409,7
346,7
227,6
507,4
1,38
17,05
18,54
16,0
61,6
FG (miligramos)
X
S
102,4
96,1
83,9
66,4
144,6
1,29
4,55
11,8
6,2
15,4
p < 0,01
CFA: Contenido fibroacuoso (húmedo).
CFG: Contenido fibrogranuloso (seco).
X: Media aritmética.
S: Desviación estándar.
DISCUSIÓN
Para justificar los resultados, debemos decir que antes
de iniciar el estudio se realizaron numerosos estudios
fitoquímicos a diversas muestras con el fin de determinar su
estructura química y someterlos posteriormente al análisis
preclínico, antes de suministrarlo a la especie humana. Estos
estudios fitoquímicos de la salvia de playa abarcaron
glucósidos, triterpenos, aceite esencial, taninos y alcaloides,1,2
pero podemos destacar que este análisis fue positivo para
flavonoides.
Los flavonoides son compuestos químicos obtenidos del
benzopiram6 a los que se le han atribuido muy variados efectos farmacológicos, entre ellos: antiinflamatorio, antimicrobiano, antialérgico, hepatoprotector, antitrombótico,
antineoplásico, antiulceroso, 7 hormonal (estrogénico),8
antidiabético, expectorante, antihemorrágico, diurético y
antiviral, 9 muchos de los cuales se han comprobado in vivo e
in vitro.6-8
Debemos destacar que el comportamiento de los animales en todas las series experimentales no se diferenció en
aquellos considerados controles y de comparación. En segundo lugar se escogieron 2 modelos experimentales, ya que
cualquier sustancia que se pretenda evaluar como
antiinflamatoria, debe tener al menos una técnica que demuestre dicha actividad en fase aguda y otra que la compruebe en fase crónica.
Atribuimos la observación de que la dosis de la planta
tenga un poder antiinflamatorio muy parecido a la
indometacina, a la presencia de flavonoides, a los cuales se
le atribuyen propiedades antiinflamatorias, debido a la inhibición de la fosfolipasa A 2, a la 5-lipoxigenasa, o a la
endoperóxido prostaglandina sintetasa, que influyen en la
inhibición de la síntesis de prostaglandinas, lo que explica
el comportamiento similar entre la dosis de 80 mg/kg y la
indometacina.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 14 de enero de 1999. Aprobado: 17 de marzo de 1999.
Dra. Vivian del Pilar Rosales Clares. Instituto Superior de Ciencias
Médicas de Santiago de Cuba. Calle 21 No. 7. Reparto Cabrera. Contramaestre. Santiago de Cuba. Cuba.
67
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):68-73
Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos
PLECTRANTHUS AMBOINICUS (LOUR.) SPRENG (ORÉGANO FRANCÉS).
ESTUDIO TOXICOGENÉTICO DE UN EXTRACTO FLUIDO
Y DEL ACEITE ESENCIAL
Lic. Angel Vizoso Parra, 1 Lic. Alberto Ramos Ruiz, 2 Aymee Edreira Armenteros,3 Dr. José Betancourt
Badell4 y Dra. Mercedes Décalo Michelena5
RESUMEN
Se emplearon 2 sistemas de ensayo de genotoxicidad, uno in vitro, la prueba de segregación somática en el hongo diploide Aspergillus
nidulans D-30, se evaluó el posible efecto genotóxico de un extracto fluido y el aceite esencial del Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng
(orégano francés) y el ensayo in vivo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón para evaluar la acción clastogénica o
aneugénica del extracto fluido de orégano francés. Las concentraciones ensayadas en el ensayo in vitro para el extracto fluido y del aceite
esencial fueron de 0,323 a 1,292 mg de sólidos totales/mL y de 0,01 a 0,1 % v/v, respectivamente. En el ensayo in vivo para el extracto
fluido, se probaron dosis de 193,50 a 773,20 mg/kg de peso corporal (pc). El extracto fluido de orégano francés y el aceite esencial
presentaron una acción citotóxica y genotóxica significativa dosis-dependiente en el ensayo de segregación somática frente al hongo
Aspergillus nidulans D-30, no evidenciándose este efecto en el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón para el
extracto fluido de Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.
SUMMARY
We used 2 genotoxic trial systems, one in vitro, somatic segregation test in diploid D-30 Aspergillus nidulans, to asses potential effect of
a fluid extract, and the essential oil from Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng (orégano francés), and the in vitro one, micronucleiinduction trial, in mouse bone marrow, to assess clastogenic or aneugenic action of fluid extract of French origan. Concentrations assayed
in the in vitro trial, to fluid extract and from essential oil, were from 0,323 to 1,292 mg of total solids/mL, and from 0,01 to 0,1 % v/v. In
the in vivo trial to fluid extract, we assayed dose from 193,50 to 773,20 mg/kg of body weight (B.W.). Fluid extract of French origan and
essential oil, showed a significant dose-dependent cytotoxic and genotoxic action in somatic segregation trial versus D-30. Aspergillus
nidulans, but without effect in micronuclei-induction trial in mouse bone marrow of fluid extract from Plectranthus amboinicus (Lour.)
Spreng.
Subject headings: PLANTS MEDICINALS; MICRONUCLEI TESTS; ASPERGILLUS NIDULANS; VOLATILE OILS; BONE
MARROW/drug effects; MICE.
En la actualidad se observa un marcado interés en los
estudios farmacológicos, toxicológicos y genotóxicos de las
plantas medicinales para obtener un basamento científico de
su acción terapéutica y del posible efecto toxicológico y
1
2
3
4
5
68
Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Agregado.
Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado.
Licenciada en Bioquímica. Investigadora Aspirante.
Doctor en Medicina. Profesor Asistente.
Doctora en Medicina. Especialista de I Grado en Microbiología.
toxicogenético sin abandonar su empleo tradicional tan
enraizado en nuestra población, que ofrece así grandes posibilidades de emplearlas como fitofármaco o en la búsqueda
de nuevos principios activos. Sin embargo, se debe tener
presente que algunos de los componentes naturales que por
tratarse de mezclas complejas, puedan dañar el material hereditario de las células somáticas o germinales. De ahí la importancia que da nuestro sistema de salud a los estudios
toxicológicos y genotóxicos de los fitofármacos comprendidos en el Plan Nacional de Plantas Medicinales. Dentro de
nuestras investigaciones se procedió a evaluar al potencial
gentotóxico de un extracto fluido y su aceite esencial del
Plectranthus amboinuicus (Lour.) Spreng (orégano francés).
El orégano francés, es ampliamente utilizado como condimento, contra catarros, como expectorante, antiasmático,
contra la cefalea (uso tópico), antimicrobiano y
antiepiléptico.1-4 Los ensayos fitoquímicos de esta planta
detectaron la presencia de flavonoides, taninos, o grupos
aminos, esteroides triterpénicos y aceites esenciales, siendo
el carvacrol el predominante con un 43,1 %.5-6
Para iniciar los ensayos de genotoxicidad se empleó un
ensayo in vitro con el hongo diploide Aspergillus nidulans
D-30 que detecta daño primario en el ADN, y se utilizó el
extracto fluido y su aceite esencial.7 Para la evaluación in
vivo se empleó la prueba de inducción de micronúcleos en
médula ósea de ratón la cual detecta aberraciones
cromosómicas en eritoblastos expuestos al extracto fluido
del Orégano francés.8
El presente trabajo tiene como objetivo determinar la
acción citotóxica y genotóxica del extracto fluido de
Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng (orégano francés) y
su aceite esencial, evaluándose en 2 sistemas de ensayos a
corto plazo: el ensayo de segregación somática con el hongo
Aspergillus nidulans, tanto para el extracto fluido como para
el aceite esencial y el ensayo de inducción de micronúcleos
para el extracto fluido de orégano francés.
MÉTODOS
MATERIAL VEGETAL
Los experimentos se realizaron a partir de un extracto
fluido y del aceite esencial obtenidos en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig" ubicada en el Municipio Güira de Melena de la Provincia de La
Habana. A partir del material vegetal seco (hojas) se probó un
extracto fluido obtenido por los métodos convencionales de
percolación en solución hidroalcohólica.9,10 Las características físico-químicas del extracto fluido del orégano francés
son las siguientes: color, amarillo-verdoso; pH, 6,16; densidad relativa, 0,9047; etanol, 50 % v/v; sólidos totales,
4,43 % y menstruo etanólico 70 %. El extracto provenía del
lote 1/95, correspondiéndole a esta planta un número de herbario Roig 4579.
ENSAYO DE SEGREGACIÓN SOMÁTICA
Se empleó el hongo Aspergillus nidulans D-30, obtenido de las cepas haploides 593 (a) y 593 (b), procedentes de
Fungal Genetics Center (FSGS) de Atlanta, USA.11 Esta cepa
diploide es portadora de 4 mutaciones recesivas para el color
de los conidios en estado heterocigótico, lo cual permite
analizar la inducción de segregación somática (mitótica) por
simple inspección ocular de los sectores en estado
homocigótico que aparecen sobre un fondo de conidiación
verde-amarillo (salvaje) al crecer en medio completo (MC).
Las mutaciones presentes en las cepas son: yA2= amarillo;
wA2= blanco; fwA2= carmelita y chA1= verde chartré.
El procedimiento experimental se realizó por incorporación en placas de MC12,13 del extracto fluido de orégano francés y del aceite esencial, diluido este último en etanol (X10)
e inoculando posteriormente conidios al centro de las placas
de la cepa diploide de Aspergillus nidulans D-30 para evaluar la toxicidad cuantitativa al cabo de las 72 h de incubación
a 37 °C. El índice de citotoxicidad (IT), dado por la reducción del diámetro de las colonias con respecto al control
negativo (solvente) se determinó transcurrido ese tiempo. La
genotoxicidad se evaluó a los 6-10 días de incubación a 30 °C,
contando directamente los sectores homocigóticos
segregantes de color aparecido en las colonias.11 La frecuencia de sectores segregantes por colonias (FSC) evidencia los
eventos genotóxicos que conducen a la segregación somática.
Se ensayaron concentraciones en mg de sólidos totales /mL
de MC de 0,393 hasta 1,292 para el extracto fluido de orégano francés y de 0,01 hasta 0,1 % v/v para el aceite esencial,
porque a partir de esos valores se observan cambios sustanciales en la morfología y coloración de los conidios que pueden prevenir una correcta visualización y conteo de los sectores segregantes.
El control negativo empleado fue etanol al 50 % y 98 %
a la concentración final presente en las máximas dosis del
extracto fluido y del aceite 1 % v/v y 0,1 v/v, respectivamente.
El control positivo utilizado fue hidrato de cloral a una
concentración final de 6 mM.12
Para el análisis estadístico de los datos primarios se normalizaron y se aplicó la transformación √(x + 0,5), a los sectores segregantes presentes en cada colonia analizada, posteriormente se le aplicó un análisis de varianza simple14 y una
prueba de comparación de medidas por medio del estadístico de Dunnett.15
ENSAYO DE MICRONÚCLEOS
Se utilizaron ratones de ambos sexos de la línea no
isogénica albina Suizo procedentes del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM, los animales tenían entre 6-8 semanas de nacidos y con un peso promedio de 28,9 « 2,37 g.
Antes de ser tratados, los animales se sometieron a un
período de adaptación de una semana, bajo condiciones de
temperatura y humedad convencionales. La alimentación
consistió en ratonina peletizada y agua sin restricción.
El esquema de tratamiento consistió en separar los ratones en sus grupos experimentales de 10 animales, 5 hembras
y 5 machos, un control negativo (etanol al 50 %), un control
positivo (ciclofosfamida 0,02 g/kg pc), un control espontáneo (agua destilada estéril) y 3 grupos tratados con diferentes dosis del extracto fluido de orégano francés, selecciona69
das sobre la base de la DL50 del extracto fluido en el ratón, y
correspondió a un valor de 1,104 g/kg pc ( Tillán J. Laboratorio de Control Biológico del CIDEM: com.pers) y como
máximo una dosis correspondiente al 80-50 % de la DL50.16
Las dosis restantes correspondieron al 50 % y 25 % de la
dosis máxima. La administración fue por vía oral a razón de
1,2 % del peso corporal.
Para que el contenido de etanol no provocara muerte en
los animales se estableció un límite que no excediera de
4,74 g/kg pc, y se tuvo presente que la DL50 para el etanol en
las condiciones de ensayo fue de 7,80 g/kg pc.
El protocolo de tratamiento consitió en 2 administraciones separadas por un intervalo de 24 h y sacrificio por dislocación cervical 24 h después del último tratamiento.17
Las muestras de médula ósea se recogieron en suero bovino fetal libre de calostro, se extendieron y fijaron con etanol
al 95 % (v/v) durante 5 min y se secaron al aire por 24 h.
Posteriormente se tiñeron con solución Giemsa al 5 % (v/v)
en agua corriente durante 20 min.18
Se contaron 1 000 eritrocitos policromáticos (PCE) por
animal y además los eritrocitos normocromáticos (NCE) por
cada 250 (PCE). La relación PCE/NCE, indica el índice de
citotoxicidad (IT). Los micronúcleos (MN) se identificaron
según el criterio establecido por The Collaborative Study
Group for the Micronucleus Test.18
Para la evaluación estadística los valores del IT y el
porcentaje de eritrocitos policromáticos micronucleados
(% mPCE) se normalizaron de acuerdo a la fórmula √(X +1).
Los valores transformados se procesaron mediante un Anova
de 2 vías, y se tuvo en cuenta el sexo y los tratamientos.14 Se
empleó el estadístico de Cochran-Armitage con el objetivo
de determinar una posible relación dosis-efecto, teniendo
como criterio genotóxico: incremento significativo en la fre-
cuencia de PCE micronucleados y que estuvieran relacionados con las dosis empleadas.19
RESULTADOS
SEGREGACIÓN SOMÁTICA EN EL HONGO
ASPERGILLUS NIDULANS D-30
Las tablas 1 y 2 muestran los resultados de 2 experimentos para el extracto fluido del orégano francés y su aceite
esencial. En todas las concentraciones de las muestras ensayadas se puede apreciar, que tanto el extracto fluido como el
aceite esencial afectan significativamente el crecimiento de
las colonias demostrado por el incremento del índice de toxicidad (IT), que expresa en por ciento la reducción del diámetro de las colonias con respecto al control negativo.
Con relación a la genotoxicidad se aprecia un incremento significativo dosis-dependiente en el número de sectores
segregantes, tanto para el extracto fluido como para el aceite
esencial. El análisis de varianza simple realizado a la frecuencia de sectores por colonias (FSC), demostró diferencias
significativas entre los tratamientos para ambas muestras
(P<0,01). El estadístico de Dunnett mostró diferencias significativas entre las concentraciones ensayadas de ambas muestras con respecto al control negativo (P < 0,05; p < 0,01). Al
analizar la FSC se observa un incremento lineal con relación
a las concentraciones del extracto y el aceite ensayados. Del
análisis de regresión lineal se obtuvieron las siguientes rectas:
• Para el extracto fluido: FSC = 20,13 (conc) + 4,75 para un
coeficiente de regresión de 0,998.
• Para el aceite esencial: FSC = 21,63 (conc) + 1,04 para un
coeficiente de regresión de 0,958.
TABLA 1. Resultados del ensayo de segregación somática en Aspergillus nidulans D-30 frente a un extracto fluido de Plectranthus amboinicus
(Lour.) Spreng (orégano francés) con un menstruo etanólico al 70 %
Concentración
mg/mL
Etanol al 1 % v/vd
0,323
0,646
0,969
1,292
Hidrato de cloral*
6 mM
Colonias
analizadas
8
8
8
8
8
8
Toxicidad
Diámetro
(mm)
37
36
31
26
23
13
IT a
(%)
2,70
16,22
29,63
37,84
64,86
Colonias
analizadas
30
30
30
30
30
30
Genotoxicidad
Sectores
segregantes
FSC b
121
368
534
729
921
446
a
Índice de citotoxicidad, b Frecuencia de sectores por colonias, c Índice de segregación mitótica inducida,
** p < 0,01; p<0,05.
Curva de regresión lineal: FSC = 20,23 (conc) + 4,75. r = 0,998.
70
d
4,03
12,27*
17,80**
24,30*
30,70*
14,86*
Control negativo,
e
ISMIc
1,00
3,04
4,42
6,30
7,02
3,68
Control positivo,
TABLA 2. Resultados del ensayo de segregación somática en Aspergillus nidulans D-30 frente al aceite esencial de Plectranthus amboinicus
(Lour.) Spreng (orégano francés)
Concentración
mg/mL
Colonias
analizadas
Toxicidad
Diámetro
(mm)
IT a
(%)
Colonias
analizadas
8
8
8
8
8
8
8
8
50
50
50
47
42
35
50
22
0
6
16
30
36
0
56
10
10
10
10
10
10
10
10
Etanol al 0,1 %d
0,01
0,025
0,05
0,08
0,1
Espontáneo
Hidrato de cloral
6 mM
Genotoxicidad
Sectores
segregantes
FSCb
13
18
22
28
85
10.4
9
72
a
Índice de citotoxicidad; b Frecuencia de sectores por colonias; c Índice de segregación mitótica inducida;
**p < 0,01; * p < 0,05.
Curva de regresión lineal: FSC = 21,63 (conc) + 1,04. r= 0,958.
d
ISMIc
1,3
1,8
22
28**
8,5**
104**
0,9
7,2*
Control negativo;
e
1,00
1,45
1,70
2,15
6,54
8,00
0,69
5,53
Control positivo;
TABLA 3. Resultados del ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón por un extracto fluido de Plectranthus amboinicus
(Lour.) Spreng (orégano francés )con un menstruo etanólico al 70 %
Tratamientos
Control
negativo
Etanol 4,74
g/kg
Control
espontáneo
Dosis mg/kg
Orégano
francés
193.50
386.60
773.20
Control
positivo
Ciclofosfamida
Animales
IT ± SDa
PCE
analizados
mPCE b
% mPCE ± SD
10
2,21 ± 1,10
10530
28
0,27 ± 0,15
10
2,72 ± 0,34
10340
27
0,26 ± 0,12
10
10
10
2,28 ± 0,44
2,13 ± 0,90
1,98 ± 0,81
10530
10300
10290
21
26
30
0,20 ± 0,10
0,25 ± 0,25
0,30 ± 0,18
10
1,02 ± 0,34**
10250
196
1,83 ± 0,90**
Índice de citotoxicidad, relación PCE/NCE.
Eritrocitos policromáticos micronucleados.
c
Cochran-Armitage (Prueba de tendencia en proporciones lineales).
p < 0,01**; p < 0,05*.
a
b
En ambas muestras ensayadas el índice de Segregación
Mitótica Inducida es mayor de 2 con respecto al control negativo y es dosis-dependiente.
ENSAYO DE INDUCCIÓN DE MICRONÚCLEOS
En la tabla 3, se muestran los resultados y se consideró
las dosis empleadas del extracto fluido de orégano francés
con etanol al 50 %. Para el índice de citotoxicidad (IT), no se
encontraron diferencias significativas en cuanto a sexo
(P = 0,95), dosis (P = 0,74) e interacción sexo X dosis (P = 0,94).
Para el porcentaje de MPCE, indicador de daño genético,
tampoco se encontraron diferencias significativas en cuanto
a sexo (P = 0,21), dosis (P = 0,16) e interacción sexo x dosis
(P = 0,55). Tampoco se encontraron diferencias estadísticas
en los valores del (IT) y el porcentaje de MPCE entre el control negativo y el espontáneo. Aunque se observa un incremento en los micronúcleos al aumentar las dosis, no hubo diferencias significativas al aplicar la prueba de tendencias en proporciones lineales (Cochran-Armitage; P = 0,31) en relación
dosis-respuesta lineal en el rango de tratamientos evaluados.
71
DISCUSIÓN
RECOMENDACIONES
Es evidente la acción citotóxica en el ensayo de segregación somática en las concentraciones ensayadas del extracto fluido y del aceite esencial. En particular el aceite
esencial del orégano francés contiene un 43 % de carvacrol,
un derivado fenólico con una fuerte actividad bactericida y
fungicida.20,21 Al parecer la toxicidad y genotoxicidad observada frente al Aspergillus nidulans D-30 puede deberse en
parte, a daños genéticos inducidos que afectan la estructura
y transmisión del material hereditario tal y como se ha observado para muchos agentes con actividad fungicida.22 Se puede pensar que el carvacrol sea el inductor de este daño primario al ADN del modelo biológico empleado, aunque no se ha
encontrado en la literatura ninguna información en otro sistema de ensayo de genotoxicidad relacionado con este compuesto. En las observaciones realizadas a las colonias se pudieron detectar numerosos sectores amarillos y manchas gemelas, las cuales aparecen como sectores contiguos amarillos-carmelita y verde chartré, estos últimos producto de la
recombinación mitótica como evento genético de reparación
incorrecta del daño inducido al ADN. La concentración de
etanol empleada (1 % v/v para el extracto fluido y 0,1 % v/v
para el aceite esencial) se encuentra dentro de los valores
admisibles para este ensayo, pues se reporta que pueden emplearse hasta concentraciones de 2 % en el método de incorporación en placa.23
El daño genético expresado in vitro, no se demuestra en
el ensayo in vivo de inducción de micronúcleos. Entre los
factores que influyen en este tipo de respuesta en sistemas
con mamíferos, se puede considerar la inactivación preferencial por mecanismos enzimáticos, baja concentración y
biodisponibilidad del mutágeno, así como una excreción
rápida (detoxificación).
• Realizar el ensayo Samonella/microsoma tanto al extracto fluido como al aceite esencial del orégano francés.
• Determinar la posible acción clastogénica del aceite esencial mediante el ensayo de micronúcleos.
CONCLUSIONES
El extracto fluido de Plectranthus amboinicus (Lour.)
Spreng (orégano francés) con un menstruo etanólico al
70 % presentó:
• Actividad citotóxica y genotóxica al presentar un incremento en el (IT) e inducir segregación mitótica en el hongo diploide Aspergillus nidulans D-30, y se observó una
relación dosis-respuesta significativa en todas las concentraciones ensayadas.
• No indujo de forma significativa la formación de
micronúcleos en médula ósea de ratón, por lo cual el extracto fluido no es genotóxico en este sistema de ensayo.
• Su aceite esencial presentó una fuerte actividad citotóxica
y genotóxica significativa dosis-dependiente frente al
hongo Aspergillus nidulans D-30.
72
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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in clinical ambolleical reseich. 1989:377-84.
Recibido: 13 de mayo de 1998. Aprobado: 17 de marzo de 1999.
Licenciado Angel Vizoso Parra. Centro de Investigación y Desarrollo
de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Cerro y Boyeros.
Plaza. Ciudad de La Habana. CP 10600. Teléfono (537)810818, 810830.
Fax(537)33556 e mail:cidem@infomed, sld.cu.
73
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):74-8
Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto"
EFECTO DEL NERIUM OLEANDER L. EN MODELO DE CORAZÓN
AISLADO DE COBAYO
Dr. Alfredo Céspedes Valcarcel,1 Lic. Aida Corral Salvadó,2 Lic. Clara Díaz Olivera, 2 y Lic. Yanet
Morales Fundora2
RESUMEN
Se realizó un estudio farmacognóstico y farmacológico del Nerium oleander L. con el objetivo de determinar la presencia de metabolitos
activos en la planta y corroborar en un modelo de corazón aislado de cobayo (Langerdorff) el efecto que como cardiotónico se le atribuye.
Se encontró la presencia de glicósidos cardiotónicos y se produjo un aumento (p < 0,05) de la contractilidad del músculo cardíaco con el
uso de un extracto fluido con menstruo hidroalcohólico al 30 % a dosis de 0,71 mg/g y 1,39 mg/g de peso del corazón, sin embargo, la
dosis de 5,13 mg/g provocó arritmias. El flujo coronario no varió.
Descriptores DeCS: OLEANDER/farmacología; CORAZON/efectos de drogas; GLICOSIDOS; COBAYOS.
SUMMARY
Authors performed a pharmacological and pharmacognosical study of Nerium oleander L. to assess presence of active metabolites in the
plant, and in a guinea pig isolated heart (langerdoff) and to corroborate its cardiotonic effect. We found presence of cardiotonic glycosides.
There was an increase P < 0.05) cardiac muscle contractility using fluid extract with hydroalcoholic menstrum (30 %) in doses of
0,71 mg/g and 1,39 mg/g of heart weight. However, dose of 5,13 mg/g provoked arrthytmias. Coronary flux was unchangeable.
Subject headings: OLEANDER/pharmacology; HEART/drug effects; GLYCOSIDES; GUINEA PIGS.
Las enfermedades cardiovasculares constituyen un problema de salud, ha sido la Insuficiencia Cardíaca una de las
más frecuentes; lo que ha motivado la búsqueda de plantas
que contribuyan a su tratamiento. Al Nerium oleander L. se
le atribuyen propiedades como carditónico1-3 sin embargo,
comparado con la Digital ha sido poco estudiado. En el trabajo se hace una caracterización de la droga cruda y del extracto fluido y se ensaya el efecto de este sobre un modelo de
corazón aislado de mamífero.
MÉTODOS
na del Este en Ciudad de La Habana, durante los meses de
noviembre a marzo.
La parte utilizada fueron las hojas del cultivar flores
rosadas, las que se colectaron de forma manual. Las hojas
fueron sometidas a secado en estufa con recirculación de
aire a una temperatura de 37-40 °C durante 48 h. El material
secado fue fragmentado con molino manual, y se obtuvo un
producto de partículas gruesas. En la etapa de recolección de
las hojas, la planta se encontraba en estadio vegetativo, y fue
previamente identificada en el Herbario del Jardín Botánico
Nacional con el número HAJB 72070.
MATERIAL VEGETAL
TAMIZAJE FITOQUÍMICO
La planta analizada Nerium oleander L. se colectó en
los alrededores del ISMM "Dr. Luis Díaz Soto", de La Haba-
Se realizó siguiendo el método descrito por el Departamento de Farmacognosia de la Universidad Médica de
1
2
74
Especialista de I Grado en Farmacología.
Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
Budapest, introducido en nuestro país por el Departamento
de Farmacognosia del Instituto de Farmacia y Alimentos de
la Universidad de La Habana.
ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO
Para realizar el estudio de la droga cruda se siguieron las
determinaciones descritas en la NRSP 309.4
ESTUDIO DEL EXTRACTO FLUIDO
La preparación del producto fue elaborado con el material vegetal seco y molinado y se empleó el método de
percolación en un solo paso, como se describe en la NRSP
311.5
ANÁLISIS DEL EXTRACTO FLUIDO
El análisis del producto terminado se realizó según la
NRSP 312.6
ESTUDIO FARMACOLÓGICO
En los experimentos se utilizaron cobayos Hartley, machos con peso entre 300 y 400 g procedentes del CENPALAB,
y fueron escogidos al azar mediante tabla de números
aleatorios del vivario del ISMM "Dr. Luis Díaz Soto". Los
animales se sacrificaron con un golpe en la región cervical.
El corazón se extrajo, y se depositó en placa Petri con solución Krebs-Henseleit modificada, y burbujeada con
carbógeno. Una vez terminado el proceso de extracción, el
corazón se conectó con una cánula a un sistema de perfusión
de Langerdorff con una columna de solución de 60 cm de
altura. Todos los experimentos se realizaron a 37 °C. Se fijó
un hilo de seda 6,0 al ápex del corazón; el órgano se dejó
perfundir durante 60 min en solución para su estabilización.7
Para el registro de actividad contráctil se fijó el extremo libre
del hilo a un transductor fuerza desplazamiento S8-IT (NihonKohden), las señales fueron enviadas a un amplificador RP 3
(Nihon Kohden) y recogidas en un polígrafo (Nihon-Kohden)
de 8 canales RM-150, y se recogió en papel mílimetrado. La
actividad contráctil del miocardio se midió ajustando la tensión de reposo al máximo de la relación longitud/tensión.
Después de estabilizado el órgano se tomó un registro control de los valores basales de contractilidad y se midió el
flujo coronario, se recogió el goteo del órgano mediante una
probeta graduada. Se realizó un registro y se utilizó el solvente hidroalcohólico (etanol -agua al 30 %) en un volumen
de 100 mL. La droga a probar consistió en el extracto fluido
con menstruo hidroalcohólico al 30 % de Nerium oleander L.
Se utilizaron las siguientes dosis: 0,52 mg, 1,04 mg y
4,15 mg que equivalen a 0,71 mg/g, 1,30 mg/g y 5,13 mg/g
de peso del corazón7 las que fueron administradas directamente a través de un catéter a la cánula de perfusión. Para la
selección de las dosis se tuvo en cuenta experimentos previos realizados con el extracto. Al administrar cada dosis de
la droga en un volumen de 100 µL se midieron los valores de
contractilidad y flujo coronario durante 5 min. Los registros
se efectuaron siguiendo el siguiente orden:
1. Basal.
2. Control (etanol 30 %).
3. Estabilización.
4. Primera dosis del extracto. 3 lavados sucesivos.
5. Estabilización.
6. Basal.
7. Segunda dosis del extracto, 3 lavados sucesivos.
8. Estabilización.
9. Basal.
10. Tercera dosis del extracto.
Los datos fueron introducidos en un ordenador, almacenados en una base de datos y procesados mediante un paquete estadístico SPSS.
Después de rechazada la normalidad de los datos y no
ser homogéneas sus varianzas se realizó un test de KurskalWallis y un test a posteriori (Bonferroni). Se utilizó como
criterio de significación un α = 0,05. En todas las series
experimentales la muestra fue igual a 8 (n= 8).
RESULTADOS
TAMIZAJE FITOQUÍMICO
Los resultados se muestran en la tabla 1.
ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO
El estudio de la droga cruda no mostró variaciones cualitativas entre las diferentes colectas. Los resultados se observan en la tabla 2.
La Descripción Macromorfológica responde a la siguiente descripción:
Hojas cartáceas, lampiñas estrechamente oblongas, de
7 a estas o verticilidas en grupos de 3, al ápice acuminado
o agudo.
En el caso de la Descripción Micromorfológica se pudo
observar las estructuras aquí descritas:
Cutícula gruesa, 2 capas de células epidérmicas en la
haz, 2 capas de parénquima en empalizada que abarcan
1/3 del mesófilo. Parénquima esponjoso laxo. Estomas
incluidos en criptas con abundantes pelos adaxialmente.
Abundantes cristales de oxalato de calcio en forma de
drusas en todo el mesófilo. Haces vasculares colaterales
alargados que abarcan todo el mesófilo. Nervio medio
prominente en el envés.
75
TABLA 1. Resultados del tamizaje fitoquímico del Nerium oleander (adelfa) cultivar flores rosadas
Ensayos
Metabolitos
Dragendorff
Baljet
Borntrager
Liebermann Burchard
Sudan III
Ninhidrina
Fehling
Baljet
FeC13/SALINA
Selivoflo
Rosenheim
Dragendorff
Liebermann-Burchard
Borntrager
Shinoda
Kedde
Dragendorff
Fehling
FeC13/SALINA
Prueba del frío
Extracto Etéreo
Alcaloides
Lactonas
Quinonas
Triterpenos y esteroides
Aceites/Grasas
Extracto etanólico directo
Aminas
Azúcares reductores
Lactonas
Fenoles y Taninos
Flavonoides
Saponinas
Leucoantocianinas
Extracto etanólico indirecto
Alcaloides
Triterpenos y esteroides
Quinonas
Flavonoides
Glicósidos cardiotónicos
Extracto acuoso
Alcaloides
Azúcares reductores
Fenoles y taninos
Mucílagos
T
H
F
+++
++
+++
-
++
++
+++
-
++
++
+++
-
++
+++
+
+/-
++
+++
+
+
-
++
+++
+
+/-
++
++
++
++
++
++
+
+/+
++
+/++
++
-
+
-
+++
-
TABLA 2. Resultados del análisis de la droga cruda Nerium oleander L.
Cosechas
Requisitos
Macromorf.
1
2
3
4
5
Responde
Responde
Responde
Responde
Responde
Requisitos
Micromorf.
Cenizas %
Totales
Cenizas %
S/Agua
Cenizas %
I/Ácido
Responde
Responde
Responde
Responde
Responde
6,37
8,55
6,99
7,25
6,94
1,85
2,90
2,45
1,91
1,86
0,05
0,08
0,04
0,04
0,40
ESTUDIO DEL EXTRACTO FLUIDO
Se muestran los valores de los ensayos realizados a los
diferentes lotes analizados en la tabla 3.
Referente a las Características Organolépticas, estas responden a:
Líquido transparente de color pardo verdoso y olor característico.
Mientras que el análisis Capilar responde a:
Imagen capilar vivamente coloreada, con un corrimiento
alto, presentando una franja irregularmente dentada, la
subfranja, banda y subbanda no se definen. Al exponer
la imagen capilar a los vapores de amoníaco se observó
una intensificación del color amarillo, a la luz
76
Contenido
H umedad %
14,0
12,0
13,0
13,0
9,4
Determinac. %
ST. SOL.
22,16
25,11
23,23
29,93
20,86
ultravioleta no se observaron diferencias en el capilarograma.
Responde para la prueba de identificación de glicósidos
cardiotónicos al ensayo de Kedde.
ESTUDIO FARMACOLÓGICO
El extracto fluido de Nerium oleander L. aumentó de
forma significativa (p < 0,05) la contractilidad del corazón
aislado de cobayo con las dosis de 0,71 mg/g y 1,30 mg/g; y
se incrementó en 1,12 g y 0,96 g respectivamente cuando se
comparó con el valor basal y menstruo, sin embargo, la dosis
de 5,13 mg/g provocó arritmias en todos los experimentos.
El menstruo utilizado como control no modificó
significativamente la variable con respecto al valor basal.
TABLA 3. Resultados de los extractos fluidos
Lotes
Requisitos
Organolept.
pH
Índice
Refracc.
Densidad
Relativa
1
2
3
4
5
Responde
Responde
Responde
Responde
Responde
5,9
6,7
6,0
6,0
6,1
1,383
1,362
1,358
1,362
1,358
1,026
1,022
1,007
1,006
1,005
Responde
Responde
Responde
Responde
Responde
Los valores medios, desviación estándar y la magnitud de las
diferencias se exponen en la tabla 4.
El flujo coronario no varió de forma significativa con el
uso de las dosis más bajas utilizadas (p > 0,05), ni cuando se
administró etanol al 30 %, con la dosis mayor no fue posible
medirlo, debido a la arritmia (tabla 5).
TABLA 4. Valores de contractilidad en el corazón aislado de cobayo
Dosis
(mg/g)
Basal
Etanol
30 %
0,71
1,30
5,13
Contractilidad
(g)
Media desviación Variación de la Significación
standard
contractilidad (g) Estadística
n
8
2,36
1,05
8
8
8
8
2,21
3,48
3,33
-
0,90
1,26
1,38
Arritmias
-
-
-0,153 n/s
0,21 *
0,96 **
n/s No significativo.
* Significativo con respecto al control y al valor basal.
** Significativo con respecto al control, valor basal, y dosis anterior.
TABLA 5. Valores del flujo coronario en el corazón aislado de
cobayo
Dosis
(mg/g)
Basal
Etanol
Al 30 %
0,71
1,30
5,13
n
Flujo coronario mL/min.
Media
Desviación
Signf.
Estad.
8
3,96
3,58
n/s
8
8
8
8
3,58
3,12
3,28
3,28
2,22
2,26
Arritmias
n/s
n/s
n/s
Análisis
Capilar
n/s No significativo
DISCUSIÓN
TAMIZAJE FITOQUÍMICO
Según los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico
se pudo comprobar la presencia de glicósidos cardiotónicos,
Sólidos
Totales
16,50 %
11,70 %
9,14 %
10,15 %
7,87 %
Contenido
Alcohólico
Identific.
Glic. Card.
19,5 %
19,5 %
27,0 %
21,3 %
23,7 %
Responde
Responde
Responde
Responde
Responde
que tienen especial interés para el trabajo pues se le atribuye
la acción encontrada en el Nerium oleander L.8 Es importante señalar que la planta posee una cantidad de alcaloides que
pudieran contribuir a su toxicidad.9
No se encontraron diferencias cualitativas entre los resultados del tamizaje de las diferentes partes de la planta, lo
que constituye una ventaja para su uso pues aumenta el rendimiento y facilita su recolección.
El tamizaje, coincidió con el de Robaina y colaboradores10 excepto en que estos investigadores no refirieron haber
encontrado alcaloides ni aminas y sí la existencia de
saponinas, lo que pudiera estar determinado porque el fraccionamiento utilizado en el presente estudio, explora la presencia de éstas en el extracto alcohólico y no en el acuoso,
donde pudiera también encontrarse.
DROGA CRUDA
Por los resultados obtenidos de los lotes analizados se
proponen los rangos de valores siguientes:
Cenizas totales
Cenizas solubles en agua
Cenizas insolubles en ácido
Contenido de humedad (Gravimétrico)
Determinación sustancias solubles
Máximo 9,0 %
Máximo 3,0 %
Máximo 1,0 %
Máximo 15,0 %
Mínimo 15,0 %
Las descripciones macro y micromorfológicas responden a las características descritas en los resultados.
EXTRACTO FLUIDO
Si se tiene en cuenta los lotes de extracto fluido estudiados se infieren los siguientes rangos de valores:
pH
Índice de refracción
Densidad relativa
Sólidos totales
Contenido alcohólico
De 5,9 - 6,9
De 1,358 - 1,383
De 1,001 - 1,030
Mínimo 7 %
Mínimo 15 %
77
Las características organolépticas, análisis capilar e identificación de los glicósidos cardiotónicos cumplen en cada
caso con lo descrito en el acápite anterior.
ESTUDIO FARMACOLÓGICO
El Nerium oleander L. es una planta muy estudiada desde el punto de vista toxicológico.11-21 Su composición y estructura química se ha informado en numerosos trabajos,8,22,23
aunque en relación a la Digital sus propiedades
farmacológicas (incluso sobre el corazón) están poco investigadas.
En el trabajo se observó que el extracto fluido de Nerium
oleander L. con menstruo hidroalcohólico al 30 %,
incrementó de forma significativa la contractilidad del corazón aislado de cobayo, lo que corrobora la acción que como
cardiotónico se le atribuye a la planta y los resultados obtenidos en el tamizaje fitoquímico del extracto.
Las dosis menores incrementaron la respuesta contráctil
y la mayor provocó arritmias. El menstruo etanólico al 30 %
utilizado como control, no modificó significativamente la
contractilidad en el modelo estudiado cuando se comparó
con el valor basal, por lo tanto, la acción puede atribuirse a
los metabolitos activos del vegetal presentes en el extracto y
no al menstruo. El flujo coronario no fue modificado en las
dosis empleadas, hecho, que ocurrió de manera similar con el
etanol al 30 %. Aunque no se encontraron informes en la
literatura revisada donde se evalúa experimentalmente de
forma similar la acción cardiotónica de esta especie, sin
embargo, Carvajal y colaboradores informaron un aumento
significativo de la contractilidad en la aurícula aislada de
cobayo cuando utilizaron una decocción de las hojas de la
especie.24
La planta posee en su composición glicósidos
cardiotónicos lo que hace atribuir el efecto inotropo positivo a éstos. Algunos autores25 han estudiado el efecto de la
ouabaína sobre el corazón aislado de cobayo y conejo, y han
utilizado la técnica de Langerdorff, y han encontrado un
aumento de la contractilidad del órgano sin incrementos del
flujo coronario lo que coincide con los resultados obtenidos
en esta investigación.
CONCLUSIONES
El tamizaje realizado al Nerium oleander L. demostró la
presencia de glicósidos cardiotónicos y de alcaloides, que
pudieran ser los responsables de la acción farmacológica y la
toxicidad de la especie.
El extracto fluido de Nerium oleander L. elaborado con
un menstruo hidroalcohólico al 30 % en dosis de 0,71 mg/g
y 1,30 mg/g de peso de corazón aumentó de forma significativa la contractilidad del corazón aislado de cobayo, y no
modificaron el flujo coronario, la dosis de 5,13 mg/g provocó arritmias.
78
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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relacionados. En: Goodman y Gilman eds. Las bases farmacológicas
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Procesos tecnológicos. Ciudad Habana: MINSAP; 1992.
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cardiotónicos, hipotensores o antiasmáticos. Plant Med 1983;3:15-22.
25. Raddino R. Effects of amrinone on isolated heart preparations:
comparative study with other inotropic agents. Cardiología
1991;36(9):729-34.
Recibido: 30 de marzo de 1998. Aprobado: 20 de diciembre de 1998.
Dr. Alfredo Céspedes Valcárcel. ISMM «Dr. Luis Díaz Soto». Avenida
Monumental y Carretera del Asilo. Habana del Este. Ciudad de La
Habana.
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):79-81
Laboratorio Provincial de Producción de Medicamentos de Camagüey
FARMACOGNOSIA DE LA DROGA "FLORES DE MAJAGUA"
(HIBISCUS ELATUS SW., FAMILIA MALVACEAE). III. ESTANDARIZACIÓN
DE LA DROGA CRUDA. ALTERACIONES DE LA DROGA
Dr. Rafael Milanés Santana,1 Lic. Dalyla Alonso Rodríguez 2 y Lic. Gerardo González Aguilar3
RESUMEN
Se explica la realización del estudio farmacognóstico de la droga "flores de majagua"(Hibiscus elatus Sw., familia Malvaceae), en relación
con la evaluación de los parámetros de calidad de la droga cruda (cenizas totales, ácido-insolubles, hidrosolubles, sustancias solubles en
etanol 50 %, composición química cualitativa de la droga y porcentaje de flavonoides), así como los aspectos relativos a las alteraciones
admisibles de la droga. Se presentan tablas que recogen los resultados de los parámetros de calidad determinados.
Descriptores DeCS: MEDICINA HERBARIA; ESTANDARES DE REFERENCIA; CONTROL DE CALIDAD.
SUMMARY
Performing of pharmacognostic study of "flores de majagua" drug (Hibiscus elatus SW. Malvacea family) is explained in relation to
assessment of quality parameters of crude drug (total ashes, unsolvable acid, water soluble, ethanol soluble substances (50 %), qualitative
chemical composition, and flavonoids percentage), as well as relative features to feasible alterations of drug. Tables with results of
determined quality parameters are presented.
Subject headings: MEDICINE HERBAL; REFERENCE, STANDARS; QUALITY CONTROL.
Es difícil definir cuál es el aspecto más importante del
proceso estandarizador de una droga. Después de recogida
en el momento oportuno y en específico, la fracción vegetal
libre de contaminantes de la propia planta, queda para el
proceso de secado la responsabilidad de garantizar el material vegetal crudo apto para consumo, y aún así resta determinar cuánto se altera la droga durante su manejo, estos elementos permiten preparar una droga para hacer repetible el
proceso que conduce a la elaboración del medicamento herbario y por extensión su validación clínica. Sólo bajo estas
circunstancias podemos cuestionar los asertos populares.
Este trabajo presenta los parámetros de calidad de la
droga cruda "flores de majagua" y las alteraciones admisibles.
1
2
3
MÉTODOS
Se trabajó con la droga utilizada para los estudios previos de evaluación macromorfológica y de secado a fin de
utilizar resultados de estas determinaciones como son: el
porcentaje de humedad residual efectuado por el método
gravimétrico según lo establecido en el país,1 el contenido
químico cualitativo de la droga de acuerdo al esquema propuesto por el Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL) de la
Universidad de La Habana,2 las modificaciones a este esquema según N. Farnsworth.3
Otro dato recogido del estudio de secado es el relativo al
porcentaje de flavonoides determinado sobre la base de Rutina según la Farmacopea Japonesa. (A. Cuéllar, Com. Pers.),
Especialista en Farmacognosia. Máster en Medicina Natural y Tradicional.
Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Instructora.
Licenciado en Química. Profesor Instructor.
79
TABLA 1. Porcentajes de flavonoides y sustancias solubles en menstruo hidroalcohólico 40 %, 50 % y 60 % para los tipos de secado
natural al sol y artificial al horno
Tipo
secado
Sustancias
solubles
Horno
Sol
38,7
31,3
40 %
Porcentaje alcohólico empleado
50 %
Flavonoides
Sustancias
Flavonoides
solubles
1,81
0,70
los restantes parámetros de control de calidad de la droga se
llevaron a cabo según las Normas Ramales de Salud Pública.1 En particular la determinación de sustancias solubles se
llevó a cabo en etanol al 50 % donde es más alto el porcentaje de flavonoides extraído según nuestra experiencia.
Para el análisis del embalaje y conservación se emplearon sacos de yute, bolsas de polietileno y cajas de cartón, y se
efectuaron controles bimensuales. En todos los casos se utilizaron 2 lotes de muestras, uno correspondiente a la droga
secada al horno y el otro a la droga secada al sol.
Este estudio se realizó en el Laboratorio Provincial de
Producción de Medicamentos (LPPM) y en el Laboratorio
Provincial de Diagnóstico Veterinario (LPDV).
RESULTADOS
PARÁMETROS DE CALIDAD DE LA DROGA
CRUDA
a) Cenizas totales
Se reportan para las variantes de secado natural al sol y
artificial al horno, y han sido en general similares con
valores entre 4,6 % y 5,9 %
b) Cenizas ácido insolubles: Varían entre 0,7 % y 1,7 %
c) Cenizas hidrosolubles: varían de 0,08 % hasta 0,3 %
d) Sustancias solubles y porcentaje de flavonoides
Las determinaciones se realizaron en 3 porcentajes
hidroalcohólicos (40 %, 50 % y 60 %) en las variantes de
secado adecuadas (natural al sol y artificial en horno con
recirculación de aire a no más de 400 C).
La tabla 1 representa los porcentajes de flavonoides y
sustancias solubles en menstruo hidroalcohólico 40 %, 50 %
y 60 % para los tipos de secado natural al sol y artificial al sol
y entre 61,1 % y 71,1 % para el secado al horno.
e) Humedad residual
Los valores están comprendidos entre 7,4 % y 8,9 % para
el secado al horno.
f) Constitución química cualitativa
80
35,3
20,0
1,6
1,01
Sustancias
solubles
60 %
31,2
26,7
Flavonoides
1,06
0,40
La droga responde a los ensayos de presencia de:
Triterpenos y esteroides, fenoles y taninos, flavonoides,
mucílagos y principios amargos (ligeramente) y astringentes. Los azúcares reductores no están en el cáliz, mientras que las saponinas sólo se muestran en éste.
La droga no responde a los ensayos de presencia de:
Alcaloides, quinonas, agrupamientos lactónicos, grupos
amino y glicósidos cardiotónicos.
En el caso de los alcaloides, aunque era de esperar su
ausencia, se aplicaron las pruebas de Dragendorff, Mayer y
Wagner, mientras que en fenoles y taninos se aplicó la prueba diferencial reportada por N. Farnsworth,523 y se confirmó
la presencia de taninos.
ALTERACIONES DE LA DROGA
a) Porcentaje máximo de flores oscurecidas en el secado artificial 3 %
b) Porcentaje máximo de materia orgánica extraña 1 %
c) Porcentaje máximo de materia inorgánica extraña 1 %
DISCUSIÓN
El esquema siguiente muestra los valores a tener en cuenta, al efecto de usar los parámetros registrados para el control
de drogas en un laboratorio de farmacognosia.
PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
a)
b)
c)
d)
e)
Cenizas totales 5,9 % como máximo
Cenizas ácido-insolubles 1,7 % como máximo
Cenizas hidrosolubles 0,3 % como máximo
Sustancias solubles en etanol 5029,0 % como mínimo
Porcentaje de humedad relativa8,9 % como máximo
f) Composición química de la droga:
• Triterpenos y esteroides
• Fenoles y taninos
• Flavonoides
• Mucílagos
• Azúcares reductores
• Principios amargos (ligeramente) y astringentes
El cáliz presenta saponinas y carece de azúcares reductores.
g) Porcentaje de flavonoides 1,01 % como mínimo
Aun cuando se obtuvo resultados de cenizas para el secado al sol y el secado artificial, se indicó el valor más elevado como punto culminante admisible en cualesquiera de los
casos. Respecto a la determinación de extractivas (sustancias solubles), a pesar de haberse evaluado en 3 menstruos
extractivos (40 %, 50 % y 60 % de grado alcohólico), se
eligió la extractiva en etanol 50 % como la normalizadora,
pues en este menstruo se alcanzan los valores más altos de
rendimiento en flavonoides, y se reportó el porcentaje más
bajo, obtenido en la droga sometida al proceso de secado
menos eficiente, y se descartó por esta vía alguna droga secada a la sombra o envejecida, que ofrece siempre valores más
bajos que el indicado.
En relación con la humedad residual, se indicó como
máximo admisible el valor rendido en el secado al sol, aun
cuando respecto a la elevada higroscopicidad de la droga y
su rápida tendencia de deterioro en nuestras condiciones
ambientales de humedad relativa es sugerente seguir cuidadosamente la droga secada al sol, pues el desarrollo de hongos es apreciable al menor descuido de tan delicada droga.
El tamizaje fitoquímico realizado suministra datos de
algún interés, pues el cáliz aporta saponinas y está exento de
azúcares reductores. La evaluación cuantitativa de
flavonoides hizo que éste parámetro perdiera interés general,
pero que se mantuviera en su justa posición de dato adicional.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 . Soler B, Sánchez E, Méndez G, Miranda M. Normas Ramales.
Medicamentos de origen vegetal. Drogas crudas. MINSAP: La Habana, 1922;73pp.
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Habana, 1992:88.
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Pharm Sci 1996;55(3):225-76.
Recibido: 19 de febrero de 1999. Aprobado: 17 de marzo de 1999.
Dr. Rafael Milanés Santana. Laboratorio Provincial de Medicamentos. Camagüey. Apartado 524, Código Postal 70100, Camagüey
1, Cuba.
81
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):82-7
Laboratorio Provincial de Producción de Medicamentos de Camagüey
FARMACOGNOSIA DE LA DROGA "FLORES DE MAJAGUA" (HIBISCUS
ELATUS SW., FAMILIA MALVACEAE). IV. ESTANDARIZACIÓN
DEL EXTRACTO FLUIDO
Dr. Rafael Milanés Santana, 1 Lic. Dalyla Alonso Rodríguez 2 y Lic. Gerardo González Aguilar3
RESUMEN
Se explica la realización del estudio farmacognóstico de la droga "flores de majagua"(Hibiscus elatus Sw., familia Malvaceae), en relación
con la evaluación de la eficiencia de los procesos extractivos, se tuvo en cuenta el porcentaje de flavonoides, cantidad de menstruo para
alcanzar dicho porcentaje y las limitaciones prácticas de los procesos. Se propone el uso del extracto fluido en menstruo hidroalcohólico
al 50 % obtenido por percolación y como variante alternativa el proceso de bimaceración. Se descarta la maceración como proceso
tecnológico. Se presentan anexos y tablas que recogen los resultados de los parámetros de calidad determinados para droga secada al sol
y al horno con recirculación de aire a no más de 40 °C en ambas variantes tecnológicas (organoleptia, índice de refracción (Ir), pH,
densidad relativa (dr), sólidos totales (St), contenido alcohólico (CA), análisis capilar y composición química cualitativa.
Descriptores DeCS: MEDICINA HERBARIA. EXTRACTOS VEGETALES/farmacocinética. EXTRACTOS VEGETALES/farmacología.
SUMMARY
Performing of pharmacognostic study of "flores de majagua " drug (Hibiscus elatus SW., Malvaceae family), is explained in relation to
assesment of efficiency of extractive processes, Flavonoids percentage, menstrum quantity, required to obtain such percentage, and
practical limitations of processes were taking in account. Authors propose use of fluid extract in hydroalcoholic menstrum to 50 %,
obtained by percolation, and as a alternative variant to bimaceration. Maceration is discarded as technological process. Annexes and tables
are presented. Which include quality parameters results, determined to dried up drug, and to furnace with air recirculation, to no more
than 40 °C in both tecnological variants (organoleptic, refraction rate (R.R.), pH relative density (R.D.), total solids (T.S.), alcoholic
content (A.C.), capilar analysus, and qualitative chemical composition.
Subject headings: MEDICINE HERBAL; PLANT EXTRACTS/pharmacocinetics; PLANT EXTRACTS/pharmacology.
Considerada como la segunda planta más utilizada popularmente para el tratamiento de las afecciones de las vías
respiratorias superiores en áreas rurales de varios municipios
camagüeyanos, y como forma parte de la formulación
IMEFASMA JARABE, las flores de majagua constituyen un
motivo de interés en relación con la estandarización de su
extracto fluido.
Culminada la evaluación teórico descriptiva concerniente a los aspectos etnológicos, históricos, geográficos, etc. y
estandarizada la droga cruda, el equipo de trabajo pretende
completar el expediente farmacognóstico de esta droga, y se
1
2
3
82
han comparado varios procesos tecnológicos en relación con
su eficiencia en el agotamiento de flavonoides.
MÉTODOS
Los extractos fluidos fueron preparados por los procesos
de percolación, maceración1 y bimaceración. Este último no
está normado, pero fue aprobado por el Comité Técnico de
Normalización de Plantas Medicinales. Sus particularidades
son expuestas (Fig. 1).
Especialista en Farmacognosia. Máster en Medicina Natural y Tradicional.
Licenciada en Ciencias Farmaceúticas. Profesora Instructora.
Licenciado en Química. Profesor Instructor.
RESULTADOS
Absorbancia a 375 nm
120
De acuerdo a las experiencias de nuestro equipo de trabajo, en relación con la eficiencia del proceso de secado se
procedió a utilizar los resultados del porcentaje de
flavonoides en extractivas a la droga secada al sol, sombra y
horno con recirculación de aire a no más de 40 °C en
menstruos etanólicos al 40 %, 50 % y 60 % (ver tabla 1).
100
80
60
40
TABLA 1. Porcentajes de flavonoides en menstruo hidroalcohólico
40 %, 50 % y 60 % para los tipos de secado ensayados
20
0
0
20
40
Concentración de rutina (ppm)
60
Tipo de secado
FIG. 1. Esquema de trabajo correspondiente al proceso tecnológico de bimaceración.
El agotamiento de la droga se comprobó en los métodos
de percolación y bimaceración mediante la prueba cualitativa de Shinoda para la determinación de la presencia de
flavonoides. 2
Los menstruos de extracción son: etanol 40 %, 50 % y
60 %, preparados según tabla de dilución de alcoholes.3
Los parámetros de control de la calidad de los extractos
fueron: requisitos organolépticos, pH, densidad relativa (dr),
índice de refracción (Ir), Sólidos totales (St), contenido alcohólico (CA) y análisis capilar. Además, a cada extracto se le
determinó la presencia de los principales grupos de
metabolitos secundarios y el porcentaje de flavonoides como
marcador de efiencia.
La evaluación de los parámetros físico-químicos de los
extractos se llevó a cabo de acuerdo con las normas existentes en nuestro país.1
El tamizaje fitoquímico se aplicó de acuerdo al esquema
propuesto por el Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL) de
la Universidad de La Habana,2 las modificaciones empleadas
fueron incluidas según N.Farnsworth.4
Las mediciones se hicieron en un espectrofotómetro
SPEKOL 11 alemán, y se utilizaron reactivos calidad analítica, excepto el alcohol empleado en la preparación de los
extractos (clase C) suministrado por el LPPM.
La determinación de flavonoides se realizó sobre la base
de Rutina, propuesta por la Farmacopea Japonesa (A. Cuéllar.,
com. pers). El análisis estadístico de los resultados se realizó
siguiendo la metodología del programa ABSTAT (Anderson-Bell) co. (84):Abstat rel 4,05).
La curva de calibración presentada en la figura 2 fue
ajustada siguiendo el procedimiento de mínimos cuadrados.
Horno
Sol
Sombra
Porcentaje alcohólico empleado
40 %
50 %
60 %
1,81
0,70
0,03
1,60
1,01
0,20
1,06
0,40
0,09
Los extractos fueron preparados por los métodos de
percolación, maceración y bimaceración, este último no está
normado, pero fue aprobado por el Comité de Normalización
de Plantas Medicinales.
Se cuantificaron los flavonoides y se determinó la cantidad de menstruo necesaria para alcanzar dicho porcentaje, y
se arrojaron los resultados presentados en la tabla 2.
El proceso de percolación no se pudo realizar en menstruo al 40 % por la formación de una masa compacta que
impide el paso de menstruo a través de la droga a partir de la
segunda extracción.
Luego se procedió a la determinación de los parámetros
de control de la calidad de los extractos obtenidos por los
procesos tecnológicos de bimaceración y percolación en las
variantes de secado natural al sol y artificial.
PARÁMETROS DE CONTROL DE LA CALIDAD
PARA LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS
OBTENIDOS
a) Extracto hidroalcohólico obtenido por Percolación
Fórmula para 1000 mL de extracto fluido
Flores de majagua pulverizadas 1 kg
Alcohol etílico al 50 % c.s
Requisitos organolépticos
Color oscuro intenso, no transparente. En capa fina rojo
vino transparente, sin partículas en suspensión, ni separación en capas. Olor característico.
83
Droga groseramente fragmentada
Añadir menstruo
hidroalcohólico hasta cubrirla
Macerar durante 72 h
1ra. Fracción
(70 %)
2da Fracción
(resto del macerado)
Decantar separando
el 70% del mercado
Macerar con menstruo
hidroalcohólico
durante 72 h
Decantar y unir con la 2da
fracción (repitiendo hasta
agotar flavonoides)
Concentrar el volumen
total de la 2da fracción
hasta el 30 %
Mezclar con la 1ra fracción
Reposar 4 d a temperatura de
8 oC - 10 oC
Filtrar
FIG. 2. Curva de calibración para la cuantificación de flavonoides sobre la base de rutina.
Parámetros de calidad
pH= 4,8-5,4
dr= 0,9582-1,0290
Ir= 1,3580-1,3670
St= 8,83 % como mínimo
CA= 19,5 % como mínimo
Análisis capilar
Imagen vivamente coloreada, de baja altura, con una
franja profundamente dentada color pardo, el resto (subfranja,
banda y subbanda no se separa), y se tornó de pardo amarillento con líneas verticales color pardo intenso en el espacio
comprendido entre el límite de inmersión y la franja, sin llegar a esta última.
84
Frente a vapores de amoníaco se acentúa el color de la
imagen definitiva.
Ante la luz U.V no se produce fluorescencia, acentuándose el color de la imagen definitiva.
Composición química
Triterpenos y esteroides
Fenoles y taninos
Flavonoides
Mucílagos
Azúcares reductores
Saponinas
Principios amargos (ligeramente) y astringentes
TABLA 2. Porcentaje de flavonoides en correspondencia con la cantidad de menstruo consumido según el tipo de secado
Tipo de
secado
Proceso de maceración
Menstruo
% de
Flavonoides
40 %
50 %
60 %
0,03
0,01
0,03
0,0016a
0,0008b
0,0040a
9
10
15
0,5560h
0,56561
0,3304j
40 %
50 %
60 %
0,05
0,01
0,03
0,0008c
0,0050b
0,0012a
10
7
15
0,4573h
0,1290k
0,3109j
Menstruo
% de
Flavonoides
40 %
50 %
60 %
0,04
0,10
0,09
0,0016a,c
0,0050d
0,0816d
71
150
150
0,8958l
1,0000m
0,9464m
40 %
50 %
60 %
0,02
0,10
0,09
0,0104a,b
0,0040d
0,0040d
93
148
151
0,9574n
2,8442o
1,931111
Menstruo
% de
Flavonoides
Artificial
40 %
50 %
60 %
0,20
0,11
0,0896e
0,0420d,f
101
326
1,7078q
3,1091r
Natural
40 %
50 %
60 %
0,13
0,07
0,0583f
0,0081g
101
326
1,2909q
1,2583r
Artificial
Natural
Tipo de
secado
Artificial
Natural
Tipo de
secado
Desv. St.
Proceso de Bimaceración
Desv. St.
Proceso de Percolación
Desv. St.
Menstruo
Consumido
Menstruo
Consumido
Menstruo
Consumido
Desv. St.
Desv. St.
Desv. St.
Nota:
- La cantidad de menstruo consumido expuesta por un índice que expresa el número de veces que dicho menstruo supera el volumen final del
extracto obtenido.
- Supraíndices iguales indican diferencias no significativas para p<0,05.
Porcentaje de flavonoides: 0,13 % como mínimo.
b) Extracto hidroalcohólico obtenido por bimaceración
Fórmula para 1000 mL de extracto hidroalcohólico
Flores de majagua groseramente fragmentadas 1 kg
Alcohol etílico al 50 % c.s
Parámetros de calidad
pH= 4,9-5,2
dr= 1,0135-1,0434
Ir= 1,3510-1,3750
St= 5,9 % como mínimo
CA= 21,76 % como mínimo
Requisitos organolépticos
Análisis capilar
Color oscuro intenso, no transparente. En capa fina rojo
vino transparente, sin partículas en suspensión ni separación
en capas. Olor característico.
Imagen vivamente coloreada, de baja altura, con una
franja irregularmente dentada de color pardo claro en el centro y oscuro en los laterales, donde asciende vez y media o
85
más el tamaño de la imagen por encima de la franja, el resto
(subfranja, banda y subbanda) no se separa, sólo una pequeña línea de color pardo claro en el espacio comprendido entre el límite de inmersión y la franja.
Frente a vapores de amoníaco se acentúan los colores de
la imagen definitiva.
Ante la U.V no se produce fluorescencia, acentuándose
las tonalidades de la imagen definitiva.
Composición química
Triterpenos y esteroides
Fenoles y taninos
Flavonoides
Mucílagos
Azúcares reductores
Saponinas
Principios amargos (ligeramente y astringentes)
Porcentaje de flavonoides: 0,1 % como mínimo.
El porcentaje de flavonoides en ambas variantes tecnológicas resultó ser mayor en menstruo hidroalcohólico al
50 %, en la bimaceración fue similar en la variante natural y
artificial, mientras que en la percolación fue ligeramente
mayor en la variante artificial.
En la bimaceración, con un consumo de menstruo mayor, se obtuvo un porcentaje de flavonoides por debajo del
obtenido en la percolación para el menstruo de etanol al
50 %.
DISCUSIÓN
Como se observa en datos reportados en la tabla 1, los
flavonoides se deterioran sustancialmente en el secado a la
sombra, quedando descartada esta variante para determinaciones ulteriores.
En el secado al sol y al horno el porcentaje de flavonoides
se mantuvo prácticamente igual en menstruo al 40 % y 50 %,
86
y fue mayor en el menstruo al 40 % para droga secada al
horno y menor en menstruo al 60 % para los 3 tipos de secado, por tanto, se decidió preparar los extractos y se utilizaron
estas 2 variantes de secado.
Según tabla 2, en la maceración el consumo de menstruo
es mucho menor en comparación con la bimaceración y
percolación, sin embargo, el porcentaje de flavonoides resultó estar muy por debajo, por lo que se descartó esta variante tecnológica.
En la bimaceración, con un consumo de menstruo mayor, se obtuvo un porcentaje de flavonoides ligeramente por
debajo del obtenido en la percolación para el menstruo de
etanol al 50 %, por lo que sugerimos que los extractos deben
prepararse preferentemente por percolación en menstruo al
50 %, y se pudo utilizar la bimaceración como variante alternativa en el mismo porcentaje etanólico, sobre todo cuando
no se dispone de los medios necesarios para la pulverización
de la droga.
La materia prima para la preparación de estos extractos
debe ser secada al horno y como variante alternativa se acepta el secado natural al sol.
Se destacó la similitud entre los parámetros de control
de la calidad de ambos extractos obtenidos por percolación
y bimaceración en las variantes de secado anteriormente
mencionadas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 . Soler B, Méndez G, García M, Miranda M. Normas Ramales. Medicamentos de origen vegetal. Tinturas y extractos fluidos. MINSAP.
La Habana, 1992; 73pp.
2 . Miranda M, Cuéllar A, Pérez M. Manual de prácticas de laboratorio
de análisis farmacognóstico. IFAL, La Habana: Universidad de La
Habana, 1992:88.
3 . Cuba, Ministerio de Salud Pública. Formulario Nacional de Preparaciones Oficinales y Extemporáneas. La Habana: Instituto del Libro, 1967:142.
Recibido: 19 de febrero de 1999. Aprobado: 17 de marzo de 1999.
Dr. Rafael Milanés Santana. Laboratorio Provincial de Producción de
Medicamentos. Apartado 524, Código Postal 70100, Camagüey 1,
Cuba.
REV CUBANA PLANT MED 1999;3(2):87-90
Instituto Superior de Ciencias Médicas "Dr. Carlos J. Finlay"
TOXICOLOGÍA AGUDA ORAL DEL EUCALYPTUS SALIGNA SM.
POR EL MÉTODO DE LAS CLASES
Dra. María del Carmen León Padilla,1 Lic. Imilla Casado Alfonso,2 Lic. Jhoanet Jacas Molina,2 Dr. José
Luis Cadenas Freixas3 y Dra. Carmen López Gómez 4
RESUMEN
El presente trabajo se desarrolló en la Unidad Provincial de Toxicología Experimental de Camagüey con el objeto de realizar el estudio
toxicológico agudo del Eucalytus saligna Sm. Para el desarrollo del mismo se utilizó el método de las clases de toxicidad aguda, a partir
de dosis prefijdas de 25, 200 y 2000 mg/kg PC. La especie empleada fue Rathus rathus, línea Wistar, con un peso corporal comprendido
entre 150 y 200 g. Se observaron signos tóxicos en la dosis de 2 000 mg/kg PC tales como: letargo, somnolencia y disminución de la
respuesta a estímulos; y en la dosis de 200 mg/kg PC no se observaron estos. Se pudo comprobar que la decocción de Eucalyptus saligna
Sm. no es tóxica, al no ocurrir mortalidad a la dosis de 2 000 mg/kg que es la dosis límite según la norma utilizada.
Descriptores DeCS: EUCALYPTUS/toxicidad. MEDICINA HERBARIA. RATAS DE CEPAS CONSANGUINEAS.
SUMMARY
Present paper was developed in Provincial Unit of Experimental Toxicology in Camagüey province, to carry out acute toxicology study of
Eucalyptus saligna Sm, where authors used class method of acute toxicity, from prefixed dose of 25,200 and 2 000 mg/kg of body weight
(B.W.). Strain used as Rathus rathus, Wistar line, weighing from 150 g to 200 g. In dose of 2 000 mg/kg of BW, toxic signs were
observed, including lethargy, somnolence and a decrease in stimuli response; but not in dose of 200 mg/kg of B.W. We confirmed that
Eucalyptus saligna Sm. decoction isn’t toxic, since there wasn’t mortality with dose of 2 000 mg/kg, which according to standard used, is the
limit dose.
Subject headings: EUCALYPTUS/toxicity; MEDICINE HERBAL; RATS, INBRED STRAINS.
La Organización Mundial de la Salud plantea que de los
119 medicamentos derivados de plantas, aproximadamente
el 74 % son usados en la medicina moderna en correlación
con los usos tradicionales como medicamentos de plantas
por las culturas nativas.1
Se define como planta medicinal a todo vegetal, que
contiene, en uno o más de sus órganos, sustancias que pueden ser empleadas directamente como medicamentos o como
precursores de éstos. Es decir, cualquier planta que cuando
se administre en cualquier forma o por cualquier vía al hombre o a los animales, ejerce un tipo de acción farmacológica
de posible uso terapéutico (Curso-Taller: "Utilización de pro-
1
2
3
4
ductos naturales en la industria farmacéutica". La Habana,
1995). Tal es el caso del Eucalyptus sp, reconocida como
planta útil en todos los conceptos. Tiene su origen en Australia y Tasmania y fue descubierto por el botánico francés
L’Heritier en 1778 e introducido en Cuba por Julius
Lachaume, aunque masivamente lo hizo el ingeniero Alberto J. Forst en 1929.2 La parte más utilizada del Eucalyptus sp
son sus hojas; las que son astringentes, febrífugas y antisépticas; ricas en tanino y principalmente en aceites esenciales;
y empleadas tópicamente para la cura de llagas, úlceras y
otras enfermedades de los tejidos y la piel.3
Doctora en Medicina. Especialista de I Grado en Farmacología. Máster en Medicina Tradicional y Natural. Profesora Asistente.
Licenciada en Biología.
Doctor en Estomatología. Especialista de I Grado en Fisiología Médica. Profesor Asistente.
Doctora en Medicina. Especialista de I Grado en Farmacología. Profesora Asistente.
87
La utilización de las plantas medicinales tradicionales
se recomienda que se efectúe sobre una base científica que
valide la efectividad terapéutica y la relativa inocuidad de
las mismas.4
La aplicación de los "métodos alternativos" en el campo de la Toxi-cología es reciente y ha coincidido con la creciente oposición social al uso indiscriminado de animales de
experimentación, así como a la necesidad que tenía esta ciencia de dar un paso de avance en la evaluación del riesgo de
toxicidad que en muchas ocasiones quedaba sólo en la descripción del daño que proporcionan los métodos tradicionales.3
El gran abánico de procedimientos alternativos posibles, incluye las mejoras en el almacenamiento, uso e intercambio de la información con el objetivo de evitar la repetición innecesaria de ensayos; las mejoras en el diseño de los
experimentos para aumentar su validez y disminuir el sufrimiento y el número de animales empleados. El resultado será
sin dudas un progreso hacia métodos más humanos y contrastados científicamente que los vigentes en la legislación
actual.6
El presente trabajo se realiza para dar continuidad a investigaciones de las propiedades antidiarreicas del
Eucalyptus saligna Sm. que se vienen realizando desde 1988.
Se propone como objetivo principal demostrar la posible
toxicidad del E. saligna Sm. y clasificar toxicológicamente
el extracto acuoso de esta especie.
MÉTODOS
Se empleó corteza de Eucalyptus saligna Sm. colectadas en diferentes épocas del año, procedentes de Las Cuabas
y de la Estación de Investigaciones Forestales, pertenecientes al MINAGRI. La planta se ubica en el lote 21, rodal 13.
Para la investigación se preparó una decocción a una
concentración del 40 % P/Va la que se le determinó el contenido de sólidos totales, presentes en la misma un 2 %.
En este ensayo se empleó el método de las clases de
toxicidad aguda (TAC), administrado a dosis única a una
especie. Este procedimiento permite la identificación de la
TAC como medida de toxicidad aguda por vía oral (Schedele,
1992).
El estudio se llevó a cabo en ratas Wistar procedentes
del Bioterio-Vivario del ISCM de Camagüey. Las mismas se
encontraban clínicamente sanas, con un peso corporal comprendido entre 150 y 200 g. Estos animales se mantuvieron
en ayunas y agua ad libitum 18 h antes del estudio, luego de
haber permanecido durante una semana en climatización.
La vía de administración escogida fue la oral, por ser la
propuesta para el uso en humanos. Se administró directo del
frasco, mediante intubación intragástrica a un sólo nivel de
dosis; de igual forma se administró el vehículo acuoso al
grupo control.
La dosis usada se seleccionó de acuerdo a una serie de
niveles de dosis definidos 25,200 y 2 000 mg/kg de peso
corporal.
88
La sustancia fue evaluada y se usó un procedimiento por
paso; cada uno emplea 3 animales de un sexo. El resultado
de cada etapa determinará si no es necesario continuar los
ensayos o que sean realizados con la misma dosis pero con
animales de otro sexo y según los resultados, el próximo
paso deberá ser realizado con la dosis siguiente mayor o siguiente menor.
Basado en esto, los animales se distribuyeron aleatoriamente de la siguiente forma:
• Un control negativo, al que se le administró el vehículo
acuoso.
• Un grupo problema, tratado con la decocción a una dosis
de 200 mg/kg.
Se comenzó con el sexo masculino.
Los animales fueron observados constantemente durante las primeras 24 h, y diariamente por un período de 14 d.
En la evaluación del examen clínico se tuvo en cuenta
la presencia de signos tóxicos, tiempo de aparición y desaparición de estos y muerte. El peso corporal se controló al inicio, a la semana y al final del estudio.
Una vez culminado el período de observación, los animales fueron sacrificados, y se efectuó un análisis
macroscópico de órganos y tejidos así como el estudio
histológico de los mismos. Los órganos evaluados fueron
encéfalo, pulmones, riñones, gónadas (testículos y ovarios),
estómago, corazón, hígado, bazo e intestino.
Para el análisis del comportamiento del peso corporal
durante el ensayo toxicológico, se realizó estadística descriptiva y test de hipótesis de medias, a través del sistema
MICROSTAT.
RESULTADOS
Para el nivel de dosis de 200 mg/kg PC en ratas machos,
no se presentó mortalidad ni hubo aparición de signos tóxicos. En el análisis microscópico realizado a tejidos y órganos no se encontraron alteraciones.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores procedimos al siguiente paso, que según el esquema de toxicidad,
corresponde reevaluar la decocción con la misma dosis pero
en ratas hembras, siguiendo igual metodología.
Al término de los 14 d de observación, no se detectaron
signos tóxicos y no hubo muertes. Los órganos no presentaron alteraciones macroscópicas.
Dado los resultados de las etapas anteriores, se continuó
el ensayo, se evaluó la decocción a un nivel de dosis superior: 2 000 mg/kg PC. Al igual que en el nivel anterior, se
mantiene el mismo método y secuencia.
Culminados los 14 d de observación no se produjo ninguna muerte. Estos resultados coinciden con los observados
en el sexo femenino.
En todos los casos, al término de los 14 d los animales
fueron sacrificados. Sus órganos se analizaron macroscópicamente, se pesaron y se conservaron en formol 10 %
para su posterior estudio histopatológico.
El comportamiento del peso corporal para ambos sexos
y dosis ensayadas, durante los 14 d del período de observación, se pudieron observar en el análisis comparativo del
peso corporal entre el grupo estudio y control en la dosis de
200 mg/kg PC, diferencias significativas (p<0,05), con una
tendencia al aumento del peso a favor del grupo estudio.
En la evaluación del peso a la dosis de 2 000 mg/kg PC
no se observó un comportamiento similar, al existir una disminución del peso en el grupo estudio, comparado con el grupo
control; resultando esta estadísticamente significativa para
p<0,01.
El estudio histopatológico no mostró alteraciones que
evidencien la posible toxicidad de la sustancia ensayada.
DISCUSIÓN
Se hizo un análisis de los resultados obtenidos, se demostró, que no existen diferencias significativas (p> 0,05) en
el comportamiento del peso corporal entre ambos sexos en
las dosis ensayadas. Esto demuestra que en el tratamiento
con decocción de Euclyptus saligna Sm. el sexo no influye
como un factor determinante.
El aumento del peso a favor del grupo estudio a la dosis
de 200 mg/kg PC puede estar relacionado con el hecho que
el grupo control sólo recibió agua destilada, no siendo así en
el grupo tratamiento que se le administró la decocción, rica
en componentes químicos tales como: aceites, lactonas,
triterpenos, esteroides, azúcares reductores, taninos, etc., que
pudieran explicar dicho aumento.
En la evaluación del peso a la dosis de 2000 mg/kg PC,
no se observó el mismo comportamiento, al existir una disminución del peso en el grupo estudio, por lo que se evidencia un efecto deletéreo de la sustancia ensayada, que pudiera
estar relacionado con la farmacocinética del producto o sea,
su absorción, distribución, metabolismo y excreción; estu-
dios éstos que aún son incipientes por tatrarse de una especie
vegetal poco estudiada.
Este hecho es justificado también por la presencia de
signos tóxicos en esta dosis tanto en el sexo masculino como
en el femenino, en las primeras 24 h, donde se observó somnolencia, letargo y diminución de la respuesta a estímulos;
que demuestra una acción depresora del SNC. El mecanismo
por el cual ejerce su acción farmacológica esta sustancia aún
no se ha estudiado y podría dar respuesta a las manifestaciones observadas.
Si se tiene en cuenta los resultados del estudio preclínico,
la tabla de mortalidad y el esquema toxicológico se clasifica
a la sustancia como no tóxica o no clasificable.
CONCLUSIONES
1. El extracto acuoso de Eucalyptus saligna Sm. se clasifica
como no toxico, ATCo , o sea, no clasificable.
2. La decocción de Eucalyptus saligna Sm. a dosis elevadas produce un efecto sobre el organismo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 . Peralta K. Fitocosméticos. Salud Natural 1996;2(6):10-11.
2 . Betancourt, A. Silvicultura especial de árboles maderables tropicales. La Habana: Editorial Científico Técnica 1987:128.
3 . Roig, J T. " Plantas medicinales, aromáticas y venenosas de Cuba".
La Habana: Ciencia y Técnica. 1974:365-8.
4 . Martínez R. Bases Científicas para el estudio y utilización de los
medicamentos. Manual de Farmacología. La Habana: Pueblo y
Educación. 1988; pte 1:24-7.
5 . Repetto G. Recientes avances en la validación y aceptación de
métodos alternativos in vivo e in vitro. Rev Toxicol. 1995;12(1):
3- 9 .
6 . Repetto MR. "Toxicología experimental" . 2da ed. Barcelona: Científico-Médica 1988:408.
Recibido: 4 de marzo de 1999. Aprobado: 17 de marzo de 1999.
Dra. María del Carmen León Padilla. Instituto Superior de Ciencias
Médicas de Camagüey.
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