TESIS GERARDO Y MALU - Universidad Nacional de la

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA
FACULTAD DE FARMACIA Y
BIOQUÍMICA
“CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE LA CORTEZA DE Cariniana decandra
DUCKE (CINTA CASPI) USADA COMO INSUMO DE BEBIDAS
HIDROALCOHÓLICAS DE USO ETNOTERAPÉUTICO EN LORETO”
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR:
Bach. BARDALES CHÁVEZ, Gerardo Daniel.
Bach. SUÁREZ SAAVEDRA, Malú Mabel.
ASESORES:
Q.F. SOSA AMAY, Frida Enriqueta Mgr.
Q.F. NONATO RAMÍREZ Luis Domingo, Dr.
IQUITOS- PERÚ
2015
1
“Calidad microbiológica de la corteza de Cariniana decandra Ducke (cinta
caspi) usada como insumo de bebidas hidroalcohólicas de uso etnoterapéutico
en Loreto”
RESUMEN
El presente estudio, tuvo como objetivo determinar la calidad microbiológica de la
corteza Cariniana decandra Ducke (cinta caspi) usada como insumo de bebidas
hidroalcohólicas de uso etnoterapéutico en Loreto. Se recolectaron muestras de
cortezas, de ambos lados de la carretera Zungarococha –Llanchama desde el Km 4.7
al Km 11.4 en los caseríos Puerto Almendra y Nina Rumí, que luego de ser
acondicionadas y conservadas en forma pulverizada, se sometieron a las pruebas de
límites microbianos establecidos por la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 35).
Los resultados determinaron ausencia de Staphylococcus aureus y Salmonella spp en
todas las muestras de la especie. De los 6 árboles muestreados de Cariniana
decandra Ducke (cinta caspi), las muestras de cortezas del árbol 1, 3 y 4 son
aceptadas como materia prima vegetal bioactiva por presentar los parámetros de
calidad microbiológica exigidos por la Farmacopea USP 35 y adoptados por la
DIGEMID de Perú.
Palabras claves: Calidad microbiológica, recuento de aerobios mesófilos totales,
plantas medicinales, Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa, Escherichia
coli, Salmonella spp.
2
"Microbiological quality bark Cariniana decandra Ducke (tape caspi) used as
input-alcoholic drinks etnoterapéutico use in Loreto"
SUMMARY
The present study aimed to determine the microbiological quality of the crust
Cariniana decandra Ducke (caspi tape) used as input-alcoholic drinks etnoterapéutico
use in Loreto. Samples of bark, on both sides of the road were collected
Zungarococha -Llanchama from km 4.7 to km 11.4 in the villages Puerto Almendra
and Nina Rumi, who after being upgraded and preserved in powdered form were
subjected to microbial limits testing established by the US Pharmacopoeia (USP 35)
.The results showed absence of Staphylococcus aureus and Salmonella spp in all
samples of the species. 6 sampled trees Cariniana decandra Ducke (caspi tape),
samples of bark of the tree 1, 3 and 4 are accepted as plant material bioactive to
present the parameters of microbiological quality required by the Pharmacopoeia
USP 35 and adopted by the DIGEMID of Peru.
Keywords: Microbiological quality, total count of mesophilic aerobic, medicinal
plants, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Salmonella spp.
3
DEDICATORIA
A mi Dios,
Quién supo guiarme por el buen camino, darme
fuerzas para seguir adelante y no desmayar,
enseñándome a encarar las adversidades y nunca
desfallecer en el intento.
A mis padres, Gonzalo y Estrella, por sus apoyo,
consejos, amor y ayuda en los momentos difíciles.
Me han dado todo lo que soy como persona para
conseguir mis objetivos.
A mi hermano Pedro por estar siempre presente,
acompañándome a lo largo de mi carrera.
A Gerardo quien ha sido y es mi motivación,
inspiración y felicidad.
A todos mis amigos que estuvieron siempre a lo
largo de nuestra vida estudiantil; a ellos que
siempre tuvieron una palabra de aliento en los
momentos difíciles y que han sido incentivos de
nuestras vidas.
A Dios todo poderoso,
Por ser mí guía, mi fortaleza y mi salvación en
todos los momentos de mi vida.
A mis padres María y Gerardo por el apoyo
incondicional y enseñarme todo en la vida.
A mis hermanos, familiares y amigos qué de una
u otra forma me apoyaron durante mi formación
profesional.
A Malu, por estar conmigo en cada momento de
mis días.
4
AGRADECIMIENTO
 Primero antes que nada, damos gracias a Dios, por estar con nosotros en cada
momento de nuestras vidas, por fortalecernos, iluminarnos y acompañarnos durante
todo el periodo de nuestro estudio.
 Al, Blgo. Pedro Marcelino Adrianzen Julca y al Ing. José David Urquiza Muñoz jefe
del Laboratorio de Suelos- CIRNA – UNAP (Centro de Investigación de Recursos
Naturales de la Amazonía) quien nos brindó la facilidad del ambiente necesario para
la realización del presente trabajo de investigación.
 Un agradecimiento especial a la Q.F Frida Enriqueta Sosa Amay, Mgr. por la
asesoría, paciencia, apoyo profesional, por aconsejarnos siempre, por ser nuestra
mentora y amiga a la vez.
 Un agradecimiento especial al Q.F Luis Domingo Nonato Ramírez, Dr.
por la
asesoría y por sus sabios consejos durante la realización del proyecto.

A los queridos catedráticos por transmitirnos sus diversos conocimientos y
encaminarnos por el camino correcto para ser profesionales competentes capaces de
afrontar los retos de la vida.
5
ÍNDICE DE CONTENIDO
Introducción………………...…...……..………………………………….
Objetivos…………………………………………………………………..
CAPÍTULO I
1. Marco teórico………………….…………………………………………
1.1. Antecedentes…………………………………………………………
1.2. Marco conceptual………..…………………..……………………….
1.2.1. Clasificación y descripción botánica de la especie……………..
1.3. Calidad microbiológica……………………………….……………...
1.3.1. Métodos de identificación bacteriana.………………………….
1.3.2. Bacilos entéricos………………………………………………...
1.3.3. Escherichia coli………………………………………………….
1.3.4. Salmonella spp…………………………………………………..
1.3.5. Pseudomona aeruginosa………………………………………..
1.3.6. Staphylococcus aureus………………………………………….
1.3.7. Hongos……………………………………………………………
1.3.7.1. Tipos de Hongos……………………………………………..
1.4. Etnomedicina………………………………………………………..
1.5. Bioseguridad………………………………………………………...
1.6. Medios de cultivo microbiológico…………………………………..
1.6.1. Condiciones generales para el cultivo de microorganismos……
1.6.2. Tipos Básicos de medios de cultivo…………………………….
1.7. Definiciones Operacionales…………………………………………
1.7.1. Variable de estudio………………………………………………
1.7.2. Indicadores……………………………………………………….
1.8. Operacionalizacion de variable……………………………………..
CAPÍTULO II
2. Metodología…...……..……………………...……………………………
2.1. Tipo de Investigación.……………………………………………….
2.2. Diseño de la investigación…………………………………………..
2.3. Población y muestra……………………………...……..................
2.3.1. Población……………………………………….……………......
2.3.2. Muestra………………………………………….……………….
2.3.3. Criterios de inclusión y exclusión………………………………
2.4. Técnicas e instrumentos.
Pág.
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6
2.4.1. Materiales e instrumentos…….…………………………..............
2.5. Procedimiento de Recolección de datos...……………………………
2.5.1. Investigación etnobotánica…………..……………………………
2.6. Investigación de patógenos………………………………….…..........
2.7. Análisis e interpretación de los datos…………………………………
CAPÍTULO III
3. Resultados…………………………………………………………………
4. Discusión...……………………………………………………….…..........
5. Conclusiones…………………………………………….…………...........
6. Recomendaciones……….…………………………..……………………..
7. Bibliografía………………………………………………………………...
8. Anexos……………………………………………………………………..
52
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69
74
INDICE DE TABLAS
TABLA 1. Recuento total más probable por el método en tubos múltiples…
Pág.
55
TABLA 2. Criterio de aceptación para la calidad microbiológica de hongos
y levaduras………………………………………………………………….
56
TABLA 3. Características morfológicas de Staphylococcus aureus en
medio Agar selectivo…………………………………………………….…..
57
TABLA 4. Características morfológicas de Pseudomona aeruginosa en
medio Agar selectivo y de diagnóstico……………………………………….
57
TABLA 5. Características morfológicas de salmonella spp. En medio Agar
selectivo………………………………………………………………………
58
TABLA 6. Características morfológicas de Escherichia coli en medio Agar
MacConkey…………………………………………………………………..
59
TABLA 7. Características de resultados de pruebas bioquímicas para,
Salmonella spp y E. coli……………………………………………………...
60
TABLA 8.Parámetros de límites microbianos según farmacopea USP para
ingredientes y productos botánicos………………………………………….
60
TABLA 9.Determinación de microorganismos aerobios mesófilos en
Cariniana decandra…………………………………………………………………
61
7
TABLA 10. Determinación de hongos y levaduras combinados en
Cariniana decandra………………………………………………………………….
61
TABLA 11. Determinación de hongos y levaduras combinados en
Cariniana decandra…………………………………………………………………
62
TABLA 12. Determinación de Staphylococcus aureus en
Cariniana
decandra………………………………………………………………………………
62
TABLA 13. Determinación de Pseudomona aeruginosa en Cariniana
decandra………………………………………………………………………….......
63
TABLA 14. Determinación de
Salmonella spp. En
Cariniana
decandra……………………………………………………………….....................
TABLA 15. Determinación de
Escherichia coli
en
Cariniana
decandra......................................................................................................
63
64
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1: Determinación de Patógenos: Recuento Total De Aerobios
Mesófilos (NMP).
74
ANEXO 2: Prueba para Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa
75
ANEXO 3: Prueba para determinar la ausencia de Salmonella spp.
75
ANEXO 4: Prueba para determinar la ausencia de Escherichia coli.
76
ANEXO 5: Recuento total combinado de Hongos y Levaduras.
76
ANEXO 6: Pruebas de Identificación para bacterias aisladas en corteza de
77
Cariniana decandra (cinta caspi).
ANEXO 7: Pruebas de Identificación para bacterias aisladas en corteza de
78
Cariniana decandra (cinta caspi).
ANEXO 8: Certificación de la Planta en Investigación.
85
ANEXO 9: Mapa con los puntos de colecta de la especie Cariniana
86
decandra (cinta caspi) en el área de intervención del estudio.
8
INTRODUCCIÓN
La organización mundial de la salud ha mencionado que la medicina tradicional
cumple un papel importante en el mantenimiento y conservación de la salud, así
como en la prevención, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad, en base a
conocimientos teóricos, habilidades y prácticas, creencias y experiencias inherentes a
las diferentes culturas, ya sean explicables o no; por ello ha recomendado introducir
recursos medicinales tradicionales, sobre bases de “seguridad, eficacia y calidad” en
los sistemas de salud, por lo cual requieren desarrollar investigaciones básicas que
permitan disponer del respaldo científico necesario para su uso como recurso
terapéutico o como insumo (1).
Esta investigación contribuye a conocer la calidad microbiológica de la corteza de
Cariniana decandra Ducke (cinta caspi) usada como insumo de bebidas
hidroalcohólicas de uso etnoterapéutico en Loreto, de gran demanda en el mercado
local por sus propiedades curativas. La calidad microbiológica que debe tener un
producto, abarca dos puntos de vista: sanitario y comercial. El aspecto comercial
implica pasos ordenados dentro de la cadena de producción, donde se pueden
presentar inconvenientes que dan como resultado, un producto con características
distintas a las deseadas tanto para el consumidor como para la empresa. La garantía
de esta calidad se basa en el control de la presencia y multiplicación de los
microorganismos en el nicho ecológico peculiar constituido por el sustrato que
proporciona el producto y por el tipo de ambiente en que se conserva o mantiene (2).
En muchos países de Latinoamérica se usan productos de plantas medicinales y
preparaciones fitofarmacéuticas, donde mencionan los criterios establecidos para
determinar la autenticidad, pureza y calidad de las materias primas. Los países de
menor desarrollo, necesitan mayor control sanitario para garantizar que los productos
sean de calidad (3). En el Perú y más aún en la región Loreto la cadena de distribución
y comercialización de plantas de uso medicinal se desarrolla en condiciones poco
sanitarias, los insumos vegetales no pasan por un control de calidad, ya que su
utilización artesanal es empírica, por lo que no hay estudios que garanticen la
9
seguridad, eficacia y calidad
(4)
de los productos preparados a partir de insumos
vegetales.
La población de Loreto utiliza aproximadamente 500 plantas medicinales, 134 de
ellas en forma comercial en el Pasaje Paquito de Iquitos
(5)
. Estas plantas, en forma
desecada contribuyen al cuidado de la salud y a la generación de ingresos
económicos en el poblador amazónico. De estas plantas actualmente son más
utilizadas 19 especies vegetales con valor comercial, el potencial de la
comercialización de plantas medicinales es todavía muy grande, pero el manejo no
adecuado actual de estos recursos naturales puede llevar a una situación crítica (5).
La corteza de Cariniana decandra Ducke (cinta caspi, tahuari) (6), es una especie que
crece en forma silvestre en el bosque primario no inundable, ocasionalmente en
bosques húmedos de “bajial”, sobre suelos casi siempre arcillosos o arcillo arenosos
(7)
, es muy requerida por la población loretana como parte de preparados
hidroalcohólicos como ejemplo: “Levántate lázaro”, “Siete veces sin sacar”.
La norma peruana dada por el Ministerio de Salud, en la Ley 29459, capítulo tres
para insumos vegetales de productos de uso terapéutico denomina entre otros análisis
la determinación de contaminantes microbianos, a fin de establecer la calidad
microbiológica de los insumos vegetales bioactivos (8), por lo que el presente estudio
tuvo como objetivo determinar la calidad microbiológica de la corteza de Cariniana
decandra Ducke (cinta caspi) usada como insumo de bebidas hidroalcohólicas de
uso etnoterapéutico en Loreto.”
10
OBJETIVOS
Objetivo General.
 Determinar la calidad microbiológica de la corteza de Cariniana decandra Ducke
(cinta caspi) usada como insumo de bebidas hidroalcohólicas de uso
etnoterapéutico en Loreto.
Objetivos Específicos.
 Determinar el recuento de microorganismos aerobios mesófilos en la corteza de
la especie de uso medicinal Cariniana decandra Ducke (cinta caspi) en Loreto.
 Determinar la presencia/ausencia de Enterobacterias: Escherichia coli y,
Salmonella spp, en la corteza de la especie de uso medicinal Cariniana decandra
Ducke (cinta caspi) en Loreto.
 Determinar la presencia/ausencia de Pseudomona aeruginosa, en la corteza de la
especie de uso medicinal Cariniana decandra Ducke (cinta caspi) en Loreto.
 Determinar la presencia/ausencia de Staphylococcus aureus en la corteza de la
especie de uso medicinal Cariniana decandra Ducke (cinta caspi) en Loreto.
 Determinar el recuento de levaduras y hongos en la corteza de la especie de uso
medicinal Cariniana decandra Ducke (cinta caspi) en Loreto.
11
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO
1.1 ANTECEDENTES
Los estudios
Cury G, Tomazello M. (2011), realizaron el estudio morfoanatómica y la correcta
identificación de las plantas medicinales de la especie Lecythidaceae y Fabaceae que
son esenciales para el control de calidad de los medicamentos a base de hierbas. En
este trabajo se caracterizó la anatomía de la madera con el fin de identificar seis
especies arbóreas con potencial medicinal. Las muestras de madera fueron extraídos
por el método no destructivo de la corteza de los árboles de las especie estudiadas
que se desarrollan en las áreas de conservación. En el laboratorio se procesaron las
muestras de madera para el análisis microscópico de la madera, aplicando las
metodologías para los estudios de anatomía. Los resultados mostraron que el
parénquima axial fue el parámetro anatómico más eficaz para la distinción de las
especies a través del análisis de su madera (9).
Janovik V, Boligon A, Bandeira B, Athayde M. (2011), determinaron el potencial
antioxidante de Cariniana domestica usando el ensayo de DPPH, se midieron los
fenólicos totales usando Ciocalteau folin y flavonoides totales utilizando cloruro de
aluminio. Se realizó un análisis de HPLC / DAD usando el sistema de gradiente. Las
hojas de C. domestica exhiben alta actividad antioxidante, así como un gran
contenido de compuestos fenólicos y flavonoides. El IC 50 obtenido con el ensayo
DPPH varió de fenoles totales y contenido de flavonoides, la especie C. domestica
exhibió un alto potencial antioxidante, siendo acetato de etilo la fracción más activa.
Varios compuestos fenólicos bioactivos fueron identificados y cuantificados en esta
fracción (10).
Costa D, Alves E, et al. (2011), determinaron la actividad antifúngica de
Anadenanthera colubrina, Artemisia annua, Cariniana estrellensis y Ficus carica
frente al hongo Alternaria alternata que afecta los frutos de tangor murcott, probaron
extractos de plantas a partir de hojas, cortezas, flores y tallos, in vitro e in vivo, que
proporcionan un método alternativo para controlar esta enfermedad cuyo control se
12
basa en fungicidas químicos, los resultados obtenidos indicaron que el extracto más
prometedor se obtuvo de Anadenanthera colubrina, que redujo la enfermedad en las
frutas de tangor murcott a los niveles obtenidos con fungicidas comerciales.
Artemisia annua, Cariniana estrellensis y Ficus carica presentaron moderada
actividad antifúngica in vitro (11).
Santos E, et al. (2010), evaluaron la actividad antiinflamatoria, antinociceptiva y
efectos antipiréticos del extracto metanólico de corteza Cariniana rubra (EMCR)
utilizando animales de experimentación. La actividad antiinflamatoria de EMCR fue
probado en carragenina de rata y el edema de pata inducido por dextrano. Las
actividades antinociceptivos y antipiréticas fueron evaluados utilizando ácido
acético, formalina y pruebas de placa caliente en ratones, así como pirexia inducida
por levadura de cerveza en ratas. El extracto inhibe la carragenina y edema inducido
por dextrano, lo que causa la reducción del volumen de exudado y de la migración de
leucocitos en la pleuresía inducida por carragenina y de la permeabilidad vascular
inducida por el aumento de ácido acético. El EMCR inhibe la nocicepción en el
retorcimiento inducido por ácido acético y en la segunda fase del ensayo de
formalina, y la disminución de la temperatura rectal. Fue, sin embargo, inactivo
contra la nocicepción térmica. Se puede presumir que EMCR causó su efecto
mediante la inhibición de la liberación y / o acción de mediadores inflamatorios
diferentes (12).
Cruz P. (2009), realizó el estudio de control de calidad microbiológico del gel
antimicótico de Matricaria chamomilla (Manzanilla), Aristiguietia glutinosa
(Matico) y Ambrosia arborescens (Marco), nos indican que utilizaron los métodos
microbiológicos establecidos por la USP 28, dando como resultado para el recuento
total de mesófilos aeróbicos, levaduras y hongos ningún tipo de crecimiento
microbiológico en el producto (13).
Inchaustegui R, et al (2008), evaluaron la eficacia del extracto acuoso liofilizado
de la corteza de Cariniana decandra Ducke (cachimbo) bajo el sistema terapéutico
de fitomedicamentos en microdosis, vía intramuscular. El estudio comparó dos tipos
de tratamiento: 1 convencional constituido por fármacos bronco dilatadores beta
13
adrenérgicos y esteroides; 2, fitoterapéutico, constituido por el extracto acuoso
liofilizado de la corteza de Cariniana decandra Ducke (cachimbo). La eficacia
clínica se evaluó por el número de episodios de crisis asmática que presentaron los
pacientes durante y al final del tratamiento. Se ingresaron un total de 40 voluntarios,
agrupados en dos tratamientos: convencional (20 sujetos) y fitoterapéutico (20
sujetos). El tiempo de evaluación de la eficacia fue de 30 días posteriores a la
aplicación de la primera dosis de los tratamientos. Conclusión. El tratamiento
fitoterapéutico demostró superior eficacia frente al tratamiento convencional, al
disminuir el número de los episodios de crisis asmática (14).
Scott A, Chi-Hua T, Chi-Chih W, Bodil C, Arne A (2007), confirmaron que la
Lecythidaceae comprende una familia pantropical mejor conocido por las semillas
comestibles de la castaña (Bertholletia excelsa) y el árbol bala de cañón (Couroupita
guianensis), que se planta como una curiosidad botánica en jardines subtropicales y
tropicales. En Además, las especies de la familia son a menudo entre los más
comunes en los bosques neotropicales, especialmente en la cuenca del Amazonas,
pero concluyen que Cariniana, Lecythis y Eschweilera no son monoyphyletic.
Debido a que la posición de la monotípico Bertholletia excelsa en relación con los
otros géneros zygomorphic (15).
Ramalho P. (2003), confirmó que las utilidades de la Cariniana estrellensis de uso
terapéutico son numerosos, incluyendo en la medicina popular en forma de té, es un
poderoso astringente desinfectante y tiene gran poder y por lo tanto se recomienda
para las inflamaciones de las mucosas y faringitis. También es útil en el tratamiento
de la diarrea, dolor de garganta y lavados vaginales (16).
Nina E. (2001), realizó el tamizaje fitoquímico de la corteza de Cariniana decandra,
lo cual evidencio la presencia de los siguientes metabolitos secundarios: alcaloides,
cumarinas, azúcares reductores, saponinas, fenoles y taninos, flavonoides, principios
amargos y astringentes, además de glicósidos (17).
Nonato L, Ríos F. (2001), realizaron estudios farmacológicos y toxicológicos de la
corteza de Cariniana decandra en ratones albinos machos y hembras, inoculando el
extracto liofilizado de esta corteza, obtuvieron una DL50 mayor a 2000 mgkg-1;
14
aplicando 100 mgkg-1 del liofilizado durante 30 días, se incrementó los niveles de
creatinina, fosfatasa alcalina y linfocitos, manteniéndose normales los niveles de
glucosa, colesterol, triglicéridos y hematocrito respecto al basal (18).
Cerruti T. (2001), determino las principales características anatómicas de la
Cariniana decandra que está definido por una conformación arbórea alcanzando
más de 40m de altura; hojas simples alternas; inflorescencia con flores sésiles de
corola amarillenta; frutos pixidios con opérculos cónicos y semillas aladas (19).
Babilonia C. (2001), realizó el estudio de control de calidad microbiológico del
tahuari y capirona, analizando contaminantes como mohos, levaduras, hongos y
bacterias, en los resultados hay presencia de estos contaminantes en la raíz y tallo de
tahuari y hojas de capirona. Sin embargo afirma que se encuentran dentro del rango
permisible aceptado por la Organización Mundial de la salud para el consumo
humano (20).
Betancourt J, Ríos F, Inchaustegui R, Nina E, Cerruti T, Villacrés J. (2000),
determinaron el potencial genotóxico del extracto acuoso liofilizado de las plantas
medicinales de la amazonia peruana (Mutingia calabura, Dioscorea bulbifera,
Uncaria tomentosa, Dracontium loretense, Mansoa alliacea, Cariniana decandra, y
Bixa orellana), por medio de los ensayos in vivo (inducción de micronúcleos en
medula ósea de ratón y anomalías de la cabeza del espermatozoides de ratón),
administrándose los extractos por vía oral. Los resultados mostraron ausencia de
citoxicidad y de genotoxicidad de los extractos evaluados en el ensayo de inducción
de micronúcleos en medula ósea de ratón Dioscorea bulbifera, Mansoa alliacea,
Cariniana decandra mostraron disminución significativa del porcentaje de micro
núcleos en los eritrocitos policromáticos, como indicadora de una posible actividad
antimutagenica, los extractos evaluados en el ensayo de cellas germinales no
mostraron actividad citotóxica ni genotóxica (21).
Ramírez L. (1999), realizó el estudio de control de calidad microbiológico de
Aspidosperma nitidum Benth “remo caspi” y Kclusia rosea Jacq. “renaquilla”.
Analizando contaminantes como mohos, levaduras, hongos y bacterias, en los
15
resultados
no se ha podido observar infestación alguna en la obtención de
extractivos por el método de maceración en solución hidroalcohólicas (22).
1.2. MARCO CONCEPTUAL.
1.2.1 CLASIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE.
Cariniana decandra Ducke (cinta caspi)
Reino
Plantae
División
Magnoliophyta
Clase
Magnoliopsida
Orden
Ericales
Familia
Lecythidaceae
Género
Cariniana
Especie
decandra
Nombre Científico
Cariniana decandra Ducke
Nombres comunes: cinta caspi, papelillo caspi, cachimbo, cachimbo caspi,
cerú, tahuari (6,7).
a)
Descripción botánica:
Árbol dominante; altura total 35 m.; altura comercial 25 m. y Dap 0.80 m.
Base tenuemente abultada. Fuste recto, cilíndrico, algunas veces de
sección cuadrada; corteza externa levemente fisurada, ritidoma leñoso,
desprendible en placas rectangulares; la corteza interna se desprende en
láminas largas y delgadas. Ramita terminal orbicular; hojas simples y
alternas. Inflorescencia: panículas terminales. Fruto: pixidio alargado en
forma de cachimbo. Semillas pequeñas con prolongación membranosa (7).
b) Distribución:
Esta especie crece en la amazonía de Perú y Brasil. En el Perú se le
encuentra en el Departamento de Loreto (7).
16
c)
Datos ambientales:
Bosque primario no inundable, ocasionalmente en bosques húmedos de
“bajial”, sobre suelos casi siempre arcillosos o arcillo arenosos, de
topografía plana a ondulada (7).
d) Compuestos presentes:
Alcaloides, cumarinas, azúcares reductores, saponinas, fenoles y taninos,
flavonoides, principios amargos y astringentes, además de glicósidos (17).
e) Usos y propiedades terapéuticas:
Tiene propiedades Asmáticas, antimutagenica, antifúngica, astringente,
antiinflamatoria y es usado en caso de diarreas (11, 12, 14, 16).
1.3. CALIDAD MICROBIOLÓGICA.
La calidad microbiológica es un elemento de evaluación de la satisfacción de
los requisitos microbiológicos que debe tener un producto, tanto desde el punto
de vista sanitario como comercial. Para alcanzar la calidad microbiológica es
necesario aplicar pasos ordenados a través de la cadena de producción. A lo
largo de esa cadena pueden presentar inconvenientes que pueden llevar a
obtener un producto que tengan características muy distintas a las esperadas.
Por esa razón, para garantizar la calidad es importante tener en cuenta que este
se basara en el control de la presencia y multiplicación de los microorganismos
ya que factores como el sustrato proporcionado como el producto, el tipo de
ambiente, temperatura, humedad relativa entre oros pueden ocasionar su
presencia (2).
1.3.1. Métodos de identificación bacteriana.
Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos
convencionales, basados en las características fenotípicas, puesto que su
realización y coste los hace más asequibles. Los métodos genotípicos suelen
reservarse para las bacterias que no se pueden identificar con métodos
convencionales. Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica
bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como su
morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas. El cultivo,
17
cuando es factible, continua siendo el método diagnóstico de elección; permite
el aislamiento del microorganismo implicado, su identificación, el estudio de
sensibilidad a los antimicrobianos y facilita la aplicación de marcadores
epidemiológicos. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de
crecimiento y las condiciones de incubación. En el proceso de identificación
bacteriana tradicional, la experiencia del microbiólogo es fundamental para la
elección de una prueba o varias pruebas de forma secuencial, en función de la
fiabilidad de las mismas, del género o de la especie bacteriana que se pretende
identificar, del origen del aislado bacteriano, así como del coste de las mismas.
Los laboratorios deben elaborar y realizar un proceso de identificación
normalizado en su actividad diaria, que utilice de forma secuencial o
simultánea un conjunto de pruebas cuyo propósito final sea la identificación
del microorganismo a nivel de género y especie y que incluya la mayoría de las
bacterias desde el punto de vista infeccioso (23).
1.3.1.1. Identificación.
a) Características microscópicas: El estudio microscópico en fresco y
tras tinción revela la forma, la manera de agruparse, la estructura de
las células y su tamaño. Las tinciones son el primer paso, y
ocasionalmente el único, para la identificación bacteriana. Las
tinciones más utilizadas e imprescindibles son la del azul de metileno
y la de Gram. La tinción de Gram es, a menudo, la primera y única
herramienta de la que nos servimos para hacer un diagnóstico
provisional en el proceso de identificación de la mayoría de las
bacterias teniendo en cuenta también el tipo de muestra y el
diagnóstico presuntivo del proceso infeccioso (23).
b) Características macroscópicas: La morfología de las colonias es
fundamental en la identificación preliminar y para la diferenciación de
los microorganismos. Para la observación morfológica es preferible
examinar colonias de cultivos frescos crecidas en medios no
selectivos. En este paso de la identificación es muy importante el
18
aislamiento de las bacterias en cultivo puro ya que esta deberá estar
compuesta por un solo tipo de microorganismos y procederá de una
única célula. Las colonias de una única especie, cuando crecen en
medios específicos y bajo condiciones idóneas se describen por sus
características de tamaño, forma, consistencia, y a veces por su color.
El tamaño de las colonias bacterianas es generalmente uniforme entre
una misma especie. Por ejemplo, las colonias de estreptococos tienen
un tamaño más pequeño que las de los estafilococos y las
enterobacterias. La forma está determinada por los bordes y el grosor
de la colonia. El borde puede ser liso o rugoso e irregular; la colonia,
abultada o plana. La textura de la colonia es también importante.
Puede variar desde seca a viscosa, con superficie lisa o granular.
Algunos microorganismos producen una colonia pigmentada, lo que
puede ser de ayuda en el proceso de identificación (ejemplo:
Pseudomonas aeruginosa (pigmento verde), Serratia marcescens
(pigmento rojo) aunque en una misma especie puede haber cepas no
pigmentadas (23).
c) Hemolisis. Algunas bacterias producen hemolisinas que causan la lisis
de los hematíes en medios que contienen sangre. Esta hemolisis puede
ser beta (zona clara alrededor de la colonia) o alfa (halo de color
verdoso alrededor de la colonia) (23).
1.3.2. Bacilos entéricos.
La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogéneo de
bacterias gramnegativas. Reciben su nombre por la localización habitual como
saprofitos en el tubo digestivo, aunque se trata de gérmenes ubicuos,
encontrándose de forma universal en el suelo, el agua y la vegetación, así como
formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales además del
hombre (24).
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son microorganismos con forma
de bastón, por lo general de 1-3 μm de largo y 0,5 μm de diámetro (24).
19
Se caracterizan, desde el punto de vista microbiológico por ser bacterias no
esporulados con crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis ósea, son anaerobios
facultativos; que reducen los nitratos a nitritos salvo algunas excepciones; que
fermentan la glucosa con o sin formación de gas; muestran negatividad a la
prueba de la oxidasa; no aumenta su crecimiento en un medio hipertónico y
pueden ser móviles, dependiendo de la presencia o no de flagelos perítricos, o
inmóviles. Son organismos gram negativos que poseen una membrana interna
(citoplasmática), una cubierta de peptidoglicano que la rodea, y una compleja
membrana externa (pared celular) que comprende la cápsula y que contiene
lipopolisacáridos y porinas (canales para la penetración de antibióticos y
nutrientes). Poseen además una serie de factores de virulencia que son esenciales
para la producción de los diferentes síndromes clínicos (24).
La familia Enterobacteriaceae consta de varios géneros: Escherichia, Shigella,
Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Morganella, Providencia,
Salmonella, Yersinia, Edwardsiella, Citrobacter (25).
1.3.3. Escherichia coli:
Escherichia coli es el microorganismo de vida libre que mejor se ha estudiado.
Estas bacterias pueden ser móviles (la mayoría) o inmóviles, la mayor parte de
ellas fermentan la lactosa y son capaces de producir indol a partir de triptófano
(24)
.
Clasificación:
a) Escherichia coli enterotoxígeno.
Es una de las causas más frecuentes de deshidratación por diarrea en
niños de menos de dos años y es la principal causa de la diarrea del
viajero, que en general se desarrolla en un individuo por lo demás sano
proveniente de un país industrializado que visita regiones tropicales o
subtropicales caracterizadas por condiciones de higiene deficientes. En
general, los síntomas tienden a ser leves, con diarrea acuosa.
Ocasionalmente los síntomas pueden ser más graves, con fiebre,
escalofríos y vómitos. La entero toxina estimula la secreción masiva de
20
líquido por las células mucosas. Se supone que la ausencia de
gastroenteritis entre los residentes adultos de áreas asociadas a la diarrea
del viajero se debe a su exposición previa a estos antígenos de
colonización y al desarrollo de una inmunidad humoral apropiada (24).
b) Escherichia coli enteropatógeno.
Es una causa importante de diarrea en neonatos en los países
subdesarrollados, causando enfermedad muy raramente en adultos en el
mundo desarrollado. Producen una lesión típica en la mucosa, con la
formación de microcolonias y la pérdida de las microvellosidades
adyacentes. La patogenia incluye tres pasos: a) adherencia de los
microorganismos a los enterocitos; b) inducción de una señal de
transducción en los enterocitos y c) desarrollo de adherencia íntima con
los enterocitos. Clínicamente se caracteriza por producir diarrea acuosa
con más o menos fiebre o vómitos. El diagnóstico de infecciones por E.
coli entero patógena (ECEP) radica en la detección de los genes
codificadores de los factores de virulencia específicos mediante el uso de
sondas de ADN o PCR. Para su prevención son diversos los estudios que
han demostrado el importante papel de la lactancia materna en los
primeros seis meses de vida (24).
c) Escherichia coli enterohemorrágica y otras cepas de Escherichia coli
productoras de toxina Shiga.
Estas cepas producen toxinas de tipo Shiga (también denominadas vero
toxinas) que consisten en citotoxinas que inducen la muerte de la célula
huésped. Las cepas que producen toxinas Shiga pueden causar enfermedad
de grado variable como diarrea acuosa, diarrea sanguinolenta, colitis
hemorrágica, síndrome hemolítico urémico (SHU) y muerte. Entre las
cepas de E. coli que generan toxinas Shiga (ECTS), aquellas que
comparten con las cepas de ECEP la capacidad para provocar el efecto de
fijación y borramiento codificado por la isla de patogenicidad LEE se
conocen como E. coli entero hemorrágicas (ECEH). Las cepas de ECEH,
sobre todo las que pertenecen al serotipo O157:H7, han sido responsables
21
de grandes brotes de infección con tasas más elevadas de complicaciones.
La ausencia frecuente de fiebre y la aparición de hematoquecia franca
pueden hacer que se consideren diagnósticos no infecciosos como la
enfermedad inflamatoria intestinal. El SHU es una complicación grave que
se ha descrito asociada con algunos brotes de estas cepas (serotipo
O157:H7), apareciendo en un 5-10% de personas durante los brotes de
ECEH (24).
d) Escherichia coli enteroagregativo.
Debe su nombre a la capacidad para agregarse en el cultivo en medio
celular. Puede considerarse una verdadera infección emergente. Los
estudios han relacionado las cepas de E. coli enteroagregativa (ECEA)
con diarrea aguda y crónica en los países en vías de desarrollo y diarrea
aguda en países desarrollados. Se ha descrito de forma excepcional como
causa de diarrea del viajero y, con mayor frecuencia, de diarrea
persistente en sujetos infectados por el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH). La confirmación diagnóstica requiere que se realicen
ensayos de adhesión en cultivos tisulares. Es difícil asegurar que una cepa
de ECEA aislada en un paciente con diarrea sea la causa del cuadro,
porque también se encuentran en pacientes asintomáticos (24).
1.3.4. Salmonella spp.
Salmonella, en el ámbito mundial, está asociada con mucha frecuencia a las
enfermedades diarreicas, las cuales continúan siendo una de las causas más
importantes de morbilidad y mortalidad sobre todo en lactantes, niños y
ancianos. Se ha estimado que en Asia, África y Latinoamérica, dependiendo de
factores socioeconómicos y nutricionales, la probabilidad de que un niño
muera por enfermedad diarreica antes de los 7 años pueda llegar al 50% (26).
a) Morfología.
Los microorganismos del género Salmonella son bacilos, Gram negativos,
anaerobios facultativos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Su
tamaño oscila de 0,3 a 1 um x 1,0 a 6,0 um. Son móviles debido a la
22
presencia de flagelos perítricos, a excepción de S. gallinarum y S.
pullorum. Salmonella (26).
b) Clasificación:
Se describen dos especies: S. entérica y S. bongori, donde la primera a su
vez se subdivide en seis subespecies: entérica, salamae, arizonae,
diarizonea, houtenae e indica; Salmonella entérica subespecie entérica
representa 99% de los serotipos aislados, siendo estos últimos
determinados por los antígenos somáticos (O), flagelares (H) y capsulares
o de superficie (Vi). Es así como se describen más de 2500 serotipos o
serovares de este género (Ejemplo: Salmonella entérica subespecie
entérica serotipo enteritidis o su abreviatura científicamente aceptada,
Salmonella enteritidis) (27).
c) Modo de trasmisión:
La vía de transmisión es la fecal-oral, a través de aguas contaminadas no
higienizadas, alimentos manipulados por portadores, ingestión de
crustáceos contaminados o vegetales regados con aguas contaminadas
(27)
.
d) Sintomatología clínica:
La salmonelosis se presenta en términos generales, dentro de dos
espectros clínicos: el primero, la fiebre entérica más conocida como fiebre
tifoidea, caracterizada por ser un cuadro febril sistémico cuyos agentes
etiológicos son S. typhi y S. paratyphi. A los 10 días de evolución de la
enfermedad pueden aparecer hemorragias y perforación intestinal. El
segundo, la gastroenteritis, caracterizada por síntomas como dolor
abdominal, malestar general, vómito, diarrea y en algunos casos fiebre,
frecuentemente relacionado a previo consumo de alimentos contaminados
de origen animal, es importante tener en cuenta que en los pacientes
adultos inmunocomprometidos con infección por Salmonella no tifoidea,
existe mayor mortalidad relacionada con bacteriemia recurrente (28).
23
1.3.5. Pseudomona aeruginosa
Constituye uno de los microorganismos más importantes y problemáticos en
las bacteriemias por gramnegativos, causante del 10% a 20% de ellas. Se
presenta con más frecuencia en pacientes inmunodeprimidos con largos
periodos de hospitalización, sometidos a diversas manipulaciones, con
antecedentes de infecciones graves y uso previo de antibióticos de amplio
espectro. Produce una mortalidad del 30% al 40%, fundamentalmente en las
primeras 24 a 48 horas de su inicio, sobre todo en relación con el foco
pulmonar y el tratamiento antimicrobiano inadecuado (29).
a) Identificación:
Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, no fermentador,
que se comporta básicamente como un patógeno nosocomial oportunista.
Sus mínimos requerimientos nutricionales, su tolerancia a una amplia
variedad de condiciones físicas y su resistencia intrínseca a un gran
número de antibióticos, explican su papel ecológico como un importante y
eficaz patógeno intrahospitalario. Aunque se ha detectado como parte de
la flora normal corporal, rara vez causa enfermedad en individuos sanos
(30)
.
b) Patogenia:
En la mayoría de los casos, la infección comienza con alguna alteración
de los mecanismos de defensa del huésped; esto puede involucrar la
disrupción en la integridad de barreras físicas como catéteres urinarios,
catéteres
intravenosos,
quemaduras
extensas
de
piel
o
tubos
endotraqueales que facilitan la colonización bacteriana. Por otro lado,
hay otras situaciones específicas del huésped que comprometen los
mecanismos de defensa específicos, tales como la neutropenia, la
inmunosupresión iatrogénica o adquirida y las patologías que cursan con
deterioro del sistema inmunológico como cáncer, desnutrición y diabetes,
que también son factores de riesgo para la infección (30).
24
c) Manifestaciones clínicas:
Puede provocar infecciones graves como: neumonía, infecciones del
tracto urinario y bacteriemia. Estas infecciones suelen ser difíciles de
tratar debido a la resistencia intrínseca que presenta P. aeruginosa y a su
extraordinaria capacidad de adquirir mecanismos de resistencia (31).
1.3.6. Staphylococcus aureus
Son cocos Gram positivos, catalasa positiva y el diamino ácido en el
peptidoglicano es la L-lisina; posee numerosos factores de virulencia, puede
convivir con el huésped humano formando parte de su flora normal sin causar
ningún daño, pueden ser de forma endógena (32).
a) Morfología
Se trata de cocos Gram positivos que poseen tendencia a agruparse en
racimos. Tienen una forma esférica y un diámetro de alrededor de una
micra (32).
b) Patogenia
S. aureus produce infecciones de dos maneras:
1. En forma directa, por invasión y posterior destrucción tisular local
(proceso supurado), o luego de haberse diseminado por vía sanguínea (32).
2. A través de efectos de toxinas (32).

Infecciones por invasión: Este tipo de infecciones puede estar
producido tanto por cepas de S. aureus residentes como no residentes.
El primer paso de la infección es la adherencia y colonización de las
células del huésped. Se describen tres tipos de adherencia. Por un
lado, la adherencia a las células de la mucosa nasal mediada por los
ácidos teicoicos y también es importante la adherencia a la mucina de
la mucosa nasofaríngea. Por otro, la adherencia a piel traumatizada o
pequeñas disrupciones de piel, así como también a objetos extraños y
estructuras subendoteliales. Además de infecciones de piel y partes
25
blandas, S. aureus puede producir infecciones invasivas como
neumonía, osteomielitis, bursitis, artritis y otras (32).

Infecciones por acción de toxinas: Estas infecciones están causadas
por la liberación al medio de sustancias tóxicas, que pueden ejercer su
acción a cierta distancia del foco infeccioso (32).

Síndrome de piel escaldada: se debe a la producción de la toxina
exfoliativa en un foco, que luego pasa al torrente sanguíneo, pudiendo
diseminarse hasta regiones alejadas del foco donde no es posible aislar
ningún germen. Esta toxina produce la formación de ampollas y la
subsiguiente descamación de láminas epidérmicas, que puede estar
localizada en una región o estar diseminada por todo el cuerpo. Se
presenta con mayor frecuencia en recién nacidos y niños pequeños (31).

Síndrome del shock tóxico: es un cuadro grave que en el pasado se ha
observado asociado a la utilización de tampones vaginales por parte
de mujeres jóvenes. El microorganismo prolifera en el tampón
contaminado y produce la toxina del shock tóxico. El cuadro clínico
está caracterizado por fiebre, hipotensión, exantema cutáneo en manos
y pies, grados variables de vómitos, diarrea, falla renal, cefalea y
conjuntivitis. Evoluciona al shock grave en 48 horas. También se
asocia a heridas traumáticas o quirúrgicas (32).

Intoxicaciones alimentarias: se producen por la contaminación de
alimentos, que suelen ser de elevado contenido en proteínas e hidratos
de carbono como pasteles, helados y salsas, y con pH superior a 5, que
permitirán un rápido crecimiento bacteriano. La mala refrigeración y
conservación hacen que el microorganismo prolifere, y si es una cepa
productora de enterotoxina termoestable, la libera en cantidad
suficiente como para producir intoxicación. El tiempo de incubación
es corto (1 a 6 horas) y los síntomas son vómitos y diarrea de hasta 2
26
días de duración, en general sin fiebre, siendo normalmente de rápida
recuperación. Este proceso sólo requiere hidratación y no necesita de
tratamiento antibiótico (32).
1.3.7. Hongos.
Son microorganismos eucarióticos que pueden ser tanto unicelulares como
pluricelulares,
y cuyas células se asocian formando cuerpos filamentosos
llamados hifas; el conjunto de estas hifas se denomina micelio. En la asociación
de estos filamentos a veces se producen falsos tejidos. Los hongos, al carecer de
clorofila, no realizan la fotosíntesis, por lo cual su alimentación es heterótrofa.
La nutrición la realizan de la siguiente forma: Segregan al exterior enzimas
digestivas y una vez digeridos, los alimentos son absorbidos (digestión externa).
Los hongos se clasifican en tres grupos dependiendo del tipo de alimento que
consuman:
 Saprófitos: se encargan de descomponer la materia orgánica.
 Parásitos: se alimentan de los líquidos del interior de otro ser vivo.
 Simbiontes: se asocian con otros seres vivos para favorecerse
mutuamente (33).
También podemos clasificar los hongos según el tipo de hifas y de esporas:
a) Ficomicetes u hongos inferiores: Presentan hifas sin membranas
plasmáticas que separan sus células. Por ejemplo moho del pan Ascomicetos: Es el grupo más amplio que forman los hongos.
Presentan hifas (septadas) con membranas plasmáticas que separan
sus células. Sus esporas se forman en el interior de células especiales
denominadas ascas, o formando conidios. Pueden ser unicelulares
como las levaduras o pluricelulares como el Penicillium que es el
productor de la "penicilina" (33).
b) Basidiomicetos: Son hongos pluricelulares. Presentan hifas septadas
y sus esporas se forman en el exterior de unas células especiales
denominadas basidios. Las setas que derivan de estas esporas pueden
ser comestibles, como el champiñón o setas venenosas como la
canaleja o el boleto de Satanás (33).
27
1.3.7.1 Tipos de hongos:
a) Levaduras: En microbiología se llama levadura a “todos los hongos con
predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida”. De esta forma, las
levaduras son hongos unicelulares microscópicos y filamentosos, que pueden
aparecer aislados o unidos unos a otros formando pequeñas cadenas o
filamentos.
Las levaduras son organismos anaerobios facultativos; en
presencia de oxígeno, estos organismos son capaces de transformar los
azúcares en dióxido de carbono, agua, cierta cantidad de levadura y energía,
creciendo rápidamente (respiración). En cambio, en ausencia de oxígeno,
estos organismos son capaces de transformar los azúcares en dióxido de
carbono y alcohol, obteniendo energía y creciendo lentamente (fermentación).
En cuanto a la reproducción de las levaduras, puede ser sexual, por gemación,
o asexual, por ascosporas. Muchas levaduras siguen un ciclo de reproducción
en el cual se van alternando los tipos de reproducción: dos células haploides,
que actúan como lamentos se unen creando una célula diploide, la cual es
capaz, por mitosis, de reproducirse creando individuos genéticamente iguales
a ella. En determinadas condiciones, una de estas células diploides, por
meiosis, origina células haploides, que actuarán de nuevo como gametos (de
cada célula diploide se obtienen cuatro gametos), cerrando el ciclo. Las
levaduras que no son capaces de recorrer el ciclo completo pertenecen al
género Cándida (33).
Se tiene constancia del uso de las levaduras desde el año 10000 a.C, cuando
se utilizaban para elaborar vinos. De aquella fecha en adelante, muchas
civilizaciones han utilizado estos microorganismos para elaborar productos
alimenticios, pan, vino, cerveza, productos de gastronomía. En la actualidad
existen algunos productos que sustituyen a la levadura biológica, como es la
levadura química, que nos proporciona resultados de forma más inmediata,
aunque la levadura biológica se sigue utilizando (33).
b) Hongos mucosos: Este grupo abarca a una serie de microorganismos
pertenecientes a los protoctistas y que a pesar de ser hongos comparten una
28
serie de características con los protozoos. Durante su vida se presentan de
distinta forma: Al principio como amebas, después como masas gelatinosas y
por último con un cuerpo fructífero. Se alimentan de materia en
descomposición o de bacterias y otros microorganismos mediante fagocitosis.
Los hongos mucosos pueden clasificarse en dos grupos principales: Los
acelulares
(Myxogastrea),
que
no
se
presentan
formando
células
independientes sino más bien una masa celular con un gran número de
núcleos rodeados por una membrana externa. Los celulares (Dyctiostelia)
formando organismos independientes que solo se unen bajo condiciones
adversas (33).
c) Setas: se les llama setas a los cuerpos fructíferos de unos hongos
pluricelulares
filamentosos,
los
hongos
pertenecientes
al
grupo
Basidiomycetes. Estos hongos producen unas esporas sexuales haploides que
crecen en forma de micelio en un ambiente adecuado, pero no producirán
cuerpos fructíferos hasta que no se les unan otros micelios haploides. Cuando
dos micelios haploides se unen, crecen formando una hifa diploide
dicariótica, y aparecen los cuerpos fructíferos o setas (33).
d) Hongos filamentosos: Los hongos filamentosos también son llamados
micelares y representan el más típico crecimiento de los hongos
microscópicos. Son los típicos mohos que suelen aparecer en las frutas,
queso, pan viejo y en medios de cultivo sólidos.
Estos hongos forman
colonias algodonosas o pulvurentas muy características. Forman filamentos
que se denominan hifas que se entrecruzan desordenadamente dando lugar a
estructuras más complejas denominadas micelio. En otros hongos las hifas se
entrecruzan con una cierta organización pero nunca llegar a formar una
estructura compacta (33).
Los hongos filamentosos se dividen en inferiores y superiores según las
características de sus hifas: Los hongos inferiores están formados por hifas
29
anchas (5-10 µm) y forman mohos mientras que los hongos superiores están
formados por hifas finas (0.5-5 µm ) y forman además de mohos las setas que
tienen tamaño macroscópico y pueden ser venenosas o comestibles. A partir
de estos micelios algunas hifas formarán conidios que son las hifas aéreas.
Los conidios son esporas asexuales de fuertes pigmentos como negro, marrón
o amarillo. Estas esporas germinan para dar nuevas hifas. Los hongos
filamentosos son los responsables de muchas alergias además de contaminar
muchos alimentos (33).
1.4. Etnomedicina.
La etnomedicina como disciplina del conocimiento científico, está basada, en la
relación interactiva del ser humano con las plantas, adquiriendo saberes que va
acumulando en el trascurso del tiempo, sin dejar de considerar su relación con el
medio ambiente, en el caso particular de la Amazonía peruana, estos elementos
han evolucionado en un contexto de aprendizaje y desarrollo vivencial, causado
por la cultura, cosmovisión y necesidades propias de su subsistencia (34).
Tenemos como ejemplo lo que ocurre en la sociedad amazónica y peruana en
general, hasta la fecha, primera década del siglo XXI, aún mantiene vivo el
conocimiento tradicional, referido al uso de las plantas medicinales, muy
arraigado y aplicado en los pueblos indígenas, así como en la sociedad mestiza.
Durante los últimos 70 años, los científicos del mundo han retomado su interés
en los recursos naturales y la población mundial ha incrementado su utilización
(34)
.
En el Perú poseemos especies vegetales amazónicas que han sido estudiadas
tanto por investigadores peruanos como extranjeros, contribuyendo al
incremento de los conocimientos científicos, tecnológicos e industriales en
aplicación a nuestra gran riqueza vegetal (34).
El uso de plantas medicinales para aliviar o sanar ciertas afecciones, ha sido
importante porque: Es una práctica tradicional, que destaca en las poblaciones de
bajos recursos económicos inicialmente, pero ahora con las características de ser
muy útiles ha dejado de ser una moda para ser una
opción
de
salud,
30
permite un acercamiento entre el paciente su médico y su familia, tiene bajos
costos, permite que se valide a nuestros ancestros que nos trasmitieron sus
conocimientos y dejaron como legado sus prácticas, legitimando el
conocimiento tradicional, muchas veces es hereditaria y permite involucrar a la
sociedad en su conjunto en las prácticas (34).
El conocimiento tradicional amazónico, es transmitido de generación a
generación a hombres y mujeres de la Amazonía, al igual que de otras regiones
del mundo, que han acumulado saberes para curarse. La historia de nuestras
plantas medicinales no sería tal, sin la participación, manejo y usos de sus
pobladores. Es conocido que ciertas especies amazónicas han sido utilizadas
desde hace siglos así tenemos por ejemplo, que: En las expediciones del siglo
XVIII, sobresale el viaje del científico alemán Alexander von Humboldt y del
botánico Aimée Bonpland, quienes realizaron un viaje a América del Sur, a la
zona de confluencia de las cuencas del río Orinoco y Amazonas en el año 1800,
donde hicieron observaciones acerca del uso que daban los indígenas al achiote
(34)
.
1.5. Bioseguridad.
Los profesionales del laboratorio están expuestos a una variedad de riesgos a su
salud relacionados con su trabajo. Como ejemplo, se encuentran aquéllos
derivados del manejo de material infeccioso, radiación, compuestos tóxicos y
químicos e inflamables. En el caso particular del material biológico-infeccioso,
el peligro surge de la posibilidad de exponerse a agentes patógenos e infectarse
por dicha exposición. En laboratorios de diagnóstico clínico, de investigación,
industriales, de patología clínica, de producción de biológicos, de enseñanza, u
otros donde se lleguen a manejar patógenos aislados o muestras que los
contengan, los profesionales del laboratorio debemos prestar especial cuidado en
las medidas que tomamos para prevenir un accidente (35).
1.5.1 Identificación de los grupos de riesgo
a) Grupo de riesgo 1 (GR1): Agentes no asociados con enfermedades en
humanos adultos saludables ni en animales (nulo o bajo riesgo al individuo
31
o la comunidad). Ejemplo: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ciertas
cepas de Escherichia coli (35).
b) Grupo de riesgo 2 (GR2): Agentes asociados con enfermedades
humanas raramente serias para las cuales siempre hay medidas preventivas
y/o terapéuticas disponibles. El riesgo de diseminación de la infección es
limitado (riesgo individual moderado, bajo riesgo a la comunidad).
Ejemplo:
Campylobacter
jejuni,
Helicobacter
pylori,
Neisseria
gonorrhoeae, Blastomyces dermatitidis, Coccidia, Toxoplasma gondii,
Adenovirus, Papovavirus (35).
c) Grupo de riesgo 3 (GR3): Agentes asociados con enfermedades
humanas serias o letales para las cuales podrían estar disponibles medidas
preventivas y/o terapéuticas. El contagio entre individuos infectados es
poco común (alto riesgo individual, bajo riesgo a la comunidad). Ejemplo:
Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis, VIH, virus de la fiebre
amarilla, virus del oeste del Nilo, bacterias multirresistentes como
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y Streptococcus
pyogenes resistente a eritromicina (SPRE) (35).
d) Grupo de riesgo 4 (GR4): Agentes causantes de enfermedades humanas
serias o letales para las cuales no hay medidas preventivas y/o terapéuticas
disponibles. El contagio entre individuos infectados se da fácilmente (alto
riesgo individual, alto riesgo a la comunidad). Ejemplo: virus del Ébola,
Marburg, Lassa (35).
1.5.2 Niveles de bioseguridad en los laboratorios
A partir de la definición de los grupos de riesgo se generó la clasificación
de los laboratorios en cuatro niveles de bioseguridad en función de (i) la
infectividad del patógeno, (ii) la severidad de la enfermedad causada, (iii)
el grado de transmisibilidad, (iv) el origen del agente (exótico o no) y, (v)
la naturaleza del trabajo llevado a cabo en el inmueble (35).
32
Cada nivel de bioseguridad refleja el tipo de prácticas microbiológicas, el
tipo de equipo y las medidas de seguridad tomadas en ese laboratorio en
particular. En general, se procura lograr un ambiente de trabajo seguro
para el personal y para las personas ajenas al laboratorio, incluyendo las
que se encuentran fuera de las instalaciones (35).
De acuerdo al CDC, los cuatro niveles de bioseguridad son los siguientes:
a) Nivel 1 (BSL-1): prácticas, equipo y medidas adecuadas para el nivel de
enseñanza. El trabajo se realiza con cepas definidas y caracterizadas de
microorganismos que no causen enfermedad en humanos adultos sanos.
No se necesita el uso de equipo especial de protección, con el equipo
básico es suficiente (35).
b) Nivel 2 (BSL-2): prácticas, equipo y medidas adecuadas para
laboratorios de análisis, diagnóstico o patología clínica donde se manejen
microorganismos de riesgo moderado que están presentes en la comunidad
y se encuentran asociados a enfermedades humanas de severidad variable
(35)
.
c) Nivel 3 (BSL-3): prácticas, equipo y medidas adecuadas para
laboratorios de análisis/diagnóstico clínico e investigación donde manejen
agentes conocidos o no conocidos que potencialmente puedan transmitirse
por aerosol o salpicaduras y, que puedan causar una infección
potencialmente letal (35).
d) Nivel 4 (BSL-4): prácticas, equipo y medidas adecuadas para
laboratorios de análisis/diagnóstico clínico e investigación que involucren
la manipulación de agentes exóticos peligrosos que representen un gran
riesgo por causar enfermedades letales, que puedan transmitirse vía aerosol
y, para los cuales no haya vacuna ni terapia conocida. De los cuatro
niveles mencionados, en los últimos dos se manejan agentes patógenos
considerados como potencialmente peligrosos por las posibilidades que
existen del surgimiento de un subtipo pandémico o por haber dado origen a
33
una epidemia no controlada (patógenos emergentes y reemergentes
respectivamente) (35).
Los laboratorios de bioseguridad nivel 3 y 4 son herramientas esenciales
en la investigación por brindar la posibilidad de aislar, cultivar y preservar
estos microorganismos en su estado activo (35).
1.5.3 Implementación de las políticas en los laboratorios
Los cuatro niveles de bioseguridad implican medidas particulares para
cubrir estas necesidades. Además de ello, existen normas básicas de
bioseguridad que todo laboratorio debe seguir sin importar el tipo de
patógeno que maneje. Como se puede ver, la bioseguridad es un tema que
compete a todas las personas que realicen actividades dentro de un
laboratorio (35).
a) Diseño de un manual de bioseguridad para eliminar o minimizar la
exposición laboral a patógenos, el cual debe estar a disposición de
cada persona del laboratorio. Este manual debe ser revisado
anualmente por el supervisor o director del laboratorio para hacer los
cambios pertinentes al sistema de bioseguridad (35).
b) Identificación de sitios, tareas y procedimientos en los que podría
ocurrir una exposición ocupacional (35).
c) Control de prácticas laborales:
•
Lavarse las manos al quitarse el equipo de protección personal y
después del contacto con sangre u otro material potencialmente
infeccioso (35).
•
No doblar, quitar o tapar de nuevo jeringas. Esta medida es muy
importante, ya que la mayoría de los accidentes laborales ocurren al
tapar de nuevo la aguja de la jeringa recién utilizada (35).
•
No ingerir alimentos ni bebidas, no fumar, no aplicarse cosméticos
ni manipular lentes de contacto en áreas de trabajo (35).
34
•
No guardar comida ni bebidas en refrigeradores, cuartos fríos,
congeladores, gabinetes o anaqueles donde se encuentre material
potencialmente infeccioso (35).
•
No pipetear con la boca. (35).
d) Equipo de protección personal.
•
Varía de acuerdo al tipo de laboratorio. Debe utilizarse de forma
obligada si se va a trabajar con material potencialmente infeccioso.
Incluye: guantes, batas, máscaras, lentes y cubre bocas, ente otros
•
Los guantes desechables no deben lavarse o descontaminarse para
su reutilización
•
Utilizar guantes siempre que se entre en contacto con sangre o
material biológico-infeccioso (35).
e) Limpieza: el área y equipo de trabajo debe mantenerse siempre limpio
y descontaminado (34).
•
La Environmental Protection Agency de los Estados Unidos provee
una lista de los desinfectantes adecuados para evitar la
contaminación por bacterias o virus. Los ejemplos más comunes
son etanol, hipoclorito de sodio, formaldehido, peróxido de
hidrógeno y desinfectantes modernos de amplio espectro (35).
f) Etiquetado de equipo y material: el símbolo de bioseguridad debe ser
utilizado para identificar contenedores de desechos, refrigeradores y
congeladores que contengan material potencialmente infeccioso (35).
g) Información y entrenamiento del personal: las personas que realicen
cualquier actividad en un laboratorio deben estar informadas del nivel
de bioseguridad al que pertenece, de los patógenos que maneja y del
riesgo que corre al encontrarse allí. Además, debe estar entrenada para
responder ante cualquier contingencia (35).
35
1.5.4 Descontaminación:
La descontaminación es uno de los principios fundamentales de la
Bioseguridad”. Se refiere por un lado, a la esterilización o destrucción
completa de
todos los microorganismos incluyendo las esporas
bacterianas y, por otro lado, a la
desinfección o destrucción y
eliminación de tipos precisos de microorganismos (36).
Es responsabilidad del Director del Laboratorio asegurar que todos los
miembros del personal del Laboratorio sean capacitados sobre el tema
y, a su vez, es responsabilidad de los miembros del personal de
utilizar de manera eficaz los
procedimientos y productos de
descontaminación cualquiera que sea su uso (36).
a) Autoclave.
Los desechos infecciosos de laboratorio (Placas de Petri, pipetas,
tubos de cultivos, material de vidrio, etc.) pueden ser eficazmente
descontaminados utilizando una autoclave con vapor directo o con
una autoclave con extracción de aire. Este último sistema permite
resolver los problemas de bolsillos de aire que se forman en las
autoclaves de vapor directo debido al movimiento del aire por
gravedad. La eficiencia de descontaminación depende de varios
factores de carga, que influencian la temperatura efectiva a la cual
el material está sometido y el tiempo de contacto. El embalaje es
también un factor determinante a la hora de favorecer la libre
circulación del vapor. La
autoclave
pueden
llevar
sobrecarga y el apilamiento en la
al
fracaso
del
proceso
de
descontaminación. Lo ideal es agregar un indicador biológico como
por ejemplo una cantidad conocida de esporas (36).
b) Desinfección química.
Los desinfectantes químicos son útiles para descontaminar las
superficies y los
aparatos que no pueden ser esterilizados en
autoclave. También son útiles para limpiar las salpicaduras de
36
materias infecciosas, las salas y las unidades de hospedaje de
animales (36).
La selección del desinfectante depende de la resistencia de los
microorganismos
manipulados. Los microorganismos más
sensibles son las bacterias vegetativas, los hongos y los virus
encapsulados. Las micobacterias y los virus no-encapsulados son
menos sensibles; las esporas bacterianas y los quistes de
protozoarios son generalmente los más resistentes (36).
Los peligros para la salud que representan los desinfectantes
químicos, así como,
la facilidad de manejo, estabilidad y
compatibilidad con los materiales a desinfectar son
factores
importantes que deben considerarse para elegir el desinfectante
adecuado. Si bien existen numerosos productos en el mercado, los
compuestos activos pertenecen a un número limitado de familias
químicas. Para elegir un desinfectante cabe entender la posibilidad
y límites de cada una de estas familias: hipocloritos, compuestos de
amonio cuaternario, compuestos fenólicos, yodados y alcohol (36).
c) Incineración.
La incineración ha sido desde siempre el método favorito de
eliminación de carcasas de animales y de desechos patológicos. En
la mayoría de los casos, los desechos que deben ser incinerados
tienen que ser embalados adecuadamente y de acuerdo a la
normativa para que sean retirados de los laboratorios por las
empresas certificadas que se encuentran operando en nuestro país.
La responsabilidad de nuestros laboratorios recae entonces, por un
lado, en el almacenamiento cuidadoso dentro de un congelador, de
uso exclusivo, a -20° C, hasta que el material biológico sea retirado
por la empresa contratada. Para aquellos centros o laboratorios
que disponen de un incinerador, cabe resaltar que la eficiencia de
la incineración depende de la calidad conceptual de los aparatos,
del tiempo y de la temperatura de incineración, de las turbulencias
37
y del aire necesario para una oxidación completa. Es importante
constatar que las emisiones producidas por la incineración tienen
que adecuarse a las normas ambientales vigentes en cuanto a
emisión de partículas y contaminantes químicos (36).
1.5.4.1 Normas específicas para el manejo de agentes
químicos de
riesgo.
a) Almacenamiento y transporte de sustancias químicas.

El laboratorio no debe ser un lugar de almacenamiento de
substancias químicas, sólo deben permanecer aquellas que
serán usadas con mayor frecuencia y en volúmenes pequeños.
Grandes volúmenes deben ser
almacenados en lugares o
edificios destinados especialmente para ese fin (36).

La recepción, almacenamiento y distribución de substancias
químicas de alto riesgo (inflamables, reactivos, tóxicos), debe
efectuarse en un lugar “ad-hoc” que cumpla con los requisitos
de aislamiento, ventilación y acceso controlado, y a cargo de
personal técnicamente calificado (36).

Dentro del recinto de bodega, se deben destinar áreas
especiales para
productos químicos sólidos, líquidos y
gaseosos, tomando en consideración el riesgo que representan
(36)
.

Cada área debe estar equipada con estanterías metálicas, para
almacenar los reactivos, de altura no superior a 2,5 mts, con
una distancia del suelo mínima de 20 cms y separados a 60
cms de la pared. Las substancias químicas deben almacenarse
en sus envases unitarios originales, sellados y
con sus
38
etiquetas originales. Deben entregarse sellados al usuario y en
ningún caso deben fraccionarse en la bodega (36).

Cada Unidad debe mantener un listado actualizado de las
substancias químicas de riesgo que en ella se manipulan y las
correspondientes fichas de Bioseguridad química. Donde se
incluya los siguientes antecedentes: nombre comercial,
formula química, compuesto activo, cantidad
tipo de riesgo más probable

almacenada,
(36)
.
El transporte de substancias químicas desde la bodega a los
laboratorios se debe efectuar en carros adecuados, tomando
las precauciones necesarias para evitar el derrame de ellas (36).

Las substancias químicas de alto riesgo que ingresan a los
laboratorios son
de responsabilidad del personal técnico
calificado, quien debe tomar las
medidas anteriormente
señaladas para su almacenamiento y uso (36).
1.6. Medios de cultivo microbiológico.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos
es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han
preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes (37).
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad
y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante (37).
39
1.6.1 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
a) Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas (37).
En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia
inductora del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias
adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones químicas que tengan lugar (37).
b) Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia
añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que
obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido.
Los medios
solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla (37).
c) Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de
oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de
variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En
un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en
condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy
reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones (37).
d) Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
40
condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando
una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio (37).
e) Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad
que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el
caso de los microorganismos fotosintéticos (37).
f) pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento
de
los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en
medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o
menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en
cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo
inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales (37).
g) Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas
entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a
80ºC o
incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas
generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho
más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios
(37)
.
h) Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar
la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso
impedir
el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente
esterilizante) (37).
41
1.6.2 Tipos básicos de medios de cultivo
a) Medios de cultivo: Sólido y Líquido
Una forma muy útil de poder aislar, identificar y conservar los
microorganismos es mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente
ideados por Pasteur (que como ya sabemos se considera el padre de la
microbiología), quien se dio cuenta que los microorganismos podían crecer
en soluciones que tuvieran azúcar y una fuente de nitrógeno. De ese tiempo
hasta acá, ha pasado mucha agua debajo del puente y actualmente existen
medios muy especializados para microorganismos muy exigentes. La forma
más sencilla de clasificar los medios de cultivo es por su consistencia,
entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los medios de cultivo
líquidos o también llamados caldos (37).
b) Medios semisólidos
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente
solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno
de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias (37).
c) Medios comunes
Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos
especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar
común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros
representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia,
(37)
.
d) Medios de enriquecimiento
Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan
una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos
exigentes. Este enriquecimiento se
hace por adición de sangre u otros
productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan
dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los
enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc.). El gonococo,
42
por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias
son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar
chocolate) (37).
e) Medios selectivos
Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una población poli microbiana. El fundamento de estos medios
consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población
microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito,
que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del
resto de Enterobacterias (37).
f) Medios inhibidores
Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden total de una
población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores
podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios
selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de
sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el
desarrollo de una población
determinada. Un medio inhibidor es el
MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e
impide el crecimiento de los Gram positivos (37).
g) Medios diferenciales
Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a
diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un
sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un
medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la
lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa
+/lactosa hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial) (37).
h) Medios de identificación
Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede
servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios
han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los
43
microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el
indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons
y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento
diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación (37).
1.6.3 Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de
medios como:
 Medios de multiplicación
Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un
microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtención de vacunas, en la
investigación y en la industria. Los medios más adecuados
para la
multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI)
(37)
.
 Medios de conservación
Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese
mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las
pruebas y reactivos utilizados (37).
En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
a) haciendo pases periódicos de placa a placa,
b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1% (37).
 Medios de transporte
Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse
inmediatamente. Su utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la
que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo).
Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart Amies, Cary-Blair,
(37)
.
44
1.6.4 Medios de cultivos comunes.
Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos
todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología (37).
a) Agar nutritivo:
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina
para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece solido incluso
a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este
agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias
pequeñas (37).
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como
una sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. El agar
nutritivo contiene normalmente (w/v).
• 0.5 % Peptona
• 0.3 % extracto de carne/extracto de levadura
• 1.5 % agar
• 0.5% NaCl
• Agua destilada
• pH casi neutro (6.8) a 25 °C (37).
b) Agar sangre
Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de
los diversos tipos de hemólisis (α, ß ó gamma). Se utiliza para el
crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se
puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un
preparado enriquecido con otras
sustancias como Columbia o el
tripticase de soja. La adición de sangre a un
medio de cultivo no
proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero
sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes
45
en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando
la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las
sustancias inhibidoras, que son termolábiles. La sangre utilizada como
aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en
algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo,
conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen
determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias
inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes (37).
c) Agar S.S:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de
algunas especies de Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros
materiales en los cuales se sospeche su presencia (37).
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada
por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de
bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo
invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la
lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de
sodio (37).
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de
desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH,
obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella,
Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen
bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes (37).
La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con
centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro (37).
Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la
muestra en Selenito caldo (B02-120-05) (37).
d) Agar Tripticase de soja:
46
Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como
Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero
no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio
recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de
aerobios, anaerobios y microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que
al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio (37).
e) Agar Manitol salado o siglas en inglés MSA (Manitol salt agar):
Es un medio de cultivo que se utiliza normalmente en microbiología.
Permite el crecimiento de un determinado grupo de bacterias mientras
que inhibe el crecimiento de otras. Este medio es importante en el
laboratorio clínico debido a que es capaz de distinguir los
microorganismos patogénicos en un corto periodo de tiempo. Contiene
una alta concentración (~7.5%-10%) de sal (NaCl), haciéndolo selectivo
para Staphylococcus (y „Micrococcaceae) debido a que el nivel de NaCl
es inhibitorio para la mayoría de las bacterias. Además contiene manitol
y un indicador de PH; rojo de fenol. Coagulase-positive Staphylococcus
produce colonias amarillas con zonas amarillas, mientras que coagulasenegative Staphylococcus produce colonias rojas o ligeramente rosadas
sin cambio alguno al medio. Si un organismo es capaz de fermentar el
manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de fenol
cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de
Staphylococcus sospechosas de ser patógenas (37).
f) Agar Baird-Parker:
Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que
los diferencia del resto (37).
g) Agar Kligler:
El agar medio de Kligler (TSI, Triple Sugar Iron) es un medio diferencial
que puede ayudarnos a distinguir entre especies de enterobacterias de
acuerdo a su capacidad (o falta de ella) para:
47

Metabolizar lactosa, sacarosa o ambas

Producir acido mediante fermentación

Producir gas durante la fermentación

Generar ácido sulfhídrico
Los componentes del medio y sus funciones
a) Rojo fenol
Un indicador de pH. En medios ácidos (debajo de 6.8) se torna
amarillo. En medios alcalinos (arriba de 8.2) se torna rojo.
b) 1,0% de lactosa y 1,0% de sacarosa
Su fermentación produce una gran cantidad de ácidos.
c) 0,1% de glucosa
Su fermentación produce una pequeña cantidad de ácidos.
d) Sulfato ferroso (FeSO4)
Nos permite averiguar si la bacteria pueden producir H2S (ácido
sulfhídrico) (37).
h) Agar Cetrimida:
Medio de cultivo selectivo para el aislamiento de Pseudomonas
aeruginosa a partir de diversas muestras. La cetrimida (Bromuro de
cetiltrimetilamonio) inhibe el crecimiento de las bacterias debido a su
acción como un compuesto cuaternario de amonio. La base de Agar
Cetrimida promueve la producción de piocianina y fluoresceina que se
observan con luz ultravioleta en los cultivos de Pseudomonas aeruginosa,
lo que puede considerarse como prueba presuntiva para su identificación.
Posteriormente se puede realizar la prueba de oxidasa. Sembrar la
muestra de ensayo en la superficie del medio de cultivo por estría
cruzada. Incubar 24 – 48 h a 35ºC (37).
48
1.7 DEFINICIONES OPERACIONALES
1.7.1 Variable de Estudio
Calidad Microbiológica de la corteza de la Cariniana decandra (cinta caspi).
1.7.2 Indicadores:

Recuento de Aerobios mesófilos

Recuento de hongos y levaduras

Presencia/ausencia de Escherichia coli

Presencia/ausencia de Staphylococcus aureus

Presencia/ausencia de Pseudomona aeruginosa

Presencia/ausencia de Salmonella spp.
49
1.8. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLE
VARIABLE DE
INVESTIGACIÓN
Calidad
Microbiológica
DEFINICIÓN
CONCEPTUAL
Es un elemento
de evaluación de
la satisfacción
de los requisitos
microbiológicos,
es
necesario
aplicar
pasos
ordenados
a
través de la
cadena
de
producción,
empezando por
los insumos.
DEFINICIÓN
OPERACIONAL
Se realizó teniendo en
INDICADOR

INDICE

Recuento Aerobios mesófilos.
cuenta los parámetros
establecidos
control
de
por
el
NMP
de
ESCALA
microorganismos escalar
viables

límites
y

UCF/gr de muestra
escalar
Escherichia

Presencia/ausencia
nominal
de

Presencia/ausencia
nominal
Identificación de Pseudomona

Presencia/ausencia
nominal

Presencia/ausencia
nominal
Recuento
de
hongos
levaduras
microbianos según la
Farmacopea USP 35

para materias primas
utilizadas
en
coli

productos de origen
botánicos.
Identificación de
Identificación
Staphylococcus aureus

aeruginosa

Identificación
de Salmonella
spp.
50
CAPITULO II
METODÓLOGÍA
2.1 Tipo de Investigación:
El estudio es de tipo Descriptivo, Prospectivo.
 Descriptivo: Porque el estudio describirá en forma clara y detallada presencia
o ausencia de microorganismos patógenos y contaminantes.
 Prospectivo: Porque en el registro de información se tomara en cuenta los
hechos a partir del inicio de la fecha de estudio.
2.2 Diseño de la investigación:
El estudio se realizó aplicando los ensayos de limite microbiano establecidas por
la farmacopea USP 35, respectivamente; conteniendo el recuento de
microorganismos mesófilos aerobios, levaduras, hongos
y pruebas de
ausencia/presencia para microorganismos patógenos como: Escherichia coli,
Salmonella spp, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus.
2.3 Población y muestra.
2.3.1. Población Vegetal: La población estuvo constituida por la especie botánica
Cariniana decandra (cinta caspi), que crecen a ambos lados de la carretera
Zungarococha –Llanchama desde el Km 4.7 al Km 11.4.
2.3.2. Muestra Vegetal:
Estuvo constituida por la Corteza de Cariniana decandra (cinta caspi), de uso
terapéutico en la ciudad de Iquitos se recolectó por la técnica de muestreo por
conveniencia.
2.3.3. Criterios de inclusión y exclusión.
a) Criterios de inclusión: Especies vegetales seleccionadas en buen estado, en
estadio adulto y georeferenciadas.
b) Criterios de exclusión: Otras especies vegetales de uso medicinal no
seleccionadas para este estudio.
51
2.4 Técnicas e Instrumentos
Técnicas
 Determinación de Aerobios Mesófilos: Técnica de NMP o tubos múltiples
 Determinación de hongos y levaduras: Recuento en placas
 Determinación de microorganismos patógenos: Prueba para Staphylococcus
aureus y Pseudomonas aeruginosa, Prueba para determinar la ausencia de
Salmonella spp y Escherichia coli.
 Medios de cultivo: Caldo Lactosado, Agar Manitol Salado, Agar Cetrimida,
Agar Mac Conkey, Agar Bismuto Sulfito, Caldo Tripticasa Soya (TSB),
Caldo Selenito Cistina, Buffer fosfato pH 7,2.
 Diluyente: Solución Amortiguadora de fosfatos (buffer fosfato pH. 7,2)
2.4.1
Materiales e Instrumentos:
Vidrio: matraz de 250ml, 100ml y 50 ml; probeta graduada de 100 ml y 50
ml; vaso de precipitado 100 ml, tubos de ensayo con tapas de jebe, placas
petri, pipetas lineales de 10ml y 1ml, varilla de vidrio.
Plástico y metal: Asa bacteriológica de punta, Asa bacteriológica de aro,
gradilla, micropipeta, mechero de bunsen
Reactivos: Buffer Fosfato pH 7.2, Caldo Tripticasa Soya (TSB), Caldo
Lactosado, Caldo Selenito Cistina, Agar MacConkey, Agar Bismuto Sulfito,
Agar Manitol Salado, Agar Cetrimida, Agar Saboraud.
Equipos: Incubadora, baño maría, termostato, refrigeradora, balanza
analítica, autoclave, agitador de tubos, centrifuga.
52
2.5 Procedimientos de Recolección de Datos.
2.5.1 Investigación etnobotánica
A. Recolección: La especie Cariniana decandra (cinta caspi), de uso
terapéutico, se recolectó, a ambos lados de la carretera Zungarococha –
Llanchama desde el Km 4.7 al Km 11.4.
B. Selección: Una vez realizada la recolección de la muestra se procedió a
hacer el acondicionamiento de la materia vegetal con el objetivo de
realizar una separación de las partes deterioradas y evitar que se mezcle
con otras especies.
C. Identificación taxonómica: La planta medicinal seleccionada, se llevó al
Herbario de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana para su
identificación Taxonómica.
D. Caracterización macromorfológica:
Se llevó a cabo analizando los siguientes caracteres: Forma, textura,
superficie, peculiaridades, color, olor, condición y dimensiones; los cuales
serán contrastados con las bibliografías correspondientes.
2.6 Investigación de patógenos
2.6.1 Determinación de Aerobios Mesófilos
Método en tubos múltiples.
 Primero se preparó el macerado inicial; para ello se disolvió 10 g de la
muestra medidos con exactitud, en Solución Amortiguadora de Fosfato de
pH 7.2, para obtener 100mL. y se homogenizó en el Stomacher durante 2
minutos. Así se consiguió el macerado inicial.
53
 En cada uno de 14 tubos de tamaño similar, se colocó 4.5 mL del medio
Caldo Tripticasa Soya (TSB). Se distribuyó 12 de los tubos en cuatro grupos
de tres tubos cada uno.
 Se procedió a pipetear 0.5 mL de la solución o suspensión de la muestra y
se transfirió a cada uno de los tres tubos de un grupo (“100”) y a un cuarto
tubo (A) y se mezcló.
 Se procedió a pipetear 0.5 mL del tubo A y se transfirió al tubo restante (B),
no incluido en un grupo y se mezcló. Estos dos tubos contienen 100 mg (o
100 ul) y 10 mL (o 10ul) de la muestra, respectivamente.
 Se procedió a pipetear 0.5mL del tubo A y se transfirió a cada uno de los
tres tubos del segundo grupo (“10”) y se pipeteó 0.5mL del tubo B y se
transfirió a cada tubo del tercer grupo (“1”). Se Desechó el contenido no
utilizado de los tubos A y B.
 Se Cerró bien y se incubó todos los tubos. Una vez transcurrido el periodo
de incubación 24 h, se examinó los tubos para verificar el crecimiento de los
microorganismos: los tres tubos de control se mantendrán transparentes y
los resultados observados en los tubos que contenían la muestra, se
interpretó según la siguiente tabla, se indicó el número más probable de
microorganismos por g o por mL de muestra.
54
Tabla 1.-Recuento total más Probable por el Método en Tubos Múltiple. (Farmacopea USP
35 pp. 62)
Combinaciones observadas de Numero de Tubos
que Evidencian Crecimiento en cada grupo
Número más probable de
microorganismos por g o por mL
Nº de mg (o mL) de muestra por tubo
100
10
1
(100 ul)
(10ul)
(1ul)
3
3
3
>1100
3
3
2
1100
3
3
1
500
3
3
0
200
3
2
3
290
3
2
2
210
3
2
1
150
3
2
0
90
3
1
3
160
3
1
2
120
3
1
1
70
3
1
0
40
3
0
3
95
3
0
2
60
3
0
1
40
3
0
0
23
55
2.6.2 Determinación de hongos y levaduras
 Primero se preparó el macerado inicial; para ello se disolvió 10 g de la muestra
medidos con exactitud, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2, para
obtener 100mL. y se homogenizó en el Stomacher durante 2 minutos. Así
conseguimos el macerado inicial.
 Se Añadió 0.5 mL del macerado inicial en un tubo que contenga 4.5 mL de
buffer fosfato pH 7,2 se homogenizó usando un agitador excéntrico de tubos de
ensayo durante 20 segundos o agitando manualmente 25 veces en 7 segundos
con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura
aproximado de 60º entre brazo y antebrazo.
 Se Repitió la operación anterior transfiriendo 0.5 de la dilución a otro tubo con
4.5 mL de buffer fosfato pH 7,2.
 Se procedió a pipetear 1 mL y se transfirió a dos placas Petri estériles por cada
nivel de dilución. Se Agregó de inmediato a cada placa de 15 a 20 mL de medio
Agar Dextrosa papa o Agar sabouraud, previamente fundido y enfriado
aproximadamente 45º. Se Cubrió las placas Petri, se mezcló la muestra con agar
inclinando ligeramente o rotando suavemente las placas y se dejó que el
contenido se solidifique a temperatura ambiente.
 Se Invirtió las placas Petri e incubar a 25 o 28ºC hasta la aparición de colonias
(aproximadamente 5 a 8 días)
Tabla 2. Criterio de aceptación para la calidad microbiológica de hongos y levaduras,
éste se interpreta de la siguiente manera: (FARMACOPEA USP 35 pp. 63)
Criterio de aceptación para la calidad microbiológica de hongos y levaduras
101 ucf: recuento máximo aceptable:
20
102 ucf: recuento máximo aceptable:
200
103 ucf: recuento máximo aceptable:
2000 y así sucesivamente.
56
2.6.3 Determinación de Microorganismos Patógenos.
2.6.3.1 Prueba para Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.
 Del macerado inicial se sacó 10 gr y se agregó el Medio Caldo Tripticasa
Soya (TSB) a la muestra, se mezcló y se procedió a incubar.
 Se examinó el medio para verificar el crecimiento y si hubo crecimiento, se
utilizó un bucle de inoculación para realizar estrías con una porción del
medio sobre la superficie del medio Agar Vogel Johnson (o Medio Agar de
Baird-Parker o Medio Manitol-Agar Salado) y del Medio Cetrimide, cada uno
de ellos se colocó en placas de Petri.
 Se Cubrió las placas, se invirtió y se incubó.
 Si al examinarlas, ninguna de las placas contiene colonias con las
características enumeradas en las siguientes tablas, para los medios utilizados,
entonces la muestra de prueba cumplirá con los requisitos de ausencia de
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.
Tabla 3. Características morfológicas de Staphylococcus aureus en Medio Agar
Selectivo.
Medio Selectivo
Morfología
colonias
características
de
las
Medio Agar de
Tinción de Gram
Cocos positivos
Negro, rodeado de una zona amarilla
Baird Parker
(en grupos)
Tabla 4. Características Morfológicas de Pseudomona aeruginosa Medio Agar
Selectivo y de Diagnostico.
Medio Selectivo
Morfología
Fluorescencia
característica de
en Luz UV
las colonias
Prueba de Tinción
Oxidasa
de Gram
Medio Agar Cetrimide
Generalmente
verdoso
Positivo
Verdoso
Bastones
negativos
57
2.6.3.2 Prueba para determinar la ausencia de Salmonella spp y Escherichia coli.
 Se agregó a la muestra que está contenida en un vaso adecuado, un volumen
de Medio Liquido de Lactosa para obtener 100 mL y se incubó.
 Se examinó el medio para verificar el crecimiento, y si presentó crecimiento,
se mezcló y agitó suavemente.
 Se procedió a pipetear porciones de 1 mL y se transfirió a tubos que
contengan respectivamente 10 mL de Medio Líquido de Selenito-Cistina, se
mezcló e incubó durante 12 a 24 horas. (Se conservó el remanente del medio
Líquido de Lactosa).
a) Prueba para determinar la ausencia de Salmonella spp.
 Por medio de un bucle de inoculación se hizo estrías de los medios SelenitoCistina sobre la superficie del Medio Agar Verde Brillante, del Medio Agar
con Sulfito de Bismuto contenidos en placas de Petri.
 Se cubrió las placas, luego se invirtió e incubó.
 Si al examinar las placas, ninguna de las colonias se ajusta a la descripción
que aparece en la siguiente tabla, nuestra muestra entonces cumplió con los
requisitos, de la prueba para determinar la ausencia del genero Salmonella.
Tabla 5. Características Morfológicas de Salmonella spp en medio Agar Selectivo
Medio Selectivo
Morfología características de las colonias
Medio Agar con Sulfito de Bismuto
Puntos de color negro o verde brillante
b) Prueba para determinar la ausencia de Escherichia coli.
 Con ayuda de un bucle de inoculación, se hizo estrías con una porción del
Medio Líquido de Lactosa restante sobre la superficie del medio Agar Mac
Conkey.
58
 Se cubrió las placas, se invirtió e incubó.
 Si al examinar las placas, y ninguna de las colonias se ajusta a la descripción
que aparece en la siguiente tabla para este medio, la muestra cumplió con los
requisitos de la prueba para determinar la ausencia de Escherichia coli.
Tabla 6. Características Morfológicas de Escherichia coli en Medio Agar Mac
Conkey.
Tinción Gram
Morfología características de las colonias
Cocos negativos
De color rojo ladrillo, pueden tener una zona
(cocos-bacilos)
de bilis precipitada alrededor
2.6.3.3 Pruebas bioquímicas complementarias.
Se realizó pruebas bioquímicas complementarias para confirmar los
microorganismos presentes en las colonias de, Salmonella spp y Escherichia
coli. Siguiendo el procedimiento.
Se transfirió las colonias sospechosas que fueron aisladas
mediante un
alambre de inoculación en tubos que contengan agar triple-azúcar-hierro, agar
lisina hierro, citrato de Simmons y SIM (azufre, indol, movilidad), para el
primero se inoculó por picadura hasta el fondo y estría en la superficie (pico
de flauta), para el segundo se procedió de la misma manera, para el tercero se
inoculó con una estría en la superficie del pico de flauta y el ultimo por
picadura vertical.
59
Tabla 7. Características de resultados de pruebas bioquímicas para, Salmonella spp y
E. coli.
MEDIO
Salmonella
E. Coli
TSI
K/A
A/A
LIA
K/K
K/K
C.S
A/A = reacción acido sobre acido, K/A = reacción alcalino sobre acido, K/K =
reacción alcalino sobre alcalino
2.7. Análisis e interpretación de los datos.
Procesamiento de la información.
El análisis e interpretación de los datos se realizó siguiendo en cuenta los
parámetros establecidos por el control de límites microbianos según la
Farmacopea USP 35 para materias primas utilizadas en productos de origen
botánicos, el cual expresa el NMP para el control de aerobios mesófilos y ufc/gr
para el recuento total de hongos y levaduras; así como también la de determinar
la presencia o ausencia de patógenos como Pseudomona aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Salmonella spp, y Escherichia coli.
Tabla 8. Parámetros de límites microbianos según farmacopea USP 35 para
ingredientes y productos botánicos
Indicadores microbiológicos
Limites microbianos requeridos
Microorganismos aerobios
totales
≤1100 NMP
Hongos y levaduras
<103UFC/g
Staphylococcus aureus
Ausente
Pseudomona aeruginosa
Ausente
Salmonella spp.
Ausente
Escherichia coli
Ausente
60
Todos los resultados son procesados en una base de datos en el programa Excel
2010 y luego serán analizados en el programa SPSS 21. Haciendo usos de una
estadística descriptiva presentados en tablas y gráficos, y según sea el caso las
medidas de posición central: Media Aritmética, Desviación Estándar y
Coeficiente de Variabilidad.
CAPITULO III
3. RESULTADOS
Tabla 9. Determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Cariniana
decandra.
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
4
5
6
Nina Rumí
Nina Rumi
Nina Rumi
Nina Rumi
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
Y
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
NMP microorganismos por g o
por mL.
órgano de la planta
Corteza
1100
>1100
500
1100
>1100
500
Según la tabla 9, para la determinación de aerobios mesófilos en Cariniana
decandra. se observó que de las 6 muestras de cortezas, las muestras 1, 3, 4 y 6 pasan
la prueba por estar dentro del límite permitido (<103), de las 6 muestras de corteza,
las muestras 2 y 5 no pasan la prueba por haber superado el límite permitido(<103).
Tabla 10. Determinación de hongos y levaduras combinados en Cariniana
decandra.
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
Nina Rumí
Nina Rumi
Nina Rumi
0680196
0680394
0680196
UFC/gr de muestra
Y
órgano de la planta
Corteza
9575569
9575560
9575573
100
2x102
100
61
4
5
6
Nina Rumi
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680353
0680196
0680201
9575386
9575416
9575425
1.5x102
2x102
1.6 x102
Según la tabla 10, para la determinación de hongos y levaduras combinados en
Cariniana decandra se observó que las 6 muestras de cortezas, pasan la prueba por
estar por debajo del límite permitido <103ufc/g.
Tabla 11. Determinación de hongos y levaduras combinados en Cariniana
decandra.
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
4
5
6
Nina Rumí
Nina Rumi
Nina Rumi
Nina Rumi
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
UFC/gr de muestra
Y
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
órgano de la planta
Corteza
Aceptada
Aceptada
Aceptada
Aceptada
Aceptada
Aceptada
Según la tabla 11, para la determinación de hongos y levaduras combinados en
Cariniana decandra se observó que las 6 muestras de cortezas son aceptadas por
estar por debajo del límite permitido <103ufc/g.
Tabla 12. Determinación de Staphylococcus aureus en Cariniana decandra.
Staphylococcus aureus
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
4
5
6
Nina Rumí
Nina Rumi
Nina Rumi
Nina Rumi
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
UFC/gr de muestra
Y
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
órgano de la planta
Corteza
Ausencia
Ausencia
Ausencia
Ausencia
Ausencia
Ausencia
62
Según la tabla 12, para la determinación de Staphylococcus aureus en Cariniana
decandra se observó que las 6 muestras corteza pasan la prueba por encontrarse el
microorganismo ausente.
Tabla 13. Determinación Pseudomona aeruginosa en Cariniana decandra.
Pseudomona aeruginosa
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
4
5
6
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
UFC/gr de muestra
Y
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
órgano de la planta
Corteza
Ausencia
Presencia
Ausencia
Ausencia
Presencia
Presencia
Según la tabla 13, para la determinación de Pseudomona aeruginosa en Cariniana
decandra se observó que de las 6 muestras de cortezas las muestras 1, 3, y 4 pasan
la prueba por encontrarse el microorganismo ausente, mientras que de las muestras
2, 5 y 6 no pasan la prueba por encontrarse presencia del microorganismo.
Tabla 14. Determinación de Salmonella spp en Cariniana decandra.
Salmonella spp.
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
4
5
6
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
UFC/gr de muestra
Y
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
órgano de la planta
Corteza
Ausencia
Ausencia
Ausencia
Ausencia
Ausencia
Ausencia
63
Según la tabla 14, para la determinación de Salmonella spp en Cariniana decandra
se observó que las 6 muestras de corteza pasan la prueba por encontrarse el
microorganismo ausente.
Tabla 15. Determinación de Escherichia coli en Cariniana decandra.
Escherichia coli
Nº de
árbol
Procedencia
Coordenadas
X
1
2
3
4
5
6
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Puerto Almendra
Puerto Almendra
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
UFC/gr de muestra
Y
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
órgano de la planta
Corteza
Ausencia
Presencia
Ausencia
Ausencia
Presencia
Presencia
Según la tabla 15, para la determinación de Escherichia coli en Cariniana decandra
se observó que las muestras 1, 3 y 4 de corteza pasan la prueba por encontrarse el
microorganismo ausente; de las 6 muestras de corteza las muestras 2, 5 y 6 no pasan
la prueba por encontrarse presencia del microorganismo.
4. DISCUSION DE LOS RESULTADOS
La calidad microbiológica es un elemento de evaluación de la satisfacción de los
requisitos microbiológicos que debe tener un producto, el control microbiológico se
basa en la presencia y multiplicación de microorganismos, utilizando parámetros
(recuento de: mesófilos aerobios, hongos, levaduras, coliformes totales y fecales),
son parámetros que controlan la calidad sanitaria tanto de la materia prima como del
producto terminado (2).
Autores que analizaron drogas vegetales determinaron la calidad microbiológica de
las mismas: Cruz
(13)
analizó Matricaria chamomilla (Manzanilla), Aristiguietia
glutinosa (Matico) y Ambrosia arborescens (Marco) dando como resultado para el
recuento total de mesófilos aeróbicos, levaduras y hongos ningún tipo de crecimiento
64
microbiológico en el producto. En el presente estudio se encontró que en Cariniana
decandra (cinta caspi) solo 4 muestras de cortezas están dentro del rango del límite
permitido, hay que recalcar que las especies presentes podrían ser especies
bacterianas propias de la microflora de la planta.
En el análisis de hongos y levaduras, tal como se puede observar en la tabla 10
muestran que Cariniana decandra (cinta caspi), no presenta un elevado recuento de
estos microorganismos, y se ajusta al límite permitido por la farmacopea USP 35,
estos resultados podrían deberse a lo que afirma el investigador Costa
(11)
quien
indica que Cariniana estrellensis presenta moderada actividad antifúngica in vitro.
Los resultados del análisis para determinar Staphylococcus aureus y Salmonella spp,
muestran ausencia de estos patógenos como se puede observar en los cuadros de
Cariniana decandra (cinta caspi), esto se ajusta a los requerimientos establecidos por
la farmacopea USP 35.
Los resultados de Cariniana decandra para determinar los microorganismos que nos
sirven de indicadores para patógenos que deben estar ausentes en esta prueba,
(Staphylococcus, Pseudomona, Salmonella y E. coli) como se puede observar estos
microorganismos están presentes al menos en una de las muestras a excepción de
Staphylococcus aureus y Salmonella spp (tablas 12, 13, 14,).
Por otro lado (Ramírez), estudió la solución hidroalcohólica de Aspidosperma
nitidum Benth “remo caspi” que pertenece a la misma clase del cinta caspi, y no
encontró presencia de coliformes, esto podría deberse que al estar en una solución
hidroalcólica esto actuaría como un inhibidor o bactericida.
La presencia de Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa en algunas muestras de
corteza de Cariniana decandra, nos da un indicativo de que estas muestras no están
aptas para ser usadas como insumo de productos vegetales. A pesar de que se tuvo
65
especial cuidado en la recolección, selección, transporte y acondicionamiento de
estas muestras, estos procesos no garantizan una buena calidad microbiológica por lo
que el producto pierde calidad en la cadena de producción, ya que existe el
desconocimiento de buenas prácticas de recolección para plantas medicinales y
carencia de normas técnicas nacionales.
Por otro lado es relevante lo que afirma Vila (38) que las plantas medicinales para ser
incorporados al sistema de salud y ser empleados deben reunir tres características
que son: calidad, eficacia y seguridad; para asegurar su calidad, deben cumplir con
las Buenas Prácticas de Almacenamiento y Recolección (BPA/R), Buenas Prácticas
de Manufactura (BPM), Buenas Prácticas de Almacenamiento (BPA) y las Buenas
Prácticas de Dispensación (BPD). Antes de su comercialización y uso deben
realizarse un control de calidad fisicoquímico, microbiológico, toxicológico.
5. CONCLUSIONES
De los 6 árboles muestreados de Cariniana decandra se determinó para aerobios
mesófilos totales que las muestras 1, 3, 4 y 6 de corteza pasan la prueba por estar por
debajo del límite permitido (≤1100NMP/g), y las muestras 2 y 5 de corteza no pasan
la prueba por superar el límite máximo permitido (>1100NMP/g) (tabla 9).
De los 6 árboles muestreados de Cariniana decandra, se determinó para hongos y
levaduras que las 6 muestras de corteza pasan la prueba por estar por debajo del
límite permitido <103ufc/g. (tabla 10).
De los 6 árboles muestreados de Cariniana decandra, se determinó ausencia de
Staphylococcus aureus en las 6 muestras de corteza de la especie (tabla 12).
De los 6 árboles muestreados de Cariniana decandra, se determinó presencia de
Pseudomona aeruginosa en la muestra 2, 5 y 6 de corteza. Todas las muestras
contaminadas con Pseudomona aeruginosa no calificaron como materia prima
vegetal bioactiva (tabla 13).
De los 6 árboles muestreados de Cariniana decandra, se determinó ausencia de
Salmonella spp en las 6 muestras de corteza de la especie (tabla 14).
66
De los 6 árboles muestreados de Cariniana decandra, se determinó presencia de
Escherichia coli en la muestra 2, 5, 6 y no pasan la prueba. Todas las muestras
contaminadas con Escherichia coli no calificaron como materia prima vegetal
bioactiva (tabla 15).
En la determinación de la calidad microbiológica de la especie de uso
etnoterapéutico tradicional, las muestras de cortezas del árbol 1, 3 y 4 de Cariniana
decandra, son aceptados como materia prima vegetal bioactiva porque presentaron
parámetros de calidad microbiológica exigidos por la Farmacopea USP 35 y
adoptados por la DIGEMID de Perú.
67
6. RECOMENDACIONES
 Realizar estrategias que involucren la educación de la población que trabaja
en la comercialización, en la recolección, almacenamiento, manejo, limpieza
y manipulación de esta planta y otras plantas medicinales en la ciudad de
Iquitos.
 Realizar normas básicas de bioseguridad en el laboratorio, a la hora de
manipular las muestras para evitar la contaminación y que influya en los
resultados obtenidos.
 Socializar los resultados a los extractores habituales de plantas medicinales de
uso en salud, a fin de dar a conocer sobre posibles contaminantes
microbiológicos, que causan daños en la salud de la población consumidora.
 Seguir con estudios que amplíen estos resultados y que permita que esta
planta medicinal sea aceptada como materia prima vegetal bioactiva de uso en
salud.
 Realizar estudios de calidad microbiológica a los preparados hidroalcohólicas
que se expenden y se elaboran a partir de la corteza de esta especie vegetal y
de otras especies en la ciudad de Iquitos.
68
7. BIBLIOGRAFIA
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San Marcos. Facultad de Farmacia y Bioquímica: 2007.
73
8. ANEXOS
Anexo 1. Determinación de Patógenos:
Recuento Total De Aerobios Mesófilos (NMP)
10g
90ml Buffer fosfato pH 7.2
0.5ml
4.5ml TSB
A
4.5ml TSB
0.5ml
B
4.5ml TSB
Incubar: 35°C x 24-48h Lectura: Tabla NMP
CONTROL 1
2
3
74
Anexo 2. Prueba para Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa
100g
10
01
10g
90ml TSB
35°C x 24h
1asa
1asa
Manitol Salado 35°C x 24h
Cetrimide
Anexo 3. Prueba para determinar la ausencia de Salmonella spp
100g
10g
90ml Caldo lactosado 35°C x 24h
1ml
Caldo Selenito-cistina 12 x24h/35°C
1 asa
Agar Bismuto Sulfito
75
Anexo 4. Prueba para determinar la ausencia de Escherichia coli.
100g
10g
90ml caldo lactosado35°C x 24h
1asa
MacConkey
Incubar x 24h a 30-35°C
Anexo 5. Recuento total combinado de Hongos y Levaduras.
10g
90ml Buffer fosfato pH 7.2
0.5ml
4.5mlBuffer
4.5mlBuffer
1ml
18ml de agar Sabouraud
18ml de agar
Sabouraud
Sabouraud
Dextrosa
Dextrosa
Incubar durante 5 a 7 días a una temperatura de 20º a 25º
76
Anexo 6. Pruebas de Identificación para bacterias aisladas en corteza de
Cariniana decandra (cinta caspi).
Staphylococcus aureus
Nº de
árbol
1
2
3
4
5
6
Procedencia
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Nina Rumí
Puerto Almendra
Puerto Almendra
Coordenadas
COAGULASA (+)
X
Y
0680196
0680394
0680196
0680353
0680196
0680201
9575569
9575560
9575573
9575386
9575416
9575425
órgano de la planta
Corteza
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
77
Anexo 7. Pruebas de Identificación para bacterias aisladas en corteza de Cariniana decandra (cinta caspi).
Nº de
árbol
Procedencia
AGAR BISMUTO SULFITO
AGAR MC CONKEY
Salmonella spp.
Escherichia coli
TSI
LIA
CS
SIM
TSI
LIA
CS
SIM
1
Nina Rumí
K/A (-)(-)
K/K
(+)
(-) (-) (-)
A/A (-)(-)
K/K
(+)
(-) (+) (+)
2
Nina Rumí
K/A (+)(-)
K/K
(+)
(-) (+) (+)
A/A (+)(-)
K/K
(+)
(-) (-) (-)
3
Nina Rumí
A/A (+)(-)
K/K
(-)
(-) (-) (+)
K/A (+)(-)
K/K
(+)
(-) (-) (-)
4
Nina Rumí
K/K (-)(-)
K/A
(-)
(-) (+) (-)
K/A (+)(-)
K/K
(+)
(-) (-) (-)
5
Puerto Almendra
A/A (+)(-)
K/K
(-)
(-) (-) (-)
A/A (+)(-)
K/K
(+)
(-) (+) (-)
6
Puerto Almendra
A/A (+)(-)
K/K
(-)
(-) (-) (+)
A/A (+)(-)
K/K
(+)
(-) (-) (-)
78
RECOLECCION DE LAS MUESTRAS
79
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
80
MACERADO INICIAL DE LAS MUESTRAS
DILUCIONES PARA EL ENSAYO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
CRECIMIENTO DE COLONIAS PARA EL RECUENTO COMBINADO DE HONGOS Y
LEVADURAS
81
CRECIMIENTO DE Pseudomona Aeruginosa EN AGAR CETRIMIDE
AUSENCIA DE Salmonella spp EN AGAR SULFITO DE BISMUTO
CRECIMIENTO DE Escherichia Coli EN AGAR MACCONKEY
82
AUSENCIA DE Staphylococcus aureus EN MANITOL SALADO Y PRUEBA DE LA
COAGULASA
PRUEBAS BIOQUIMICAS (TSI, LIA, CITRATO Y SIM) REALIZADAS A LAS
COLONIAS SOSPECHOSAS
83
TÉCNICA DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
LECTURA DE PLACAS
84
Anexo 8. Certificación de la Planta en Investigación.
85
Anexo 9. Mapa con los puntos de colecta de la especie Cariniana decandra (cinta caspi) en el área de intervención del estudio.
86