INTRODUCCIÓN - Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL

INTRODUCCIÓN
Francisco J. Iruegas Buentello
La importancia de la Parasitología en México
y el Mundo:
El Programa Regional de Enfermedades
Parasitarias y Desatendidas creado por la
Organización Panamericana de la Salud (OPS)
son un grupo de enfermedades parasitarias
(filariosis linfática, oncocercosis, helmintiasis
intestinal, esquistosomiosis y leishmaniosis y
otras
infecciosas
bacterianas)
que
generalmente se caracterizan por la inversión
históricamente baja del sector farmacéutico y
que principalmente afectan a los grupos más
desprivilegiadas de la sociedad (Fig. 1).
Fig. 1. La carga de las enfermedades desatendidas en América Latina y el Caribe en
comparación con otras enfermedades trasmisibles en millones de casos (OPS, 2010a).
1
La esquistosomiosis (Schistoma mansoni)
todavía afecta por lo menos a ocho países
de Latinoamérica; Brasil lleva la mayor
carga, donde se estima que al menos 2,5
millones de personas están infectadas y 6
millones están en riesgo (OPS, 2010a). La
filariosis linfática (elefantitis o elefantiasis
filárica) afecta a más de medio millón de
personas en Latinoamérica, donde se estima
que en términos mínimos 6–8 millones de
personas están en riesgo, principalmente en
Haití pero también en Guyana, la República
Dominicana y la parte del nordeste del
Brasil. La oncocercosis pone en riesgo a
cerca de medio millón de personas. Lo más
problemático abarca una región extensa de
comunidades remotas en la zona fronteriza
Venezuela-Brasil.
La
leishmaniosis
constituye un problema creciente en las
zonas rurales y periurbanas en muchos
países de Latinoamérica, con casi 35,000
casos notificados en el Brasil sólo en 2003;
sin embargo, la notificación insuficiente o la
falta de información es común en las zonas
marginales rurales y periurbanas de la
Región
donde
estas
enfermedades
generalmente se encuentran.
La geohelmintiasis y la esquistosomiosis son
problemas de salud pública serios que
afectan principalmente a la población en
edad escolar y mujeres en edad fecunda,
adolescentes y los jóvenes adultos en edad
de trabajar. Para abordar esta carga de
morbilidad, por lo menos 75% de niños en
edad escolar que viven en las áreas de
riesgo
para
geohelmintos
y
esquistosomiosis van a necesitar acceso a la
quimioterapia regular para 2010, donde se
superponen las dos enfermedades, las
normas de la OMS recomiendan el
tratamiento combinado junto con mejor
agua y saneamiento y educación sanitaria
(OPS, 2010b).
La OPS (2010) reporta para México 1.1 casos
humanos de teniasis por cada 100 mil
habitantes teniasis y 0,7 de cisticercosis El
número de defunciones por cisticercosis fue
de 200. El mayor brote de malaria en los
últimos cuatro años lo padeció Oaxaca con
11.349 casos entre 1994-1998. La
oncocercosis tuvo entre 1997 y el 2000 un
total de 1,424 casos notificados, pero en el
2007 se reporta 001 % en el sur de Chiapas
y 0 % en el Norte del mismo estado y en
Oaxaca (WHO, 2009). La leishmaniosis se
presentó fundamentalmente en los estados
de Quintana Roo, Tabasco, Campeche y
Chiapas, con una morbilidad reportada de
1.700 casos en 1999. En cuanto a la
tripanosomosis americana en el 2000 se
encontró que la incidencia fluctuaba entre 1
y 20 casos por 1,000 habitantes. El tamizaje
serológico para la enfermedad de Chagas
reportado por los bancos de sangre del país
fue del 13%.
2
Los helmintos trasmitidos por suelo (HTS)
conocidos comúnmente como gusanos
intestinales son las infecciones más
comunes en el mundo que afectan a las
comunidades más desprotegidas.
Los
agentes causales de HTS son Ascaris
lumbricoides, Trichuris trichiura y las
uncinarias. Reportes recientes indican que
A. lumbricoides afecta a 1 billón de
personas, T. trichiura a 795 millones y las
uncinarias (Ancylostoma duodenale and
Necator americanus) parasita a 740
millones. El mayor número de infecciones
por HTS ocurre en África-Sahariana,
América, China y este de Asia (WHO, 2009).
La OMS calcula que 20–30% de todos los
latinoamericanos están infectados por
helmintos
intestinales
(parásitos
intestinales), mientras que las cifras en los
barrios pobres alcanzan con frecuencia el
50% y hasta el 95% en algunas tribus
indígenas (OPS, 2010b). La prevalencia de
HTS ha sido analizada por la WHO (2009)
del 2002 al 2006. Los reportes indican
rangos de prevalencia en los siguientes
niveles: Argentina 9.0-38.7%; Belice: 43.652.2%; Brasil: 2-36%, Haití: 15-87%;
Honduras: 12.2-97%, México: 0.01-16.3%,
Nicaragua 27-80% y Venezuela: 3-19%. De
ellos, solo Venezuela y México reportan
prevalencias inferiores al 20%. Para otros
países, los rangos oscilan de la siguiente
forma: Bolivia: 4.5-65.4%, Colombia: 10.749.3%, Cuba: 4.5-47.3%, República
Dominicana: 5.3-55.3%; Ecuador: 28.5-71%,
Guatemala: 12.7-68%, Guyana: 12.3-38%,
Perú: 1.8-80.4%, Santa Lucia: 35-45% y
Surinam: 36-43% (Fig. 2, PAHO, 2011).
Por este motivo, en el curso de Parasitología
Clínica de la carrera de Químico
Bacteriólogo Parasitólogo tiene como
objetivo general capacitar al alumno en el
conocimiento de la morfología, fases de
desarrollo,
ciclo
biológico,
medidas
profilácticas y diagnóstico y de las entidades
parasitarias. Es importante destacar que la
migración de las poblaciones humanas de
zonas rurales hacia zonas urbanas o países
3
Fig. 2. Prevalencia de HTS en América Latina y el Caribe (PAHO, 2011)
desarrollados, en busca de un mejoría en su
calidad de vida, cambian el patrón de la
distribución geográfica de las parasitosis
que antes eran casi exclusivas de las zonas
desprotegidas,
como
ejemplo,
la
tripanosomiosis americana, la cual era una
infección primeramente trasmitida por
vectores hematófagos, es actualmente
trasmitida primeramente por transfusión
sanguínea en las áreas urbanas.
4
Bibliografía
Hotez PJ, ME Bottazzi, CF-Paredes, SK Ault,
MR Periago. 2008. The Neglected
Tropical Diseases of Latin America and
the Caribbean: A Review of Disease
Burden and Distribution and a
Roadmap for Control and Elimination.
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desatendidas. La carga de las
enfermedades
desatendidas
en
América Latina y el Caribe en
comparación con otras enfermedades
transmisibles.
http://www.paho.org/Spanish/AD/DP
C/CD/psit-nd-graph.htm y
OPS
(PAHO),
2010b.
Enfermedades
parasíticas
y
desatendidas:
El
Programa
Regional
de
la
OPS.Programas de prevención, control
y/o
eliminación:
http://www.paho.org/Spanish/AD/DP
C/CD/psit-program-page.htm
PAHO, 2011. Prevalence and intensity of
infection
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Soil-transmitted
Helminths in Latin America and the
Caribbean. Countries: Mapping at
second administrative level 20002010. Washington, D.C.:
WHO, 2009. Intestinal Worms: Soiltransmitted
helminthes.
http://www.who.int/intestinal_worms
/en/index.html. Acceso el 18 de
marzo, 2010.
5
PRÁCTICA 1
MICROSCOPÍA
L. Galaviz Silva
Introducción
El microscopio es un instrumento que sirve
en el campo diagnóstico e investigación para
detectar microorganismos que no es posible
ver a simple vista y para el estudio
morfológico de protozoarios y helmintos.
Estos constan de tres sistemas elementales,
que son el sistema mecánico, óptico y de
iluminación. Desde los modelos más
antiguos, hasta los equipos más modernos,
podemos encontrar estos tres sistemas. De
hecho, el conocimiento de las células y
organismos microscópicos es paralelo al
desarrollo del microscopio. El primero en
utilizar la palabra microscopium fue Atanasio
Kircher (1601-1680). No se sabe con certeza
cuando se descubrieron las propiedades de
los cristales curvos para modificar los haces
de luz y formar o amplificar imágenes. Las
evidencias indican que desde el siglo XIII, en
Italia, ya se usaban estas propiedades de los
cristales, pero fue hasta 1665 cuando se
describe su aplicación en el estudio de la
célula, aplicándose inicialmente en una
rebanada de corcho por Robert Hooke.
Siguiendo a estas observaciones, otros
personajes de la misma época, utilizaron el
mismo tipo de instrumentos para describir
protozoarios, células vegetales y tejidos
animales (Gama, 2007).
En 1830, al desarrollar una óptica más
adecuada se constató que todos los tejidos,
animales y vegetales, estaban constituidos
por células y que el embrión de las plantas se
derivaban de una célula única. Esta primera
aplicación, más formal, fue llevada por
Matthias Schleiden en 1838. Un año más
tarde, el investigador Theodore Schwann,
colega de Schleiden, publicó uno de los
trabajos más completos sobre las bases
celulares de la vida. Propuso que todos los
tejidos estaban formados por células y que
estas eran la unidad funcional de los
organismos vivos. Schwann, junto con su
colega establecieron la Teoría Celular (Gama,
2010).
El
microscopio,
a
diferencia
del
estereoscopio, nos proyecta una imagen
bidimensional e invertida en un doble plano.
De esta manera, la imagen que es
transportada en el haz de luz, al pasar por la
6
lente del objetivo sufre el primer aumento e
inversión (imagen intermedia), y al pasar por
la lente del ocular se invierte en el segundo
plano, siguiendo las leyes de la propagación
rectilínea de la luz (Gu, 2002; Inoué, 2007).
El poder de resolución del microscopio
significa su capacidad para separar dos
puntos que aparentemente son uno solo y es
función de la apertura numérica del objetivo,
del condensador y de la longitud de onda de
la luz. La apertura numérica es también el
aumento útil de las imágenes y el límite de
resolución de las lentes. El aumento útil
significa la cantidad de veces que puede
ampliarse un objeto distinguiendo en él más
detalles que originalmente han escapado de
nuestra vista (resolución), pero finalmente,
cuando llegamos al límite de resolución de la
lente ya no se observarán más detalles del
objeto por más aumentos que se le apliquen.
A esto se le llama amplificación vacía y se
refiere al límite de resolución. La apertura
numérica de las lentes, se refiere al ángulo
de que se forma por el axis óptico de los
rayos de la luz (A) que inciden en el objetivo,
también llamado ángulo de apertura. La
magnitud de este ángulo no está indicada en
grados, sino en el valor del ángulo seno, que
es un valor numérico. Esto explica el origen
del término que es “apertura numérica”.
Esto es el seno de la mitad del ángulo de
apertura multiplicada por el índice de
refracción (n) del medio que llena el espacio
entre el cubreobjetos y la lente (Inoué,
2007).
Donde n es el índice de refracción del medio
que llena el espacio entre el cubreobjetos y
el objetivo. Este oscila entre 1 en el caso del
aire, hasta 1.51 si es aceite de inmersión.
A partir de esta ecuación, es obvio que
cuando el medio es el aire, (n=1), entonces la
apertura numérica depende solamente del
ángulo , cuyo máximo valor es 90°. El sin
del ángulo
por lo mismo, tiene un valor
máximo de 1.0 (sen (90°))= 1, el cual es la
apertura numérica máxima de un lente
operando con aire usando objetivos “secos”
(Davidson, 2010).
Analizando la ecuación de apertura
numérica, aparentemente el índice de
refracción es factor limitante, para lograr
aperturas mayores de 1.0. Por eso, para
obtener mayores aperturas numéricas se
debe incrementar el indice de refracción del
medio que llena el frente de la lente del
objetivo y el cubreobjetos. Ahora se han
desarrollado objetivos que permiten medios
alternativos como el agua (n=1.33), glicerina
(n=1.47) y aceite de inmersio´n, (n=1.51). De
acuerdo a la marca del microscopio, varía la
banda de color que identifica el medio de
inmersión recomendado (Kapitza, 1997;
Juskaitis, 2007).
7
3. El estudiante aplicará las normas para el
mantenimiento
y
cuidado
del
microscopio.
u´
u´
Aire
Aceite
Material
Fig. 3. Esquema de la apertura numérica (u´).
IR del aire = 1.
IR del aceite= 1.515
U´ y u´: Angulo de apertura de los rayos. No en
grados, sino en forma de un valor seno, que es
un valor numérico = Apertura numérica
Objetivo general
Mostrar al alumno la aplicación de las
técnicas microscópicas en Parasitología, el
uso correcto y el mantenimiento del
microscopio de luz ó microscopio óptico,
debido a que el diagnóstico de certeza de las
parasitosis, se basa en este importante
instrumento.
Objetivos particulares:
1. Dar a conocer al estudiante las técnicas
microscópicas de campo claro, contraste
de fases, campo oscuro, interferencia y
polarización.
2. El estudiante será capaz de esquematizar
estructuras microscópicas y conducir un
estudio morfométrico de los protozoarios
aplicando las medidas de longitud
correspondientes.
1. Microscopio estándar, foto microscopio o
mini cámara digital para el ocular,
microscopio de contraste de fases,
estereoscopio, microscopio invertido,
cámara lúcida o clara, micrómetro ocular.
1. Método para calcular el poder de
resolución:
Para calcular el poder de resolución, se
requiere conocer la longitud de onda de la
luz visible, la apertura numérica del objetivo
y del condensador.
Una vez que investigue estas tres variables,
aplique la siguiente formula:
Poder de resolución = / AN objetivo + AN
condensador
Poder de resolución = 0.55 μm/1.25 + 0.9 =
0.25 μm
Ejemplo de apertura numérica: Si es el
objetivo de 100 X, este se fabrica con una
apertura numérica de 1.25 (Kapitza, 1997),
entonces, el poder de resolución calculado
será:
Un poder de resolución de 0.25 μm, significa
que este lente de 100 X, tiene la capacidad
8
de resolver áreas o distancias entre dos
puntos de 0.25 μm (la cuarta parte de la
milésima de un milímetro).
Imagen en dos dimensiones: largo y ancho.
Imagen invertida
Distancia focal.
Condensador.
Actividad. Calcule el poder de resolución del
microscopio que le proporcione el instructor.
2. Método para explicar la formación de la
imagen
Aumento y transporte de la imagen a través
de la propagación rectilínea de la luz.
Aumento total: Coeficiente de aumento (CA)
del objetivo x CA del ocular x C A del
multiplicador de aumentos (Si lo tiene).
B´´
B´
A
B
A´
A´´
Fig. 4. Formación de la primera y segunda imagen.
Aumento vacío: Aumento que no
proporciona más información sobre el
objeto.
Aumento útil: Es la apertura numérica que
permite conocer el poder de resolución del
microscopio (capacidad de resolver la
distancia entre dos puntos, que parecen ser
uno solo),
Actividad a) Investigue el aumento total y el
aumento útil de los instrumentos que le
proporcione el instructor. b) Anote la letra A
y la B en un acetato. Obsérvelas a través del
microscopio (3X, 10X) y reporte el plano de
observación e inversión observado.
9
3. Método para conocer las partes del
Carro y pinza
microscopio.
Tornillos de desplazamiento, Diafragma
Con el instrumento proporcionado por el
Tornillo del condensador, Revolver
instructor, identifique las siguientes partes
según el modelo y marca:
Función de los objetivos: Proporcionarnos un
a) Sistema óptico:
aumento estándar del objeto, de 3.2 X a 100
Ocular
X. En los microsdopios Carl Zeiss®, los
Objetivo
objetivos vienen graduados con información
Condensador
que indica:
Espejo
a) El aumento alcanzado (3.2 X; 10 X; 40X,
b) Sistema mecánico:
100 X). Permite calcular el aumento total.
Estativo
b) Apertura numérica: Mide el poder de
Pie
resolución del objetivo, permitiendo calcular
Tornillo de ajuste macrométrico
el aumento útil.
Tornillo de ajuste micrométrico
c) Distancia del ocular al objetivo: Regulada a
Platina
160 mm.
PRINCIPALES PARTES DEL MICROSCOPIO
Sistema óptico
Sistema mecánico
Ocular
•Tubo del ocular
Objetivos
•Estativo
Condensador
Filtros
•Carro y pinzas
•Platina
•Piñones de desplazamiento
del carro
•Diafragma
•Piñones de enfoque
Fig. 5. Principales partes del microscopio (Carl Zeiss©).
APROXIMADO Y FINO
10
d) Grosor del cubreobjetos (si requiere): 0.17
mm.
e) Línea superior de color: Aumento del
objetivo. Línea amarilla=10 X; Línea azul =
40X; Línea blanca = 100 X.
f) Línea inferior de color: Indica el líquido de
inmersión. Naranja: Glicerina (IR 1.455;
Negra: Solo aceite de inmersión (IR 1.515),
Blanca: Agua (1.333); Amarillo: Ioduro de
metilo (1.740). (Kapitza, 1997; Petraco &
Kubic, 2004).
Obviamente, esta información no está
estandarizada y varía de acuerdo a la marca.
Actividad. De acuerdo al modelo y marca del
microscopio, identifique las partes y
nomenclatura de los oculares y objetivos.
Fig. 6. Objetivos Marza Zeiss©. Flecha: Banda de
color indica el aumento. (Azúl=40X. Verde=20X)
4. Método para usar los principales
accesorios del microscopio:
Existen hoy en día infinidad de accesorios
para efectuar trabajos de investigación y
diagnóstico microscópicos. Entre ellos se
describirán como ejemplo la cámara lúcida y
el micrómetro ocular, aclarando que en la
actualidad se cuentan con micro proyectores
de laminillas, cámaras de circuito cerrado,
foto microscopios, equipos con interface a
equipos computacionales, etc.
a) Cámara lúcida: Diseñada por Wollaston en
1806, esta se emplea para elaborar
esquemas de protozoarios y helmintos
directamente del microscopio con la ventaja
de que se conserva la proporcionalidad del
tamaño y forma de las estructuras. Consta
de un adaptador para el ocular del
microscopio, filtros que regulan la intensidad
de luz emergente y un espejo que proyecta
la mano y lápiz del investigador al interior
del campo del microscopio permitiendo
seguir el contorno de las estructuras
calcándolo sobre papel.
Al utilizar este accesorio, se coloca el espejo
a 45 ° aprox. Ensamblándolo sobre el ocular
del microscopio y sujetándolo con el tornillo
11
correspondiente. Enseguida se enfoca la
preparación y se regula la intensidad de luz
con el diafragma iris, o bien, con uno de los
filtros de la cámara. El tornillo de enfoque
fino y diafragma se mueven repetidamente a
lo largo de la sesión, según los
requerimientos de la iluminación. La luz en el
exterior o ambiental, deberá ser tenue para
que no interfiera con la luz de la bombilla del
microscopio, impidiendo ver con claridad o
nitidez las estructuras a dibujar. Solo en
contorno o detalles gruesos de las
estructuras se dibujan con la cámara. Los
detalles finos se toman directamente del
microscopio, sin la cámara y si se requiere en
el objetivo de inmersión (100 X).
Una vez iniciada la sesión para elaborar el
esquema, es muy recomendable terminarlo
totalmente, pues es difícil volver a colocar el
organismo en la misma ubicación del
bosquejo anterior y que coincida en todos
sus contornos.
Actividad. Dibuje con la cámara lúcida, el
protozoario o helminto proporcionado por el
maestro o instructor.
b) Micrómetro ocular: Se le llama así a un
disco de acrílico o cristal que lleva impresa
una línea con 5 o 10 divisiones mayores,
entre las cuales aparecen 10 subdivisiones. A
cada una de las subdivisiones les
denominamos trazos, y una vez que se
cuenta la cantidad de trazos, estos se
multiplican por el factor de conversión
correspondiente al objetivo (10X, 40X ó 100
X) y al microscopio calibrado para este
efecto.
Material necesario para la calibración del
microscopio. a) Micrómetro ocular, consiste
en un círculo de 18 mm, con escala. b)
Acercamiento a la escala del micrómetro
ocular; consiste en una línea de 1 cm con
100 divisiones, c) Micrómetro objetivo para
calibrar la escala del ocular. Se muestra una
microescala de 2 mm con divisiones de 0.01
mm (10 mm cada una).
1. Proceso de calibración del microscopio:
Posicione la escala del micrómetro ocular
sobre la escala del micrómetro objetivo.
12
Enfocar. Hacer coincidir ambas líneas de los ceros.
Buscar las líneas donde vuelven a coincidir ambas escalas.
Fig. 7. Escala del micrometro ocular con 100 divisiones.
Fig. 8. Portaobjetos con la escala calibradora (micrómetro objetivo), donde cada linea está
separada 0.01mm (10 micrómetros) y sirve para calibrar el micrómetro ocular.
Escala del
micrómetro ocular
Escala del portaobjetos con
la escala calibradora
Fig. 9. Calibración del micrómetro ocular. 1) Girar el ocular para hacer coincidir los ceros de
ambas escalas. 2) Buscar lineas de coincidencia (flecha)
Ejemplo: 83 divisiones del micrómetro ocular
corresponden a 55 divisiones del micrómetro
objetivo (55 x 10 m, en objetivo 10X =
550 m). La escala de este último es de
1/100 (0.01 mm = 10 m). Dividiendo la
medida del micrómetro objetivo entre el
número de líneas del micrómetro ocular, se
obtiene la calibración correcta del objetivo
de 10 X en micrómetros.
Medida del micrómetro objetivo / Líneas del
micrómetro ocular = 550 m /83 = 6.62 m.
13
Realizar varios cálculos con las otras
coincidencias y obtener el promedio.
El valor solo es válido para el objetivo donde
se calibró. Puede variar si el ocular se cambia
a otro tipo de microscopio.
Actividad: Tabule los valores de calibración
en 10X, 40X y 100X. Diseñe una tabla de
calibración siguiendo el ejemplo hipotético
de abajo.
Tabla 1. Ejemplo de la conversión del
número de líneas a micrómetros según el
objetivo.
Número
de
líneas
1
2
3
4
5
etc.
50
CONVERSIÓN EN MICROMETROS
( m)
10X
40 X
100X
6.62
5
1
13.24
10
2
19.86
15
3
26.48
20
4
33.1
25
5
…
…
…
331
500
50
Mida cinco de los organelos u órganos
(según se trate) del parásito y repórtelos en
micrómetros.
c) Método para usar la cámara digital de
microscopio Moticam®.
1. Instale el programa del CD incluido en el
equipo. Siga las instrucciones de acuerdo al
fabricante.
3. Solamente
remueva un ocular del
microscopio e inserte la cámara digital
ensamblada como se muestra por el
instructor
4. Conecte el cable USB a la computadora y
examine la imagen en su programa de video
o fotografía favorito. Este es compatible con
software TWAIN (Motic,. 2007)
3. Coloque la laminilla del protozoario o
helminto proporcionado por el instructor
bajo la lente del objetivo, seleccione el área
que desea analizar y enfoque en la pantalla
de la computadora.
Fig. 10. Cámara para microscopio para digitalizar
imágenes de parásitos.
4. Grabe la (s) imágenes solicitadas por el
instructor en Microsoft Photo Editor®, Paint
® o Publisher® en JPEG o TIFF con el
nombre que desee en una unidad extraíble
(tarjeta de memoria, disco flexible, etc.)
14
Actividad: Identifique con la ayuda de
bibliografía, la morfología del parásito
indique cada uno de sus órganos
organelos, según se trate. Inclúyalo en
reporte de la práctica.
la
e
u
el
Resultados y Discusión
1) Reporte las actividades solicitadas en la
práctica apoyándose con la literatura
consultada.
2) Investigue sobre las aplicaciones de la
microscopía de contraste de fases y la
iluminación Köeler.
Cuidado del microscopio:
El microscopio es un instrumento valioso y
de precisión. Para que pueda funcionar
eficientemente, es necesario darle un
adecuado cuidado. Por ello debemos tener
presentes las siguientes normas:
que se rayen. No use solventes, las
superficies de los cristales también se
limpian con una tela de lino o algodón, no
con gamuza.
5. Inspeccione con frecuencia que los lentes
estén libres de los restos de aceite de
inmersión, huellas, maquillaje y trazas de
grasa.
6. No coloque el microscopio en el borde de
la mesa, un leve empujón o descuido
podrá derribarlo.
7. Trasládelo en posición vertical, sin
inclinarlo.
8. Enrolle el cable de luz apropiadamente.
9. Enfoque primero en panorámico, seco
débil, fuerte y finalmente, en el de
inmersión para evitar rayar o romper los
objetivos.
10. No desarme jamás, el microscopio, o le
quite oculares u objetivos para
intercambiarlos sin no tiene la asesoría o
preparación adecuada.
1. Si la lámpara está encendida no lo sacuda,
pues el filamento incandescente puede
romperse.
2. Si no está ocupando el microscopio,
protéjalo del polvo colocándole su funda.
El polvo es el peor enemigo.
3. Los oculares deben estar siempre
introducidos. Evite transportarlo de lado
para que no se desprendan y se rompan.
4. Elimine el polvo con algodón hidrófilo
humedecido con agua o con vaho
(aliento), sin tallar las lentes para evitar
15
® Zeiss: Marca Registrada por la Compañía
Carl Zeiss, Alemania. ® Microsoft Photo Bibliografía
Editor, Paint, Publisher: Marcas registradas
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Manual of Microscopy for Criminalists,
Chemists, and Conservators. CRC Press.
USA. 310 pp.
Sterrenburg, AS. 2005. Microscopy Primer.
Micscape Magazine. United Kindom.
17
PRÁCTICA 2
TÉCNICAS HEMATOLÓGICAS Y TISULARES
L Galaviz Silva
Introducción
Las técnicas para el estudio parasitológico de
sangre y tejidos se emplean para el
diagnostico de parásitos como son los
géneros
Plasmodium,
Leishmania,
Trypanosoma, etc. Cuando los parásitos
invaden y se reproducen en el interior de los
tejidos se les llama histozoicos, mientras
que aquellos que habitan el interior de
órganos huecos o lumen intestinal se les
llama celozóicos. Entre el grupo de los
metazoarios (pluricelulares) existe la
superfamilia Filarioidea (nemátodos) los
cuales habitan linfa y sangre, arrojando sus
embriones (microfilarias) en el torrente
sanguíneo. Estas son de gran importancia en
medicina humana en el Sur de nuestro país,
tal como es Onchocerca volvulus, causante
de la oncocercosis o ceguera de los ríos,
quien habita el tejido subepitelia (Garcia,
2001).
Objetivo general
Reforzar en el estudiante su habilidad para el
manejo de órganos y tejidos en el
diagnóstico de las parasitosis causadas por
protozoarios. Esta práctica corresponde a la
Unidad A (Protozoarios de importancia
médica) y Unidad E (Nemátodos de
importancia médica) de la carta descriptiva
de la materia.
Objetivos particulares:
1. El alumno practicará la realización de
frotis sanguíneos extendidos, gota gruesa
y preparación de improntas para estudio
histológico.
2. Aplicará las técnicas de fijación y tinción
(Giemsa,
Wright
y
combinada)
convencionales para la preservación y
estudio de las muestras.
Material
Para la obtención de la muestra de sangre y
realización de frotis extendidos se necesita
utilizar anticoagulantes, cualquiera de estos
pueden prepararse en el laboratorio (según
los reactivos disponibles) de la siguiente
manera:
A) Anticoagulante de Heller y Paul
Oxalato de potasio 0.8 g
Oxalato de amonio 0.2 g
Agua destilada. Aforar a 100 ml
18
Se emplea 1 ml de la solución por tubo de
ensaye. Se deja evaporar el agua en una
estufa. El residuo cristalino se mezcla con 10
ml de sangre.
B) Heparina en polvo
Utilizar 2 mg por cada ml de sangre. Se
puede disolver en etanol absoluto o agua y
evaporarlo antes de usar.
C) Citrato de sodio
Citrato trisódico
2g
Solución salina 0.85% 100ml
Utilizar 2ml por cada 8 ml de sangre.
D) EDTA. Se emplea 1-2 mg de EDTA en
polvo por cada mililitro de sangre.
Detalles de la preparación y el modo de
acción de cada anticoagulante, se describen
en Todd et al. (2005).
El instructor proporcionará al alumno el
siguiente material:
Microscopio
Jarras de tinción
MetanolCanastillas de tinción
Anticoagulante
Colorante de Wright
Colorantde Giemsa
Amortiguador de Giemsa y Wright
El alumno se responsabilizará de aportar el
material biológico para la práctica y el
siguiente material:
Portaobjetos (limpios y
desengrasados)
Aplicadores
Franela
Etanol 95° (no potable)
Jeringas de 1mL y 3-5mL
Cubreobjetos
Gasa
Algodón
Pipetas Pasteur
Método
1. Técnicas para realización de frotis e
improntas
a) Examen microscópico directo. Esta se
emplea como un procedimiento preliminar
para la detección de parásitos en sangre,
pero de ninguna manera, es definitivo para
un diagnóstico de certeza, siendo de gran
ayuda para los parásitos extracelulares como
tripanosomas o microfilarias.
1. Obtener sangre con jeringa preparada con
anticoagulante (según el procedimiento M21
recomendado por el INDRE, 2010) lancetas o
en el caso de ratones de laboratorio, por el
corte del ápice caudal. Depositar 1-2 gotas
en portaobjetos.
2.. Mezclar con una gota de solución salina
fisiológica si no se usó anticoagulante (en
mamíferos esta tiene una concentración
del 0.85%).
3. Depositar el cubreobjetos.
19
4. Examinar al microscopio. En muestras
recientes, los tripanosomas o microfilarias
se evidencian por su movimiento entre las
células sanguíneas. Es necesario que el
frotis no quede excesivamente grueso,
porque los eritrocitos enmascaran los
parásitos dificultando su diagnóstico.
b) Frotis extendido. Los frotis extendidos
son útiles para el estudio morfológico de los
parásitos intra e intercelulares. Además, con
estos se obtienen registros permanentes de
los parásitos, empleándose en las laminillas
en docencia, investigación ó bien como
preparaciones de referencia. Mayores
detalles de la preparación de los
portaobjetos, técnica del procedimiento se
citan en Todd et al. (2005) e INDRE (2010) en
el Procedimiento M7. La técnica es la
siguiente:
1.
Depositar una gota de sangre
(aproximadamente de 2-3 mm de dm)
cerca de un extremo del portaobjetos.
Usar solo portaobjetos nuevos, lavados
con
detergente,
enjuagados
y
desengrasados con etanol 95° o acetona,
sumergiéndolos en esta solución varios
días
antes.
45°
Fig. 11. Portaobjetos “extensor” sin
esquinas cortado con un lápiz de punta
de diamante.
Fig. 12. Desplazar con un
hacia el extremo opuesto.
2. Acercar el extremo des esquinado del
portaobjetos extensor a la gota de la
sangre y permitir que se difunda por
capilaridad en toda la orilla.
3. Inclinar el extensor en un ángulo de 45°
aproximadamente
y
desplazarlo
horizontalmente hacia la orilla opuesta de
la gota con un movimiento uniforme.
movimiento uniforme
4. Secar inmediatamente el frotis agitándolo
como abanico para fijar las células
sanguíneas. El propósito es realizar una
extensión de una sola capa de células
sanguíneas. El secado es importante para
evitar la crenación de las células. El secado
al aire funciona como un fijador físico,
comparable a los fijadores químicos como
20
el metanol o formaldehído que se emplean
para otros tipos de tejidos o células. Una
secadora de pelo o abanico pueden ayudar
a secar rápido la preparación. Si no se van a
teñir inmediatamente, guardar en un sitio
libre de polvo o insectos, o envolviéndolos
en papel absorbente.
agua lave todos los restos de células y
hemoglobina. Interrumpir el procedimiento
cuando la preparación adquiera una
coloración blanca u opaca. Si el
portaobjetos no está libre de grasa, esta
capa blanquecina no se adherirá a la
superficie.
c) Frotis de gota gruesa. Esta es una técnica
de “concentración” para parásitos,
considerándose así por la destrucción
selectiva de eritrocitos, quedando en la
preparación solamente las formas parásitas
y los núcleos de las células blancas (Garcia,
2001; Trujillo et al., 2001; Todd et al.,
2005).
5. Colocar verticalmente sobre un papel filtro
o absorbente y escurrir el exceso de agua.
Teñir con el colorante de Giemsa, sin el paso
de fijación por metanol. La inmersión en
agua destilada, tiene como objeto lisar el
resto de las células sanguíneas que quedaron
intactas y eliminar la hemoglobina, por lo
tanto, solo deben observarse núcleos de las
células blancas y los parásitos si la muestra
es positiva.
1. Si se usa lanceta, se limpia la yema del
dedo o el lóbulo de la oreja con una
torunda de algodón empapada en alcohol
etílico al 70% y se deja secar. Si es por
punción venosa, siga las instrucciones del
maestro. Depositar 1-2 gotas de sangre
obtenidas por lanceta. o punción venosa.
en el centro del portaobjetos, desechando
la primera gota (Procedimiento M9 del
INDRE, 2010).
2. Macerar los eritrocitos girando sobre la
muestra con la esquina de un portaobjetos
por 0.5-1 cm.
3. Secar el frotis protegiéndolo de los
insectos y el polvo.
4. Una vez seca la preparación, sumergir el
frotis en agua destilada. Esperar a que el
d) Técnica para realización de improntas.
Para los tejidos obtenidos por biopsias o por
autopsias de animales, las improntas suelen
ser una técnica económica y sencilla para la
detección de parásitos. El órgano o tejidos a
estudiar, depende del parásito estudiado.
Para Leshmania donovani las improntas se
realizan con muestras de bazo, hígado o
nódulos linfáticos. En el caso de L. tropica se
selecciona el borde indurado de la lesión. En
L. braziliensis el borde indurado de las
úlceras sobre la piel, nódulos o ulceraciones
sobre la membrana mucosa. En estudios de
T. cruzi, los tejidos se estudian por autopsia
seccionando el músculo esquelético,
corazón, bazo, hígado, nódulos linfáticos y
21
de ser posible el chagoma. En Sarcocystis
lindermani los quistes se localizan en
músculo, principalmente esófago, diafragma,
abdomen y tórax. Toxoplasma gondii se
puede detectar en bazo, pulmón, hígado,
nódulos linfáticos, cerebro y otros tejidos en
casos agudos. Pneumocystis carinii
es
común
en
pulmones.
Tripanosoma
gambiense y T. rhodesiense se encuentran en
nódulos linfáticos. Las improntas son
principalmente útiles para el estudio de
protozoos en tejidos, porque quedan más
libres en comparación con los cortes
histológicos, donde se obtiene una masa
compacta de organismos embebidos en el
tejido. Las biopsias de piel son útiles para
diagnosticar amebiasis
cutánea y las
microfilarias. En biopsias de músculo se
pueden detectar a Trichinella spiralis,
Cysticercus cellulosae y en muestras de colon
y recto se demuestran huevos de
esquistosomas.
Portaobjetos
En los helmintos también, es conveniente
cuando se estudian estadios larvarios de
microfilarias en piel o nódulos linfáticos.
Detalles especiales sobre improntas de piel
se detallan en el Procedimiento M12 del
INDRE (2010).
1. Lavar la muestra de tejido con agua
destilada, eliminando el exceso de
líquidos tisulares.
2. Cortar un trozo de tejido. Eliminando
nuevamente cualquier exceso de sangre
con agua destilada y secar con papel
absorbente.
3. Envolver en un extremo del portaobjetos,
una tira de aproximadamente 5 cm por 1.
5 cm.
4. Adherir la muestra de tejido a la tira de
papel, de manera que la zona del corte
permanezca expuesta.
5. Acercar el portaobjetos limpio y libre de
grasa, hasta hacer contacto con el tejido.
Retirar una vez que se imprima en el
portaobjetos. Secar a temperatura
ambiente o en incubadora a 37°C.
Papel
absorbente
Trozo de tejido
Fig. 13. Técnica para improntas. Enrollar (3 o 4 vueltas) el extremo del portaobjetos con el papel
absorbente y sobre él, adherir el trozo de tejido. Imprimir la “huella” del tejido sobre el otro
portaobjetos.
22
6. Teñir con Giemsa, Wright o combinada.
Transparentar en Xilol y montar en resina
sintética. Si lo prefiere en vez de montar,
agregué aceite de inmersión al tejido y
examine al microscopio.
e) Técnica para concentración de
tripanosomas por triple centrifugación. Esta
se recomienda para el examen y
recuperación de parásitos en hospederos
inoculados experimentalmente, o con
infección natural, pero también, evadiendo
el primer paso, se pueden recuperar
tripanosomas de heces de triatominos para
inoculación en ratones, medio de cultivo,
determinación de parasitemias o elaboración
de laminillas, Preparar recientemente citrato
de sodio al 6% en agua destilada.
1. Mezclar 9 ml de sangre y 1ml de citrato de
sodio al 6%.
2. Centrifugar a 300 x g por 10min.
3. Transferir el sobrenadante a otro tubo y
centrifugar a 500 x g por 15min.
4. De nuevo, transferir el sobrenadante a
otro tubo y centrifugar a 900 x g.
5. Decantar el sobrenadante y examinar el
sedimento
al
microscopio
en
preparaciones húmedas o extender el
sedimento en un portaobjetos y teñir con
Giemsa (Garcia, 2001; Cerrada-Bravo,
2004).
2. Técnicas de tinción
La preparación de los colorantes en el
laboratorio se realiza con días o semanas de
anticipación, debido a que estos requieren
de un proceso de “maduración” en frascos
ámbar protegiéndolos de la luz. La
“maduración” permite que las soluciones
adquieran sus propiedades adecuadas para
teñir constituyentes celulares acidófilos y/o
basófilos propias. Los colorantes en polvo,
deberán mostrar una certificación como es la
que extiende la Biological Stain Commision,
University of Rochester, Medical Center,
Rochester, NY y el número correspondiente
de certificación.
a) Técnica de Giemsa.
Solución madre del colorante de Giemsa.
Solución madre:
Colorante de Giemsa en polvo (tipo azure B)
0.60 g
Alcohol metílico absoluto, libre de acetona
50 ml
Glicerina neutra
50 ml
Moler pequeñas alícuotas del colorante y la
glicerina en mortero y colectarlas en un en
matraz de 500 ml. Tapar el envase con una
torunda de algodón y tapón de papel.
Colocar el matraz en baño maría a 55-60°C
por 2 h. Agitar suavemente en intervalos de
30 min. Al terminar de moler el colorante y
la glicerina, enjuague con el alcohol metílico
23
el mortero y después guardarlo en un envase
bien cerrado
de trabajo de amortiguador de fosfatos se
ajusta de acuerdo al pH requerido.
Al terminar el baño maría, dejar enfriar a
temperatura ambiente. Agregue el metanol y
agite bien la mezcla. Filtre el colorante en
papel Whatman 1 y almacene dividiéndolo
en varios frascos ámbar de 30 ml para evitar
una posible contaminación de la solución
madre. Es recomendable dejarlo madurar
por 3 semanas, agitándolo periódicamente.
Esta solución, se diluye para preparar la
solución de trabajo en una proporción de
1:10 a 1:50 con amortiguador de fosfatos. La
dilución varía según el tiempo de tinción que
se desea usar. Una regla general para la
dilución contra el tiempo de tinción es la
siguiente: Si la dilución es 1:20, teñir por 20
min. Si la dilución es 1:30, teñir por 30 min.
El tiempo de tinción promedio oscila entre
30 a 40 min. Si este excede una hora, será
recomendable aumentar la proporción de la
solución madre o prolongar el tiempo de
maduración. El núcleo de los leucocitos debe
verse azul violeta; los neutrófilos rojopúrpura con granitos violeta en el
citoplasma. En los parásitos de la malaria se
observa la cromatina roja con o sin gránulos
de pigmento y citoplasma azul. La solución
Amortiguador de fosfato monobásico
Na2HPO4
9.2 g
Agua destilada
1,000 ml
Amortiguador de fosfato dibásico
Na2HPO4 anhidro
9.5 g
Agua destilada
1,000 ml
1. Fijar la preparación en metanol por 1 min.
Escurrir el exceso de alcohol.
2. Sumergir en la solución de trabajo del
colorante de Giemsa recién preparada
diluida 1:10 a 1:50 en amortiguador de
fosfatos (pH 7.0a 7.2). El tiempo de
tinción óptimo será proporcionado por el
instructor.
3. Eliminar el exceso de colorante
sacudiéndolo sobre la misma cubeta de
tinción.
4. Sumergir por 3 min. en amortiguador de
fosfatos a pH 7.0 (o bien en una cubeta
con agua de la llave con unas gotas de
colorante). Lave con agua destilada o al
chorro de agua para eliminar algunas
partículas precipitadas del colorante y
dejar secar en posición vertical.
5. Examine al microscopio impregnando la
preparación en aceite de inmersión.
24
Tabla 2. Preparación de amortiguador según el pH requerido
Mililitros de:
pH
Na2HPO4
(9.5g/L)
NaH2PO4H2O
(9.2 g/L)
Agua
destilada
6.6
6.8
7.0
7.2
37.5
49.6
61.1
72.0
62.5
50.4
38.9
28.0
900
900
900
900
Esta mezcla se deja madurar por transcurso
de una semana. A diferencia del Giemsa,
esta se emplea como solución de trabajo
directamente.
b) Técnica de Wright
Colorante de Wright.
Colorante de Wright en polvo (certificado)
0.9 g
Metanol absoluto, libre de acetona
500 ml
Se muele en mortero los0.9 g de colorante
con 15 ml de metanol. Se agrega el metanol
gradualmente mientras se muele, agregue
mas metanol, vacié gradualmente en un
frasco ámbar hasta que se termine el
metanol. Almacenar en un frasco bien
cerrado y agite periódicamente por al
menos 5 días. Filtre el papel Whatman N° 1
y distribuir alícuotas en varios envases.
1. Sumergir el frotis en el colorante de
Wright (o cubrirlo en posición
horizontal) por 2-3 min. 2. Eliminar el
colorante sacudiéndolo en el fregadero
o sobre la jarra de tinción.
3. Agregar o transferir el frotis al
amortiguador de fosfatos (pH 7.0) por 48 min. Debe aparecer una película verde
metálica sobre el frotis.
4. Lavar en agua corriente y luego en agua
destilada. Dejar secar y examine con
aceite de inmersión.
c) Técnica combinada
En esta técnica de emplean los colorantes
de Giemsa y Wright, aprovechando al
máximo las propiedades de tinción
25
diferencial de ambos. Se aplica en frotis
extendidos e improntas, preferentemente.
1. Sumergir la preparación en el colorante
de Wright por 3 a 5 min. Sacudir el
exceso de colorante.
2. Sumergir en el colorante de Giemsa por
30-40 min.
3. Equilibrar la tinción en amortiguador de
fosfatos buffer de Giemsa por 3 min.
Lavar en agua de la llave y dejar secar
antes de examinarlo al microscopio.
26
Resultados y Discusión
1. Esquematice las células y parásito observados en el examen directo (10X, 40X y 100 X).
2. Esquematice las formas parásitas y células y sanguíneas observados en frotis extendido (10X,
40X y 100 X).
3. Esquematice las células y/o parásitos observados en la técnica de gota gruesa.
27
4. Esquematice de las laminillas de colección, cuatro parásitos diferentes que habiten o se
reproduzcan en sangre y tejidos. Consulte la morfología en la literatura correspondiente.
Conclusiones
Literatura consultada (por el alumno)
28
Bibliografía
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Programa Académico de la Asignatura de
Microbiología y Parasitología.
Departamento de Microbiología y
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29
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Uribarren Berrueta T. 2004. Recursos en
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Parasitología, UNAM. México, D.F.
http://www.facmed.unam.mx/
marco/index.php?dir_ver=87.
Acceso
Marzo 27, 2010.
30
PRÁCTICA 3
PROTOZOARIOS HEMOFLAGELADOS
Z J Molina Garza
Introducción
Los protozoarios se ordenan principalmente
según el tipo de organelos de locomoción
que presentan. Aquellos que poseen
flagelos, se les llama comúnmente
flagelados por ejemplo, y como parasitan
y/o se reproducen el torrente sanguíneo se
les
conoce
como
hemoflagelados,
pertenecen al Filum Euglenozoa, Clase
Kinetoplastea
y
la
familia
Tripanosomatidae. Los tripanosomatidos
que causan enfermedades en el ser humano
y animales domésticos y silvestres son del
género Trypanosoma y Leishmania. Estos
son heteroxenos (con unas excepciones)alguno de sus estadios de vida viven en
sangre o y/o tejidos de toda clase de
vertebrados, mientras que otros estadios
habitan
el
aparato
digestivo
de
invertebrados hematófagos. Todas las
especies se dividen por fisión binaria
longitudinal (asexual), son alargadas, con un
solo flagelo y membrana ondulante, o
redondas y con un flagelo muy corto que no
sobresale de la membrana celular,
uninucleadas. El flagelo se origina en el
blefaroplasto o cuerpo basal, asociado
íntimamente al cinetoplasto (cuerpo
parabasal) en forma de disco o salchicha.
Los organismos del género Trypanosoma y
Leishmania, pasan por todas o algunas de
las cuatro fases de desarrollo o estadios
(Beaver et al., 2003; Uribarren Berrueta,
2004) que se describen brevemente a
continuación:
A) Amastigote (forma tipo, Leishmania):
Células esféricas, con un núcleo,
aflageladas y cinetoplasto prominente
entre el núcleo y la membrana celular.
Habitan el interior de las células
incluyendo macrófagos.
B) Promastigote (Leptomona): Cuerpo
fusiforme o de hoja, flagelo solitario en
el extremo anterior sin membrana
ondulante, cinetoplasto inmediatamente
en la base del flagelo. Esta forma es la
que se desarrolla en los hospederos
invertebrados del género Leishmania y
Trypanosoma o en los medio de cultivo
artificiales.
C) Epimastigote (Blastocrithidia): Cuerpo
fusiforme o de hoja, el flagelo emerge de
la región medial o medio-anterior de la
célula
formando
una
pequeña
membrana ondulante entre el flagelo y la
membrana celular. Cinetoplasto frente al
margen anterior del núcleo. En el género
31
Trypanosoma, esta fase se desarrolla en
el intestino de los vectores.
D) Tripomastigote (Trypanosoma): Cuerpo
fusiforme o en forma de hoja,
cinetoplasto cerca del extremo posterior
de donde emerge el flagelo formando la
membrana ondulante. Estadio o fase de
desarrollo que se presenta en sangre o
linfa los vertebrados y en intestino de
invertebrados.
Objetivo general
Proporcionar al estudiante la información
práctica sobre la morfología de los
protozoarios
hemoflagelados
de
importancia médica y veterinaria en México
y el mundo. Lo anterior, mediante el
examen de preparaciones permanentes de
los mismos, capacitándolo para efectuar
diagnósticos parasitológicos de certeza y
aumentar su destreza en el campo de la
investigación clínica o en el campo de la
biología (crecimiento y reproducción) de
este grupo de protozoarios. Esta práctica
concuerda con la teoría de la Unidad B (B1 a
B5, Flagelados de sangre y tejidos) de la
carta descriptiva de la materia.
Objetivos particulares:
1. Examinar
preparaciones
permanentes de los agentes
etiológicos de la tripanosomiosis y
leishmaniosis, causantes de la
tripanosomiosis
americana,
enfermedad
del
sueño
y
leishmaniosis visceral o kala-azar.
2. El estudiante comprobará además,
los cambios morfológicos que
presentan estos protozoarios al
crecer en medios de cultivo artificial
o bien, al crecer en diferentes
tejidos u hospederos, mediante el
examen al microscopio de laminillas
permanentes.
Material
El instructor le proporcionará preparaciones
permanentes
entre
portaobjetos
y
cubreobjetos de la colección que
corresponden a Trypanosoma cruzi, T.
gambiense, T. rhodesiense, Leishmania
donovani, L. brazilienses, L. tropica y L.
mexicana, estos obtenidos de sangre o
tejido infectado, cortes histológicos así
como de medios de cultivos.
Cada estudiante aportará lápices para
colorear, cuaderno de hojas blancas para
dibujo y lápiz.
Método
Coloque las laminillas de colección que le
proporcione el instructor en el microscopio
y esquematice los protozoarios en los
objetivos de 10X, 40X y 100X, coloreándolos
según las estructuras. Identifique o consulte
32
la morfología característica de cada uno y
señale con una flecha el nombre de cada
organelo.
Resultados y discusiones.
En cada una de los siguientes esquemas,
señale el nombre del estadio o fase de
desarrollo, estructuras subcelulares, tipo
de tejido o células donde se localiza y la
técnica
de
tinción.
Indique
las
características diagnósticas de cada
parásito.
1. Trypanosoma cruzi en corazón.
2. T. cruzi en frotis sanguíneo
3. T. rhodesiense en frotis sanguíneo
4. T. gambiense en frotis sanguíneo
33
5. Trypanosoma en cultivo.
6. T. gambiense. Corte histológico de cerebro
7. Leishmania donovani en hígado
8. Leishmaniosis mexicana cutánea.
34
9. L. tropica en cultivo
10. L. donovani en
cultivo.
Literatura consultada (por el alumno)
Bibliografía
Beaver, PC, Jung, RC & EW Cupp.
2003. Parasitología Clínica. 2003.
3° ed. Masson Doyma México,
S.A. México, DF. 823 pp.
Botero D. & M. Restrepo. 2005.
Parasitosis humanas. 4° ed.
Quebecor Word, Bogota,
Colombia. CIB. 235-237 pp.
Carrada-Bravo
T.
2004.
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