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Universidad de La Habana
Facultad de Biología
Selección de un modelo celular para evaluar la
influencia de la sobre-expresión del gen supresor
de tumores Cdh1 en células tumorales
Autor: Dayana Pérez Martínez
Tutores: Dr. Joel de León Delgado / Lic. Anett Rubio Torres
Centro de Inmunología Molecular
La Habana, junio 2015
“Lo importante en ciencia no es tanto obtener nuevos hechos
como descubrir nuevas formas de pensar sobre ellos.”
William Lawrence Bragg
A las personas que confían y apuestan por mi
Índice
Índice
1. Introducción ...........................................................................................................................................1
2. Revisión bibliográfica ............................................................................................................................3
2.1 La molécula Cdh1 .................................................................................................................................3
2.1.1 Cdh1 como co-activador del APC/C ..................................................................................................3
2.1.2 Cdh1 como gen supresor de tumores ...............................................................................................5
2.2 Regulación de la actividad del APC/CCdh1 .............................................................................................6
2.3 Blancos del APC/CCdh1 .........................................................................................................................10
2.3.1 Regulación de la expresión de Plk1 .................................................................................................10
2.3.2 Regulación de la expresión de Aurora quinasa A ............................................................................12
2.3.3 Relación indirecta del APC/CCdh1 con p27 ........................................................................................13
3. Materiales y métodos..........................................................................................................................15
3.1 Líneas celulares ..................................................................................................................................15
3.2 Condiciones de cultivo celular............................................................................................................15
3.3 Sincronización en la fase G2/M del ciclo celular ................................................................................15
3.4 Ensayos de citometría de flujo ...........................................................................................................16
3.5 Ensayos de Western Blot ....................................................................................................................17
3.6 Procesamiento de los datos ...............................................................................................................18
4. Resultados............................................................................................................................................19
4.1 Comparación de los niveles de expresión de la proteína Cdh1 en líneas tumorales humanas de
diferentes localizaciones. .........................................................................................................................19
4.2 Determinación de los niveles de expresión de la proteína Cdh1 en líneas tumorales humanas de
origen mamario. .......................................................................................................................................19
4.3 Determinación de la expresión del inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas p27 y de los
blancos moleculares de Cdh1, AURKA y Plk1, en líneas tumorales humanas de origen mamario. .........21
4.4 Determinación de la expresión proteica de Cdh1 en líneas tumorales murinas de origen mamario.
..................................................................................................................................................................24
5. Discusión ..............................................................................................................................................26
6. Conclusiones ........................................................................................................................................30
7. Recomendaciones ...............................................................................................................................31
8. Referencias bibliográficas ...................................................................................................................32
Introducción
1. Introducción
El ciclo celular requiere de proteínas reguladoras para la correcta multiplicación de las células.
Dentro de estas proteínas se pueden citar las ciclinas, las quinasas dependientes de ciclinas,
las proteínas inhibidoras de estas quinasas, así como las proteínas de control que a su vez
determinan el funcionamiento de las anteriores (Vermeulen y cols., 2003). Fallas en la actividad
de estas moléculas conllevan al desarrollo y acumulación de aberraciones genéticas que, junto
a otros factores intrínsecos y extrínsecos, favorecen el desarrollo de neoplasias (Hartwell y
Kastan, 1994). La relación directa entre las afectaciones en el funcionamiento y expresión de
estas moléculas reguladoras y la aparición de diferentes tipos de cáncer se ha demostrado
(Sherr, 1996; Park y Lee, 2003). Por ello, la búsqueda de blancos terapéuticos relacionados
directamente con la dinámica del ciclo celular representa una estrategia para combatir esta
enfermedad (McDonald y el Deiry, 2000). En este marco emerge el gen supresor de tumores
Cdh1 (del inglés, Cdc20 homologue 1) como blanco atractivo en la terapia antitumoral.
Cdh1 es una proteína de 55 kDa que actúa como co-activador del Complejo Promotor de la
Anafase/Ciclosoma (APC/C; del inglés, Anaphase Promoting Complex/Cyclosome). Al asociarse
a este complejo, juega un rol fundamental en el control de la mitosis mediando la ubicuitinación
y degradación de importantes reguladores mitóticos, tales como las ciclinas A y B1, securina,
geminina, Polo-like quinasa 1 (Plk1, del inglés Polo-like kinase 1) y Aurora quinasa A (AURKA,
del inglés Aurora A kinase) (Peters, 2006; Li y Zhang, 2009). El APC/C humano es una
ubicuitín-ligasa E3 compuesto por la asociación de más de una docena de subunidades
distintas, alcanzando un peso molecular aproximado de 1.5 MDa (Peters, 2006). Los dos coactivadores más estudiados que determinan la especificidad de sustratos de esta ubicuitínligasa son las proteínas adaptadoras Cdc20 (del inglés, cell division cycle 20) y Cdh1. En el
ciclo celular Cdc20 se une al APC/C en la mitosis temprana para promover la transición de
metafase a anafase, mientras que Cdh1 se une al APC/C en la mitosis tardía y extiende su
actividad hasta la fase G1 donde evita la entrada prematura a la fase S (Li y cols., 2007; 2008;
García-Higuera y cols., 2008). APC/CCdh1 promueve los eventos de diferenciación celular al
coordinar la salida de la mitosis y la detención del ciclo en la fase G1 (Wäsch y cols., 2010).
También contribuye a la integridad genética de las células, ya que participa en las rutas de
señalización apoptóticas ante la presencia de daños en el ADN (Qiao y cols., 2010), así como
en los puntos de control que evitan el progreso del ciclo celular ante estos mismos daños. La
afectación de la expresión de Cdh1 provoca la acumulación de sus blancos moleculares,
algunos de los cuales potencian la proliferación celular causando una menor fidelidad de la
duplicación del material genético (García-Higuera y cols., 2008). Por tanto, la afectación de la
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Introducción
funcionalidad de la proteína Cdh1 conlleva a trastornos importantes en la dinámica del ciclo
celular, lo que podría desencadenar el desarrollo de neoplasias.
Por otra parte, se ha demostrado la relación entre APC/CCdh1 y el metabolismo energético. Esta
ubicuitín-ligasa reconoce y destina a la degradación a dos enzimas metabólicas relevantes para
la proliferación de las células tumorales, la PFKBR3 (del inglés, 6-phosphofructo-2kinase/fructose-2,6-bisphosphatase) y la GLS1 (glutaminasa 1) (Moncada y cols., 2012). Las
células tumorales expresan preferentemente PFKBR3, lo que favorece la ruta glicolítica y el
efecto Warburg (Chesney y cols., 1999; Yalcin y cols., 2009). GLS1 es crucial para el consumo
de la glutamina en el paso de la fase S a la mitosis (Pérez y cols., 2005).
Varias investigaciones relacionan la afectación de la expresión y funcionalidad de Cdh1 con el
desarrollo de tumores. Wang y Kung en el 2012 expusieron que debido a la acción de la
quinasa MAK (de inglés, Male germ cell Associated Kinase), Cdh1 es poco funcional en el
cáncer de próstata. Además, se han encontrado diferencias significativas en el nivel de esta
proteína entre tejidos normales y los respectivos tejidos tumorales, por ejemplo en el cáncer de
recto, pulmón, ovario, próstata, colon y mama (Fujita y cols., 2008; 2009). En particular, se ha
indagado sobre el valor pronóstico de Cdh1 en el cáncer de mama y se ha demostrado que
altos niveles relativos de esta proteína se asocian a una mayor supervivencia en pacientes con
dicha enfermedad, lo que puede convertir a Cdh1 un novedoso biomarcador para este tipo de
neoplasia (Fujita y cols., 2008).
El diseño de una estrategia para manipular la expresión de la molécula Cdh1 e incidir sobre la
tumorigenicidad requiere de la selección de un modelo relevante de células neoplásicas.
Considerando este hecho y los antecedentes antes expuestos, se propuso como objetivo
general del trabajo: seleccionar un modelo celular para estudiar la influencia de Cdh1
sobre la tumorigenicidad, basado en la determinación de la expresión de este gen
supresor de tumores y de moléculas relacionadas con su funcionalidad. En
correspondencia, se trazaron los siguientes objetivos específicos:
1. Comparar la expresión de Cdh1 en líneas tumorales de diferentes localizaciones,
sincronizadas o no en la fase G2/M del ciclo celular.
2. Evaluar la expresión de AURKA y Plk1, blancos moleculares de Cdh1, así como del inhibidor
de las quinasas dependientes de ciclinas p27 en células tumorales.
El presente estudio permitirá comparar la expresión de Cdh1 entre diferentes líneas tumorales y
brindará información sobre la expresión de sus blancos, lo cual servirá como herramienta para
la correcta selección de un posible modelo celular sobre el cual se evaluará la relevancia de la
sobre-expresión de Cdh1 en la tumorigenicidad de las células.
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Revisión bibliográfica
2. Revisión bibliográfica
2.1 La molécula Cdh1
2.1.1 Cdh1 como co-activador del APC/C
El APC/C es una ubicuitín ligasa E3 que regula progresión del ciclo celular. Está compuesta por
alrededor de 14 subunidades distintas que se ensamblan en un complejo llegando a alcanzar
más de 1.2 MDa (Zhang y cols., 2013). Este complejo es imprescindible en las células
eucariotas, puesto que de él depende la separación de las cromátidas en la anafase y por tanto
la realización completa de la mitosis, así como los eventos necesarios para la replicación del
ADN en la fase S (Peters, 2006). Además se ha demostrado que la inactivación genética de
APC/C causa letalidad en todas las especies evaluadas (Wirth y cols., 2004).
Las funciones de este complejo de proteínas dependen de su capacidad de ensamblar cadenas
de poliubicuitinas sobre las proteínas diana, las que son destruidas por el complejo de
proteasoma 26S. Los sustratos del APC/C pueden ser proteínas catalíticas, como es el caso de
AURKA y Plk1, o activadores de estas, como por ejemplo las ciclinas, las cuales constituyen
subunidades activadoras de las quinasas dependientes de ciclinas (Cdk, del inglés cyclin
dependent kinase). El APC/C también puede estimular la actividad enzimática a partir de
favorecer la proteólisis de sus inhibidores, como el caso de la securina, cuya degradación
estimula la actividad de la enzima separasa importante en la disociación de las cromátidas
hermanas durante la anafase (Peters, 2006).
La actividad del APC/C es dependiente de varias proteínas co-activadoras que se vinculan al
complejo durante períodos específicos del ciclo celular. Las mejores estudiadas son las
proteínas Cdc20 y Cdh1, las que se codifican en todas las células eucariotas. APC/CCdc20 está
activo en los momentos iniciales de la mitosis, mientras que APC/CCdh1 se activa en la etapa
final de la mitosis y se mantiene durante la fase G1, para luego inactivarse nuevamente en el
tránsito a la fase S (Peters, 2006). Las proteínas co-activadoras, cuya asociación con APC/C
está estrictamente regulada, le confieren especificidad a la acción del APC/C al contar con
motivos de reconocimiento específicos para las llamadas cajas de destrucción D (Glotzer y
cols., 1991) y cajas KEN encontradas en los sustratos, las cuales determinan el tiempo de vida
media de los mismos (Pfleger y Kirschner, 2000). Los sustratos con caja D son reconocidos por
ambos co-activadores, mientras que los que cuentan con caja KEN solo se reconocen por Cdh1
(Pfleger y cols., 2001). Las regiones comprometidas con dicho reconocimiento se encuentran en
el N-terminal de estos co-activadores y son funcionalmente activas independientemente de que
estos estén unidos al APC/C (Pfleger y cols., 2001). Estudios previos demuestran que la
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Revisión bibliográfica
afectación mínima de esta región puede ser fatal para la identificación de las moléculas blancos
tales como las ciclinas (Sorensen y cols., 2001). Además, Passmore y Barford evidenciaron en
el 2005 que la interacción óptima de los sustratos con el APC/C es específicamente
dependiente de la asociación simultánea con el co-activador Cdh1, lo cual explica la existencia
de una relación estequiométrica entre ellos, donde, según estos resultados, Cdh1 representa
una molécula limitante al comprarse con las cantidades del APC/C. Adicionalmente, la actividad
ubicuitín-ligasa de los APC/CCdc20 y APC/CCdh1 se puede ver limitada por la fosforilación de sus
sustratos en sitios específicos que impidan una adecuada interacción y reconocimiento entre
estas moléculas (Mailand y Diffley, 2005).
La inactivación del APC/CCdh1, al terminar la fase G1, es determinante para la acumulación de
proteínas requeridas para la replicación del ADN y la mitosis. Los mecanismos descritos como
inhibidores de la actividad de este complejo incluyen la degradación en la fase G1, por el propio
APC/CCdh1, del componente funcional del complejo UBCH10 (del inglés, ubiquitin-conjugating
catalytic human 10), lo que favorece la acumulación de sustratos como la ciclina A. Esta última
es un activador de la Cdk2, la que fosforila Cdh1 y favorece su disociación del APC/C. Una vez
fosforilado, Cdh1 es ubicuitinado por otra familia de ubicuitín-ligasa y degradado por el
proteasoma 26S (Peters, 2006). Adicionalmente, la proteína Emi1 (del inglés, early mitotic
inhibitor 1), cuya expresión se estimula en la transición G1-S, inhibe a APC/CCdh1 y APC/CCdc20,
lo que favorece la acumulación de los sustratos de estos complejos en este momento del ciclo
(Reimann y cols., 2001; Hsu y cols., 2002).
Los mecanismos de control que operan durante la fase G0-G1 del ciclo celular influyen en la
capacidad de la célula de: replicar su ADN y dividirse, o abandonar el ciclo celular y comenzar
el proceso de diferenciación. Precisamente, APC/CCdh1 coordina ambos fenómenos a partir de
determinar los niveles de expresión de proteínas que conducen a las células por un camino u
otro. La desregulación de este complejo provoca la progresión del ciclo limitando los eventos de
diferenciación y potenciando la inestabilidad genética (Qiao y cols., 2010). Por tanto, la
reducción en la expresión de Cdh1 puede favorecer la tumorigénesis, a partir de estimular la
proliferación de células pobremente diferenciadas y genéticamente inestables (Wäsch y cols.,
2010). Lo anterior se explica por la acumulación de sustratos del APC/CCdh1 cuya expresión
aberrada contribuye a la inestabilidad genética, tales como AURKA y Plk1, los que se
encuentran incrementados en múltiples tipos de tumores (Wäsch y Engelbert, 2005; Lehman y
cols., 2007).
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Revisión bibliográfica
2.1.2 Cdh1 como gen supresor de tumores
En la actualidad, la relevancia funcional de Cdh1 ha determinado que esta molécula sea
considerada un gen supresor de tumores. La importancia de la misma ha sido evidenciada dado
que se ha demostrado que las células deficientes de Cdh1 manifiestan alteraciones en la
proliferación y acumulan aberraciones cromosómicas, a la par de que animales heterocigóticos
de este gen desarrollan tumores espontáneos (García-Higuera y cols., 2008). La regulación
negativa en la expresión de Cdh1 ha sido detectada tanto en cánceres hematológicos como en
tumores sólidos (Engelbert y cols., 2008). Tal disminución, respecto a la contraparte del tejido
normal, se ha demostrado además en cortes de tejidos tumorales de diversas localizaciones
(Fujita y cols., 2008). Además, se ha descrito en una diversidad de tumores humanos el
incremento en la expresión de la molécula Emi1, que como se comentó anteriormente ejerce un
control negativo sobre la expresión de Cdh1 (Lehman y cols., 2007). En pacientes con tumores
de mama no se han demostrado diferencias significativas entre la expresión de Cdh1 y el
estado de la enfermedad, el tamaño del tumor o la presencia de metástasis. Sin embargo, en
estos mismos pacientes, sí se ha demostrado una correlación inversa entre el intervalo libre de
enfermedad y los niveles de expresión de Cdh1 (Fujita y cols., 2009). En modelos tumorales de
carcinoma mamario se ha demostrado que la manipulación in vitro de Cdh1 conduce a
incrementar o reducir la tumorigenicidad de líneas celulares, en dependencia de la modulación
negativa o la sobre-expresión de esta molécula, respectivamente (Fujita y cols., 2009).
Los mecanismos que pueden contribuir al carácter de gen supresor de tumores conferido a
Cdh1 se relacionan con el efecto de este co-activador sobre eventos que rebasan el control
directo del ciclo celular. Esto es debido a su relación con otras proteínas importantes en la
biología tumoral, ya sean oncogenes u otros genes supresores de tumores. En este sentido, se
ha demostrado la capacidad de Cdh1 de ubicuitinar la molécula Skp2 (del ingés, S phase
kinase-associated protein 2), lo que determina la estabilización del gen supresor de tumores
p27 quien limita la transición de G1-S y posibilita la realización de este punto de control del ciclo
celular (Fujita y cols., 2008; 2009). En tumores donde el oncogén Akt (proteína quinasa B) se
encuentra activado, la fosforilación de Skp2 la hace insensible a la degradación por APC/CCdh1,
lo que trae como consecuencia la reducción en la expresión de p27 y la pérdida de este punto
de control (Gao, 2009). A esto se suma el gen supresor de tumores retinoblastoma quien ejerce
su actividad por un mecanismo dependiente de APC/CCdh1, también asociado al control de p27
(Santamaría y Pagano, 2007). Otro gen supresor de tumores, PTEN (del inglés, phosphatase
and tensin homolog), cuya actividad determina el control de Akt, contribuye a estabilizar la
actividad de Cdh1 por un mecanismo independiente de su actividad fosfatasa (Song y cols.,
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Revisión bibliográfica
2011). Por otra parte uno de los eventos más sorprendentes es que se ha demostrado la
participación de Cdh1, tanto en células normales como tumorales, en la conexión entre la
proliferación celular y los ajustes en el metabolismo energético asociados a cada etapa del ciclo
celular. Estudios han evidenciado la correlación negativa entre la expresión de Cdh1 y las
enzimas PFKFBR3 y GLS1, claves en las rutas de glicólisis y glutaminólisis, respectivamente
(Moncada y cols., 2012). Otros eventos importantes para la biología tumoral, como la
estabilización de Factor inducible por hipoxia‐1α (HIF1α, del inglés, Hypoxia Inducible Factor‐
1α) por el gen supresor de tumores VHL (von Hippel-Lindau), también se han asociado con la
actividad de APC/CCdh1 (Liu y cols., 2011).
A pesar de lo atractivo que resulta el gen supresor de tumores Cdh1 como blanco en la terapia
antitumoral, no hay reportes en la literatura que demuestren su manipulación in vivo para sobreexpresarlo en células tumorales e incidir sobre la progresión tumoral. En este mismo sentido, la
manipulación de su modulador negativo Emi1 tampoco ha sido abordada. De hecho, las
evidencias que demuestran que la alteración de la expresión de Cdh1, incremento o reducción,
incide en la progresión tumoral, se han obtenido por manipulación in vitro de células tumorales
humanas y la posterior implantación de estas en animales inmunodeficientes (Fujita y cols.,
2008; 2009). No obstante, blancos de APC/CCdh1 cuya expresión está incrementada en varios
tipos de tumores y de los que se ha descrito su valor pronóstico, como AURKA y Plk1, sí han
sido dianas de estrategias terapéuticas, por ejemplo las basadas en inhibidores de pequeña
talla (Harrington y cols., 2004; Strebhardt y Ulrich, 2006).
2.2 Regulación de la actividad del APC/CCdh1
La capacidad del APC/CCdh1 de reconocer selectivamente sus sustratos en el momento correcto
del ciclo celular es esencial para el desarrollo de las diferentes fases de este y la preparación
para la ronda de replicación del ADN (Peters, 2006). En correspondencia con su importancia, la
actividad de este complejo está estrictamente controlada por mecanismos redundantes que se
describen a continuación.
En primer lugar, el APC/CCdh1 está básicamente regulado por reacciones sucesivas de
fosforilación-desfosforilación, así como por la influencia de determinadas moléculas que actúan
como pseudo-sustratos e impiden la correcta actividad del complejo. En las células normales
estos mecanismos se complementan para garantizar la actividad del sistema en función del reloj
bilógico del ciclo, sin embargo, en las células tumorales, muchos de estos mecanismos están
alterados, por lo que rompen la dinámica necesaria para la óptima división celular.
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Revisión bibliográfica
En el tránsito de la fase G1 a S, APC/CCdh1 se inactiva debido a la acción de las ciclinas y
quinasas que a este término se acumulan, principalmente la ciclina A y la quinasa Cdk 2 (Lukas
y cols., 1999). Estas ciclinas/Cdks fosforilan ambos componentes del complejo, facilitando la
disociación del mismo. Una vez que Cdh1 es fosforilado y disociado, se convierte en blanco de
degradación del complejo de ubicuitín-ligasas E3 SCF (del inglés, Skp Cullin F-box containing
complex), las cuales reconocen preferencialmente los sustratos fosforilados e hidroxilados
(Petroski y Deshaies, 2005). Existen evidencias de un mecanismo de retroalimentación negativa
en el cual el propio complejo ubicuitina una de sus subunidades, la UBCH-10, la cual es crucial
para la degradación de la propia ciclina A (Rape y Kirschner, 2004).
La inactivación del complejo en G1-S también es llevada a cabo por el pseudosustrato Emi1, el
cual se activa tras la acción del factor de transcripción E2F e impide la actividad de APC/CCdh1
al bloquear la unión de Cdh1 con los verdaderos sustratos (Hsu y cols., 2002). Este mecanismo
de regulación es crucial en los procesos de diferenciación de las células madres embrionarias
humanas, donde se ha demostrado que la desdiferenciación de estas células es función de los
niveles elevados de Emi1 (Bar-On y cols., 2010). En tumores de próstata se describió un
mecanismo similar al de Emi1, basado en la actividad de un inhibidor del complejo, el represor
de la transcripción Daxx, el cual se une a los co-activadores (tanto Cdh1 como Cdc20) por
medio de la región consenso de reconocimiento D-box e impide la degradación de los
respectivos sustratos verdaderos durante la mitosis (Kwan y cols., 2013). Otra molécula
identificada como pseudosustrato del APC/CCdh1 es la proteína Acm1 (APCCdh1 modulator 1), la
cual, aunque es prescindible para la inhibición de la actividad catalítica del complejo, evita las
interacciones prematuras de los sustratos con el complejo durante la fase tardía de la mitosis
(Martínez y cols., 2012).
Otro mecanismo de regulación negativa del complejo por fosforilación es el encontrado por
Wang y Kung en el 2012, en el cual Cdh1 es fosforilado e inactivado por la acción de las
quinasas MAK. Estas enzimas fosforilan a Cdh1 en los mismos sitios donde actúan las Cdk y
determinan la inactividad del complejo durante la fase S y el inicio de la mitosis. Esta
inactivación desencadena la acumulación de sustratos como Plk1, AURKA y las ciclinas
mitóticas en el cáncer de próstata, donde esta quinasa está sobre-expresada (Wang y Kung,
2012).
Según lo antes expuesto, APC/CCdh1 se mantiene inactivo desde el trance de G1 a S, durante
toda la fase S del ciclo (donde se requiere de la acumulación de los sustratos del mismo para la
nueva ronda de replicación) y hasta la fase tardía de la mitosis, donde, por acción previa del
APC/CCdc20 los niveles de las ciclinas (en este caso las tipo B) y quinasas (Cdk1 principalmente)
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Revisión bibliográfica
han disminuido. Debido a esto, los niveles de Cdh1 fosforilados decrecen, por lo que
nuevamente recupera su actividad al unirse al APC/C. Es estrictamente necesaria la
coordinación entre la actividad del complejo mediada por Cdc20 y Cdh1 durante toda la mitosis.
En este sentido, las moléculas pertenecientes al complejo del control mitótico MAD2L2 ( del
inglés, mitotic arrest deficient 2-like 2) juegan un rol fundamental al actuar como inhibidoras del
complejo (al bloquear la región de reconocimiento de los sustratos) y contribuir a la activación
secuencial del APC/C por sus co-activadores (Listovsky y Sale, 2013). En prometafase,
MAD2L2 secuestra las moléculas de Cdh1 disociadas del complejo y a la llegada de la anafase,
es rápidamente degradada por el APC/CCdc20, elevándose de esta forma los niveles de Cdh1
que pueden interactuar nuevamente con el APC/C desfosforilado. Se ha demostrado que la
pérdida de MAD2L2 conlleva a una asociación prematura de Cdh1 con el complejo, a la
destrucción temprana de sus sustratos y una mitosis acelerada con frecuentes errores, por lo
que MAD2L2 ayuda en la coordinación del trance de metafase a anafase y contribuye a la
fidelidad de la mitosis (Listovsky y Sale, 2013). Por otra parte, se sospecha que la activación de
Cdh1 en la mitosis tardía también depende de la existencia de fosfatasas homólogas a la Cdc14
encontrada en levaduras (hCdc14a, del inglés human Cdc 14 a), que desfosforilan y activan a
las moléculas de Cdh1 fosforiladas remanentes (Peters, 2002).
La funcionalidad del APC/CCdh1 también está determinada por la forma en que se presentan los
sustratos. Estudios develan que modificaciones post-transcripcionales de determinados
sustratos, cercanas a la región de reconocimiento, pueden influir directamente en la capacidad
de reconocimiento del complejo de los mismos y en la actividad de ubicuitinación sobre ellos
(Littlepage y Ruderman, 2002; Mailand y Diffley, 2005). También se ha descrito la regulación
temporal de ubicuitinación del APC/CCdh1 en función de los sustratos. Existen sustratos con
mayor susceptibilidad y rapidez de ser ubicuitinados que otros, lo cual determina la existencia
de una regulación intrínseca del complejo que define los sustratos tempranos y tardíos del
mismo, lo cual depende de la afinidad o estabilidad entre las interacciones intermoleculares
durante la reacción de ubicuitinación (Rape y cols., 2006).
La acetilación/desacetilación de Cdh1 constituye otra herramienta para controlar el
funcionamiento del complejo. Resultados demuestran que cuando Cdh1 está desacetilado se
optimiza la unión del mismo al APC/C, mientras que la acetilación provoca el efecto contrario.
En este estudio se demostró que la desacetilación y por tanto activación del complejo, es
llevado a cabo por la histona desacetilasa SIRT2 (del inglés, Sirtuin-2), la cual por esta vía,
emerge como proteína que mantiene la integridad del genoma y la supresión de la
tumorigénesis (Kim y cols., 2011).
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Revisión bibliográfica
Respecto a la regulación espacial del complejo durante el ciclo celular, Zhou y cols. en el 2003
demostraron que Cdh1 se encuentra preferencialmente en el núcleo durante la interfase,
mientras que durante la metafase y la anafase se encuentra asociado a los centrosomas. Esta
localización preferencial en el núcleo durante la interfase responde a la actividad del complejo
de ubicuitinar a la ciclina A. Sin embargo, como se describió anteriormente, en el tránsito de G1S, los eventos de fosforilación de la ciclina A/Cdk2 junto a la activación de otros mecanismos
reguladores negativos del complejo, hacen que decaiga la actividad del mismo. O sea, durante
toda la interfase se establece una relación de competencia recíproca entre Cdh1 y sus
moléculas blancos. Como resultado de este estudio se reveló que esta localización nuclear es
regulada precisamente por las reacciones de fosforilación de esta ciclina, las cuales determinan
la exportación de Cdh1 hacia el citosol (Zhou y cols., 2003). Contrariamente, la localización
nuclear del APC/CCdh1 puede estar beneficiada por otras moléculas reguladoras como por
ejemplo la fosfatasa PTEN, la cual independientemente de su actividad fosfatasa, interactúa y
estabiliza la asociación del complejo mejorando la actividad de ubicuitinación del mismo (Song y
cols., 2011).
En cuanto a la regulación transcripcional de Cdh1, se ha evidenciado que la transcripción del
ARNm de este gen (Fzr1, del inglés Fizzy-related 1) comienza en la fase G1, justo antes del
punto de restricción G1-S, extendiéndose hasta las fases S y G2. Posteriormente, los niveles de
ARNm decaen bruscamente en el momento de la división celular y se mantienen indetectables
durante los primeros momentos de la fase G1, aspectos que son contradictorios ya que el
producto proteico se mantiene estable durante todo este período. Además, es en este momento
de la interfase (inicio de G1) donde más actividad muestra la proteína para potenciar los
eventos de diferenciación celular (Inbal y cols., 1999). Estos resultados sugieren que Fzr1 sufre
una compleja regulación a diferentes niveles de síntesis y degradación. Por otra parte, cuando
las células son detenidas en G0 por ausencia de nutrientes, se evidencia un aumento de la
transcripción de este gen, lo cual demuestra la importancia del mismo en la quiescencia celular
(Inbal y cols., 1999).
Actualmente los virus han emergido como nuevas entidades reguladoras del APC/C y sus coactivadores. La existencia de diversas familias virales con la capacidad de reprogramar el ciclo
celular mediante el APC/C, abre las puertas de un ámbito desconocido lleno de interrogantes.
Los mecanismos que emplean los virus responden a los requerimientos celulares que los
benefician, e involucran el secuestro de las células en una determinada fase del ciclo celular lo
que causa diversas afectaciones en el funcionamiento del complejo (Fehr y Yu, 2013). Algunos
de estos mecanismos desencadenan irreversiblemente la transformación de las células
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Revisión bibliográfica
hospederas hacia células malignas, por lo que el entendimiento de estos procesos puede
constituir una herramienta útil para la terapéutica de las enfermedades relacionadas, tanto
víricas como neoplásicas (Fehr y Yu, 2013).
2.3 Blancos del APC/CCdh1
El APC/C regula el progreso del ciclo celular, debido en primera instancia, a que determina los
niveles proteicos de moléculas claves para el control del mismo. La regulación de la expresión
de estas moléculas por el complejo puede ser de una forma directa (si las mismas son
reconocidas como sustratos y son ubicuitinadas) o de una forma indirecta (si la molécula que es
blanco directo del complejo, es otra molécula que determina la expresión de la primera). Son
muchas las proteínas que se han identificado como blancos del APC/CCdh1, sobresaliendo
aquellas que participan en la salida de la mitosis, la entrada de la anafase, el ensamblaje de las
fibras del huso mitótico, la síntesis del ADN, el mantenimiento de las fases G0/G1, así como en
diversas rutas de señalización (Li y Zhang, 2009). Dentro de estas moléculas, el control de la
expresión de las quinasas Plk1 y AURKA es un evento crítico para la correcta división celular,
dado que participan activamente en la mitosis y determinan en cuantía la estabilidad genética
de las células (Floyd y cols., 2008). Se ha demostrado que la sobre-expresión de estas
quinasas es evidente en transformaciones malignas de diferentes localizaciones y se asocia al
desarrollo de aneuploidías y carcinogénesis (Strebhardt y Ullrich, 2006; Ice y cols., 2013).
Ambas quinasas se comportan como sustratos directos del APC/CCdh1.
Por otra parte, uno de los blancos indirectos del complejo es el inhibidor de las quinasas
dependientes de ciclinas p27. Esta proteína es miembro de la familia de los CDKIs (del inglés,
cyclin-dependent kinase inhibitors) y en el ciclo regula la transición de G1 a S al detener la
célula en G1 (Koljonen y cols., 2006). Precisamente, uno de los mecanismos que tiene el
APC/CCdh1 para optimizar la diferenciación celular tras la detención de la célula en esa fase, es
impidiendo la degradación proteolítica de p27 (Santamaría y Pagano, 2007).
2.3.1 Regulación de la expresión de Plk1
Plk1 se expresa en células en proliferación y regula diversos procesos que incluyen la
maduración de los centrosomas, la entrada en la mitosis, el puto de control de G2/M, la
migración cromosómica, la formación del complejo bipolar del huso mitótico, la activación del
complejo ciclina B/Cdk1, la salida de la mitosis y la citocinesis (Zitouni y cols., 2014). Estudios
demuestran que la expresión exacerbada de Plk1 es evidente en tumores de pulmón, colón,
estómago, cérvix, mama, próstata, ente otros, lo cual demuestra el fallo de los diferentes
10
Revisión bibliográfica
mecanismos reguladores de la expresión de esta proteína durante el ciclo celular (Winkles y
Alberts, 2005; Strebhardt y Ullrich, 2006; Lehman y cols., 2007; Kim y cols., 2013;).
Uno de los mecanismos reguladores de Plk1 es la ubicuitinación de la misma en la anafase por
el APC/CCdh1, para optimizar la salida de la mitosis (Eckerdt y Strebhardt, 2006).
Paradójicamente, esta quinasa es necesaria en la citocinesis, lo cual sugiere la existencia de
otros niveles de regulación (Zitouni y cols., 2014). Por ejemplo, en el 2013, Kim y cols.
demostraron la existencia de una proteína llamada CIP2A ( del inglés, Cancerous Inhibitor of
PP2A), la cual obstruía el reconocimiento del APC/CCdh1 por Plk1, impidiendo de esta forma la
degradación de la misma. Lindon y Pines en el 2004 evidenciaron que la activación del
APC/CCdh1 no se correlaciona con la disminución inmediata de los niveles de Plk1, lo que ratifica
que la regulación de esta quinasa es compleja y puede involucrar mecanismos que van desde
la localización celular hasta la afinidad preferencial del APC/C por sus sustratos. Plk1 también
es regulada post-traduccionalmente por fosforilación. Según los resultados expuestos por Tang
y cols. en el 2008, la fosforilación de Plk1 en la serina 326 (sitio cercano a la región D-box) por
acción de Mk2 (del inglés, MAP kinase-activated protein kinase 2), puede conllevar a una
estabilidad de la misma al hacerla insensible a la degradación proteolítica. Además, se han
obtenido resultados que sugieren que la activación de Plk1 en la transición de G2 a M in vivo,
puede ser atribuible mayoritariamente, sino en la totalidad, a la fosforilación (Mundt y cols.,
1997). Un mecanismo que contrarresta esta activación por fosforilación es el punto de control
ante daños en el ADN en G2/M, donde para impedir el avance del ciclo en este término, se
desencadenan mecanismos que impiden la fosforilación de Plk1 en la Serina 137 y la
Treonina 210 (Tsvetkov y Stern, 2005).
Plk1 también cuenta con un mecanismo de auto-inhibición el cual depende de interacciones
entre los extremos C y N terminal de la molécula y es independiente del estado en que se
encuentre el ciclo celular. Esta auto-inhibición puede ser revertida por fosforilaciones en el
extremo N terminal (Serina 123 y 137; Treonina 196 y 210) o por la unión de un fosfopéptido en
el C terminal (Xu y cols., 2013).
Además Plk1 es estrictamente regulada a nivel transcripcional. Tanto los niveles de proteínas
como los de ARNm son bajos en la Interface y altos en la mitosis (Winkles y Alberts, 2005). La
expresión de los genes de Plk1 están bajo el control de varios represores transcripcionales en
G1 y activadores transcripcionales en G2 (Archambault y Glover, 2009). Uno de los activadores
transcripcionales descritos es el factor E2F, el cual también media la expresión positiva del ya
referido inhibidor del APC/C Emi1, de esta forma se justifica la convergencia de la existencia de
estas moléculas en diversos tipos de tumores (Lehman y cols., 2007). Por otra parte, los niveles
11
Revisión bibliográfica
intracelulares de esta quinasa parecen estar también controlados por la chaperona
Hsp90 (Winkles y Alberts, 2005).
2.3.2 Regulación de la expresión de Aurora quinasa A
AURKA es una serina/treonina quinasa esencial para la entrada de la mitosis, la duplicación de
los centrosomas, la formación del huso mitótico, la segregación cromosómica y la
citocinesis (Marumoto y cols., 2005). Se encuentra sobre-expresada en muchos tipos de cáncer
(Zhou y cols., 1998) sobresaliendo los de mama, ovario, colon y próstata. Altos niveles de esta
proteína se asocian a una disminución en la supervivencia de los pacientes por lo que
constituye un marcador pronóstico de esta enfermedad (Ke y cols., 2003; Nadler y cols., 2008).
Aunque en los carcinomas primarios de mamas invasivos el 94% tienen una sobre-expresión de
esta molécula (Tanaka y cols., 1999), solo el 13.6% muestra una amplificación en estos genes,
por lo que en este tipo de transformación maligna los mecanismos post-transcripcionales que
determinan la estabilidad o tiempo de vida media de esta proteína son muy importantes
(Kitajima y cols., 2007; Ice y cols., 2013).
Al igual que Plk1, en la mitosis tardía del ciclo celular, AURKA es poliubicuitinada por el
APC/CCdh1 lo que reduce los niveles de la misma (Taguchi y cols., 2002; Floyd y cols., 2008). La
ubicuitinación de esta quinasa depende del reconocimiento por el APC/C de las regiones
consensos D-box y A-box (Kitajima y cols., 2007). Pese a esto, las células tumorales expresan
altos niveles de AURKA independientemente del momento del ciclo, lo cual sugiere que hay
mecanismos que hacen escapar a esta quinasa de la degradación proteolítica dependiente de
ubicuitinación (Ice y cols., 2013). El primer ejemplo lo constituye la acción de la USP2a (del
inglés, Ubiquitin-specific Cysteine Protease 2a). UPS2a es miembro de la familia de
deubicuitinasas de la cual se ha evaluado su potencial como oncogén ya que su sobreexpresión se asocia con la formación y progresión de tumores humanos (Priolo y cols., 2006).
En el 2011 se demostró que esta deubicuitinasa interactúa directamente con AURKA tanto in
vitro como in vivo sugiriéndola como uno de sus sustratos (Shi y cols., 2011). De esta forma la
actividad del APC/CCdh1 es directamente revertida, por lo que la degradación de AURKA hasta
este nivel, dependerá del balance de ubicuitinación/deubicuitinación de las respectivas enzimas
involucradas.
Recientemente se ha descrito la existencia de proteínas involucradas en la regulación de la
estabilidad de AURKA (Huang y cols., 2011). En este sentido, emerge el factor traduccional
PUMP2, el cual se une físicamente a la región D-box de AURKA e impide el reconocimiento y la
ubicuitinación de la misma por el APC/CCdh1. La asociación de PUMP2 con AURKA alarga el
12
Revisión bibliográfica
tiempo de vida media de la misma y perfecciona su actividad quinasa. Este mismo estudio
sugiere que PUMP2 juega dos roles diferentes durante la progresión del ciclo celular: en la
interfase, actúa como represor traduccional a través de su dominio de unión al ARN y en la
mitosis se une físicamente con AURKA para mejorar su estabilidad y funcionalidad. Otra
molécula que impide la destrucción de AURKA por esta vía es el marcador de genes
metastásicos NEDD9 (del inglés, Neural precursor cell-expressed, developmentally downregulated 9) identificado en adenocarcinomas de mama y melanomas. Incrementos en la
expresión de NEDD9 se correlacionan con incrementos de los niveles de AURKA en cáncer de
mama. Esto es debido a que NEDD9 forma un complejo con esta quinasa (por la región A-box
de reconocimiento por el APC/CCdh1) y regula su estabilidad. La reducción de NEDD9 por sí sola
o en combinación con inhibidores de AURKA disminuye el tamaño de tumores y la metástasis
de pulmón en ratones xenotrasplantados (Ice y cols., 2013).
Por otra parte, Kitajima y cols. en el 2007 observaron que eventos de fosforilación sobre A-box
(Serina 51) pueden impedir la ubicuitinación y por tanto la degradación por esta vía,
encontrando además que esta fosforilación ocurre de forma constitutiva en células tumorales de
cabeza y cuello donde esta quinasa está sobre-expresada. Además, se demostró que la
proteína de unión a los microtúbulos TPX2 (del inglés, targeting protein for Xklp2) no solo incidía
en la actividad y localización de AURKA, sino que también determinaba los niveles de la misma
al proteger esta quinasa de la acción ubicuitinante del APC/CCdh1 (Giubettini y cols., 2011).
También se identificó a la quinasa LIMK2 (del inglés, LIM domain kinase 2), la cual es
importante en la oncogénesis de las células de mama debido a que estabiliza a AURKA
mediante su dominio LIM. LIMK2 regula positivamente los niveles de AURKA mediante su
acción quinasa, creando un mecanismo de retroalimentación positiva mediante el cual AURKA
promueve la transformación celular en este tipo de cáncer (Johnson y cols., 2012).
2.3.3 Relación indirecta del APC/CCdh1 con p27
p27 es una proteína de 27 kDa que pertenece a la familia de las KIP (del inglés, kinase inhibitor
protein) y al unirse a las Cdks (principalmente Cdk2) evita que estas interactúen con las ciclinas
indispensables para la entrada de la célula en la duplicación de su material genético
(Slingerland y Pagano, 2000). Los daños en el ADN, las señales inhibitorias del crecimiento y
los procesos de proliferación y diferenciación de tejidos en desarrollo estimulan la actividad de
p27 (Koljonen y cols., 2006; Egozi y cols., 2007; Cuadrado y cols., 2009), lo que conduce a
bloquear la transición errónea de G1 a S. p27 es considerado como un gen supresor de
tumores y en correspondencia, las células malignas con frecuencia tienen reducidos los niveles
de la misma (Oh y Park, 2000; Bloom y Pagano, 2003).
13
Revisión bibliográfica
Los niveles proteicos de p27 están determinados en gran medida por la acción de la proteína
Skp2 en asociación con el complejo SCF las cuales la ubicuitinan y la destinan a la degradación
proteolítica (Carrano y cols., 1999; Sutterluty y cols., 1999). La asociación de p27 con SCF
depende de que Skp2 reconozca el residuo fosforilado de la treonina 187 del mismo, acción que
ocurre a cargo de la Cdk2b (Slingerland y Pagano, 2000). De esta forma, altos niveles de Skp2
pueden conllevar a la disminución de p27 y por tanto a la progresión errada del ciclo celular, lo
cual desemboca en el desarrollo de transformaciones neoplásicas. Una de las vías claves por
las que el APC/CCdh1 regula el ciclo celular es precisamente reconociendo y ubicuitinando a
Skp2, por lo que Cdh1 estabiliza p27 y con esto protege la fidelidad del ciclo celular (Bashir y
cols., 2004; Wei y cols., 2004). En células de cáncer de mama y colon se evidenció que las
cantidades de Cdh1 y p27 disminuyen significativamente con respecto al tejido normal, mientras
que Skp2 se mantiene elevada (Fujita y cols., 2008; 2009). Una de las rutas de señalización que
atentan contra la efectividad de la asociación del APC/CCdh1 con Skp2 es la que involucra a la
quinasa Akt1. Esta quinasa fosforila a Skp2 en la serina72, provocando así su localización
citoplasmática y estabilidad al impedir la unión con Cdh1. Esta primera fosforilación facilita que
ocurra una segunda en la serina 75 mediada por CKI (del inglés Casein kinase I), lo que resulta
en una mayor repulsión entre APC/CCdh1 y Skp2. Esto sugiere que los tumores con exacerbada
actividad de Akt1 tienen bajos niveles de p27, lo cual evidencia la existencia de mecanismos
recurrentes en las células malignas para garantizar su proliferación y evadir las principales vías
de control del ciclo celular (Gao y cols., 2009). Interesantemente, Shirane y cols. demostraron
en 1999 que junto a la degradación de p27 dependiente de ubicuitinación, existe otro
mecanismo dependiente de ATP (del inglés, Adenosine triphosphate) que disminuye las
cantidades proteicas de p27 en G1/S. Este consiste en la degradación proteolítica de esta
proteína independientemente de su ubicuitinación (mediada por 26S), pasando por un
intermediario de 22 kDa en el cual ha sido removido el dominio de unión con las ciclinas del Nterminal. Estos resultados evidencian otra forma de regular negativamente los niveles de p27,
primero asegurando su inactividad y después mediando su degradación proteolítica.
14
Materiales y métodos
3. Materiales y métodos
3.1 Líneas celulares
En el presente trabajo se emplearon las líneas celulares humanas: A431 (carcinoma
epidermoide de vulva), H125 (carcinoma de pulmón), PC3 (adenocarcinoma de próstata), los
adenocarcinomas de mama MCF7, MCF7-HER2, MDA-MB231 y MDA-MB468, así como los
carcinomas mamarios ZR75, T47D y SKBR3. Además se emplearon las líneas celulares
murinas de origen mamario AT3 (carcinoma), F3II (adenocarcinoma) y 4T1 (carcinoma).
3.2 Condiciones de cultivo celular
Las células se cultivaron con el medio DMEM-F12 (del inglés, Dulbecco's Modified Eagle's
Medium/Nutrient F-12 Ham, Gibco, EUA) excepto las T47D y las SKBR3, las cuales se
cultivaron con el medio RPMI-1640 (del ingés, Roswell Park Memorial Institute, PAA, Austria).
Se emplearon como suplementos adicionales 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de
estreptomicina y suero fetal de ternera (SFT) al 10%, todos adquiridos de la firma Gibco, EUA.
Las células se cultivaron a 37ºC en atmósfera de 5% de CO2.
3.3 Sincronización en la fase G2/M del ciclo celular
Para sincronizar las células en la fase G2/M del ciclo celular, se utilizaron diferentes
concentraciones del agente desestabilizante de los microtúbulos nocodazol (Sigma, EUA). Las
concentraciones empleadas de nocodazol y los tiempos de tratamiento para cada tipo celular se
describen en la Tabla 1. En todos los casos las células se sembraron en placas de 6 pozos
(Greiner BioOne, Alemania) a razón de 2x105 células por pozo y el nocodazol se añadió
después de 18 h de iniciado el cultivo.
Tabla 1. Tiempo de incubación y concentración de nocodazol empleado para la sincronización de
las líneas celulares
Líneas
celulares
ng/ml
Tiempo de incubación (h)
A431
200
12
H125
100
15
PC3
100
24
MDA-MB231
200
15
AT3
200
24
F3II
200
24
4T1
200
24
15
Materiales y métodos
3.4 Ensayos de citometría de flujo
Para la determinación de la expresión de Cdh1 en las líneas celulares, sincronizadas o no en la
fase G2/M del ciclo celular, las células se colectaron por tratamiento con 300μL de tripsinaEDTA (Gibco, EUA). Luego, se pasaron a viales de 1.5mL y se lavaron dos veces por
centrifugación con 1mL de solución salina tamponada con fosfato (SSTF), a 555 x g por 5 min
(Eppendorf, Alemania). Las células se permeabilizaron y fijaron con las soluciones
Cytofix/Cytoperm, Cytofix/Cytoperm plus y Perm/Wash, incluidas en un juego de reactivos
adquirido de la firma BD Bioscience (EUA). Se siguieron las indicaciones del fabricante, con
ajustes menores. Brevemente, las células se resuspendieron en 100µL de Cytofix/Cytoperm y
se incubaron durante 30 min en hielo. Al cabo de este tiempo, se lavaron por centrifugación a
555 x g durante 5 min. Luego se incubaron con 50μL de Cytofix/Cytoperm plus por 10 min, se
lavaron por centrifugaron en similares condiciones y se incubaron nuevamente con 50μL de
Cytofix/Cytoperm, por 5 min, antes de volverlas a lavar. Todos los lavados se realizaron en
500μL de Perm/Wash, diluido en agua destilada, a partir de una solución madre concentrada
10x. Posteriormente las células se marcaron durante 30 min con el anticuerpo (Ac) específico
para la molécula Cdh1 (Abcam, EUA), diluido 1/20 en 40μL de la solución Perm/Wash. Al cabo
de este tiempo, y después de lavar las células, estas se incubaron 30 min con el Ac antiinmunoglubulina murina conjugado a biotina (Jackson, EUA), diluido 1/800, en un volumen de
100μL de la solución Perm/Wash. Finalmente, las células se incubaron 20 min con del
conjugado de estreptavidina y Ficoeritrina-Cianina 5 (PE-Cy5, del inglés: phycoerythrin- cyanine
5; BD Bioscience) diluido 1/400 en 100μL de Perm/Wash. Las células se lavaron con 1mL de
Perm/Wash y se resuspendieron en 300μL de SSTF para realizar la determinación en el
citómetro de flujo. Como control, se incluyeron células de cada línea permeabilizadas y
marcadas con el Ac secundario y el conjugado de estreptavidina y PE-Cy5.
Las células utilizadas como control de la sincronización se marcaron con el agente intercalante
de las bases del ADN, yoduro de propidio (PI, del inglés Propidium iodide; Sigma). Inicialmente,
estas se lavaron con SSTF y se fijaron con 500μl de una mezcla metanol:acetona (1:4) más
500μL de SSTF, durante 2 h. Se lavaron por centrifugación a 555 x g por 5 min y
posteriormente se incubaron con 50μl de RNAsa (100μg/mL; Sigma) por 20 min a 37ºC. Se
lavaron por centrifugación, se añadieron 300μl de PI a 100μg/mL y se incubaron bajo estas
condiciones durante 20 min.
Para la detección de los niveles proteicos de AURKA se realizó un ensayo de marcaje
simultáneo de esta molécula con PI. Para ello se siguió exactamente el protocolo de marcaje
con PI solo que las células antes de ser incubadas con el mismo, se incubaron con 100µl del Ac
16
Materiales y métodos
murino anti-AURKA (1/600; Cell Signalling) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron y se
incubaron con 50µl de Ac anti-inmunoglubulina murina conjugado a isotiocianato de
fluoresceína (FITC, del inglés Fluorescein isothiocyanate; 1/200; Abcam), 30 min a 4oC.
Posteriormente las células se lavaron y se incubaron con PI.
La lectura de las muestras, marcadas con anti-Cdh1, AURKA y PI, se realizó en un citómetro de
flujo Gallios (Beckman Coulter, EUA).
3.5 Ensayos de Western Blot
Las líneas celulares humanas de origen mamario (provenientes de frascos de 25cm2 con un
80% aproximado de confluencia) se homogenizaron por 10 min a 4ºC en un tampón de lisis que
incluye: nonidet P40 1%, deoxicolato de sodio 0,5%, SDS 0,1%, NaF 50 mM, Na 3VO4 1 mM,
EDTA 5 mM y fluoruro del fenilmetilsulfonilo 1 mM, todos adquiridos de Sigma. Luego se realizó
una centrifugación durante 30 min a 14 000 x g a 4°C, y se colectó el sobrenadante que
contiene el extracto de proteínas totales aisladas. La concentración de proteínas se determinó
mediante el método del ácido becinconínico descrito por Smith y cols, en el año 1985, utilizando
un juego de reactivos comerciales (Pierce, EEUU). Se aplicaron 30μg de los lisados celulares
antes descritos en dos geles de SDS-PAGE al 10% en condiciones de reducción para la
separación de las proteínas. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una
membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF del inglés polyvinylidine difluoride) (GE
Healthcare Amersham Hybond-P, Reino Unido). El bloqueo de las membranas se realizó con
una solución de Tween al 0.1 % y leche descremada al 5% en TBS (Tris-Base Solution),
durante 2 h a 37ºC. Posteriormente, se incubaron las membranas durante otras 18 h a 4ºC con
los respectivos anticuerpos primarios: primeramente se incubó una membrana con anti-Cdh1
(1/1000; Abcam) y la otra con anti-AURKA (1/1000, Cell Signaling, EUA) ambos originados en
ratón. Después de tres lavados con TBS/Tween 0,1% (TBS/T) y bloqueo durante 1 h a 37ºC, las
membranas se incubaron con los Acs de conejo anti-p27 (1/1000, Cell Signaling) y el Ac antiPlk1 (1/1000, Cell Signaling), respectivamente. Todos los Acs se diluyeron en TBS/Tween al 5%
de BSA excepto el anti-AURKA, el cual fue diluido en la solución de bloqueo. Después de tres
lavados de 5 min con TBS/T, las membranas se incubó con los Acs secundarios anti-IgG de
ratón (Cell Signaling) y anti-IgG de conejo (Cell Signalling), respectivamente, conjugados a
peroxidasa de rábano picante (HRP del inglés horseradish peroxidase), diluidos 1/1000 en la
solución de bloqueo. Luego de tres lavados con esta misma solución, el ensayo se reveló
empleando el juego de reactivos Western Blotting
Luminol Reagent (Santa Cruz
Biotechnologies) y se expusiero las membranas al filme fotográfico Chemiluminescence BioMax
Light Film (Kodak-Industries, Francia), para visualizar las proteínas inmunorreactivas.
17
Materiales y métodos
Para determinar la expresión de la proteína de referencia β-actina, las membranas se incubaron
durante 30 min a 56ºC con un tampón de remoción (Tris-HCl 62,5mM [pH 6,7], βmercaptoetanol 100 mM, SDS 2%) para la eliminación de los Acs primarios y secundarios.
Posteriormente, se realizó un protocolo similar al antes descrito. Las membranas se bloquearon,
se incubaron con un Ac de conejo anti-β-actina (dilución 1/1000; Cell Signaling) y con el
respectivo Ac secundario para la detección de las proteínas.
3.6 Procesamiento de los datos
El procesamiento de los datos de la citometría de flujo se realizó empleando los programa
Summit versión 4.3 y el programa Kaluza versión 1.2. Los datos se expresaron como valores
porcentuales o Intensidad Media de Fluorescencia (IMF), en dependencia del análisis requerido.
En el caso de los resultados obtenidos del ensayo de Western Blot, la cuantificación de
proteínas totales se realizó empleando un ajuste no lineal en el editor de gráficos GraphPad
Prism versión 5.0, mientras que el análisis densitométrico se realizó empleando el programa
Image J versión 1.46r. Los cálculos, en todos los casos, se auxiliaron de las hojas de Excel.
18
Resultados
4. Resultados
4.1 Comparación de los niveles de expresión de la proteína Cdh1 en líneas tumorales
humanas de diferentes localizaciones.
Con el objetivo de comparar los niveles de expresión proteica del gen supresor de tumores
Cdh1 en líneas tumorales de diferentes localizaciones, se procedió a la medición de esta
molécula en células sincronizadas o no en la fase G2/M del ciclo celular, por citometría de flujo.
Para ello, las líneas tumorales provenientes de vulva, pulmón, próstata y mama se colectaron
tras ser cultivadas con nocodazol, y posteriormente se marcaron con PI y el Ac anti-Cdh1.
Como se observa en la Figura 1, en la evaluación del ciclo celular de las líneas tumorales
tratadas o no con nocodazol, ocurrió un incremento en la proporción de células detectables en
la fase G2/M del ciclo celular con respecto a las células no tratadas, lo que sugiere la eficacia
de las condiciones de sincronización empleadas.
En cuanto a la determinación de los niveles de expresión de Cdh1, todas las líneas tumorales
sincronizadas en la fase G2/M del ciclo celular mostraron un incremento en los valores de ∆IMF
con respecto a las líneas celulares no sincronizadas. Entre las células no sincronizadas la línea
tumoral de vulva A431 presenta los menores valores de ∆IMF, sin embargo, al hacer una
comparación entre las líneas tumorales en la condición de sincronización, se observa que la
línea MDA-MB231 de origen mamario, presenta los menores valores de ∆IMF, lo cual sugiere
un menor nivel de expresión de Cdh1 en esa línea tumoral (Fig. 1).
4.2 Determinación de los niveles de expresión de la proteína Cdh1 en líneas tumorales
humanas de origen mamario.
Al considerar el menor nivel de expresión de Cdh1 en la línea tumoral humana de origen
mamario MDA-MB231, nos propusimos extender la determinación de los niveles proteicos de
esta molécula hacia otras líneas tumorales de igual localización, con el objetivo de seleccionar
la línea tumoral de menor expresión de Cdh1 dentro de nuestro panel de líneas celulares
evaluadas. Las determinaciones se realizaron mediante ensayos de Western Blot, donde se
utilizaron lisados de proteínas totales que se obtuvieron a partir de cultivos celulares con
alrededor de un 80% de confluencia.
En la Figura 2 se muestran los resultados de la determinación de los niveles de expresión
proteica de Cdh1 obtenidos por Western Blot y se grafican los valores de las intensidades
relativas de las bandas correspondientes a cada línea tumoral evaluada, datos obtenidos a
partir de un análisis densitométrico. Los valores de las intensidades relativas de las bandas
indican que las menores cantidades proteicas de Cdh1 se encuentran en las líneas MDA-
19
Resultados
MB231, MDA-MB468, T47D y MCF7-HER2, las cuales poseen similares valores de
intensidades relativas entre ellas.
Yoduro de Propidio
Cdh1
Figura 1. Determinación de los niveles de expresión de la proteína Cdh1 en líneas
tumorales de diferentes localizaciones: A431 de vulva, H125 de pulmón, PC3 de próstata
y MDA-MB231 de mama. La primera columna muestra la evaluación del ciclo celular mediante
el marcaje con PI de células no tratadas (histogramas insertados) o tratadas con nocodazol
(histogramas mayores). El resto de las columnas corresponde al marcaje de Cdh1 en células no
sincronizadas (segunda columna) y sincronizadas (tercera columna) en la fase G2/M del ciclo
celular. La región delimitada como R2 representa el fondo de marcaje con el anticuerpo
secundario. Se muestran los valores de ∆IMF=IMF [marcaje Cdh1] - IMF [control Ac
secundario].
20
Resultados
Por su parte, las líneas ZR75, MCF7 y SKBR3 muestran los mayores niveles relativos de Cdh1.
Este resultado centra nuestro interés en las cuatro líneas celulares con menores niveles de
expresión de Cdh1, dado que esta condición facilitaría la evaluación futura de los efectos que
tendría el hecho de sobre-expresar Cdh1 en la biología tumoral de estas células.
Figura 2. Expresión proteica de Cdh1 en líneas tumorales humanas de origen mamario.
La expresión de los niveles proteicos de Cdh1 en líneas humanas se determinó mediante
Western Blot (panel superior). La carga total de proteína se normalizó con la proteína de
referencia β‐actina y los valores de intensidad relativa de las bandas obtenidas se muestran en
un gráfico de barras (panel inferior). Para el análisis de densitometría se empleó el programa
Image J.
4.3 Determinación de la expresión del inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas
p27 y de los blancos moleculares de Cdh1, AURKA y Plk1, en líneas tumorales humanas
de origen mamario.
Luego de identificar entre un panel de líneas tumorales humanas de mama aquellas con menor
nivel de expresión proteica de Cdh1, consideramos importante evaluar sobre estas mismas
células los niveles de expresión proteica de moléculas relacionadas con la funcionalidad de
Cdh1. Las moléculas que se seleccionaron fueron AURKA y Plk1, blancos moleculares directos
21
Resultados
de Cdh1 (Lehman y cols., 2007) y el inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas p27, el
cual es regulado positivamente por Cdh1 de una forma indirecta (Bashir y cols., 2004).
La determinación de los niveles de expresión de las proteínas AURKA, Plk1 y p27 se realizó
mediante ensayos de Western Blot y los resultados se representan en la Figura 3. Como se
muestra, en el caso del inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas p27, los valores de
intensidad relativa de las bandas indican que los niveles proteicos de esta molécula se
encuentran disminuidos en la línea celular MDA-MB231 con respecto a las líneas MCF7, MCF7HER2 y T47D. En estas últimas, las cantidades relativas de p27 alcanzan valores de intensidad
relativa superiores al doble de las calculadas para la línea tumoral MDA-MB231. En el caso de
las líneas MDA-MB468 y SKBR3, se observan valores intermedios de intensidad relativa de las
bandas.
En la determinación de los niveles de expresión de Plk1, los resultados densitométricos
mostraron que la expresión proteica de esta quinasa es semejante entre las líneas tumorales
MCF7, MCF7-HER2, MDA-MB468 y SKBR3, mientras que en la línea celular T47D los niveles
de expresión son menores. En la línea tumoral MDA-MB231 se calculó el mayor valor de
intensidad relativa de la banda, el cual supera aproximadamente tres veces el calculado para la
línea tumoral T47D. Lo anterior indica que la línea celular MDA-MB231 presenta los mayores
niveles de expresión proteica de Plk1.
Los resultados obtenidos en la evaluación de AURKA demuestran que su nivel de expresión
proteica es variable en el panel de líneas celulares empleadas. Al igual que en la determinación
anterior, el valor de intensidad relativa de la banda calculada para MDA-MB231 se encuentra
por encima del calculado para el resto de las células. En este caso, la línea SKBR3 posee la
menor expresión de AURKA, ya que presenta niveles de expresión aproximadamente 5 veces
inferiores a los mostrados por la línea tumoral MDA-MB231.
Con el objetivo de corroborar el resultado obtenido mediante Western Blot respecto al
comportamiento de la expresión de AURKA, realizamos un ensayo de citometría de doble
marcaje, con un Ac anti-AURKA y PI, para visualizar la expresión de AURKA en función de las
diferentes fases del ciclo celular. Para este estudio se seleccionó la línea celular MDA-MB231,
la cual muestra según los resultados obtenidos por Western Blot, los mayores niveles de
expresión de AURKA, así como la línea celular MDA-MB468, que presenta niveles intermedios
de expresión de dicha quinasa. Como se observa en la Figura 4, el porcentaje de células de la
línea MDA-MB231 positivas al marcaje de AURKA supera al obtenido para la línea MDAMB468. Este resultado ratifica lo obsevado en el ensayo de Western Blot al confirmar que la
22
Resultados
expresión proteica de AURKA en MDA-MB231 es superior a la encontrada en la línea celular
MDA-MB468.
Al analizar de forma global los resultados obtenidos, es la línea tumoral MDA-MB231 la que
presenta las condiciones más adecuadas para considerarla como un modelo celular de interés
sobre el cual evaluar la relevancia de la manipulación positiva de Cdh1 sobre la
tumorigenicidad, debido al patrón de expresión mostrado entre todas las moléculas estudiadas.
Figura 3. Determinación de los niveles proteicos de p27, Plk1 y AURKA en líneas
tumorales humanas de mama. La determinación se realizó por el ensayo de Western Blot y la
carga total de proteína se normalizó con la proteína de referencia β‐actina (panel izquierdo). Se
muestra en gráficos de barras los valores relativos de la intensidad de las bandas obtenidas
(panel derecho), producto del análisis densitométrico realizado en el programa Image J.
23
Resultados
4.4 Determinación de la expresión proteica de Cdh1 en líneas tumorales murinas de
origen mamario.
Con el fin de acercarnos a un modelo celular que permita evaluar in vivo los efectos de la sobreexpresión de Cdh1 en el microambiente tumoral, decidimos determinar los niveles de expresión
de esta molécula en líneas tumorales murinas de origen mamario. Para ello, las células
tumorales de mama murinas AT3, F3II y 4T1 se sincronizaron en la fase G2/M del ciclo celular,
se marcaron con PI y el Ac anti-Cdh1 y se evaluaron por citometría de flujo.
Figura 4. Expresión de AURKA en función del ciclo celular en las líneas MDA-MB231 y
MDA-MB468. La expresión de AURKA se midió mediante una citometría de flujo de doble
marcaje con PI. Para cada línea se muestra el ciclo celular (columna izquierda) y el doble
marcaje PI / AURKA (columna derecha). La barrera situada entre las regiones E++ y E+delimita el marcaje del Ac anti-AURKA con respecto al fondo de marcaje del Ac secundario
respectivamente. Se muestra el porcentaje de las células positivas para AURKA obtenido a
partir del análisis de los datos en el programa Kaluza.
En las células murinas tratadas con nocodazol se incrementó el número de células en la fase
G2/M del ciclo celular, lo que confirma la efectividad del proceso de sincronización (Fig. 5).
Además como se puede observar en las tres líneas tumorales, en la condición de sincronización
se obtuvo un incremento en el porcentaje de células positivas al marcaje de Cdh1, así como en
24
Resultados
los valores de ∆IMF, con respecto a las células no sincronizadas. Sin embargo, no se
evidenciaron diferencias importantes en ambos parámetros al comparar entre sí las líneas
celulares, lo que sugiere que los niveles de expresión de Cdh1 en estas líneas son similares.
Figura 5. Expresión proteica de Cdh1 en líneas tumorales murinas de origen mamario. La
expresión de los niveles proteicos de Cdh1 en líneas murinas fue determinada mediante
citometría de flujo. Las dos primeras columnas representan la medición del ciclo celular
mediante PI en células no tratadas (columna izquierda) o tratadas (columna derecha) con
nocodazol. Las otras columnas representan la expresión de Cdh1 en células sin y con
nocodazol. Se muestran los porcentajes de células positivas al marcaje del Ac anti-Cdh1 y los
valores respectivos de ∆IMF calculados en el programa Kaluza (∆IMF=IMF [marcaje Cdh1] IMF [control Ac secundario]). La barrera situada entre las regiones F++ y F-+ delimita el marcaje
del Ac anti-Cdh1 con respecto al fondo de marcaje del Ac secundario respectivamente.
25
Discusión
5. Discusión
La molécula Cdh1, proteína adaptadora del APC/C, es actualmente considerada como un gen
supresor de tumores debido en primera instancia, a que regula los procesos de diferenciación
celular e integridad del genoma. Esto justifica que en las células donde existe una afectación en
su expresión, ocurra la proliferación de las mismas con aberraciones genéticas, lo cual
desencadena el desarrollo de transformaciones malignas (Wäsch y cols., 2010). Además, Cdh1
regula la fidelidad de los eventos tardíos de la mitosis, al determinar el tiempo de vida media de
importantes enzimas mitóticas tales como Plk1 y AURKA, las cuales se encuentran sobreexpresadas en diversos tipos de cáncer (Qiao y cols.,2010).
También se ha referenciado la relación de este cofactor con otras moléculas supresoras de
tumores, oncogenes y enzimas involucradas en el metabolismo energético, lo que lo convierte
en un punto de convergencia de mecanismos y rutas claves que influyen en la biología tumoral
(Gao, 2009; Song y cols., 2011; Moncada y cols., 2012). Todos estos aspectos convierten a
Cdh1 en un atractivo blanco terapéutico antitumoral.
Con este trabajo nos propusimos, sobre la base del estudio de la expresión de Cdh1 y de otras
moléculas relacionadas con su funcionalidad, seleccionar una línea celular adecuada que sirva
como modelo para evaluar los efectos que sobre la tumorigenicidad tendría el hecho de sobreexpresar Cdh1. En este sentido, la línea celular más adecuada sería aquella que posea bajos
niveles de Cdh1 y que los niveles de expresión de sus dianas moleculares estén en
correspondencia con la reducida expresión de la misma. El hecho de que exista una línea
celular que cumpla con estas características, permitiría validar a Cdh1 como blanco de la
terapia antitumoral al evaluar el efecto de su manipulación sobre la biología tumoral y a la vez,
focalizaría la evaluación de su impacto clínico en tumores de un determinado tipo histológico y
localización.
Inicialmente, se compararon los niveles de expresión proteica de Cdh1 entre líneas tumorales
de diferentes localizaciones. Cdh1 aunque también tiene actividad durante la fase G0/G1 del
ciclo celular, tiene una alta participación en la mitosis, de modo que en este período del ciclo
sus niveles de expresión proteica se elevan (Li y cols., 2007; 2008). Teniendo lo anterior en
cuenta, las células se sincronizaron en la fase G2/M del ciclo celular con el fin de detectar los
máximos niveles de expresión de esta proteína. Es válido señalar que la variedad de líneas
celulares incluidas en esta comparación representan localizaciones tumorales para las cuales
se ha demostrado una reducida expresión de Cdh1 respecto a la contraparte del tejido normal
(Fujita y cols., 2009), de ahí que hemos comparado los niveles de esta molécula entre células
26
Discusión
tumorales que probablemente ya contienen una afectación en la expresión de esta proteína.
Los estudios realizados por Fujita y cols. en el 2009 incluyeron células provenientes de pulmón,
próstata y mama, localizaciones presentes en nuestro estudio, sin embargo, estos autores no
hacen alusión a células tumorales provenientes de vulva, las cuales, según los valores de ∆IMF
obtenidos en la condición de sincronización, presentan los mayores niveles de expresión de
Cdh1. Los resultados obtenidos apuntan a que, entre las líneas tumorales en estudio (A431 de
vulva, H125 de pulmón, PC3 de próstata y MDA-MB231 de mama), la de menor nivel de
expresión de Cdh1 es la de origen mamario en la condición de sincronización.
Coincidentemente, los bajos niveles de expresión de Cdh1 en líneas tumorales de origen
mamario ha sido reportada por Fujita y cols. en el 2008, llegando incluso a proponer a esta
molécula como un factor pronóstico para este tipo de neoplasia maligna.
Dado que los primeros resultados obtenidos apuntan a que las células tumorales de mama son
las que presentan menores niveles de expresión de Cdh1, decidimos centrarnos en varias
líneas tumorales de esta localización para hacer una comparación más extensa de los niveles
de expresión de esta molécula. Los resultados obtenidos permitieron la identificación de cuatro
líneas celulares con menores cantidades de Cdh1: MDA-MB231, MDA-MB468, T47D y MCF7HER2; mientras que las líneas ZR75, SKBR3 y MCF7 poseen una mayor expresión de la
misma. Lo anterior nos hizo enfocarnos en estas cuatro líneas para definir, teniendo en cuenta
el resto de las determinaciones, la línea más adecuada para el modelo celular que buscamos.
Además de la medición de Cdh1 en las células tumorales humanas de origen mamario,
evaluamos los niveles de expresión de las quinasas AURKA y Plk1 (reguladas negativamente
por Cdh1) y del inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas p27 (regulado positivamente
por Cdh1). La importancia de estos experimentos consiste en que con la determinación de la
expresión de moléculas funcionalmente conectadas con Cdh1 en las líneas celulares de interés,
se puede especular acerca de la presencia en mayor o menor cuantía de múltiples mecanismos
de regulación que operan sobre la función de Cdh1 (Lehman y cols., 2007; Tang y cols., 2008;
Gao y cols., 2009; Huang y cols., 2011; Shi y cols., 2011), los cuales van más allá de los niveles
de expresión de esta molécula.
Si se analizan en conjunto los resultados mostrados en las Figuras 2 y 3, podemos considerar
que dentro de las líneas que tienen menores niveles de expresión de Cdh1, sólo la línea tumoral
MDA-MB231 cumple la relación esperada respecto a la expresión de AURKA, Plk1 y p27. O
sea, sólo en esta línea celular las cantidades de p27 fueron comparativamente inferiores con
respecto al resto de las líneas, mientras que las de AURKA y Plk1 están elevadas. Además, en
27
Discusión
el caso específico de AURKA corroboramos los resultados obtenidos en el ensayo de Western
Blot, mediante un marcaje intracelular de citometría de flujo. Observamos que la línea tumoral
MDA-MB231 muestra niveles de expresión de esta quinasa superiores a los encontrados en la
línea MDA-MB468 (MDA-MB468 fue la línea tumoral seleccionada para la comparación debido
a que sus niveles de expresión de Cdh1 son similares a los de MDA-MB231). Teniendo esto en
cuenta, los resultados sugieren que las cantidades elevadas de AURKA en MDA-MB231,
detectadas por ambas técnicas, no solo podría deberse a la expresión reducida de Cdh1 que
esta posee, sino también a la existencia en estas células de mecanismos alternativos que
determinan la sobre-expresión de esta quinasa. De hecho, existen estudios que evidencian que
en células neoplásicas la tumorigenicidad de las mismas se refuerza por la sobre-expresión de
quinasas mitóticas como Plk1 y en especial AURKA (Tanaka y cols., 1999; Strebhardt y Ullrich,
2006; Nadler y cols., 2008; Johnson y cols., 2012), por lo que es posible que mecanismos
dilucidados en tales estudios estén presentes en esta línea celular.
El hecho de que MDA-MB231 sea una línea celular con bajos niveles de Cdh1 y p27, y
elevados niveles de Plk1 y AURKA, la señala como adecuada para evaluar los efectos directos
que podría tener el acto de sobre-expresar Cdh1 en estas células, ya que permitiría comparar y
corroborar mediante la medición de estas mismas moléculas la funcionalidad del producto
proteico del transgén de Cdh1 incorporado.
En las otras líneas tumorales humanas de mama ensayadas donde se detectaron niveles de
Cdh1 similares a los de MDA-MB231, pueden estar operando algunos de los mecanismos de
regulación negativa de la funcionalidad de Cdh1 que impiden relacionar directamente la
expresión de esta molécula y la de sus blancos. Dentro de estos mecanismos figuran aquellos
donde diferentes moléculas limitan la unión y reconocimiento del APCCdh1 por los sustratos
independientemente de las cantidades proteicas de Cdh1. Ejemplo de estas moléculas son
Emi1, CIP2A y NEDD9 de las cuales se ha comprobado su participación en la oncogénesis y
agresividad de diferentes tipos de tumores, incluyendo los de mama (Lehman y cols., 2007; Ice
y cols., 2013; Kim y cols., 2013). Por tanto, sería importante la determinación de estas
moléculas en las líneas celulares en estudio, incluyendo la propia MDA-MB231.
En el caso de las líneas tumorales murinas de origen mamario, el hecho de que no se
encontrarse diferencias importantes entre los niveles de expresión de Cdh1, motiva la
determinación de otras moléculas relacionadas. Ello permitirá obtener un modelo celular válido
para realizar los experimentos in vivo en los cuales se evalúe la incidencia de la sobreexpresión de Cdh1 sobre la tumorigenicidad de las células en el contexto del microambiente
28
Discusión
tumoral. El hallazgo de este modelo celular tendría gran importancia ya que no hay evidencias
en la literatura que demuestren la manipulación de Cdh1 in vivo en aras de incidir
negativamente sobre la progresión tumoral. De hecho, los estudios que demuestran que la
alteración de la expresión de Cdh1, por incremento o reducción, inciden en la progresión
tumoral, se han obtenido por manipulación in vitro de células tumorales humanas y la posterior
implantación de estas en animales inmunodeficientes (Fujita y cols., 2008; 2009). Lo anterior
limita el estudio e impide entender la posible relación entre la actividad de Cdh1 y la conocida
capacidad de las células tumorales de evadir la vigilancia inmunológica (Schreiber y cols.,
2011), por lo que con el empleo futuro de un modelo murino derivado de nuestros estudios
estos obstáculos podrían superarse.
Los resultados obtenidos a lo largo del presente estudio permitieron seleccionar una línea
tumoral humana como potencial modelo para estudiar la influencia que la manipulación de Cdh1
puede tener en la tumorigenicidad, y validar la relevancia de esta molécula para la terapia del
cáncer. La estrategia de selección evidenció que no solo la determinación de los niveles de
expresión de Cdh1, sino además los de sus blancos moleculares, son requisitos claves para
valorar la actividad del complejo APC/CCdh1. Esto último debe extenderse a la selección de una
variante tumoral murina por la relevancia que tendría para las evaluaciones in vivo. Ambos
modelos, tanto humano como murino, podrían convertirse en herramientas eficaces para futuras
terapias contra el cáncer que tengan como centro de atención al gen supresor de tumores
Cdh1.
29
Conclusiones
6. Conclusiones
1. La línea tumoral humana de mama MDA-MB231, sincronizada en la fase G2/M del ciclo
celular, tiene menor nivel de expresión de Cdh1 que las líneas tumorales de vulva,
pulmón y próstata evaluadas.
2. La línea tumoral MDA-MB231 tiene menor nivel de expresión de p27 y mayor de AURKA
y PlK1 que el resto de las líneas tumorales de mama evaluadas, lo que sugiere una
menor actividad de Cdh1 en esta línea y la convierte en un modelo adecuado para
estudiar el efecto de la sobre-expresión de esta molécula en la tumorigenicidad de estas
células.
30
Recomendaciones
7. Recomendaciones
1. Determinar la influencia de la modificación de la expresión de Cdh1 sobre la
tumorigenicidad de la línea celular humana MDA-MB231.
2. Medir en la línea celular humana MDA-MB231 la expresión de moléculas relacionadas
con la regulación del complejo APC/CCdh1.
3. Extender el estudio a las células murinas de mama para seleccionar un modelo celular
adecuado para experimentos in vivo.
31
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