Universidad Veracruzana Facultad de Biología

Universidad Veracruzana
Facultad de Biología
“Aislamiento, caracterización e identificación de bacterias causantes de
pudrición blanda en malanga (Colocasia esculenta Schott).”
TESIS EXPERIMENTAL
PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA RECEPCIONAL
DE LA CARRERA DE LA LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
QUE PRESENTA:
MARCO TULIO SOLANO DE LA CRUZ.
DIRECTOR DE TESIS:
MAURICIO LUNA RODRÍGUEZ.
Xalapa de Enríquez, Veracruz, México
2010
DEDICATORIA
A mi madre LUCIA DE LA CRUZ FRANCISCO, por su paciencia, su cariño y comprensión.
Gracias por apoyarme siempre.
A mis hermanos: Luís Gustavo, Juan Esaú y Dalia Cecilia, por creer ciegamente en mí. Gracias
por darme respaldo aliento.
A Karina. Gracias por tu cariño y compresión y por no dejar que me diera por vencido.
A mis amigos: Antonio, Moisés, Sergio, Enrique, Oscar, Gabriel e Ivonne. Gracias por su
amistad y por todo lo que me han enseñado.
i
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Ma. Del Socorro Fernández, por su apoyo incondicional en la culminación del
presente trabajo, por su orientación en la Experiencia Recepcional y por ser parte fundamental de
en mi formación profesional.
A la Doctora Beatriz Palmeros Sánchez por su dedicación, empeño y su tiempo, por su asesoría y
por compartir sus conocimientos para enriquecer el presente trabajo.
A la Doctora Elda María del Rocío Coutiño Rodríguez por sus atinadas sugerencias y por su
valiosa asesoría para puntualizar el presente trabajo.
Al Doctor Mauricio Luna Rodríguez por permitirme desarrollar el presente trabajo, por su
atinada dirección y por proporcionarme los recursos y los conocimientos requeridos para llevar a
cabo la presente tesis.
Al QFB Sergio Ventura Limón, por su paciencia y disposición
para contribuir con
sus
conocimientos y experiencia, en la realización de este trabajo.
Al laboratorio de Alta tecnología de Xalapa S.C. (Latex). Por proporcionarme y el espacio,
materiales y reactivos necesarios para realizar esta investigación.
ii
ÍNDICE:
ÍNDICE DE TABLAS.
ÍNDICE DE FIGURAS.
V
V
RESUMEN
I.
INTRODUCCIÓN.
II.
ANTECEDENTES.
2.1. El cultivo de malanga (Colocasia esculenta Schott).
2.2. Propagación del cultivo.
2.3. Problemas fitosanitarios de la malanga.
2.4. Pudriciones blandas causadas por bacterias.
2.5. Características
y
requerimientos
ambientales
de
las
Enterobacterias causantes de pudrición blanda en vegetales.
2.6. Mecanismo de infección.
2.7. Los géneros Pectobacterium y Dickeya.
2.8. Dickeya chrysanthemi.
2.9. El gen rRNA 16 S.
III. JUSTIFICACIÓN.
IV. OBJETIVOS.
V. HIPÓTESIS.
VI. MÉTODO.
6.1. Obtención de aislamientos bacterianos.
6.2. Caracterización fisiológica.
6.2.1. Pruebas fisiológicas: pudrición en tubérculos de papa y en
cormo de malanga.
6.2.2. Reacción de hipersensibilidad.
6.2.3. Pruebas Bioquímicas.
6.2.4. Análisis de factorial de correspondencias.
VI
1
2
2
4
4
6
6.3. Caracterización genotípica.
6.3.1. Extracción de DNA geonómico de bacterias.
6.3.2. Visualización y cuantificación del DNA.
6.3.3. Amplificación del gen del rDNA 16S en bacterias.
6.3.4. Purificación de los productos de amplificación.
6.3.5.
Análisis de la secuenciación del gen rDNA 16S amplificado.
VII.
RESULTADOS.
7.1. Aislamiento.
7.2. Caracterización bioquímica.
7.3. Caracterización fisiológica.
7
10
10
12
14
17
22
22
23
23
24
24
24
25
25
25
25
26
27
29
29
30
30
31
32
iii
7.4. Identificación bioquímica del aislamiento 2ca.
7.5. Análisis factorial de correspondencias.
7.5. Extracción de DNA.
7.6. Amplificación.
7.7. Purificacion.
7.8. Secuenciación.
7.9. Análisis filogenético.
7.9.1. Algoritmo Blast.
7.9.2 Neighbor-joining.
7.9.3. Minimum Evolution.
7.9.4. Máximum Parsimony.
7.9.5. UPMGA.
VIII. DISCUSIÓN `
IX. CONCLUSIONES
X. PERSPECTIVAS.
XI. BIBLIOGRAFÍA.
ANEXO I.
iv
33
35
36
37
38
38
40
40
44
45
46
47
48
51
52
53
62
ÍNDICE DE TABLAS:
Tabla 1. Clasificación taxonómica de C. esculenta.
5
Tabla 2. Iniciadores Universales.
28
Tabla 3. Especificaciones para PCR.
28
Tabla 4. Programa térmico para PCR.
29
Tabla 5. Resultados de las pruebas bioquímicas.
32
Tabla 6. Resultados de las pruebas de patogenicidad.
33
Tabla 7. Galería API 20 E.
34
Tabla 8. Cuantificación de DNA.
36
Tabla 9. Resultado de los alineamientos algoritmo BLAST.
39
Tabla 10. Aislamientos relacionados a 2ca.
41
ÍNDICE DE FIGURAS:
Figura 1. Aislamientos bacterianos.
31
Figura 2. Galería Api 20 E.
34
Figura 3. Análisis de correspondencias.
35
Figura 4. DNA genómico.
36
Figura 5. Productos de amplificación.
37
Figura 6. Purificación de amplificados.
37
Figura 7. Electroferograma de la secuencia obtenida.
38
Figura 8. Alineamiento de la secuencia obtenida y la secuencia HM590195.1
40
Figura 9. Dendograma por el método Neighbor-joining.
42
Figura 10. Dendograma por el método Minimum Evolution.
43
Figura 11 Dendograma por el método Máximum Parsimony.
44
Figura 12. Dendograma por el método UPMGA.
45
v
RESUMEN.
A partir de plantas de malanga
(C. esculenta Schott) que presentaban pudrición blanda,
procedentes del Municipio de Actopan Veracruz, se obtuvieron 20 aislamientos bacterianos; de
los cuales 8 son capaces de ocasionar pudrición blanda en cormos de malanga y tubérculos de
papa, además inducen la respuesta hipersensible en tabaco (N. tabacum). Los aislamientos
potencialmente patógenos fueron caracterizados bioquímica y fisiológicamente, determinando
que los agentes causales de la pudrición blanda en malanga, son enterobacterias corresponden a
los géneros Pectobacterium y Dickeya de acuerdo con Schaad (2001).
Sin embargo uno de los aislamientos denominado 2ca muestra características
fenotípicas
especiales para el género Dickeya, por lo que se le aplicó una galería API 20 E, encontrando
dificultades para su identificación.
Actualmente, la secuencia del gen rDNA 16S es utilizada ampliamente para identificar especies
con
mayor precisión y certeza. Se extrajo DNA genómico integro, a partir de los ocho
aislamientos potencialmente patógenos, de acuerdo al método descrito por Cheng & Jiang (2006).
Se amplificó el gen rRNA 16S a partir del DNAg extraído. La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) se llevó a cabo mediante iniciadores universales de rDNA‟s bacterianos
(Veilleux, 2009) obteniendo un fragmento amplificado de aproximadamente 750 pb.
Se realizó la secuenciación del gen rRNA 16S del aislamiento problema. El producto de
amplificación del aislamiento 2ca, fue purificado con el método descrito por Sambrook y Russell
(2001). Para la secuenciación del gen rDNA 16S los productos amplificados fueron enviados al
Instituto de Biotecnología de la UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México) campus
Morelos. A continuación una vez que se obtuvo la secuencia fue editada con los programas
BioEdit y FinchTV para su posterior análisis in silico.
La comparación de las secuencias obtenidas de la amplificación con las secuencias de especies
bacterianas pertenecientes al género Pectobacterium y Dickeya contenidas en la base de datos
vi
GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), se realizó mediante
alineamientos de secuencias utilizando el algoritmo BLAST. Para establecer las relaciones
filogenéticas correspondientes se utilizó el programa Mega 4.1.
Se determinó, mediante el
análisis filogenético, que el aislamiento 2ca corresponde a D. chysanthemi.
vii
I.
INTRODUCCIÓN.
Uno de los cultivos con más alto potencial de producción en las zonas tropicales es la malanga
(Colocasia esculenta Schott), por su gran contenido de almidones posee un alto valor nutritivo,
(Taracena, 2004). El cormo de malanga forma parte de la dieta diaria de millones de personas
alrededor del mundo, originalmente en África, Asia, Oceanía, y debido a la fuerte inmigración
hacia occidente, recientemente se consume en América y Europa.
En los últimos años en los cultivos de malanga se ha detectando la incidencia de pudrición blanda
causada principalmente por P. carotovorum carotovorum y D. chrysanthemi. El porcentaje de
pérdidas en la producción de cormos de malanga por pudrición blanda no ha sido determinado;
sin embargo dado que las condiciones de cultivo para la malanga en las zonas tropicales,
involucran la temperatura y humedad óptimas para el desarrollo de la pudrición blanda, esta
enfermedad representa un problema potencial en el desarrollo de nuevos cultivos en México.
Samson et al. (2005) señalan que la diversidad fenotípica del complejo D. chrysanthemi y P.
carotovorum es amplia, incluso utilizando pruebas bioquímicas clásicas, auxonogramas y galerías
API, resulta difícil la identificación de aislamientos pertenecientes a este complejo. Las pruebas
de patogenicidad en la práctica presentan dificultades para al momento de ubicar un aislamiento
como miembro de algún patovar determinado.
La identificación molecular basada en el análisis del RNAr 16S (o del gen que lo codifica) puede
representar una ventaja, en tiempo y precisión, compitiendo de manera favorable con otras
técnicas rápidas y eficaces como las técnicas inmunológicas (Rodicio y Mendoza, 2004). El
presente trabajo se realizó con el fin de determinar si los agentes causantes de la pudrición
blanda en plantas de Malanga (Colocasia esculenta) procedentes del municipio de Actopan
Veracruz, pertenecen al grupo de enterobacterias fitopatógenas.
1
II.
ANTECEDENTES.
2.1 El cultivo de malanga (Colocasia esculenta Schott.).
Colocasia esculenta pertenece a la familia de las Araceas y es conocida por muchos nombres
comunes como taro, malanga, yautía entre otros. Muchos de estos mismos nombres se aplican
también a las especies del género Xanthosoma, las plantas comestibles en los dos géneros se
pueden distinguir fácilmente por las hojas peltadas en Colocasia y la ausencia de una punta estéril
en el espádice en Xanthosoma (Rodríguez, 2008).
Colocasia esculenta (Linnaeus) Schott presenta bulbos subterráneos ricos en almidón, estolones
alargados, con nodos producidos en o cerca de la superficie, extendiéndose horizontalmente.
Hojas: verdes del pecíolo, a menudo púrpura apical, 30 x 80 (- 180) cm., tejido foliar esponjoso y
lleno de espacios de aire, la hoja va de verde a verde oscuro, verde azul o glauco en la superficie
adaxial, usualmente con una mancha roja o púrpura cerca al pecíolo, peltadas de 2,5 x 7 cm., 17 x
70, 10 a 40 cm.; venas laterales primarias, venas paralelas secundarias, ápice mucronado.
Inflorescencias: espata 20 a 35 cm.; espádice 9 a 15 cm. Flores: de color verde guisante flores
pistiladas, intercalados con pistillodes blanco; un ovario locular, óvulos 36 a 67; flores estériles
blanco a amarillo pálido, las flores estaminadas y naranja pálido punta estéril, estambres 3 a 6,
connados. Las frutas de color naranja. Semillas de 1 a 1,5 mm. Floración tardía primavera –
otoño (Thompson, 2000).
2
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA.
Dominio
Eukaryota.
Subreino
Viridiplantae.
Phylum
Streptophyta.
Division
Magnoliophyta
Clase
Liliopsida.
Orden
Alismatales.
Familia
Araceae.
Subfamilia
Aroideae.
Tribu
Colocasieae.
Género
Colocasia
Especie
C. esculenta
Tabla 1. Clasificación taxonómica de C. esculenta. Tomado de NCBI Taxonomy.
Las especies del género Colocasia han recibido poca atención, excepto para C. esculenta, que se
cultiva en los trópicos y subtrópicos por su alto contenido de almidón y bulbos comestibles. El
origen esta especie cultivada es incierto, pero todas las demás especies del género se producen en
el noreste de la India y el sureste de Asia. Antes de la modernización, el taro era especialmente
importante en las islas del Pacífico. Hawai fue el principal centro de cultivo y tuvo un papel
fundamental en la cultura nativa. Alrededor de 150 variedades de C. esculenta se desarrollaron en
Hawai (Matthews, 1991).
C. esculenta fue llevada probablemente al Caribe y América del Norte procedente de África,
como parte de la trata de esclavos. En el sureste de Estados Unidos, el taro se cultiva
comúnmente en los huertos de los esclavos y sus descendientes libres. A principios de 1900, el
Departamento de Agricultura de EE.UU. intentó una campaña para introducir el cultivo de taro
en las zonas libres de heladas en el sur de los Estados Unidos. Pero el taro no fue aceptado como
un sustituto de la papa (Matthews, 1991).
3
2.2
Propagación del cultivo
La malanga se reproduce de forma asexual, para esto se aprovecha los cormelos (conocidos
comúnmente como hijos) los cuales deben ser sanos y vigorosos con un grosor de 0.5 a 1 pulgada
de diámetro a los que se debe cortar sus hojas a 4 – 6 pulgadas de alto. Además se pueden
aprovechar los cormelos que salen durante la cosecha, con una previa reproducción en semilleros,
estos, son una buena alternativa para conservar la semilla para siembras en épocas de escasez de
hijos (Fernández, 1999).
2.3
Problemas fitosanitarios de la malanga.
En la cuenca del Pacifico se ha detectado la presencia un tipo pudrición blanda del cormo y raíz
de malanga, ocasionada por los hongos del género Pythium (Trujillo 1967; Plucknett, de la Peña,
y Obrero 1970). Y el tizón de la hoja causado por Phytophthora (Trujillo 1967; Jackson and
Gollifer 1975c). Son las enfermedades más devastadoras a las que se enfrentan los cultivos de
malanga, ya que arrasan con más del 80 % de la cosecha. Se encuentra distribuida por todo el
Pacifico y América del Norte (Trujillo, 1967).
En el género Colocasia se han detectado en Cuba, pudriciones secas causadas por los hongos,
Fusarium oxysporum Schlecht, Sclerotium rolfsii Sacc. y Rhizoctonia solani Kühn (Espinosa,
2003).
La mancha foliar ocasionada por los hongos del género Phyllosticta a menudo se puede ver en las
tierras secas de Hawai, especialmente en las áreas de alta precipitación de las islas. Las manchas
que causa Phyllosticta se asemejan a las causadas por el hongo Phytophthora colocasiae excepto
por la ausencia de esporangios en las lesiones producidas por Phytophthora colocasiae. Los
cultivos enfermos son quemados causando la pérdida de la cosecha. La variedad hawaiana
Manini Uliuli es resistente a la penetración de hongos a través de la epidermis (Parris 1941).
El de Tizón del sur, enfermedad causada por hongos del género Sclerotium, aparece en regiones
secas y húmedas. Se presenta en cormos maduros y plantas estresadas. Ocasiona la pudrición de
4
los cormos causando pérdidas de hasta un 100 % si se presenta durante el almacenamiento
(Espinosa, 2003). El hongo Botryodiplodia theobromae causa una pudrición esponjosa, a veces
seca o polvosa. Este hongo es capaz de invadir cormos sanos en condiciones de alta humedad
relativa ocasionando la pérdida de la cosecha (Parris 1941).
El mosaico del Dasheen es una enfermedad causado por un virus conocido como Dasheen
Mosaic Virus (DMV) muy común en los campos de malanga. El DMV es común en Florida,
afectando a la variedad de malanga islefia y muchas especies de aroides ornamentales.
Virtualmente ocurre en todas las plantaciones de malanga, afectando el 90 % de las plantas. Se
considera que esta enfermedad reduce los rendimientos, pero no se han hecho estudios
sistemáticos para cuantificar las pérdidas ocasionadas por esta enfermedad viral (Zettler et al.
1970).
Se han detectado patologías causadas por bacterias pertenecientes al género Erwinia (Erwinia
carotovora y Erwinia chrysanthemi), las cuales causan pudriciones blandas de olor fétido en
coloraciones desde el blanco al azul oscuro. Para la invasión de la bacteria se requiere alta
humedad y es diseminada por los daños que causa la alimentación de los insectos (Ooka, 1985).
La mancha bacterial de las hojas de la malanga, causada por Xanthomonas campestris pv.
diffenbachiae, fue reportada en India en 1946, descrita y caracterizada en los Estados Unidos de
América hasta mediados de 1980. El patógeno puede invadir el tejido vascular de las hojas,
causando rayas o bandas acuosas a lo largo de las venas principales. Una vez que la bacteria está
dentro de los tejidos, ésta puede llegar a las coronas (rizomas) y tubérculos, contaminando así el
material potencial de propagación. La relación entre la severidad de la enfermedad, mancha
bacterial de las hojas y los rendimientos no es conocida y se considera de poca relevancia (De la
Peña y Obrero, 1970).
5
2.4
Pudriciones blandas causadas por bacterias.
La pudrición blanda se caracteriza por la maceración del tejido parenquimatoso, que termina en
una pudrición húmeda y granulosa. El olor fétido que frecuentemente acompaña a la pudrición es
causado por organismos secundarios, los cuales son particularmente activos a temperaturas de
más de 25º C (Elphinstone, 1987).
Las bacterias fitopatógenas antes incluidas en el género Erwinia (Enterobacteriaceae) y ahora en
los géneros Pectobacterium y Dickeya gen. nov. (Samson y col., 2005), son responsables de
podredumbres blandas en distintas especies vegetales, afectando a un amplio rango de plantas
cultivadas y ocasionando graves pérdidas en la producción (Porombelon y Kelman, 1980).
Algunas especies de estos géneros se encuentran frecuentemente en aguas superficiales de lagos,
ríos, pantanos e incluso en el mar (Franc y col., 1985; Jorge y Harrison, 1986; Cother y Gilbert,
1990).
Se destaca a Pectobacterium carotovorum spp. atrosepticum, Pectobacterium carotovorum ssp.
carotovorum y Dickeya chrysanthemi (Syn. Pectobacterium chrysanthemi), dentro de las
principales causantes de la pudrición blanda de los tubérculos de la papa, así como en la
pudrición o marchites de los tallos en plantas de papa en crecimiento, enfermedad conocida como
pierna negra (García, 1994). Estas bacterias causan problemas en la producción de papa en todo
el mundo. No existe un control químico práctico, aunque las medidas culturales pueden reducir
el impacto de la enfermedad (Elphinstone, 1987).
Diversos estudios realizados en Estados Unidos (Powelson y Apple, 1984; Cappaert y col., 1988;
López y col., 1986), Japón (Goto, 1979) y España (Martí y col., 1989), han mostrado que también
están presentes en aguas de riego de campos cultivados, encontrando una relación entre el uso de
aguas contaminadas para el riego y la incidencia de podredumbres blandas en patata y maíz, entre
otros cultivos.
Las bacterias causantes de la pudrición blanda tienen una distribución climática amplia, lo que se
ve reflejado en su diversidad de hospederos y temperaturas de crecimiento. P. carotovorum
6
subsp. atrosepticum se encuentra restringida principalmente a climas templados y casi
exclusivamente a la papa. D. chrysanthemi afecta a una amplia diversidad de cultivos tropicales
y subtropicales, incluyendo papa, plantas ornamentales, maíz, arroz y piña entre otros, en tanto
que P. carotovorum subsp. carotovorum ataca una amplia diversidad de plantas y se encuentra
tanto en las zonas templadas como en las zonas tropicales, causando enfermedad en papa y
muchas frutas y hortalizas (García, 1997).
La pudrición blanda de la papa limita el almacenamiento de los tubérculos, especialmente en
ambientes tropicales. En condiciones deficientes de manejo y almacenamiento, las pérdidas
poscosecha pueden alcanzar el 100%. En operaciones grandes, las pérdidas han alcanzado
millones de dólares. Pérdidas similares pueden ocurrir durante los embarques de papa para
consumo o siembra. Las pérdidas a escala global probablemente alcanzan cientos de millones de
dólares al año (Hooker, 1980).
No se han reportado cifras precisas sobre las pérdidas causadas por la pudrición blanda y la
pierna negra en México. Además, las pérdidas varían de un país a otro, y en ellas influyen el
clima y las condiciones de crecimiento y almacenamiento (Elphinstone, 1987).
Esta patología también es un problema de suma relevancia en el cultivo de la malanga, ya que su
tallo al ser subterráneo con alto contenido de carbohidratos y los altos requerimientos de
humedad del sustrato, necesarios para su producción, propician la proliferación de enterobacterias
en su entorno (Porombelon y Kelman, 1980).
2.5 Características y requerimientos ambientales de las Enterobacterias causantes de
pudrición blanda en vegetales.
Las bacterias causantes de la pudrición blanda pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, y se
caracterizan por que no forman esporas, son Gram negativas, tienen forma de bastón y son
anaerobias facultativas. Todas tiene flagelos y un tamaño de 0,5 a 1,0 x 1,0 a 30 µm. se
diferencian de otros miembros de esta misma familia por su habilidad para producir grandes
cantidades de enzimas pécticas que maceran el tejido parenquimatoso (Porombelon y Kelman
7
1987). Los bacteriólogos las separan en especies y subespecies (subsp.) basándose principalmente
en la temperatura necesaria para crecer en medio artificial, y en propiedades bioquímicas (Lund,
1979). Para su identificación y clasificación también pueden utilizarse técnicas serológicas, de
allí que para D. chrysanthemi se han determinado cuatro grupos serológicos (Samson et al.,
2005).
Dado que estas bacterias son de suma importancia en el cultivo de la papa por la relevancia de
este, se ha dedicado especial atención a esta patología y se ha observado que las bacterias
pectolíticas que atacan los tubérculos y tallos de papa no son patógenos agresivos, ya que sólo
causan infección cuando existen los factores necesarios (Elphinstone, 1987). Comúnmente se
encuentran en estado latente en las lenticelas de los tubérculos, iniciándose la pudrición cuando a
causa de la saturación del suelo por exceso de lluvias o riego, se producen las condiciones
anaeróbicas. Cuando las condiciones son adversas para el cultivo, la infección avanza hasta los
tallos ocasionando pudrición (García, 1997).
Una película de agua sobre la superficie del tubérculo provee condiciones anaeróbicas para el
crecimiento rápido de las bacterias y es necesaria para la iniciación de la pudrición blanda. Así,
un porcentaje alto de humedad del suelo favorece la enfermedad. También se incrementa la
pudrición blanda cuando los tubérculos almacenados están húmedos, o cuando son almacenados
bajo alta humedad relativa o con ventilación deficiente que favorezca la condensación de agua
sobre la superficie del tubérculo (Elphinstone, 1987).
La temperatura determina la velocidad y desarrollo de las bacterias, de allí que a temperaturas
por debajo de los 25°C, P. carotovorum subsp. atrosepticum predomina tanto en la pudrición
blanda como en la pudrición del tallo, y con el incremento de la temperatura se ha observado la
presencia tanto de P. carotovorum subsp. carotovorum como P. chrysanthemi (Lund, 1979).
La interacción entre la humedad del suelo y la temperatura determina la incidencia de la
enfermedad y la expresión de los síntomas. En suelos húmedos, las temperaturas calurosas
durante la emergencia aceleran el desarrollo de la enfermedad. Si la temperatura inicial es inferior
a la óptima para el desarrollo del patógeno, los brotes emergen y desarrollan los síntomas de la
8
enfermedad de pierna negra. Posteriormente, las condiciones húmedas o secas llevan a la
pudrición y marchites de la planta (Porombelo y Kelman, 1980).
En suelos secos durante la emergencia, las plantas presentan apariencia sana, si la temperatura es
calurosa o fría. Posteriormente pueden aparecer los síntomas de pierna negra si la humedad
incrementa, en cambio las plantas permanecen sanas si los suelos permanecen secos (García,
1997).
La incidencia tanto de la pudrición blanda como de la pierna negra está correlacionada con el
número de bacterias latentes por tubérculo. Las plantas que crecen de tubérculos grandes
desarrollan síntomas de pierna negra con mayor frecuencia que las que provienen de tubérculos
pequeños. Sin embargo las fallas en los surcos son más frecuentes cuando se usan tubérculos
pequeños. La pudrición blanda pueden verse favorecida por los daños causados al tubérculo por
una cosecha descuidada, manipulación violenta de tubérculos, insectos, nematodos, hongos, corte
o fraccionamiento de tubérculos – semilla y cambios en la temperatura (Elphinstone, 1987).
La propagación de las bacterias que causan pudrición blanda puede ocurrir en el campo o durante
el almacenamiento. Los tubérculos – semilla con infección en fase de latencia son una fuente
importante de inóculo. Frecuentemente se pudren y liberan bacterias que se filtran a las fuentes
de agua a través del suelo, de esta manera contaminan nuevos tubérculos (Hooker, 1980).
Los informes sobre la supervivencia de las bacterias causantes de pudrición blanda en el suelo
son contradictorios. En zonas templadas, estas bacterias pueden pasar el invierno sobre residuos
vegetales, pero no se ha observado que sobrevivan cuando el cultivo de papa entra en rotación
con cultivos no hospedantes (Lund, 1979).
En los climas más calurosos donde no existe rotación de cultivos, o donde se aplican ciclos cortos
de rotación, las bacterias pasan fácilmente de un cultivo al siguiente, en especial cuando el suelo
está drenado deficientemente (Elphinstone, 1987).
9
Las plantas espontáneas de papa y las rizósferas de otros cultivos y las malezas portan el inóculo.
Las bacterias sobreviven también en lugares donde se desechan tubérculos y hortalizas podridas
(Hooker, 1980).
2.6 Mecanismo de infección.
Las bacterias pectolíticas causan pudrición blanda en un amplio rango de hospederos. El proceso
de pudrición involucra la maceración del tejido vegetal mediante la depolimerizacion de la
pectina en la pared celular vegetal, la pectina es un heteropolisacárido con una cadena de acido
galacturónico parcialmente metílesterificado y acetílesterificado. La capacidad de depolimerizar
la pectina se debe a la presencia de las enzimas, pectín metíl esterasa, pectín acetíl esterasa,
pectato líasa, pectín líasa y pligalacturónasa (Shevchik y Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2003),
celulasas y proteasas, que degradan los componentes de la pared celular de las plantas, lo cual
conlleva a la maceración de los tejidos y la liberación de nutrientes para el crecimiento bacteriano
(Py et al., 1998; Toth et al., 2003).
La enzima pectato líasa secretada por la bacterias que causan pudrición blanda en plantas, ha sido
correlacionada con la patogenicidad y la virulencia de dichas bacterias fitopatógenas (Matsumoto
et al., 2003).
El exceso de agua también es esencial pues permite que las células bacterianas se muevan más
fácilmente a través del tejido de la planta. Además conlleva a una disminución en la
disponibilidad de oxígeno, lo cual crea un ambiente anaeróbico dentro de la planta y limita los
mecanismos de defensa dependientes de oxígeno (Toth et al., 2003).
2.7 Los géneros Pectobacterium y Dickeya.
El género Erwinia, dividido ahora en los géneros Erwinia, Pectobacterium, Pantoea, Brenneria y
actualmente Dickeya, inicialmente fue denominado así en honor de Erwin Smith, fue el primero
propuesto para bacterias patógenas de plantas con forma de bastón, móviles por flagelos
perítricos y anaeróbicos facultativos (Hernández y Rodríguez, 2004).
10
Noval (1991) señala que mientras algunos miembros de estos géneros se limitan a vivir sobre las
superficies vegetales o a ejercer un papel secundario en diversas infecciones, otros, verdaderos
patógenos, desencadenan enfermedades de gran interés para la agricultura, como es el caso del
tizón del fuego de las rosáceas, cuyo agente productor (Erwinia amylovora) merece destacarse
por las medidas de lucha adoptadas en su contra, reflejo de su importancia, y también por la
curiosidad histórica de constituir el punto de partida de la bacteriología vegetal.
Han sido señalados como organismos patógenos presentes en cultivos y plantas ornamentales,
como Dieffenbachia sp. (Ochoa et al., 1987), tomate (Lycopersicon esculentum L. Mill; Custodio
et al., 1993), batata (Ipomoea batatas L. Lam; Varela et al., 1993), papa (Solanum tuberosum L.;
Faría et al., 1993), maíz (Zea mays L.; Hernández et al., 1994), lechosa (Carica papaya L.; Soto,
1994), mango (Mangifera indica; Guevara et al., 1980), zanahoria (Daucus carota; Rodríguez et
al., 2002), patilla (Citrullus lanatus; Carvajal y Corrales, 1993), plátano (Musa AAB; Ordosgoitti
et al., 1974), yuca (Manihot esculenta Crantz; Guevara et al., 1992), cafecito de jardín
(Aglaonema commutatum; Hernández y Trujillo, 1993).
Figuran también organismos de menor renombre histórico, pero más devastadores e importantes
por el daño que ocasionan a los cultivos y a los productos hortícolas, tales como P. carotovorum
y D. chrysanthemi (Erwinia carotovora subsp. carotovora y E. chrysanthemi), organismos
patógenos causantes de pudriciones blandas, cuya importancia se incrementa por el amplio rango
de hospederos y su distribución mundial, así como sus mecanismos de sobrevivencia y dispersión
(Perombelon y Kelman, 1980).
Estas especies constituyen un taxón complejo consistente de razas con un amplio rango de
características génicas, fenotípicas, bioquímicas y de hospederos, consecuencia de su amplia
distribución (Mee-Ngan et al., 2004). La compleja heterogeneidad de las especies del grupo ha
contribuido a que aún no se cuente con descriptores satisfactorios de subespecies o patovares
(Schaad et al., 2001).
11
P. carotovorum subsp. carotovorum afecta principalmente a los cultivos vegetales en las regiones
subtropicales y templadas, probablemente es una de las bacterias fitopatógenas con rango más
amplio de hospederos. Es el agente causal de la pudrición blanda bacteriana, una enfermedad
grave y devastadora de muchos cultivos de importancia económica como la papa, tomate,
pimiento, berenjena y repollo (Khaled Hibar 2007).
Tanto P. carotovorum subsp. carotovorum y D. chrysanthemi tienen una distribución mundial y
se consideran las bacterias patógenas de mayor importancia en el cultivo de la papa desde el
punto de vista comercial (Benelli et al., 2004; Duarte et al., 2004, Burr et al., 2006).
El Bergey's Manual of Systematic Bacteriology describe al género Pectobacterium (incluyendo a
D. chrysanthemi en este género) como bacterias gram negativas de 0.05 a 1.0 x 1.0 a 3.0 µm,
móviles por flagelos peritricos, fermentativas, anaerobias facultativas. Con un crecimiento
optimo de 27º C a 30º C; con una temperatura máxima de crecimiento de 40º C, oxidasa negativa,
catalasa positiva. Bacteria productoras de acido a partir de: N – acetílglucosamina, fructosa, D –
galactosa, D - glucosa, D – manosa, L – ramnosa, D – ribosa, salicina y sacarosa, pero no
producen acido a partir de adonitol, L – arabinol, D – lixosa, α – metilmanosido, L – sorbosa, y D
– tagatosa. Utilizan acetato, arbutina, fructosa, fumarosa, D – galactosa, D –glucosa, glicerol,
malato, D – manitol, Manosa, ß – Metilglucósido, ribosa, salicina, succinato, sacarosa, benzoato,
butanol, galato, metanol, oxalato, propionato, o sorbato como fuentes de carbón y energía.
Utilizan L -alanina, alantoína, ácido γ-aminobutanico, cloruro de amonio, arginina, asparagina,
ácido asparagínico, citrulina, glucosamina, glutamina, el ácido L - glutamínico, glutatión, glicina,
glicilglicina, histidina, leucina, L-metionina, fenilalanina, L-serina, L-triptófano, tirosina, y urea,
pero no ácido antranílico, betaína, colina, cisteamina, ácido hidroxiprolina, acido quinolínico,
sarcosina, espermidina, espermina, trigonelina o trimetilamonio como fuentes de nitrógeno. No se
posee decarboxilasas para arginina, lisina u ornitina. No poseen triptófano deaminasa o ureasa.
Hidrolizan esculina pero almidón.
2.8 Dickeya chrysanthemi
12
D. chrysanthemi (Erwinia chrysanthemi) fue descrita en 1953, como el agente causante de la
enfermedad de “tallo hueco” en Chrysanthemum morifolium por Burkholder et al. Bacterias
similares fueron subsecuentemente aisladas de diversas especies de plantas enfermas que
presentaban marchites y pudrición blanda. Tomando como base una serie de pruebas bioquímicas
los fitobacteriólogos determinaron seis patovares de D. chrysanthemi: pv. chrysanthemi, pv.
dianthicola, pv. dieffenbachiae, pv. parthenii, pv. zeae y pv. paradisíaca (Samson et al., 2005).
En base a relaciones filogenéticas establecidas mediante la secuencia del gen rRNA 16S. E.
chrysanthemi pv. paradisíaca fue reubicada y renombrada como Brenneria paradisíaca, mientras
que los demás patovares permanecieron sin cambio (Samson et al., 2005).
Samson et al. (2005) señalan que la diversidad fenotípica del complejo D. chrysanthemi es
amplia, incluso utilizando pruebas bioquímicas clásicas, auxonogramas y galerías API, resulta
difícil la identificación de aislamientos pertenecientes a este complejo. Las pruebas de
patogenicidad en la práctica presentan dificultades para al momento de ubicar un aislamiento
como miembro de algún patovar determinado.
La ribotipificación y los estudios de PCR – RFLP muestran una gran heterogeneidad genómica
en los aislamientos del complejo D. chrysanthemi. Sin embargo mediante estas técnicas es
posible ubicar cepas pertenecientes a grupos fenotípicos diferentes y relacionados genéticamente
en biovares (Samson et al., 2005).
La diversidad general de los aislamientos del complejo D. crysanthemi también fue demostrada
por la técnica de Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP), sin embargo
ninguno de estos estudios permite la clarificación de la taxonomía del complejo (Samson et al.,
2005).
Los estudios iniciales de las relaciones filogenéticas en base al análisis de DNA, a pesar de contar
con un bajo número de aislamientos, reveló que D. chrysanthemi podría dividirse en cuatro
grupos relacionados genéticamente: el primer grupo pertenece a los aislamientos de
Dieffenbachia, el segundo grupo corresponde a los aislamientos procedentes de Chrysanthemum
13
morifolium y Parthenium sp., el tercer grupo pertenece a los aislamientos obtenidos a partir de
Maíz, el cuarto grupo a los obtenidos a partir de caña de azúcar (Samson et al., 2005).
2.9 El gen rRNA 16 S.
Los ribosomas son orgánulos complejos, muy especializados, requeridos para la síntesis de
proteínas. El ribosoma bacteriano tiene un coeficiente de sedimentación 70s, puede disociarse en
dos subunidades, la subunidad grande de 50s y la pequeña de 30s. Cada subunidad constituye un
complejo de proteínas ribosomales y moléculas de rRNA específicas. La subunidad 30s contiene
rRNA 16S y 21 proteínas ribosomales (Rodicio et al., 2004).
El gen 16S rRNA también es designado como 16S rDNA, los dos términos son usados
indistintamente, sin embargo la política de ASM (American Society for Microbiology) es usar el
término “gen 16S rRNA”.
Los genes bacterianos que codifican los rRNA están organizados en operones. Cada operón
ribosómico (rrs) incluye genes para el rRNA 16S de la subunidad pequeña y genes para rRNA
23S y 5S de la subunidad grande, separados por regiones íntergénicas (IG) El producto de la
trascripción del operón a partir de dos promotores, P1 y P2, situados en la región anterior a rrs,
será procesado por el enzima ARNasa III mediante cortes en sitios específicos que separan las
tres clases de ARNr, el/los ARNt y las dos IG. El gen rRNA 16 S Es un polinucleótido de
aproximadamente de 1500 nucleótidos. La secuencia del gen rRNA 16S posee regiones variables
y conservadas. (Rodicio et al., 2004).
En la década de los 60, Dubnau et al., notaron que existe cierto grado de conservación en las
secuencias del gen 16S rRNA en Bacillus spp. Este hecho puede asumirse como resultado de la
importancia de gen 16S rRNA como un componente crítico para el funcionamiento celular;
hecho que contrasta con los genes que codifican enzimas. Pocos son los genes altamente
conservados como el 16S rDNA (Clarridge. 2004).
14
Aunque la tasa absoluta de cambio del gen 16 S rRNA no se conoce, marca las distancias
evolutivas y el grado de relación entre organismos. El problema en la asignación de un valor
numérico a la tasa de cambio del gen 16 S rRNA puede deberse al hecho de que la tasa de
variación de este gen no es igual para todos los organismos, diferentes grupos taxonómicos
pueden tener diferentes tasas de cambio. Las tasas de cambio pueden variar en ocasiones durante
la evolución, o pueden ser diferentes a lo largo del gen rRNA 16S (Harmsen et al., 2004).
En la década de 1980 comenzaron a desarrollarse nuevos estándares de identificación de
microorganismos. Woese demostró que las relaciones filogenéticas entre bacterias, y de hecho en
todos los organismos, podrían ser determinadas por la comparación de una parte estable del
genoma. Woese consideró al gen rRNA 16s como un cronómetro molecular, ya que permite
establecer alineamientos y comparaciones entre sus secuencias y relacionarlos a diferentes
niveles taxonómicos. El gen es bastante largo, presenta suficiente polimorfismo ínterespecifico de
genes rRNA 16S, lo que proporciona diferenciación y mediciones estadísticamente validas
(Clarridge. 2004).
El análisis de secuencias de los rRNA 16s para el estudio de procariotas, reveló que existen una o
más secuencias específicas cortas y que están siempre presentes en los miembros de
determinados grupos filogenéticos, estas secuencias características nunca están presentes en
grupos filogenéticos distintos; dichas secuencias se denominan nucleótidos firma, los cuáles
muestran un mayor número de mutaciones; esas regiones no son las mismas para todas las
especies (Tortoli, 2003). (Rodicio et al., 2004).
El resultado de los trabajos de Woese, después de sus análisis filogenéticos moleculares, fue la
división de los procariotas en dos grupos o reinos ampliamente divergentes: Eubacterias y
Archeas. A partir de esta primera división fue posible establecer las divisiones mayoritarias y
subdivisiones dentro de ambos reinos (Rodicio et al., 2004).
El análisis realizado por Woese consistió solo en la secuenciación parcial de fragmentos de
rRNA 16s, este método se denomina catalogación de oligonucleótidos. Esta técnica consiste en
el marcaje in vivo de las secuencias de rRNA 16s, posteriormente la molécula de rRNA 16s es
15
purificada para ser tratada con la ribonucleasa T1. A continuación son separados y secuenciados
todos los fragmentos que al menos tengan 6 nucleótidos. Actualmente se ha sustituido
catalogación de oligonucleótidos por la secuenciación del gen (DNAr) que codifica los rRNA 16s
(Rodicio et al., 2004).
Para esta tarea en bacterias, en un principio se pensó en los genes codificantes de los RNAs de las
subunidades ribosomales 5S, 16S y 23S, así como las regiones entre dichos genes. (Bottger.,
1989). El gen 16S rRNA no solamente puede ser comparado a nivel de bacterias, sino que
también puede ser comparado con el gen 16S rRNA de arqueobacterias ó con el ge 18 S rRNA de
eucariotas (Pace., 1997). Otras regiones del gen rRNA han sido utilizadas para establecer
relaciones filogenéticas entre bacterias.
Roth et al., utilizo la secuencia del espaciador interno trascrito 16S – 23S rRNA. Para diferenciar
especies de Mycobacterium spp, encontrando que este análisis puede ser utilizado
particularmente para especies que no pueden ser diferenciadas mediante la secuencia del gen
rRNA 16 S. Se ha encontrado que la secuencia del gen rRNA 23S puede utilizarse para distinguir
entre las especies de Estreptococcus spp. (Roth et al., 1998).
La fácil secuenciación de los rRNA 16s ha llevado al establecimiento de bases de datos amplias y
en constante crecimiento, gracias a la aparición de programas informáticos que hacen posible
determinar coeficientes de asociación; lo cual hace de este análisis una herramienta práctica y
muy útil en la identificación bacteriana (Rodicio et al., 2004).
El número de copias del operón ribosómico por genoma bacteriano varía considerablemente, de 1
a 15, siendo relativamente constante a nivel de especie, género e incluso familia. Entre las copias
de los ARNr 16S codificadas por un mismo genoma se ha detectado un cierto grado de
heterogeneidad (denominada microheterogeneidad) (Rodicio y Mendoza, 2004).
La presencia de polimorfismo intracelular, significa que existen varias copias del gen rRNA 16S
dentro de una misma célula (en un mismo genoma), alguna de estas copias podría contener una
secuencia diferente para el mismo gen, ocasionando que en la secuenciación aparezcan 2 bases
16
diferentes en un lugar determinado. La existencia de alelos variantes para el gen rRNA 16S en
un mismo genoma ha sido reportada por Gee et al., 2003, Ninet et al., 1996, Reischl et al., 1998,
Ueda et al., 1998; y Wilson et al., 2001.
El polimorfismo intracelular no parece ser un problema para la identificación de bacterias basada
en la secuenciación del gen rRNA 16S, debido al bajo porcentaje de variación que presenta
(alrededor del 1%), es decir no son lo suficientemente numerosos, para causar diferencias en las
secuencias en que se presentan, siendo ubicadas, las secuencias polimórficas, bajo la misma
especie (Clarridge. 2004).
El gen rRNA 16s es también objetivo de varios agentes antimicrobianos. Las mutaciones en el
gen rRNA 16 S pueden afectar la susceptibilidad de los organismos a tales agentes, la secuencia
del ge rRNA 16s puede conferir la resistencia fenotípica a los agentes microbianos (Pfister et al.,
2003).
Sin embargo la resistencia a agentes antimicrobianos no evita o afecta el uso de la secuencia del
gen rRNA 16S para la identificación bacteriana, o la asignación de relaciones más filogenéticas
cerradas como genero y especie. La resistencia a agentes antimicrobianos tiene un gran impacto
en el establecimiento de relaciones filogenéticas más amplias (Garrity et al,. 2001).
III.
JUSTIFICACIÓN
Uno de los cultivos con mayor potencial de producción en las zonas tropicales es la malanga
(Colocasia esculenta Schott), por su gran contenido de almidones, el cormo tiene un alto valor
nutritivo, (23 – 60% de carbohidratos del volumen total del cormo) y es muy utilizado en la
industria alimenticia. En la década de los años ochenta, se incremento el cultivo de malanga
como parte de la producción de alimentos no tradicionales. Esta planta esta considerada dentro de
las especies de raíces y tubérculos más importantes en la zona tropical (Taracena, 2004).
El cormo de malanga forma parte de la dieta diaria de millones de personas alrededor del mundo,
originalmente en África, Asia, Oceanía, y debido a la fuerte inmigración hacia occidente,
17
recientemente se consume en América y Europa. Se enmarca dentro de los productos exóticos o
no tradicionales, cuyo consumo mundial ha tenido un auge importante aprovechando el interés
por parte de sectores crecientes de consumidores.
Existen varias regiones que cuentan con las condiciones adecuadas para explotación y cultivo de
malanga en México, lo que lo hace un producto con alto potencial para su implantación en el
país. En la zona tropical, este cultivo produce aproximadamente siete toneladas por hectárea
(Taracena 2004).
Los principales países productores de malanga son Nigeria, Ghana y Costa de Marfil. Sin
embargo Nigeria posee el 74% de la producción mientras Ghana y Costa de Marfil cuentan con el
11% y el 9% respectivamente.
Los principales países exportadores de malanga son Brasil, Jamaica y Ghana. Sin embargo por el
valor unitario de las exportaciones, es decir el precio por tonelada, las posiciones cambian
teniendo en primer lugar a Dominica, en segundo a China y en tercero a Jamaica. Los principales
países importadores de malanga son Estados Unidos, China y Malí, teniendo el 85%, el 9% y el
6% del total mundial respectivamente.
En México, el único Estado productor ha sido Veracruz, aunque en los años 2001 y 2005 no se
reporta producción de malanga. Los datos de malanga para el Estado de Veracruz a noviembre de
2006, fueron de 2.5 hectáreas como superficie cosechada y 100 toneladas como producción,
siendo Soledad de Doblado el único municipio productor a escala comercial, sin embargo existen
plantaciones menores en la zona centro del estado.
La malanga se adapta a los climas y tipos de suelo de varias regiones productivas del país, sobre
todo en las regiones calurosas, donde las condiciones
agroclimáticas hacen posible su
implantación como cultivo rentable y opción altamente potencial para el mercado de productos
exóticos, así como una alternativa viable para participar en la reconversión de cultivos poco
rentables en sistemas de producción sanos, con una productividad aceptable y una interesante
rentabilidad.
18
En corto plazo, los cultivos forestales y no tradicionales deberán tener mayor participación en el
mercado agropecuario, sustituyendo a cultivos que por su baja productividad y sobreoferta
internacional no sean rentables.
Existen varios factores que limitan o reducen la producción de cultivos extensivos, entre los
cuales las enfermedades de origen bacteriano juegan un papel predominante debido a las pérdidas
que ocasionan.
Funnell (1993), señala que en las plantaciones de calas, las pérdidas ocasionadas por
Pectobacterium carotovurum, alcanzan en muchas ocasiones 30%. En 1980, pérdidas mundiales
atribuidas a la pudrición bacteriana se estimaron por sobre US $100 millones/año. En Nueva
Zelanda la industria de cala pierde más de 2 millones $NZ por año (Vanneste 1996.; Wright,
1998).
La pudrición blanda, causada por Sclerotinia sclerotiorum y S. minor, es la enfermedad más
limitante en Colombia y ocasiona pérdidas económicas en la lechuga equivalentes a una
reducción entre el 30-50% de la población de plantas. Tanto las condiciones climáticas como la
densidad de los esclerocios en el suelo influencian los niveles de pérdidas en el cultivo, siendo
por lo tanto esta enfermedad de gran importancia para el horticultor (Pérez et al. 2009).
El cultivo de papa ocupa el cuarto lugar entre los principales cultivos alimenticios a nivel
mundial, en las zonas más calidas las pérdidas ocasionadas por la pudrición blanda pueden
alcanzar el 100%. Las pérdidas a escala global probablemente alcanzan cientos de millones de
dólares al año.
En los últimos años en los cultivos de malanga se ha detectando la incidencia de pudrición blanda
causada principalmente por P. carotovorum carotovorum y D. chrysanthemi. El porcentaje de
pérdidas en la producción de cormos de malanga por pudrición blanda no ha sido determinado;
sin embargo dado que las condiciones de cultivo para la malanga en las zonas tropicales,
19
involucran la temperatura y la humedad óptimas para el desarrollo de la pudrición blanda, esta
enfermedad representa un problema potencial en el desarrollo de nuevos cultivos en México.
No se ha establecido ningún mecanismo para el control químico o biológico de la pudrición
blanda, sin embargo la correcta identificación de los patógenos, permite establecer medidas que
eviten la propagación de la enfermedad.
Samson et al. (2005) señalan que la diversidad fenotípica del complejo D. chrysanthemi es
amplia, incluso utilizando pruebas bioquímicas clásicas, auxonogramas y galerías API, resulta
difícil la identificación de aislamientos pertenecientes a este complejo. Las pruebas de
patogenicidad en la práctica presentan dificultades para al momento de ubicar un aislamiento
como miembro de algún patovar determinado.
La diversidad general de los aislamientos del complejo D. crysanthemi también fue demostrada
por la técnica de Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP), sin embargo
ninguno de estos estudios permite la clarificación de la taxonomía del complejo (Samson et al.,
2005).
Las especies causantes de pudrición blanda constituyen un taxón complejo consistente de razas
con un amplio rango de características génicas, fenotípicas, bioquímicas y de hospederos,
consecuencia de su amplia distribución (Mee-Ngan et al., 2004). La compleja heterogeneidad de
las especies de este grupo ha contribuido a que aún no se cuente con descriptores satisfactorios de
subespecies o patovares (Schaad et al., 2001).
En los últimos años se ha extendido el uso de los genes 16S como marcadores
moleculares, siendo herramientas útiles en la determinación taxonómica de bacterias (Wise et al
1997); los análisis taxonómicos por medio de marcadores moleculares, como la secuenciación de
genes 16S le han dado precisión y fortaleza a la identificación bacteriana basada en técnicas de
cultivo tradicionales (Wise et al 1997).
20
La Identificación molecular basada en el ADNr 16S se requiere para la determinación de
bacterias cuya identificación se dificulta o resulta imprecisa mediante otro tipo de técnicas
(Rodicio et al., 2004).
La técnica de análisis para establecer relaciones filogenéticos entre bacterias a partir de la
comparación de las secuencias rRNA 16S o de sus genes codificadores, ha permitido el
establecimiento de la clasificación taxonómica bacteriana vigente (Rodicio et al., 2004).
La identificación molecular basada en el análisis del RNAr 16S (o del gen que lo codifica) puede
representar una ventaja, tanto como en tiempo como en precisión, compitiendo de manera
favorable con otras técnicas rápidas y eficaces como las técnicas inmunológicas (Rodicio y
Mendoza, 2004).
La secuenciación de gen rRNA 16S, tradicionalmente ha ocupado un papel limitado en la
identificación de microorganismos, principalmente debido a su alto costo, requisitos técnicos, a
las dificultades en el uso del software de análisis comparativo, y a la disponibilidad de bases de
datos.
Sin embargo la aparición de mejores técnicas de secuenciación de DNA, el aumento en el
contenido y precisión de la información en las bases de datos, y la disponibilidad de equipos y
software, hacen de esta tecnología una alternativa competitiva con las técnicas de rutina en la
identificación de microorganismos. Los costos pueden ser comparables a los métodos
tradicionales de identificación de crecimiento lento para organismos difíciles de identificar
(Clarridge. 2004).
Actualmente en estudios de identificación taxonómica de bacterias se recomienda para una
identificación precisa, utilizar criterios fenotipitos así como los resultados de los análisis de
comparación de secuencias rRNA 16 S o sus genes codificadores.
21
IV.
OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar la especie bacteriana causante de la pudrición blanda en cormos de malanga
(Colocasia esculenta) procedentes de Actopan, Ver.
Objetivos específicos

Aislar bajo condiciones in Vitro, los microorganismos asociados al daño del material
vegetal.

Caracterizar e identificar fenotípicamente (pruebas bioquímicas y fisiológicas) los
aislamientos bacterianos.

V.
Caracterizar e identificar genotípicamente (rRNA 16S) los aislamientos bacterianos.
HIPÓTESIS.
Si los daños en el cormo de malanga son causados por bacterias, entonces los organismos
responsables corresponden a algún género de enterobacterias.
22
VI.
MÉTODO
6.1.
Obtención de aislamientos bacterianos.
Los aislamientos bacterianos se obtuvieron a partir de cormos de plantas de C. esculenta Schott
(malanga), con daño evidente de pudriciones blandas de olor fétido, procedentes del municipio de
Actopan, Veracruz.
Para ello, se procedió a realizar los siguientes pasos tomando las recomendaciones de Schaad et
al. (2001):

El tejido vegetal fue lavado superficialmente con agua destilada estéril y desinfectado por
inmersión en solución de hipoclorito de sodio (1% v/v) durante 1 a 2 min.

A continuación se enjuagó con agua destilada estéril.

Se eliminaron las zonas vegetales con daño avanzado y se utilizó tejido periférico de la
zona lesionada.

Se seccionaron segmentos de tallos de 5 plantas en cortes menores a 1 cm2, mismos que
se homogenizaron en un mortero de porcelana estéril adicionado con 1 mL de agua
destilada estéril.

La solución de maceración fue estriada en cajas Petri con medio B de King (KB).

Las placas estriadas fueron incubadas a 27°C ± 1°C hasta la formación de crecimiento
bacteriano evidente.

De cada caja se seleccionaron colonias por cada tipo colonial desarrollado y se estriaron
en medio de cultivo nuevo, descartando las colonias con crecimiento rápido a las 24 h.

Este procedimiento se repitió las veces necesarias con la finalidad de obtener cultivos
puros, evaluando la morfología y agrupación colonial mediante técnicas de observación
microscópica.
23
Nota: El agua y los morteros se esterilizaron a 121°C/15 min/15 psi en un autoclave
convencional (Felisa FE-387).
6.2.
Caracterización fisiológica.
6.2.1. Pruebas fisiológicas: pudrición en tubérculos de papa y en cormo de malanga.
Se seleccionó material vegetal sano de tubérculos de papa (Solanum tuberosum) y cormos de
malanga (Colocasia esculenta Schott.), los cuales fueron desinfectados superficialmente en
hipoclorito de sodio al 1% durante 3 minutos, posteriormente se enjuagaron con agua estéril y se
inocularon con 100 µL de suspensión bacteriana (108 UFC/ml) preparada a partir de cada
aislamiento. Los resultados de la inoculación se observaron 48 horas (Khaled Hibar 2007).
6.2.2. Reacción de hipersensibilidad
Para probar la capacidad de los aislamientos obtenidos para inducir reacción de hipersensibilidad
en hojas de tabaco, (Nicotiana tabacum). Se estableció un semillero de tabaco sembrando las
semillas en tierra (previamente esterilizada 121°C/15 min/15 psi). A partir de cultivos puros cada
uno de los aislamientos obtenidos se prepara una suspensión bacteriana en agua destilada estéril,
utilizando colonias con 24 horas de crecimiento en medio KB, cuya absorbancia fue de 0.1 con
una longitud de onda de 600 nm, correspondiente a una concentración de 1 x 10 8 UFC / ml (He et
al., 1983). Se utilizaron plantas de tabaco de ocho semanas de desarrollo, las cuales se inocularon
por infiltración con una jeringa en las nervaduras por el envés de las hojas. Una vez que las
plantas fueron inoculadas permanecieron a temperatura ambiente en el vivero.
24
6.2.3. Pruebas Bioquímicas.
Las pruebas bioquímicas se realizaron de acuerdo a los métodos descritos por Schaad et al.
(2001) para prueba de Gram, oxido-fermentación de glucosa, oxidasa, catalasa, reducción de
nitratos, sensibilidad a 15 mg de eritromicina, tolerancia a NaCl 5%, crecimiento en extracto de
levadura (YS) a 37°C, liquefacción de gelatina, y producción de indol.
Posterior a las pruebas bioquímicas generales se aplicó una galería API 20 E para enterobacterias
al aislamiento 2ca. Se siguió el protocolo desarrollado por API TM. Los resultados se corrieron
en el software APIWEB (BIOMERIEUX INC.).
6.3.
Análisis de factorial de correspondencias.
Para determinar si es posible establecer grupos fenotipos, en base a los resultados de las pruebas
bioquímicas aplicadas a los 20 aislamientos obtenidos.
Se realizó un análisis
factorial de
correspondencias utilizando el programa informático STATISTICA 7. Los resultados de las
pruebas bioquímicas de los 20 aislamientos fueron comparados utilizando los datos para las
especies de Pectobacterium, reportados por Schaad et al. (2001).
6.4.
Caracterización genotípica.
En este apartado se realizaron las siguientes etapas:
6.4.1. Extracción de DNA geonómico de bacterias.
La extracción del ADN bacteriano se llevó a cabo de acuerdo al método propuesto por Hai-Rong
& Ning (2006) que consistió en:
1. Transferir 10 colonias de bacterias, después de 24 horas de crecimiento en medio KB, a
un tubo de microcentrifuga para formar una suspensión bacteriana en 1 ml de agua
estéril.
2. La suspensión bacteriana se centrifuga a 12,000 rpm durante 2 minutos.
25
3. Se desechó el sobrenadante por decantación, conservando el precipitado o pastilla.
4. Se realizó un lavado al precipitado añadiendo 400 µl de Buffer STE (100 mM, NaCl, 10
mM Tris/ HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) y resuspendiendo la pastilla por medio Vórtex.
5. La suspensión celular en buffer STE se centrifuga a 12,000 rpm durante 2 minutos.
6. Se desecha el sobrenadante conservando el precipitado.
7. Se resuspende el precipitado en 200 µl de buffer TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH
8.0) por medio de Vórtex.
8. Se añaden 100 µl de Tris – Fenol saturado (pH 8) a la suspensión bacteriana en TE.
9. Se agita vigorosamente la suspensión bacteriana mediante Vórtex durante 60 segundos.
10. Se centrifuga la suspensión bacteriana a 16,000 rpm durante 5 minutos a 4 a.C. a fin de
separar la fase orgánica de la fase acuosa.
11. Se transfirieren 150 µl de la fase acuosa a un tubo limpio para microcentrifuga.
12. Se añaden 40 µl de buffer TE para obtener un volumen de 200 µl.
13. Se añaden 100 µl de cloroformo.
14. Se centrifuga la solución a 16,000 rpm durante 5 minutos a 4 a.C.
15. Se repite el proceso desde el paso 11 dos veces hasta no observar una interfase de color
blanco presente en el sobrenadante.
16. Se toman 160 µl del sobrenadante y se trasfirieron a un tubo para microcentrifuga limpio.
17. Se añaden 40 µl de buffer TE.
18. A la solución anterior se le añaden 5 µl de RNasa (a una concentración de 10 mg/ µl).
19. Se incuba la solución a 37 ºC durante 10 minutos para digerir el RNA presente.
20. Se añaden 100 µl de cloroformo a la solución anterior.
21. Se centrifuga la solución a 16,000 rpm durante 5 minutos a 4 ºC .
22. Se transfieren 150 µl del sobrenadante a un tubo para microcentrifuga limpio y se
almaceno a -20 ºC para los ensayos posteriores.
6.4.2. Visualización y cuantificación del DNA.
Para observar el grado de integridad del DNAg obtenido se llevó a cabo una electroforesis en geles
de agarosa al 0.8% (TBE 0.5 X) en una cámara horizontal CONSORT a 70 V durante 90 minutos.
Los geles de agarosa fueron teñidos en 100 ml de solución TBE 0.5 X con 2 μL de bromuro de
26
etidio (10 mg/ml) durante 20 min, y visualizados con luz UV en un equipo transiluminador
CONSORT. El DNAg observado, separado por electroforesis se registró mediante fotografía, las
imágenes fueron editadas en el sistema de fotodocumentación Axiovision Zoom Browser EX
(Cannon).
La cuantificación del DNA se realizó partiendo del supuesto que una unidad de absorbancia a 260
nm es igual a 50 ng/μL de DNA de doble cadena (Rickwood & Hames, 1990). La calidad del ADN
fue inferida mediante el cálculo de la relación A260/A280. Las lecturas de absorbancia se realizaron
en un espectrofotómetro PERKIN ELMER Lamdba 40.
6.4.3. Amplificación del gen del rDNA 16S en bacterias.
La amplificación de gen rDNA 16S se realiza utilizando las siguientes condiciones de acuerdo
con Veilleux (2009).
1. Los iniciadores utilizados fueron
.
INICIADORES UNIVERSALES
Primer
Secuencia.
Primer Universal Bact Forward
5‟ GAT CCT GGC TCA GGA TGA AC 3‟
Primer Universal Bact Reverse
5‟ GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC 3‟
Tabla 2. Iniciadores Universales UniBact Forward y Reverse.
2. Se prepara la siguiente mezcla de reacción.
27
REACCION DE PCR
Componentes de reacción
Requerimiento/ reacción
DNA genómico
40 ng
Primer Universal Bact Forward (10 pM/µL)
15 pM
Primer Universal Bact Reverse (10 pM/µL)
15 pM
dNTP´s 25 mM (Promega)
0.2 mM
Tampón taq, 5 X (Promega)
1X
MgCl2, 25mM (Promega)
2 Mm
Taq DNA polimerasa, 5 U/µL (Promega)
Volumen final
1U
25 µL
Tabla 3. Reacción general de PCR para amplificar el gen rRNA 16S.
3. La reacción se lleva a cabo en un termociclador Eppendorf bajo el siguiente programa
térmico.
PROGRAMA TÉRMICO.
Temperatura (°C)
Tiempo
94 °C
2 min
94 °C
1 min
55 °C
1min
72 °C
1min
72 °C
5 min
Ciclos
1
30
1
Tabla 4.Programa de termociclador para llevar a cabo la amplificación del gen
rRNA 16S mediante PCR.
4.
La separación de los productos amplificados se realizo por medio de electroforesis en gel
de agarosa 1.6% en buffer TBE 1X a 90 V en una cámara horizontal CONSORT.
28
5. Para la visualización de los productos amplificados los geles de azarosa al 1.6 % fueron
teñidos en 100 ml de solución TBE 0.5 X adicionando 2 μL de bromuro de etidio (10
mg/ml) durante 20 min.
6. Los productos de amplificación fueron visualizados en luz UV con un equipo
transiluminador marca CONSORT.
7. Los productos de amplificación observados fueron registrados mediante fotografía, y
editados en el sistema de fotodocumentación Axiovision Zoom Browser EX (Cannon).
6.4.4. purificación de los productos de amplificación.
Para la purificación de los productos de amplificación se sigue el protocolo descrito por
Sambrook y Russell 2001, que se detalla en los anexos. Cabe mencionar que se utiliza agarosa en
lugar acrilamida para la preparación los geles (como recomienda el método señalado).
6.4.5. Análisis de la secuenciación del gen rDNA 16S amplificado.
Para la secuenciación del gen rDNA 16S los productos amplificados fueron enviados al Instituto
de Biotecnología de la UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México ) campus Morelos.
A continuación una vez que se obtuvo la secuencia fue editada con los programas BioEdit y
FinchTV para el posterior análisis in silico.
La comparación de las secuencias obtenidas de la amplificación con las secuencias de especies
bacterianas pertenecientes al género Pectobacterium contenidas en la base de datos GenBank del
National Center for Biotechnology Information (NCBI), se realizó mediante alineamientos de
secuencias utilizando el algoritmo BLAST. Para establecer las relaciones filogenéticas
correspondientes se utilizó el programa Mega 4.1.
29
VII.
RESULTADOS.
7.1. Aislamiento.
A partir de plantas de malanga que presentaban pudrición, a las 24 horas de incubación a 27º C
se obtuvieron placas con crecimiento abundante en medio KB y YDC, sobre ambas placas se
podía observar una gran variedad de colonias morfológicamente distintas. De acuerdo con Schaad
(2001) se seleccionaron solamente aquellas colonias (posibles enterobacterias patógenas de
plantas) que presentaban color blanquecino a amarillo crema en medio KB, que fueran colonias
brillantes, no mucoides, con morfología colonial circular uniforme, de aproximadamente 0.5
mm. a 1 mm. de diámetro, las colonias se vuelven tornasol con la incidencia de la luz visible
sobre la placa.
Los 20 tipos coloniales obtenidos y que cumplen con la descripción anterior, fueron reaislados
en medio KB hasta obtener cultivos puros de cada tipo colonial. A las 48 de incubación horas las
colonias sobre medio KB, presentaban un diámetro de 2.5 a 5 mm. Las colonias se tomaron
coloraciones de blanco crema; las colonias sobre el medio YDC se tornaron de blanco a amarillo
pálido. Uno de los aislamientos denominado 2ca a partir de las primeras 24 horas de crecimiento,
muestra características morfológicas distintas a los demás aislamientos y también distintas de la
características fenotípicas reportadas para enterobacterias causantes de pudrición blanda; cambia
la coloración típica del medio KB, tornado la placa café oscuro, las colonias de este aislamiento
también cambian de color, hacia las 72 horas de crecimiento las colonias, en KB y YDC son
totalmente café oscuro. Estas colonias despiden un olor característico diferente de los demás
aislamientos.
30
TIPOS DE AISLAMIENTOS OBTENIDOS.
Figura 1. A. Aislamientos característicos de pudriciones blandas malanga a las 24 horas de
crecimiento. B. aislamiento 2ca a las 24 hrs de crecimiento.
7.2.
Caracterización bioquímica.
Las pruebas bioquímicas se realizaron de acuerdo a los métodos descritos por Schaad et al.
(2001) para prueba de Gram, oxido-fermentación de glucosa, oxidasa, catalasa, reducción de
nitratos, sensibilidad a 15 mg de eritromicina, tolerancia a NaCl 5%, crecimiento en extracto de
levadura (YS) a 37°C, liquefacción de gelatina, y producción de indol. Los resultados de las
pruebas bioquímicas se muestran a continuación.
31
PRUEBAS BIOQUÍMICAS.
Tabla 5. Resultados de la pruebas bioquímicas aplicadas a los 20 aislamientos obtenidos. En
amarillo se muestran los aislamientos que presentan resultados compatibles con P. carotovorum,
en verde se observan los aislamientos con resultados compatibles con D. chrysanthemi.
De acuerdo con Schaad (2001), los aislamientos 21b, 2ca, 2hb, *2gb pertenecen al genero
Dickeya. Mientras que los aislamientos 21a, 2ha, 2b, *21b, pertenecen al genero Pectobacterium.
7.3.
Caracterización fisiológica.
De los 20 veinte aislamientos iniciales 8 tienen la capacidad de causar pudrición blanda en
malanga (C. esculenta Shott.) y papa (S. tuberosum), además esos 8 aislamientos inducen la
32
respuesta hipersensible en tabaco (Nicotiana tabacum) denominados como (21b, 2b, *21b, *2gb,
21a, 2ha, 2ca, 2hb.).
PRUEBAS BIOQUÍMICAS.
Tabla 6. Resultados de la pruebas de patogenicidad. En color verde se muestran los aislamientos
que resultaron positivos para las tres pruebas aplicadas.
7.4.
Identificación bioquímica del aislamiento 2ca.
Para el aislamiento 2ca que presenta características morfológicas distintas se realizó una galería
Api 20e (para enterobacterias) con finalidad de realizar una caracterización mas precisa.
33
GALERIA API 20 E.
Tabla 7. Resultados del aislamiento 2ca emitidos por software APIWEB (BIOMERIEUX INC.)
para el perfil bioquímico del aislamiento 2ca.
Figura 2. Muestra el perfil bioquímico obtenido a las 24 horas de incubación a 28º C de la galería
API 20 E, de acuerdo al método descrito por API TM. Arriba se muestran las reacciones que se
consideran como positivas y negativas en la galería.
34
7.5.
Análisis factorial de correspondencias.
A continuación se muestran las gráficas resultantes del análisis factorial de correspondencias
realizado en el programa STATISTICA 7, se observan tres grupos de aislamientos
bacterianos agrupados en base a los resultados de las pruebas bioquímicas, tomando como
referencia los datos establecidos para el género Pectobacterium, de acuerdo con Schadd et al
(2004).
Los datos pertenecientes a los aislamientos 2gb, *2gb, 21a, 2ca y 2hb corresponden con los
datos de las pruebas bioquímicas reportados para P.chrysanthemi (D. chrysanthemi). Los
datos obtenidos para los aislamientos 2b, *21b, 2ha, corresponden con los datos reportados de
pruebas bioquímicas reportados para P. carotovorum.
Figura 3. Análisis Factorial de correspondencias. En rojo se observan los aislamientos
relacionados con P. carotovorum. En verde se resaltan los aislamientos relacionados con D.
chrysanthemi.
35
7.6.
Extracción de DNA.
Se realizó la extracción de DNA geonómico de las bacterias que causaron pudrición blanda en
papa y malanga (21b, 2b, *21b, *2gb, 21a, 2ha, 2ca, 2hb.). No se realizaron modificaciones al
método de Cheng & Jiang mediante el cual se obtuvo DNA de buena calidad, como se observa en
el gel de agarosa al 0.8%. Se aprecian bandas de DNA geonómico integro.
A continuación se muestran los resultados de la cuantificación del DNA obtenido con el método
desarrollado por Cheng & Jiang (2006). Para calcular la cantidad de DNA presente en cada
extracción, se partió del supuesto que una unidad de absorbancia a 260 nm es igual a 50 μg/μL de
DNA de doble cadena (Rickwood & Hames, 1990). La calidad del ADN fue inferida mediante el
cálculo de la relación A260/A280.
CUANTIFICACIÓN DE DNA.
Tabla 8. Muestra las lecturas de absorbancia a 230, 260 y 280 nm; también se muestran las
relaciones d absorbancia a 260/ 230 y 260/ 280 nm y los µg/ml de DNA pertenecientes a cada
muestra.
36
En la figura 3 se observa un gel de agarosa al 08% con el DNA geonómico extraído a partir de
los aislamientos 21b, 2b, *21b, *2gb, 21a, 2ha, 2ca, 2hb.
7.7.
Amplificación.
Como resultado de la amplificación del gen rRNA 16S mediante PCR usando cebadores
universales (Veilleux, 2009)., se obtuvo una banda de aproximadamente 7 50bp, correspondiente
a una región del rRNA 16S. El producto de amplificación presenta impurezas por lo que fue
necesario purificarlo. Sin embargo la el fragmento de interés se observa integro y de buena
calidad.
PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN.
Figura 3. A. gel de agarosa al 1.6 con los fragmentos de amplificacion de 750pb del gen rRNA 16
S de los aislamientos 2b, *21b, *2gb, 21a, 2ha, 2ca, 2hb; al centro el marcador molecular de
100pb.
En la figura B se observa el mismo fragmento de 750 pb, en el aislamiento 2ca, al
extremo un marcador de peso molecular de 50 pb.
37
7.8.
Purificacion
El metodo empleado en la purificacion resulto ser bastante efectivo, se obtuvo el fragemento
amplificado de alrededor de 750 pb integro, sin interferencias y de buena calidad. La purificacion
se realizó para poder secuenciar el fragmento amplificado.
Figura 4. Se observan los fragmentos purficados de alrededor de 750 pb pertenecientes al
aislamiento 2ca. A la derecha se observa el marcador de peso molecular 100 pb.
7.9.
Secuenciación.
Como resultado de la reacción de secuenciación se obtuvo el electroferograma correspondiente a
la secuencia parcial reverse del gen rRNA 16S, que se observa a continuación. La secuencia
resultante no presenta ambigüedades significativas por lo que cumple los requerimientos para
poder realizar el análisis filogenético.
38
ELECTROFEROGRAMA SECUENCIA 2CA.
Figura 5. Electroferograma de la secuencia reverse correspondiente al aislamiento 2ca.
A continuación se muestra la secuencia complementaria correspondiente a un fragmento de 626
nucleótidos editados a partir del la secuencia reverse mostrada en la figura anterior.
CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGG
TAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACGCCATCGGATGAAC
CCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAG
GATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT
GCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCAC
TTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTAAGGTTAATAACCTTACCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACC
GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATGACTGGGCGTA
AAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTCAA
AACTGACAGGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC
TGGAGGAATACCGGTG
39
7.10. Análisis filogenético.
7.10.1. Algoritmo Blast.
La secuencia editada de 626 nucleótidos fue corrida en el algoritmo BLAST del NCBI, para
determinar el grado de homología que guarda la secuencia del aislamiento 2ca con respecto a las
secuencias depositadas en la base de datos publica GenBank. Se encontraron 18 aislamientos con
los cuales la secuencia Reverse de CA mantiene un 99 % de homología.
40
ALINEAMIENTOS.
Accession
Description
Erwinia chrysanthemi strain wuda1 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain sangzhi1 16S
HM590193.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain miandian1 16S
HM590190.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Pectobacterium chrysanthemi partial 16S
FM946179.1
rRNA, isolate SCH-01
Erwinia chrysanthemi strain sangzhi2 16S
HM590194.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain miandian3 16S
HM590192.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain miandian2 16S
HM590191.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain 809 16S
FJ544326.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain 807 16S
FJ544325.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain esjsx 16S
FJ463864.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain yunnan 16S
HM590189.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain 1015-1 16S
GQ293897.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain wuda2 16S
HM590196.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain 0911-2 16S
GQ293898.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain ICMP 9290
EF530561.1
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain S3-1 16S
AY360397.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain 09-1 16S
HM222417.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Erwinia chrysanthemi strain H12 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
GU252371.1
HM590195.1
Max
score
Total
score
Query
coverage
E
Max
value ident
1151
1151
100%
0.0
99%
1151
1151
100%
0.0
99%
1151
1151
100%
0.0
99%
1151
1151
100%
0.0
99%
1146
1146
100%
0.0
99%
1146
1146
100%
0.0
99%
1146
1146
100%
0.0
99%
1146
1146
100%
0.0
99%
1146
1146
100%
0.0
99%
1146
1146
100%
0.0
99%
1140
1140
100%
0.0
99%
1140
1140
100%
0.0
99%
1134
1134
100%
0.0
99%
1129
1129
100%
0.0
99%
1129
1129
100%
0.0
99%
1125
1125
100%
0.0
99%
1123
1123
100%
0.0
99%
1123
1123
100%
0.0
99%
41
Tabla 9. Secuencias del gen rRNA 16 S contenidas en la base de datos Genbank, con las que la
secuencia reverse correspondiente al aislamiento 2ca presenta 99 % de homología.
A continuación se muestra un alineamiento con la secuencia parcial forward del gen rRNA 16 S
del Aislamiento wuda1, correspondiente a Erwinia chrysanthemi. Se observa un 99 % de
homología y una diferencia en un solo nucleótido.
EJEMPLO DE ALINEAMIENTO.
Figura 6. Alineamiento de dos secuencias de 626 pertenecientes al gen rRNA 16 S, la secuencia
Query corresponde al aislamiento 2ca. La secuencia Sbjct se encuentra en la base de datos
GenBank. Se resalta con un círculo rojo el nucleótido en el que difieren las secuencias.
Para la elaboración de los dendogramas se utilizo el programa MEGA 4 desarrollado por Tamura
et al., el análisis se realizo con cuatro métodos diferentes para la elaboración de dendogramas. El
alineamiento de las secuencias tomadas del GenBank se realizo por el algoritmo ClustalW. Las
secuencias alineadas y comparadas son las que se encuentran registradas en la base de datos
GenBank bajo los siguientes números de acceso: GU252371.1, FM946179.1, GQ293898.1,
42
GQ293897.1, EU490613.1, AF373175.1, AF373174.1, AF373173.1, AY360397.1, Z96093.1,
AJ233412.1, AF520709.2, AF520710.1, AF520711.2 AF520712.1, AF520708.1, AF520707.1,
NR_026538.1, Z96096.1, GU075708.1, U80200.
AISLAMIENTOS Y HOSPEDEROS.
Numero de
ascensión
GenBank.
Especie.
Hospedero.
GU252371.1
Dickeya dianthicola 99%.
Dickeya dadantii 99 %.
Ipomoea batatas
FM946179.1
Dickeya dadantii 98 %.
Dickeya dianthicola 98 %.
Oncidium bifolium Sims.
GQ293898.1
Dickeya dadantii 99 %.
GQ293897.1
EU490613.1
Dickeya dadantii 99 %.
Dickeya zeae.
Dickeya dieffenbachiae
Dickeya dadantii
Dickeya dadantii 99%
Pectobacterium carotovorum subsp.
Carotovorum.
Pectobacterium carotovorum subsp.
atrosepticum
Dickeya dadantii
Dickeya dadantii 98%
Dickeya zeae y Dickeya dadantii 98 %
Dickeya zeae Dickeya dadantii 98 %
Dickeya dieffenbachiae 99%, Dickeya
zeae 99%
Dickeya paradisiaca
Dickeya zeae
Dickeya dieffenbachiae
Dickeya dianthicola
con FM946179.1, Tolumnia antes gen
Oncidium
Tolumnia antes gen Oncidium
AF373175.1
AF373174.1
AF373173.1
AY360397.1
Z96093.1,
AJ233412.1
AF520709.2
AF520710.1
AF520711.2
AF520712.1
AF520708.1
AF520707.1
Potato
Zantedeschia aethiopica
Dickeya dadantii
NR_026538.1
Z96096.1
GU075708.1
Dieffenbachia picta
Chrysanthemum,
Dickeya paradisiaca
Dickeya paradisiaca
Pectobacterium carotovorum subsp.
Carotovorum
U80200
2ca
Dickeya
Dickeya zeae
Dickeya dadantii
dadantii
99%
Dickeya
C. esculenta Schott.
43
dianthicola 98%
Tabla 10. Se muestran los aislamientos registrados en la base de datos GenBank, más
estrechamente relacionados con el asilamiento 2ca, se incluye el hospedero a partir del cual se
aisló cada cepa.
7.10.2.
Dendograma elaborado por el método Neighbor-joining.
Como resultado de este método observamos que el aislamiento 2ca pertenece a Pectobacterium
chrysanthemi, y se encuentra relacionado estrechamente con el aislamiento FM946179 (87 %), y
puede relacionarse con los aislamientos GQ293898,
y GQ293897 de Pectobacterium
chrysanthemi.
Dickeya dadantii
Dickeya dianthicola
Dickeya zeae
Dickeya dieffenbachiae
Dickeya paradisiaca
Pectobacterium
carotovorum
Figura 9. Dendograma elaborado por el método Neighbor-joining. Se obervan 5 grupos de
aislamientos bacterianos agrupados de acuerdo a relaciones filogenéticas. El aislamiento 2ca se
encuentra fuertemente relacionado con el aislamiento FM946179.1.
44
7.10.3. Dendograma elaborado por el método Minimum Evolution.
Como resultado de este método observamos que el aislamiento 2ca pertenece a Pectobacterium
chrysanthemi, se encuentra estrechamente relacionado con el aislamiento FM946179 en un 87
%, también mantiene relación estrecha con GQ293898, y GQ293897 pertenecientes a
Pectobacterium chrysanthemi.
Dickeya dadantii
Dickeya dianthicola
Dickeya zeae
Dickeya dieffenbachiae
Dickeya paradisiaca
Pectobacterium
carotovorum
Figura 10. Dendograma elaborado por el método Minimum Evolution. Se obervan 5 grupos de
aislamientos bacterianos agrupados de acuerdo a relaciones filogenéticas. El aislamiento 2ca se
encuentra fuertemente relacionado con el aislamiento FM946179.1.
45
7.10.4. Dendograma elaborado por el método Máximum Parsimony.
Como resultado de este método observamos que el aislamiento 2ca pertenece a Pectobacterium
chrysanthemi, se encuentra estrechamente relacionado con el aislamiento FM946179 en un 89 %,
sin embargo también puede relacionarse con los aislamientos GQ293898,
y GQ293897
pertenecientes a la misma especie.
Figura 11. Dendograma elaborado por el método Máximum Parsimony. Se obervan 5 grupos de
aislamientos bacterianos agrupados de acuerdo a relaciones filogeneticas. El aislamiento 2ca se
encuentra fuertemente relacionado con el aislamiento FM946179.1.
46
7.10.5. Dendograma elaborado por el método UPMGA.
Como resultado de este método observamos que el aislamiento CA pertenece a Pectobacterium
chrysanthemi, se encuentra estrechamente relacionado con el aislamiento FM946179 con 82 %.
En este método también se observa que el aislamiento analizado mantiene relación con los
aislamientos GQ293898, y GQ293897 pertenecientes a la misma especie.
Figura 12. Dendograma elaborado por el método UPMGA. Se obervan 5 grupos de aislamientos
bacterianos agrupados de acuerdo a relaciones filogenéticas. El aislamiento 2ca se encuentra
fuertemente relacionado con el aislamiento FM946179.1.
47
VIII. DISCUSIÓN `
Mediante la caracterización bioquímica fisiológica, fue posible determinar que los aislamientos
obtenidos pertenecen a los géneros de enterobacterias Pectobacterium y Dickeya. El resultado de
la prueba de sensibilidad a Eritromicina (15mg) permite diferenciar si un aislamiento pertenece al
género Pectobacterium ó a Dickeya. La prueba de hipersensibilidad en tabaco (N. tabacum) y la
pudrición blanda en papa permiten determinar el potencial patogénico de los aislamientos.
Dado que las bacterias presentan una amplia diversidad fenotípica y genotípica, es necesario
realizar la identificación no solo bioquímica y fisiológica sino que también molecular (basada en
la secuenciación del gen rRNA 16S). Bajo la premisa anterior se realizo la secuenciación y el
análisis filogenético de la secuencia del gen rRNA 16 S, correspondiente al aislamiento 2ca,
debido a que presenta características especiales no descritas para el genero Dickeya.
La amplificación se realizo por medio de cebadores universales ya que generalmente son elegidos
como complemento de las regiones conservadas en el comienzo del gen, y ya sea en la región de
las 540 pb o al final de la secuencia completa (sobre la región de 1 500 pb), la secuencia de la
región variable de en medio es usada para la taxonomía comparativa (Chen et al., 1989).
Clarridge. 2004 refiere que en el proceso de identificación de microorganismos en base a la
secuenciación del gen rRNA 16S, los análisis filogenéticos muestran la misma relación a nivel de
especie si se utilizan secuencias de diferentes longitudes (500 pb y 1500 pb). En un sentido
práctico la obtención de la secuencia de 500 pb resulta más económica, en contraste con la
secuencia de 1500 pb que requiere más reacciones de secuenciación (Clarridge. 2004).Algunos
sistemas informáticos permiten la comparación de una sola secuencia, ya sea Forward o Reverse.
Si una de las secuencias de DNA obtenidas, presenta regiones donde se superponen diferentes
lecturas y no presenta alguna región clara; el análisis de identificación bacteriana puede realizarse
48
con una sola secuencia, ya sea la secuencia Forward o Reverse. De hecho existen laboratorios que
ofrecen el servicio de identificación de microorganismos en base a la secuenciación del gen
rRNA 16S, que solo utilizan la secuencia Forward en sus análisis (Bosshard, 2003).
Las ambigüedades en las secuencias pueden tener su origen en problemas técnicos, tales como,
que la muestra analizada no sea un cultivo puro o una falla en la reacción de secuenciación
(Clarridge. 2004).
Los valores de similitud o divergencia en los análisis filogenéticos varían en menor grado,
dependiendo del programa informático utilizado para generar los dendogramas. Sin embargo este
análisis permite estimar la relación relativa entre organismos. Además de la elaboración de
dendogramas es necesario analizar el porcentaje de similitud o divergencia de las secuencias
comparadas (Clarridge. 2004).
No existe un consenso en el grado de exactitud en la diferencia genética que define una especie,
tampoco hay consenso en el algoritmo matemático utilizado para generar ese dato. En la practica
se utiliza un rango de diferencia del 0.5 al 1% de diferencia (Song et al., 2003). Bosshard et al.,
utiliza 99% de similitud para definir especie y 95 % determinar para genero
Actualmente existen dos clases de métodos para la construcción de arboles
filogenéticos,
métodos basados en distancias y metodos basados en caracteres. A su vez los métodos basados en
distancias se dividen en los que se basan en agrupamiento y calculan el árbol usando una matriz
de distancias (tal es el caso del método UPGMA y Neighbor Joining), y los métodos basados en
la optimalidad, los cuales comparan muchas topologías de árboles y seleccionan la mejor
(Método de evolución Mínima) (Waterman, 1995).
Los metodos basados en caracteres (o métodos discretos) como la Máxima Parsimonia, están
basados en el análisis de los caracteres que forman las secuencias, cuentan los eventos de
mutación, preservando la pérdida de información que ocurre cuando los caracteres son
transformados a distancias.
49
Estos métodos son comparables entre si, al comparar dendogramas elaborados con distintos
métodos los grupos principales se conservan, sí los aislamientos están estrechamente
relacionados. Sin embargo, cuando los taxa que son comparados, no están estrechamente
relacionados. Las relaciones en los dendogramas se ven afectadas por el programa utilizado
(Clarridge. 2004).
En los cuatro dendogramas se observa el mismo patrón de relación entre los aislamientos, se
distinguen seis grupos, cada uno perteneciente a cada una especie bacteriana distinta, las 6
especies pertenecen a los géneros Dickeya y Pectobacterium. Los seis grupos muestran la
relación que existe entre las distintas especies representativas de cada grupo de aislamientos.
Tenemos entonces que de acuerdo a los dendogramas elaborados en base a secuencias del gen
rRNA 16S de aislamientos registrados en el GenBank, las bacterias D. paradisiaca y D. dadantii,
corresponden a los grupos de aislamientos mas alejados, a que guardan menos relación.
Los
grupos pertenecientes a las bacterias D. dadantii y D. dianthicola se encuentran estrechamente
relacionados, los aislamientos de Dickeya dieffenbachiae y Dickeya zeae presentan una relación
estrecha, es interesante notar que estos grupos se son el puente que une y relaciona a los grupos
de aislamientos D. dadantii - D. dianthicola con el grupo de aislamientos pertenecientes a D.
paradisiaca.
50
IX.
CONCLUSIONES
La malanga (C. esculenta Scout.) es un cultivo de gran potencial para el estado de Veracruz,
porque el estado presenta las condiciones optimas para su cultivo y producción, además del valor
nutrimental y comercial que posee la malanga.
El resultado de la pruebas bioquímicas y fisiológicas indica que los aislamientos bacterianos, 2ha,
*21b, *2gb, 21a, 2ca, causantes de la pudrición blanda en las plantas de malanga (C. esculenta
Schott) utilizadas en este trabajo, son enterobacterias pertenecientes al género Dickeya.
El resultado de la pruebas bioquímicas fisiológicas indica que los aislamientos bacterianos, 2b,
21b, y 2hb, causantes de la pudrición blanda en las plantas de malanga (C. esculenta Schott)
utilizadas en este trabajo, son enterobacterias pertenecientes al género Pectobacterium.
El fenotipo especial y característico del aislamiento 2ca, dificulta la identificación de dicho
organismo por medio de galerías API 20 e.
El aislamiento denominado 2ca corresponde a Dickeya chrysantemi, mostrando un 99 % de
homología con secuencias de Dickeya chrysantemi contenidas en el GenBank. El resultado del
alineamiento realizado en el algoritmo Blast fue confirmado por análisis filogenético ubica, por
consenso de cuatro metodos de análisis,
al aislamiento 2ca como una cepa relacionada
estrechamente (alrededor de 88 % de relación) con aislamientos reportados de D. chrysanthemi.
La identificación bioquímica y fisiológica de microorganismos, debe ser respaldada por la
identificación genotípica, la secuenciación y análisis del gen rRNA 16 S es una herramienta
confiable y ampliamente utilizada para tal fin.
51
X.
PERSPECTIVAS.
Es necesario estudiar detalladamente el aislamiento bacteriano 2ca, ya que se trata de un fenotipo
característico, no reportado en la literatura a fin determinar la presencia de los metabólitos
liberados por la bacteria sobre el medio de cultivo.
Se beben buscar mecanismos de control, basados en el conocimiento detallado de los agentes
causantes de la pudrición blanda en malanga, con la finalidad de que sea un cultivo rentable,
dado su potencial de explotación.
Se deben realizar análisis moleculares más detallados como los análisis multiloci, para
complementar la identificación aislamiento 2ca.
52
XI.
BIBLIOGRAFÍA.
Bansal, A. K., and T. E. Meyer. 2002. Evolutionary analysis by wholegenome comparisons. J.
Bacteriol. 184:2260–2272.
Bottger, E. C. 1989. Rapid determination of bacterial ribosomal RNA sequences by direct
sequencing of enzymatically amplified DNA. FEMS Microbiol. Lett. 65:171–176.
Burkholder, W.H.; McFadden, L.H.; Dimock, A.W. (1953) A bacterial blight of
chrysanthemums. Phytopathology 43, 522-525.
Carvajal R, Corrales S (1993) Detección de bacterias en semillas de patilla (Citrullus canatus) y
su relación con la pudrición de los frutos. Fitopatol. Venez. 6: 43-44.
Clayton, R. A., G. Sutton, P. S. Hinkle, Jr., C. Bult, and C. Fields. 1995. Intraspecific variation in
small-subunit rRNA sequences in GenBank: why single sequences may not adequately represent
prokaryotic taxa. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:595–599.
Chen, K., H. Neimark, P. Rumore, and C. R. Steinman. 1989. Broad-range DNA probes for
detecting and amplifying eubacterial nucleic acids. FEMS Microbiol. Lett. 57:19–24.
Custodio F, Hernández Y, Trujillo G (1993) Erwinia carotovora subsp. carotovora en frutos de
tomate. Fitopatol. Venez. 6: 43-44.
DUARTE, V.; DE BOER, S.; WARD, L.; DE OLIVEIRA, A. 2004. Characterization of atypical
Erwinia carotovora strains causing blackleg of potato in Brazil. Journal of Applied Microbiology
96: 535–545.
Funke, G., A. V. Graevenitz, J. E. Clarridge III, and K. Bernard. 1997. Clinical microbiology of
coryneform organisms. Clin. Microbiol. Rev. 10: 125–159.
53
Dubnau, D., I. Smith, P. Morell, and J. Marmur. 1965. Gene conservation in Bacillus species. I.
Conserved genetic and nucleic acid base sequence homologies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
54:491–498.
Elphinston, J. G. 1987. La Pudricion Blanda y la Pierna Negra de la Papa. Boletin de Información
Técnica No. 21. Colegio Internacional de la Papa. Lima, Perú.
Espinosa, E. (2003). Estudio de las pudriciones secas en el cultivo de la malanga (Xanthosoma
spp. y Colocasia esculenta Schott. 2003.-- 45p. Tesis de Maestría. Facultad de Ciencias
Agropecuarias, UCLV, Villa Clara, Cuba, 2003.
García, R. 2000. Especies y Subespecies de Erwinia, Causantes de Pudrición Blanda y Pierna
Negra en la Papa Cultivada, en el Estado de Mérida –Venezuela. Rev. Forest. Venez. 44 (1), 107
– 114.
Garrido M, Hernández Y, Trujillo G (1993) Identificación de Erwinia herbicola infectando
ocumo bravo. Fitopatol. Venez. 6: 43.
Garrity, George M.; Brenner, Don J.; Krieg, Noel R.; Staley, James R. (2005). Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology, Volume Two: The Proteobacteria, Parts A - C.. Springer - Verlag.
Guevara Y, Rondón A, Solórzano R (1980) Bacteriosis del mango (Mangifera indica L.) en
Venezuela. I. Sintomatología e identificación. Agron. Trop. 30: 65-76.
Gee, J. E., C. T. Sacchi, M. B. Glass, B. K. De, R. S. Weyant, P. N. Levett, A. M. Whitney, A. R.
Hoffmaster, and T. Popovic. 2003. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid identification and
differentiation of Burkholderia pseudomallei and B. mallei. J. Clin. Microbiol. 41:4647–4654.
Guevara Y, Rondón A, Arnal E, Suárez Z, Solórzano R, Navas R (1992) La pudrición bacterial
del tallo de la yuca en Venezuela. Fitopatol. Venez. 5: 33-36.
54
Hall, L., K. A. Doerr, L. S. Wohlfiel, and G. D. Roberts. 2003. Evaluation of the MicroSeq
system for Identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration
into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41:1447–1453.
Harmsen, D., and H. Karch. 2004. 16S rDNA for diagnosing pathogens: a living tree. ASM News
70:19–24.
HERNANDEZ, Yonis y TRUJILLO, Gustavo. Relaciones serológicas entre aislamientos
bacterianos de los géneros Erwinia, Pectobacterium Y Pantoea. INCI, ago. 2004, vol.29, no.8,
p.447-454. ISSN 0378-1844.
Hernández Y, Pino I, Trujillo G (1994) Pudrición en tallos de maíz (Zea mays L.). Memorias 2ª
Jornada Científica Nacional del Maíz. pp. 59-60.
Hernández Y, Trujillo G (1993ª) Manchas foliares acuosas en cafecito de jardín (Aglaonema
commutatum) „María‟. Fitopatol. Venez. 6: 42.
Hibar, K., Daami-Remadi, M., and El Mahjoub, M. 2007. First report of Pectobacterium
carotovorum subsp. carotovorum on tomato plants in Tunisia. Tunisian Journal of Plant
Protection 2: 1-5.
Hooker, W.J. 1980. Compendio de enfermedades de la papa. Centro Internacional de la Papa,
Lima, Peru. Pp, 37 – 40.
Kattar, M. M., J. F. Chavez, A. P. Limaye, S. L. Rassoulian-Barrett, S. L. Yarfitz, L. C. Carlson,
Y. Houze, S. Swanzy, B. L. Wood, and B. T. Cookson. 2001. Application of 16S rRNA gene
sequencing to identify Bordetella hinzii as the causative agent of fatal septicemia. J. Clin.
Microbiol. 38:789–794.
Luna-Rodríguez,
Mauricio;Toledo-González,
Alicia;Iglesias-Andreu,
Lourdes
Georgina
Identificación de Enterobacterias Causantes de Pudriciones Blandas en Cucúrbita pepo L. en
55
Veracruz, México Revista Mexicana de Fitopatología, Vol. 27, Núm. 1, enero-junio, 2009, pp.
64-68 Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. México.
Lund, B.M. 1979. Bacterial soft rot of patatoes. Pp. 14 – 49. In: Lovelock, D. W.; Davies, R.
Plant Pathogens. Society of Applied Bacteriology. Technical Series No. 12, Academic Press,
New York.
MATSUMOTO, H.; JITAREERAT, P.; BABA, Y.; TSUYUMU, S. 2003. Comparative study of
regulatory mechanisms for pectinase production by Erwinia carotovora subsp. carotovora and
Erwinia chrysanthemi. Mol. Plant-Microbe Interact 16: 226-237.
Ninet, B., M. Monod, S. Emler, J. Pawlowski, C. Metral, P. Rohner, R. Auckenthaler, and B.
Hirschel. 1996. Two different 16S rRNA genes in a mycobacterial strain. J. Clin. Microbiol.
34:2531–2536.
Noval C (1991) Género Erwinia. En Manual de Laboratorio. Diagnóstico de hongos, bacterias y
nematodos fitopatógenos. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Madrid, España. pp.
203-239.
Ooka, J.J. and Uchida, J.Y. 1985. Taro root and corm rot caused by Pythium myriotylum.
Phytopathology 75(1):1316.
Ochoa, F.; G. Trujillo; N. de Albarracín; J. Fernández. 1987. Enfermedad bacterial en
Dieffenbachia sp. X Seminario Nacional de Fitopatología. Maracay. p. 7.
Olsen GJ, Woese CR. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB J 1993; 7 : 1 1 3-2 3.
Ordosgoitti A, Santos R, Haddad O (1974) La pudrición acuosa del tallo del plátano. Agron.
Trop. 24: 350-354.
Pace, N. 1997. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 276:734–740.
56
Parris, G.K. 1941. Diseases of taro in Hawaii and their control. Hawaii Agr. Exp. Sta. Circ. No.
18. 29 pp.
PÉROMBELON, M. 2002. Potato diseases caused by soft rot erwinias: an overview of
pathogenesis. Plant Pathol. 51: 1-12.
PÉROMBELON, M.C.M. & KELMAN, A. Ecology of the soft-rot Erwinia. Annual Review of
Phytopathology 12:361-387. 1980.
Pfister, P., M. Risch, D. E. Brodersen, and E. C. Bottger. 2003. Role of 16S rRNA helix 44 in
ribosomal resistance to hygromycin B. Antimicrob. Agents Chemother. 47:1496–1502.
Plucknett, D.L., de la Pena, RS., and Obrero, F. 1970. Taro (Colocasia esculenta), a review. Field
Crop Abst. 23:413-426. 58.
PY, B.; BARRAS, F.; HARRIS, S.; ROBSON, N.; SALMOND, G. 1998. Extracellular enzymes
and their role in Erwinia virulence. Meth. Microbiol. 27: 157-168.
Reischl, U., K. Feldmann, L. Naumann, B. J. Gaugler, B. Ninet, B. Hirschel, and S. Emler. 1998.
16S rRNA sequence diversity in Mycobacterium celatum strains caused by presence of two
different copies of 16S rRNA gene. J. Clin. Microbiol. 36:1761–1764.
Rodicio, María del Rosario; Mendoza, María del Carmen; Identificación bacteriana mediante
secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica.
2004. Enfermedades infecciosas y microbiología clínica, ISSN 0213-005X, Vol. 22, Nº. 4, 2004 ,
pags. 238-245.
Rodríguez I (1989) La serología en el diagnóstico y estudio de bacteriosis en plantas. Boletín de
Reseñas Nº30. La Habana, Cuba. 35 pp.
57
Rodríguez S, Sanabria de Albarracín N, Arjona A, Albarracín M, Hernández Y (2002)
Diagnóstico postcosecha de enfermedades bacterianas zanahoria. Fitopatol. Venez. 15: 17-20.
RODRÍGUEZ –REYES, E. EVALUACIÓN DE TRES CULTIVARES DE MALANGA
(Colocasia esculenta) Y APORTE AL DESARROLLO SOSTENIBLE DE LA COMUNIDAD
DE IXQUISIS, MUNICIPIO DE SAN MATEO IXTATÁN, DEPARTAMENTO DE
HUEHUETENANGO. TESIS. UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE AGRONOMÍA ÁREA INTEGRADA. GUATEMALA 2008. Pag. 27 – 34.
Roth, A., M. Fischer, M. E. Hamid, S. Michalke, W. Ludwig, and H. Mauch. 1998.
Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S–23S
rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J. Clin. Microbiol. 36:139–147.
Samson R., Bernard Legendre J., Christen R., Fischer-Le Saux M., Achouak W., Gardan L..
2005.Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al. 1953) Brenner et al. 1973 and
Brenneria paradisiaca to the genus Dickeya gen. nov. as Dickeya chrysanthemi comb. nov. and
Dickeya paradisiaca comb. nov. and delineation of four novel species, Dickeya dadantii sp. nov.,
Dickeya dianthicola sp. nov., Dickeya dieffenbachiae sp. nov. and Dickeya zeae sp. nov.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 1415–1427.
Sacchi, C. T., A. M. Whitney, L. W. Mayer, R. Morey, A. Steigerwalt, A. Boras, R. S. Weyant,
and T. Popovic. 2002. Sequencing of 16S rRNA gene: a rapid tool for identification of Bacillus
anthracis. Emerg. Infect. Dis. 8:1117–1123.
Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd
ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Sambrook J. and Russell D.W. 2001Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the
crush and soak method. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition.Cold Spring
Harbor LAboratory Press. New York pp 5.51- 5.54
58
Schaad, N.W., Jones, J.B., and Chun, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant
Pathogenic Bacteria. The American Phytopathological Society Press. St. Paul, Minnesota, USA.
373 p.
Schaad NW (1979) Serological identification of plant pathogenic bacteria. Ann. Rev.
Phytopathol. 17: 123-147.
SCOTT, R.; CHARD, J.; HOCART, M.; LENNARD, J.; GRAHAM, D. 1996. Penetration of
potato tuber lenticels by bacteria in relation to biological control of blackleg disease. Potato Res.
39: 333-344.
SHEVCHIK V.E. and HUGOUVIEUX-COTTE-PATTAT N. (2003) PaeX, a second pectin
acetyl esterase of Erwinia chrysanthemi 3937. J. Bacteriol 185: 3091-3100.
SMADJA, B.; LATOUR, X.; TRIGUI, S.; BURINI, J.; CHEVALIER, S.; ORANGE, N. 2004.
Thermodependence of growth and enzymatic activities implicated in pathogenicity of two
Erwinia carotovora subspecies (Pectobacterium spp.). Can. J. Microbiol. 50:19-27
Soto M (1994) Identificación y estudio de algunos aspectos epidemiológicos de las bacterias que
afectan al lechoso (Carica papaya). Tesis. Facultad de Agronomía. Universidad Central de
Venezuela. Maracay, Venezuela. 247 pp.
Thompson SA. 2000. Araceae Juss. In Flora of North America Editorial Committee (Eds.) Flora
of North America North of Mexico, Vol. 22: Magnoliophyta: Alismatidae Arecidae,
Commelinidae (in Part), and Zingiberidae. New York and Oxford. On-line version.
Tortoli, E. 2003. Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria
of the 1990s. Clin. Microbiol. Rev. 16:319–354.
TOTH, I.; BELL, K.; HOLEVA, M.; BIRCH, P. 2003. Soft rot erwiniae: from genes to genomes.
Molecular Plant Pathology 4 : 17-30.
59
Ueda, K., T. Seki, T. Kudo, T. Yoshida, and M. Kataoka. Two distinct mechanisms cause
heterogeneity of 16S rRNA. J. Bacteriol. 181:78–82.
Varela, Gloria. Hernández, Yonis. Trujillo, Gustavo.La pudrición del tallo de la batata (Ipomoea
batatas (L.) Lam.) causada por Erwinia chrysanthemi en Maracay, estado Aragua,
Venezuela.Rev. Fac. Agron. (Maracay) 25:29-40. 1999.
Wilck, M. B., Y. Wu, J. G. Howe, J. Y. Crouch, and S. C. Edberg. 2001. Endocarditis caused by
culture-negative organisms visible by Brown and Brenn staining: utility of PCR and DNA
sequencing for diagnosis. J. Clin. Microbiol. 39:2025–2027.
Wilson, R. W., V. A. Steingrube, E. C. Bottger, B. Springer, B. A. Brown- Elliott, V. Vincent, K.
C. Jost, Jr., Y. Zhang, M. J. Garcia, S. H. Chiu, G. O. Onyi, H. Rossmoore, D. R. Nash, and R. J.
Wallace, Jr. 2001. Mycobacterium immunogenum sp. nov., a novel species related to
Mycobacterium abscessus and associated with clinical disease, pseudo- outbreaks and
contaminated metalworking fluids: an international cooperative study on mycobacterial
taxonomy. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:1751–1764.
WISE MARK G.,1 MCARTHUR J VAUN, 2 AND SHIMKETS LAWRENCE J.. Bacterial
Diversity of a Carolina Bay as Determined by 16S rRNA Gene Analysis: Confirmation of Novel
Taxa APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Apr. 1997, p. 1505–1514
Wise, M.G., L.J. Smickets y J.V. McArthur. 1995. Genetic structure of a lotic population of
Burkholderia (Pseudomonas) cepacia. Appl Environ Microbiol 61: 11791-1798.
Woese CR, Kandler O, Wheelis ML. Towards a natural system of organisms: proposal for the
domains A r c h a e a, B a c t e r i a, and E u c a r y a. Proc Natl Acad Sci USA 1 9 9 0 ; 8 7 : 4 5
7 6-9 .
Woese CR. Bacterial evolution. Microbiol Rev 1987;51:221-7 .
60
Woese, C. R., E. Stackebrandt, T. J. Macke, and G. E. Fox. 1985. A phylogenetic definition of
the major eubacterial taxa. Syst. Appl. Microbiol.
6:143–151.
Woese, C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51:221–271.
61
XII.
ANEXO I.
Purificación de los productos amplificados.
Protocolo de purificación de DNA descrito por Sambrook y Russell 2001.
1. Se realizó un gel preparatorio de agarosa al 1.6%. se aumento la capacidad convencional
de los pozos.
2. Se cargó en el gel aproximadamente 80 µl de producto de amplificación, con 10 µl de
buffer de carga.
3.
Una vez transcurrida la electorforesis, se visulizó el gel para observar la integridad del
material genético.
4. Con la ayuda de un bisturí se cortó la banda de interés.
5. Los fragmentos cortados de agarosa que contienen la banda de interés se colocaron en
jeringas para insulina estériles.
6. Las jeringas para insulina que contienen los fragmentos de agarosa se someten a
congelación por 12 horas.
7. Transcurrido el tiempo de congelación se colocan transfieren los fragmentos de agarosa a
tubos de microcentrifuga de 1.5 ml por medio de inyección.
8. La jeringas se enjuagaron con 200 µl de buffer TE 10/1.
9. se añadieron a los tubos que contienen la agarosa, 250 µl de fenol y 250 µl de cloroformo.
10. Los tubos se agitaron por medio de vortex.
11. Los tubos con agarosa fueron llevados a congelación a – 80º C por 30 minutos.
12. Transcurrido el tiempo de congelación los tubos con agarosa fueron agitados mediante
vortex.
13. Los tubos fueron centrifugados a 13 000 rpm durante 10 minutos.
14. Posteriormente se transfirió el sobrenadante a un tubo de 1.5 ml y se le agregaron 100 µl
de buffer TE 1/10.
15. A la solución anterior se le añadieron 250 µl de fenol y se mezclo por vortex.
16. La solución se centrífugo a 13 000 rpm durante 15 minutos.
17. El sobrenadante fue transferido a tubos nuevos de 1.5 ml
18. Nuevamente se centrifugaron los tubos a 13 000 rpm durante 8 minutos.
62
19. Se transfirió el sobrenandante a tubos nuevos de 1.5 ml y se le añadieron 500 µl de
cloroformo.
20. Se centrifugaron los tubos los tubos a 13 000 rpm durante 4 minutos.
21. Nuevamente se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio.
22. Se agrego 1 µl de glicógeno.
23. El volumen total contenido en el tubo para microcentrifuga fue multiplicado por 0.54 para
obtener el volumen de isopropanol que se añadirá.
24. La solución se mezcló por inmersión durante 1 minuto y se dejó reposar por minutos.
25. Los tubos fueron centrifugados por 15 minutos a 13 000 rpm.
26. Por decantación se eliminó el sobrenadante.
27. Se añadió 1 ml de etanol al 80 % para lavar el pellet.
28. Se decanto el sobrenadante y se los tubos fueron incubados durante 1 hora a 37º C.
29. Resuspender en 37 µl de TE 10/1 y se homogeneizó mediante vortex.
30. Se corrió electroforesis en gel de agarosa al 1.6 % para observar la integridad del material
purificado.
63