CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA, -CONCYT-

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTFUNDACION ROZAS-BOTRAN/ INSTITUTO DE INVESTIGACION SOBRE
ENFERMEDADES GENETICAS Y METABOLICAS –INVEGEM–
INFORME FINAL
Identificación, caracterización y evaluación de anormalidades
cromosómicas en niños con diagnóstico comprobado de cardiopatía
congénita.
PROYECTO FODECYT No. 10-2012
Lic. Allan Urbizo
Investigador Principal
GUATEMALA, MARZO DE 2014
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología –CONCYT– .
i
OTROS AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al:

Apoyo financiero y académico del Instituto de Investigación y Educación sobre
las Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM–.

Apoyo financiero de la Fundación Rozas-Botrán.

Apoyo científico de la Unidad de Cirugía Cardiovascular de Guatemala
–UNICAR–.
ii
RESUMEN
Las cardiopatías congénitas (CC) son anomalías estructurales del corazón debidas a
alteraciones en su formación durante el desarrollo embrionario (Perich, 2008).
Representan un importante problema de salud infantil en todo el mundo con una
incidencia que varía de 4/1000 a 50/1000 nacimientos vivos (Hoffman & Kaplan, 2002).
En Guatemala el único centro especializado en el tema de malformaciones congénitas del
corazón es la Unidad de Cirugía Cardiovascular –UNICAR-Fundación Aldo Castañeda–
en donde se atienden a nivel de consulta externa aproximadamente 6,500 casos por año
de niños con CC. Aproximadamente un 13% de los casos de CC en nacimientos vivos se
deben a una anomalía cromosómica, identificable a través de un estudio citogenético. Es
por ello que ante un niño con una CC es fundamental realizar un estudio de cariotipo para
poder descartar o confirmar el diagnóstico. Por esta razón, el objetivo del presente
estudio fue identificar, caracterizar y evaluar las anormalidades cromosómicas en niños
con diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita referidos por UNICAR. Para ello
fue necesario realizar una análisis citogenético numérico y estructural a través del estudio
de metafases de alto bandeo a fin de observar variaciones en los patrones normales
cromosómicos. Los resultados evidenciaron la presencia de anormalidades cromosómicas
y variantes hereromórficas en 5/32 pacientes (15.63%), identificando a los cromosomas
No. 21 y 22 como los más frecuentes en variación de longitud satelital y el cromosoma 5
como el más frecuente en variación heterocromática. Asimismo se identificó la región
22q11 como área candidata a estudios posteriores con técnicas de citogenética molecular
como FISH. Desde el punto de vista médico, los resultados confirman el potencial e
impacto del estudio citogenético en la identificación de anormalidades cromosómicas,
variantes polimórficas y reconocimiento de áreas candidatas para su estudio posterior a
nivel molecular, por lo que es necesario realizar mayor investigación concerniente a la
etiología de las cardiopatías congénitas involucrando la citogenética tradicional y
molecular.
iii
ABSTRACT
Congenital Heart Disease (CHD) is a problem with the heart’s structure and
function, which occurs as a result of disorders during its embryological development
throughout the 3rd and 10th weeks of gestation. The incidence of CHD varies from about
4/1000 to 50/1000 live births and is responsible for the vast majority of prenatal losses.
Despite advances in diagnosis and cardiovascular surgery, the etiology of CHD is still not
completely understood; some studies have shown that CHD have an etiology due to
genetic or environmental factors, or even a combination of both (multifactorial).
Nonetheless, genetic advances such as the human genome sequencing and the
improvement of molecular techniques have increased the evidence about the role of
genetic factors as significant cause in the CHD. Before the availability of advanced
cytogenetic techniques such as the high-resolution banding karyotype or FISH, standard
chromosome analysis revealed chromosomal aberration in 8% to 13% of neonates with
CHD. However, the improved resolution in cytogenetic analysis has allowed the
description and association of new chromosomal abnormalities in CHD. Hence, the
prevalence of chromosomal abnormalities in CHD is now estimated to be much higher.
Thereby, chromosomal analyses in children with various types of CHD are an important
part of their medical evaluation. The main objective of the present study was to identify
chromosomal abnormalities in children with CHD referred by UNICAR. In order to
complete this, metaphase analysis was done with high banding technique that could let us
identify any chromosome abnormality in these patients. The results showed the presence
of chromosomal abnormalities in 5/32 patients (15.63%) identifying chromosomes 21
and 22 as the most frequent in satellite variation and chromosome 5 as the more frequent
in heterochromatic variation. Also 22q11 region was identified as candidate for further
study with molecular cytogenetic techniques such as FISH. From the medical point of
view the results confirm the potential and impact of cytogenetic analysis in identifying
chromosomal abnormalities, polymorphic variants and recognition of candidate areas for
further study at the molecular level. Additional study is needed concerning the etiology
of congenital heart disease involving traditional and molecular genetics.
iv
BIBLIOGRAFÍA ACADÉMICA
Allan Urbizo es un biólogo Guatemalteco quien ha trabajado en la investigación,
diagnóstico y educación de enfermedades genéticas como el Síndrome de X Frágil,
Autismo y Xeroderma Pigmentosa. Asimismo, ha trabajado en el campo de la
citogenética, identificando y caracterizando anormalidades cromosómicas numéricas y
estructurales en pacientes pediátricos. Actualmente labora en el Instituto de Investigación
y Educación sobre las Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM– en los
laboratorios de Citogenética y Biología Molecular.
v
ÍNDICE
Página
RESUMEN…………………………………………………………………....
iii
ABSTRACT……………………………………………………………..........
iv
LISTA DE FIGURAS ………………………………………………..............
vii
LISTA DE TABLAS …………………………………………………………
viii
PARTE I:
I.1 INTRODUCCIÓN…………………………..……………………....
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…….……………………..
I.2.1 Antecedentes en Guatemala……………………………….....
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación…………………....
I.3 OBJETIVOS………………………………………………………....
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General……………………………………………………..
I.3.1.2 Específicos…………………………………………………
I.4 METODOLOGÍA…………………………………………………...
I.4.1 Las Variables………………………………………………..
1.4.2 Indicadores…………………………………………………..
I.4.3 Estrategia Metodológica…………………………………….
I.4.4 El Método…………………………………….……………..
I.4.5 La técnica Estadística……………………………………….
1.4.6 Los instrumentos a utilizar…………………………………
7
7
8
8
9
9
11
13
13
PARTE II
MARCO TEÓRICO…………………………………………………………...
19
PARTE III
III. RESULTADOS…………………………………………………………….
III.1 Discusión de Resultados……………………………………………………
34
40
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES………………………………………………..............
IV.2 RECOMENDACIONES…………………………………………………
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………….............
IV.4 ANEXOS………………………………………………………….............
44
46
47
54
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO………………………………………....
75
1
3
3
5
7
vi
LISTA DE FIGURAS
PAG.
Figura 1: Marcador Cromosómico evidenciado……………………………..
37
Figura 2: Variaciones polimórficas evidenciadas……………………………
38
Figura 3: Región 22q11 como área candidata……………………………….
39
LISTA DE TABLAS
PAG.
Cuadro 1: Anormalidades cromosómicas y variantes hetermomófricas…….
34
Cuadro 2: Diagnóstico clínico y citogenético……………………………….
35
LISTA DE FOTOGRAFÍAS
PAG.
Fotografía 1. Paciente CC-2. Metafase 46,XY…………………………………….54
Fotografía 2. Paciente CC-3. Metafase 46, XX…………………………………....54
Fotografía 3. Paciente CC-4. Metafase 46, XY…………………………………....55
Fotografía 4. Paciente CC-5. Metafase 46, XX, 5qh+……………………...……...55
Fotografía 5. Paciente CC-6. Metafase 46, XX……………………………….…...56
Fotografía 6. Paciente CC-7. Metafase 46, XX……………………………….…...56
Fotografía 7. Paciente CC-8. Metafase 46, XX……………………………….…...57
Fotografía 8. Paciente CC-9. Metafase 46, XY……………………………….…...57
Fotografía 9. Paciente CC-10. Metafase 46, XY, 21ps+, 22ps+……………….…..58
Fotografía 10. Paciente CC-11. Metafase 46, XY…………………………...……..58
Fotografía 11. Paciente CC-12. Metafase 46, XY…………………………………..59
Fotografía 12. Paciente CC-13. Metafase 46, XX. 5qh+…..………………………..59
Fotografía 13. Paciente CC-14. Metafase 46, XX…………………………………..60
Fotografía 14. Paciente CC-15. Metafase 46, XY…………………………………..60
Fotografía 15. Paciente CC-16. Metafase 46, XY…………………………………..61
Fotografía 16. Paciente CC-17. Metafase 46, XX…………………………………..61
vii
Fotografía 17. Paciente CC-18. Metafase 46, XX…………………………………..62
Fotografía 18. Paciente CC-19. Metafase 46, XX…………………………………..62
Fotografía 19. Paciente CC-20. Metafase 46, XX, 22ps+….………………………..63
Fotografía 20. Paciente CC-21. Metafase 46, XY, +mar..…………………………..63
Fotografía 21. Paciente CC-22. Metafase 46, XY…………………………………..64
Fotografía 22. Paciente CC-23. Metafase 46, XY…………………………………..64
Fotografía 23. Paciente CC-24. Metafase 46, XX…………………………………..65
Fotografía 24. Paciente CC-25. Metafase 46, XY…………………………………..65
Fotografía 25. Paciente CC-26. Metafase 46, XX…………………………………..66
Fotografía 26. Paciente CC-27. Metafase 46, XX…………………………………..66
Fotografía 27. Paciente CC-28. Metafase 46, XX…………………………………..67
Fotografía 28. Paciente CC-29. Metafase 46, XX…………………………………..67
Fotografía 29. Paciente CC-30. Metafase 46, XY…………………………………..68
Fotografía 30. Paciente CC-31. Metafase 46, XX…………………………………..68
Fotografía 31. Paciente CC-32. Metafase 46, XY…………………………………..69
Fotografía 32. Paciente CC-33. Metafase 46, XX…………………………………..69
viii
PARTE I
I.1
INTRODUCCIÓN
Las cardiopatías congénitas (CC) –o CHD por sus siglas en inglés– son
malformaciones anatómicas del corazón que ocurren como resultado de alteraciones
durante su formación en el desarrollo embrionario, aproximadamente entre la 3ª y 10ª
semanas de gestación (Perich, 2008). Comprenden un grupo heterogéneo de defectos que
incluyen malformaciones cardíacas, cardiomiopatías y arritmias cardíacas que en las
últimas décadas han cobrado importancia no solo por su impacto en la morbilidad y
mortalidad pediátricas, sino también por su incremento como problema de salud pública.
En estudios publicados desde 1955 la incidencia varía de 4/1000 a 50/1000 nacidos vivos
(Hoffman & Kaplan, 2002) aunque otros estudios han reportado una incidencia mucho
más alta que la anterior, documentando de 19/1000 a 75/1000 nacidos vivos (Richards &
Garg, 2010). Las diferencias en la tasa de los distintos estudios se deben, en gran parte, a
problemas metodológicos, como los distintos criterios de registro (inclusión o no de
algunas CC) y a los procedimientos diagnósticos empleados, así como la época de estudio
(Pradat, Francannet, Harris & Robert, 2003; Richards & Garg, 2010).
A pesar de los avances en el diagnóstico y la cirugía cardiovascular, la etiología de las
CC aún no es completamente comprendida; con índices en aumento de niños con CC que
sobreviven hasta la adultez y se reproducen, resulta necesario comprender los orígenes de
estas malformaciones. Estudios han evidenciado que las CC poseen una etiología debida
a predisposiciones genéticas, influencias ambientales o multifactoriales (genéticoambientales). A pesar de ello, avances como la secuenciación del genoma humano y las
técnicas moleculares han aumentado la evidencia acerca del rol de los factores genéticos
como causa significativa en las CC multifactoriales (Richards & Garg, 2010).
Aproximadamente un 13% de los casos de CC en nacimientos vivos se deben a una
anomalía cromosómica, identificable a través de un estudio citogenético. Sin embargo, la
reciente mejora del análisis citogenético –cariotipo de alto bandeo– y la disponibilidad de
1
nuevas técnicas moleculares tales como FISH y microarray, han permitido descubrir y
asociar nuevas anormalidades cromosómicas con CC, por lo que se estima que el dato
anterior pueda llegar a ser hasta el 33% de los casos de CC en nacimientos vivos
(Pierpont et al., 2007). Es por ello que ante un niño con una CC es fundamental realizar
un estudio de cariotipo para poder desarrollar programas de diagnóstico, tratamiento e
investigación como iniciativas de salud preventiva y curativa que contribuyan a la
reducción de las CC en nuestro país.
Por esta razón, el presente trabajo tuvo como objetivos principales la identificación,
caracterización y evaluación de las anormalidades cromosómicas en niños con CC, así
como también la determinación de rearreglos cromosómicos y el establecimiento de la
relación del diagnóstico clínico-citogenético con el fin de aportar datos sobre la etiología
de las CC en los pacientes Guatemaltecos. Estos objetivos fueron evaluados a través del
análisis de metafases, realizado en el Laboratorio de Citogenética del Instituto de
Investigación sobre las Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM–.
2
I.2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)
Las Cardiopatías Congénitas (CC) constituyen una importante causa de mortalidad
en el período perinatal e infancia, alcanzando hasta un 20% de las muertes neonatales
(Aguilera, Rodríguez, Enríquez, Vascopé, Pizarro & Almuna, 2006). Grandes avances se
han hecho en el diagnóstico y tratamiento de estos defectos, a pesar de ello, el estudio
preciso del impacto en la población y la comprensión de su etiología y patogénesis ha
avanzado a un ritmo lento, especialmente en nuestro país. Estos aspectos son
fundamentales para lograr una verdadera reducción de las CC a través de la prevención
primaria.
En Guatemala y Centroamérica –con excepción de Costa Rica– el único centro
especializado en el tema de malformaciones congénitas del corazón es la Unidad de
Cirugía Cardiovascular –UNICAR-Fundación Aldo Castañeda– en donde se atienden a
nivel de consulta externa aproximadamente 6,500 casos por año de niños con CC. El
Dr. Aldo Castañeda –fundador y actual jefe del Departamento de Pediatría de UNICAR–
es una autoridad mundial en el tema de cirugía cardiovascular pediátrica; a lo largo de sus
años de trabajo en Guatemala y el mundo ha contribuido con la educación quirúrgica,
investigación y cirugía cardiológica pediátrica, logrando reconocimiento y excelencia a
nivel mundial.
Dentro de las muchas contribuciones del trabajo del Dr. Castañeda en Guatemala, se
encuentra la documentación de la incidencia de las malformaciones cardíacas, la cual
reporta varía entre 10/1000 a 12/1000 nacidos vivos (comunicación personal, abril,
2011). Asimismo, ha documentado que uno de los principales defectos congénitos del
corazón es la cardiopatía tipo Retorno Venoso Anómalo Total o Parcial en más del 6% de
los pacientes, lo cual representa uno de los índices más altos reportados ya que la
incidencia mundial corresponde a 1/15,000 nacidos vivos (Correa-Villasenor, Ferencz,
Boughman & Neil, 1991). Entre las causas de este tipo de cardiopatía se reportan con
3
frecuencia las anormalidades cromosómicas del tipo deleciones y translocaciones, tanto
aisladas como asociadas a síndromes específicos (e.g. síndrome de ojo de gato).
Otro de los científicos que ha realizado importante investigación en el tema de CC en
Guatemala es el Dr. Gabriel Silva, quien con el apoyo del Dr. Castañeda fundó la Clínica
de Cardiogenética en UNICAR en el año 2004, con el fin de investigar las CC desde el
punto de vista genético. El Dr. Silva ha reportado el hallazgo de raras translocaciones
cromosómicas como la 18/21 o síndrome de monosomía 18 y su asociación con CC.
Asimismo ha encontrado la asociación de deleción parcial del brazo pequeño del
cromosoma 18 y su asociación con cardiopatías y otras anomalías congénitas que son
descritas en el síndrome urorectal. Estos hallazgos hacen que este cromosoma sea
candidato a ser estudiado en futuras investigaciones, especialmente en el área del brazo
pequeño (18p) (comunicación personal, junio 10, 2011)
De esta manera, recientemente en Octubre de 2010, se inauguró el Instituto de
Investigación y Educación sobre las Enfermedades Genéticas y Metabólicas
–INVEGEM– el cual es una institución de ciencia médica humana creada con el objetivo
de brindar una solución a la necesidad del entendimiento, diagnóstico y tratamiento de las
enfermedades de origen genético en el país; el Dr. Silva es su actual director científico.
Este instituto tiene la visión de realizar investigación de las enfermedades genéticas
–incluyendo CC– promoviendo brindar una mejor calidad de vida a los pacientes con la
enfermedad.
Gracias a los trabajos previos de científicos como los Drs. Aldo Castañeda y Gabriel
Silva, y a la disponibilidad de infraestructura adecuada para la investigación genética
como la posee el INVEGEM, es posible darle seguimiento al tema de la etiología de las
CC en Guatemala. Esta información contribuirá al desarrollo de estrategias de prevención
a través del diagnóstico correcto, de la asesoría familiar genética y los programas de
detección temprana de las enfermedades genéticas aplicados al sistema de salud pública
en Guatemala.
4
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Las cardiopatías congénitas (CC) son anomalías estructurales del corazón debidas a
alteraciones en su formación durante el desarrollo embrionario (Perich, 2008).
Representan un importante problema de salud infantil en todo el mundo con una
incidencia que varía de 4/1000 a 50/1000 nacimientos vivos (Hoffman & Kaplan, 2002),
considerándosele como la anormalidad más frecuente en el nacimiento y la causa de
mayor pérdida prenatal en el mundo (Gruber & Epstein, 2003).
Las CC incluyen malformaciones cardíacas y cardiomiopatías que son causadas por
factores genéticos (cromosómicos o de un solo gen), ambientales o multifactoriales
(genético-ambientales) (Perich, 2008). Aunque en la mayoría de los casos las causas
específicas se desconocen, los avances en genética han llevado a la identificación de una
gran proporción de defectos o anomalías a nivel cromosómico (Christiansen, 2004).
Los análisis citogenéticos revelan que de 8 a 13% de nacimientos con CC están
asociados con una anormalidad cromosómica, sin embargo, la reciente mejora del análisis
citogenético –cariotipo de alto bandeo– y la disponibilidad de nuevas técnicas
moleculares tales como FISH y microarray, han permitido descubrir y asociar nuevas
anormalidades cromosómicas con CC, por lo que se estima que el dato anterior es mucho
más elevado en la actualidad (Pierpont, et al., 2007).
Con base en lo anterior, el presente estudio identificó anomalías cromosómicas en
niños con diagnóstico comprobado de CC del Departamento de Pediatría de UNICAR,
con el fin de conocer los patrones genéticos subyacentes de estas malformaciones
cardíacas. Esta información ayudará al médico a proporcionar un consejo genético
adecuado e investigar problemas asociados con las anomalías cromosómicas en el
paciente. Asimismo ayudará a planificar y prevenir complicaciones propias de muchos de
los síndromes cromosómicos asociados a CC, además de conocer el pronóstico y su
condición o riesgo de un nuevo caso en la familia.
5
Finalmente, la información generada permitirá el establecimiento de marcadores
cromosómicos que puedan estar involucrados en la etiología de las CC, lo cual abrirá del
campo de la biología molecular en la investigación de los genes y polimorfismos
involucrados en las anomalías cardíacas. Estas acciones permitirán reducir las CC a
través de la prevención primaria.
6
I.3
OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1
Objetivos
I.3.1.1 General
 Identificar, caracterizar y evaluar las anormalidades cromosómicas en niños
con diangóstico comprobado de cardiopatía congénita.
I.3.1.2 Específicos
 Identificar la existencia de anormalidades cromosómicas en niños con
diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita del Departamento de
Pediatría de UNICAR-Fundación Aldo Castañeda de Guatemala.
 Determinar el tipo de organización o rearreglos cromosómicos que se
presentan en las anormalidades cromosómicas en niños con diagnóstico
comprobado de cardiopatía congénita del Departamento de Pediatría de
UNICAR-Fundación Aldo Castañeda de Guatemala.
 Establecer la relación del diagnóstico clínico y citogenético (asociación
fenotipo-genotipo en niños con diagnóstico comprobado de cardiopatía
congénita del Departamento de Pediatría de UNICAR-Fundación Aldo
Castañeda de Guatemala.
 Identificar la presencia de marcadores cromosómicos como objeto de estudio
posterior en la búsqueda de genes y polimorfismos asociados como posible
etiología de las cardiopatías congénitas, mediante estudios con técnicas
moleculares.
 Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su
competencia la información obtenida de la investigación.
7
I.4
METODOLOGIA (Descripción detallada de la Metodología)
I.4.1
Localización
El presente estudio, analizó niños con diagnóstico ecocardiográfico de
cardiopatía congénita candidatos a una cirugía cardíaca, provenientes de
todos los departamentos de Guatemala; referidos al Departamento de
Pediatría de la Unidad de Cirugía Cardiovascular de Guatemala
–UNICAR–. Las muestras fueron analizadas en el Instituto de
Investigación y Educación sobre de las Enfermedades Genéticas y
Metabólicas –INVEGEM–, localizado en el Km. 28.5 Carretera a Bárcenas
Santa Lucía Milpas Altas, Sacatepéquez, Guatemala; coordenadas
14.57478, -90.64407.
I.4.2 Las Variables
1.4.1.1 Variables dependientes
Anormalidades
cromosómicas
a)
numéricas,
que
incluyen
monosomías, trisomías y tetrasomías autosómicas, especialmente de los
cromosomas 18 y 21; b) estructurales, que incluyen deleciones,
inversiones,
translocaciones
y
duplicaciones,
y
c)
aberraciones
estructurales como el aumento de un segmento cromosómico que no
proviene de ningún otro cromosoma, adiciones o duplicaciones parciales
de un segmento y pérdida de un segmento de cromosoma con la
subsecuente formación de un anillo cromosómico
dependientes de la
presencia de una cardiopatía congénita.
1.4.1.2 Variables Independientes
La manifestación de cardiopatía congénita en el paciente.
8
I.4.3 Indicadores
La presencia de anomalías cromosómicas numéricas (monosomías, trisomías y
tetrasomías)
y estructurales
(deleciones,
inversiones,
duplicaciones
y/o
translocaciones) se observaron mediante un microscopio de fluorescencia con un
objetivo de 100x. Asimismo, se fotografió como mínimo una metafase por
paciente, lo que sirvió como evidencia del resultado (Anexo 1).
El estudio de la estructura externa de los cromosomas de cualquier especie
eucariótica consiste en analizar la forma, tamaño y número de cromosomas que
posee. La forma de los cromosomas viene determinada por la posición del
centrómero o constricción primaria, región por que las cromátidas interaccionan
con las fibras del huso acromático para separarse a polos distintos. El tamaño de
los cromosomas involucra la longitud de cada uno de los brazos (p, brazo corto y
q, brazo largo) como guía de la dimensión del mismo. El número normal de
cromosomas en humanos es de 46 en cada metafase.
La presencia de variaciones en la forma y tamaño de los cromosomas (e.g.
alteraciones de su estructura y tamaño, recurrentes en distintas metafases) son
indicadores de alteraciones cromosómicas. Asimismo, la variación del número
normal de cromosomas en las metafases (e.g. monosomías, trisomías, tetrasomías,
etc.) así como la presencia de marcadores cromosómicos en las metafases, es un
indicador de anormalidad cromosómica en el paciente.
I.4.4 Estrategia metodológica
El presente estudio es un proyecto descriptivo prospectivo observacional, se
evaluaron y detectaron anomalías cromosómicas en estructura en pacientes con
diagnóstico ecocardiográfico de cardiopatía congénita y se proporcionó
información citogenética según las caracterizticas clínicas del paciente. No se
aplicó ningún diseño estadístico.
9
I.4.4.1 Población y Muestra
POBLACIÓN
Pacientes con diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita
candidatos a cirugía cardíaca del Departamento de Pediatría de la Unidad
de Cirugía Cardiovascular de Guatemala –UNICAR-Fundación Aldo
Castañeda–
CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Niños con diagnóstico ecocardiográfico de cardiopátía congénita
candidatos a cirugía cardíaca del Departamento de Pediatría de
UNICAR-Fundación Aldo Castañeda

Pacientes originarios y recidentes del área rural y urbana de la
República de Guatemala.

Niños y niñas comprendidos entre recién nacidos (RN) hasta 12 años.

Pacientes con cardiopatías congénitas no asociadas con síndromes
genéticos específicos.
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

Pacientes que hayan sido estudiados previamente con test de
cromosomas o test de genes.

Pacientes que no sean originarios y residentes de Guatemala.

Pacientes comprendidos entre las edades de 13 años en adelante.

Pacientes con cardiopatías asociadas con síndromes genéticos
específicos, ya diagnosticados clínicamente y/o comprobados con test
de genes.
10
MUESTRA
30 pacientes con diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita
candidatos a cirugía cardíaca del Departamento de Pediatría de la Unidad
de Cirugía Cardiovascular de Guatemala –UNICAR-Fundación Aldo
Castañeda–
I.4.5 El Método
I.4.5.1 MATERIALES Y REACTIVOS
A. Toma de Muestra

Tubos con heparina sódica (tapa verde).
B. Cultivo celular

Tubos de centrifugado graduados de 50 ml

Medio completo RPMI 1640

L-Glutamina

Penicilina/Estreptomicina

Heparina Sódica

Suero Fetal Bovino (SFB)

Campana de Bioseguridad

Discos de Filtrado Nalgene de 0.22µl

Baño de María

Colchicina

Incubadora

0.08 M Timidina (TdR)

6M 5-Fluoro-2’-deoxy-uridina (FudR)

Fitohemaglutinina (PHA)
11
C. Cosechado

Centrífuga

Aspiradora al vacío

Pipetas pasteur

Cloruro de Potasio –KCl– 0.075M

Fijador (Acido acético y Metanol 1:3)

Congelador a -20ºC

Bromuro de Etidio
D. Laminas

Laminillas

Deshumificador

Microscopio de contraste de fases.
E. Técnica de bandas G: Tinción con solución de GIEMSA

7,5% Bicarbonato de sodio

Solución de GIEMSA

70% Etanol

Tripsina Enzar-T

Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)

Tarros de coplin

Agua destilada

Tampón de citrato-fosfato, pH 6,8
F. Análisis Citogenético
 Microscopio de fluorescencia Leitz
12
 Computadora Dell Optiplex GX620
 Software de análisis cromosomico Cytovision®
6 La técnica estadística
Al ser un estudio descriptivo no se utilizará ninguna técnica estadística para el
análisis de datos.
I.4.6 Los instrumentos a utilizar:
 Cabina de bioseguridad
 Baño maría
 Incubadora a 37ºC
 Pipetas automáticas
 Centrífuga
 Aspiradora al vacío
 Congelador a -20ºC
 Thermotron
 Microscopio de contraste de fases
 Computadoras
I.4.5.2 Metodología
La metodología utilizada se obtuvo del Manual del Laboratorio de Citogenética AGT
publicado en el año 1997, manual Internacional de Nomenclatura de Citogenética
Humana –ISCN– 2009 y Manual de cultivo celular del Laboratorio Kleberg del Baylor
College of Medicine, Texas, USA.
13
A. Obtención de muestras de paciente
Los pacientes pediátricos con diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita a
participar en el estudio fueron referidos por médicos cardiólogos del Departamento de
Pediatría de UNICAR-Fundación Aldo Castañeda. Se sostuvo una reunión con los padres
y/o guardianes legales del paciente para informar sobre el estudio genético. Luego de ello
se les informó acerca de la invitación a su hijo/niño en custodia a participar en el estudio
mediante la lectura del consentimiento informado, el cual firmaron (Anexo 2).
Posteriormente, a cada niño se le extrajo 3-4ml de sangre periférica y se colocó en un
tubo con heparina sódica. Esta muestra fue utilizada para realizar el análisis citogenético.
Las muestras fueron transportadas y procesadas en el laboratorio de citogenética del
Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM–.
B. Siembra
Una vez transportadas las muestras sanguíneas de los pacientes pediátricos al
INVEGEM, éstas fueron sembradas en medio de cultivo, el cual fue preparado utilizando:
RPMI 1640, suero fetal bovino (15%), L-Glutamina, penicilina/estreptomicina y heparina
sódica. Seguidamente éste se filtró utilizando un disco Nalgene de 0.22 µl con el fin de
esterilizar la solución. Puesto que algunas células sanguíneas no experimentan una
división celular espontánea –particularmente los linfocitos maduros– éstos fueron
estimulados mediante la adición del mitógeno fitohemaglutinina (PHA). Finalmente el
medio fue atemperado a 37ºC previo a la adición de la muestra de sangre con el fin de
evitar un choque térmico que causara una alteración molecular e interfiriera con el
análisis citogenético en la muestra. Los medios fueron preparados en el momento en que
ingresó cada muestra a analizar para mantener la frescura del cultivo.
B. Cultivo
Cada muestra de sangre fue sembrada en 2 tubos diferentes con 10ml de medio de
cultivo cada uno; añadiendo 1 ml de sangre en cada tubo e incubando a 37ºC con sistema
14
cerrado por 72 horas, para dar lugar a los procesos de división celular. La razón de
incubar por un lapso de 72 horas radica en que la división celular inducida químicamente
por la PHA inicia 48 horas después de su adición al medio, por lo que en las 24 horas
restantes existen extensos intervalos de división celular, haciendo de éste un lapso óptimo
para los cultivos de sangre periférica (Gersen & Keagle, 2005)
Puesto que el objetivo principal del presente estudio fue detectar cualquier
anormalidad cromosómica –incluyendo deleciones y microdeleciones– fue necesario
obtener cromosomas más largos y menos condensados que los evidenciados
tradicionalmente en una metafase. Por lo tanto, se hizo uso de las drogas 5-Fluoro-2deoxy-urudina –FudR– y Timidina –TdR– las cuales permitieron sincronizar y cosechar
los linfocitos de interés de manera anticipada en el ciclo celular –profase o prometafase–
con el fin de obtener los cromosomas con las características deseadas. Por ello, 18 horas
antes del cosechado se añadió cada droga en un tubo por separado.
C. Cosechado
Una vez que las células fueron cultivadas durante el período adecuado y que existió
un número suficiente en división, se inició con el proceso de cosechado. Este proceso
incluyó la colecta de linfocitos en metafase, su subsecuente tratamiento hipotónico y de
fijación y el colocamiento de los cromosomas en láminas para ser teñidos y examinados
en el microscopio (Gersen & Keagle, 2005).
Inicialmente, la suspensión de células fue centrifugada a 2,400 rpm por 8min y se
retiró el sobrenadante con la ayuda de una pipeta Pasteur, dejando 1ml de medio por
encima del precipitado. Seguidamente éste fue resuspendido en 10ml de RPMI 1640
previamente atemperado a 37°C y luego incubado por 3h 10min a 37°C. Al finalizar ese
lapso se procedió a inducir químicamente una elongación en los cromosomas, añadiendo
bromuro de etidio en ambos tubos, el cual actuó como agente intercalante entre las bases
nucleotídicas del ADN, disminuyendo así la contracción de los cromosomas. El cultivo se
dejó incubando por 1h 30min a 37°C con este químico.
15
Posteriormente se añadió colchicina a cada tubo, la cual ayudó a obtener un número
adecuado de células en metafase, ya que previene la separación de las cromátidas
hermanas en la anafase (Gersen & Keagle, 2005). El medio de cultivo se incubó por
10min a 37°C.
Después, el cultivo celular fue centrifugado a 2,400rpm durante 7min y el
sobrenadante se descartó. El precipitado se resuspendió con 10ml de KCl (a 37°C), que
actuó como una solución hipotónica en el medio, creando un gradiente osmótico. Esto
causó la entrada de agua a la célula, hinchándola, y así permitiendo separar los
cromosomas para su mejor observación en el microscopio. La adición del KCl se hizo
gota por gota, agitando los tubos por inversión cada cierto volumen agregado. El KCl se
dejó actuando por 20min a 37°C.
Acto seguido, al medio se le agregó 1ml de fijador y fue centrifugado a 2,400rpm
durante 10min. Luego el sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en
10ml de fijador frío y se dejó reposar por 15 min a temperatura ambiente. Después, el
medio se cenrifugó a 2,400rpm por 10min y se descartó el sobrenadante hasta dejar 1ml
de medio. El precipitado se resuspendió en 10ml de fijador frío. Este paso se repetió hasta
obtener un precipitado limpio y un sobrenadante transparente. Finalmente, el precipitado
se congeló a -20°C hasta el momento de realizar el goteo en las laminillas.
En seguida, se agregó el fijador gota a gota agitando el tubo por inversión cada cierto
volumen agregado. Se dejó reposando por 15 minutos a temperatura ambiente, luego se
centrifugó, el sobrenadante se descartó y el pellet se resuspendió. El paso de fijación se
repetió hasta obtener un pellet limpio y un sobrenadante transparente. Por último, el
pellet se congeló a -20ºC hasta el momento del goteo.
D. Preparación de laminillas
En la preparación de laminillas, inicialmente, las células almacenadas a -20°C fueron
centrifugadas a 3,000rpm por 7min y, luego de descartar el sobrenadante, fueron
16
resuspendidas en fijador frío fresco hasta obtener una suspensión blanquecina. Ya que la
temperatura y humedad ambiental son factores que afectan la dispersión de los
cromosomas en la lámina, estas variables fueron reguladas entre 24-27ºC y 35- 45% H
con la ayuda de un controlador ambiental.
Posteriormente, se aplicó 1ml de fijador en el portaobjetos, distribuido en toda la
superficie, permitiendo la evaporación del mismo. Luego, se distribuyó 30 µl de la
suspensión celular, procurando una dispersión uniforme en el portaobjetos (Anexo 3).
Finalmente se dejó secar la laminilla y se utilizó un microscopio de contraste de fases
para observar el número y calidad de las metafases y la densidad celular. Se realizaron de
4 a 6 extensiones por muestra en función de las metafases observadas en el microscopio
de contraste de fases.
E. Técnica de bandas G: Tinción con solución de GIEMSA
Las láminas preparadas en la fase de cosechado fueron tratadas con la enzima tripsina
y teñidas con Giemsa. Este procedimiento produjo una serie de bandas claras y obscuras
que permitió la identificación adecuada de los cromosomas. Para ello, inicialmente las
láminas se secaron en un horno a 90ºC por 35min con el fin de maximizar el bandeo
cromosómico. Luego cada lámina fue sumergida en 5 soluciones: a) Solución de Hanks
–HBSS– 1x; b) HBSS y tripsina, pH ajustado a 7- 7.2 con bicarbonato sódico; c) y d)
etanol al 70%; y e) agua destilada, Giemsa y tampón citrato-fosfato. Finalizado el
proceso de tinción las láminas fueron enjuagadas con agua destilada y secadas.
F. Análisis e interpretación del resultado
El análisis citogenético de los pacientes inició con la búsqueda de metafases en las
laminillas. Una vez reunidos los criterios de dispersión y concentración de las mismas, se
realizó un conteo de cromosomas con el fin de evidenciar la existencia de anormalidades
cromosómicas numéricas. Luego de ello se hizo un análisis minucioso sobre la estructura
de los cromosomas, evaluando parámetros como tamaño, forma y patrón de bandas G.
17
Para el análisis de las anormalidades cromosómicas numéricas y estructurales, se
utilizaron los criterios del ISCN (2013). Los criterios citogenéticos para definir la
presencia de una anormalidad cromosómica son los siguientes: evidenciar como mínimo
20 metafases en donde aparezca la misma anormalidad –numérica o estructural–
observada en la muestra del paciente. El procedimiento de identificación e interpretación
de las anormalidades cromosómicas fue supervisado por el Dr. Gabriel Silva, médico
pediatra genetista, especialista en análisis citogenético por el Baylor College of Medicine
de Texas, USA.
Las laminillas y muestras analizadas fueron almacenadas con el código y fecha
correspondiente, en una caja diseñada para portaobjetos y crioviales a -30C,
respectivamente
18
PARTE II
MARCO TEÓRICO
A. CARDIOPATIAS CONGENITAS
Las Cardiopatías Congénitas (CC) se definen como una anormalidad en la estructura y
función del corazón en el recién nacido, establecida durante la gestación. Comprenden un
grupo heterogéneo de defectos que incluyen malformaciones cardíacas, cardiomiopatías y
arritmias cardíacas causadas por factores genéticos, ambientales o multifactoriales
(Gruber & Epstein, 2003). Las CC representan un importante problema de salud infantil
en todo el mundo, en estudios publicados desde 1955 la incidencia varía de 4/1000 a
50/1000 nacidos vivos (Hoffman & Kaplan, 2002) aunque otros estudios han reportado
una incidencia mucho más alta que la anterior, documentando de 19/1000 a 75/1000
nacidos vivos (Richards & Garg, 2010). Las diferencias en la tasa de los distintos
estudios se deben, en gran parte, a problemas metodológicos, como los distintos criterios
de registro (inclusión o no de CC como la válvula aórtica bicúspide, vena cava superior
izquierda, ciertas arritmias y miocardiopatías con base genética, entre otras), y a los
procedimientos diagnósticos empleados, así como la época de estudio (Pradat et al.,
2003; Richards & Garg, 2010).
En los trabajos más recientes se ha observado un aumento aparente de la incidencia
de las CC, especialmente de las cardiopatías más leves, como la comunicación
interauricular (CIA) y la comunicación interventricular (CIV), permaneciendo constante
la prevalencia al nacimiento de las más severas, como la transposición de las grandes
arterias (TGA) y el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (SCIH) (Botto & Correa,
2003). Esto se debe a una mayor rapidez en el diagnóstico y, sobre todo, una mejora en
las técnicas de diagnóstico, como por ejemplo la implementación del eco-Doppler, capaz
de detectar CIV’s de muy pequeño tamaño, que frecuentemente se cierran
espontáneamente en los primeros meses (Hoffman & Kaplan, 2002).
19
Por ejemplo, en el trabajo de Cloarec et al., (1999), la prevalencia de las CC
disminuía del 9.8 al 5.3% si se excluían las CIV musculares de diámetro inferior a los
3mm, que representaban el 70.2% de todas las CIV. Asimismo, algunos autores han
observado una prevalencia del 8% de los recién nacidos vivos al año y del 12.5% a los 16
años. Existe un predominio más evidente del sexo masculino a las obstrucciones al tracto
de salida del ventrículo izquierdo (Guia, et al., 2002). La incidencia en los prematuros y
en neonatos con bajo peso es mucho mayor que en los neonatos a término. Alrededor del
25-30% de las CC se presentan en el contexto de síndromes malformativos o
comosomopatías. A su vez, la tasa de CC en algunas comosomopatías, como las trisomías
21, 18 y 13 o el síndrome de Turner (45X) es muy elevada (Linn & Ardinger, 2005).
Las malformaciones cardíacas constituyen la causa principal de mortalidad por
anomalías congénitas en lactantes (algo más de 1/3 de las muertes por anomalías
congénitas y alrededor de 1/10 de todas las muertes en ese período de vida). Sin embargo,
la mortalidad por esta causa ha bajado considerablemente en los últimos años, debido a
los avances en el diagnóstico, tratamiento quirúrgico y cuidados postoperatorios (un
descenso del 40% en EEUU entre 1979-1997). No obstante, en el caso de las anomalías
más severas como el corazón izquierdo hipoplásico o el corazón univentricular, la
mortalidad es todavía sustancial y la morbilidad es muy elevada. Debido al descenso de
mortalidad, la edad de fallecimiento ha aumentado, con el consiguiente incremento de la
supervivencia (Hoffman, Kaplam & Liberthson, 2004).
Etiología
La etiología todavía no es clara en muchas de las CC y se consideran tres principales
causas: genética, factores ambientales y multifactorial. Dentro de las CC con etiología
genética se estima que un 10% de los casos se asocian a anomalías cromosómicas visibles
con técnicas convencionales, aunque si se incluyen las microdeleciones (e.g. 22q11.2), la
proporción aumenta hasta casi un 25% (Goddship, Cross, LiLing & Wren, 1998;
Hoffman & Kaplan, 2002). Aparte de las cromosomopatías conocidas se han identificado
defectos genéticos y moleculares específicos que contribuyen a las malformaciones
20
cardiacas. Por ejemplo, se han identificado mutaciones de un solo gen en malformaciones
cardiacas aisladas, como la estenosis aórtica supravalvular y la coartación aórtica, o
asociadas a síndromes malformativos, como: Alaguille, Marfan, Noonan, o Holt Oram
(Perich, 2008).
Dentro de las CC con etiología ambiental (2-3%), se considera que las causas
externas más frecuentes responsables de malformaciones cardíacas, son: a) Enfermedades
maternas: como la diabetes pre-gestacional, fenilcetonuria, lupus eritematoso y la
infección por VIH y b) Exposición a tóxicos: como disolventes orgánicos, lacas, pinturas,
herbicidas, pesticidas y productos de cloración (Perich, 2008).
Finalmente la mayor parte de CC (alrededor del 70-80%) se deben a herencia
poligénica multifactorial (Botto & Correa, 2003). Esto significa que la causa de
malformaciones cardiacas se debe a la combinación de factores genéticos y ambientales.
La malformación se expresa cuando el efecto aditivo de varios genes predisponentes
(herencia poligénica) excede un umbral; a su vez, el umbral puede modificarse por el
efecto de teratógenos ambientales. Este modelo explica la existencia de riesgos menores
que los de la herencia mendeliana, como ocurre en gran parte de las CC (Botto & Correa,
2003; Perich, 2008).
Riesgo de recurrencia
El riesgo de recurrencia en cardiopatías con herencia de tipo monogénico es del 50%
en los casos de herencia autosómica dominante con penetrancia completa. Cuando la
herencia es autosómica recesiva, si existe un hermano afectado, el riesgo de recurrencia
para otro hermano es del 25%, mientras que si el afectado es uno de los progenitores el
riesgo es considerablemente inferior. En el caso de herencia recesiva ligada al
cromosoma X, el riesgo para la descendencia masculina de una portadora femenina es del
50%; si es dominante, la enfermedad es viable en ambos sexos, con un riesgo del 50% de
hijos afectados. En el caso que dos progenitores sanos que tienen un hijo con una
enfermedad autosómica dominante, la causa puede ser: a) Una mutación de novo, donde
21
el riesgo de transmisión a un hijo del afectado muy bajo pero más alto que el de la
población general, y b) La existencia del trastorno con penetrancia incompleta, que no se
manifiesta en el progenitor (Priori, Napolitano & Scwartz, 1999).
Las enfermedades autosómicas dominantes tienen una expresividad fenotípica
variable y pueden presentarse problemas en la determinación del riesgo de recurrencia,
especialmente cuando la expresión es muy pequeña, como ocurre en el síndrome de
Marfan o de Alagille. Asimismo, las mutaciones de un mismo gen pueden causar
cardiopatías diferentes y, por el contrario, la misma cardiopatía puede tener su origen en
diferentes genes (Payne, Johnson, Grant & Strauss, 1995).
El riesgo de recurrencia en las cardiopatías asociadas a cromosomopatías depende del
tipo de anomalía cromosómica. En las parejas con un hijo con una cromosomopatía por
no disyunción, el riesgo de recurrencia es del 1%, mismo que aumenta cuando alguno de
los progenitores presenta translocación (hasta el 10% si la presenta la madre y el 100% si
la presentan ambos progenitores). Muchos de los síndromes por microdeleción son
esporádicos, pero en algunos como el síndrome de DiGeorge, puede haber transmisión
familiar. Si alguno de los progenitores presenta la deleción, el riesgo de recurrencia en
sus descendientes se incrementa hasta el 50% (Moreno, Gómez & Barreiro, 2000).
Cuando no se conoce el tipo de herencia, el riesgo se establece empíricamente en base
al modelo aditivo multifactorial, cuantificándose en el 2-4% para los hermanos de un hijo
afectado, valor que se triplica cuando los afectados son 2 hijos. El riesgo es mayor
cuando los afectados son los progenitores que cuando hay un hermano afectado. Para
algunos autores, el riesgo es mayor en el caso de que la afectada sea la madre, mientras
que otros no encuentran diferencias significativas o, incluso, hallan que la incidencia es
mayor cuando el afectado es el padre (Whittemore & Castellsague, 1994).
Asimismo el riesgo de recurrencia varía según la cardiopatía. A pesar de le elevada
tasa de concordancia exacta o de grupo en las recurrencias encontrada en algunos
estudios (hasta el 80% en el caso del canal atrioventricular común) el hallazgo de una
22
cardiopatía leve no excluye una más severa en las recurrencias y, por el contrario, la
existencia de una cardiopatía severa no implica necesariamente otra cardiopatía severa en
caso de recurrencia (Gill, Splitt, Sharland, & Simpson, 2003).
Prevención
La prevención es un tema de vital importancia en las CC, por lo que actualmente se
divide en 2 fases: prevención primaria y secundaria. Para la prevención primaria de las
CC se han adoptado una serie de medidas, como el control de la diabetes materna, la
vacuna de la rubéola y evitar la exposición a teratógenos durante el embarazo. Asimismo
un buen control de la glucemia antes de la concepción y durante el embarazo reduce el
riesgo de anomalías congénitas (Freinkel, Dooley & Metzger, 1985). Estudios recientes
en ratas con diabetes inducida han mostrado una reducción del riesgo de embriopatía
diabética con la administración de antioxidantes (vitamina E) a las madres gestantes.
Otros trabajos han sugerido un efecto protector de los suplementos vitamínicos que
contienen ácido fólico (Siman & Erikson, 1997; Czeicel, 1998; Boto, Mulinare &
Erikson, 2000).
Con respecto a las medidas de prevención secundaria, se han implementado modelos
preventivos como el consejo genético y el diagnóstico prenatal, procesos que son
importantes en las parejas con factores de riesgo conocidos. La identificación de una
causa genética es muy importante, ya que permite establecer un consejo genético más
fiable, así como la valoración de posibles anomalías en otros órganos, la evaluación de
otros familiares asintomáticos y una estratificación del riesgo de recurrencia (Pierpont, et
al., 2007)
Existen casos particulares como los casos con riesgo aumentado, en donde se puede
recurrir al diagnóstico prenatal. La aminocentesis, la biopsia de las vellosidades
coriónicas y las muestras de sangre del cordón umbilical permiten el estudio citogenético
en madres con riesgo para anomalías cromosómicas, aunque son procedimientos
invasivos con riesgo de aborto. El screening de sangre materna al final del primer
23
trimestre o durante el segundo trimestre de la gestación –para el estudio de la alfafetoproteína, la gonadotropina coriónica y el estriol no conjugado- también constituye un
procedimiento eficiente (Alfirevic, Sundberd & Brigham, 2003; Alvarez et al., 2003).
Cardiopatías Congénitas más frecuentes
Existen numerosas CC y también diversas formas de clasificarlas tanto de acuerdo a
su fisiopatología como a su presentación clínica. A continuación se hará una descripción
de las CC más frecuentes en Guatemala según lo observado por el Dr. Gabriel Silva,
encargado de la Clínica de Cardiogenética en UNICAR.
Comunicación interauricular (CIA)
La comunicación interauricular (CIA) es un defecto del tabique interauricular que
comunica las dos aurículas permitiendo el flujo sanguíneo entre ellas. Estos defectos
pueden estar localizados en cualquier sitio del tabique interauricular siendo el más
frecuente la región del foramen oval (alrededor del 70%) (Keith, 1978). Esta patología es
muy difícil de diagnosticar en los primeros días de vida, cuando el defecto es pequeño,
porque se puede confundir con un foramen oval que es normal a esta edad (Díaz, Fragoso
& Gordillo, 2011).
La CIA es una CC relativamente frecuente si se observa en una forma global y
representa alrededor del 7% del total de cardiopatías en diferentes series, y de 0.317 por
1000 nacidos vivos según el Baltimore Washington Infant Study (Ferencz, Rubin &
McCarter, 1985). Este defecto es más frecuente en el sexo femenino, con una porción de
2:1, también se asocia con antecedentes familiares, y frecuentemente también con el
síndrome de Holt-Oram, el cual sigue un patrón de herencia autosómico dominante (Holt
& Oram, 1960). La forma más común de CIA es el agujero oval permeable, la sangre
fluye a través de este agujero, desde la aurícula derecha hacia la izquierda la cual produce
dificultad para respirar y un retraso del crecimiento, incluso puede producir cianosis
(Díaz et al., 2011).
24
Los síntomas y signos de la CIA incluyen: a) Retraso del crecimiento, b)
Palpitaciones, y c) Falta de aliento o dificultad para respirar. Aunque la CIA está presente
desde el nacimiento, los síntomas a menudo no aparecen durante la niñez. En cambio, la
aurícula derecha puede agrandarse con el tiempo, causando problemas en la edad adulta.
Los adultos con CIA pueden padecer arritmia o insuficiencia cardíaca. Esta insuficiencia
hace que se acumulen sangre y líquidos en ciertas partes del cuerpo, tales como los
pulmones, el hígado, el abdomen y las piernas (Nagm & Rao, 2004).
Clasificación de la CIA
Actualmente se distinguen cuatro tipos importantes de CIA: a) Anomalía de tipo
ostium secundum, b) Anomalías del cojinete endocárdico con anomalía del tipo ostium
primum, c) Anomalía del seno venoso, y d) Aurícula común. A continuación se hará una
breve descripción de cada una de ellas
Anomalía de tipo ostium secundum
La comunicación interauricular (CIA) tipo ostium secundum es una de las más
comunes constituyendo el 80% de las comunicaciones interauriculares, ésta CIA se
encuentra ubicada en la zona de la fosa oval incluyendo tanto anomalías del primer
tabique como del segundo tabique. Un agujero oval permeable suele deberse a la
reabsorción anómala del primer tabique durante la formación del ostium secundum; en el
caso de una reabsorción excesiva de éste tabique, el primer tabique resultará corto y por
lo tanto no se cerrará el agujero oval. Si se forma un agujero oval grande, por un
desarrollo defectuoso del septum secundum, éstas pueden ocurrir por una combinación
de una reaborción excesiva del primer tabique y un agujero oval grande. La CIA de tipo
secundum se toleran bien durante la infancia. El cierre se lleva a cabo por medio de
cirugía de corazón abierto (Perich, 2008).
25
Anomalías del cojinete endocárdico con anomalía del tipo ostium primum
Estas anomalías son las menos comunes de la CIA, y son consecuencia de un defecto
de los tabiques endocárdicos y del tabique AV. En éste caso no se fusiona el primer
tabique con los cojinetes, causando un ostium primum permeable o anomalía del ostium
primum. Este tipo de anomalía ocurre alrededor del 20% en personas con síndrome de
Down, caracterizándose por una comunicación interauricular interventricular con
válvulas auriculoventriculares notablemente anómalas. Esta grave anomalía se puede
detectar por medio de un estudio del corazón fetal (Gill et al., 2003).
CIA tipo seno venoso
Este tipo de anomalía es uno de los casos más raros de CIA, se localiza en la parte
superior del tabique interauricular (CIA altas) cerca de la entrada de la vena cava
superior; se debe a la reabsorción incompleta del seno venoso en la aurícula derecha o
desarrollo anómalo del septum secundum (Perich, 2008).
Aurícula común
Este tipo de CIA es una anomalía poco frecuente en la que está ausente el tabique
interauricular, se desarrolla como consecuencia de la falta de desarrollo del primer y
segundo tabiques (Perich, 2008).
Diagnóstico de las CIA
El diagnóstico de esta anomalía resulta con más frecuencia en el adulto, el método de
primera elección para su diagnóstico y seguimiento es la ecocardigrafía Dopper (ED),
además la resonancia magnética cardiovascular (RMC), con sus múltiples aplicaciones,
es una excelente alternativa para su estudio. La RMC tiene ventaja adicional de que con
ella el defecto se puede observar con imágenes frontales, y es actualmente el único
método capaz de cuantificar, en forma directa el volumen sanguíneo que lo atraviesa. La
26
necesidad de descartar la presencia de orificios septales múltiples o retornos venosos
anómalos, acompañado a la CIA, obliga a complementar el estudio de ED con el eco
transesofágico (ETE) (Díaz et al., 2011).
Tratamiento de la CIA
Alrededor del 40% de las CIA se cierran solas antes de los dos años de edad. Después
de esa edad, es raro que cierren en forma natural, por eso generalmente se recomienda
una intervención quirúrgica para casos graves (cuando el lado derecho del corazón se ha
agrandado). La intervención quirúrgica generalmente consiste en tapar el orificio con un
parche. Para cerrar el orificio sin necesidad de realizar una intervención de corazón
abierto, algunos médicos utilizan un procedimiento de cateterización. La cirugía para
cerrar la comunicación interauricular es exitosa en el 99% de los casos. Si se realiza en la
niñez, el corazón agrandado volverá a su tamaño normal de 4 a 6 meses (Díaz et al.,
2011).
Comunicación interventricular (CIV)
La comunicación interventricular es un defecto a nivel septo interventricular que
comunica el ventrículo izquierdo con el ventrículo derecho. La CIV aislada corresponde a
un 25% de todas las CC. También puede estar asociada a otras cardiopatías como:
Tetralogía de Fallot, canal atrioventricular, transposición de grandes arterias, etc (Perich,
2008).
Prevalencia de la CIV
La prevalencia de la CIV se ha definido entre 1 y 3.5/1000 recién nacidos vivos
(RNV), mayor en prematuros; sin embargo, recientemente se han dado cifras más
elevadas, hasta de 50/1000 RNV y superiores (Roguin et al., 1995; McDaniel, &
Gutgesell, 2008). Los factores que explican las diferencias son: La población
seleccionada, si el diagnóstico atiende a criterios clínicos o ecocardiográficos y si se
27
incluyen o no diagnósticos prenatales. Los estudios a todos los RNV con ecordiografía
han evidenciado una elevada incidencia, a expensas de pequeñas o mínimas CIV
musculares, un 85-90% de las cuales se pueden cerrar espontáneamente en el primer año
y quedar excluidas en otro tipo de valoración (McDaniel, & Gutgesell, 2008).
Actualmente se le atribuye una etiología multifactorial, con interacción entre la
predisposición hereditaria y factores ambientales como condicionantes del defecto. En las
CIV no asociadas a cromosomopatía o a enfermedades con herencia mendeliana, el
riesgo de recurrencia de cardiopatía congénita en familiares de primer grado de un
afectado se sitúa entre el 3 y 4%, existiendo concordancia (esto es, la cardiopatía será
también una CIV) en más de la mitad de los casos (Gill et al., 2003)
Anatomía y clasificación
Las CIV se clasifican según su localización y tamaño, en donde existen una gran
variedad de manifestaciones. Según su localización se clasifican en: CVI membranosa,
CIV supracristal, CIV muscular, CIV del septo de entrada. Según su tamaño se clasifican
en pequeñas, moderadas y grandes (Perich, 2008).
CIV membranosa
Las CIV membranosas son las más frecuentes (constituyen el 75-80% del total). El
septo membranoso es una pequeña zona adyacente a la válvula aórtica, por debajo de la
misma en el lado izquierdo y contigua a la válvula tricúspide en el lado derecho. La valva
septal tricúspide lo divide en dos porciones (septo membranoso interventricular y
atrioventricular), que separan el ventrículo izquierdo del ventrículo derecho y de la
aurícula derecha, respectivamente (Keane & Fyler, 2006).
Las CIV membranosas implican al septo membranoso con extensión a una o varias de
las porciones próximas del septo muscular (de entrada, de salida o trabecular). A nivel del
tracto de salida ventricular izquierdo de sitúan inmediatamente por debajo de la válvula
28
aórtica. En el ventrículo derecho el defecto se localiza por debajo de la inserción de la
valva septal tricúspide, que con frecuencia presenta tejido accesorio que ocluye parcial o
completamente el defecto, lo que se define como aneurisma del septo membranoso. La
válvula tricúspide puede asociar anomalías menores (comisura ancha, perforación de la
valva, hendidura) que condicionen la comunicación entre el ventrículo izquierdo y ambas
cavidades derechas y, excepcionalmente, existe cortocircuito aislado del ventrículo
izquierdo a la aurícula derecha por el defecto del septo membranoso atrioventricular (Gill
et al., 2003; Perich, 2008).
CIV supracristal
Las CIV supracistales representan aproximadamente el 5-7% de las CIV. El septo
infundibular comprende la porción septal entre la crista supraventricular y la válvula
pulmonar. Son defectos en el tracto de salida del ventrículo derecho debajo de la válvula
pulmonar y asocian con frecuencia insuficiencia aórtica (Gill et al., 2003).
CIV muscular
Las CIV musculares constituyen entre el 5 y 20% del total. En el lado derecho, el
septo tabeculado se extiende entre las inserciones de las cuerdas ticusídeas, el ápex y la
crista supraventricular. Pueden subdividirse en apicales (las más frecuentes), centrales y
marginales o anteriores (cercanas al límite entre el septo y la pared libre). Con frecuencia
son múltiples o se asocian a defectos de otra localización (Rudolph, 2001).
CIV del septo de entrada
Las CIV del septo de entrada suponen el 5-8% de las CIV. Se llaman también
defectos de tipo canal atrioventricular, pero este término no es adecuado porque no
asocian anomalías de válvulas aurículo-ventriculares. El septo de entrada separa las
porciones septales de los anillos mitral y tricúspide. Son defectos posteriores e inferiores
a los membranosos, por detrás de la valva septal de la válvula tricúspide. La localización
29
del defecto condiciona la relación del tejido de conducción con el mismo. El haz de His
cursa subendocárdico por el borde inferior de las perimembranosas y por el borde
superior de las de septo de entrada, y no tiene relación directa con el resto, salvo que
tengan extensión perimembranosa. Con frecuencia en las infundibulares en ocasiones en
las perimembranosas puede producirse insuficiencia aórtica, por prolapso de alguna de
las valvas de la sigmoidea relacionadas con el defecto (Maître, 2002).
En los defectos perimembranosos puede existir mal alineamiento entre el septo
infundibular el septo anterior, lo que condiciona un cabalgamiento de la válvula aórtica
sobre el defecto cuando el mal alinimiento es anterior, o una obstrucción subaoórtica si es
posterior. Un porcentaje reducido de defectos medianos y grandes desarrollan estenosis
pulmonar infundibular, que modificia la evolución del cuadro clínico (Perich, 2008).
Retorno venoso anómalo
El retorno venoso pulmonar anómalo total (RVAT) es una malformación congénita
común en Guatemala, en la que las cuatro venas pulmonares no se conectan normalmente
al atrio izquierdo, sino que drenan sangre de manera anormal al atrio derecho a través de
una conexión anormal. Los pacientes con RVAT manifiestan la enfermedad
inmediatamente después del nacimiento, al presentar cuadros cianóticos graves. Además
tienen dificultades respiratorias graves, que incluye respiración acelerada, silbido y
retracción de los músculos de la caja torácica (Albert et al., 2000).
B. ANORMALIDADES CROMOSOMICAS
Se entiende por mutación o anormalidad cromosómica al proceso de cambio que da
lugar a la reorganización de partes de un cromosoma, o a un número anormal de
cromosomas concretos o de la dotación cromosómica completa. Las anormalidades
cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales. Las anormalidades del orden
numérico pueden ser menores o mayores de 46 cromosomas en los humanos. Puede ser
menor como en el caso de las monosomías en la destaca la única compatible con la vida,
30
como lo es el Síndrome de Turner o 45X, o mayor como los casos de las trisomías,
tetrasomías, etc (Griffiths, Millar, Suzuki, Lewontin & Gelbart, 2002).
En el caso de las anormalidades estructurales, éstas pueden ser de varios tipos según el
evento qu ese manifiesta: deleción, duplicación, inversión y translocación. Las deleciones
se refieren a la pérdida de algún segmento del cromosoma; las duplicaciones se refieren a
la presencia de dos copias de una misma región cromosómica; las inversiones se refieren
a que un segmento del cromosoma rota 180ºC y se vuelve a unir al mismo cromosoma
pero en sentido inverso; y las translocaciones se refieren al intercambio de segmentos
entre cromosomas no homólogos (Griffiths et al., 2002).
Rearreglos cromosómicos balanceados y no balanceados
Las anormalidades estructurales pueden clasificarse en balanceadas y no balanceadas,
según la conservación o pérdida del material genético, respectivamente.
Se considera como una translocación cromosómica balanceada cuando parte de un
segmento de un cromosoma se traslada a otro cromosoma y en el examen citogenético se
encentra tanto el cromosoma como el segmento perdido como el cromosoma hacia donde
el segmento se ha trasladado o traslocado, por lo que se considera que hay conservación
del material genético (ISCN 2013).
Por el contrario, un rearreglo cromosómico no balanceado se refiere a aquellos en los
que solo se encuentra el cromosoma con el segmento agregado o translocado y se
identifica como un cromosoma extraño o nuevo y no se encuentra el resto del cromosoma
de donde proviene el segmento adicional, por tanto en este caso sí hay perdida de
material genético que usualmente se expresa como enfermedad. Dentro de esta
clasificación también puede incluirse el caso en que existe la presencia de tres
cromosomas, y el cromosoma extra se encuentra translocado en un cromosoma diferente.
En los dos ejemplos anteriores generalmente uno de los padres es el portador de esta
anormalidad por lo que el estudio citogenético de los padres es necesario (ISCN 2013).
31
Generalmente las translocaciones balanceadas o equilibradas suelen cursar con
fenotipo normal y el portador puede transmitirlo a sus descendientes y original
translocaciones no balanceadas con alteración fenotípica, todo indificio con esta segunda
presentación se deberá investigar en sus progenitores la posibilidad de que alguno de los
dos sean portadores de translocacion balanceada.
C. CITOGENETICA
La citogenética es la disciplina de estudio de los cromosomas normales y anormales.
Su análisis incluye el estudio de la estructura cromosómica y la dilucidación y
descripción de las relaciones entre la estructura cromosómica y el fenotipo, y la búsqueda
de causas de las anormalidades cromosómicas (ISCN 2013). Básicamente los
cromosomas son analizados y caracterizados por medio del cariotipo de un individuo. Se
conoce como cariotipo al complemento cromosómico completo de un individuo o célula
tal como se observa durante la fase mitótica y la descripción del número y estructura de
los cromosomas (Griffiths et al., 2002).
Técnicas de bandeo
Se han reportado numerosos procedimientos técnicos para generar patrones de bandas
en cromosomas de la metafase. Una banda se define como la parte de un cromosoma que
es claramente distinguible de sus segmentos adyacentes debido a su aspecto más oscuro o
más claro utilizando una o más técnicas de bandeado; una banda que se colorea obscura
con un método puede colorearse clara con otros métodos. Los cromosomas se visualizan
como una serie continua de bandas claras y bandas obscuras, de modo que por definición
no hay interbandas (ISCN, 2013).
Los primeros métodos de bandeado publicados que mostraban bandas a lo largo de
los cromosomas fueron los que usaban mostaza de quinacrina o dihidrocloruro de
quinacrina para producir un patrón de bandas fluorescentes; estos métodos se
denominaron como Tinción Q, para generar bandas Q. Las técnicas que mostraban un
patrón casi idético al de bandeado Q en bandas oscuras y claras
lo largo de los
cromosomas utilizaban la mezcla de colorantes Giemsa; estos métodos se denominaron
32
como de Tinción G, para generar bandas G. Algunas técnicas de bandeado generan
patrones que son opuestos en intensidad de tinción a los obtenidos por los métodos de
tinción G; estos métodos de tinción reversa generan bandas R (ISCN, 2013).
Bandeado de alta resolución
Las técnicas de bandeado de alta resolución pueden aplicarse a cromosomas en
diferentes etapas del ciclo celular (e.g. profase, prometafase o interfase). Adicionalmente,
el número de bandas discernibles depende no sólo del estado de condensación sino
también de la técnica de bandeado utilizada. El nivel de resolución se determina por el
número de bandas vistas en un set haploide de cromosomas –22 autosomas +X+Y–. Los
idiogramas estándar provee una representación esquemática de los cromosomas
correspondiente a aproximadamente 300, 400, 550, 700 y 850 bandas; aunque pueden
visualizarse más bandas, los idiogramas de 550-850 bandas son suficientes para
propósitos prácticos.
Base molecular del bandeado G
Las bandas en los cromosomas reflejan la organización funcional del genoma que
regula la replicación, reparación, transcripción y recombinación genética del ADN. Las
bandas son estructuras grandes, cada una de aproximadamente 5 a 10 megabases de ADN
que pueden incluir cientos de genes. Se sabe que la base molecular de los métodos de
bandeado involucra la composición de bases, las proteínas asociadas y la organización
funcional del genoma; en general, las bandas G oscuras son ricas en AT, de replicación
tardía y pobres en genes, mientras que las bandas G claras son ricas en GC. De
replicación temprana y relativamente ricas en genes (ISCN 2013).
33
PARTE III
III.
RESULTADOS
Un total de 33 pacientes pediátricos con diagnóstico comprobado de cardiopatía
congénita candidatos a cirugía cardíaca fueron referidos de UNICAR para análisis
cromosómico al Laboratorio de Citogenética de INVEGEM. A 32/33 pacientes se les realizó
exitosamente el proceso de extracción de linfocitos para el análisis cromosómico, sin
embargo, en una muestra el proceso de crecimiento celular no fue exitoso por lo que ésta fue
excluida del estudio (Cuadro 2). La edad promedio de los pacientes fue de tres años, con una
taza de 1.13 mujeres por cada hombre 17:15. Las anormalidades cromosómicas se
identificaron en 1/32 (3.13%) de los pacientes, siendo la anormalidad encontrada clasificada
dentro de los rearreglos cromosómicos estructurales, denominado marcador cromosómico
(Fig 1). 2/32 (6.25%) de los casos presentaron rearreglos en los segmentos heterocromáticos
y 2/32 (6.25%) rearreglos en la longitud satelital (Cuadro 1, Fig. 2), características
clasificadas como variaciones polimórficas en los cromosomas (ISCN, 2013). Los
cromosomas con más variaciones en la longitud de los satélites fueron los cromosomas No.
21 y 22; el cromosoma con más variaciones en los segmentos heterocromáticos fue el
cromosoma No. 5 (Cuadro 1).
Cuadro 1. Anormalidades cromosómicas encontradas en 3.13% de casos y variaciones cromosómicas
encontradas en 12.5% de casos en pacientes con diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita provenientes
de UNICAR.
Paciente
Edad
(Años)
Sexo
Resultado Citogenético
I nterpretación
Variación: Segmento Heterocromático 2/32 = 6.25 %
CC-5
3.9
F
46, XX, 5qh+
Variación en la compactacion de la cromatina
CC-13
3
M
46, XY, 5qh+
Variación en la compactacion de la cromatina
Variación: Región Satelital 2/32 = 6.25 %
CC-10
CC-20
0.6
1.4
M
F
46, XY, 21ps+, 22ps+
46, XX, 22ps+
Variación en el largo de los satélites
Variación en el largo de los satélites
M arcador Cromosómico 1/32 = 3.13%
CC-21
5.4
M
46, XY, +mar
Presencia de Marcador Cromosómico
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
34
Cuadro 2. Diagnóstico clínico y citogenético de los pacientes con cardiopatía congénita referidos por
UNICAR del proyecto FODECYT 10-2012. Edad dada en años.
Paciente
Sexo
Edad
Diagnóstico Clínico
Resultado Citogenético
CC-1
F
5.8
Ductus Arteriosus/Membrana Subaórtica
Sin crecimiento
CC2
M
2
Comnicación Inerventricular Subaórtica
46, XY
CC-3
F
0.8
Comunicación Interventricular Subaórtica/Comunicación
Interventricular Media Muscular/ PDA
46, XX
CC-4
M
0.5
Tetralogía de Fallot
46, XY
CC-5
F
3.9
Comunicación interauricular ostium secundum
46, XX, 5qh+
CC-6
F
0.4
Comnicación Inerventricular Subaórtica
46, XX
CC-7
F
3
Conexión venosa anómala pulmonar parcial derechas a cavo
atrial
46, XX
CC-8
M
3
Comunicación interauricular y estenosis pulmonar valvular
46, XY
CC-9
M
0.6
Comunicación interventricular +
Persistencia del conducto arterioso
46, XY
CC-10
M
0.6
Tetralogía de Fallot
46, XY, 21ps+, 22ps+
CC-11
M
2
Comunicación interventricular +
Persistencia del conducto arterioso
46, XY
CC-12
M
0.8
Comunicación interventricular +
Persistencia del conducto arterioso
46, XY
CC-13
M
3
Comunicación interventricular +
Persistencia del conducto arterioso
46, XY, 5qh+
CC-14
F
0.08
Conexión venosa anómala pulmonar parcial derechas a cavo
atrial
46, XX
CC-15
M
4.7
Comnicación Inerventricular Subaórtica
46, XY
CC-16
M
2
Comunicación interventricular, persistencia del conducto
arterioso, hipertensión pulmonar
46, XY
CC-17
F
0.6
Comunicación interauricular seno venoso inferior
46, XX
CC-18
F
10
Estenosis mitral, s/p cambio valvular mitral por bioprotesis #27
46, XX
CC-19
F
2.2
Comunicación interventricular subaórtica
46, XX
CC-20
F
1.4
S/P Coartación Aórtica +
Estenocis Mitral Sub Valvular
46, XX, 22ps+
CC-21
M
5.4
PDA
46, XY, +mar
CC-22
M
10
Comunicación interauricular ostium secundum
46, XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
35
Cuadro 2. (Continuación) Diagnóstico clínico y citogenético de los pacientes con cardiopatía congénita
referidos por UNICAR del proyecto FODECYT 10-2012.
Paciente
Sexo
Edad
Diagnóstico Clínico
Resultado Citogenético
CC-23
M
3.25
Membrana subaórtica +
persistencia del conducto arterioso
46, XY
CC-24
F
3.3
Comunicación interauricular ostium secundum
46, XX
CC-25
M
0.9
Comnicación Inerventricular Subaórtica
46, XY
CC-26
F
5.08
Comunicación interauricular +
Vena cava superior izquierda persistente
46, XX
CC-27
F
1.6
Tetralogía de Fallot
46, XX
CC-28
F
1.2
Tetralogía de Fallot
46, XX
CC-29
F
2.5
Alambres esternales dolorosos +
s/p cierre comunicación interauricular
46, XX
CC-30
M
3
Comunicación interauricular ostium secundum
46, XY
CC-31
F
4.6
Comunicación interauricular seno venoso +
Conexión venosa anómala pulmonar parcial derechas
46, XX
CC-32
M
2.7
Tetralogía de Fallot + ramas pulmonares pequeñas + vena cava
superior izquierda persistente
46, XY
CC-33
F
2.9
Tetralogía de Fallot + atresia pulmonar + ausencia arteria
pulmonar + colaterales aorto-pulmonares
46, XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fue posible evidenciar pequeñas variaciones de longitud en la región 22q11 en algunas
metafases (Fig. 3) sin embargo éstas no fueron de tal magnitud como para considerarse como
deleciones cromosómicas. A pesar de ello, las variaciones en este sitio la hacen candidata a
estudios posteriores con técnicas de citogenética molecular.
3.2 Diagnóstico médico
Con respecto a la relación diagnóstico citogenético y clínico, todos los hallazgos y
correlaciones clínicas de los pacientes en el estudio, se encuentran detalladas en el Cuadro 2.
Se obtuvo una variedad de diagnósticos clínicos, dentro de los más frecuentes fueron:
Comunicación
Interauricular
(8/32),
Tetralogía
de
Fallot
(6/32),
Comunicación
Interventricular Subaórtica (6/32) y Persistencia del conducto arterioso (6/32). Todos los
pacientes fueron intervenidos quirúrgicamente en UNICAR y fue reportado para Diciembre
de 2012 el deceso de uno de los pacientes durante el estudio, de 3 años de edad (CC-32,
Cuadro 2).
36
Figura 1. Marcador cromosómico evidenciado en 1/32 pacientes considerado una anomalía cromosómica
estructural. La estructura fue evidenciada de manera constitutiva en las metafases analizadas.
!
Fuente: FODECYT 10-2012
37
Figura 2. Variaciones polimórficas evidenciadas en los cromosomas No. 5, 21 y 22 en pacientes con
diagnóstico clínico de cardiopatía congénita de UNICAR
Fuente: FODECYT 10-2012
38
Figura 3. Variación en la región 22q11 evidenciada en distintas metafases de pacientes con cardiopatía
congénita.
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Fuente: FODECYT 10-2012
39
IV. DISCUSION DE RESULTADOS
Los resultados en el presente estudio evidenciaron anormalidades citogenéticas en
pacientes pediátricos con diagnóstico comprobado de Cardiopatía Congénita (CC). Si
bien, los hallazgos de anormalidades cromosómicas fueron evidentes en el 3.13% de los
casos, es importante reconocer la identificación y caracterización de variaciones tanto de
segmentos heterocromáticos como de longitud satelital, que en conjunto con las
anormalidades evidenciadas sumaron un total de 15.63% de casos con hallazgos
citogenéticos en el estudio (Cuadro 1).
4.1 Genética de las Cardiopatías Congénitas
El estudio del componente genético en las CC es un campo de investigación
importante en la medicina, puesto que la mejora en el conocimiento de las causas de las
CC puede contribuir a su prevención al permitir a los investigadores adentrarse en las
bases patobiológicas de las CC y delimitar su riesgo. En ese sentido, para un médico que
trata con un paciente con CC es muy importante determinar la existencia de un patrón
genético subyacente (e.g. deleciones, duplicaciones, etc.) por las siguientes razones: a)
puede existir un daño de un órgano o sistema importante del que no se tenga
conocimiento, b) la información recabada puede complementar los resultados clínicos,
c) pueden existir importantes riesgos genéticos reproductivos sobre los cuales la familia
debe de saber, y d) pueden existir otros miembros de la familia a los cuales puede ser
apropiado realizar otras pruebas genéticas (Pierpont et al., 2007). Debido a ello, existen
numerosos estudios dedicados al estudio y documentación de la base genética de las CC.
En ese orden, Pierpont et al. (2007), basados en el análisis de investigaciones sobre la
base genética de las CC estimaron que las anormalidades cromosómicas se presentan en
8-13% de neonatos que nacen con CC. En contraste, de los niños nacidos con
anormalidades cromosómicas, al menos el 30% tiene un defecto congénito del corazón,
variando esta incidencia en la población general a casi el 100%, como en la trisomía 18.
Otros investigadores han reportado anormalidades cromosómicas en pacientes con CC
40
variando de 12-44% de los casos1/, por lo que concluyen que el análisis cromosómico se
debe de considerar en pacientes con defectos congénitos del corazón (Johnson, Hing,
Wood & Watson, 1997).
Los datos anteriores indican que el porcentaje de pacientes con anormalidades
cromosómicas observados en el estudio (3.13%, Cuadro 1) se mantuvo por debajo de las
estadísticas descritas en estudios sobre el componente citogenético en pacientes con CC.
Sin embargo, es importante destacar que los casos pediátricos de cardiopatía congénita
evaluados en el presente estudio fueron no sindrómicos y/o sin características
dismorfológicas que hubieran sugerido un síndrome cromosómico, lo que implicó una
selección cautelosa de pacientes desde la evaluación previa realizada por los médicos
cardiólogos de UNICAR. Este hecho se realizó con el fin de evitar obtener datos que son
de conocimiento general en investigación, como la asociación de CC con trisomías
autosómicas (Emerit, Grouchy, Vernant & Cronone, 1989). De lo contrario el número de
pacientes se hubiera triplicado y la información obtenida hubiera sido redundante.
4.2 Anormalidades Cromosómicas
La evidencia de un marcador cromosómico en el presente estudio, clasificado como
una anormalidad citogenética de tipo estructural, despierta inquietudes sobre su
influencia en el diagnóstico de CC del paciente debido a que no es una estructura
citogenética observada con frecuencia. Según la ISCN (2013) un marcador cromosómico
es un cromosoma estructuralmente anormal el cual no puede identificarse y caracterizarse
de manera inequívoca por técnicas de citogenética convencionales. Puede ser derivado
del rompimiento de un cromosoma con la pérdida de un fragmento acéntrico y la no
disyunción de su cromosoma homólogo durante la meiosis o, asimismo, pueden ser
isocromosomas o cromosomas normales con variaciones heteromorficas inusuales como
inversiones o presencia de cromatina extra (Sach, Van Hemel, Den Hollander & Jahoda,
1987; Taylor, Wolfinger, Brown & Chadwick, 1975; Richardson, 1997).
1/
Tomando en cuenta la citogenética molecular como el análisis de FISH.
41
En este caso, se logró evidenciar el marcador cromosómico en diferentes metafases,
adoptando diferentes formas y fragmentos, lo cual dio certeza que el fenómeno en
cuestión se mostraba de manera constitutiva (Fig. 1). Ahora bien, las implicaciones
médicas que conlleva la presencia de un marcador cromosómico en la constitución
genética de un individuo y su posible influencia en la causa de la CC del paciente
depende en gran parte de la información genética que contenga esta estructura. Por
ejemplo, actualmente se sabe que la significancia clínica de los marcadores
cromosómicos varía ampliamente ya que en algunas incidencias, la ocurrencia y
transmisión familiar de marcadores cromosómicos no ha producido efectos fenotípicos
significativos (Richardson, 1997). Por el contrario, Gocke, Murdaw, Zerres & Hansmann
(1986) reportaron un marcador metacéntrico identificado como un isocromosoma 18p
que produjo efectos clínicos severos en una familia. Nielsen et al., (1978) demostraron
que la presencia de marcadores influía en las familias dependiendo del tamaño y tipo de
herencia a través de la evaluación y análisis de 5 casos pediátricos.
Esta evidencia nos indica que la presencia del marcador cromosómico en el paciente
pediátrico del presente estudio pudo tener influencia en el diagnóstico de la anormalidad
cardíaca presentada (Cuadro 2), por el contrario existe otra posibilidad que involucra el
estado silencioso e inofensivo del marcador tanto en el paciente como su familia. En
términos citogenéticos este hallazgo representa un avance importante puesto que se puede
reportar esta estructura y dejar documentada su presencia y asociarla con la CC
presentada, sin embargo, la influencia genética de esta estructura se podría determinar
mediante un segundo análisis, involucrando un test de genes como (eg. Microarray) que
permitan determinar qué genes se están expresando y si alguno de ellos tiene relación con
alguna CC reportada hasta la fecha.
Por otra parte, en el estudio se evidenciaron pacientes con variaciones de segmentos
heterocromáticos y regiones satelitales (12.5%, Cuadro 1), dos fenómenos clasificados
como variaciones polimórficas o variantes heteromórficas (ISCN, 2013, Fig. 2). Según la
ISCN (2013) la variación en la longitud satelital y los rearreglos en los segmentos
heterocromáticos (compactación de cromatina) son características de la variación normal
42
cromosómica que ocurre naturalmente en estas estructuras. Aunque las variaciones
citogenéticas raramente tienen una significancia clínica, éstas pueden servir de referencia
para estudios de poblaciones (Bhasin, 2005) y el origen de ciertos cromosomas con
deleciones y translocaciones (Chen, Kao, Marks & Chen, 1981). Por esta razón, aún no
teniendo implicaciones clínicas, la evidencia de este tipo de rearreglos implica
información valiosa sobre las variaciones presentes en los pacientes evaluados y su
población de origen.
Dentro de este concepto, es importante reconocer la variación que existió en el sitio
22q11 en varias de las metafases evaluadas (Fig. 3), por lo que surge la inquietud sobre la
utilización de la citogenética molecular (FISH) y técnicas genéticas como microarreglo
de alta resolución en la determinación de mutaciones como deleciones crípticas que no
son perceptibles al ojo humano a través del microscopio. Esto podría evidenciar y asociar
este sitio con otras cardiopatías congénitas las cuales no tuvieron alguna asociación con
anormalidades cromosómicas en el presente estudio (Cuadro 2).
43
CONCLUSIONES
1. A través del análisis citogenético fue posible identificar, caracterizar y evaluar
anormalidades cromosómicas en 15.63% de los pacientes con diagnóstico
confirmado de cardiopatía congénita de UNICAR, evidenciando hallazgos
citogenéticos como marcadores cromosómicos, variaciones en segmentos
heterocromáticos y variaciones de longitud satelital.
2. Las anormalidades cromosómicas evidenciadas en el estudio se presentaron bajo
dos tipos de rearreglos cromosómicos: a) Anormalidades estructurales (3.13%), y
b) Variantes heteromórficas (12.5%). Estos hallazgos citogenéticos fueron
identificados en los cromosomas No. 5, 21 y 22 en las distintas metafases
evaluadas de los pacientes con diagnóstico confirmado de cardiopatía congénita
de UNICAR.
3. A partir de los datos generados en el estudio, se estableció la relación del
diagnóstico clínico-citogenético en la cardiopatía congénita denominada Ductus
Arterioso Persistente a través de la presencia constitutiva de un marcador
cromosómico en las distintas metafases evaluadas del paciente. Otras cardiopatías
congénitas presentaron hallazgos citogenéticos de tipo variante heteromórfica, los
cuales no fueron una referencia directa en las manifestaciones clínicas de la
enfermedad, por lo que no fue posible realizar la asociación en ellas.
4. Puesto que se evidenciaron variantes heteromórficas en el sitio 22q11 en
diferentes pacientes, el presente estudio propone a éste como un marcador
cromosómico candidato a estudios posteriores en la búsqueda de genes y
polimorfismos, a través de técnicas moleculares avanzadas como FISH, que
permitan reconocer anormalidades citogenéticas en pequeñas variaciones de la
estructura cromosómica. Esto permitirá asociar nuevas cardiopatías congénitas y
44
características clínicas con anormalidades citogenéticas asociadas a nivel
molecular.
5. En términos globales, la información evidenciada en el estudio sugiere que la
etiología de las cardiopatías congénitas en la población de estudio no es explicada
en su totalidad por un componente cromosómico en la técnica usada de análisis de
metafases de alto bandeo. Por lo pronto, desde el punto de vista biológico, es
importante considerar el componente genético a nivel molecular, donde las
mutaciones actúan de forma puntual y pueden explicar en alguna medida
(asociadas o no a factores ambientales) la etiología de las cardiopatías congénitas
en la población Guatemalteca.
6. A través de los resultados del presente estudio es posible reconocer el impacto e
importancia del estudio citogenético en la identificación de anormalidades
cromosómicas, variaciones polimórficas y reconocimiento de marcadores
cromosómicos para su estudio posterior a nivel molecular, por lo que es necesario
realizar mayor investigación concerniente a la etiología de las cardiopatías
congénitas involucrando la citogenética tradicional y molecular.
45
RECOMENDACIONES
1. Implementar la citogenética molecular en la identificación, caracterización y
evaluación de anormalidades cromosómicas en pacientes con diagnóstico
comprobado de cardiopatía congénita. Esta disposición mejoraría sustancialmente
la determinación de hallazgos citogenéticos de importancia clínica que aportarían
nuevos datos sobre la etiología de las cardiopatías congénitas en Guatemala.
2. Considerar las cardiopatías congénitas que presentaron una relación del
diagnóstico clínico-citogenético con variantes heteromórficas (e.g. Tetralogía de
Fallot, Estenosis Mitral Subvalvular, CIA ostium secundum, entre otras) en
futuros estudios de citogenética molecular para determinar si a través de esas
técnicas más sensibles se pueden asociar ambos campos de manera definitiva.
3. Considerar el sitio 22q11 como un marcador cromosómico a estudio posterior a
través de la citogenética molecular, especialmente la técnica de FISH que permite
identificar deleciones, translocasiones y otras alteraciones citogenéticas por medio
del principio de hibridización. Esto permitirá identificar con una mayor presición
las deleciones no visibles al ojo humano en microscopio y aportar datos valiosos
sobre la etiología de las cardiopatías congénitas en Guatemala.
4. En estudios citogenéticos futuros se recomienda obtener muestras de sangre
previo a cualquier tratamiento farmacológico asociado a cirugía o procedimiento
preventivo en los pacientes a evaluar, puesto que estos medicamentos pueden
intervenir en el crecimmiento celular, lo cual impide el análisis cromosómico.
46
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53
ANEXOS
Anexo 1
Fotografías de metafases analizadas de 32 pacientes con diagnostico comprobado de cardiopatía congenital de
la Unidad de Cirugía Cardiovascular de Guatemala –UNICAR– del proyecto FODECYT 10-2012.
Fotografía 1. Paciente CC-2. Metafase 46,XY.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 2. Paciente CC-3. Metafase 46,XX.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
54
Fotografía 3. Paciente CC-4. Metafase 46,XY.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 4. Paciente CC-5. Metafase 46,XX,5qh+
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
55
Fotografía 5. Paciente CC-6. Metafase 46,XX.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 6. Paciente CC-7. Metafase 46,XX.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
56
Fotografía 7. Paciente CC-8. Metafase 46,XY.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 8. Paciente CC-9. Metafase 46,XY.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
57
Fotografía 9. Paciente CC-10. Metafase 46,XY, 21ps+, 22ps+
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 10. Paciente CC-11. Metafase 46,XY.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
58
Fotografía 11. Paciente CC-12. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 12. Paciente CC-13. Metafase 46,XY.
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
59
Fotografía 13. Paciente CC-14. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 14. Paciente CC-15. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
60
Fotografía 15. Paciente CC-16. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 16. Paciente CC-17. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
61
Fotografía 17. Paciente CC-18. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 18. Paciente CC-19. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
62
Fotografía 19. Paciente CC-20. Metafase 46,XX, 22ps+
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 20. Paciente CC-21. Metafase 46,XY, +mar
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
63
Fotografía 21. Paciente CC-22. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 22. Paciente CC-23. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
64
Fotografía 23. Paciente CC-24. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 24. Paciente CC-25. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
65
Fotografía 25. Paciente CC-26. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 26. Paciente CC-27. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
66
Fotografía 27. Paciente CC-28. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 28. Paciente CC-29. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
67
Fotografía 29. Paciente CC-30. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 30. Paciente CC-31. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
68
Fotografía 31. Paciente CC-32. Metafase 46,XY
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
Fotografía 32. Paciente CC-33. Metafase 46,XX
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
69
Anexo 2
Consentimiento informado utilizado para el proceso de inclusion de pacientes del proeyecto FODECYT
10-2012, aprobado por el Comité de Bioética del Ministerio de Salud de Guatemala.
Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas
–INVEGEM–
Consentimiento informado para pruebas citogenéticas
Título:
Caracterización e identificación de anormalidades cromosómicas en niños con diagnóstico comprobado de
cardiopatía congénita
Investigadores:
Lic. Allan Urbizo
Laboratorio de Citogenética
Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM–
Gabriel Silva, MD., M.Sc.
Director Científico
Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM–
El presente documento es un consentimiento informado que le brindará a usted y su familia información
importante sobre el presente estudio. Puede que el documento contenga palabras que usted no entienda. Por
favor pregunte al investigador encargado o a cualquier personal del estudio para que le explique cualquier
palabra o información que usted no comprenda claramente. Usted puede llevarse a su casa una copia de
este consentimiento informado para pensar sobre este estudio o para discutir con su familia o amigos antes
de tomar la decisión de participar o no en el.
INTRODUCCIÓN
Su hijo o niño en custodia ha sido invitado a participar en un estudio de investigación. Antes de que usted
decida dejarlo participar en el estudio por favor lea este consentimiento informado cuidadosamente. Haga
todas las preguntas que usted tenga, para asegurarse de que entienda los procedimientos del estudio,
incluyendo los riesgos y los beneficios.
PROPOSITO DEL ESTUDIO
El propósito del presente estudio es identificar la existencia de anormalidades cromosómicas en niños con
diagnóstico confirmado de cardiopatía congénita del Departamento de Pediatría de UNICAR-Fundación
Aldo Castañeda. Esto con el fin de entender las causas genéticas que están asociadas a las cardiopatías
congénitas y conocer los riesgos de le enfermedad. Esta información será útil para el proceso de prevención
y guía hacia el tratamiento adecuado de la enfermedad, a través del consejo genético.
70
PARTICIPANTES
Criterios de Inclusión




Niños con diagnóstico ecocardiográfico de CC candidatos a cirugía cardíaca del Departamento de
Pediatría de UNICAR-Fundación Aldo Castañeda.
Pacientes originarios y residentes del área rural y del área urbana de la Republica de Guatemala.
Niños y niñas comprendidos entre recién nacidos (RN) hasta 12 años.
Pacientes con cardiopatías congénitas no asociadas con síndromes genéticos específicos.
Criterios de Exclusión




Pacientes que hayan sido estudiados previamente con test de cromosomas o test de genes.
Pacientes que no sean originarios y residentes de Guatemala.
Pacientes comprendidos entre las edades de 13 años en adelante.
Pacientes con cardiopatías asociadas con síndromes genéticos específicos ya diagnosticados
clínicamente y-o comprobados con test de genes.
Con el fin de identificar la existencia de anormalidades cromosómicas en niños con diagnóstico confirmado
de cardiopatía congénita, el presente estudio requiere la participación de su hijo o niño en custodia, ya que
éste reúne los criterios de inclusión para colaborar con el estudio. La participación de su hijo o niño en
custodia es completamente voluntaria. Su hijo o niño en custodia puede abandonar el estudio en
cualquier momento sin ser penalizado.
PROCEDIMIENTOS
Puesto que su hijo o niño en custodia fue diagnosticado con algún tipo de cardiopatía congénita y es
candidato a una cirugía cardíaca, a éste, al momento de su ingreso a la sala de operaciones, se le deberá
extraer sangre como parte de los procedimientos de rutina que se realizan previo a la intervención
quirúrgica en UNICAR. Para el análisis citogenético (estudio de los cromosomas) del presente estudio, se
requiere la obtención de 3 a 4ml de sangre periférica del paciente pediátrico, los cuales serán obtenidos del
mismo catéter central colocado para la extracción de sangre requerida como parte de los procedimientos de
rutina de la sala de operaciones. Esto evitará la colocación de un nuevo catéter al paciente pediátrico para la
extracción de sangre para el estudio y minimizará el riesgo del paciente en el presente estudio. La muestra
de sangre será trasladada al Laboratorio de Citogenética de INVEGEM en donde se realizará el análisis
cromosómico.
RIESGOS
Ninguno.
BENEFICIOS
Es probable que su hijo o niño en custodia no reciba ningún beneficio personal por participar en este
estudio, en caso de no encontrarle alguna anormalidad cromosómica. Sin embargo, en caso de encontrarse
una anormalidad cromosómica, éste y su familia serán referidos a la Clínica de Cardiogenética de UNICAR
con el Dr. Gabriel Silva, médico genetista pediátrico, quien realizará el consejo genético sin costo alguno.
Sin importar el hallazgo o no de anormalidades cromosómicas en el niño, se hará entrega de una copia de
los resultados a los familiares como evidencia del análisis efectuado en el estudio.
PARTICIPACIÓN Y RETIRO VOLUNTARIOS
La participación de su hijo o niño en custodia en este estudio es voluntaria. Usted puede decidir su
participación o retirarlo del estudio en cualquier momento. La decisión suya no resultará en ninguna
71
penalidad. De ser necesario, la participación del niño en este estudio puede ser detenida en cualquier
momento por el investigador del estudio o por el patrocinador sin su consentimiento.
PREGUNTAS
Si tiene alguna pregunta sobre este estudio o sobre la participación de su hijo o niño en custodia en el
mismo, usted puede contactar a:
Lic. Allan Urbizo
Laboratorio de Citogenética
Instituto de Investigación sobre Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM–
Teléfono: (502) 4579-1792
E-mail: [email protected]
No firme este consentimiento a menos que usted haya tenido la oportunidad de hacer preguntas y recibir
contestaciones satisfactorias para todas sus preguntas.
Si usted firma aceptando la participación de su hijo o niño en custodia en este estudio, recibirá una copia
firmada, con el sello de aprobación de INVEGEM y con la fecha de esta hoja de consentimiento para usted.
72
CONSENTIMIENTO
Yo,
______________________________
(nombre
y
apellidos)
con
cédula
de
vecindad
_______________después de haber sido informado personalmente de los procedimientos que se utilizarán
para establecer el diagnóstico, autorizo que se le realicen la prueba citogenética a mi hijo(a)
___________________________________ .
Fecha:
___________________________________
Firma de los padres y/o responsables:
___________________________________
Sello de la institución
Firma del médico
____________________________________
FUENTE: PROYECTO FODECYT 10-2012
73
Anexo 3
Técnica de Bandeo con Giemsa
FUENTE: Gersen & Keagle, 2005.
74
PARTE IV
INFORME FINANCIERO
AD-R-0013
FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA
LINEA:
FODECYT
"Identificación, caracterización y evaluación de anormalidades cromosómicas en niños con
Nombre del Proyecto:
diagnóstico comprobado de cardiopatía congénita"
010-2012
Numero del Proyecto:
Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto:
Monto Autorizado:
Plazo en meses
Fecha de Inicio y Finalización:
Grupo
Renglon
Nombre del Gasto
LIC. ALLAN ESTUARDO URBIZO HERRERA
Q74.250,00
Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):
12 meses
02/04/2012 al 31/03/2013
PRORROGA AL 31/7/2013
TRANSFERENCIA
Asignacion
Pendiente de
Menos (-)
Ejecutado
Mas (+)
Ejecutar
Presupuestaria
SERVICIOS NO PERSONALES
1
122
181
189
2
261
266
272
292
295
3
323
Impresión, encuadernación y reproducción
Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad
Otros estudios y/o servicios (Evaluación externa
de impacto)
MATERIALES Y SUMINISTROS
Elementos y compuestos químicos
Productos medicinales y farmaceúticos
Productos de vidrio
Útiles de limpieza y productos sanitarios
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio
PROPIEDAD,
PLANTA,
EQUIPO E
INTANGIBLES
Equipo médico-sanitario y de laboratorio
MONTO AUTORIZADO
(-) EJECUTADO
SUBTOTAL
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR
Q
Q
1.000,00
30.000,00
Q
8.000,00
Q
Q
Q
Q
Q
20.000,00
6.500,00 Q
600,00
150,00
Q
30.000,00
6.500,00 Q
26.473,92
Q
310,50
6.500,00
Q
Q
1.000,00
-
Q
8.000,00
Q
Q
Q
Q
26,08
289,50
150,00
Q
31,98
Q
4.000,00
Q
3.968,02
Q
4.000,00
Q
3.818,00
Q
182,00
Q
74.250,00
Q
64.570,44
Q
9.679,56
Q
Q
Q
Q
Q
74.250,00
64.570,44
9.679,56
9.679,56
Disponibilidad
Q
9.679,56
Q
6.500,00
Q
6.500,00
75