monitoreo del potencial de membrana vesicular mediante un

Profesor Patrocinante
Dr. Sebastian Brauchi Ulloa
Instituto de Fisiología
Facultad de Medicina
MONITOREO DEL POTENCIAL DE MEMBRANA VESICULAR
MEDIANTE UN SISTEMA
HIBRIDO ENTRE PROTEÍNAS FLUORESCENTES Y
MOLÉCULAS SINTÉTICAS
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
Juan Pablo Vivar Casas
VALDIVIA – CHILE
2013
INDICE GENERAL
Resumen …………………………………………………………………………………….
1
Summary ……………………………………………………………………………………
2
Introducción ………………………………………………………………………………..
3
Sinapsis Química ………………………………………………………………………..
3
Anatomía vesicular ……………………………………………………………………..
5
Mecanismos de fusión vesicular ……………………………………………………….
10
Potencial de membrana …………………………………………………………………
12
Circuito equivalente de membrana …………………………………………………….
13
Comportamiento eléctrico de las vesículas sinápticas …………………………..……
16
Fluorescencia …………………………………………………………………………….
22
Reflexión total interna de la fluorescencia …………………………………………….
24
Transferencia de energía resonante ……………………………………………………
26
Propuesta metodológica …………………………………………………………………
28
Hipótesis …………………………………………………………………………………….
33
Objetivo general .....…………………………………………………………………………
34
Objetivos específicos…………………………………………………………………………
35
Materiales …………………………………………………………………………………..
36
Métodos ……………………………………………………………………………………..
39
Resultados ………………………………………………………………………………….
43
Discusión ……………………………………………………………………………………
62
Bibliografía …………………………………………………………………………………
69
INDICE DE FIGURAS
Figura 1
.…………………………………………………………………………………
6
Figura 2
………………………………………………………………………………… .
11
Figura 3
………………………………………………………………………………… .
14
Figura 4
………………………………………………………………………………… .
17
Figura 5
………………………………………………………………………………… .
19
Figura 6
………………………………………………………………………………… .
21
Figura 7
………………………………………………………………………………… .
23
Figura 8
………………………………………………………………………………… .
25
Figura 9
……………………………………………………………………………… ….
27
Figura 10
…………………………………………………………………………………..
30
Figura 11
…………………………………………………………………………………..
44
Figura 12
…………………………………………………………………………………..
46
Figura 13
…………………………………………………………………………………..
48
Figura 14
…………………………………………………………………………………..
50
Figura 15
…………………………………………………………………………………..
52
Figura 16
………………………………………………………………………………….
54
Figura 17
………………………………………………………………………………….
56
Figura 18
………………………………………………………………………………….
58
Figura 19
………………………………………………………………………………….
60
Figura 20
………………………………………………………………………………….
67
INDICE DE TABLAS
Tabla I. TRANSPORTADORES VESICULARES
………………..…………………..
9
LISTADO DE ABREVIATURAS
FRET
Förster Resonance Energy Transfer (Transferencia de Energía Resonante
de Förster)
GFP
Green Fluorescent Protein (Proteína Fluorescente Verde)
dpa
Dipicrilamina
VAChT
Vesicular Acetylchiline Transporter (Transportador de acetilcolina
vesicular)
TIRF
Total Internal Reflection Fluorescence (Reflexión Total Interna de la
Fluorescencia)
1
RESUMEN
Las vesículas sinápticas son los organelos encargados de la movilización intracelular de
neurotransmisores los que finalmente son liberados a la hendidura sináptica mediando la sinapsis
química. Estas estructuras están definidas por una membrana lipídica que contiene diferentes
clases de proteínas incluyendo una ATPasa vesicular, transportadores y canales de iones. Al igual
que la membrana plasmática, la membrana vesicular puede ser considerada un capacitor que
acumula cierta cantidad de carga en respuesta a un cambio de potencial eléctrico. Este potencial
de transmembrana es establecido por un desbalance de iones a ambos lados de la bicapa lipídica.
La contribución de diferentes conductancias al potencial de membrana vesicular ha sido sugerida
pero no descrita en detalle, en parte, debido a las limitaciones técnicas para acceder a esta escala.
Este trabajo consiste en la adaptación de una metodología inicialmente descrita en membrana
plasmática, para evaluar cambios en el potencial eléctrico de vesículas sinápticas aisladas.
El sistema de registro se basa en el fenómeno de transferencia de energía por resonancia (FRET)
entre dos moléculas: una proteína fluorescente verde (GFP) expresada en forma de proteína de
fusión y dirigida a la membrana vesicular de elección y el ión hidrófobo dipicrilamina (dpa) el
cual se particiona en la bicapa lipídica y que es capaz de responder a cambios de voltaje
movilizándose hacia el lado positivo de la bicapa. De esta forma, toda vez que dpa se encuentre
en la cercanía de la molécula de GFP, la fluorescencia de esta última disminuirá
proporcionalmente con la distancia. El sistema implementado es capaz de monitorear el
comportamiento eléctrico de estructuras subcelulares mediante variaciones en la señal de
fluorescencia.
2
SUMMARY
Synaptic Vesicles are organelles in charge of intracellular mobilization of neurotransmitters
which are ultimately liberated to the synaptic cleft mediating the chemical synapse. These
structures are defined by a lipidic membrane containing a variety of proteins including a vesicular
ATPase, transporters and ion channels. Like the plasma membrane, the vesicular membrane may
be considered as an electric capacitor able to accumulate charge in response to a change in the
electric potential. The transmembrane potential is set by the imbalance of ionic species on both
sides of the lipid bilayer. The contribution of different conductances to the vesicular membrane
potential has been suggested but not described in detail, in part, due the technical limitations to
access at this scale.
This work consists in the adaptation of a methodology, initially described in plasmatic
membrane, which allows the evaluation of changes in the electric potential of isolated synaptic
vesicles. The recording system is based on the phenomenon of resonance energy transfer (FRET)
between the two components that are involved: a green fluorescent protein (GFP) expres in the
vesicular membrane and the hydrophobic ion dipicrylamine (dpa) which responds to changes in
voltage travelling to the positive side of the bilayer. Thus, it is possible to reinterpret the electric
behavior of subcellular structures by variations of a fluorescence signal.
3
INTRODUCCION
Sinapsis Química.
Corresponde a un sistema de intercambio de información entre células del sistema nervioso. Para
que este ocurra es necesario la participación de neuronas pre- y post- sinápticas donde el mensaje
o neurotransmisor, es entregado desde la primera a la segunda atravesando el espacio sináptico
(Südhof, 1995).
Las vesículas sinápticas son estructuras capaces de contener a los neurotransmisores y ponerlos a
disposición en cada evento exocítico (Rizo y Rosenmund 2009). Estas vesículas cumplen un ciclo
de uso (Südhof, 2004). Una vez cargadas con neurotransmisores se alojan en la llamada zona
activa, circundante a la membrana pre-sináptica y lugar donde ocurre el contacto inicial entre las
membranas vesicular y plasmática (acoplamiento o docking). Luego, las vesículas sufren un
proceso de maduración en el que transitan por dos estadios, el primero dependiente de ATP
(priming), en el cual las membranas vesiculares y plasmáticas se deforman permitiendo en una
segunda etapa (dependiente de calcio) que las membranas se fusionen. El aumento de calcio
intracelular ([Ca+2]i) necesario para producir este evento de fusión es ocasionado por la llegada de
un potencial de acción a la terminal pre-sináptica, lo que ocasiona un aumento de la probabilidad
de apertura de los canales de calcio voltaje dependiente (Cav). El subsecuente influjo de Ca +2
determina el inicio de la exocitosis (Chad y Eckert 1984). Terminada la descarga de
neurotransmisores, las vesículas vacías son recicladas para su posterior acidificación y re
utilización mediante un proceso endocítico. Para el caso de fusiones completas, el reciclamiento
involucra la incorporación de un manto de moléculas de clatrina sobre su membrana (P. Holroyd
et al., 2002), pasando por un estadío de fusión con endosomas tempranos, para concluir con la
acumulación de neurotransmisores en las vesículas vía un mecanismo ATP dependiente
4
(Johnson, 1987). Alternativamente, las vesículas pueden ser recicladas íntegramente cuando su
fusión no es completa, éste es el caso de vesículas en modos kiss-and-run o kiss-and-linger.
Finalmente las vesículas se dirigen de nuevo hacia la zona activa.
5
Anatomía vesicular.
La caracterización proteica de estos pequeños organelos (30-50 nm) es relativamente sencilla
(Südhof, 1995). Los polipéptidos vesiculares pueden dividirse en dos categorías (Digiovanni et
al., 2012):
1) Proteínas involucradas en la regulación del tráfico vesicular.
La exocitosis puede considerarse como un proceso de fusión de membranas (Rizo y Rosenmund
2009). Para esto se requiere de la acción de una serie de proteínas de andamio altamente
conservadas, denominadas SNARE (receptora de SNAP), complejo proteico que gobierna casi
todos los tipos de tráfico donde participan las membranas celulares. La interacción entre estas
proteínas de andamio tiene por objeto primero el reconocimiento de membranas celulares y
puntos de fusión y segundo proveer herramientas moleculares que permitan la deformación de las
membranas en contacto para promover la reacción de fusión, la que es altamente costosa en
términos energéticos. Los polipéptidos insertos en la membrana vesicular son catalogados como
v-SNARE
(e.g.
sinaptobrevina
(VAMP):
vesicular
associated
membrane
protein;
sinaptotagmina); y aquellos insertos en la membrana target como t-SNARE (e.g. sintaxina-1 y
SNAP-25, proteínas integrales de membrana plasmática) (Carr y Munson 2007) (Figura 1).
6
Figura 1. Proteínas requeridas para la liberación de neurotransmisores inducida por Ca +2. (A)
Complejo SNARE y estructura de la proteína sinaptotagmina con sus respectivos dominios C 2A y
C2B que acomplejan dos y tres iones calcio respectivamente. (B) Complexina se une al complejo
SNARE.
Carr y Munson 2007. “Tag team action at the synapse”.
7
El macro complejo SNARE se conforma por la interacción entre VAMP con sintaxina-1 y
SNAP-25 en la membrana plasmática. Sus hélices se disponen para favorecer la formación del
complejo y una vez ensamblado, proteínas conocidas como complexinas se asocian a él para
mantener a la vesícula en un estado de docking inhibiendo la fusión prematura (Carr y Munson
2007) (Rizo y Rosenmund 2009). Sinaptotagmina también se une al ensamble y para cuando un
potencial de acción alcanza la terminal y la [Ca +2]i aumenta, es la encargada de acomplejar a este
catión manteniéndose además asociada a las membranas. Esto produce la disociación de
complexina dando paso a la formación del poro de fusión y la consecuente liberación de
neurotransmisores.
Durante el desarrollo de este trabajo se utilizó la proteína sinaptofisina como marcador debido a
que es el polipéptido con mayor presencia en la membrana de las vesículas sinápticas,
correspondiendo aproximadamente al 10% de la masa proteica vesicular, con unas 32 copias
distribuidas en la membrana de este organelo. Respecto a su función, se ha descrito que
sinaptofisina estaría participando en la coordinación del proceso de endocitosis de las vesículas
sinápticas, determinando la cinética de reciclamiento de estas estructuras (Kwon y Chapman
2011). Sumado a esto, sinaptofisina también estaría controlando el targeting de VAMP2 a la
membrana vesicular participando de igual forma en el proceso de exocitosis, regulando la
interacción de esta proteína con otros polipéptidos del complejo SNARE (Bonanomi et al., 2007).
2) Proteínas participantes en el transporte a través de la membrana vesicular.
La incorporación de neurotransmisores se sostiene en el funcionamiento de proteínas
transportadoras que en conjunto con canales iónicos y una ATPasa vesicular,
aseguran la
8
concentración de estos en el lumen (Liu y Edwards 1990) manteniendo también el equilibrio
iónico en la vesícula y un pH alrededor de 5.6 (Johnson, 1987) (Ahnert-Hilger et al., 2003).
En cuanto a los transportadores existen al menos siete tipos específicos con diferentes afinidades
por sus moléculas o neurotransmisores sustrato y que no necesariamente están presentes en una
misma vesícula (ver Tabla I) (Ahnert-Hilger et al., 2003) (Takamori et al., 2006).
9
Tabla I.
TRANSPORTADORES VESICULARES
Nombre
Abreviación
Función
Transportador de Glutamato
Vesicular 1
VGLUT1
Transporte de neurotransmisores
Transportador de Glutamato
Vesicular 2
VGLUT2
Transporte de neurotransmisores
Transportador de Glutamato
Vesicular 3
VGLUT3
Transporte de neurotransmisores
Transportador Vesicular de GABA
VGAT
Transporte de neurotransmisores
Transportador de monoamina
vesicular 2
VMAT2
Transporte de neurotransmisores
Transportador de acetilcolina
vesicular
VACHT
Transporte de neurotransmisores
ATPasa vesicular
V-ATPasa
Mantención de gradiente electroquímico
y control de pH vesicular
Transportador de aminofosgolípidos
-
Transporte lipídico
Glicoproteína Vesicular
SV-2 (a-c)
Unión a sinaptotagmina, posible
transporte de Cl-
10
Mecanismos de fusión vesicular.
Actualmente existen al menos tres modelos de fusión vesicular. Si bien estas variantes involucran
escalas temporales diferentes, pueden incluso coexistir dentro de una misma célula o durante el
mismo esquema sináptico (Valtorta et al., 2001).
El modelo clásico de descarga de neurotransmisores apunta a un evento “todo o nada”, donde la
liberación se produce mediante la fusión total de las membranas y la recuperación del organelo
mediante un manto de moléculas de clatrina (Rahamimoff y Fernandez 1997). La cantidad de
neurotransmisor contenido en una vesícula lleva el nombre de “quanta” y puede ser calculado
mediante distintas aproximaciones experimentales (Rahamimoff y Fernandez 1997) (Valtorta et
al., 2001) (Fatt y Katz 1952).
El mecanismo de kiss and run propone la existencia de un poro de fusión cuya abertura expone el
lumen vesicular a la hendidura sináptica y la liberación de neurotransmisores es seguida por el
reciclaje completo del organelo intacto (Alvarez de Toledo 1993 et al., 1993).
Un tercer modelo postula que las vesículas permanecen detenidas en la zona de liberación cuando
el poro de fusión se consolida, permaneciendo durante más tiempo que en el proceso de kiss and
run (Ryan 2003). En este fenómeno denominado pinch fuse and linger, participa la GTPasa
dinamina que estaría regulando el cierre del poro y la reconformación de la vesícula (Holroyd et
al., 2002) (Figura 2).
11
Figura 2. Tres tipos de mecanismos de fusión y recuperación de componentes membranosos
pueden coexistir en vesículas secretorias. (Arriba) Mecanismo clásico. Se produce una mezcla de
las membranas vesicular y plasmática. (Al centro) Mecanismo que involucra la acción de la
GTPasa dinamina en la fisión de la vesícula y su posterior recuperación. (Abajo) El evento de
fusión finaliza con un cierre directo del poro.
Ryan 2003. “The life and times of a neurosecretory granule”.
12
Potencial de membrana.
En las células eucariontes, las membranas biológicas cumplen roles diversos. Los lípidos actúan
como un separador de compartimentos que difieren en su constitución bioquímica por lo que las
membranas biológicas establecen y mantienen una composición iónica diferente en los medios
que aíslan, inequidad que ocasiona una diferencia de potencial eléctrico (ΔV) (Latorre, R.,
López-Barneo, J., Bezanilla, F and Llinás, R.
(1996). Biofísica y Biología Celular). Este
potencial transmembrana es cero en la ausencia de poros o canales conductores abiertos, pero si
la condición de este equilibrio electroquímico se perturba, mediante la apertura de poros
selectivos, esta se traduce en un flujo de moléculas con carga a través de la membrana de acuerdo
a su gradiente electroquímico, produciendo una separación de cargas y estableciendo finalmente
un potencial eléctrico transmembrana. Esta es la base de la generación del potencial de reposo
celular.
Este flujo de iones genera una corriente (I) (medida en amperes (A)) pues se involucra el
movimiento de cargas eléctricas (C) en el tiempo (s):
(ec.1)
Ambos parámetros, potencial y corriente, pueden ser medidos utilizando equipamiento
electrofisiológico (The Axon Guide, Molecular Devices, www.whitney.ufl.edu).
13
Circuito equivalente de membrana (Bio-circuito).
La estructura y composición de una bicapa lipídica se asemeja a la arquitectura de un circuito
electrónico simple. La membrana puede ser representada como un capacitor polarizable o
condensador que almacena carga eléctrica (Q) al existir una diferencia de potencial (ΔV) entre
sus extremos (ec. 2)
Δ
(ec.2)
Entonces, el establecimiento de un potencial transmembrana también supone la polarización de
este.
Los medios de composición y concentraciones iónicas desiguales equivalen a las partes
conductoras del condensador, así como la bicapa corresponde al material dieléctrico o no
conductor, propiedad que radica en su naturaleza hidrófoba (Hille, B. (2001). Ion Channels of
Excitable Membranes). En consecuencia, la Capacitancia (C) (en Faradios, F), es una magnitud
que da cuenta de la habilidad de un sistema de almacenar carga eléctrica y depende de la
constante dieléctrica del material aislante y de la geometría de las placas conductoras (Hille, B.
(2001). Ion Channels of Excitable Membranes)
En este escenario, las macromoléculas representativas de las membranas pueden asociarse a
elementos electrónicos específicos (Figura 3).
14
Figura 3. Representación de membrana como un circuito. Las membranas biológicas se
comportan eléctricamente similares a una capacitancia (lípidos) conectada en paralelo a una
resistencia (canal iónico). Este último es representado como una conductancia debido al rol que
juega en la membrana.
The Axon Guide. A Guide to Electrophysiology and Biophysics Laboratory Techniques,
15
Según (ec.2), una carga es almacenada en un condensador solo cuando existe una diferencia de
potencial a lo largo de éste. Si hacemos circular una corriente I, es posible afirmar que esta es
proporcional al cambio de voltaje en el tiempo (ec.3)
(ec.3)
Así, cualquier cambio de potencial en las membranas biológicas está acompañado de una
variación en la cantidad de carga almacenada (The Axon Guide, Molecular Devices,
www.whitney.ufl.edu).
Entonces, todos los fenómenos electrofisiológicos pueden considerarse equivalentes a los
observados en los circuitos eléctricos pues responden a las mismas leyes físicas (Hille, B. (2001).
Ion Channels of Excitable Membranes). Una de las más importantes corresponde a la ley de
Ohm, la que describe una relación lineal entre corriente y voltaje, de la cual se puede calcular una
resistencia, y por extensión una conductancia.
Formalmente, la conductancia (medida en siemens, S) es definida como la medición de corriente
entre dos puntos. Además, la diferencia de potencial es definida también como la fuerza necesaria
para mover una carga puntual de un lugar a otro. Por consiguiente, la corriente es igual al
producto de la conductancia (g) y la diferencia de voltaje (E) a lo largo del conductor (ec.4).
I = gE (ec.4)
La relectura biológica de la ley de Ohm es importante pues cada canal iónico es considerado un
elemento conductor inmerso en un material aislante, donde la conductancia total es la sumatoria
de todas las conductancias que cruzan la membrana y que reflejan cuántos canales permiten el
paso de iones y cuántos son movilizados a través de ellos (Hille, B. (2001). Ion Channels of
Excitable Membranes).
16
En estos términos, la permeabilidad de la membrana a un ion en particular determinará el
potencial eléctrico debido a la distribución de la especie iónica y el establecimiento de la
condición de equilibrio. Este estado puede expresarse mediante la ecuación de Nernst (ec. 5):
ln
(5)
Según esta relación, el potencial eléctrico es equivalente al potencial de equilibrio que
experimenta un ion en una membrana semi permeable, variando de forma logarítmica al radio de
las concentraciones de este a ambos lados de la bicapa (outside, inside) y de forma lineal a la
temperatura (Hille, B. (2001). Ion Channels of Excitable Membranes).
Por lo general los sistemas fisiológicos involucran la intervención de más de una especie iónica
para mantener su funcionamiento, por lo que la estructura lipídica debe contener proteínas
permeables a más iones. La ecuación de Goldman-Hodgkin y Katz da cuenta del valor del
potencial de equilibrio cuando más de un ion contribuye a él (Hodgkin y Huxley 1952)
Comportamiento eléctrico de las vesículas sinápticas.
El almacenaje y liberación de neurotransmisores es una operación coordinada y supeditada al
carácter eléctrico de las vesículas sinápticas. Los eventos exocíticos involucran por ejemplo un
aumento en la capacitancia de la membrana plasmática (Gillespie 1979); suceso precedido por la
aparición de una corriente iónica indicadora del establecimiento del poro de fusión y (Fernandez
y Gomperts 1984) cuyo registro revela una conductancia inicial de 230 pS
(Breckenridge y Almers 1987).
(Figura 4)
17
Figura 4. Actividad eléctrica en una membrana de mastocito. Las líneas gruesas indican la
corriente medida mediante patch clamp (configuración célula completa), mientras que los trazos
verticales señalan los valores de capacitancia asociados (pF). Se registró la corriente de una
membrana mantenida a +10mV. El registro evidencia unas espigas de corriente que indicarían la
apertura del poro conductor y el aumento de capacitancia asociado por la llegada de la vesícula a
la membrana.
Breckenridge y Almers 1987. “Currents through the fusion pore that forms during exocytosis of a
secretory vesicle”.
18
En otra arista, la incorporación de moléculas neurotransmisor al lumen vesicular necesita de una
gradiente de protones. Esta gradiente se genera a través del actuar de una ATPasa residente en la
membrana vesicular, la que determina el movimiento vectorial de protones (H+) mediante la
hidrólisis de ATP. Así entonces, condiciona la eficiencia del transporte de neurotransmisor que
está asociado al mantenimiento de este gradiente electroquímico (Luqmani 1981).
La bomba de protones corresponde a un agente clave en la arquitectura eléctrica de la membrana
vesicular (Johnson 1987)
(ec. 6)
Según (ec.6), en la vesícula el potencial electroquímico (
contribuciones del potencial eléctrico transmembrana (
) está determinado por las
y del gradiente de pH (
, de esta
forma se mantiene una diferencia del potencial electroquímico de aproximadamente 180 mV
(calculado para vesículas secretoras) que otorga la energía potencial necesaria para realizar el
transporte de sustrato hacía el lumen (Johnson 1987). Este gradiente electroquímico, se disipa y
regenera en cada ciclo de exo y endocitosis condicionando así también la acidificación de la
vesícula (Edwards 2007)
El proceso de acidificación se ve incrementado en presencia de Cloruro (Cl-), ion que ocasiona la
disipación del potencial eléctrico (Edwards 2007) y el encargado de mantener el balance de carga
asociado a la incorporación de protones (Figura 5) (Ahnert-hilger y Jahn 2011). Para que esto
ocurra deben existir proteínas vesiculares que aumenten la permeabilidad de Cl-. Investigaciones
previas han demostrado la existencia de proteínas que conducen cloruro en la membrana de la
vesícula denominados inicialmente como canales CLC, donde CLC-3 corresponde a la isoforma
predominante en la membrana vesicular.
19
Figura 5. Transporte de moléculas neurotransmisibles en la membrana vesicular. La ATPasa
produce el gradiente electroquímico de H+ que conduce a la incorporación de neurotransmisores
en el lumen. En todos los casos el movimiento de H+ en una dirección está acoplado al
movimiento de soluto en el sentido contrario pero para ciertos transportadores (en rojo), el
movimiento está supeditado mayoritariamente o al gradiente químico
transporte de monoaminas y acetilcolina o al potencial eléctrico como
como en el caso del
en el caso del
glutamato. Esto debido a la cantidad de cargas involucradas al movilizar estos neurotransmisores
desde el citosol al lumen. La carga de GABA involucra el igual movimiento de cargas y H +
haciéndolo dependiente tanto de
como de
Edwards 2007. “The neurotransmitter cycle and quantal size”.
20
Actualmente son considerados sistemas antiport que intercambian Cl - por H+ manteniendo el
gradiente de pH en estructuras vesiculares específicas (Edwards 2007).
La existencia de canales vesiculares no solo involucra la expresión de sistemas conductores de
aniones como Cl-. Existen también canales catiónicos no selectivos insertos en la membrana,
algunos de ellos voltaje dependiente y cuya participación puede desenvolverse en cualquier
estadío del tránsito donde las vesículas están expuestas a campos eléctricos variables (AhdutHacohen et al., 2004).
La hipótesis de la resina de intercambio trata de explicar el rol de aquellos canales catiónicos no
selectivos. Su propuesta declara que los gránulos secretorios contienen una matriz interna que
funciona como una resina de intercambio iónico, donde la concentración libre de
neurotransmisores requiere del accionar de contraiones que mantengan las propiedades luminales
electroneutras al producirse la descarga (Uvnas y Aborg 1983). En el caso de moléculas cargo
positivas como acetilcolina (ACh), la matriz debería ser de naturaleza negativa debido a la
contribución de proteoglicanos y otros biopolímeros, luego, cuando se produzca el contacto entre
las membranas, el potencial vesicular y plasmático serán equivalentes. Este cambio de potencial
debería ser suficiente para aumentar la probabilidad de apertura de los canales voltaje
dependientes ubicados en la membrana vesicular, permitiendo el flujo cationes necesarios para el
intercambio de cargas, ayudando así a la liberación de moléculas (Rahamimoff y Fernandez
1997) (Meir et al., 1999) (Figura 6).
21
Figura 6. Mecanismo hipotético de la liberación de productos neurotransmisibles mediada por el
intercambio de iones.
(A) Las cargas negativas de la matriz son compensadas por un número igual de productos
secretorios con carga positiva. La liberación mediada por intercambio iónico implica la permuta
de un catión existente (en rojo) por uno nuevo (en azul). La apertura de un poro de fusión
desencadena un flujo de iones desde dos fuentes: (B) a través de la membrana del gránulo y (C) a
mediante el poro de fusión.
(B) El flujo de contraiones a través de la membrana del gránulo está regulado por proteínas que
actúan como bombas (círculo en verde) o por canales iónicos (cilindros en gris).
(C) El flujo de contraiones a través del poro de fusión es controlado por su tamaño y por las
propiedades de la interfaz de este mismo.
Rahamimoff y Fernandez 1997. “Pre- and postfusion regulation of transmitter release”.
22
Fluorescencia.
La fluorescencia corresponde a la emisión de radiación electromagnética en una escala de tiempo
muy corta (108 s-1), ocurre típicamente en moléculas aromáticas y es posible representarla en un
diagrama de distribución de energía (o de Jablonski) que ilustre los estados electrónicos de la
molécula o fluoroforo y las transiciones que pueden ocurrir entre ellos (Figura 7).
23
Figura 7. Diagrama de Jablonski. Se esquematizan los niveles de energía que pueden ocupar los
electrones: basal (S0) y estados excitados (S1, S2) y la escala temporal de las transiciones
energéticas.
Lakowicz. J.R. (2006). Third Edition
24
Según este diagrama un fluoroforo es usualmente excitado desde su estado basal (S 0) a los
niveles vibracionales mas altos (S1 o S2) y rápidamente (10-12 s) se produce una relajación hacia
los niveles vibratorios de menor energía que constituyen S1 (conversión interna). La emisión de
luz ocurre generalmente desde este piso energético al estado basal. Estos reacomodos determinan
que la energía de emisión es menor que la empleada para producir la excitación de la molécula
(Lakowicz 2006). Esto causa últimamente que la longitud de onda de excitación sea siempre
menor que la longitud de onda de emisión.
Reflexión total interna de la fluorescencia (TIRF)
Corresponde a un efecto óptico que posibilita el estudio de fenómenos que ocurren en la interfaz
de dos materiales con índices de refracción disimiles. Se produce cuando un haz de luz atraviesa
un medio con índice de refracción (n3) menor al del medio en el que se encontraba (n1), y el
ángulo de incidencia (Ѳ) medido en función de la recta normal a la interfaz entre ambos medios,
supera al ángulo crítico (Ѳc) (ec.7). Como resultado, el haz de fotones se refleja completamente
hacía el medio en que viajaba al impactar la interfase, mientras que al mismo tiempo genera un
campo electromagnético que se propaga paralelo a esta en forma de una onda evanescente en el
medio (Figura 8) (Axelrod 2003).
Ѳc = sen -1 (n1/n3) (ec.7)
25
Figura 8. Fenómeno de TIRF. El índice de refracción n3 debe ser mayor que n1. El medio n2 no es
necesario para que ocurra la reflexión total, sin embargo puede ocasionar propiedades ópticas
considerables. Para que se produzca el ángulo incidente Ѳ debe ser mayor al crítico Ѳc.
Axelrod 2003. “Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology”.
26
Este campo de evanescencia (I(z)) posee la misma frecuencia que la luz incidente y decae
exponencialmente a medida que se aleja de la superficie (ec.8).
I(z) = I0e-z/d
con d =
[n32 sen2 Ѳ – n12] -1/2 (ec. 8)
Así, es capaz de establecer un corte óptico y excitar fluoroforos de forma selectiva cuando estos
se distribuyen cercanos a la interfase excluyendo a aquellos localizados en planos internos de la
célula (Axelrod 1984)
Transferencia de Energía Resonante.
La Transferencia de Energía Resonante de Förster (FRET), corresponde a un mecanismo de
transferencia de energía entre dos fluoroforos (dador y aceptor) situados cerca el uno del otro
mediante una interacción dipolo-dipolo (Figura 9A). Los espectros de emisión y absorción de los
cromóforos deben solaparse (Figura 9B). Dentro de las características generales del proceso
destaca el hecho que no hay emisión de luz por parte del dador y que no existe un fotón
intermediario.
27
Figura 9. Transferencia de Energía Resonante de Förster. Un sistema de FRET está compuesto
por dos moléculas: aceptor y donor. (A) Representación mediante un diagrama de Jablonski del
fenómeno de FRET. La molécula aceptor absorbe la energía desde el estado excitado en el que se
encuentra el donor el cual vuelve al estado electrónico basal mientras que el aceptor emite
radiación electromagnética a una mayor longitud de onda. (B) Una de las condiciones para que
ocurra FRET es que exista un solapamiento del espectro de emisión del donor con el espectro de
absorción del aceptor.
Lakowicz. J.R. (2006). Third Edition.
28
La cantidad de energía transferida (KT (r) ) depende del rendimiento cuántico del dador, del grado
de solapamiento que muestren los espectros de las moléculas involucradas y de la orientación
relativa de los dipolos de ambas moléculas.
KT (r) =
Donde r es la distancia entre donor y aceptor y
)6 (ec.9)
D
corresponde al tiempo de vida del donor en el
caso de que no ocurriera transferencia de energía.
La eficiencia del FRET depende de la distancia entre ambos fluoroforos, la cual es comparable
con el grosor de las membranas biológicas (30 – 60 Å), esto categoriza al fenómeno de FRET
como un medio para evaluar dinámicas a escala de membranas celulares donde ya ha sido
utilizado para monitorear cambios en el potencial eléctrico (González y Tsien 1995).
Propuesta metodológica.
El sistema híbrido hVos (Chanda et al., 2005) consiste en un par FRET compuesto por una GFP y
el ion hidrófobo dipicrilamina (dpa). Este último se particiona rápidamente ( =500 us) en la
bicapa en respuesta al cambio de potencial de membrana. Esta metodología para detectar cambios
en el potencial de membrana utiliza el fenómeno de FRET que se establece entre ambos
componentes para dar cuenta de cambios en la actividad eléctrica con una alta variación en la
intensidad de fluorescencia de GFP (ΔF/F = 34% cada 100 mV) y rápido tiempo de respuesta,
perfilándose como un arreglo eficiente para monitorear incluso potenciales de acción (DiFranco
et al., 2007, Wang et al., 2010) (Figura 10A).
La carga negativa de la molécula de dpa permite que se distribuya en la cara externa o interna,
dependiendo del potencial de membrana. Entonces, un cambio en la polaridad de la membrana
conlleva a una redistribución de la molécula al interior de la bicapa. Si existe una molécula de
29
GFP anclada a una cara específica, la proximidad de las moléculas de dipicrilamina determinará
la eficiencia del FRET (Figura 10B). Experimentalmente se monitorea la fluorescencia de
emisión del donador, pues dpa no es fluorescente.
30
Figura 10. (A) El solapamiento (área sombreada) del espectro de emisión de GFP (en negro) y de
absorción de dpa (en gris) determina la transferencia de energía entre ambos (adaptado de
Chanda et al., 2005) (B) Esquematización de la translocación voltaje dependiente de dpa y su
interacción con una GFP anclada a una membrana lipídica (adaptado de DiFranco et al., 2007).
Adaptación. Chanda et al., 2005. “A hybrid approach to measuring electrical activity in
genetically specified neurons”.
DiFranco et al., 2007. “Voltage-dependent dynamic FRET
signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers”.
31
La magnitud del potencial de reposo vesicular ha sido sugerida pero no conocida en específico
(Małecki et al., 2002) debido a la dificultad para acceder a esta escala. Por lo que nuestra oferta
metodológica implica en esta primera etapa, el monitoreo de la actividad eléctrica de vesículas
aisladas en estado de docking en un sistema libre de células utilizando el fenómeno de FRET
entre una GFP residente en la vesícula y el ion hidrófobo dipicrilamina.
Para realizar estos experimentos utilizaremos células PC12, una línea celular derivada de un
tumor alojado en la medula adrenal de una rata (feocromocitoma). Estas células se caracterizan
por manifestar un fenotipo neuroendocrino y son utilizadas frecuentemente como modelo en
estudios de tráfico de proteínas, biogénesis de aminas, comportamiento vesicular (Martin y
Grishanin 2003) (Eaton y Duplan 2004) (Westerink y Ewing 2008) y secreción. Exhiben una
forma poligonal o redondeada con tendencia a construir conglomerados de carácter irregular
cuando se mantienen en cultivo (Greene y Tischler 1976). Dentro de los organelos que alojan,
destacan dos tipos vesiculares: a) grandes gránulos electrodensos (100 - 350nm) o LDCVs (Large
Dense Core Vesicles) y b) pequeñas vesículas tipo sinápticas (20-70 nm) o SLMVs (Synapticlike Micro Vesicles), de origen endosomal. Estos participan en fenómenos secretorios
independientes donde, los cuerpos vesiculares de gran tamaño liberan catecolaminas y
neuropéptidos y las vesículas pequeñas se encargan de movilizar acetilcolina.
La molécula de GFP necesaria para formar el par FRET será dirigida específicamente a las
SLMVs de las células PC12 mediante el uso de una proteína de fusión sinaptofisina-gfp.
Sinaptofisina es una proteína que posee dos dominios transmembrana y presenta sus extremos
carboxilo y amino hacia el citoplasma celular. Nuestra proteína GFP reportera está unida al
extremo amino terminal de sinaptofisina.
32
El hecho de ser la proteína más abundante en la membrana de las vesículas sinápticas la
convierte en un excelente marcador vesicular. Se ha sugerido que sinaptofisina participa en la
regulación de la cinética de endocitosis vesicular (Kwon y Chapman 2011).
33
HIPOTESIS
Para realizar un seguimiento eficaz de las variaciones en el potencial de membrana de las
vesículas sinápticas mediante técnicas de fluorescencia, uno debe contar con un método que
permita el aislamiento específico de las vesículas y que posea una alta sensibilidad (temporal y
espacial) frente a cambios de voltaje.
34
OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un método que permita monitorear cambios en el potencial de membrana de vesículas
unitarias mediante el uso de un sistema híbrido constituido por proteínas fluorescentes y el
compuesto sintético Dipicrilamina (dpa).
35
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Obtener y mantener cultivos celulares de PC12.
2. Estandarizar el protocolo de transfección de células PC12.
3. Estandarizar un protocolo que permita obtener láminas de membrana que contengan vesículas
intactas desde células PC12.
4. Establecer un procedimiento de registro imagenológico mediante microscopía de fluorescencia
de reflexión interna (TIRF) para seguir eventos de fusión vesicular en láminas de membrana.
5. Establecer un procedimiento de registro imagenológico mediante microscopía de fluorescencia
de reflexión interna (TIRF) para monitorear fluctuaciones de intensidad de fluorescencia a nivel
de vesícula única en láminas de membrana eventos de fusión vesicular en láminas de membrana.
6. Estandarizar la “carga” de dipicrilamina en los compartimentos vesiculares.
7. Estandarizar un sistema de perfusión eficiente que permita el rápido cambio de soluciones
sobre las láminas de membrana.
36
MATERIALES
Cultivo celular
Células PC12. Línea celular derivada de un tumor alojado en la medula adrenal de una rata
(feocromocitoma).
Material plástico. Las células fueron mantenidas en botellas T25 (Falcon) manteniendo así un
stock de estas. Adicionalmente se utilizaron placas de 35 mm (orange) para preparar la
transfección.
Reactivos. Suero de ternero (Hyclone), Suero de caballo (Hyclone), DMEM-F12 (GIBCO),
penicilina-estreptomicina (Hyclone), tripsina-EDTA, poli-L-lisina (Sigma), lipofectamina 2000
(Invitrogen), Optimem.
Constructos. Se utilizaron dos plasmidios, ambos construidos sobre el vector pcDNA3.1. Uno de
ellos contiene una secuencia codificante para sinaptofisina fusionada a una proteína fluorescente
verde en el extremo carboxilo terminal que se expresa al lado citoplasmático (sinaptofisina-GFP).
Sinaptofisina corresponde a una glicoproteína de 4 segmentos transmembrana y de 38 KDa que
se localiza en la membrana de SLMVs. Se considera un marcador exclusivo de vesículas
sinápticas y de SLMVs. Su función no ha sido completamente dilucidada pero se sabe que
interactúa con sinaptobrevina en el proceso de exocitosis.
El otro vector utilizado, posee la secuencia codificante para el transportador de acetilcolina
vesicular (VAChT), proteína encargada de la incorporación de acetilcolina al lumen de las
SLMVs. Este transportador se encuentra fusionado a una proteína fluorescente llamada fluorin (o
pHlourin) construida mediante mutagénesis directa sobre la secuencia de GFP, dando como
resultado una variante sensible a pH cuya eficiencia cuántica aumenta al menos en un orden de
magnitud cuando se ve expuesta a un valor de pH 7.4 o superior. Esta condición se manifiesta en
37
procesos exociticos cuando el lumen vesicular toma contacto con el medio externo por lo que el
constructo VAChT-pHlourin puede ser utilizado como reportero fluorescente de fusiones
vesiculares.
Sales Inorgánicas
Solución de Potasio MES ( KMES, Sigma), Ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)- N, N, N´,
tetraacético (EGTA, Fluka), ATP- Sal de Magnesio (Adenosin 5’-trifosfato sal de magnesio,
Sigma), Cloruro de Potasio (KCl, Merck), Cloruro de Sodio (NaCl, Merck), Ácido 2-[4-(2Hidroxietil)-1-Pireracinil-Etanosulfónico (HEPES, Calbiochem), Dipicrilamina (DPA, Merck),
Cloruro de Calcio (CaCl2, Merck), Cloruro de Magnesio (MgCl2, Merck), Ditiotreitol (DTT,
Sigma), Acetato de Potasio (CH3COOK, Merck).
Microscopia
Vidrios para microscopia de 25 mm (VWR), cámara de teflón para registro imagenológico,
microscopio invertido con objetivo de TIRF 60x, de apertura numérica 1.49, OLYMPUS IX-71
acoplado a una cámara de video CCD Hamamatsu Orca 12ER. La fuente de iluminación
corresponde a un Laser azul de estado sólido (longitud de onda 473 nm).
Software para el tratamiento y análisis de imágenes
Los sets de imágenes (compilados en una película) fueron obtenidos mediante el software de
acceso abierto Micromanager el cual permite controlar el setup de microscopía. Este se encuentra
acoplado al software Image J que fue utilizado para el procesamiento de las imágenes.
Previamente, en nuestro laboratorio se trabajó sobre esta última plataforma para construir una
38
serie de plugins en lenguaje de programación Java que permitieron realizar un seguimiento de las
vesículas transfectadas con nuestros marcadores fluorescentes, además de otros procedimientos
como la corrección del fotoblanqueo y el conteo de eventos de fusión vesicular.
39
METODOS
Preparación de soluciones.
Soluciones de registro. Estas fueron preparadas disolviendo las sales en un volumen de agua
destilada correspondiente al 70% del volumen final ajustando el valor de pH con NaOH 10M o
KOH 10M según correspondiera hasta alcanzar un valor de pH entre 7.3 y 7.4. A continuación
las soluciones fueron llevadas hasta alcanzar el aforo en un matraz de vidrio y rotuladas para su
posterior uso. Las soluciones utilizadas en los registros de fueron: NaCl 140 mM, HEPES 8 mM,
MgCl2 2mM pH 7.31 ; KCl 140 mM, HEPES 8 mM, MgCl2 2 mM pH7.3; NaCl 140 mM,
HEPES 8 mM, MgCl2 2mM, CaCl2 2 mM; KCl 140 mM, HEPES 8 mM, MgCl2 2 mM , CaCl2 2
mM pH7.3.
Para los experimentos de fusión vesicular se utilizó una solución KMES 120 mM, HEPES 20
mM, EGTA 2 mM, CH3COOK 20 mM, Mg-ATP 2 mM, DTT 0.5 mM pH 7.2 para evitar la
fusión, y una solución KMES 120 mM, HEPES 20 mM, CH3COOK 20 mM, Mg-ATP 2 mM,
DTT 0.5, CaCl2 5 mM pH 7.2 para promover la fusión de las vesículas en las láminas de
membrana
Stock de dipicrilamina. Se dispuso de una solución stock de dipicrilamina (Dpa, 1 mM)
disolviendo la sal en 30% DMSO y 70% Solución Ringer. Esta fue preparada en cada sesión de
experimentos.
Cultivo Celular.
Las células PC12 fueron cultivadas en frascos T25 con medio DMEM F-12 suplementado con
10% suero de caballo, 5% suero de ternero y penicilina estreptomicina al 1%, manteniendo así un
stock celular en incubación con 5% CO2 y a una temperatura de 37°C. Para preparar los
40
experimentos los stocks fueron tratados con tripsina-EDTA 0,25% sobre placas 35 mm para
lograr una confluencia del 70 – 80% y proceder con la transfección. Una vez alcanzada esta
cantidad fueron transfectadas sobre la base de la incorporación de DNA utilizando lípidos
catiónicos, para esto se ocupo el agente lipofectamina 2000 siguiendo el protocolo descrito:
Utilizar dos tubos eppendorf y en cada uno de estos agregar 50 uL de medio OPTIMEM o PBS
estéril, agregar a uno de ellos 1 ugr de DNA plasmidial a transfectar (tubo A) y al otro 5 uL de
lipofectamina 2000 (tubo B), incubar por separado durante 10 minutos y luego traspasar el
contenido del tubo A al tubo B dejando incubar la muestra durante 15 minutos; una vez
alcanzado el tiempo el volumen final se agrega a la placa donde se mantienen las células. A
continuación la placa ahora transfectada se regresa al incubador a 37°C y 24 hrs después se
tripsinizan las células depositándolas sobre vidrios de 25 mm cubiertos con poli lisina D para ser
utilizados en el proceso de adquisición de imágenes.
Microscopia.
Todos los experimentos fueron realizados 48 hrs post transfección. Los vidrios con células
transfectadas fueron montados en una cámara de registro imagenológico de forma circular y
dispuestas en nuestro setup de microscopía acondicionado para trabajar a nivel del plano TIRF.
La cámara de registro se conectó a un sistema de perfusión artesanal que permitió el intercambio
de soluciones y a una bomba de vacío que extraía la solución entrante estableciendo de un flujo
acuoso continuo.
41
Preparación de láminas de membrana.
Las láminas de membrana fueron construidas utilizando un sonicador (Cole-parmer Instrument
Company) mediante 4 pulsos de 3 s de duración, luego de cada pulso el cover de vidrio fue
visualizado en campo claro y en plano de TIRF para confirmar la existencia de un parche de
membrana con vesículas fluorescentes aisladas y sin otros componentes celulares. Las láminas
fueron lavadas tres veces con la misma solución en la cual fueron construidas con el fin de
remover las trazas celulares presentes luego de la sonicación.
Registro y análisis de la señal.
Registro. Las imágenes fueron visualizadas mediante una cámara para videomicroscopía CCD
Hamamatsu Orca 12ER y utilizando los softwares micromanager e image J para realizar la
adquisición y análisis. En los experimentos de fusión vesicular
Para la carga de dpa se estandarizó un protocolo de registro capturando un total de 300 cuadros a
una frecuencia de 200 mseg, obteniendo un registro de 60 s de duración. Finalizada la captura, el
medio de incubación de dpa fue lavado dos veces perfundiendo la misma solución en la que se
encontraban las láminas eliminando así los restos de dpa. En los experimentos de cambio de
soluciones, el registro fue de 800 cuadros totales a una frecuencia de 500 mseg por cuadro
visualizando así 400 s de actividad a nivel vesicular. Análisis. Todas las imágenes fueron
procesadas mediante Image J en primera instancia convirtiéndolas de 16 a 8 bit y utilizando la
herramienta ROI Manager para seleccionar los ROIs (Region of Interest) a analizar. Antes del
procesamiento las imágenes fueron depuradas del posible quenching acontecido durante el
registro mediante la herramienta Bleaching Corrector (para Image J) creado en nuestro
laboratorio. En la primera etapa del procesamiento se eliminaron los cuadros fuera de foco y el
42
background de cada uno de los videos, de esta forma se descarta el ruido en cada imagen. Cada
ROI analizado correspondió a un punto fluorescente, de esta manera registramos el cambio de
fluorescencia a escala de una vesícula individual. Para cada uno de los videos obtenidos se
seleccionó un total de 3 ROIs con el fin de representar el comportamiento general de las
vesículas. Los datos obtenidos fueron corregidos según la fórmula: ΔF/F =
donde Froi
corresponde a la fluorescencia registrada en la región de interés y F0 corresponde al valor basal
de fluorescencia obtenido de la media de los 10 primeros puntos del registro. Cada gráfica fue
construida ocupando el software OriginPro versión 8.
43
RESULTADOS
Cultivo y expresión de marcadores vesiculares.
Para poder visualizar las vesículas estas fueron marcadas con una molécula reportera
fluorescente. Para esto se utilizó la proteína vesicular sinaptofisina fusionada a GFP. Se probaron
diferentes condiciones de transfección con el fin de elaborar el protocolo adecuado para los
cultivos de células PC12, que exhibieron un patrón de expresión puntiforme luego de estandarizar
el procedimiento y ser vistas mediante microscopía de TIRF (Figura 11).
44
Figura 11. Expresión de marcador vesicular. Células PC12 transfectadas con el vector
codificante para sinaptofisina-GFP. Se observa un patrón punteado, tanto en epifluorescencia
como en el plano de TIRF donde cada punto brillante corresponde a una vesícula. Las células
fueron vistas 48 hrs post transfección.
45
Elaboración de láminas de membrana.
Para acceder a las vesículas fue necesario construir parches o láminas de membrana que nos
permitieron trabajar en un medio libre de células. Las láminas fueron elaboradas utilizando
células PC12 transfectadas previamente con el vector sinaptofisina-GFP. Se trabajó con tres
grupos de células creciendo en cubreobjetos diferentes, cada uno fue sometido a condiciones de
sonicación desiguales con el fin de
seleccionar a que intensidad se consigue formar la
preparación más apta. De acuerdo a la Figura 12 la sonicación a una intensidad de 20 W/m² no es
lo suficientemente eficiente para obtener vesículas aisladas, representadas en las imágenes
adquiridas por puntos brillantes únicos (A y B); además supusimos que una lámina de estas
características es de difícil acceso. La condición que entregó una mejor preparación corresponde
a aquellas células sonicadas a una intensidad de 60 W/m², esto se ilustra en la Figura 12 (C y D).
Luego de este tratamiento es posible observar una lámina de membrana que mantiene de forma
íntegra algunas zonas de la membrana plasmática pero que además contiene vesículas únicas que
serán las utilizadas en el análisis posterior.
46
Figura 12. Fabricación de láminas de membrana. Cada grupo de células fue intervenido con
cuatro pulsos de sonicación realizados a diferentes intensidades obteniéndose dos tipos de
preparación diferentes (B y D. Todas las células fueron transfectadas con sinaptofisina-GFP y
visualizadas antes de sonicar (A, C) y posterior al tratamiento sonoro (B y D). Las láminas fueron
construidas en una solución Ringer fisiológica.
47
Es posible confirmar que se obtuvo una lámina de membrana de forma exitosa tratando de
observar la preparación en campo claro y comparar la imagen con la registrada en plano TIRF.
Después de la sonicación, las vesículas en estado de docking solo son visibles en la interfaz entre
el agua y el vidrio por lo que al intentar observar la lámina solo con luz de transmisión y en un
plano distinto a TIRF, esta no es perceptible.
Calidad de la muestra y mantención de la funcionalidad luego de la preparación de la
lámina.
Posteriormente y con el objetivo de comprobar que las vesículas residentes en las láminas de
membrana no son afectadas por la sonicación y mantienen sus propiedades funcionales, se
transfectaron células PC12 con el marcador pHlourin fusionado al transportador de acetilcolina
vesicular, VAChT. PHlourin es una versión pH-dependiente de GFP. Su uso permite monitorear
fusiones vesiculares a nivel de vesícula única (Miesenböck et al., 1998) Así entonces, utilizamos
la capacidad de fusión como criterio de calidad de la muestra. La fusión vesicular fue promovida
incubando las láminas con 2mM Ca+2 (Figura 13). Nuestro laboratorio cuenta con un plugin java
para Image-J que es capaz de reconocer de forma semi-automática fluctuaciones en la intensidad
de la fluorescencia, indicativo de una fusión vesicular (Figura 13 A1, áreas en verde y A2).
Nuestro sistema de registro y análisis es capaz de realizar el seguimiento de los eventos de fusión
sin problemas (Figura 13B círculos rojos). Hemos determinado así que nuestro protocolo de
obtención de láminas de membrana permite mantener vesículas funcionales.
48
Figura 13. La sonicación no afecta la función vesicular. (a1) Imagen TIRF de células PC12
transfectadas con la sonda sensible a pH VAChT-pHlourin (izquierda) y el reconocimiento de un
evento de fusión en una región de interés (derecha). Para registrar y describir eventos de fusión se
utilizó un Plugin In para Image J diseñado en nuestro laboratorio. Con esta herramienta es posible
identificar eventos de fusión específicos (puntos verdes) de acuerdo a la variación en la
fluorescencia. (a2) El trazo muestra el cambio en la fluorescencia correspondiente a una fusión
vesicular (b) Secuencia de imágenes correspondiente a 3 ROIs diferentes de una lámina de
membrana durante fusión vesicular.
49
Incorporación del ion hidrófobo dipicrilamina.
Una vez construidas las láminas es posible mantener ciertas condiciones iónicas con el fin de
recrear el medio intracelular. Las láminas de membrana expresando sinaptofisina-GFP se
mantuvieron en una solución de alta concentración de K+ y privadas de Ca+2 para evitar la fusión
vesicular prematura, estas fueron incubadas con dipicrilamina para evaluar su respuesta
identificando si se produce o no el fenómeno de FRET (ver Figura 14.). En la Figura 14 A se
evidencia que cuando no hay dpa en el medio no existe cambio en la intensidad de la
fluorescencia de GFP. Sin embargo cuando las vesículas son expuestas al ion hidrófobo, la
intensidad de fluorescencia de GFP decae producto de la transferencia de energía entre GFP y
dpa.
50
Figura 14. Seguimiento de la fluorescencia de GFP en el tiempo. Las láminas de membrana
fueron incubadas con dpa observando el efecto de apagamiento de la fluorescencia. Tomando
registro de una lámina sin incubar (A) y de una preparación tratada con 6 µM dpa (B). Los
registros fueron adquiridos 48hrs post transfección y tuvieron una duración de 400 ms. La sonda
fue incorporada en la mitad de la captura. (C) Representación de la localización de sinaptofisinaGFP en la membrana vesicular. GFP se expone hacia el intracelular. Sinaptofisina se muestra en
purpura, GFP en verde y dpa en rojo.
51
Una vez que dpa alcanza el microambiente donde residen las vesículas, la alta concentración de
iones hidrófobos se incorpora en las membranas vesiculares situándose en la cara externa de la
bicapa, esto porque en nuestras condiciones experimentales (sin Mg-ATP en solución) (Holz
1978), la membrana adquiere un potencial eléctrico estimado de – 70 mV (negativo por dentro)
(Russell y Holz 1981), de esta manera dpa al poseer carga negativa, se ordena mayoritariamente
en el lado del capacitor con polarización positiva (Figura 14 C).
Con el fin de confirmar el efecto de dpa, el ensayo de incubación se repitió en diferentes
preparaciones analizando el comportamiento solo de vesículas aisladas (Figura 15 A, círculos en
rojo). En promedio, el efecto de dipicrilamina sobre GFP produce un decaimiento del 90 % de la
fluorescencia inicial (Figura 15 B).
52
Figura 15. Incorporación de moléculas de dpa en vesículas sináptica aisladas. (a) Vesículas en
estado de docking utilizadas para realizar el análisis de fluorescencia. (b) Comparación de la
intensidad de fluorescencia antes (-) y después (+) del tratamiento con dpa. Se analizaron 9
vesículas diferentes (barras = DS).
53
La Figura 16 grafica la magnitud de la caída de la fluorescencia cuando las láminas de membrana
son incubadas con dipicrilamina. Al parecer el declive de la fluorescencia varía de acuerdo a la
concentración de moléculas de dpa presumiblemente porque al situarse en la membrana vesicular,
una elevada cantidad de estas (4 y 6 µM) puede apantallar de forma mayoritaria la fluorescencia
de GFP traduciéndose así en un cambio de fluorescencia (ΔF/Fmax) incluso superior al 70%
(Figura 16 B y C). En contraposición, las moléculas incorporadas en una concentración de 2 µM
dpa al parecer, no son suficientes para producir un apagamiento de GFP que alcance al menos el
50% del nivel de fluorescencia inicial (Figura 16A). En los experimentos siguientes se utilizó una
concentración de 4 µM dpa que garantiza un quenching mayoritario pero que sin embargo no
aumenta el efecto foto tóxico sobre la preparación debido al exceso de moléculas cromóforas.
54
Figura 16. Cuantificación de la caída de fluorescencia en el sistema GFP/dpa sobre vesículas
sinápticas aisladas. Las preparaciones incubadas con diferentes concentraciones de dpa exhiben
un decaimiento diferencial en su fluorescencia. (A) Incubación con 2 µM dpa ocasiona un
ΔF/Fmax de 46% (B) Lámina de membrana cargada con 4 µM dpa presenta una reducción del
84,6% respecto a la fluorescencia inicial. (C) Las vesículas tratadas con una concentración de 6
µM incluso vuelven imperceptible la lámina de membrana luego del tratamiento con la sonda.
Cada gráfica fue construida a partir de 20 cuadros representativos de cada condición.
55
Análisis de la señal y el efecto de Mg-ATP.
Como se señaló las pruebas con dipicrilamina fueron realizadas sin contar con ATP en el medio
de incubación. En estas condiciones la ATPasa vesicular no estaría funcionando a causa de la
falta de sustrato lo que fijaría un potencial transmembrana cercano a los -70 mV (negativo en el
lumen) (Russell y Holz 1981) valor que se contrapone con los +50 mV documentados en la
literatura cuando si se cuenta con la presencia de ATP (Holz 1978). Es necesario entonces
evaluar si la presencia de ATP en el medio modifica el valor del potencial eléctrico mediante el
funcionamiento de la ATPasa y si nuestra metodología es capaz de registrar ese cambio. En la
Figura 17A se pueden observar los registros originales de dos vesículas independientes (círculos
rojo y amarillo) obtenidos al tratar una lámina de membrana previamente transfectada con
sinaptofisina-GFP e incubada con 4 uM dpa y con 2 Mm Mg-ATP. Es posible observar un
descenso considerable de la intensidad de brillo de la GFP lo que estaría indicando un cambio en
el potencial transmembrana y por lo tanto un re acomodo de dpa en el dieléctrico. Este efecto es
reversible ya que al lavar el Mg-ATP del medio la intensidad de la fluorescencia de GFP vuelve
a su estado inicial (Wash). En promedio se observa una variación de fluorescencia (ΔF) de
81,75% al tratar las vesículas con Mg-ATP (Figura 17B).
Con el fin de realizar la calibración de nuestro sistema de registro y tratar de clarificar el poder
resolutivo del mismo, se realizó un análisis de la señal de fluorescencia de GFP. En la Figura 17C
se observa un registro de la fluorescencia y se demarcan una y dos desviaciones estándar (líneas
punteadas) a partir de la media original. Con esta información se fabricó un registro (Figura 17D)
donde se observa una transición correspondiente a dos desviaciones estándar del valor original.
56
Figura 17. Análisis de la señal y efecto de Mg-ATP sobre la señal de FRET entre dpa y GFP. (a)
Registro original de dos vesículas únicas (círculos amarillos y rojos) y el efecto de la adición de
2mM Mg-ATP en la fluorescencia de las mismas. (b) El promedio de ΔF/F muestra alrededor de
un 80% de diferencia en la fluorescencia al incorporar Mg-ATP al medio. (c) Registro muestra
una y dos desviaciones estándar de la señal de fluorescencia original. (d) Transición fabricada
equivalente dos desviaciones estándar (2 st dv). La media de las dos señales son estadísticamente
diferentes (p<0.01). (e) Representación esquemática de las condiciones eléctricas en las que se
encuentra la vesícula. (f) El análisis muestra el límite de resolución del sistema bajo nuestras
condiciones experimentales. Los experimentos fueron realizados en una solución KCl 140 mM,
8mM NaCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucosa, 2 mM CaCl2.
57
Esto ya que mediante un análisis estadístico se logró determinar que si se comparan ambas
medias la diferencia entre ellas es estadísticamente significativa, siendo este el límite de
resolución de nuestra técnica.
La Figura 17E representa las condiciones eléctricas en las que se encuentran las vesículas en
ausencia y presencia de Mg-ATP en el medio. La Figura 17F muestra el resultado del análisis
antes mencionado utilizando un valor de 120 mV (entre -70 mV y +50mV) como referencia para
calcular el límite de resolución de la metodología.
Aproximación al monitoreo de conductancias vesiculares.
Luego de comprobar que es posible registrar el fenómeno de FRET en una vesícula una vez que
dpa se localiza en su membrana, nos propusimos explorar si nuestro sistema es igualmente capaz
de registrar cambios en la señal de FRET cuando las especies iónicas del medio son sustituidas.
Debido a la escala nanométrica en la cual estamos trabajando los dispositivos electrofisiológicos
tradicionales son incapaces de acceder a la membrana de una vesícula para imponer y controlar el
potencial eléctrico. Como el potencial es definido por la concentración diferencial de especies
iónicas a ambos lados de la bicapa y podemos controlar el medio en el cual las vesículas están
embebidas, optamos por cambiar la composición iónica de este con el fin de ocasionar una
variación en el potencial y observar el efecto en nuestro sistema. Si analizamos un registro
continuo de la fluorescencia a medida que intercambiamos las soluciones que bañan las láminas
de membrana ya tratadas con dpa, es posible distinguir estados de fluorescencia que se mantienen
mientras una solución está presente pero que se diferencian al cambiarla (Figura 18).
58
Figura 18. Monitoreo de la actividad eléctrica a nivel vesicular. Los datos muestran una
variación de la fluorescencia en el tiempo debido a la translocación de dpa.
59
Estas transiciones son representativas de los cambios eléctricos en la membrana vesicular que
producen un reacomodo de dpa en el manto lipídico, aumentando o disminuyendo la distancia
respecto a la GFP y por ende la probabilidad de ocurrencia de FRET.
La Figura 19 muestra como el cambio de una solución de alta concentración de K+ a una rica en
Na+ ocasiona un decaimiento de la fluorescencia en un 27% a causa de la hiperpolarización de la
membrana lo que se traduce en un aumento en la ocurrencia de FRET. Caso contrario, al
polarizar la membrana, se produce la fuerza electromotriz necesaria para posicionar el dpa en la
cara interna de la vesícula, disminuyendo las posibilidades de FRET y aumentando la señal de
fluorescencia en un 17% respecto a la condición inicial.
60
Figura 19. Movimiento de dpa en la membrana vesicular cuando diferentes soluciones son
perfundidas. Se observa una variación de un 27% de la fluorescencia de GFP cuando se
intercambia K+ por Na+ y al intercambiar Na+ por K+ la diferencia es de un 17%.
61
Podemos afirmar que la membrana vesicular exhibe cierta permeabilidad a los iones Na + y K+ y
que quizás estos contribuyen, en mayor o menor grado, al establecimiento del potencial de
reposo.
62
DISCUSION
Este trabajo representa nuestra primera incursión al estudio de la actividad eléctrica de estructuras
subcelulares y fue concebido a partir del interés que suscita en nuestro laboratorio, la exploración
de la función de canales iónicos residentes en compartimentos membranosos intracelulares.
Si bien los métodos utilizados para estudiar las propiedades eléctricas de la membrana plasmática
tuvieron su origen hace décadas e involucran en su mayoría el uso de equipamiento
electrofisiológico (Hodgkin y Huxley 1952) (Neher y Sakman 1976), las estrategias para evaluar
la actividad eléctrica de membranas intracelulares han sido pobremente desarrolladas, en parte,
debido al difícil acceso al medio intracelular y al mantenimiento de las condiciones nativas del
mismo.
De igual forma, en el caso de las vesículas secretorias no se han logrado grandes innovaciones
metodológicas para evaluar el potencial transmembrana y las conductancias participantes. Desde
el descubrimiento y caracterización de las propiedades conductoras de las vesículas cromafines
(Holz 1978) las aproximaciones experimentales han contemplado el uso de sondas
espectrofotométricas e iones lipofílicos cuya distribución ha dado luces sobre posibles valores del
potencial de reposo vesicular: que rondaría los +50 mV (positivo en el lumen) (Holz 1978) y que
además se vería desplazado hacía valores negativos cuando no existe ATP en el medio (Johnson
1987, Russell y Holz 1981). Estas estrategias han sido utilizadas en vesículas neurosecretorias,
gránulos de mastocitos, vesículas colinérgicas y dopaminérgicas y al igual que los ensayos
electrofisiológicos realizados en estas vesículas, exigen la extracción de estas estructuras desde su
ambiente nativo (Yakir y Rahamimoff 1995). Sin embargo los procedimientos de aislamiento y
mantención de las vesículas junto con ser engorrosos, someten a estos organelos a un
considerable estrés mecánico y químico por lo que consideramos que la fabricación de láminas de
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membrana corresponde a un sistema de evaluación menos agresivo y con igual eficiencia para
acceder a las vesículas y conservarlas no solo de forma íntegra sino que además en su ambiente
nativo.
Muchos de los métodos antes mencionados presentan algunas complicaciones al tratar de definir
fenómenos eléctricos más finos o al querer estudiar el comportamiento simultaneo de poblaciones
celulares, además de una baja resolución temporal (Sjulson y Miesenböck 2007). Las estrategias
ópticas apuntan a sortear estas dificultades permitiendo la visualización de la actividad eléctrica
como una señal lumínica utilizando moléculas reporteras fluorescentes con sensibilidad a voltaje
(Cohen et al., 1978, Waggoner 1976, Waggoner 1979) o mediante la construcción de proteínas de
fusión entre canales iónicos y proteínas fluorescentes como GFP de tal forma que los cambios en
el voltaje transmembrana se traduzcan en un cambio en la intensidad de la fluorescencia, tal es el
caso de FlaSh, VSFP1 y SPARC (Ataka y Pieribone 2002, Sakai et al., 2001, Siegel y Isacoff
1997)
Teniendo en cuenta estos antecedentes, para evaluar la actividad eléctrica en la membrana
vesicular hemos escogido un sistema de monitoreo de dos componentes basado en la señal de
FRET entre GFP y dpa. Este par FRET ha sido probado con anterioridad solo en membrana
plasmática (líneas celulares, cultivo primario de neuronas, fibras musculares). Evaluando las
características de la metodología podemos señalar que el fenómeno de FRET es un buen
reportero pues entrega una señal clara (todo o nada) que en este caso da cuenta de un cambio en
el potencial transmembrana. Además, la cinética de respuesta del sistema GFP/dpa es bastante
rápida ( = 500 us) al compararla con otras técnicas donde el aceptor de energía también es móvil,
como el oxonol ( = 4 s) o, con aproximaciones de un componente como la sonda di-8-ANEPPS
donde la sonda responde con gran rapidez ( = 4 us) pero el porcentaje de cambio de la
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fluorescencia por cada 100 mV expresado en ΔF/F es menor (ΔF/F= 22%) que en el arreglo
hVOS (ΔF/F = 30%). Junto con esto, la contribución de dpa al potencial eléctrico (al menos en
membrana plasmática) es bastante pequeña y el rango dinámico donde este par FRET puede ser
utilizado es bastante amplio (-150 mV a +50 mV) (Chanda et al., 2005).
Nuestros resultados demuestran que esta metodología puede ser adaptada para estudiar las
pequeñas vesículas tipo sinápticas al ser estas mantenidas en un ambiente libre de células
perpetuando así las propiedades electrodensas del lumen, sin someter a las vesículas a
procedimientos tan invasivos. Nosotros y otros (Avery et al., 2000, Holroyd et al., 2002) hemos
demostrado que estas vesículas mantienen sus propiedades funcionales ya que son capaces de
fusionarse bajo la estimulación con Ca2+. Adicionalmente, según nuestras condiciones
experimentales la incorporación del ion hidrófobo dipicrilamina a la membrana vesicular no
presenta grandes restricciones, produciendo una disminución de la fluorescencia inicial de
alrededor de un ΔF/F=90% cuando se produce la transferencia de energía con GFP
Por otro lado, el rastreo de la actividad eléctrica, sugerido previamente por otros (Goh et al.,
2011) indica que la membrana vesicular exhibe ciertas permeabilidades a cationes monovalentes
como Na+ y K+ además de la ya documentada permeabilidad a Cl - (experimentos en curso), y que
estas especies ocasionan una variación de potencial tal que es posible reacomodar el sensor de
voltaje dpa entre ambas caras de la bicapa. Nuestros resultados dan cuenta de una diferencia de
alrededor del 30% al comparar el cambio de K+ a Na+ (ΔF/F=27%) con la situación contraria
(ΔF/F=17%). Esto podría indicar que la membrana vesicular es más permeable a un tipo de
catión que al otro ya sea por la cantidad de canales iónicos conductores o por la presencia de
transportadores (ion-ion o ion-soluto) así como también por la existencia de conductancias
pasivas a lo largo de la membrana de la vesícula. Pretendemos dilucidar mediante experimentos
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posteriores cuál de estas especies iónicas es más permeable en la membrana vesicular, si dichas
especies contribuyen mayoritariamente al establecimiento del potencial de reposo y la magnitud
de dicha contribución. Nos interesa también confirmar la permeabilidad a Cl - utilizando para esto
soluciones que no contemplen este ion como por ejemplo NaMES para luego sustituirla por
NaCl.
Si bien no conocemos de forma exacta el potencial que se establece en las vesículas utilizamos
los datos encontrados en la literatura para realizar nuestra propia calibración y de esta forma
estimar el límite de resolución de nuestro método, situación que si bien esta sobreestimada, dista
mucho de ser exacta. Como se mencionó anteriormente al mantener las láminas de membrana en
una solución de KCl 140mM e incubarlas transitoriamente con 2mM ATP se espera un Δ =
120mV ya que según los valores descritos, la vesícula sin ATP exhibiría un potencial de
alrededor de -70 mV que se vería incrementado a +50 mV cuando ATP si está presente en el
medio. Utilizando estos 120mV y el ΔF/F observado cuando se incuba a las vesículas con ATP es
posible afirmar que nuestro método es capaz de resolver valores superiores a 6mV (ver cálculo
Figura 17). Pretendemos mejorar nuestro sistema de calibración en experimentos futuros
utilizando el ionóforo de K+ valinomicina que nos permitirá mantener el potencial
transmembrana en un valor conocido y realizar una mejor estimación de la resolución de nuestra
técnica. Junto con esto pretendemos volver a evaluar la contribución de cationes monovalentes
esta vez utilizando Mg-ATP en el medio y de esta forma aproximarnos de mejor forma a lo que
ocurre en la vesícula en su ambiente nativa.
Al relacionar los resultados obtenidos al tratar las vesículas con ATP y aquellos donde se
cambian las especies iónicas del medio, encontramos una discordancia entre los resultados
esperados y lo obtenido. De acuerdo a los resultados obtenidos, al reemplazar Na + por K+ se
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observa una diferencia del 17% en el nivel fluorescencia, este ΔV es considerado positivo (+) ya
que se produce un aumento de la señal de fluorescencia. Esto indicaría que el potencial se
volvería más positivo al interior de la vesícula y que una porción de los iones de dipicrilamina se
alejarían lo suficiente para disminuir la eficiencia del FRET aumentando así la señal de GFP.
Esto está de acuerdo con lo reportado en la literatura para vesículas aisladas. Según lo recopilado
en la literatura al incubar la lámina con Mg-ATP, el potencial de la vesícula cambiaría
dramáticamente hasta un valor cercano a los 50 mV (positivo en el lumen), por lo que se espera
que todo el dpa esté en el lumen aumentando aún más la señal de fluorescencia. Sin embargo, se
observa lo contrario, un gran cambio en la fluorescencia pero de signo contrario. Al tratar la
lámina con ATP la fluorescencia decae alrededor de un 90% lo que indicaría que dpa estaría más
cercano a la GFP (la que está en la cara externa) y se apantallaría casi por completo la
fluorescencia de esta. Esto implicaría que la polaridad de la vesícula está invertida con respecto a
lo esperado y reportado por múltiples (Figura 20). Una posible explicación para lo ocurrido
radica en el efecto de los iones de dpa que se sitúan en los trozos de membrana que no
corresponden a la vesícula. Dipicrilamina al ser un ion hidrófobo puede adsorberse en todas las
membranas lipídicas, por lo que es probable que exista una proporción de esta sonda que se
encuentre en las trazas de membrana plasmática que aún existen luego de fabricar la lámina y que
sean estos iones lo que se desplacen acercándose a la GFP aumentando el quenching. Entonces, la
geometría de la vesícula estacionada en la membrana y la localización particular de nuestro
reportero (sinaptofisina-GFP) no sería conveniente para este tipo de mediciones en las que el
potencial cambia drásticamente, pues la membrana plasmática residual presenta un potencial cero
que podría atraer moléculas de DPA bajo ciertas condiciones de ΔV vesicular.
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Figura 20. Esquematización de lo esperado teóricamente al relacionar distintos experimentos y el
resultado observado. Se representan las condiciones de distribución de dpa (en rojo) y una
estimación de las condiciones eléctricas de la membrana vesicular cuando se cambian los
cationes monovalentes y se incuba con ATP.
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Se están llevando a cabo experimentos con otros marcadores vesiculares (e.g RABV, VAChT)
que en teoría se distribuyen lejos del cuello de la vesícula estacionada, esto con la finalidad de
estandarizar la metodología con las técnicas disponibles.
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