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EVALUACIÓN DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS PRESENTES EN
EXTRACTOS OBTENIDOS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS AISLADAS
DE SUERO COSTEÑO
JENNY ANDREA RODRÍGUEZ PEÑA
LINA MARCELA TORRES LOZANO
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL
BOGOTA
2006
EVALUACIÓN DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS PRESENTES EN
EXTRACTOS OBTENIDOS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS AISLADAS
DE SUERO COSTEÑO.
JENNY ANDREA RODRÍGUEZ PEÑA
LINA MARCELA TORRES LOZANO
Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero de Producción
Agroindustrial
Director
MSc. María Clementina Cueto Vigil
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL
BOGOTA
2006
ii
Nota de aceptación
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
Presidente del Jurado
_______________________________
Jurado
_______________________________
Jurado
Bogotá, Agosto de 2006
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darnos la vida y la oportunidad de conocer a tantas personas que
han contribuido de manera significativa en éste trabajo y en nuestras vidas.
A la Universidad de La Sabana y Colciencias por apoyar económicamente la
realización de éste proyecto, a la Doctora Clementina Cueto por su dedicación
y compromiso incondicionales, a nuestras familias y amigos por no dejarnos
desfallecer en ningún momento, al Ingeniero Francisco Garcés, a la Doctora
Indira Sotelo y al Doctor Elkin Hernández por sus valiosas sugerencias y
acertados aportes, a las auxiliares de laboratorio y a todos aquellos que con su
trabajo hicieron posible la realización de éste proyecto.
iv
CONTENIDO
pág
12
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
13
1. MARCO TEÓRICO
14
1.1 EL SUERO COSTEÑO
14
1.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
14
1.2.1 Generalidades
14
1.2.2 Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas
15
1.2.2.1 Ácidos orgánicos
16
1.2.2.2 Peróxido de hidrógeno y otros metabolitos del oxígeno
16
1.2.2.3 Dióxido de carbono
17
1.2.2.4 Diacetilo
17
1.2.2.5 Acetaldehído
17
1.2.3 Género Lactobacillus
18
1.2.4 Género Lactococcus
19
1.2.5 Género Leuconostoc
20
1.3 BACTERIOCINAS
20
1.3.1 Generalidades
20
1.3.2 Clasificación
21
1.3.3 Modo de acción
22
1.3.4 Aplicaciones de bacteriocinas en alimentos
23
1.3.5 Antecedentes
25
v
1.4 MICROORGANISMOS INDICADORES
25
1.4.1 Escherichia coli
27
1.4.2 Staphylococcus aureus
27
1.5 FUNDAMENTO DE TÉCNICAS EMPLEADAS
28
1.5.1 Sedimentación de la biomasa por centrifugación
28
1.5.2 Concentración de sobrenadantes por evaporación
28
1.5.3 Pruebas de inhibición
29
1.5.4 Análisis visual de proteínas con electroforesis SDS-PAGE
29
2. MATERIALES Y MÉTODOS
31
2.1 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS UTILIZADAS
31
2.2 MICROORGANISMOS INDICADORES
31
2.3 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO
31
2.3.1 Activación de las BAL
31
2.3.2 Cultivo de las cepas activadas
32
2.3.3 Verificación de cultivo
32
2.3.4 Separación por centrifugación
32
2.3.5 Neutralización de sobrenadantes
32
2.4 CONCENTRACIÓN DE SOBRENADANTES POR EVAPORACIÓN
32
2.5 PRUEBAS DE INHIBICIÓN
33
2.6 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA TOTAL
33
2.7 PRUEBAS DE CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO
CONCENTRADO NEUTRO
34
2.7.1 Determinación de la naturaleza proteica
34
2.7.2 Termoresistencia
34
vi
2.7.3 Catalasa
35
2.7.4 Análisis visual de proteínas con electroforesis SDS-PAGE
35
2.8 APLICACIÓN EN MATRIZ ALIMENTARIA
35
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS
37
3.1 RESULTADOS PRELIMINARES
37
3.2 RESULTADOS EXPERIMENTALES
37
3.2.1 Activación y cultivo de cepas aisladas
37
3.2.2 Verificación de cultivo
37
3.2.3 Neutralización de sobrenadantes
37
3.2.4 Concentración de sobrenadantes por evaporación
38
3.2.5 Determinación del contenido de proteína total
43
3.2.6 Pruebas de caracterización del extracto neutro concentrado
44
3.2.6.1 Determinación de la naturaleza proteica
44
3.2.6.2 Termoresistencia
45
3.2.6.3 Análisis visual de proteínas con electroforesis SDS-PAGE
48
3.2.7 Aplicación en matriz alimentaria
50
4. CONCLUSIONES
52
5. RECOMENDACIONES
53
BIBLIOGRAFÍA
54
ANEXOS
60
vii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición química del Suero Costeño.
pág.
14
Tabla 2. Clasificación por géneros de las bacterias ácido lácticas.
15
Tabla 3. Lactobacillus productores de bacteriocinas.
20
Tabla 4. Relación general de cepas de bacterias ácido lácticas
utilizadas.
31
Tabla 5. Composición de la salsa ranchera casera
35
Tabla 6. Convenciones para Tabla 7 y Figuras 11 a 20.
38
Tabla 7. Resultados de pruebas de inhibición de evaporación a presión
atmosférica, 40ºC y 100 horas de tratamiento.
38
Tabla 8. Porcentaje de éxitos de muestras neutras evaporadas.
40
Tabla 9. Resultados de la medición de proteína total con las tiras
Uriscreen®10.
43
Tabla 10. Resultados de la prueba de proteasa para extractos neutros.
44
Tabla 11. Resultados de la prueba de termoresistencia: 100ºC, 15
minutos para extractos neutros
45
Tabla 12. Resumen de resultados para extractos neutros
47
Tabla 13. Resultados de la aplicación en matriz alimentaria del extracto
antimicrobiano de la cepa 238.
50
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Micrografía electrónica de barrido de Lactobacillus casei
pág.
18
Figura 2. Micrografía electrónica de barrido de Lactococcus lactis
19
Figura 3. Micrografía electrónica de barrido de Leuconostoc mesenteroides.
20
Figura 4. Modo de acción de las bacteriocinas
23
Figura 5. Estructura de la pared celular de las Gram positivas.
26
Figura 6. Estructura de la pared celular de las Gram negativas.
26
Figura 7. Micrografía electrónica de barrido de E. coli
27
Figura 8. Micrografía electrónica de barrido de S. aureus
27
Figura 9. Ejemplo de prueba de inhibición vs. E. coli
39
Figura 10. Ejemplo de prueba de inhibición vs. S. aureus
39
Figura 11. Pruebas inhibición de Lactococcus lactis lactis 1 (156)
40
Figura 12. Pruebas inhibición de Lactobacillus brevis 1 (40)
40
Figura 13. Pruebas inhibición de Lactobacillus plantarum 1 (238)
41
Figura 14. Pruebas inhibición de Lactococcus lactis lactis 2 (381)
41
Figura 15. Pruebas inhibición de Lactobacillus paracasei paracasei 1 (205)
41
Figura 16. Pruebas inhibición de Lactobacillus acidophilus 3 (10)
41
Figura 17. Pruebas inhibición de Lactobacillus pentosus (02)
41
Figura 18. Pruebas inhibición de Leuconostoc lactis (206)
42
Figura 19. Pruebas inhibición de Lactobacillus paracasei paracasei 1 (279)
42
Figura 20. Pruebas inhibición de Lactobacillus casei
42
Figura 21. Electroforegrama extractos concentrados preliminares
48
Figura 22. Electroforegramas extractos concentrados finales
49
ix
LISTA DE ANEXOS
pág.
ANEXO A. SISTEMA CRYOBANK
60
ANEXO B. COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
61
ANEXO C. TINCIÓN DE GRAM
62
ANEXO D. RESULTADOS PRELIMINARES
64
ANEXO E. PROTOCOLO PARA ELABORACIÓN DE
ELECTROFORESIS SDS – PAGE DE LAEMMLI
72
ANEXO F. MARCADOR MARK 12® DE INVITROGEN
74
ANEXO G. TABLA DE pH ANTES Y DESPUÉS DE NEUTRALIZAR
75
ANEXO H. TABLA RESUMEN DE ELECTROFORESIS REALIZADAS
76
x
RESUMEN
Con el objeto de evaluar el efecto antimicrobiano de nueve Bacterias Ácido
Lácticas aisladas de Suero Costeño, se obtuvo un extracto concentrado de las
sustancias extracelulares producidas por dichas bacterias, para lo cual se hizo
una sedimentación de la biomasa presente en el cultivo inicial, se neutralizó el
sobrenadante con NaOH 10N para descartar inhibición por acidez y
posteriormente se concentró por evaporación. Obtenido el extracto, se
determinó su capacidad antimicrobiana ante dos microorganismos, Escherichia
coli y Staphylococcus aureus, por medición de diámetro de halos de inhibición
mediante la técnica de difusión en agar.
Se realizó hidrólisis enzimática con proteasa para verificar la naturaleza
proteica de las sustancias antimicrobianas, se estableció su termoresistencia
por exposición a temperatura de 100ºC y se examinó visualmente la presencia
de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida. Además se ensayó el
efecto inhibitorio de uno de los extractos en una matriz alimentaria contaminada
con E. coli y S. aureus, separadamente, con el fin de observar si era
reproducible en alimentos.
ABSTRACT
To evaluate the antibiotic effect of nine Acid Lactic Bacteria isolated from
artisanal whey (Suero Costeño), a concentrated extract from extracellular
substances produced by such bacteria was obtained; for that purpose a
sedimentation from the bio-mass in the initial culture was performed, the
supernatant was neutralized with NaOH 10N to avoid acidity inhibition and then
it was concentrated by evaporation. Once the extract was obtained, its
antimicrobial ability was determined against two microorganisms, Escherichia
coli and Staphylococcus aureus, by measuring the diameter of the inhibition
halos through agar diffusion technique.
Enzymatic hydrolysis with protease was performed in order to verify the proteic
nature of the antimicrobial substances; their thermoresistance was established
by exposure to 100ºC temperature and the presence of proteins was visually
examinee by poliacrilamide gel electrophoresis. In addition, the inhibitory effect
of one extract was assayed in a food matrix contaminated with E.coli, and S.
aureus, separately, in order to observe if it was reproducible in food products.
xi
INTRODUCCIÓN
La preocupación ancestral del hombre por prolongar la vida útil de los
alimentos, lo ha llevado a descubrir diferentes métodos de conservación ya
sean químicos, físicos ó biológicos. Algunos de estos métodos generan
cambios indeseables en los productos que pueden afectar o que simplemente
generan no conformidades en el consumidor final. Es por esto que el mercado
demanda tecnologías de conservación que no solo se adapten al ritmo de vida
sino que la protejan, manteniendo los atributos originales de los productos.
Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), son microorganismos con gran potencial
de bioconservación por la producción de ácidos orgánicos que acidifican el
medio, haciéndolo inadecuado para otras poblaciones microbianas presentes;
así mismo, por la producción de sustancias antimicrobianas de distinta
naturaleza, entre ellas algunas de naturaleza proteica, que también pueden ser
producidas por otros tipos de bacterias, y se denominan bacteriocinas. Las BAL
cuentan con una condición GRAS (generally regarded as safe) que aprueba su
uso en alimentos, adicionalmente la mayoría de sus péptidos antimicrobianos
no generan resistencia bacteriana como ocurre con los antibióticos.
En la Facultad de Ingeniería de la Universidad de La Sabana, se han aislado
algunas cepas de BAL presentes en el Suero Costeño y a partir de
sobrenadantes de cultivo líquido se ha evidenciado la presencia de actividad
antimicrobiana ante E. coli y S. aureus.
Este estudio que hace parte del proyecto financiado por Colciencias y La
Universidad de La Sabana titulado “Evaluación y modelación matemática de la
presencia de bacterias ácido lácticas productoras de sustancias
antimicrobianas de interés industrial en el Suero Costeño”, pretende evaluar
las sustancias antimicrobianas presentes en los extractos obtenidos de las
cepas aisladas de Suero Costeño confirmando su naturaleza peptídica y
termoestabilidad, así como su potencial eficiencia en matrices alimenticias.
Esta evaluación es importante, ya que las sustancias antimicrobianas pueden
llegar a ser parte de la tecnología de barreras en la industria de alimentos; por
otra parte podría ser el primer paso para que se realicen investigaciones
biotecnológicas mas profundas dirigidas al Suero Costeño. Cabe resaltar que
en este proyecto se emplean métodos físicos para la concentración del
extracto, libre de agentes químicos como se realiza convencionalmente.
12
OBJETIVOS
Objetivo General:
Evaluar las sustancias antimicrobianas presentes en extractos obtenidos
de BAL aisladas de Suero Costeño.
Objetivos Específicos:
•
Obtener extractos concentrados de nueve cepas de
presumiblemente productoras de sustancias antimicrobianas.
•
Evaluar el efecto antimicrobiano del extracto concentrado ante dos
microorganismos indicadores Escherichia coli y Staphylococcus
aureus.
•
Establecer la naturaleza proteica de las sustancias antimicrobianas,
por medios enzimáticos.
•
Clasificar las sustancias proteicas antimicrobianas encontradas por
termoestabilidad de los péptidos y peso molecular.
•
Evaluar el efecto antimicrobiano de las sustancias proteicas
producidas por una de las cepas en una matriz alimenticia.
13
BAL
Marco Teórico
1. MARCO TEÓRICO
1.1 EL SUERO COSTEÑO
El Suero Costeño es un producto lácteo obtenido mediante la acidificación de la
leche a través de la fermentación producida por BAL. Es elaborado de acuerdo
al esquema tecnológico desarrollado y difundido en la región de la Costa
Atlántica colombiana, en la mayoría de los municipios de los departamentos de
Bolívar, Cesar, Córdoba, Magdalena y Sucre. La apariencia del Suero Costeño
es la de un producto de color crema blanco suave, moderadamente fluido que
presenta grumos y algo de sinéresis (Chamie et al., 1999).
Según la disposición que se le dé a la crema que se separa espontáneamente
en el proceso de preparación, el Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos
(ICTA) propone clasificar el Suero Costeño en tres tipos: magro, semigraso y
graso.
En la Tabla 1 se describe la composición química del Suero Costeño,
propuesta en un trabajo sobre caracterización de productos lácteos
fermentados colombianos realizado en el ICTA (Rodríguez, 1988).
Tabla 1. Composición química del Suero Costeño
TIPOS DE SUERO
Magro
Semigraso
PBH
PBS
PBH
PBS
13.60 – 15.60
15.70 – 23.50
Humedad
2.00 – 3.62
20.63
3.63 – 8.65
35.17
Grasa
4.50 – 6.55
22.19
2.8 – 4.45
21.26
Proteína
1.00 – 3.90
20.12
1.00 – 3.90
14.08
Ceniza
3.68
3.77
pH
0.92
0.92
aw
1.00- 1.20
1.00 – 1.20
Densidad
0.02 – 0.15
0.32
0.02 – 0.15
0.39
Calcio
0.50 – 1.60
5.24
0.50 – 1.60
5.25
Fósforo
0.95 – 3.50
18.50
0.95 – 3.50
12.70
Sal (NaCl)
Graso
PBH
PBS
23.70 – 38.40
8.66 – 17.20 47.19
1.02 – 2.70
7.62
1.00 – 3.90
6.29
3.72
0.92
1.00 – 1.20
0.02 – 0.15
0.31
0.50 – 1.60
3.43
0.95 – 3.50
6.01
PBH: Porcentaje en base húmeda. PBS: Porcentaje en base seca. aw: Actividad de agua.
Fuente: Rodríguez, 1988.
1.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
1.2.1 Generalidades. Las BAL son un grupo de bacterias Gram-positivas, no
esporuladas. Producen ácido láctico como producto principal ó único del
mecanismo fermentativo. Estas bacterias carecen de porfirinas y citocromos,
14
Marco Teórico
no realizan fosforilación por transporte de electrones, por lo que reciben la
energía solo a nivel de sustrato (Madigan et al., 2001).
Las BAL son anaerobias aerotolerantes, es decir que pueden crecer con o sin
presencia de oxígeno. Algunas cepas son capaces de tomar oxígeno por medio
de sistemas de flavoproteína oxidasa, produciendo peróxido de hidrógeno por
medio de enzimas alternativas llamadas peroxidasas. No se forma ATP en la
reacción flavoproteína oxidasa, pero el sistema oxidasa puede emplearse para
la reoxidación de nicotidamida adenin dinucleotido reducido (NADH). La mayor
parte de las BAL pueden obtener energía solo de la fermentación de los
carbohidratos y compuestos relacionados, de ahí que estén restringidas a
hábitats en los que existen azúcares (Madigan et al., 2001).
El grupo denominado homofermentativo produce únicamente ácido láctico en la
fermentación, mientras que el heterofermentativo produce también etanol,
dióxido de carbono, ácido acético y ácido fórmico.
Según la morfología y el tipo de metabolismo, las BAL se clasifican en géneros
como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Clasificación por géneros de las bacterias ácido lácticas.
GÉNERO
Streptococcus
Leuconostoc
Pediococcus
MORFOLOGÍA
Cocos en cadenas
Cocos en cadenas
Cocos en tétradas
Bacilos en cadena
Lactobacillus
Bacilos en cadena
Lactococcus
Cocos en cadena
Fuente: Madigan et al., 2001.
FERMENTACIÓN
Homofermentativa
Heterofermentativa
Homofermentativa
Homofermentativa
Heterofermentativa
Homofermentativa
Las BAL tienen una gran importancia en la industria de alimentos ya que las
actividades metabólicas que desarrollan en ellos, principalmente la producción
de ácido láctico, inducen cambios en la textura, aroma, sabor, color,
digestibilidad y palatabilidad deseables. Por otra parte las BAL producen
sustancias antimicrobianas que inhiben el crecimiento de microorganismos
patógenos o alterantes.
Las BAL pueden o no producir proteasas extracelulares que a su vez llegarían
a afectar, por medio de hidrólisis enzimática, la funcionalidad de algunas de las
sustancias antimicrobianas de origen peptídico producidas. Davis et al., (1998)
reportó que de 166 cepas de BAL estudiadas ninguna produce proteasas
extracelulares.
1.2.2 Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas. Las BAL se
han empleado para fermentar o crear cultivos en alimentos durante cuatro
15
Marco Teórico
milenios. La aplicación mas corriente en todo el mundo se encuentra en los
productos lácteos fermentados, como el yogurt, el queso, la mantequilla, la
crema de leche, el kefir y el kumis. Contribuyen a la conservación de los
alimentos fermentados debido a su capacidad de inhibir el desarrollo de
microorganismos alterantes y patógenos. El efecto antimicrobiano primario de
esta clase de bacterias se produce por la competencia de nutrientes y al
descenso del pH, debido a la producción de ácidos orgánicos. Además se
producen otras sustancias antimicrobianas como etanol, dióxido de carbono,
diacetilo, acetaldehído, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas (Madigan et al.,
2001).
1.2.2.1 Ácidos orgánicos. Debido a la fermentación de la glucosa y otras
hexosas, se produce ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético y etanol. Una
vez que son sintetizados se liberan al medio extracelular donde valores bajos
de pH (< 4), inhiben o retardan el crecimiento de microorganismos patógenos o
alterantes como E. coli, Salmonella spp, S. aureus, esporas de hongos y
levaduras (Salminen et al., 2004).
1.2.2.2 Peróxido de hidrógeno y otros metabolitos del oxígeno. Como el
desarrollo de las BAL se lleva a cabo en un medio aerobio, se producen
metabolitos del oxígeno como anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno
(H2O2) y radical hidroxilo (HO-), todos ellos producidos durante el proceso de
reducción del oxígeno hasta agua durante la respiración. Estos metabolitos
tienen un efecto antimicrobiano principalmente por la inactivación de enzimas
como: gliceraldehído – 3P – deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, alcohol
deshidrogenasa o coenzima A, por la oxidación de los grupos sulfidrilo. La
inhibición también puede ser causada por el aumento de la permeabilidad de
las membranas debido a la peroxidación de los lípidos y a daños en el material
genético (Madigan et al., 2001).
Algunas BAL pueden producir H2O2, que contribuye a la actividad inhibitoria
contra otros microorganismos, incluidos los patógenos presentes en alimentos
(Gilliland, 1977). El H2O2 imita el efecto de las bacteriocinas, por eso su efecto
antimicrobiano debe ser excluido para comprobar el poder bactericida de las
bacteriocinas (Tagg, 1976).
Rodríguez (1997), determinó que el H2O2 puede ser detectado en caldo Man
Rogosa – Sharpe (MRS) con un pH de 3.9, pero no en uno de pH 6.2,
indicando una fuerte influencia del pH en su estabilidad. La rápida degradación
del H2O2 en MRS sugiere que la composición del medio puede influenciar
altamente la determinación del H2O2 producido por BAL o incluso su habilidad
para producirlo.
16
Marco Teórico
Berthier (1993) encontró que había una relación inversamente proporcional
entre la cantidad de glucosa y la producción de H2O2, independientemente del
medio de cultivo empleado, concluyendo que el MRS reduce la producción del
H2O2 por su alto contenido de glucosa (20g l-1).
Por otra parte Porubcan y Sellars (1979), demostraron que el extracto de
levadura tiene actividad de catalasa por lo tanto no es necesario adicionar
catalasa para evitar el efecto de H2O2 en los medios que contienen este
componente en una cantidad significativa como el MRS (4g l-1).
1.2.2.3 Dióxido de carbono. Como consecuencia de un proceso
heterofermentativo de hidratos de carbono, las BAL producen dióxido de
carbono, que puede crear condiciones anaeróbicas e inhibir el crecimiento de
microorganismos aerobios obligados ó formar ácido carbónico y causar un
descenso de pH (Salminen et al., 2004).
1.2.2.4 Diacetilo. Una vez que se sintetiza, en la vía de degradación del
piruvato, se libera al medio extracelular donde además de formar algunos
aromas de productos fermentados, tiene un efecto antimicrobiano contra
bacterias, hongos y levaduras, posiblemente por la inactivación de enzimas
(Salminen et al., 2004).
1.2.2.5 Acetaldehído. Es producido por L. delbrueckii ssp. bulgaricus por
acción de la treonina-aldolasa, la cual rompe la treonina produciendo
acetaldehído y glicina. Como las cepas de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y S.
thermophilus no pueden metabolizar el aldehído cuando se encuentran en
productos como el yogurt, éste se concentra en el producto aproximadamente
en 25 ppm.
El acetaldehído en concentraciones de 10 – 100 ppm inhibe el crecimiento de
S. aureus, Salmonella typhimurium y E. coli en productos lácteos (Piard et al.,
1991).
17
Marco Teórico
1.2.3 Género Lactobacillus
Figura 1. Micrografía Electrónica de barrido de Lactobacillus casei
Fuente: Broadbent, 2003.
El género Lactobacillus comprende diversas bacterias que tienen en común su
habilidad para producir ácido láctico como producto principal, son Gram
positivas y no forman esporas. Son anaerobios facultativos y su crecimiento
óptimo se da entre 30 y 40ºC, aunque pueden crecer en temperaturas en un
rango de 5 a 53ºC. El pH óptimo de crecimiento esta en pH 5.5 – 5.8, pero en
general crecen a pH <5. El género incluye cerca de 25 especies y su principal
criterio de diferenciación se basa en la composición del producto final de la
fermentación. Algunas bacterias ácido lácticas pueden ser homofermentativas
como L. delbrueckii, L. leichmannii y L. acidophilus ya que el 85% de sus
productos finales es ácido láctico, mientras que otras son heterofermentativas
como L. fermentum, L. brevis, L. casei y L. buchneri, producen solo el 50% de
ácido láctico además de otros productos como etanol, dióxido de carbono y
lactato (Batt, 1999).
En la industria alimentaria son muy útiles en la producción de alimentos
fermentados como yogur, pan, pepinillos y olivas, entre otros, con el fin de
contribuir a la preservación, valor nutricional y sabor (Batt, 1999).
Otra propiedad del género Lactobacillus es la capacidad para producir
bacteriocinas; algunos ejemplos de bacteriocinas producidas por este tipo de
microorganismos se presentan en la Tabla 3.
18
Marco Teórico
Tabla 3. Lactobacillus productores de bacteriocinas.
BACTERIOCINA
PRODUCTOR
ORGANISMOS SENSIBLES
L. acidophilus
Lactacina B
L. delbrueckii, L. helveticus
B L. delbrueckii,
L. fermentum, S. aureus, E. faecalis
Lactacina F
L. acidophilus
P. damnosus
Brevicina 37
L. delbrueckii
Lacticina A
L. delbrueckii subsp. lactis
L. helveticus
L. helveticus, L. delbrueckii
Helveticina J
L. sake
L. monocytogenes
Sakacina A
L. plantarum
Plantaricina A
Lactococcus lactis, E. faecalis
L. gasseri
L. acidophilus, L. brevis
Gassericina A
Adaptado de: González et al., 2003.
1.2.4 Género Lactococcus
Figura 2. Micrografía Electrónica de barrido de Lactococcus lactis
Fuente: Dworkin, 2003.
Los miembros del género de los Lactococcus son bacterias Gram positivas y
según sus condiciones de crecimiento pueden tener un tamaño entre 0.5 – 1.5
µm, no forman esporas y no tienen movilidad. Tienen un metabolismo
fermentativo y producen grandes cantidades de ácido láctico, como es de
esperarse de una cepa de BAL y tienen requerimientos nutricionales complejos.
Su crecimiento óptimo se da a los 30ºC y pueden crecer en temperaturas bajas
hasta los 10ºC. (Batt, 1999).
El género de los Lactococcus es útil en la fabricación de productos de consumo
alimenticio diario. Algunos como L. lactis, L. lactis subsp. lactis y L. cremoris se
usan a diario como fermentos en la producción de derivados lácteos. Además
pueden ayudar a preservar los productos con la producción de bacteriocinas.
De éstas bacteriocinas, la más estudiada es la nisina, que es producida por
Lactococcus lactis (Batt, 1999).
19
Marco Teórico
1.2.5 Género Leuconostoc
Figura 3. Micrografía Electrónica de Barrido de Leuconostoc mesenteroides.
Fuente: Funel, 1999.
El género Leuconostoc comprende bacterias Gram positivas no esporuladas.
Se desarrollan en anaerobiosis o aerobiosis. Como los otros grupos de BAL
necesitan un medio de crecimiento complejo, rico en aminoácidos, péptidos,
carbohidratos, vitaminas y iones metálicos. Por lo general son células esféricas
semejantes a bacilos muy cortos con extremos redondeados (Funel, 1999).
Alrededor del 12% de las BAL aisladas de muchos ecosistemas, en la gran
mayoría de material vegetal, son especies de Leuconostoc. Algunas son
aisladas de la superficie de vegetales y frutas y otras de carnes refrigeradas y
productos lácteos. Como otras especies de BAL el género Leuconostoc es
tecnológicamente interesante en la industria de comidas y bebidas. Además
cepas como Leuconostoc carnosum y Leuconostoc mesenteroides subsp.
dextranicumc producen leucocina A, una bacteriocina que tienen efecto
antimicrobiano comprobado contra la Listeria spp. (Funel, 1999).
1.3 BACTERIOCINAS
1.3.1 Generalidades. En 1925 en Bélgica se descubrió que los filtrados de una
cepa de E. coli, inhibían el crecimiento de otras cepas de la misma especie;
con el tiempo se demostró que la sustancia inhibidora era bactericida y se
denominó colicina. Desde entonces se han realizado aislamientos de agentes
similares en varios géneros microbianos que actúan sobre microorganismos
taxonómicamente relacionados, o no, con el que las produce; el grupo en
conjunto se conoce actualmente como bacteriocinas (Freeman, 1989; Jay,
1992; Pelezar, 1991).
Las bacteriocinas son sustancias antibacterianas de origen ribosomal,
producidas por una gran cantidad de especies bacterianas. Forman un grupo
heterogéneo de moléculas de origen proteico que ejercen acción
20
Marco Teórico
antimicrobiana sobre bacterias susceptibles. Difieren de los antibióticos en su
naturaleza proteica y en su acción sobre especies taxonómicamente
relacionadas; además no tienen uso terapéutico ni en humanos ni animales
(Jay, 1992).
Las bacteriocinas producidas por BAL ejercen efecto inhibitorio especialmente,
sobre microorganismos Gram positivos (Doyle, 1997), existen pocos reportes
de bacteriocinas que inhiban el crecimiento de microorganismos Gram
negativos, aunque se han encontrado algunas cepas como el L. curvatus y el L.
casei que inhiben el crecimiento de cepas patógenas de E. coli y Salmonella
enerica sin necesidad de tratamiento previo (Chung, 2003). Por lo general las
bacterias Gram negativas se tratan inicialmente con agentes quelantes como el
EDTA, alta presión hidrostática o alguna otra lesión que destruya la pared
celular para permitir la entrada de las bacteriocinas y obtener un efecto
antibacterial satisfactorio (Stevens, 1991; Kalchayanand, 1994).
En la actualidad se someten extractos crudos a diferentes factores físicoquímicos ya que el efecto de estos sobre la actividad de una bacteriocina no
sólo tiene el fin de caracterizarla, sino también sirve para inferir su posible
aplicación industrial, ya que las altas temperaturas y las amplias variaciones de
pH son, entre otras, algunas de las condiciones que debe resistir una
bacteriocina para ser útil como potencial agente inhibidor de microorganismos
no deseados en procesos alimenticios (fermentaciones de leche, maduración
de quesos, curado de encurtidos, etc.) (Farías, 1996).
1.3.2 Clasificación. Las bacteriocinas tienen una serie de propiedades
bioquímicas comunes como la sensibilidad a la acción de enzimas proteolíticas,
debida a su naturaleza proteica, tolerancia a elevadas temperaturas y
estabilidad a bajo pH, aunque también difieren en su espectro de actividad,
modo de acción, características bioquímicas y determinantes genéticos, por lo
que se han clasificado de la siguiente manera (Klaenhammer, 1993):
•
Grupo I. Las bacteriocinas de este grupo, llamadas lantibióticos, son
pequeños péptidos (<5kDa), que contienen aminoácidos poco comunes
como dehidroalanina (DHA), dehidrobutirina (DHB), lantionina y β –
metilantionina. Este grupo se divide en dos subgrupos en base a su
estructura y funcionalidad.
Ia) Péptidos catiónicos y alargados. Actúan interfiriendo la
integridad de la membrana del microorganismo objetivo. La Nisina
A que es la bacteriocina mejor caracterizada de las producidas por
bacterias ácido lácticas, pertenece a éste grupo.
Ib) Péptidos globulares, actúan interfiriendo en la función
enzimática de la membrana celular.
21
Marco Teórico
•
Grupo II. Son péptidos pequeños (<10kDa), termoestables y sin
aminoácidos modificados en su estructura primaria. Se dividen en cuatro
subclases:
IIa) Se caracterizan por ser particularmente activas frente a los
organismos del género Listeria spp. La bacteriocina más estudiada
de éste grupo es la pediocina.
IIb) Contiene bacteriocinas cuya actividad depende de la acción
complementaria de dos péptidos como la lactococina G.
IIc) Incluye a las bacteriocinas de la clase II que se transportan
usando un sistema sec-dependiente.
IId) Son aquellas bacteriocinas del grupo II que no pueden
clasificarse en ninguna de las anteriores subclases, como la
lactococina A.
•
Grupo III. Estas bacteriocinas se caracterizan por ser proteínas
termolábiles de mayor peso molecular (>30kDa). Hay muy pocas
bacteriocinas clasificadas en este grupo (Lantacina A y B, Caseicin,
Acidophilucin A, Helveticin J y V-1829) posiblemente por la falta de
conocimiento en el tema. (Salminen et al., 2004)
•
Grupo IV. Las bacteriocinas de es grupo como leuconocina S, lactocina
27 y pediocina SJ-1 tienen una fracción de lípido o carbohidrato. La
composición y función de estas porciones no proteicas son
desconocidas (Jack, 1995; Montville et al., 1997).
1.3.3 Modo de Acción. Las bacteriocinas actúan sobre la membrana celular
del microorganismo sensible, rompiendo la permeabilidad de la membrana
citoplasmática, incrementando la permeabilidad de pequeños compuestos (K+,
Na+, Cl-), haciendo que las células no sean capaces de proteger al citoplasma
del medio ambiente, llevando a la inhibición celular.
Se conocen dos tipos de modos de acción principalmente (Figura 4):
•
•
Formación de poros: los monómeros de bacteriocina enlazados se
insertan y polimerizan en la membrana citoplasmática para formar un
poro con los residuos hidrofílicos en la cara interior y los hidrofóbicos en
la cara exterior (Klaenhammer, 1993; Abee et al., 1994; Chikindas et al.,
1993).
Efecto detergente: las bacteriocinas hacen más permeable a la
membrana, aumentando la interacción en ésta con el medio ambiente
permitiendo la liberación de iones, enzimas y ATP (Sahl, 1985;
Chikindas et al., 1993).
22
Marco Teórico
Figura 4. Modo de acción de las bacteriocinas.
Fuente: Doyle, 1997.
1.3.4 Aplicaciones de bacteriocinas en alimentos. Un amplio rango de
bacteriocinas producidas por BAL han sido investigadas intensamente
permitiendo su caracterización química detallada (Roos, 1999). Debido a que
las BAL han sido usadas por siglos para alimentos fermentados, se consideran
como seguras por la FDA (Food and drug administration) de Estados Unidos y
esto permite su uso en la fermentación de alimentos sin una aprobación
adicional. La nisina fue la primer bacteriocina en ser aislada y aprobada para
ser usada en alimentos específicamente para prevenir el brote de esporas de
Clostridium botulinum en quesos distribuidos en Inglaterra (Chung, 1989).
El uso de nisina tiene una larga historia y actualmente es empleada como
conservante seguro de alimentos en alrededor de 48 países diferentes siendo
aprobada por la FDA en 1988 (Roos, 1999). La atención de los investigadores
de bacteriocinas se enfocó en la bacteria Listeria monocytogenes, agente
causal de listeriosis, ya que la frecuencia de brotes de esta infección aumentó
combinada con la resistencia natural del agente causal. Además, el estudio de
esta bacteria fue interesante debido a su capacidad de crecer a temperaturas
cercanas a la refrigeración que se utilizan para la preservación tradicional de
alimentos. Esto condujo al aislamiento de un gran número de bacteriocinas de
clase IIa, las cuales son altamente activas contra L. monocytogenes (Ennahar,
2000).
Las bacteriocinas también han sido usadas en carne curada, leche, queso y
pasta de soya (Riley, 2002). Se ha desarrollado gelatina de pediocina, una
bacteriocina de clase IIa producida por bacterias productoras de ácido láctico,
que protege a las comidas rápidas de la contaminación bacteriana (Raloff,
1998). Una cepa productora de pediocina también ha sido adicionada a
embutidos y se ha encontrado una reducción del número de bacterias unas
10.000 veces respecto al número en embutidos no tratados. Además la
pediocina activa fue encontrada en los embutidos dos meses después de la
23
Marco Teórico
refrigeración. Otro ejemplo de una bacteriocina que podría usarse en la
industria alimenticia es la piscicolina, una bacteriocina producida por
Carnobacterium pscicola otra bacteria productora de ácido láctico (Raloff,
1998). La piscicolina ya ha sido patentada y pronto será usada en productos de
carne y para lavar ensaladas verdes (Raloff, 1998).
En la actualidad se emplean bacteriocinas para desarrollar envases activosreactivos. Morales et al. (2004) ensayó la pediocina en extracto crudo liofilizado
producido en MRS y nisina comercial concentrada por rotoevaporación, para
desarrollar películas de polietileno antimicrobianas. Por otra parte, se ha
estudiado la producción de envases comestibles con diferentes
concentraciones de nisina, con lo que se contribuye a disminuir aditivos en los
alimentos (Schause et al., 2004). Estas bacteriocinas por lo general se emplean
como parte de la tecnología de barreras por su termoresistencia y
disponibilidad comercial.
Tecnología de barreras. La estabilidad y seguridad microbiana de la mayoría de
los alimentos se basa en la combinación de varios factores (obstáculos), que
no deberían ser vencidos por los microorganismos. Esto es ilustrado por el
llamado "efecto barrera", que es de fundamental importancia para la
preservación de alimentos dado que las barreras en un producto estable
controlan los procesos de deterioro o fermentación no deseados y disminuyen
la producción de toxinas por parte de microorganismos patógenos. Además, el
concepto de barrera ilustra el hecho de que las complejas interacciones entre
temperatura, actividad de agua, pH, potencial redox, etc., son significativas
para la estabilidad microbiana de los alimentos. La tecnología de barreras
(tecnología de obstáculos o métodos combinados), permite mejoras en la
seguridad y calidad, así como en las propiedades económicas de los alimentos,
mediante una combinación inteligente de obstáculos que aseguran la
estabilidad y seguridad microbiana, así como propiedades organolépticas y
nutritivas satisfactorias (Murno, 2003).
La preservación por métodos naturales se ha vuelto el gran desafío para la
industria de los alimentos. Todos los alimentos pueden ser procesados usando
métodos físicos o químicos que los vuelven microbiológicamente sanos. Sin
embargo, esos alimentos son poco llamativos para los consumidores porque
prefieren el flavour natural y fresco. Las bacteriocinas purificadas o las BAL
productoras de bacteriocinas podrían utilizarse, solas o en combinación con
otras barreras, para asegurar la calidad higiénica y sanitaria de muchos
alimentos. Alzamora (2004) combinó tratamiento de nisina y pulsos eléctricos
en puré de frutas contaminado con Bacillus cereus reduciendo en 5 log la carga
microbiana.
24
Marco Teórico
1.3.5 Antecedentes. A continuación se relacionan algunas fuentes que
reportan avances en cuanto a producción, caracterización y concentración;
algunos de los posibles usos de bacteriocinas se mencionan en el numeral
1.3.4.
AUTOR
FECHA
APORTE
Es necesario un medio complejo como el MRS para
Yang y Ray
1994
el crecimiento de las BAL para poder obtener
mayor producción de bacteriocinas.
El Tween 80 (presente en el medio MRS) estabiliza
la actividad antimicrobiana de las bacteriocinas
Garver
1994
formando micelas con las proteínas del medio de
cultivo.
La purificación de las bacteriocinas producidas por
Chung
2003
BAL se dificulta por la interferencia de los medios
de cultivo.
La concentración por ultra-filtración causa perdida
Klimchalk y Wang
1997
de la actividad antimicrobiana, en algunos casos.
Precipitación con sulfato de amonio, cromatografía
de intercambio iónico y HPL se emplean con éxito
Tichackzek
1992
para purificar bacteriocinas, sin embargo los
cambios de pH disminuyen la actividad
antimicrobiana.
Recomienda para el estudio de las bacteriocinas la
purificación por diversos medio químicos. Para el
Chung
2003
uso no es necesaria dicha purificación.
CARACTERIZACIÓN: Los diferentes autores difieren en las técnicas empleadas para
obtener un extracto libre de células a caracterizar, sin embargo el proceso de
caracterización empleado es básicamente el mismo.
Para caracterizar bacteriocinas descartó el efecto
inhibitorio de ácidos orgánicos y H2O2, determinó la
naturaleza proteica ensayando 3 proteasas,
Chung
2003
termoresistencia a 60 y 100ºC por 10 y 20 minutos
y evaluó inhibición contra dos cepas de E. coli, dos
de Salmonella y Listeria.
CONCENTRACIÓN: Pocas referencias detallan el proceso de concentración de las
bacteriocinas. Comercialmente se consiguen en polvo liofilizado.
Empleó en su estudio nisina concentrada por
Morales
2004
rotoevaporación y pediocina en extracto crudo
liofilizado producida en MRS.
1.4 MICROORGANISMOS INDICADORES
Los microorganismos indicadores, son organismos habitualmente asociados a
la presencia de patógenos. En las pruebas de inhibición se utilizan para evaluar
la capacidad inhibitoria de las sustancias antimicrobianas estudiadas. Para el
caso que se estudia en éste proyecto, se utilizaron dos microorganismos
indicadores: E. coli y S. aureus. Cada uno representa a un grupo de bacterias
25
Marco Teórico
Gram negativas y Gram positivas, respectivamente, con el fin de evaluar el
efecto inhibitorio de las sustancias antimicrobianas obtenidas, ante
microorganismos con paredes celulares estructuralmente distintas.
Las bacterias Gram positivas presentan a menudo polisacáridos ácidos unidos
a la pared celular denominados ácidos teicoicos, que incluye a toda la pared,
membrana o polímeros capsulares que contienen glicerolfosfato o residuos de
fosfato de ribitol. Estos polialcoholes están unidos por ésteres de fosfato, y
generalmente se les unen otros azúcares y D-alanina. La carga negativa neta
de la superficie celular es aportada por los ácidos teicoicos y puede servir para
el trasiego de iones a través de la pared celular. Además presenta una capa de
peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared y es la responsable de
su rigidez (Madigan et al., 2001).
Las bacterias Gram negativas presentan 10% de peptidoglicano en la pared
celular, poseen una capa adicional que está compuesta de lipopolisacáridos.
Esta capa representa de hecho una segunda bicapa lipídica, que contiene
además polisacáridos y proteínas (Madigan et al., 2001).
Figura 5. Estructura de la pared celular de las Gram positivas.
Fuente: Madigan et al., 2001.
Figura 6. Estructura de la pared celular de las Gram negativas.
Fuente: Danival org, 2006.
26
Marco Teórico
1.4.1 Escherichia coli.
Figura 7. Micrografía Electrónica de barrido de E. coli
Fuente: Rocky Mountain Laboratorios, 2005.
Es un microorganismo Gram negativo, no esporulado, que tiene la habilidad de
invadir la mucosa intestinal. Es un organismo mesófilo típico que crece a
temperaturas entre 7 y 50ºC, con una temperatura óptima a 37ºC.
Varias cepas de E. coli han emergido recientemente como importantes
patógenos transmitidos por alimentos. Se caracterizan por su capacidad de
producir potentes enterotoxinas y por ello se las designa como cepas de E. coli
enterotóxico o cepas ETEC. La fuente mas común de infecciones por E. coli es
la carne cruda o poco cocida (Esquivel, s.f)
1.4.2 Staphylococcus aureus. Es un coco Gram positivo, catalasa positivo,
osmotolerante y soporta una actividad acuosa (aw) baja. S. aureus produce
una enterotoxina responsable del síndrome de choque tóxico e intoxicación por
alimentos. Esta enterotoxina no es destruida a 100ºC durante treinta minutos.
Figura 8. Micrografía Electrónica de barrido de S. aureus
Fuente: Todar, 2005.
La diseminación de ésta bacteria en los alimentos se lleva a cabo por
humanos, por contacto directo o indirecto a través de la respiración. La
producción de la toxina se produce por refrigeración inadecuada, escasa
higiene personal, calentamiento inadecuado o un uso prolongado de bajo
calentamiento. Se puede encontrar en carnes, utensilios almacenados, leche
27
Marco Teórico
contaminada y productos diversos que son manipulados por el hombre (Bryan,
1976; Doyle, 1997).
1.5 FUNDAMENTO DE TÉCNICAS EMPLEADAS
1.5.1 Sedimentación de la biomasa por centrifugación. La centrifugación
busca la separación de las fases de un fluido basándose en la diferencia de
densidades de éstas por medio de fuerzas centrífugas. El uso de centrifugas
aumenta en alto grado las fuerzas que actúan sobre las partículas, así,
aquellas que no se precipiten o que lo hagan con mucha lentitud en
precipitadores por gravedad, casi siempre se pueden separar por medio de
fuerzas centrífugas. Estas fuerzas de precipitación de gran magnitud permiten
obtener velocidades prácticas con partículas mucho mas pequeñas que en los
precipitadores por gravedad. Se usa para separar la crema de la leche,
procesamiento de aceites vegetales, concentración de proteínas de pescado,
etc (Geankoplis, 2003).
Para el estudio de sustancias antimicrobianas producidas por BAL, se emplea
la centrifugación para disminuir y/o eliminar la presencia de células en los
sobrenadantes (Morales et al., 2004; ANPENET, 2006).
1.5.2 Concentración de sobrenadantes por evaporación. Es uno de los
principales métodos utilizados en la industria para la concentración de
disoluciones acuosas. Normalmente implica la separación de agua de una
disolución mediante la ebullición de la misma en un recipiente adecuado, el
evaporador, con separación del vapor. La evaporación se lleva a cabo
suministrando calor a la disolución para vaporizar al disolvente. El calor se
suministra en gran parte para proporcionar el calor latente de vaporización
(Geankoplis, 2003).
Los extractos de los cuales se obtienen sustancias proteicas producidas por
BAL han sido concentradas por métodos físicos como: evaporación (Cardoso,
2004), liofilización (ANPENET, 2006; Bousquets et al., 2004; Morales et al.,
2004) y rotoevaporación (Morales et al., 2004). Sin embargo estos métodos son
empleados para caracterización preliminar ya que la pureza del extracto
obtenido puede ser baja (ANPENET, 2006).
De estudios realizados se sabe que las sustancias inhibitorias de origen
proteico presentes en los extractos son un grupo heterogéneo de biomoléculas
en cuanto a composición, estructura y propiedades, lo que hace difícil unificar
criterios de purificación, más aún cuando se trata de moléculas cuya actividad
biológica debe ser conservada durante el proceso (ANPENET, 2006). Sin
embargo las técnicas comúnmente empleadas para la purificación y
28
Marco Teórico
concentración de este tipo de proteínas son: precipitación con sulfato de
amonio, cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrofóbica,
cromatografía de exclusión por tamaño y HPLC de fase reversible. El método y
las secuencias dependen de las propiedades biológicas y físico-químicas de los
extractos como el peso molecular, la carga neta, características bioespecíficas
e hidrofobicidad (Kennedy, 1990; García et al., 1993).
1.5.3 Pruebas de inhibición. Los métodos usados para evaluar la actividad de
los antimicrobianos se dividen en pruebas discriminativas o de aplicación. Las
primeras a su vez pueden ser:
a) De punto final, cuando un microorganismo es probado por un periodo de
tiempo arbitrario y los resultados reflejan el poder inhibitorio de un
compuesto solo por un tiempo específico a través de: pruebas de
difusión en agar y caldo, placas con gradientes y pruebas de
desinfectantes y sanitizantes.
b) Descriptivas, donde se realiza un muestreo periódico para determinar los
cambios en el número de células viables con respecto a un tiempo
determinado por pruebas turbidimétricas y curvas de inhibición o muerte
(Davidson et al., 1993).
El método de difusión en agar ha sido el más usado para la determinación de
actividad antimicrobiana (NCCLS, 1991), ha sido aceptado por la FDA – USDA
y es un método estándar aceptado por la Nacional Committee for Clinical
Laboratory Standard (NCCLS). En dicha prueba el compuesto antimicrobiano
se adiciona a una capa de agar impregnado en un disco de papel o en un pozo
en el agar. El grado de inhibición se observa por una zona de no crecimiento
alrededor del disco o pozo, la susceptibilidad de los microorganismos
indicadores se relaciona con los halos de inhibición (en mm), lo que depende
de la velocidad de difusión del compuesto y del crecimiento celular. Los
resultados que se obtienen son cualitativos (NCCLS, 1991).
1.5.4 Análisis visual de proteínas con electroforesis SDS-PAGE. La
electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño
y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa (Berkelman, 1998).
Fue empleada por primera vez por Tiselius en el año 1937, pero su importancia
vino a incrementarse cuando en los años cincuenta Raymond y Weintraub,
impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asignó a la separación de
materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte;
aunque este término se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas
submicroscópicas, se ha convertido en estos últimos años en una metodología
aplicada a sustancias de bajo peso molecular (Berkelman, 1998).
29
Marco Teórico
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida,
comúnmente
denominada
electroforesis
en
poliacrilamida
(PAGE,
'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las técnicas
más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La
electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico
a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de
microgramos de proteína (Reina, 2003).
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio
que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la
propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La
velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la
proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será
la migración. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son
químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pH,
temperatura y fuerza iónica (Reina, 2003).
El SDS es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las cadenas
polipeptídicas desnaturalizadas con una relación de 1.4 g de SDS por gramo de
proteína, uniéndose aproximadamente una molécula de SDS por cada dos
aminoácidos de la cadena. Esta unión masiva de moléculas de SDS bloquea la
carga propia de la molécula de proteína y le confiere al complejo una carga
neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las proteínas
acomplejadas con SDS viajen hacia el ánodo. La separación de los complejos
SDS-proteína es proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas tienen
la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces determinar el peso
molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de
proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas
en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso
molecular (Reina, 2003).
30
Materiales y Métodos
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS UTILIZADAS
Se usaron nueve cepas de BAL, conservadas según el sistema Cryobank™
(véase el Anexo A), aisladas de Suero Costeño e identificadas por medio del
sistema API de Biomérieux (Tabla 4) en el Laboratorio de Ingeniería de la
Universidad de La Sabana en un proyecto anterior 1. También se usó una cepa
comercial de Lactobacillus casei de la empresa Centro Sperimentale del Latte
(CSL), como microorganismo control en las pruebas de inhibición del proceso
de concentración, referenciada como productora de bacteriocinas (Chung,
2003).
Tabla 4. Relación general de cepas de bacterias ácido lácticas utilizadas.
REFERENCIA
2
10
40
156
205
206
279
381
238
ID. API V5.0
Lactobacillus pentosus
Lactobacillus acidophilus 3
Lactobacillus brevis 1
Lactococcus lactis lactis 1
Lactobacillus paracasei paracasei 1
Leuconostoc lactis
Lactobacillus paracasei paracasei 1
Lactococcus lactis lactis 2
Lactobacillus plantarum 1
Fuente: Cruz, 2006 (Datos no publicados).
2.2 MICROORGANISMOS INDICADORES
Se utilizaron las cepas ATCC 25922 de E. coli y ATCC 460716 de S. aureus,
conservadas mediante el sistema Cryobank™, como microorganismos
indicadores para evaluar el efecto inhibidor de los extractos de BAL. Se
activaron bajo el mismo protocolo del Anexo A en caldo Müller Hinton y se
incubaron durante 48 horas a 37ºC.
2.3 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO
2.3.1 Activación de las BAL. Se activó el inóculo congelado, de cada una de
las cepas reportadas en la Tabla 4 según el sistema Cryobank™, en tubos de
ensayo con 5 ml de caldo Man Rogosa – Sharpe (MRS) (véase el Anexo B) y
se incubaron a 37ºC por 72 horas.
1
Cruz, 2006 (Datos no publicados).
31
Materiales y Métodos
El caldo MRS se utiliza para el enriquecimiento, cultivo y aislamiento de todas
las especies de Lactobacillus, a partir de todo tipo de materiales de
investigación (DeMAN et al., 1960). Al contrario de otros medios de cultivo,
sobre los medios MRS crecen todo tipo de lactobacilos, incluso los L. brevis y
L. fermenti difícilmente cultivables (MERCK, 1994).
2.3.2 Cultivo de las cepas activadas. Se inocularon, en condiciones
asépticas, 50 ml de caldo MRS con 0.1 ml del cultivo obtenido previamente,
con el fin de obtener un volumen suficiente de muestra para poder llevar a cabo
los procedimientos planteados.
2.3.3 Verificación de cultivo. Se verificó la morfología de los microorganismos
presentes por medio de tinción de Gram (véase el Anexo C). Además se
realizaron controles en placas de agar Müeller Hinton (MH) (véase el Anexo B)
y a las 24 horas de crecimiento se realizó prueba de catalasa.
2.3.4 Separación por centrifugación. Se centrifugó el cultivo en dos ciclos de
15 minutos cada uno para separar el extracto proteico de las bacterias y
moléculas grandes del medio de cultivo. Se ajustó la centrífuga Universal 32R,
a 9500 x g, 4ºC, 15 minutos. Al finalizar el primero de los ciclos se pasó el
sobrenadante a otro tubo limpio evitando generar turbulencia y luego se repitió
el procedimiento.
Por último el sobrenadante se repartió en dos partes iguales, una de las cuales
se neutralizó y la otra no.
2.3.5 Neutralización de sobrenadantes. Se ajustó el sobrenadante obtenido a
pH (6-7), con el titulador 702 SM Titrino® y una solución de NaOH 10N, con el
fin de descartar efecto de inhibición por acidez.
2.4 CONCENTRACIÓN DE SOBRENADANTES POR EVAPORACIÓN
La producción de bacteriocinas tiene como limitante la cantidad que se produce
por litro de cultivo; Martínez et al. (1998), obtuvo 0.025 µg/ml de pediocina PA1, valor que varía de acuerdo a las condiciones y cepas a producir. Por lo tanto
se hace necesario concentrar dichas sustancias para poder ser estudiadas y
obtener mejores resultados en los ensayos de inhibición. Para este trabajo se
ensayaron diferentes métodos de concentración (véase el Anexo D). Dadas las
condiciones de trabajo se determinó concentrar por evaporación.
32
Materiales y Métodos
En frascos de vidrio, se sirvieron 3 ml de sobrenadante de cada una de los
extractos crudos neutralizados y no neutralizados y se llevaron a una estufa
Memmert a 40ºC, durante 100 horas. Cumplido el tiempo establecido (por los
autores), se determinó, por diferencia de volúmenes, una reducción de hasta
6.25 veces (84% del volumen inicial). Las muestras se conservaron en
refrigeración a 4ºC.
Al establecer las condiciones de este proceso se tuvo en cuenta una
temperatura baja (40ºC) para evitar la desnaturalización de las proteínas y un
tiempo de proceso largo de 100 horas para obtener un porcentaje significativo
en la reducción del volumen.
2.5 PRUEBAS DE INHIBICIÓN
El procedimiento que se siguió para medir la inhibición de los microorganismos
indicadores en desarrollo del proyecto fue la difusión en agar.
•
Se sembraron los cultivos indicadores E. coli y S. aureus en dos tubos
de ensayo, cada uno con 10 ml de caldo MH y se incubaron a 37ºC por
48 horas.
•
Cumplido el crecimiento de los microorganismos indicadores, se preparó
agar MH en dos erlenmeyer cada uno con el volumen correspondiente al
número de cajas a emplear, teniendo en cuenta que en cada una se
sirven 20 ml de agar. Se esterilizó en autoclave a 125ºC y 15 psi y se
llevo al baño de María a una temperatura de 40ºC para evitar que se
gelificara el agar.
•
Se dispuso de un cultivo de microorganismo indicador para cada
erlenmeyer y se inoculó cada uno con 0.1% de los cultivos. Se sirvieron
rápidamente 20 ml en cada caja de Petri.
•
Una vez el agar se gelificó, se abrieron hasta ocho pozos en el agar con
la parte superior de una pipeta Pasteur estéril y en cada uno se sirvieron
70 µl de extracto.
•
Se incubó durante 24 horas a 37ºC y se midió el diámetro de los halos
de inhibición. Si fue superior a 7 mm (incluyendo el diámetro del pozo
que es de 6mm), el efecto inhibitorio se consideró como positivo.
2.6 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA TOTAL
La proteína presente en el extracto debe cuantificarse para determinar la
cantidad a utilizar en los ensayos de electroforesis.
33
Materiales y Métodos
Existen diversos métodos para la cuantificación de proteínas, todos ellos
basados en alguna de sus propiedades, como pueden ser los patrones de
adsorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos, la
reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, etc. Los métodos
espetrofotométricos y colorimétricos se miden por absorbancia con UV, el cual
junto con lípidos, hidratos de carbono y azúcares pueden causar reacciones
que interfieran en la determinación (Badui, 1999).
Se ensayaron diferentes métodos de cuantificación de proteína disponibles en
el laboratorio sin obtener éxito, dada la composición del medio de cultivo, por lo
tanto se estimó la cantidad en los extractos empleando las tiras Uriscreen®10,
que se utilizan en medicina para determinar la proteína presente en la orina.
Los resultados obtenidos se dan en un rango entre 0 y 500 mg/dl de proteína
total, un rango muy amplio para los valores esperados, sin embargo se
evaluaron dependiendo del color que tomó la zona reactiva de la tira luego de
ser sumergida en la muestra.
2.7 PRUEBAS DE CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO CONCENTRADO
NEUTRO
Para poder clasificar las posibles bacteriocinas es necesario determinar que la
sustancia inhibitoria del microorganismo indicador sea de naturaleza proteica y
se debe conocer su termoresistencia y peso molecular.
2.7.1 Determinación de la naturaleza proteica. Con el fin de comprobar la
naturaleza proteica del producto, se hizo una hidrólisis enzimática de proteínas
para romper las uniones peptídicas en el interior de las cadenas de polipéptidos
y se utilizó Alcalase® Grado Alimenticio de Novozymes (Ficha Técnica
Alacalasa® Grado Alimenticio, Novozymes®, 2006).
Se sirvieron 400 µl de los diferentes extractos en tubos Eppendorff y se
agregaron 3 µl de la enzima por cada 100 µl del extracto. Se agitó y se colocó
en estufa a 37ºC por 3 horas (ANPENET, 2006) luego de las cuales se realizó
la prueba de inhibición por difusión en agar. Si los resultados de la prueba
mostraban halos, significaba que el efecto inhibitorio de las muestras fue
causado por otro agente diferente a los péptidos.
2.7.2 Termoresistencia. Según la clasificación de Klaenhammer (1993), las
bacteriocinas según el grupo al que pertenezcan, pueden ser termoresistentes
o termolábiles. Para comprobar el efecto de la temperatura en el extracto, se
sirvió 1 ml de muestra en tubos Eppendorff y luego se expusieron a una
34
Materiales y Métodos
temperatura de 100ºC durante 15 minutos (Oscáriz, 2000). Después se dejaron
enfriar y se realizó una prueba de inhibición por difusión en agar.
2.7.3 Catalasa. Como se ha mencionado el cultivo de las cepas de BAL se
lleva a cabo en caldo MRS. Con base en la bibliografía del numeral 1.2.2.2 se
descarta que el efecto inhibitorio se deba al H2O2.
2.7.4 Análisis visual de proteínas con electroforesis SDS-PAGE. Se
prepararon los geles y muestras como se indica en el protocolo para
electroforesis SDS – PAGE de Laemmli (véase el Anexo E). Se realizó el
montaje en la cámara de electroforesis Mini PROTEAN® 3 Cell de BIO –RAD,
para un gel con 8 y 14% de concentración de monómeros totales en los geles
de concentración y resolución, respectivamente.
Las muestras fueron preparadas diluyéndolas a una concentración 1:2 con el
buffer y se sirvieron 10µl por pozo. En cada desarrollo electroforético se usaron
3.8µl de marcador: Mark 12® Unstained Standard de Invitrogen® que resuelve
hasta un peso molecular de 6kDa (véase el Anexo F).
La electroforesis se corrió durante tres horas a 80 voltios, manteniendo la
cámara dentro de un recipiente con agua fría, para disipar el calor producido
por los electrodos y de esta forma evitar problemas de resolución. Una vez
completado el tiempo de corrido se siguió el protocolo para coloración del gel.
Se tomaron analizaron las fotografías del gel con el programa Quantity One®.
2.8 APLICACIÓN EN MATRIZ ALIMENTARIA
Se buscó un alimento de consumo masivo, preferiblemente líquido para facilitar
el manejo del ensayo y con posibilidades de ser usado a temperatura ambiente,
como lo es una salsa ranchera de barra de ensaladas de preparación casera
cuya composición se encuentra en la Tabla 5.
Tabla 5. Composición de la salsa ranchera casera.
Ingrediente
Huevo
Aceite de oliva
Vinagre
Crema de leche
Queso parmesano
Sal
Pimienta
Fuente: Autores
35
%
6.25
56.87
2.28
22.5
10
1.3
0.8
Materiales y Métodos
Para evaluar la calidad inicial de la salsa se sembraron 0.1 ml de ésta en una
placa con agar manitol sal y otra con agar VRBD (Agar- Violeta cristal- Rojo
neutro- Bilis- Glucosa) (véase el Anexo B).
La siembra en agar manitol sal tiene como objetivo el aislamiento selectivo de
estafilococos, éstos fermentan el manitol produciendo viraje del medio a
amarillo alrededor de las colonias por producción de ácido a partir de manitol.
Esta característica es un criterio para orientar la identificación de S. aureus. El
elevado contenido de cloruro sódico limita el crecimiento de algunas bacterias
distintas a estafilococos. En el agar VRBD el violeta cristal y las sales biliares
inhiben considerablemente la flora acompañante. La degradación de la glucosa
con la consiguiente formación de ácido se manifiesta por el viraje a rojo y
eventualmente por la precipitación de ácidos biliares alrededor de las colonias
correspondientes. Puesto que todas las enterobacterias degradan la glucosa,
con formación de ácido, son fácilmente reconocibles en este agar (MERK,
1994).
Para comprobar el efecto inhibitorio en alimento se realizó el siguiente
procedimiento:
a) Se hicieron diluciones seriadas de los microorganismos indicadores
hasta alcanzar una concentración de 105 Unidades Formadoras de
Colonia (UFC)/ml.
b) Se colocaron 4 ml de salsa en 12 tubos de ensayo estériles.
c) Se inocularon 6 tubos con 0.1ml de la última dilución de E. coli y 6 tubos
con 0.1ml de la última dilución de S. aureus.
d) A 2 tubos inoculados con E. coli y a 2 tubos inoculados con S. aureus se
adicionaron 10µl de extracto concentrado/ml de salsa y se repitió el
proceso con 20 y 30µl de extracto en los tubos restantes.
e) Se hicieron 4 diluciones seriadas de todos los tubos a la hora cero de
inoculación y se sembraron en una placa de Petri con 20ml de agar MH
por cada tubo con 20µl de cada dilución. Se repitieron los dos pasos
anteriores a las 12 y 24 horas de inoculación.
f) Se realizó el recuento de microorganismos totales a las 24 horas de
cada siembra.
g) Para tener un control de microorganismos, se llevó a cabo un
procedimiento como el anterior pero sin adicionar extracto concentrado.
El extracto concentrado empleado para esta prueba fue el de la cepa
Lactobacillus plantarum (238), el cual presentó inhibición contra los dos
microorganismos indicadores en los diferentes ensayos.
36
Resultados y Análisis
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS
3.1 RESULTADOS PRELIMINARES
Se consideran resultados preliminares, los realizados por Lina Marcela Torres,
uno de los autores, en el año 2004 con el proyecto “Evaluación de efectos
inhibitorios de Lactobacillus casei en cepas de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus” para la asignatura de microbiología, el cual consistió
en concentrar los sobrenadantes por diferentes métodos: rotoevaporación y
liofilización.
También se consideran resultados preliminares los realizados por los autores
en los años 2005 y 2006, con los cuales se buscó estandarizar los métodos
propuestos. Los resultados preliminares se encuentran en el Anexo D.
3.2 RESULTADOS EXPERIMENTALES
Son los obtenidos durante el ensayo final que reúne los procedimientos de
concentración, inhibición de microorganismos indicadores y caracterización de
los extractos.
3.2.1 Activación y cultivo de cepas aisladas. Una vez activadas y cultivadas
las nueve cepas de BAL obtenidas de Suero Costeño y el L. casei, se realizó
un conteo de microorganismos y se determinó un crecimiento en la mayoría de
cepas de 1X109 UFC/ml, después de 48 horas de activación.
3.2.2 Verificación de cultivo. Por medio de la tinción de Gram se comprobó
que los cultivos de las BAL no presentaban bacterias Gram negativas ni
morfologías mixtas. En algunos ensayos se realizaron repiques en placas de
Petri con MRS y prueba de catalasa sobre los mismos.
3.2.3 Neutralización de sobrenadantes. En el Anexo G, se muestran los
valores de pH obtenidos antes y después de la neutralización, donde se
reportan valores de pH entre 3.66 y 4.61, que indican que hubo producción de
ácidos orgánicos por las cepas de BAL ensayadas.
Estos resultados se acercan a los obtenidos por Alvarado (2000) donde las
cepas de BAL cultivadas para estudios en producción de quesos, manejan
rangos de pH similares y son confirmados con cepas de referencia.
37
Resultados y Análisis
3.2.4 Concentración de sobrenadantes por evaporación. De acuerdo al
numeral 2.4 los ensayos realizados a 40ºC por 100 horas, concentraron
aproximadamente un 84% del volumen inicial del sobrenadante. Las pruebas
de inhibición para éste ensayo arrojaron resultados positivos, como se observa
en la Tabla 7. Estos resultados se consideran válidos y coherentes ya que los
diámetros de los halos de inhibición de los extractos neutros fueron de menor
tamaño que los observados para los extractos sin neutralizar.
Tabla 6. Convenciones para Tabla 7 y Figuras 11 a 20.
1
2
3
4
5
6
7
8
Muestra 1 neutra
Duplicado muestra 1
Muestra 2 neutra
Duplicado muestra 2
Muestra 1 no neutra
Duplicado muestra 1 no neutra
Muestra 2 no neutra
Duplicado muestra 2 no neutra
Tabla 7. Resultados de pruebas de inhibición de evaporación a presión atmosférica,
40ºC y 100 horas de tratamiento.
CEPA
Lactobacillus pentosus
(02)
Lactobacillus
acidophilus (10)
Lactobacillus brevis 1
(40)
Lactococcus lactis lactis
1 (156)
Lactobacillus paracasei
paracasei 1 (205)
INDICADOR
S.aureus
E.coli
S.aureus
E.coli
S.aureus
E.coli
S.aureus
E.coli
S.aureus
E.coli
S.aureus
Leuconostoc lactis (206)
E.coli
Lactobacillus plantarum S.aureus
E.coli
1 (238)
Lactobacillus paracasei S.aureus
E.coli
paracasei 1 (279)
Lactococcus lactis lactis S.aureus
2 (381)
E.coli
S.aureus
Lactobacillus casei
E.coli
M UESTRAS
1
++
++
++
++
++
++
+
+
0
0
0
0
+
+
0
0
++
++
0
++
2
++
++
++
++
++
++
+
+
++
++
0
0
+
++
0
0
++
++
0
++
3
+
0
+
+
+
+
++
++
++
++
+
+
+
+
+
+
0
+
+
+
4
+
0
+
0
+
+
+
+
++
++
+
+
+
+
+
+
+
+
++
++
5
+++
++
++
++
++
++
++
++
++
+
+++
+++
++
++
+++
+++
++
++
+++
+++
6
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+
+++
+++
++
++
+++
+++
++
++
+++
+++
7
++
++
++
+
++
+
++
++
++
++
+
++
+
++
++
++
++
++
++
+
8
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Los extractos de las cepas 2, 10, 40, 156, 205, 238 y 381, que corresponden a
Lactobacillus pentosus, Lactobacillus acidophilus 3, Lactobacillus brevis 1,
38
Resultados y Análisis
Lactococcus lactis lactis 1, Lactobacillus paracasei paracasei 1, Lactobacillus
plantarum 1 y Lactococcus lactis lactis 2, respectivamente, presentaron
actividad inhibitoria positiva con halos entre 11 y 23 mm de diámetro (véase
ejemplo de pruebas de inhibición en Figuras 9 y 10) para extractos
neutralizados, con lo que se muestra que dichas cepas sí presentan actividad
inhibitoria causada por efectos diferentes a los valores bajos de pH producidos
por la formación de ácidos orgánicos.
Barefoot et al., (1983), Reenen et al., (1998) y Savadogo, et al., (2004),
reportan resultados positivos para ensayos de difusión en agar contra Listeria
spp., E. coli, y S. aureus evaluando la inhibición de sobrenadantes producto de
cepas de BAL de los mismos géneros de bacterias empleados en este estudio.
Las cepas 206 y 279 Leuconostoc lactis y Lactobacillus paracasei paracasei 1,
respectivamente, presentaron grandes diámetros de halos de inhibición, entre
15 y 26 mm, en los extractos no neutralizados; mientras que en los
neutralizados no superan los 10 mm. Éstas cepas no podrían considerarse
como productoras de agentes antimicrobianos (diferentes al ácido), pero
podrían ser muy útiles en la industria láctea ya que los valores bajos de pH
facilitan la coagulación de la leche generando texturas deseables en diferentes
productos lácteos (Alvarado, 2000).
Figura 9. Ejemplo de prueba de
inhibición vs. E. coli.
Figura 10. Ejemplo de prueba de
inhibición vs. S. aureus.
Fuente: Autores.
Fuente: Autores.
En las Figuras 9 y 10 se presentan placas de Petri con 20 ml de agar MH,
inoculadas con 0.1 ml de microorganismo indicador con una población de
aproximadamente 1010UFC/ml. En cada pozo se sirvieron 75 µl de diferentes
muestras de extracto. Los halos formados alrededor del pozo indican la
inhibición del crecimiento del microorganismo indicador.
Para la población de microorganismo indicador ensayada, los extractos neutros
sin concentrar no produjeron inhibición, lo que permite afirmar que el efecto
inhibitorio aumenta con la concentración del extracto y que el método de
concentración ensayado, a pesar de tener un tiempo de proceso largo, puede
39
Resultados y Análisis
ser útil por su bajo costo comparado con la liofilización o rotoevaporación, pues
sólo se requiere de una estufa.
Tabla 8. Porcentaje de éxitos de muestras neutras evaporadas.
% DE EXITOS vs
CEPA
TOTAL
S. aureus E. coli
Lactobacillus pentosus (02)
100
50
75.0
Lactobacillus acidophilus (10)
100
75
87.5
Lactobacillus brevis 1 (40)
100
100
100.0
Lactococcus lactis lactis 1 (156)
100
100
100.0
Lactobacillus paracasei paracasei 1 (205)
75
75
75.0
Leuconostoc lactis (206)
50
50
50.0
Lactobacillus plantarum 1 (238)
100
100
100.0
Lactobacillus paracasei paracasei 1 (279)
50
50
50.0
Lactococcus lactis lactis 2 (381)
75
100
87.5
Lactobacillus casei
50
100
75.0
Se realizó una ponderación (véase la Tabla 8), con la cantidad de resultados
positivos obtenidos de las pruebas de inhibición para extractos neutros, que se
denominaron número de éxitos tanto para E. coli como S. aureus. Se
consideran como aceptables aquellas muestras que tienen un porcentaje de
éxitos mayor o igual a 60%; con lo que se descartan por falta de
reproducibilidad en los ensayos los extractos producidos por las cepas 206 y
279.
En las figuras 11 a 20, se comparan los resultados experimentales obtenidos
en las pruebas de inhibición realizadas con extractos evaporados neutralizados
y sin neutralizar evaluados contra los microorganismos indicadores (M.O
indicador).
Figura 12. Pruebas inhibición de Lactobacillus
brevis 1 (40)
Lactobacillus brevis 1 (40)
M.O. indicador:
Muestras
S. aureus
M.O. indicador:
E. coli
40
Muestras
S. aureus
E. coli
8
0
7
5
6
8
7
6
5
4
3
0
2
5
10
5
10
15
4
15
20
2
20
25
1
Diámetro de inhibición (mm)
25
1
Diámetro de inhibición (mm)
Lactococcus lactis lactis 1 (156)
3
Figura 11. Pruebas inhibición de Lactococcus
lactis lactis 1 (156)
Resultados y Análisis
Figura 13. Pruebas inhibición de Lactobacillus
plantarum 1 (238)
Los extractos de las cepas 156,
40 y 238 presentan diámetros
de halo positivos que se
mantuvieron constantes para las
diferentes muestras, reflejando
el 100% de éxito en la inhibición
contra S. aureus y E.coli.
25
20
15
10
8
7
6
5
4
3
0
2
5
1
Muestras
E. coli
Figura 15. Pruebas inhibición de Lactobacillus
paracasei paracasei 1 (205)
Lactobacillus paracasei paracasei 1 (205)
Muestras
0
Muestras
M.O. indicador:
E. coli
Figura 16. Pruebas inhibición de Lactobacillus
acidophilus (10)
Muestras
S. aureus
10
0
M.O. indicador:
E. coli
41
Muestras
S. aureus
E. coli
8
5
7
8
7
6
5
4
3
2
5
15
6
10
20
5
15
25
1
Diámetro de inhibición (mm)
20
1
Diámetro de inhibición (mm)
Lactobacillus pentosus (02)
25
M.O. indicador:
E. coli
Figura 17. Pruebas inhibición de Lactobacillus
pentosus (02)
Lactobacillus acidophilus (10)
0
S. aureus
4
S. aureus
5
3
M.O. indicador:
10
8
8
7
6
5
4
3
0
2
5
15
7
10
20
6
15
25
5
20
4
Diámetro de inhibición (mm)
25
1
Diámetro de inhibición (mm)
Lactococcus lactis lactis 2 (381)
3
Figura 14. Pruebas inhibición de Lactococcus
lactis lactis 2 (381)
2
S. aureus
2
M.O. indicador:
1
Diámetro de inhibición (mm)
Lactobacillus plantarum 1 (238)
Resultados y Análisis
En los resultados de inhibición de los extractos 2, 10, 205 y 381, los
porcentajes de éxito no llegan al 100% y las diferencias entre diámetro de halos
son notorias, ésta situación podría ser consecuencia de una producción de
proteasas extracelulares que disminuyen la actividad de las sustancias
proteicas antimicrobianas reduciendo la cantidad de éstas en el extracto.
Los extractos de las cepas 206 y 279 presentan un efecto inhibitorio producido
por acidez más marcado que el de los demás extractos, mostrando que las
cepas tienen una alta producción de ácidos orgánicos.
En los extractos neutros los resultados indican que probablemente no son
productoras de sustancias proteicas inhibitorias o que el tiempo de crecimiento
no fue suficiente, para tener una mayor producción de dichas sustancias, esto
se deduce del comportamiento que las cepas presentaron en algunos ensayos
en los cuales necesitaron más de 24 horas para iniciar su crecimiento.
Figura 18. Pruebas inhibición de Leuconostoc
lactis (206)
Figura 19. Pruebas inhibición de Lactobacillus
paracasei paracasei 1 (279)
Lactobacillus paracasei paracasei 1 (279)
M.O. indicador:
Muestras
S. aureus
10
8
Muestras
M.O. indicador:
E. coli
7
0
6
5
5
8
7
6
5
4
3
0
2
5
15
4
10
20
3
15
25
2
20
1
Diámetro de inhibición (mm)
25
1
Diámetro de inhibición (mm)
Leuconostoc lactis (206)
S. aureus
E. coli
42
8
7
6
5
4
3
2
1
Diámetro de inhibición (mm)
El extracto de la cepa L. casei Figura 20. Pruebas inhibición de Lactobacillus
muestra en uno de los ensayos casei
Lactobacillus casei
resultados negativos contra S.
aureus, que pudieron ser causados
por errores de manipulación en el
25
momento de realizar el ensayo ya
20
que de acuerdo a la teoría debería
15
tener mayor efecto inhibitorio ante
10
microorganismos Gram positivos
como el S. aureus. Dado que éstos
5
resultados no fueron reproducibles
0
no se tuvieron en cuenta como
Muestras
control. En estudios futuros seria
preferible contar con un extracto
S. aureus
E. coli
M.O. indicador:
estandarizado y referenciado.
Resultados y Análisis
En resumen, las cepas con cuyos extractos neutros se obtuvieron los mejores
resultados de inhibición son la 02, 10, 40, 156, 205, 238 y 381, que
corresponden a Lactobacillus pentosus, Lactobacillus acidophilus 3,
Lactobacillus brevis 1, Lactococcus lactis lactis 1, Lactobacillus paracasei
paracasei 1, Lactobacillus plantarum 1, Lactococcus lactis lactis 2,
respectivamente.
3.2.5 Determinación del contenido de proteína total. Los experimentos
preliminares realizados de acuerdo al Protocolo para cuantificación de
proteínas por espectrofotometría (Ausubel, 2005), no permitieron cuantificar la
proteína presente en las muestras, ya que al intentar hacer la curva patrón los
datos leídos no presentaron ninguna tendencia lineal, por lo que se tomó la
decisión de no cuantificar la proteína por espectrofotometría ya que al parecer
la gran cantidad de biomoleculas que tiene el MRS por ser un agar muy
nutritivo, interfieren en la lectura del UV del espectrofotómetro arrojando
resultados erróneos. Por ésta razón no se usaron otros métodos colorimétricos
como Biuret, Lowry o Ácido Bicinchoninico, ya que los hidratos de carbono,
lípidos y azúcares, contenidos en el caldo de cultivo MRS, reaccionan con sus
componentes (Badui, 1999).
Las tiras Uriscreen®10, como se menciona en el numeral 2.6, se utilizan en
medicina para medir la cantidad de proteína presente en la orina. Dan
resultados en un rango entre 0 y 500 mg/dl de proteína total y se evalúan
dependiendo del color que tome la zona reactiva de la tira luego de ser
sumergida en la muestra. A pesar del amplio rango, se decidió hacer una
medición aproximada con las tiras Uriscreen®10, que fueron facilitadas por la
Facultad de Medicina de la Universidad de La Sabana.
Tabla 9. Resultados de la medición de proteína total con las tiras Uriscreen®10.
RANGO DE CANTIDAD
CEPA
DE PROTEÍNA (mg/ml)
02
1–5
10
1–5
40
1–5
156
1–5
205
0,3 – 1
206
0,3 – 1
238
0,3 – 1
279
0,3 – 1
381
0,3 – 1
L. casei
0,3 – 1
MRS
0 – 0,3
En la Tabla 9, se muestran los resultados obtenidos de la medición con las tiras
Uriscreen®10. La cantidad de proteína medida en el caldo de cultivo MRS se
43
Resultados y Análisis
encuentra en un rango entre 0 y 0,3 mg/ml, mientras que las cantidades en los
extractos son mayores con valores que oscilan entre 0,3 y 5 mg/ml, lo que
implica que en dichos extractos sí hay proteína producida durante el
crecimiento de los microorganismos.
Martínez et al. (1998), obtuvo 0.025µg/ml de pediocina PA-1, valor que esta
muy por debajo de los obtenidos, ya que las tiras cuantifican la proteína total.
Con este ensayo solo se puede afirmar que existe proteína en los extractos sin
especificar que sea la causante del efecto inhibitorio.
3.2.6 Pruebas de caracterización del extracto neutro concentrado
3.2.6.1 Determinación de la naturaleza proteica. Una vez se agregó la
alcalasa, se realizó una prueba de inhibición contra los microorganismos
indicadores, que arrojó los resultados que se muestran en la Tabla 10, donde
se descartan como productores de bacteriocina aquellas cepas que cuando se
encuentran neutralizadas presentan halos de inhibición positivos, en éste caso
las cepas 156 y 205, aunque puede ser posible que la proteasa utilizada no
hidrolice los péptidos presentes en estos dos extractos y sin embargo tengan
sustancias proteicas inhibitorias.
Tabla 10. Resultados de la prueba de proteasa para extractos neutros.
ENSAYOS
1
2
3
Lactobacillus pentosus
0
S.aureus
0
+
(02)
0
E.coli
0
+
Lactobacillus acidophilus S.aureus
0
+
0
(10)
0
E.coli
+
0
Lactobacillus brevis 1
0
S.aureus
0
0
(40)
0
E.coli
+
0
Lactococcus lactis lactis
+
S.aureus
++
0
1 (156)
+
E.coli
++
0
Lactobacillus paracasei
+
S.aureus
+
0
paracasei 1 (205)
+
E.coli
+
0
0
S.aureus
0
0
Leuconostoc lactis (206)
0
E.coli
0
0
Lactobacillus plantarum
0
S.aureus
0
0
1 (238)
0
E.coli
0
0
Lactobacillus paracasei
0
S.aureus
0
0
paracasei 1 (279)
0
E.coli
0
0
Lactococcus lactis lactis
0
S.aureus
0
+
2 (381)
0
E.coli
0
0
0
S.aureus
++
0
Lactobacillus casei
0
E.coli
++
0
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición
de diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
CEPA
INDICADOR
44
Resultados y Análisis
La alcalasa es una marca comercial de proteasa cuyo componente principal es
la enzima Subtilisina A. No se encontraron reportes de ensayos que se hayan
realizado con ésta enzima en específico. Las enzimas que se utilizan
comúnmente para determinar la naturaleza proteica de los extractos obtenidos
de BAL son pepsina, papaína, quimotripsina, tripsina y Proteinasa K (no
disponibles para este ensayo), siendo sensibles ante ellas las sustancias
antimicrobianas proteicas producidas por Lactobacillus plantarum 426 (Reenen
et al., 1998), L. acidophilus 11759, Lactococcus lactis subs. lactis B14 (Ivanova,
2000).
3.2.6.2 Termoresistencia. Después de someter las muestras durante 15
minutos a una temperatura de 100ºC, los extractos de las cepas que aún
presentaron actividad inhibitoria fueron la 2, 10, 40, 156, 238 y 381. Lo que
indica que la sustancia que está causando el efecto inhibitorio en dichas cepas
es termoresistente. En la Tabla 11, se muestran los resultados obtenidos en los
ensayos.
Tabla 11. Resultados de la prueba de termoresistencia: 100ºC, 15 minutos
para extractos neutros.
ENSAYOS
1
2
3
Lactobacillus pentosus
S.aureus
++
++
+
(02)
E.coli
++
++
+
Lactobacillus acidophilus S.aureus
++
++
+
(10)
0
E.coli
++
+
Lactobacillus brevis 1
S.aureus
++
++
+
(40)
E.coli
+
+
+
Lactococcus lactis lactis
0
S.aureus
++
+
1 (156)
0
E.coli
++
+
Lactobacillus paracasei
S.aureus
++
0
++
paracasei 1 (205)
E.coli
++
0
++
+
S.aureus
0
0
Leuconostoc lactis (206)
+
E.coli
0
0
Lactobacillus plantarum
S.aureus
+
+
+
1 (238)
E.coli
+
+
+
Lactobacillus paracasei
S.aureus
+
0
+
paracasei 1 (279)
E.coli
0
0
+
Lactococcus lactis lactis
S.aureus
0
++
+
2 (381)
E.coli
0
++
+
S.aureus
+++
0
+
Lactobacillus casei
E.coli
+++
0
+
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
CEPA
INDICADOR
El extracto proteico producido por Lactobacillus plantarum 423, es resistente a
la temperatura y al tiempo de exposición del ensayo (Reenen, 1998), mientras
que para las sustancias producidas por el Lactococcus lactis subs. lactis B14
45
Resultados y Análisis
se reportan como termolábiles (Ivanova, 2000)., la diferencia con los datos
obtenidos en este trabajo se basa en la cepa, aunque sean del mismo género
sus comportamientos difieren incluso hasta entre sustancias proteicas de una
misma especie.
En la Tabla 12 se resumen los resultados de todos los ensayos realizados tanto
para las pruebas de inhibición como las pruebas de caracterización de
extractos neutros.
Haciendo un análisis global, se observa que los extractos de las cepas 40 y
238 que presentaron los mejores resultados en inhibición, son de naturaleza
proteica y termoresistentes. A diferencia del extracto producido por la cepa 156
a la cual no se le pudo confirmar su naturaleza proteica.
Por otra parte, los extractos concentrados de las cepas 206 y 279, de acuerdo
a los resultados obtenidos, son de naturaleza proteica y termolábiles aunque no
se consideraron como productores de bacteriocinas por la falta de
reproducibilidad de resultados en la prueba de inhibición. Estos resultados
contradictorios podrían implicar que las dos cepas producen sustancias
proteicas antimicrobianas de menor poder inhibitorio por lo que es
recomendable estudiarlas en detalle para determinar a qué factores se debe la
baja reproducibilidad de resultados.
En las pruebas de inhibición para los extractos de las cepas 2, 10, 205 y 381,
se considera que pueden haber otros agentes como la acción de proteasas
extracelulares que afectaron la reproducibilidad de los resultados;
adicionalmente se podrían clasificar como extractos termoresistentes de
naturaleza proteica a excepción del extracto 205 al cual no se le pudo
determinar dicha naturaleza.
Se determinó que el extracto de la cepa L. casei es de naturaleza proteico y
termoresistente, sin embargo sus resultados no se tomaron en cuenta como
control por el comportamiento que presentó en las pruebas de inhibición al ser
concentrado.
46
Resultados y Análisis
Tabla 12. Resumen de resultados para extractos neutros.
CEPA
Lactobacillus pentosus
(02)
Lactobacillus acidophilus
(10)
Lactobacillus brevis 1 (40)
Lactococcus lactis lactis 1
(156)
Lactobacillus paracasei
paracasei 1 (205)
Leuconostoc lactis (206)
Lactobacillus plantarum 1
(238)
Lactobacillus paracasei
paracasei 1 (279)
Lactococcus lactis lactis 2
(381)
Lactobacillus casei
INDICADOR
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
S. aureus
E. coli
1
++
++
++
++
++
++
+
+
0
0
0
0
+
+
0
0
++
++
0
++
INHIBICIÓN DE
EVAPORACIÓN
ENSAYOS
2
3
++
+
++
0
++
+
++
+
++
+
++
+
+
++
+
++
++
++
++
++
0
+
0
+
+
+
++
+
0
+
0
+
++
0
++
+
0
+
++
+
47
ALCALASA
4
+
0
+
0
+
+
+
+
++
++
+
+
+
+
+
+
+
+
++
++
1
0
0
+
+
0
+
++
++
+
+
0
0
0
0
0
0
0
0
++
++
ENSAYOS
2
+
+
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+
0
0
0
TERMORESISTENCIA
3
0
0
0
0
0
0
+
+
+
+
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
++
++
++
++
++
+
++
++
++
++
0
0
+
+
+
0
0
0
+++
+++
ENSAYOS
2
3
++
+
++
+
++
+
+
0
++
+
+
+
+
0
+
0
0
++
0
++
0
+
0
+
+
+
+
+
0
+
0
+
++
+
++
+
0
+
0
+
Resultados y Análisis
3.2.6.3 Análisis visual de proteínas con electroforesis SDS-PAGE. Después
de realizar 20 ensayos electroforéticos, se determinó que la mejor resolución
para las muestras se obtenía con un gel de 14% de acrilamida en el gel de
resolución y 4% en el de concentración, con una dilución de muestra en buffer
de 1:2 y voltaje de 80V constante por 3 horas aproximadamente (véase el
Anexo H).
En los diferentes ensayos se empleó el marcador de peso molecular de
Invitrogen (Mark 12) 6-200kDa, (véase el Anexo F). Sin embargo este se
deterioró después de realizar el ensayo de la Figura 21, por lo tanto solo se
cuenta con ésta como referencia. También se corrió una muestra de insulina
NPH como control teniendo en cuenta que se divide en subunidades de 12 y
3.5kDa. (Sanger, 1954)
Figura 21. Electroforegrama extractos concentrados preliminares
200
116.3
97.4
66.3
55.4
36.5
31
21.5
14.4
3.5
Pesos moleculares en kDa. Fuente: Autores.
En el electroforegrama de la Figura 21, el marcador Mark 12 resolvió aunque
no completamente, pues muestra sólo 9 de sus 12 bandas. La insulina muestra
dos bandas: una bien definida por debajo de las bandas del marcador que
correspondería a la subunidad de 3.5kDa y la otra a 12kDa aproximadamente.
El medio de cultivo MRS es rico en péptidos de bajo peso molecular similar a la
mayoría de bacteriocinas conocidas (3000-6000 Da) lo que dificulta la
separación de posibles bandas las sustancias antimicrobianas (Chung, 2003).
48
Resultados y Análisis
La ausencia de proteína en el carril del MRS se puede deber a una alta dilución
del medio de cultivo, para este electroforegrama la muestra del MRS no se
encontraba concentrada como las otras muestras. Las muestras problema no
resolvieron correctamente, pero los carriles del marcador e insulina podrían
servir como base para comparar con la Figura 22, en la que se aprecia un
electroforegrama corrido en las mismas condiciones y concentraciones de gel.
En la Figura 22 se observan bandas en los carriles de los extractos 2, 10, 40,
156, 205, 206, 238 y L. casei, mientras que en los de los extractos 279 y 381
seguramente la cantidad de proteína fue poca aunque se diferencian bandas
tenues. Teniendo en cuenta la banda de la insulina se podría afirmar que los
péptidos presentes en las muestras tienen un peso molecular entre 3.5 y
12kDa. Sin embargo de la revisión bibliográfica se conoce que en este tipo de
geles (glicina) los péptidos y proteínas de bajo peso molecular se encuentran
en micelas con el SDS, por lo tanto no se separan adecuadamente de este
detergente y se podrían confundir con el frente de corrido.
Los reportes encontrados aseguran la capacidad de las cepas de BAL
utilizadas, para la producción de bacteriocinas como el Lactococcus lactis lactis
(Ivanova, 2000), Lactobacillus plantarum (Ogunbanwo, 2003), Lactobacillus
brevis (Ogunbanwo, 2003), Lactobacillus acidophilus (Klaenhammer, 1993),
Lactobacillus pentosus (Okkers, 1999) y Leuconostoc lactis (Parente, 1994).
Figura 22. Electroforegramas extractos concentrados finales
3.5 kDa
3.5 kDa
Fuente: Autores.
Los resultados obtenidos en las electroforesis no fueron tomados en cuenta
para la estimación del peso molecular de las sustancias antimicrobianas
presentes en los extractos, ya que al encontrarse encapsuladas con el SDS
impide la adecuada resolución de las bandas.
49
Resultados y Análisis
La separación de péptidos y proteínas de pesos moleculares inferiores a 10kDa
no es posible por el método tradicional de sistema de geles discontinuos de
Laemmli ya que este cubre un espectro 12 a 200 kDa. Esto se debe a la
comigración del SDS con las proteínas de bajo peso molecular, impidiendo la
resolución de bandas (Ausubel, 2005).
Para lograr separar proteínas y péptidos de 5 a 20 kDa se recomienda usar el
método de electroforesis con Tris-Tricina o un protocolo alterno al tradicional de
Laemmli con buffers tris más concentrados. Este protocolo separa las proteínas
contenidas en las micelas con el SDS al incrementar la concentración de los
buffers (Ausubel, 2005).
3.2.7 Aplicación en matriz alimentaria. Una vez que se realizó la prueba de
calidad microbiológica de la salsa ranchera en agar Manitol – Sal y VRBD, se
comprobó que no estaba contaminada con ningún tipo de microorganismo
semejante a los que se sembrarían en ella.
En la Tabla 13, se encuentran los resultados de las pruebas realizadas sobre el
alimento, comparándolas con el control realizado a la salsa.
Tabla 13. Resultados de la aplicación en matriz alimentaria del
extracto antimicrobiano de la cepa 238.
Microorganismo Indicador
Condiciones
Tiempo (h)
0
12
24
Cantidad
S. aureus
Extracto (µl) UFC/ml
Control
10
20
30
Control
10
20
30
Control
10
20
30
7,50E+04
1,95E+04
2,08E+04
2,86E+04
2,30E+02
0
0
0
8,30E+01
0
0
0
S. aureus
UFC/ml
E. coli
UFC/ml
E. coli
UFC/ml
8,75E+04
1,63E+04
2,68E+04
2,60E+04
2,80E+02
0
0
0
1,12E+02
0
0
0
1,40E+05
1,97E+04
1,97E+04
1,91E+04
5,30E+02
0
0
0
2,65E+02
0
0
0
1,37E+05
1,54E+04
2,07E+04
2,25E+04
4,95E+02
2,00E+02
0
0
1,96E+02
0
3,45E+03
0
Los resultados de la muestras control presentan inhibición sobre los
microorganismos indicadores bajando la carga microbiana entre uno y dos
ciclos logarítmicos, esto se debe a que dos de los componentes de la salsa, el
vinagre y la pimienta, tienen características antimicrobianas (Tipsrisukond et
al., 1998). Por otra parte se observa que en el tiempo cero se da una baja
disminución de los microorganismos presentes, esto se debe posiblemente al
efecto antimicrobiano de la salsa y al poco tiempo de acción del extracto.
50
Resultados y Análisis
Para los tiempos 12 y 24 horas de acción del extracto sobre la salsa
contaminada, las muestras no presentaron ninguna carga microbiana
mostrando que la sustancia antimicrobiana está presente en la muestra y
podría funcionar en alimentos, independientemente al efecto antimicrobiano de
la salsa.
Davies (1997), experimentó con nisina aplicándola a quesos tipo ricotta,
demostrando que el crecimiento de microorganismos patógenos a una
concentración de 102UFC/g, puede ser inhibido totalmente con 2.5mg de nisina
por litro. En el ensayo con la salsa ranchera se aplicaron 7.5 ml de extracto por
litro de salsa, una cantidad mayor que permitió una disminución significativa en
la población microbiana aunque no se puede atribuir todo el efecto
antimicrobiano al extracto porque posiblemente la salsa actuó como una primer
barrera disminuyendo la carga bacteriana.
Esta es sólo una pequeña introducción hacia el uso de sustancias
antimicrobianas proteicas producidas por BAL en la tecnología de barreras,
pues deben hacerse ensayos con réplicas suficientes que permitan la
comparación estadística entre las concentraciones y los tiempos analizados.
Seguramente los otros extractos no ensayados pueden presentar un
comportamiento similar en alimentos, para comprobarlo se recomienda realizar
estudios con un diseño experimental adecuado; sin embargo el presente
resultado aunque puntual, es también un resultado alentador, que abre
horizontes para la aplicación en la industria de alimentos, de las sustancias
antimicrobianas responsables del efecto inhibitorio ensayado.
Los estudios deben enfocarse en potenciar y optimizar la producción de
bacteriocinas para que puedan ser producidas a escala industrial.
51
Conclusiones
4. CONCLUSIONES
1. Se obtuvieron sustancias inhibitorias en extractos concentrados por
evaporación a presión atmosférica, temperatura de 42ºC y 100 horas de
tratamiento, tiempo durante el cual reducen su volumen 6.25 veces
equivalentes al 84%.
2. Los extractos neutros concentrados de las cepas Lactobacillus pentosus,
Lactobacillus acidophilus 3, Lactobacillus brevis 1, Lactococcus lactis lactis 1,
Lactobacillus paracasei paracasei 1, Lactobacillus plantarum 1 y Lactococcus
lactis lactis 2, respectivamente presentaron actividad inhibitoria contra dos
microorganismos patógenos: S. aureus y E. coli, con diámetro de halos entre 7
y 26 mm, descartando inhibición por acidez.
3. Se estableció la naturaleza proteica de los extractos neutros realizando
hidrólisis enzimática con Alcalasa®. Se observó que los extractos de las cepas
Lactobacillus pentosus, Lactobacillus acidophilus 3, Lactobacillus brevis 1,
Leuconostoc lactis, Lactobacillus plantarum 1 y Lactococcus lactis lactis 2
deben su efecto inhibitorio a sustancias de naturaleza proteica, ya que los
resultados de las pruebas de inhibición fueron negativos. Para confirmar los
otros extractos deben ensayarse diferentes proteasas.
4. Los extractos neutros proteicos de las cepas Lactobacillus pentosus,
Lactobacillus acidophilus 3, Lactobacillus brevis 1, Lactococcus lactis lactis 1,
Lactobacillus plantarum 1 y Lactococcus lactis lactis 2 dieron resultados
positivos para la prueba de termoresistencia, lo que les confiere un valor
agregado en la industria de alimentos porque se ajustan a los procesos
térmicos sin perder su capacidad inhibitoria.
5. Los extractos proteicos no pudieron ser clasificados dado que los resultados
obtenidos en la evaluación del peso molecular no son válidos y no pueden ser
usados para el análisis. El protocolo que se escogió para éste ensayo no fue el
adecuado considerando así las pruebas como un ejercicio de metodología.
6. El efecto antimicrobiano de un extracto concentrado fue reproducible en una
salsa ranchera de tipo casero, que se utilizó como matriz alimentaria, la cual a
su vez contenía agentes inhibitorios que actuaron como barrera facilitando la
acción del extracto.
52
Recomendaciones
5. RECOMENDACIONES
1. Para efectos de comparación de métodos y facilitar la cuantificación de
proteína, sería interesante realizar una investigación que incluya la purificación
con sulfato de amonio de los extractos y HPLC en fase reversible que de las
herramientas para hacer una clasificación de las sustancias antimicrobianas
presentes en los extractos.
2. La optimización y estandarización del proceso de obtención de sustancias
antimicrobianas producidas por BAL, por métodos físicos, sería una
investigación que aportaría a la industria de alimentos una nueva herramienta
de conservación que le daría un valor agregado a los productos.
3. Una electroforesis SDS – PAGE que incluya tris-tricina resolvería las
bandas que muestren los pesos moleculares de los péptidos. Además si se
realiza una electroforesis en gel no denaturante, sin teñir y luego se inocula con
patógenos podría comprobarse que dichos péptidos tienen actividad
antimicrobiana clasificándolos como bacteriocinas. El hallazgo de bacteriocinas
en los extractos trabajados en éste proyecto sería la base de numerosas
investigaciones que buscarían los alimentos específicos podrían actuar y sus
proyecciones industriales.
4. Podrían realizarse ensayos con diferentes matrices alimentarias como
carnes, pescados, vegetales y productos perecederos que por sus
características culinarias no requieran tiempos de cocción convirtiéndolos en
blanco fácil de los microorganismos patógenos. Por otra parte sería interesante
ver el comportamiento de las sustancias antimicrobianas al combinarse con
tratamientos físicos y químicos tanto en proceso como en empaque y evaluar
su eficiencia.
53
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publicados).
YANG, R., B, RAY. Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid
bacteria. Food Microbiol. sl. 1994.
59
Anexos
ANEXO A. SISTEMA CRYOBANK
Sistema de fácil manipulación diseñado para almacenar en forma
congelada muestras de cepas o cultivos bacterianos con rápida y
eficiente recuperación.
ALMACENAMIENTO DE TUBOS CRYOBANK ESTERILES
Los tubos estériles CRYOBANK pueden ser almacenados en cuartos fríos y
refrigeradores protegidos de la luz.
Antes de usar los tubos se debe chequear que el liquido críoconservante no
este turbio, si se presente este caso descartar el tubo.
REFERENCIA:
Sistema CryoBank [online]. COPAN innovation (USA). 2006.
< http://www.copanusa.com/assets/pdf/spanish_pdfs/CryoBank_span.pdf>
60
Anexos
ANEXO B. COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
¾ CALDO MRS (MAN, ROGOSA Y SHARPE) (g/litro)
Peptona universal 10,0; extracto de carne 5,0; extracto de levadura 5,0; D(+)glucosa 20,0; hidrogeno fosfato dipotásico 2,0; Tween® 80 1,0; hidrogencitrato
diamónico 2,0; acetato sódico 5,0; sulfato de magnesio 0,1; sulfato de
manganeso 0,05.
¾ AGAR MH (MULLER-HINTON) (g/litro)
Infusión de carne 2,0; hidrolizado de caseína 17,5; almidón 1,5; Agar-agar 13,0.
¾ AGAR MANITOL SAL (g/litro)
Peptona 10,0; extracto de carne 1,0; cloruro sódico 75,0; D(-)-manitol 10,0;
Rojo de fenol 0,025; Agar-agar 12,0.
¾ AGAR VRBD (Agar Violeta Cristal-Rojo neutro-Bilis-Glucosa) (g/litro)
Peptona de carne 7,0; extracto de levadura; 3,0; cloruro sódico 5,0; D(+)glucosa 10,0; mezcla de sales biliares 1,5; rojo neutro 0,03; violeta cristal
0.002; Agar-agar 13,0.
REFERENCIA:
MERCK. Manual de medios de cultivo. Alemania. Copyright 1994.
61
Anexos
ANEXO C. TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología
para la visualización de bacterias. Debe su nombre al bacteriólogo danés
Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1844. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfología celular bacteriana como también para la primera
diferenciación bacteriana, considerándose Bacterias Gram-positivas a las
bacterias que se visualizan de color violeta y Bacterias Gram-negativa a las
que se visualizan de color rosa.
Hay varios pasos a seguir para lograr la coloración, una vez se tiene la bacteria
diluida en una gota de agua y fijada con un calor leve.
Fuente: Madigan et al., 2001.
1. Fijar las células con calor
2. Agregar Azul Violeta (Cristal Violeta) y esperar 30 segundos.
(Moradas/Gram Positiva). El cristal violeta ingresa a todas las células
bacterianas ya sean Gram positivas o negativas.
62
Anexos
3. Enjuagar con agua.
4. Agregar lugol y esperar 30 segundos. El lugol está formado por I2
(iodo) en equilibrio con KI (ioduro de potasio), el cual está presente
para solubilizar el iodo. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
5. Enjuagar con agua.
6. Agregar alcohol y acetona. La mezcla de alcohol-acetona que se
agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es
soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos
no se decoloran, mientras que los Gram-negativos sí lo hacen.
7. Enjuagar con agua.
8. Agregar Safranina y esperar 1 minuto. Para poner de manifiesto las
células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células
Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas
permanecen azules.
9. Enjuagar con agua.
10. Agregar una gota de aceite de inmersión y mirar en el microscopio.
Tinción Gram negativo, E. coli.
Tinción Gram positivo, S. aureus
Fuente: Klein, 2005.
Fuente: Klein, 2005.
REFERENCIAS:
1. MADIGAN, MARTINKO y PARKER. BROCK. Biología de los microorganismos.
Octava Edición. Prentice Hall.2001.
63
Anexos
ANEXO D. RESULTADOS PRELIMINARES
Separación por centrifugación: En las pruebas preliminares se ensayó una
centrifugación a 9,500 x g durante 15 minutos y posteriormente una filtración
con membrana Sartorius de 0.22 micrómetros de diámetro de poro, para
retener la mayor cantidad de material no deseable en el sobrenadante.
El proceso de purificación por filtración no es viable para éste caso, ya que es
muy lento y el riesgo de contaminación es muy alto, como se comprobó
experimentalmente. Para asegurar inocuidad en el procedimiento sería
necesario por lo menos un equipo de filtración estéril para cada cepa y cada
tratamiento ya que se maneja un volumen de 50 ml.
Dada la contaminación de las muestras después de la filtración, se determinó
que para llevar a cabo una semi–purificación, los cultivos deben centrifugarse
dos veces, cada una durante 15 minutos y que para evitar la contaminación es
necesario cambiar el tubo de centrifuga una vez se terminan los primeros
quince minutos y esterilizar todo el material.
CONCENTRACIÓN
Rotoevaporación: La evaporación de varios materiales biológicos suele diferir
de la de materiales inorgánicos y orgánicos. Los materiales biológicos como los
productos farmacéuticos, la leche, los jugos cítricos y los extractos vegetales,
suelen ser muy sensibles al calor y con frecuencia tienen partículas muy finas
suspendidas en la solución. Muchos materiales biológicos en disolución
presentan elevación del punto de ebullición muy bajo al concentrarse. La
degradación de los materiales biológicos durante la evaporación está en
función de la temperatura y el tiempo de procesamiento. Para mantener la
temperatura baja, la evaporación debe hacerse al vacío, lo que reduce el punto
de ebullición de la disolución. Para que el tiempo de contacto sea corto, el
equipo debe tener un tiempo bajo de retención del material que se está
evaporando (Geankoplis, 2003).
Procedimiento: En el rotoevaporador Heidolph, disponer la muestra en el balón
aforado para el extracto, usar aceite mineral como calefactor y ajustar el vacío
a 53 mmHg. Tener presente que la temperatura del baño de aceite no debe
superar los 60ºC con el fin de asegurar que la temperatura del sobrenadante a
concentrar no supere 50ºC y se desnaturalicen las proteínas. Para un volumen
de 200 ml, el proceso debe realizarse durante cinco horas (Torres et al., 2004).
Resultados: En el año 2004, se realizó una prueba con Lactobacillus casei en
la cual, después de activar el microorganismo en medio líquido, centrifugar y
64
Anexos
neutralizar, se concentró el sobrenadante por rotoevaporación y se logró
reducir el volumen en 23.5%. El procedimiento arrojó pruebas inhibitorias
positivas, pero ninguna con un halo de diámetro mayor a 8 mm por lo que fue
necesario complementarlo con liofilización para aumentar la concentración
llegando a reducir el volumen en 94% (Torres et al., 2004).
Dado que el equipo tiene una capacidad de un litro y que el volumen que se
maneja por extracto es de 50ml no se realizó esta prueba posteriormente ya
que el volumen se reducía tanto por la evaporación como por las perdidas en el
balón y no se obtendría suficiente extracto para realizar todos los ensayos.
Liofilización: Por lo general, la sustancia que va a secarse se congela
exponiéndola a aire muy frío. En la liofilización por congelación, el agua se
elimina como vapor por sublimación del material congelado en una cámara al
vacío. Después de que la humedad se sublima como vapor, éste se extrae con
bombas de vacío mecánicas o eyectores de chorro de vapor.
La liofilización da lugar a productos de más alta calidad, el factor principal es la
rigidez estructural que se preserva en la sustancia congelada cuando se
verifica la sublimación. Esto evita el colapso de la estructura porosa después
del secado. Al añadir agua posteriormente, el producto re-hidratado retiene la
mayor parte de su estructura original. La liofilización de materiales biológicos y
alimenticios también tiene la ventaja de que conserva su sabor o aroma. Las
temperaturas bajas que se emplean reducen al mínimo las reacciones de
degradación que casi siempre ocurren en los procesos comunes de secado.
Sin embargo la liofilización es una técnica muy costosa de secado, debido a la
velocidad lenta de secado y a la necesidad de usar vacío (Geankoplis, 2003).
Procedimiento: Congelar 3 ml de las muestras en el congelador Revco® a
-70ºC, en frascos de vidrio durante dos horas. Llevar al liofilizador (Labconco)
ajustando a una presión de vacío de 20 inHg durante 60 horas, tiempo durante
el cual las muestras deberán haber concentrado alrededor del 94%. (Torres et
al., 2004). Una vez culminado el proceso rehidratar con 200µl de agua
destilada para poder llevar a cabo las pruebas de inhibición.
Las primeras pruebas que se realizaron en el año 2004 se llevaron a cabo en el
liofilizador Labconco de la Universidad de La Sabana, donde se trabajó a 20
inHg de vacío y a una temperatura de congelación de -40oC. Con estas
condiciones los resultados en las pruebas de inhibición arrojaron resultados
positivos con halos de diámetros entre 7 y 22 mm en el proceso combinado con
rotoevaporación, por lo que se concluyó que este era el mejor método de
concentración.
Las siguientes pruebas se realizaron en el año 2005 Y 2006, no se llevaron a
cabo en el mismo equipo de liofilización, debido a problemas con la bomba de
65
Anexos
vacío, por lo que se usó un equipo que manejaba una presión de vacío de
0.5mm de Hg a temperatura de congelación de -20oC.
Se realizaron tres ensayos preliminares para establecer las condiciones de
operación. En el primero se manejó temperatura de congelación a -20ºC, pero
los resultados no fueron positivos para extractos neutros.
En el segundo se cambió la temperatura de congelación a -70oC ya que la
congelación lenta puede llegar a deteriorar las proteínas (Careche et al., 2004).
Para éste caso los resultados
seguían siendo poco satisfactorios,
posiblemente porque durante el transporte hacia el equipo de liofilización se
presentaron problemas de descongelación que pudieron llevar al deterioro de
las proteínas impidiendo un buen desempeño en las pruebas de inhibición.
En un tercer ensayo se controló estrictamente el proceso de congelación que
no se pudo realizar a -70oC por fallas en el congelador. Se congeló a -20oC
cerciorándose que el vacío se iniciara cuando las muestras aún estaban
congeladas. Además se incluyó una cepa de Lactobacillus casei como control
teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el experimento del año 2004.
En las tablas de este anexo se muestran los resultados donde se aprecia que
las muestras neutralizadas no tienen capacidad de inhibición.
Por los resultados obtenidos en los diferentes ensayos, se concluyó que
aunque el proceso de concentración alcanzó a reducir el volumen en 93% en
promedio, el procedimiento deterioró las sustancias que le dan la capacidad
inhibitoria al extracto posiblemente por los cambios en las condiciones
controladas en las pruebas iniciales (presión de vacío y tiempo de exposición),
por lo que se decidió eliminar este método de concentración ya que no se
pueden reproducir las condiciones iniciales en otro equipo, estableciendo como
método de concentración la evaporación a presión atmosférica.
Evaporación: Se realizaron pruebas iniciales en el año 2005 concentrando en
cápsulas de porcelana de 8 cm de diámetro, lo que indicaba mayor área de
contacto y por lo tanto mayor eficiencia en el proceso de concentración. A 37oC
durante 60 horas, se obtuvieron resultados positivos de inhibición, sin embargo
algunas muestras se contaminaron por la exposición al ambiente en las
cápsulas. Por lo tanto se consideró apropiado emplear frascos de vidrio
estériles de 10 ml de capacidad con tapón de caucho para evitar la entrada de
material contaminante y abertura lateral
para permitir la salida de
condensados.
Finalmente se realizó otro ensayo en frascos de vidrio, a 40oC, presión
atmosférica y 100 horas, los cuales presentaron pruebas de inhibición positivas
por lo cual se determinó como el mejor procedimiento.
66
Anexos
Pruebas de inhibición: Inicialmente se realizaron las pruebas con la técnica
de césped, que consiste en hacer una siembra de superficie del
microorganismo indicador en agar MH y luego hacer pozos con la parte
superior de una pipeta Pasteur en donde se depositan 75µl del extracto
concentrado a estudiar, incubar a 37ºC por 24 horas y evaluar de la misma
forma que las pruebas por difusión en agar, sin embargo en algunos casos los
halos no estaban bien definidos pues la muestra podía no tener contacto
prolongado con la superficie. Por lo tanto se ensayó con la técnica de difusión
en agar con los microorganismos indicadores sembrados en profundidad
comprobando que los halos formados no solo se definen mejor sino que
además no se ven afectados por agua condensada como sucede con la técnica
de césped.
Nomenclatura de tratamientos
Tratamientos
1 Liofilizado neutro Tc - 70oC
2 Liofilizado neutro Tc - 70oC Duplicado
3 Liofilizado neutro Tc - 70oC
4 Liofilizado neutro Tc - 20oC Duplicado
5 Estufa neutro
6 Estufa neutro duplicado
7 Neutro sin tratamiento
8 Liofilizado no neutro Tc - 70oC
9 Liofilizado no neutro Tc - 70oC Duplicado
10 Liofilizado no neutro Tc - 20oC
11 Liofilizado no neutro Tc - 20oC Duplicado
12 Estufa no neutro
13 Estufa no neutro duplicado
14 No neutro sin tratamiento
Tc: Temperatura de congelación. En los ensayos 2 y 3 la temperatura de congelación
-70oC se cambió a -20oC por falta de ultracongelador.
Las siguientes tablas muestran los resultados, intentos de concentración por
liofilización, se observó que independientemente de la temperatura de
congelación hubo fallas en el proceso.
Se aprecia en estos resultados que las muestras sin tratamiento no presentan
inhibición y las concentradas por evaporación a presión atmosférica en estufa a
42ºC, durante 100 horas fueron exitosas contra S. aureus y E. coli por lo cual
se determinó como el mejor procedimiento, donde la temperatura no afectaría a
los posibles péptidos que se encontraran en los extractos.
67
Anexos
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus pentosus (02)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
+ + + + + + 0 + + + + + + +
1
E.coli
0 + 0 + 0 + 0 + + + + + + 0
S.aureus
0 0 + + 0 0 0 + + + + + + 0
2
E.coli
+ 0 + 0 0 0 0 + + + + 0 0 0
S.aureus
0 0 0 0 ++ +++ 0 + + + 0 ++ ++ 0
3
E.coli
0 0 0 0 + ++ 0 0 0 + 0 ++ ++ +
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus acidophilus 3 (10)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
0 0 0 0 + + 0 0 0 0 0 0 0 +
1
E.coli
0 0 0 0 + + 0 + + + + + + 0
S.aureus
+ + + + + + 0 + + + + + + 0
2
E.coli
+ + 0 0 + + 0 + + + + 0 0 0
S.aureus
0 0 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0 ++ 0 +
3
E.coli
0 0 0 0 ++ 0 0 0 0 0 + ++ 0 0
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus brevis 1
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
S.aureus
+ + + + + + 0 0 0 0 0 0
1
E.coli
+ + 0 0 0 0 0 + + + + +
S.aureus
+ + + + 0 0 0 + + + + 0
2
E.coli
0 0 0 0 0 0 0 + + + 0 0
S.aureus
0 0 0 0 ++ ++ 0 ++ + 0 + ++
3
E.coli
+ 0 + 0 ++ ++ 0 ++ + + + ++
(40)
13 14
0 +
+ 0
0 0
0 0
++ ++
++ +
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
68
Anexos
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactococcus lactis lactis 1 (156)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
0 0 0 0 + + 0 + + + + + ++ +
1
E.coli
+ + 0 0 + + 0 + + + + + + +
S.aureus
+ + + + + + 0 + + + + + + 0
2
E.coli
0 0 0 0 + ++ 0 + + 0 0 + ++ 0
S.aureus
0 0 0 0 +++ ++ 0 0 0 ++ 0 +++ +++ 0
3
E.coli
0 0 0 0 + + 0 0 0 ++ 0 ++ +++ 0
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus paracasei paracasei
1 (205)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
+ + + + + + 0 0 0 + + 0 0 0
1
E.coli
0 0 0 0 0 0 0 + + + + + + 0
S.aureus
+ + + + + + 0 + + + + + + +
2
E.coli
0 0 0 0 ++ + 0 + + + + 0 0 0
S.aureus
0 0 0 0 ++ + 0 0 ++ 0 + ++ ++ 0
3
E.coli
0 0 0 0 + + 0 0 ++ 0 ++ ++ +++ ++
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Leuconostoc lactis (206)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
S.aureus
0 0 0 0 + + 0 + + + + ++ +
1
E.coli
+ + 0 0 0 0 0 + + + + + +
S.aureus
+ + + + + + 0 + + + + ++ ++
2
E.coli
0 0 0 0 + + 0 + ++ + + ++ ++
S.aureus
0 0 0 + 0 0 0 ++ ++ ++ ++ +++ +++
3
E.coli
0 0 0 0 + + 0 +++ ++ +++ ++ +++ ++
14
0
0
0
0
++
++
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
69
Anexos
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus plantarum 1 (238)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
+ + 0 0 + + 0 + + + + 0 0 +
1
E.coli
+ + + + + + 0 + + + + + + +
S.aureus
0 0 0 0 0 0 + + + + + 0 0 +
2
E.coli
0 0 0 0 + + 0 + + + + + ++ 0
S.aureus
0 0 0 0 ++ ++ 0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ +
3
E.coli
0 0 0 0 + ++ 0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ +
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus paracasei paracasei
1 (279)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
+ 0 + 0 + + 0 ++ ++ ++ +++ + + +
1
E.coli
0 0 0 0 0 0 0 + ++ + ++ 0 0 0
S.aureus
+ + + + 0 0 0 ++ +++ +++ + + 0 +
2
E.coli
+ + + + 0 0 0 ++ ++ ++ +++ + + +
S.aureus
0 0 0 0 + + 0 ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++
3
E.coli
0 0 0 0 + + 0 ++ +++ ++ +++ ++ ++ ++
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactococcus lactis lactis 2 (381)
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
+ 0 + 0 + 0 0 + 0 + + 0 0 +
1
E.coli
+ 0 + 0 + 0 0 + + ++ + + + +
S.aureus
+ + + + 0 0 0 + + + + + + 0
2
E.coli
+ + + + 0 0 0 + + + + + + 0
S.aureus
0 0 0 0 + + 0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
3
E.coli
0 0 0 0 + ++ 0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ +
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
Resultados preliminares pruebas inhibicion: Lactobacillus casei
TRATAMIENTOS
ENSAYO INDICADOR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
S.aureus
0 0 0 0 0 0 0 +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++
3
E.coli
0 0 0 0 0 0 0 +++ ++ +++ ++ ++ +++ ++
Nota: +++: Halos de inhibición de diámetro entre 16 y 26 mm. ++: Halos de inhibición de
diámetro entre 11 y 15 mm. +: Halos de inhibición de diámetro entre 7 y 10 mm.
70
Anexos
Cuantificación de proteína: Los experimentos preliminares realizados de
acuerdo al Protocolo para cuantificación de proteínas por espectrofotometría
(Ausubel, 2005), no permitieron cuantificar la proteína presente en las
muestras, ya que al intentar hacer la curva patrón los datos leídos no
presentaron ninguna tendencia lineal.
Se hizo un barrido para obtener los picos de lectura en cada muestra patrón
obteniendo un pico común en 309 nm con blanco MRS al igual que con agua,
sin embargo al intentar nuevamente ajustar la curva patrón, los resultados
seguían sin presentar ninguna tendencia lineal. Se decidió no cuantificar la
proteína por espectrofotometría ya por ser el MRS un medio coloreado y al
parecer la gran cantidad de biomoléculas que tiene por ser un caldo muy
nutritivo, interfieren en la lectura del UV del espectrofotómetro arrojando
resultados erróneos. Por ésta razón no se usaron otros métodos colorimétricos
como Biuret, Lowry o Ácido Bicinchoninico, ya que los hidratos de carbono,
lípidos y azúcares, contenidos en el caldo de cultivo MRS, reaccionan con sus
componentes (Badui, 1999).
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por García (2004) en sus
experimentos con Lactobacillus casei, donde la medición de proteína total no
arrojó ninguna tendencia en los resultados.
Curva Proteina
1.5000
MRS1
Agua1
Agua2
1.0000
MRS3
abs
Agua4
0.5000
0.0000
0
500
1000
-0.5000
1500
2000
2500
µg/ml
71
Anexos
ANEXO E. PROTOCOLO PARA ELABORACIÓN DE ELECTROFORESIS
SDS – PAGE DE LAEMMLI
Disoluciones:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Solución 1. Acrilamida; Bis-acrilamida: 30% de monómeros totales (T),
con 29,2 g de acrilamida y 0.8 g de bis-acrilamida (monómero
entrecruzador C) aforados a 100 ml con agua desionizada.
Solución 2. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8: Disolver 18,5 g de Tris base en 53 ml
de agua desionizada, ajustar pH a 8.8 con HCl 6N y aforar a 100 ml con
agua desionizada.
Solución 3. 0.5 M Tris HCl 6.8: Disolver 6 g de Tris base en 60 ml de
agua desionizada ajustar pH a 6.8 con HCl 6N y aforar a 100 ml con
agua desionizada.
Solución 4. Dodecil sulfato sodico (SDS) al 10% en agua desionizada.
Solución 5. Persulfato de amonio (APS) al 10% en agua desionizada
(preparar diariamente máximo 1 ml).
Solución 6: Buffer para la muestra: 3.55 ml de agua desionizada, 1.25 ml
de solución 3, 2.5 ml de glicerol, 2 ml de solución 4, 0.2 ml de 0.5%
(m/v)de azul de bromofenol
Solución 7. Buffer de corrida 10x pH 8.3: Disolver 30,3 g de Tris base
144 g de glicina y 10 g de SDS, aforar a 1 L con agua desionizada. Para
cada corrida diluir 100 ml del buffer de corrida 10x en 900 ml de agua
desionizada.
Solución 8. Solución Fijadora: En 60 ml de agua desionizada, disolver 10
ml de ácido acético y 30 ml de metanol.
Solución 9. Solución de Tinción de Coomassie (Ausubel, 2005).
Solución 10. Solución de Decoloración: Medir 10 ml de ácido acético y
aforar a 100 ml con agua desionizada.
Preparación del Gel:
Gel de Resolución o Separating (14% T): En un recipiente de vidrio ambar
adicionar 2.7 ml de agua desionizada, 4.7 ml de solución 1, 2.5 ml de
solución 2, 0.1 ml de solución 4, 50 µl de solución 5 y 5 µl de TEMED.
Gel de Concentración o Stacking (8% T): En un recipiente ámbar adicionar
4.7 ml de agua desionizada, 2.7 ml de solución 1, 2.5 ml de solución 3, 0.1
ml de solución 4, 50 µl de solución 5 y 10 µl de TEMED.
Realizar el montaje de los vidrios como está indicado en la cámara, verter 3
ml del gel de resolución entre los cristales de electroforesis, dejar gelificar y
adicionar el gel de concentración hasta llenar los cristales, colocando en su
interior el peine que formara los pocillos donde se depositan las muestras.
72
Anexos
Preparación de las muestras:
1. En un tubo Eppendorff mezclar 50 µl de β-Mercaptoetanol y 950 µl de
la disolución 6.
2. Servir 20 µl de la mezcla anterior en mini Eppendorff con 10 µl del
extracto a evaluar (tantos como muestras se tengan).
3. Calentar en baño maría a 95oC por 5 minutos.
Equipo y condiciones electroforéticas:
Emplear un equipo de electroforesis Mini PROTEAN® 3 Cell de BIO –RAD,
con su respectiva fuente de poder.
1. Armar la cámara verificando que quede sellada.
2. Llenar la cámara interior con disolución 7.
3. Retirar el peine del gel ya polimerizado y servir 10 µl de muestra en cada
pozo, dejando uno libre para 3.8 µl de patrón.
4. Servir suficiente disolución 7 en la cámara exterior para cubrir mínimo
dos terceras partes de la cámara interior, para permitir el paso de la
corriente.
5. Cerrar el equipo, verificando la posición correcta de los conectores.
6. Colocar la cámara en una cubeta que se mantiene refrigerada con agua
corriente.
7. Ajustar la fuente de poder a 80 voltios constantes e iniciar el paso de
corriente, el cual se verifica con el paso de burbujas en la cámara
interior.
8. Vigilar el frente de corrido para evitar que se salgan los extractos. El
tiempo aproximado de corrida para el tipo de muestras que se maneja
en este proyecto es de tres horas.
9. Una vez cumplido el tiempo de corrida, retirar los cristales del equipo,
enjuagar con abundante agua corriente, desprender suavemente el gel
de los vidrios evitando que se rompa y depositarlos en un recipiente
plástico limpio con la disolución 8, durante 15 minutos.
10. Retirar la disolución del recipiente y agregar la disolución 9, dejar dos
horas y agitar suavemente ocasionalmente.
11. Retirar la disolución 9 del recipiente y agregar la 10, dejándolo entre 12 y
24 horas.
12. Tomar la foto y analizar con el programa Quantity One.
REFERENCIAS:
AUSUBEL, F. Current Protocols in Molecular Biology. Vol. 2. Analysis of
Proteins. 2005.
73
Anexos
ANEXO F. MARCADOR MARK 12® DE INVITROGEN
Fuente: Invitrogen, 2006
74
Anexos
ANEXO G. TABLA DE pH ANTES Y DESPUÉS DE NEUTRALIZAR
2
2
Febrero 2006 Manual Febrero 2006 CON TITULADOR Marzo 2006 CON TITULADOR Junio 2006 CON TITULADOR
CEPA
pHi
pHf
pHi
pHf
Vol ml
pHi
pHf
Vol ml
pHi
pHf
Vol ml
4.48
6.98
4.70
6.15
0.134
4.22
6.35
0.268
4.30
6.12
0.368
Lactobacillus pentosus (02)
4.52
7.80
4.69
6.88
0.220
Lactobacillus acidophilus
5.01
7.04
4.58
6.48
0.200
4.21
6.99
0.272
4.39
6.26
0.366
4.57
7.10
4.55
8.02
0.254
(10)
Lactobacillus brevis 1
4.71
6.98
4.48
6.64
0.228
4.45
6.86
0.230
4.50
6.40
0.470
4.68
7.24
4.49
6.40
0.240
(40)
Lactococcus lactis lactis
4.95
6.99
6.24
6.24
0.000
4.68
7.12
0.194
4.22
7.24
0.274
5.03
7.25
6.19
6.19
0.000
1 (156)
Lactobacillus paracasei
4.57
6.98
4.98
7.06
0.166
4.61
7.03
0.180
4.32
6.35
0.240
4.53
7.58
3.96
6.42
0.490
paracasei 1 (205)
4.56
7.47
3.75
6.64
0.514
3.70
7.30
0.590
4.24
7.32
0.280
Leuconostoc lactis (206)
NO CRECIO
3.73
6.20
0.462
Lactobacillus plantarum
4.54
7.21
4.24
6.58
0.278
4.18
6.33
0.266
4.35
7.50
0.274
4.55
8.41
4.22
6.48
0.300
1 (238)
Lactobacillus paracasei
3.91
7.27
4.12
7.20
0.352
3.66
7.31
0.586
3.63
6.23
0.762
3.88
7.05
3.72
6.92
0.552
paracasei 1 (279)
Lactococcus lactis lactis
4.42
6.94
4.13
7.23
0.330
4.15
7.59
0.312
4.18
6.61
0.360
4.42
7.60
4.13
6.16
0.302
2 (381)
3.69
6.51
0.748
3.66
6.72
0.500
4.26
6.47
0.316
Lactobacillus casei 1
3.69
7.11
0.560
NO SE SEMBRO
1. Se sembro para verificar comportamiento en liofilizador
2. Se neutraliza en un mismo erlenmeyer, se toman dos muestras para duplicado.
75
Anexos
ANEXO H. TABLA RESUMEN DE ELECTROFORESIS REALIZADAS
ENSAYO
% Acrilamida gel
Dilución
de la
De
De
concentración resolución muestra
Marcador de
peso
OBSERVACIONES
molecular
SIGMA Ultra
Voltaje constante de 120V. Por el corto tiempo de corrida
1h 15min
bajo peso
no resuelven bien las bandas
molecular
Se inicia en 20 mA constantes, a los 30 minutos es
Invitrogen
necesario bajar a 10 mA por efecto sonrisa. Se distinguen
1h 45min
MARK 12
algunas bandas sin embargo algunos carriles no estan bien
definidos.
Tiempo
1
16
16
1:2
2
16
16
1:2
3
16
16
1:1
1h 30min
Invitrogen
MARK 12
Voltaje constante de 120V. Las bandas del marcador se
ondulan y los carriles de las muestras se adelgazan.
4
16
16
1:2
2h 35min
Invitrogen
MARK 12
Voltaje constante de 100V. El marcador no resuelve bien y
las muestras presentan bandas altas y no de bajo peso.
5
8
14
1:2
2h 30min
Invitrogen
MARK 12
Voltaje constante de 80V. Las ultimas bandas del marcador
no resuelven bien, se diferencian bandas de bajo peso
molecular en las muestras.
6
8
14
1:1
3h
Invitrogen
MARK 12
Voltaje constante de 80V. No hay buena resolucion.
7
8
14
1:2
3h
Invitrogen
MARK 12
Voltaje constante de 80V. No hay buena resolucion del
marcador pero se diferencian bandas de bajo peso
molecular en las muestras..
8
8
14
1:2
3h
Invitrogen
MARK 12
15 mA por 15 minutos y 2 horas 45 minutos a 80V
constante. El marcador no resuelve, se ven bandas de bajo
peso pero no en todas las muestras.
2h 30min
SIGMA,
Invitrogen y
BIO-RAD
Se ensayan tres marcadores a diferentes concentraciones y
dos muestras, hay corrido pero no se diferencian todas las
bandas de los marcadores, las muestras presentan bandas
de bajo peso molecular.
9
8
14
1:2
76