aislamiento y evaluacion de microorganismos celuloliticos

AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y
EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)
DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ
LILIANA IBETH PEREZ PEREZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito
Para optar al título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIA
Bogotá, D.C.
Enero de 2007
i
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
ii
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y
EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)
DIANA MARIA GAITÁN BOHORQUEZ
LILIANA IBETH PEREZ PEREZ
APROBADO
Adriana Matiz Villamil
Bacterióloga M.Sc.
DIRECTORA
Balkys Quevedo Hidalgo
Ingeniera Quimica M.Sc.
CODIRECTORA
Andrea Aguirre
Bacterióloga M.Sc.
JURADO
Ivonne Gutierrez
Bacteriologa M.Sc.
JURADO
iii
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y
EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)
DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ
LILIANA IBETH PEREZ PEREZ
APROBADO
Angela Umaña Muñoz, M. Phil.
Decana académica
Facultad de Ciencias
David Gomez Mendez, M.Sc.
Director Carrera
Microbiología Industrial
i
A Dios por ser mi guía, a mi familia, en especial a mi mamá, mis abuelitos,
Camila y Batty por su infinito amor y compañía.
A Gustavo por brindarme su amor y orientación como lo hace un padre.
A Liliana por su constante dedicación, pero sobre todo por su amistad.
A Paulis, Pili y Memo por su amistad incondicional.
A Mario A. por su continuo interés, apoyo y por hacerme reír siempre.
Diana Gaitán
ii
A Dios por permitirme finalizar este trabajo.
A mis padres y hermanitos por su amor, interés, guía y continuo apoyo.
A mi Tía Nubia y Camilo por su apoyo incondicional.
A Dianis por sus enseñanzas y confianza.
A la familia Bohórquez Galindo, por acogerme en su hogar.
Liliana Pérez
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Adriana Matíz, por sus conocimientos, dedicación, paciencia y
confianza.
A la Ingeniera Balkys Quevedo, por su continua orientación, interés y
paciencia.
Al Doctor David Gómez, por su asesoria y apoyo continúo.
A cultivos del Norte, por permitirnos hacer uso de sus instalaciones.
A Viviana Gutiérrez por su amistad, ayuda y conocimientos.
A Johanna Buitrago y Dolly Tenjo, por su amistad y colaboración
permanente.
A Marcela Quintero, Martha Hernández, Jhon Manosalva, Paula Sarmiento,
Erika Fajardo, Sandra Sarmiento, Angela Pinzón, Mónica Chávez, Sandra
Gómez, Leonardo Sastoque, Maritza López por su amistad y su apoyo.
A Carlos Roa, por su paciencia y disposición.
A todas las personas que de una u otra manera formaron parte de esta
investigación.
vii
TABLA DE CONTENIDO
Pag.
1.
INTRODUCCIÓN
1
2.
MARCO TEÓRICO
2
2.1
La Celulosa
2
2.2
Degradación de la celulosa
4
2.2.1
Enzimas implicadas en la degradación de la celulosa
4
2.2.2
Evaluación de la Actividad Enzimática
5
2.2.2.1
Endoglucanasas
5
2.2.2.2
Exoglucanasas
6
2.2.2.3
β-glucosidasas
6
2.2.2.4
Celulasas Totales
7
2.2.3 Microorganismos Celulolíticos
2.2.3.1
7
Degradación de la celulosa por microorganismos aerobios
y anaerobios
9
2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradación
microbiológica de la celulosa
10
2.2.4.1
Concentración de Nitrógeno en el suelo
11
2.2.4.2
Temperatura
11
2.2.4.3
Aireación
11
2.2.4.4
pH
11
2.2.5
Factores que determinan la Actividad enzimática de las
Celulasas
12
2.2.5.1
Sinergismo
12
2.2.5.2
Adsorción
13
2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales
Lignocelulósicos
13
2.2.7 Productos de degradación de la celulosa y su utilidad industrial
13
2.2.8 Aplicación de la glucosa a nivel industrial
14
viii
2.2.9 Determinación de actividad celulolítica
15
2.2.9.1
Prueba cualitativa con Rojo Congo
15
2.2.9.2
Prueba cuantitativa por la técnica del Ácido
3,5- dinitrosalicílico (DNS)
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
2.2.10.1
16
17
Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal
generado en cultivos de flores (Cultivos del Norte)
18
3.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
19
4.
OBJETIVOS
20
4.1
Objetivo general
20
4.2
Objetivos específicos
20
5.
MATERIALES Y MÉTODOS
21
5.1
Localización y condiciones de muestreo
21
5.2
Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos
21
5.2.1 Aislamiento primario
21
5.2.2 Aislamiento secundario
22
5.3
Pruebas de antagonismo
22
5.4
Conservación de cepas
23
5.5
Caracterización y procesamiento del residuo vegetal
23
5.6
Proceso de fermentación en cultivo discontinuo
24
5.6.1 Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolíticos seleccionados
5.6.1.1
24
Pruebas preliminares de actividad celulolítica de las cepas
seleccionadas (Individualmente)
5.6.1.2
24
Evaluación de la actividad celulolítica de las
cepas
seleccionadas (Consorcio)
25
5.7
Determinación de azúcares reductores
25
5.8
Determinación de actividad celulolítica
26
ix
5.8.1 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
pH 7.0
26
5.8.2 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico
0.1M pH 5
27
5.9
Identificación Bioquímica
27
5.10
Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo
28
5.11
Análisis Estadístico
28
6.
RESULTADOS Y DISCUSION
29
6.1
Aislamiento de microorganismos celulolíticos
29
6.2
Pruebas de Antagonismo
35
6.3
Pretratamiento del residuo vegetal
39
6.4
Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas
aisladas
40
6.4.1
Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio
41
6.5
identificación Bioquímica
44
6.6
Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico 47
6.6.1 Condiciones de pH y temperatura durante la fermentación
6.7
50
Actividad enzimática y liberación de azúcares reductores
a partir del residuo vegetal de crisantemo
51
7.
CONCLUSIONES
56
8.
RECOMENDACIONES
57
9.
LITERATURA CITADA
58
x
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 1.
Bacterias con alta Actividad Específica de celulasas
8
Tabla 2.
Hongos con alta Actividad Específica de celulasas
9
Tabla 3.
Caracterización macro y microscópica de las cepas
con actividad celulolítica aisladas en agar CMC 1%(p/v)
30
Actividad celulolítica cualitativa de las cepas aisladas
en agar CMC 1%(p/v)
30
Tabla 5.
Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v)
38
Tabla 6.
Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 2%(p/v)
38
Tabla 7.
Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 3%(p/v)
39
Tabla 24.
Identificación Bioquímica cepa 8
44
Tabla 25.
Identificación Bioquímica Actinomiceto
46
Tabla 4.
xi
INDICE DE FIGURAS
Pag.
Figura 1.
Estructura Química de la celulosa
3
Figura 2.
Estructura de la Celulosa: regiones cristalinas y amorfas
4
Figura 3.
Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1%(p/v)
31
Figura 4.
Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1%(p/v)
31
Figura 5.
Zonas de aclaramiento, cepa 3 en Agar CMC 1%(p/v)
32
Figura 6.
Zonas de aclaramiento, cepa 4 en Agar CMC 1%(p/v)
32
Figura 7.
Zonas de aclaramiento, cepa 5 en Agar CMC 1%(p/v)
33
Figura 8.
Zonas de aclaramiento, cepa 6 en Agar CMC 1%(p/v)
33
Figura 9.
Zonas de aclaramiento, cepa 7 en Agar CMC 1%(p/v)
34
Figura 10.
Zonas de aclaramiento, cepa 8 en Agar CMC 1%(p/v)
34
Figura 11.
Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1
35
Figura 12.
Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2
35
Figura 13.
Antagonismo cepa 8 frente a cepa 4
36
Figura 14.
Antagonismo cepa 8 frente a cepa 5
36
Figura 15.
Antagonismo cepa 8 frente a cepa 6
36
Figura 16.
Antagonismo cepa 8 frente a cepa 7
36
Figura 18.
Resistencia cepa 8
36
Figura 19.
Residuo vegetal de crisantemo molido
40
xii
Figura 20.
Azúcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)
en SVS al 10% (p/v)
42
Figura 21. Actividad enzimática en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)
en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de
pH7 37ºC y pH5 50ºC
43
Figura 22.
Azúcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en
SVS al 10%(p/v)
43
Actividad enzimática en el cultivo de Streptomyces sp.
en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de
pH7 37ºC y pH5 50ºC
43
Características macroscópicas cepa 8 en agar
CMC 1%(p/v)
44
Características macroscópicas Streptomyces sp.
en agar avena 5%(p/v)
45
Figura 26.
Características microscópicas Streptomyces sp.
45
Figura 27.
Azúcares reductores en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)
49
Figura 23.
Figura 24.
Figura 25.
Figura 28.
Azúcares reductores en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v) 49
Figura 29.
Variación de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)
50
Variación de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS
al 10%(p/v)
51
Figura 30.
Figura 31.
Actividad enzimática en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37ºC
51
Figura 32.
Actividad enzimática en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC
xiii
52
Figura 33.
Actividad enzimática en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37ºC
xiv
52
LISTA DE ANEXOS
Pag.
ANEXO 1.
Medios de cultivo y reactivos
64
ANEXO 2.
Determinación de azúcares reductotes por el método
del Acido 3,5- dinitrosalicílico
66
Pruebas preliminares: Determinación de Azúcares
reductores y Actividad enzimática cepas 1, 3,4 y 7
68
ANEXO 3.
ANEXO 4.
ANEXO 5.
Pruebas preliminares: Determinación de Azúcares
reductores y Actividad enzimática de Bacillus sp.
(cepa 8) y Streptomyces sp. por separado y en consorcio 71
Pruebas preliminares: Determinación de Azúcares
reductores y Actividad enzimática del consorcio
(Bacillus sp y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo
en SV y SVS al 5 y 10%(p/v)
74
ANEXO 6.
Análisis fisicoquímico del residuo vegetal de crisantemo
76
ANEXO 7.
Perfil cromatográfico: Sobrenadante de la hora seis de
fermentación en SV Y SVS al 10%(p/v)
77
ANEXO 8.
Análisis estadístico (SPSS, versión 14)
xv
79
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos
degradadores de celulosa a partir de residuos vegetales frescos y en
compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesofílicas con actividad
celulolítica a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje. La
actividad celulolítica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante
el
revelado
de
halos
de
hidrólisis
con
rojo
congo
en
medio
Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v), posteriormente, con el objetivo de
establecer un consorcio bacteriano celulolítico
se realizaron pruebas de
antagonismo para determinar si existía algún tipo de inhibición entre éstas.
La actividad celulolítica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la
técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) a partir de la cual sólo una cepa
fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de potencializar la
actividad de dicha cepa se usó un actinomiceto aislado y evaluado en otro
estudio.
Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y
Streptomyces sp.. La capacidad degradadora del consorcio sobre el residuo
vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con sustrato vegetal
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales, llamado
medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y otro, compuesto de sustrato
vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona,
llamado medio sustrato vegetal (SV), determinando la concentración de
azúcares reductores liberados mediante la técnica de DNS y la actividad
enzimática en buffer fosfato pH7 37ºC y buffer ácido cítrico pH5 50ºC. Los
resultados obtenidos mostraron que la degradación del sustrato vegetal de
crisantemo fue mejor cuando las microorganismos actuaron en consorcio
demostrando una acción sinérgica entre sus enzimas, por otro lado, en el
medio SV en una concentración del 10%(p/v) se dió la mayor liberación de
azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimática
de0.1056UC.
ABSTRACT
The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose
degradation by microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic
activity were isolation and purified from vegetable wastes of a composting
system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism
was
evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red
and
carboximethylcellulose (CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the
objective to create a cellulolytic bacterial association developed antagonism
test for determine if any type of inhibition existed between them. The
cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid
(DNS) method, only one microorganism was selected for the bacterial
association. With the aim of boost the bacteria activity, employed a cellulolytic
actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation. This
microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The
degradation capacity of bacterial association using vegetable wastes of
crisantemo was evaluated employing two broths: one of this with vegetable
waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations,
yeast extract and peptone (SV) the concentration of reducing sugars was
evaluated with DNS method and the cellulose activity using CMC phosphate
buffer pH7 37ºC and CMC citric acid pH5 50ºC. The obtained results
indicated that the best degradation of vegetable wastes was using the
bacterial
association,
showing
a
synergetic
furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed
cellulose
degradation,
the best concentration of
reducing sugars (1.665 g/L) and cellulose activity
of
0.1056 UC.
1. INTRODUCCION
La floricultura es una de las actividades más desarrolladas en Colombia, el
crisantemo ocupa el cuarto lugar en flores de exportación y genera durante
casi todas las etapas del proceso productivo, grandes cantidades de residuos
vegetales de difícil degradación en el medio ambiente. Dentro del programa
de gestión ambiental de este sector los residuos sólidos generados son
tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnológica
es la utilización de microorganismos celulolíticos capaces de degradar estos
residuos, con la consecuente producción de azúcares fermentables que a su
vez puedan ser usados como sustrato glicosídico natural.
Los microorganismos encargados de la degradación de la celulosa, principal
componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias, hongos y
actinomycetes, aerobios, anaerobios, mesofílicos y termofílicos, los cuales
cuentan con la maquinaria enzimática necesaria para dicho propósito, por tal
razón, su aislamiento e identificación representa un importante recurso para
lograr la disminución del impacto ambiental y la generación de un sustrato
fermentable cuya utilidad podría estar en la producción de etanol, obtención
de ácidos orgánicos, edulcorantes, productos farmacéuticos y alimentos,
entre otros.
2. MARCO TEÓRICO
2.1 La Celulosa
La celulosa es un importante constituyente carbonado de las plantas
superiores y probablemente el compuesto orgánico más abundante en la
naturaleza. Debido a que gran parte de la vegetación que pasa a formar
parte del suelo es celulósica, la descomposición de este carbohidrato tiene
una importancia muy especial en el
ciclo
biológico
del
carbono,
consecuentemente los microorganismos del suelo que catabolizan la
hidrólisis del material vegetal (40-60% de residuos de plantas) influencian el
flujo de energía desde éste hasta la formación de CO2 y su liberación a la
atmósfera. Como las bacterias y hongos del suelo son los microorganismos
mayormente involucrados en el ciclaje del material vegetal, cambios en el
número de estos pueden indicar modificaciones en el contenido de materia
orgánica del suelo. Cuando esto se corrobora con otros indicadores
ecológicos (biomasa y diversidad de especies encontradas) se obtiene
información acerca del estado del suelo y su productividad (Hendricks, et al,
1995). Como resultado, se ha prestado gran atención a los organismos que
participan en la descomposición de esta sustancia (Alexander, 1980).
Estructuralmente, la celulosa es un carbohidrato compuesto de unidades de
glucosa unidas en una larga cadena lineal por enlaces β en los átomos de
carbono 1 y 4 de la molécula de azúcar (Fig. 1)
2
Fig.1 Estructura Química de la celulosa (Heldt, 1997)
La celulosa existe en las plantas superiores, en las algas, en muchos tipos de
hongos y en los quistes de algunos protozoarios. El polisacárido está
localizado en la pared celular donde se encuentra como unidades
submicroscópicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,
estas micelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas, las
cuales están suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración no
sólo de enzimas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua (Lynd, et
al, 2002).
Una importante característica de la celulosa, relativamente inusual de los
polisacáridos es su estructura cristalina (Fig. 2), sin embargo, las fibras
individuales no son puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas
donde las fibras contienen torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual
permite la formación de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos
para permitir la penetración de moléculas relativamente grandes incluyendo,
en algunos casos enzimas celulolíticas (Lynd, et al, 2002).
Las microfibrillas de celulosa están estabilizadas por enlaces de hidrógeno
intra e intermoleculares y rodeadas por polisacáridos hemicelulósicos
(manano y xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrógeno y
enlaces covalentes, los cuales la
hacen extremadamente resistente a la
3
hidrólisis química y biológica. Así mismo, las regiones amorfas de la
estructura cristalina de la celulosa tienen una composición heterogénea
caracterizada por una variedad de enlaces. Finalmente este arreglo
asimétrico
que caracteriza las regiones amorfas es crucial para la
biodegradación de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002)
Fig. 2 Estructura de la celulosa: regiones cristalinas y amorfas
(Guevara, et al, 2003)
2.2 Degradación de la celulosa
2.2.1 Enzimas implicadas en la degradación de la celulosa
El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrólisis enzimática de
la celulosa involucra la acción enzimática de tres enzimas: la endo β-1,4
glucanasa (β-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo β-1,4 celobiohidrolasa y
la β-1,4 glucosidasa (Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).
La endo β- 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces β- 1,4
glucosídicos intramoleculares accesibles de cadenas de celulosa para
4
producir oligosacáridos de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa
cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de
celobiosa o glucosa y por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso
hidrolítico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo
glucosa desde los extremos no reductores de pequeños celoligosacáridos.
(Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).
2.2.2 Evaluación de la Actividad Enzimática
La actividad enzimática de las celulasas puede ser medida de dos formas
básicas:
•
Medición de la actividad individual de cada celulasa (endoglucanasas,
exoglucanasas y β-glucosidasas).
•
Medición de la actividad total de las celulasas (Zhang et al, 2006).
2.2.2.1 Endoglucanasas
Las endoglucanasas actúan al azar sobre los enlaces β- 1,4 glucosídicos y
su actividad es con frecuencia medida sobre celulosa soluble con alto grado
de polimerización, como es el caso de la carboximetilcelulosa CMC. La
acción de las endoglucanasas sobre este sustrato celulósico se caracteriza
por la disminución de la viscosidad realizando clivajes intramoleculares
(Zhang et al, 2006). Además la tasa de hidrólisis está condicionada a la
habilidad de las endoglucanasas para actuar en las regiones amorfas de la
matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos reductores en los
cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete, 2002).
5
La medición de la actividad de endoglucanasa puede ser basada
en la
reducción de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos
reductores que se determinan por técnicas que permitan medir azúcares
reductores. Sin embargo, la actividad de las exoglucanasas también
incrementa el número de extremos reductores por lo cual, es recomendable
que la actividad de las endoglucanasas sea medida por ambos métodos
(viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al, 2005).
Por otro lado, dicha actividad puede ser fácilmente detectada en medios con
CMC o celulosa y adición de varios colorantes como el rojo congo, debido a
que estos son adsorbidos sólo por largas cadenas de polisacáridos. Este
método es semi-cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un
gran número de muestras (Ten et al, 2004).
2.2.2.2 Exoglucanasas
Las exoglucanasas clivan los extremos accesibles de la molécula de celulosa
para liberar glucosa y celobiosa. La celulosa microcristalina (Avicel) es un
sustrato adecuado para la medición de la actividad por tener un bajo grado
de polimerización y una baja accesibilidad (Lynd et al, 2005; Zhang et al,
2006).
2.2.2.3 β-glucosidasas
La β-glucosidasa hidroliza la celobiosa soluble y otras celodextrinas con un
grado de polimerización superior a 6 y la posterior producción de glucosa. La
tasa de hidrólisis disminuye con el incremento en el grado de polimerización
del sustrato. La actividad de esta enzima también puede ser medida usando
celobiosa, la cual no es hidrolizada por las endoglucanasas ni exoglucanasas
(Lynd et al, 2005).
6
2.2.2.4 Celulasas Totales
El
sistema
de
celulasas
esta
conformado
por
endoglucanasas,
exoglucanasas y β- glucosidasas, las cuales hidrolizan sinérgicamente la
celulosa cristalina. La evaluación de la actividad de las enzimas celulolíticas
es con frecuencia evaluada usando sustratos insolubles los cuales incluyen:
papel filtro Whatman Nº1 y celulosa microcristalina. La heterogeneidad de la
celulosa insoluble y la complejidad del sistema de celulasas causa problemas
en la medición de la actividad total. Resultados experimentales muestran que
la estructura heterogénea de la celulosa insoluble induce la disminución en la
tasa de hidrólisis en corto tiempo (menos de una hora) provocando la
desactivación de las celulasas (Zhang et al, 2006).
2.2.3 Microorganismos Celulolíticos
Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias,
aerobios y anaerobios, mesofílicos y termofílicos que ocupan una variedad
de habitats (Aubert, 1988). Entre los hongos celulolíticos se destacan:
Trichoderma
reesei,
Phanerochaete
chrysosporium,
Fusarium
solani,
Penicillum funiculosum, Trichoderma koningii, Sporotrix sp., Alternaria sp.,
Geotrichum sp., Rhizoctonia sp., Trametes sp., Paecilomyces sp. , Mucor
sp.,Cladosporium sp., Bulgaria sp., Chaetomium sp., Helotium sp.,
Aspergillus sp.. Las bacterias celulolíticas más abundantes y conocidas son
las aerobias entra las cuales se pueden citar: Cellulomonas sp., Microbispora
bispora, Thermomonospora sp. ,Cytophaga sp., Corynebacterium sp., Vibrio
sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp.,Thermobifida sp.. Además se encuentran
algunos
anaerobios
Bacteroides
cellulovorans,
como:
cellulosolvens,
Clostridium
Acetivibrio
cellulolyticus,
Bacteroides
thermocellum,
Butirivibrio
succinogenes,
sp.,
Clostridium
Ruminococcus
albus,
Ruminococcus flavefaciens (Lynd, et al, 2002). Entre los actinomicetes se
7
destacan: Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus (Semedo,
et al., 2004; Grigorevski, et al., 2005; Li, 1997), Themomonospora curvata,
Thermomonospora chromogena, Thermomonospora alba y Thermomobifida
fusca (Ramírez y Coha, 2003).
El pH óptimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias
abarca un amplio rango, el cual incluye condiciones ácidas y alcalinas. (Tabla
1). Por otro lado, las celulasas producidas por hongos requieren
generalmente un pH ácido (Tabla 2).
Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Específica de celulasas
Microorganismo
Actividad Específica (μmol.min-1.mg-1)
pH óptimo
Bacillus subtilis
514
5-7
Clostridium thermocellum
428
7
Streptomyces murinus
6.7
6
Bacillus macerans
5030
6
Bacillus sp.
369.6
9
(Howard et al., 2003)
8
Tabla 2. Hongos con alta Actividad Específica de celulasas.
Microorganismo
Actividad Específica
-1
pH óptimo
-1
(μmol.min .mg )
Sclerotium rolfsii
475
3.3
Aspergillus niger
194
5
Achlya bisexualis
7840
6
Orpinomyces sp.
3659
5.8
Rizhopus chinensis
4800
ND
Penicillium
405
4.2
brefeldianum
(Howard et al., 2003)
N.D. No determinado
2.2.3.1 Degradación de la celulosa por microorganismos aerobios y
anaerobios
Existe una diferencia fundamental en el mecanismo de hidrólisis de la
celulosa entre bacterias y hongos aerobios y anaerobios. Los hongos y
bacterias aeróbicos característicamente cuentan con un sistema de celulasas
no complejo lo cual, conlleva a la secreción de enzimas hidrolíticas de
celulosa en el medio de cultivo. Sin embargo, bacterias anaeróbicas
especialmente Clostridium spp. y hongos del género Neocallimastix,
Piromonas y Sphaeromonas contienen un sistema de celulasas que forman
un complejo donde las enzimas que degradan la celulosa están contenidas
en una membrana llamada celulososoma. Esta fundamental diferencia tiene
implicaciones en el uso biotecnológico de estos microorganismos, pues las
basadas en bacterias y hongos anaerobios pueden tener ventajas sobre los
sistemas aeróbicos en términos de eficiencia hidrolítica. El sistema de
celulasas dispuestas en un complejo permite un alto grado de coordinación
entre las enzimas involucradas en la hidrólisis de la celulosa lo que permite
9
evitar la pérdida de los intermediarios durante la degradación por los cambios
en las condiciones ambientales (Malherbe y Cloete, 2002).
En los sistemas aeróbicos donde se requiere una agitación y aireación
continuas, la pérdida de las enzimas secretadas y de los intermediarios de
degradación puede afectar la eficiencia del proceso. Sin embargo, los
microorganismos aerobios ganan más energía de la glucosa que los
anaerobios (38 moles de ATP vs 2-4 moles de ATP por cada mol de glucosa)
por lo tanto, la aparente eficiencia hidrolítica de los microoganismos
aeróbicos es benéfica en cuanto a ganancia energética. Sin embargo, dado
los bajos requerimientos técnicos para la aplicación de microorganismos
anaeróbicos comparados con los sistemas aeróbicos (ausencia de agitación
vigorosa para facilitar la aireación y tecnologías para el control de flujo) el uso
de hongos y bacterias anaerobios en proyectos de biorremediación pueden
ser más atractivos por el bajo costo que requieren y la alta eficiencia de la
maquinaria hidrolítica sobre la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).
2.2.4
Factores
ambientales
que
determinan
la
degradación
microbiológica de la celulosa
La tasa a la cual se metaboliza la celulosa está dada por varios factores del
medio ambiente, y los suelos que varían en sus características físicas y
químicas poseen marcadas diferencias en su capacidad celulolítica. Los
principales factores del medio ambiente que afectan la transformación son el
nivel de nitrógeno disponible, la temperatura, aireación, humedad, pH, la
presencia de otros carbohidratos y la proporción relativa de lignina en los
restos vegetales ( Alexander, 1980).
10
2.2.4.1 Concentración de Nitrógeno en el suelo
La aplicación de nitrógeno inorgánico aumenta la descomposición de la
celulosa en el suelo y tanto las sales de amonio como las de nitrato son
buenas fuentes de este elemento. La respuesta a éste indica que el nivel de
nitrógeno en el suelo es un factor limitante (Alexander, 1980).
2.2.4.2 Temperatura
La utilización biológica de la celulosa puede llevarse a cabo desde
temperaturas cercanas a la congelación hasta alrededor de los 65ºC. Cada
una de las variedades de organismos celulolíticos es afectada en forma
diferente por la temperatura. Los mesófilos dominan en temperaturas
moderadas mientras que la microflora termofílica puede degradar la celulosa
por arriba de los 45ºC. Debido a los cambios en la composición de la flora
inducidos por la temperatura, el calor aumenta la velocidad de transformación
del sustrato a causa del efecto directo de ésta sobre la acción enzimática
(Alexander, 1980).
2.2.4.3 Aireación
La aireación también rige la composición de la flora activa. A causa del
proceso
anaeróbico,
el
metabolismo
de
la
celulosa
es
reducido
significativamente en medios deficientes de oxigeno en comparación con
habitats aireados (Alexander, 1980).
2.2.4.4 pH
En medios con pH entre neutro y alcalino, muchos microorganismos son
capaces de crecer y liberar las enzimas apropiadas para la hidrólisis del
11
polisacárido; bajo condiciones ácidas la desaparición de la celulosa se debe
principalmente a los hogos filamentosos. Aunque el proceso es rápido a pH
menor de 5 y ocasionalmente por debajo de 4, los suelos con bajas
concentraciones del ion hidrógeno degradan la celulosa más fácilmente
(Alexander, 1980).
2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimática de las celulasas
Diversos factores asociados con la naturaleza del sistema enzimático de las
celulasas ha sido sugerido por influenciar el proceso hidrolítico. Estos
incluyen: inhibición del complejo de celulasas por el producto final,
inactivación térmica, sinergismo e irreversible adsorción de las enzimas,
teniendo estos últimos la mayor influencia en la tasa de degradación del
polisacárido (Mansfield et al, 1999).
2.2.5.1 Sinergismo
El sinergismo ocurre cuando la acción combinada de dos o más enzimas
aumenta la tasa de acción sobre el sustrato respecto a la acción individual.
Se han hecho estudios en los que se ha observado una actividad cooperada
de las celulasas de Trichoderma reseei en el que las endoglucanasas actúan
al azar a lo largo de las cadenas de celulosa generando sitios donde actúan
las exoglucanasas las cuales liberan celobiosa como producto principal, una
tercera enzima, la β-glucosidasa es necesaria para hidrolizar la celobiosa
previniendo de esta manera la inhibición de las exoglucanasas por
acumulación de producto y por tanto generando un
hidrolítica. (Mansfield et al, 1999)
12
aumento en la tasa
2.2.5.2 Adsorción
La hidrólisis de la celulosa difiere de otras reacciones enzimáticas en que el
sustrato es insoluble y requiere una previa adsorción de la enzima al
sustrato. La adsorción de las celulasas es facilitada por la presencia de
dominios en el sustrato los cuales son susceptibles al clivaje proteolítico
mediante uniones por fuerzas de van der waals y puentes de hidrogeno.
Además dichos dominios cuentan con aminoácidos aromáticos que confieren
una especificidad adicional y estabilidad al complejo enzima -
sustrato
(Mansfield et al., 1999).
Existen dos teorías para explicar la interacción de los dominios con la
celulosa. La primera se basa en que los dominios incrementan la
concentración local de enzimas en la superficie de la celulosa, la segunda
propone que los dominios son un instrumento que permite el rompimiento de
cadenas de celulosa cristalina pero no de celulosa amorfa (Mansfield et al.,
1999).
2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales lignocelulósicos
Los materiales lignocelulósicos pueden ser tratados aplicando estrategias
que incluyen: tratamiento anaeróbico, compostaje, producción de proteína
celular para la alimentación de animales rumiantes y cultivo de champiñón
(Howard et al., 2003).
2.2.7 Productos de degradación de la celulosa y su utilidad industrial
Las bacterias aerobias generalmente convierten la celulosa en dos productos
principales: CO2 y biomasa. No existen acumulaciones significativas de
intermediarios carbonados y la concentración de ácidos orgánicos raramente
13
alcanza un nivel apreciable. Por otro lado, en condiciones anaerobias las
bacterias son incapaces de metabolizar completamente dicho sustrato,
siendo los principales productos de acumulación, CO2, CH4, H2, etanol y
ácidos acético, fórmico, succínico, butírico y láctico (Alexander, 1980).
La celulosa es empleada a nivel industrial en la manufactura de papel y
cartón, telas, películas fotográficas, celofanes, explosivos, diluyentes,
jabones, aromas y alimentos (Alexander, 1980).
En Colombia se han adelantado diferentes investigaciones en búsqueda de
nuevas alternativas para la utilización de celulosa fibra, entre estas:
•
Diseño,
fórmula,
elaboración
y
evaluación
de
un
excipiente
coprocesado a base de celulosa fibra para la elaboración de formas
farmacéuticas sólidas (tabletas) por el método de compresión directa
(Sánchez y Zuluaga, 1999).
•
Utilización de residuos vegetales generados en el sector floricultor
nacional en la elaboración de papel manual (Pérez, 1996).
•
Obtención de etanol como biocombustible a partir de residuos
lignocelulósicos y amiláceos mediante ensayo de hidrólisis y
fermentación de azúcares (Tellez y Pava, 2003).
2.2.8 Aplicación de la glucosa a nivel industrial
La glucosa, por ser un producto que posee diferentes características, entre
ellas el ser edulcorante, preservativo de la humedad, inhibidor frente a
levaduras y mohos, estabilizador de la viscosidad, etc, tiene gran aplicación
en la industria farmacéutica y de alimentos. La característica reductora de la
14
glucosa referida a la capacidad de su grupo carboxilo para reaccionar como
tal, esta directamente relacionado con la capacidad de formar colores, y
aromas de tostado por la reacción con las proteínas (Forero, 1986).
•
Industria de alimentos: En confitería como agente anti cristalizador, en
producción de jaleas y mermeladas previene la cristalización del azúcar,
en la elaboración de productos horneados de panadería se utiliza para
dar volumen, endulzar y prolongar la vida útil de los productos.
•
Industria Farmacéutica: Es utilizada como excipiente en la elaboración de
jarabes y grageas, hace parte de la formulación de algunos sueros orales,
etc.
•
Producción de etanol como biocombustible
•
Producción de ácidos orgánicos (Forero, 1986).
2.2.9 Determinación de actividad celulolítica
2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo
Diferentes procedimientos utilizados en la identificación y enumeración de
los microorganismos capaces de utilizar la celulosa han sido descritos;
siendo la base de estos la hidrólisis de sustratos celulósicos. La utilización de
medios líquidos que contienen celulosa permiten estimar cualitativa y
cuantitativamente los microorganismos degradadores, los medios sólidos son
generalmente más usados pero en estos las colonias de microorganismos
que utilizan el sustrato son con frecuencia difíciles de diferenciar de otros
microorganismos que no lo hacen. Teather y Wood en 1982, observaron que
el rojo congo podía ser usado en los ensayos para evidenciar la hidrólisis de
15
polisacáridos debido a que el colorante forma complejos con las moléculas
aún no hidrolizadas, facilitando así la diferenciación entre microorganismos
celulolíticos y no celulolíticos por la formación de zonas de aclaramiento
alrededor de las colonias (Hendricks, et al., 1995).
2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la técnica del Ácido 3,5- dinitrosalicílico
(DNS)
La actividad del sistema enzimático en el complejo celulolítico puede medirse
determinando la cantidad de glucosa liberada mediante DNS. Esta técnica
demuestra la presencia del grupo carbonilo libre (C=O) de los azúcares
reductores que implica la oxidación del grupo funcional aldehído de la
glucosa (Miller,1959).
En este método el Ácido 3,5- dinitrosalicílico es reducido a ácido 3-amino-5nitrosalicílico, mientras que los grupos aldehídos son oxidados a grupos
carboxilos. La reducción del ácido genera un color amarillo el cual es
proporcional a la concentración del azúcar reductor presente y se evidencia
por medio de la lectura de absorbancias en el espectrofotómetro lo que
implica la aplicación de la ley de Beer Lambert (Miller,1959).
La lectura de la prueba de DNS es altamente influenciada por las mismas
condiciones de la prueba, como la temperatura del agua de calentamiento, la
transferencia de calor, el tiempo de reacción, la proporción de glucosa,
celobiosa y celodextrinas presentes y el tiempo de preparación del reactivo,
el cual con frecuencia es ignorado (Zhang et al., 2006).
16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
Uno de los cultivos que actualmente genera el mayor número de divisas
dentro de las exportaciones no tradicionales colombianas es el de la
floricultura. En un período no superior a diez años, Colombia se ha
convertido en el segundo exportador mundial (después de Holanda) de flores
cortadas, con una participación del 10% sobre el total de las exportaciones
mundiales. Más de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan
el clavel, el pompón, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la
Sabana de Bogotá, el Oriente Antioqueño y el Valle del Cauca siendo sus
principales mercados Estados Unidos (80%) y la Unión Europea (14%).
(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).
El
crisantemo
(Dendranthema
grandiflora)
es
un
híbrido
complejo
perteneciente a la familia Asteraceae y engloba flores de las más antiguas
cultivadas en Colombia. Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas,
ligulosas o rugosas, de color variable entre el verde claro y oscuro,
recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un aspecto grisáceo (Stace,
2003; Santana, et al, 2002).
La propagación se realiza por esquejes terminales que se obtienen de
plantas madre seleccionadas por su conformación a la progenie, capacidad
de cosecha y vigor mantenidas bajo condiciones de día largo para inhibir la
formación de botones finales. Los esquejes terminales de 8-10cm de longitud
pueden colocarse directamente en el medio para enraizamiento o
almacenarse a 0-3ºC durante unas seis semanas, en cajas de cartón
forradas con polietileno para evitar la deshidratación (Vidiale, 1983). Entre los
sustratos utilizados en el proceso de enraizamiento se destacan: perlita,
vermiculita, arena, turba o mezclas de estos. En la sabana de Bogotá se
17
emplean productos naturales como cascarilla de arroz o escoria (Santana, et
al,2002).
En cuanto a sus requerimientos nutricionales el crisantemo es un cultivo
bastante exigente en lo referido a las cantidades de nitrógeno, fósforo y
potasio necesarias para la obtención de flores y plantas de óptima calidad.
Cuando existen deficiencias, aplicaciones moderadas no logran remediar los
trastornos ocasionados, por lo cual, luego de la siembra de los esquejes se
recomienda utilizar fertilizantes con alto contenido en nitrógeno, potasio y
otros microelementos, manteniendo un pH entre 55.5 y 6.5 (Santana, et al.,
2002).
2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal generado
en cultivos de flores (Cultivos del Norte).
Durante la actividad de cosecha realizada en cultivo de flores (Cultivos del
Norte) se generan aproximadamente cuatro toneladas de residuos vegetales
al mes, dichos residuos son acumulados y posteriormente llevados en su
totalidad a pilas de compostaje; con el fin de obtener abono orgánico utilizado
en la adecuación de los suelos, por lo cual en este caso los residuos
vegetales no tienen ningún valor comercial. (comunicación verbal)
18
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Actualmente una gran cantidad de residuos de celulosa que puede ser
medida en billones de toneladas son producidos en el mundo entero como
resultado de actividades en la agricultura y la industria.
En Colombia, el cultivo de flores representa una fuente importante de dichos
residuos, se cultivan más de 50 tipos diferentes, del total de las
exportaciones colombianas de flores para el año 2001 la participación fue de
24.7% de rosa, 21.4% de clavel estándar, 11.3% de mini clavel y 2.3% de
crisantemo. Actualmente este sector libera altos volúmenes de residuos
vegetales que dificultan su manejo y debido a su lenta degradación se
convierten en un problema de alto impacto ambiental (pérdida de espacio
físico, impacto paisajístico, generación de plagas, etc) (Asocolflores, 2001)
La utilización de microorganismos con actividad celulolítica representa una
de las opciones con mayor viabilidad en la solución de esta problemática ya
que el costo de inversión es bajo y se da un uso adecuado a dichos residuos
obteniendo un sustrato que puede ser aprovechado como fuente de carbono
en producción industrial.
En el presente trabajo se plantea el aislamiento e identificación de consorcios
microbianos con actividad celulolítica, a partir de residuos celulósicos
generados
en
un
cultivo
productor
de
crisantemo
(Dendranthema
grandiflora), útiles en la degradación celulósica de residuos vegetales y
además generadores de sustratos glucosídicos que pueden ser empleados
en la obtención de etanol, ácidos orgánicos, edulcorantes, alimentos e
industria farmacéutica.
19
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a partir de
residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de
crisantemo (Dendranthema grandiflora).
4.2 Objetivos específicos
•
Aislar e identificar microorganismos con actividad celulolítica a partir
de residuos vegetales frescos y en compost provenientes de un cultivo
de crisantemo (Dendranthema grandiflora).
•
Seleccionar los microorganismos que presenten mayor actividad
celulolítica y realizar banco de cepas.
•
Realizar pruebas de antagonismo entre las cepas que presenten
mayor actividad celulolítica.
•
Evaluar actividad celulolítica del consorcio microbiano aislado
utilizando como sustrato residuo vegetal con y sin suplemento, a una
concentración del 5%(p/v) y 10%(p/v).
20
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Localización y condiciones de muestreo
El muestreo del residuo vegetal se realizó a partir de residuos frescos y en
compostaje de un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
localizado en el municipio de Tocancipá, ubicado a 2606 m.s.n.m cuya
temperatura promedio es de
13ºC y una humedad relativa del 80%
(http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co)
Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de residuo fresco de 1
semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una temperatura
de 18ºC; en el caso de los residuos en degradación se muestrearon
diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradación,
registrando una temperatura de 50ºC y un pH de 8.6. Los residuos vegetales
fueron recolectados manualmente con ayuda de un barreno y depositados en
bolsas de polipropileno, que posteriormente fueron llevadas al laboratorio de
Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y mantenidas
en nevera a 4ºC, mientras fueron procesadas.
5.2 Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos
5.2.1 Aislamiento primario
Se pesaron 10g de las muestras de residuos vegetales frescos y en
compostaje, cada uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua
peptonada 0.1%(p/v). Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de
10-1 a 10-5 en agua peptonada a 0.1%(p/v). A partir de las diluciones
preparadas se realizó siembra en superficie en agar Carboximetilcelulosa
(CMC) al 1%(p/v) (Anexo 1). Las cajas fueron incubadas a 35oC por 48
21
horas. Transcurrido el tiempo de incubación se adicionó rojo congo al
1%(p/v) (Anexo 1) como revelador a las colonias presentes en los medios,
luego de quince minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 0.1M (Anexo
1), dejando reposar por quince minutos más, para luego hacer el recuento de
las colonias que presentaron halos de hidrólisis (Teather y Wood, 1982).
5.2.2 Aislamiento secundario
A partir de los microorganismos obtenidos en el aislamiento primario se
realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que presentaron
actividad celulolítica, llevando a incubación y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario.
5.3 Pruebas de antagonismo
Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se siguió el método de
Gauze, para lo cual se preparó una suspensión en solución salina 0.85%
(p/v) de 10ml de cada uno de los microorganismos seleccionados por
presentar mayor actividad enzimática, igualando la concentración al tubo uno
del patrón de Mc Farland (3x108 cel/ml) y llevando a incubación a 100 rpm,
35ºC durante 14h. (Moreno et al, 2000). Por triplicado se dispusieron sobre
agar CMC al 1%(p/v), 2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del
microorganismo a enfrentar), anillos plásticos estériles de un centímetro de
diámetro de tal modo que una parte del anillo quedó dentro del agar sin tocar
la base de la caja de petri. Dentro de los anillos se inoculó una suspensión de
50μl del microorganismo antagonista. Control negativo: anillo con agua
destilada estéril. Teniendo como criterio de selección halos mayores a 5mm
(Gauze, 1967).
22
5.4 Conservación de cepas
Las cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a
tinción de Gram y una vez definidas sus características microscópicas se
procedió a obtener cultivos axénicos en agar CMC 1%(p/v). Se llevaron a
cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1%(p/v)
(composición igual a agar celulosa excepto agar) igualando la concentración
al tubo 1 del patrón de Mc. Farland (3*108 cel/ml). Estas suspensiones se
mezclaron con glicerol a una concentración final de 25% (v/v), posteriormente
las suspensiones celulares fueron distribuidas en tubos eppendorf, cada uno
conteniendo un volumen de un mililitro que luego fueron almacenados a –
20ºC (Poutou, et al., 1994).
5.5 Caracterización y procesamiento del residuo vegetal
Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron
sometidos a una caracterización físico-química en AGRILAB, laboratorio de
análisis químicos e insumos agrícolas certificado como laboratorio de
referencia por el ICA. Para el procesamiento de dicho residuo se llevó a cabo
el siguiente protocolo: lavado con agua para retirar partículas de suelo,
reducción de tamaño mediante picado, lavado con SDS (Sodio Dodecil
Sulfato) al 1%(p/v) ebullición por un período de media hora con SDS al 1%
(p/v), secado a 55ºC y finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et
al., 2003)
23
5.6 Proceso de fermentación en cultivo discontinuo
5.6.1 Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolíticos seleccionados
Para la realización de este proceso se emplearon dos medios: uno con
sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) junto con los
componentes del caldo celulosa exceptuando la carboximetilcelulosa,
llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) (Anexo 1) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de
levadura (2.5g/L) y peptona (2.5g/L) llamado medio sustrato vegetal (SV)
(Anexo 1).
5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celulolítica de las cepas
seleccionadas (Individualmente)
Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimático y la
subsecuente liberación de azúcares reductores utilizando las cepas aisladas
y seleccionadas en las pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo
CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y 5%(p/v) y SVS al 10%(p/v).
Inicialmente estas cepas fueron reactivadas del banco en cajas de agar CMC
al 1%(p/v) e incubadas a 35ºC durante 48 horas. A partir de cada cepa se
hizo un raspado en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x
108 cel/ml e incubando a 35ºC y 120rpm durante
24 horas. Las
fermentaciones se llevaron a cabo por triplicado en un VET de 250ml
adicionando el 10% de inóculo, con un tiempo de duración entre 18 y 24
horas, a 35ºC y 120rpm, muestreando cada dos horas hasta completar el
tiempo de fermentación. En cada una de las horas de muestreo. En cada una
de las horas de muestreo se realizó la determinación de azúcares reductores
24
por triplicado mediante la técnica de DNS (Numeral 5.7). Además se evaluó
Actividad enzimática en CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37ºC y buffer
acido cítrico pH5 50ºC relación 1:1 (numeral 5.8) con tiempos de reacción
enzima-sustrato de 30’, 60’ y 120’, realizando cada una de estas
evaluaciones por triplicado.
5.6.1.2
Evaluación de la actividad celulolítica de las cepas
seleccionadas (En consorcio)
Para evaluar la actividad hidrolítica de las cepas en consorcio se realizaron
fermentaciones
en
caldo
CMC
al
1%(p/v),
caldo
SV
y
SVS
en
concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno, con un VET de 1000ml, .
adicionando 10% de inóculo repartido en volúmenes iguales de cada cepa a
evaluar ; incubando a 35ºC y 120 rpm durante 18-24 horas. La biomasa
inicial fue determinada mediante recuento en placa, en el caso de bacterias y
recuento de conidios en cámara de Neubawer, para microorganismos
filamentosos. A partir de los muestreos realizados la determinación de
azúcares reductores mediante DNS (numeral 5.7) y actividad enzimática en
CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC al 1%(p/v) en buffer ácido
cítrico pH5 50ºC, relación 1:1 (numeral 5.8) con tiempo de reacción enzimasustrato de 60 minutos.
5.7 Determinación de azúcares reductores
Las muestras tomadas en cada hora de fermentación fueron inmediatamente
centrifugadas durante 20 minutos a 100rpm, a partir del sobrenadante
obtenido se tomó un volumen de 0.25ml, al cual se adicionó 0.25ml de DNS
(Anexo 2), esta mezcla se sometió a ebullición por 5 minutos, transcurrido
este tiempo, la mezcla se llevó a un recipiente con hielo durante 5 minutos y
posteriormente se adicionaron 2.5ml de agua destilada. Esta solución fue
25
leída en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad
media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplazó en la
ecuación de la línea recta arrojada por la curva patrón previamente realizada
(Anexo2), para la obtención de la concentración de glucosa residual en cada
hora de muestreo (Miller, 1959).
5.8 Determinación de actividad celulolítica
Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer
fosfato 0.1M pH 7 y buffer ácido cítrico pH5 (Anexo 1).
5.8.1 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
pH7
Se tomó 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo
en cada una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1ml de la
solución carboximetilcelulosa - buffer fosfato pH7. Dicha preparación se
realizó por triplicado para evaluar la reacción enzima-sustrato durante el
tiempo de reacción establecido para cada curva, incubando a 37ºC en baño
termostatado. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras fueron
llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para detener la
reacción enzimática, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100
rpm. A partir de los sobrenadantes se tomaron 0.25ml adicionando 0.25ml
de DNS, la mezcla fue puesta en ebullición por 5 minutos para luego
detener la reacción en hielo por 10 minutos luego, se adicionaron 2.5ml de
agua destilada y finalmente de hizo la lectura de las absorbancias
generadas
en
el
espectrofotómetro
a
540nm,
sensibilidad
media,
registrando los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva
patrón de DNS (Anexo 2) (Dávila, et al, 2002).
26
5.8.2 Solución de carboximetilcelulosa celulosa al 1%(p/v) en buffer
ácido cítrico 0.1M pH5
La determinación de la actividad enzimática con buffer ácido cítrico pH5. (se
llevo a cabo haciendo reaccionar 1ml de extracto crudo correspondiente a
cada hora de muestreo con 1ml de la solución de celulosa en buffer ácido
cítrico pH5. Esta preparación se realizó por triplicado para evaluar la reacción
enzima-sustrato durante 60 minutos a 50ºC. Transcurrido cada tiempo de
incubación se detuvo la reacción en hielo por 10 minutos para
posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100rpm. A partir del
sobrenadante se tomó 0.25ml adicionando 0.25ml de DNS, la mezcla se llevó
a ebullición por 5 minutos, posteriormente se paso a hielo por 10 minutos y
por último se adicionaron 2.5ml de agua destilada realizando las lecturas de
absorbancia en el espectrofotómetro a 540nm, sensibilidad media registrando
los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva patrón de DNS
(Anexo 2) (Adrado, et al, 2005).
5.9 Identificación Bioquímica
La identificación bioquímica se realizó a los dos microorganismos que
finalmente fueron seleccionados para conformar el consorcio microbiano
celulolítico, por presentar la mejor actividad hidrolítica sobre el sustrato
evaluado.
Las
cepas
fueron
identificadas
macroscópica
y
microscópicamente, así mismo se realizó la evaluación del comportamiento
metabólico de acuerdo con el Manual de Bergey´s de Bacteriología
Sistemática.
27
5.10 Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo
El extracto crudo correspondiente a la hora seis de fermentación en SV y
SVS al 10%(p/v), obtenido como resultado de la actividad hidrolítica del
consorcio celulolítico definitivo, fue evaluado mediante cromatografía líquida
en el laboratorio de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de
Colombia, con el fin de determinar la concentración de azúcares reductores
presentes.
5.11 Análisis Estadístico
El análisis estadístico de los datos obtenidos durante la prueba experimental
se realizó determinando inicialmente la distribución normal de los datos
mediante la prueba de Chapiro Wilk y como prueba paramétrica T student,
utilizando el programa estadístico SPSS versión 14.
28
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Aislamiento de microorganismos celulolíticos
Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento
de microorganismos con actividad celulolítica, mientras que a partir de los
residuos vegetales en compostaje se logró el aislamiento de 8 cepas
bacterianas con dicha actividad (Tabla 3), esta diferencia probablemente se
debió a que en el proceso de compostaje la actividad metabólica microbiana
se incrementa, además, el tiempo de degradación transcurrido, la alta
temperatura y el pH alcalino permitieron el aislamiento de microorganismos
celulolíticos, pues dichas condiciones facilitan que bacterias esporógenas y
actinomicetes incrementen su actividad y por ende su población (Granados y
Valderrama, 2003).
La actividad celulolítica se evidenció mediante evaluación cualitativa con el
revelado de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1% (p/v) como ha
sido reportado por diferentes autores (Hendricks et al., 1995; Lu et al.,2005;
Zhang et al.,2006). El diámetro de los halos de hidrólisis generados no fue
establecido para la mayoría de las cepas, pues, se obtuvieron zonas de
aclaramiento que se difundieron en todo el medio; sin embargo, en el caso de
la cepas 2, 6 y 8 el diámetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35mm,
respectivamente (Tabla 4, figura 3-10), que comparados con el estudio
realizado por Lu et al. (2005), en el que los diámetros de hidrólisis de las
cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar CMC e incubadas a una
temperatura de 30+/-2ºC durante 5 días, alcanzaron valores de 6.4cm,
demuestran una baja actividad celulolítica de las cepas 2, 6 y 8 en este
medio. Sin embargo, se debe resaltar que las demás cepas pueden poseer
una actividad superior a la reportada por este autor.
29
Tabla 3. Caracterización macro y microscópica de las cepas aisladas con actividad
celulolítica en agar CMC 1%(p/v)
Cepa
Morfología
Gram
Borde
Color
Textura
1
Bacilos esporulados
Positivo
Irregular
Rosa pálido
Cremosa
2
Bacilos esporulados
Positivo
Irregular
Blanco
Cremosa
3
Bacilos esporulados
Negativo
Irregular
Incolora
Cremosa
4
Bacilos esporulados
Negativo
Irregular
Blanco
Cremosa
5
Bacilos esporulados
Positivo
Irregular
Blanco
Cremosa
6
Bacilos esporulados
Positivo
Irregular
Incolora
Cremosa
7
Bacilos esporulados
Positivo
Irregular
Incolora
Cremosa
8
Bacilos esporulados
Positivo
Regular
Beige
Cremosa
Fuente: Autores
Tabla 4. Actividad celulolítica cualitativa de las cepas aisladas en agar CMC 1%(p/v)
Cepa
Figura
Diámetro halo de hidrólisis
1
3
Indeterminado
2
4
0.3 mm
3
5
Indeterminado
4
6
Indeterminado
5
7
Indeterminado
6
8
0.2 mm
7
9
Indeterminado
8
10
0.35 mm
Fuente: Autores
30
Fig 3 Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
Fig 4. Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
31
Fig 5. Zonas de aclaramiento, cepa 3 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
Fig 6. Zonas de aclaramiento, cepa 4 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
32
Fig 7. Zonas de aclaramiento, cepa 5 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
Fig 8. Zonas de aclaramiento, cepa 6 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
33
Fig 9. Zonas de aclaramiento, cepa 7 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
Fig 10. Zonas de aclaramiento, cepa 8 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
34
6.2 Pruebas de Antagonismo
Con el fin de potencializar la actividad celulolítica de algunos de los
microorganismos aislados, se planteó la posibilidad de establecer un
consorcio microbiano para lo cual fue necesario realizar pruebas de
antagonismo que descartaran aquellas cepas que generaran algún tipo de
inhibición sobre las demás.
Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo
la mayor actividad antagónica frente a las demás cepas evaluadas
generando el máximo halo de inhibición (7.5mm) frente a la cepa 1 (Figura
11), por lo que en un principio fue descartada como parte del consorcio
microbiano, debido a su antagonismo frente a las siete cepas restantes
(Tabla 5, Figura 11-18).
Fig 11 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1
Fig 12 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2
Fuente: Autores
Fuente: Autores
35
Fig 13 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 4
Fig 14 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 5
Fuente: Autores
Fuente: Autores
Fig 15 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 6
Fig 16 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 7
Fuente: Autores
Fuente: Autores
Fig 18 Resistencia cepa 8
Fuente: Autores
36
La mayor susceptibilidad se observó en las cepas 2, 5 y 6, cuyo crecimiento
se vió inhibido por las demás cepas, generándose halos con diámetros hasta
de 5.0mm (Tabla 5). Las pruebas de antagonismo también se realizaron en
concentraciones de CMC al 2%(p/v) y 3 %(p/v) con el fin de determinar si el
comportamiento antagónico y crecimiento de cada cepa se mantenía a pesar
del incremento en la concentración de la fuente de carbono y de alguna
manera evaluar la inhibición por sustrato de las cepas seleccionadas.
En la concentración de 2%(p/v) en agar CMC se confirmó la susceptibilidad
de las cepas 2, 5 y 6 (Tabla 6) pues los resultados fueron muy similares a los
obtenidos en agar CMC al 1%(p/v) por lo cual, quedaron descartadas para
ser parte del consorcio.
La actividad antagónica evidenciada durante el desarrollo de las pruebas en
CMC al 1%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de
microorganismos aislados de una misma fuente puede generarse inhibición
entre ellos, una posible explicación a este hecho es que existan diferencias
en la complejidad del
sistema enzimático que les permite degradar el
sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando lugar a una
competencia por sustrato y espacio.
En los resultados obtenidos en agar CMC al 3%(p/v) las cepas 1, 3, 4 y 7, no
desarrollaron ningún efecto antagónico entre sí (Tabla 7), presentando un
crecimiento normal a dicha concentración, lo que demostró que estos
microorganismos contaban con una maquinaria enzimática adecuada para
degradar un sustrato celulósico, por lo cual, fueron escogidos inicialmente
para conformar el consorcio microbiano celulolítico.
37
Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v)
Cepa
Cepas en siembra masiva
Antagónica
1
2
3
4
5
6
a
1
N.D.
-
-
-
0.6
2
-
N.D.
-
-
1.0 a
-
5.0
a
-
a
a
-
N.D.
-
3
N.D.
1.8
0.5
7
a
-
0.5
8
a
-
-
-
2.0
a
-
-
2.0
a
-
-
4
-
5.0
5
-
4.0 a
-
-
N.D.
2.5 a
-
-
-
a
-
-
-
N.D.
6
3.2
7
-
-
-
-
8
7.5 a
4.4 a
3.8 a
3.1 a
0.7
a
-
-
a
N.D.
-
3.8 a
2.9 a
N.D.
1.0
5.0 a
Fuente: Autores
a
Promedio de tres repeticiones del diámetro del halo de inhibición (mm)
( - ) No hubo inhibición
ND No se determina
Tabla 6. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 2%(p/v)
Cepa en siembra masiva
Cepa Antagónica
2
5
6
1
-
-
0.8 a
2
N.D.
3
3.0
a
4
4.5 a
-
2.5 a
5
3.5 a
N.D.
3.2 a
6
-
2.8 a
N.D.
7
-
1.5 a
4.0 a
1.5
a
Fuente: Autores
a
Promedio de tres repeticiones del diámetro del halo de inhibición (mm)
(-) No hubo inhibición
N.D. No se determino
38
-
Tabla 7. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 3%(p/v)
Cepa en siembra masiva
Cepa Antagónica
1
3
4
7
1
N.D.
-
-
-
3
-
N.D.
-
-
4
-
-
N.D.
-
7
-
-
-
N.D.
Fuente: Autores
( - )No hubo inhibición
ND No se determina
6.3 Pretratamiento del Residuo Vegetal
Un pretratamiento eficiente reduce el contenido de lignina y de celulosa
cristalina e incrementa el área superficial para las reacciones enzimáticas.
Los pretratamientos pueden ser clasificados en métodos mecánicos,
químicos y físicos (Mtui y Nakamura, 2005).
En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un
pretratamiento mecánico el cual involucró la reducción de tamaño del
material celulósico por cortado, molienda y pulverización con el fin de
modificar la estructura cristalina de la celulosa (figura 19), pues la cantidad
de lignina que contiene este residuo no hizo necesario someter el sustrato a
otro tipo de tratamiento ya que los resultados de los análisis físico-químicos
indicaron un muy bajo porcentaje de esta (Anexo 6).
39
Fig 19. Residuo vegetal de Crisantemo molido
Fuente: Autores
El pretratamiento mecánico utilizado permitió la obtención de un tamaño de
partícula muy pequeño (menor a 850μ) que además de favorecer el acceso
de las enzimas hidrolíticas del consorcio facilitó la preparación de los medios
de producción y el seguimiento de los montajes realizados. Krishna (1999)
reportó la importancia de esta condición pues afecta la relación área/
volumen y la densidad de empaquetamiento que determina la fracción de
sustrato inicialmente accesible al microorganismo. Esta relación se
incrementa cuando el tamaño de partícula disminuye determinando así el
espacio vacío que es ocupado por el aire, y por ende la tasa de transferencia
de oxigeno que afecta directamente el crecimiento de los microorganismos.
6.4 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas
aisladas
Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pruebas de antagonismo se
realizaron pruebas preliminares para evaluar la capacidad celulolítica de
cada una de ellas determinando la liberación de azúcares reductores por la
técnica de DNS (Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v),
3%(p/v) y 5%(p/v), los resultados indicaron una actividad celulolítica nula en
todas las cepas, en las tres concentraciones y durante las veinte horas de
40
fermentación (Anexo 3, Tablas 8-11), lo cual indicó la falta de concordancia
entre la evaluación cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicación de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneció en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubación,
aumentando así la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para
degradar el polisacárido; mientras que en la técnica de actividad cuantitativa
por DNS, el extracto enzimático entró en contacto con la celulosa con un
tiempo de reacción de 60 minutos que probablemente no fue suficiente para
que se diera una reacción enzima-sustrato completa.
Otro posible factor a tener en cuenta es que la cantidad de enzima presente
en el sobrenadante no haya sido suficiente para hidrolizar la celulosa o para
obtener cantidades de azúcares reductores que pudieran ser detectados por
esta técnica, a pesar de que la prueba se realizó en condiciones de pH y
temperatura óptimos para la detección de las enzimas encargadas de la
degradación del sustrato.
6.4.1 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio
Al evaluar la actividad celulolítica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los
resultados obtenidos tanto en la fermentación realizada en caldo CMC al 1%
(p/v) como en caldo SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azúcares
reductores y la actividad enzimática del consorcio en los dos sustratos fue
nula. (Anexo 3, tablas 12-14). Con base en estos resultados se decidió
buscar una segunda opción que incluyó la evaluación de la cepa 8 que había
sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual,
se realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
determinando azúcares reductores y actividad enzimática, alcanzándose
valores mayores a los obtenidos con el consorcio propuesto (Anexo 2, Tablas
15-16).
41
Con el objetivo de potencializar la actividad enzimática de la cepa 8, teniendo
en cuenta que fue un microorganismo “nativo” del sustrato vegetal a evaluar
y, que durante la realización de las pruebas de antagonismo se caracterizó
por inhibir a las demás cepas, probablemente por tener una alta tasa de
crecimiento que lo hacía competitivo por espacio y nutrientes y basados en
que el sinergismo de las enzimas celulolíticas hacen posible la hidrólisis de
celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005; Malherbe y Cloete, 2002) se evaluó el
efecto sinérgico entre la cepa 8 y un actinomiceto con buena actividad
celulolítica cualitativa en CMC al 1%(p/v) (halos de hidrólisis de 2.14cm de
diámetro) aislado de suelo de un cultivo de Stevia durante el desarrollo del
trabajo de investigación: “Estandarización de la técnica de detección de β1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluorógenos en suelos provenientes
de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni” (Gutierrez, et al, 2006).
Para lo anterior se realizaron curvas de cada microorganismo por separado
en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de evaluar la actividad enzimática sobre
dicho sustrato. Los dos microorganismos presentaron una degradación del
sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenció con la cuantificación de
azúcares reductores y la actividad enzimática obtenida (Anexo 2, Tablas 15-
Azúcares reductores (g/L)
18) (Figura 20-23).
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo (h)
Fig 20 Azúcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8) en SVS al 10%(p/v)
42
Actividad enzimática (UC)
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo (h)
UC pH 7 37ºC
UC pH 5 50ºC
Fig 21. Actividad enzimática en el cultivo de Bacillus sp. (Cepa 8) en SVS al
10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC
Azúcares reductores (g/L)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo (h)
Actividad enzimática (UC)
Fig 22. Azúcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v)
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo (h)
UC pH 7 37ºC
UC pH 5 50ºC
Fig 23. Actividad enzimática en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v),
establecida bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC
43
6.5 Identificación Bioquímica
El perfil bioquímico de la cepa 8 (Figura 24) indicó su capacidad para
asimilar la glucosa como fuente de carbono y la subsecuente producción de
ácidos, así mismo redujo sulfatos y nitratos, produjo la enzima catalasa y
mostró crecimiento en concentración de NaCl al 3%(p/v) (Tabla 24).
Teniendo en cuenta el perfil bioquímico obtenido según Bergey’s y que al
realizar la coloración de Gram se observaron bacilos Gram positivos
esporulados, la cepa 8 fue identificada como Bacillus sp.
.
Fig. 24 Características macroscópicas
cepa 8 en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
Tabla 24. Identificación Bioquímica cepa 8
Característica
Resultados (Cepa 8)
Motilidad
Negativo
Reducción de sulfato a sulfito
Negativo
Reducción de nitratos a nitritos
Positivo
Oxidasa
Negativo
Catalasa
Positivo
Producción de ácidos a partir de glucosa
Positivo
Crecimiento en concentración de NaCl 3% (p/v)
Positivo
Producción endosporas
Positivo
Fuente: Autores
44
La identificación del Actinomiceto se llevó a cabo mediante observación de
las características macro y microscópicas. En agar avena (Anexo 1) dicho
microorganismo desarrolló un micelio aéreo abundante inicialmente blanco y
con el transcurso del tiempo de color café, las colonias se observaron
pequeñas, de borde irregular y aspecto pulverulento (Fig 25), al reverso de la
caja se observó la producción de un pigmento difusible de color amarillo
oscuro, generó un olor característico a suelo húmedo. Microscópicamente el
microorganismo se tiñó como Gram positivo, en cuanto al número y
disposición de esporas –otra característica importante para distinguir los
géneros de Actinomicetes- se presentaron esporas ovoides en cadenas
espiraladas y rectas (Fig 26).
Fig 25 Características macroscópicas
Fig 26 Características microscópicas
Streptomyces sp. en agar avena 5 %(p/v)
Streptomyces sp.
Fuente: Autores
Fuente: Autores
Como parte complementaria de la identificación se realizó el perfil bioquímico
del actino. (Tabla 25). El microorganismo hidrolizó galactosa, fructosa,
sucrosa, arabinosa, rafinosa, xilosa, celobiosa, ramnosa, esculina e inositol,
así mismo se evidenció la producción de la enzima catalasa y la reducción de
nitratos a nitritos.
45
Tabla 25. Identificación Bioquímica Actinomiceto
Característica
Resultados (Actino)
Galactosa
Fructosa
Sucrosa
Arabinosa
Rafinosa
Xilosa
Urea
Celobiosa
Ramnosa
Melobiosa
Inositol
Manitol
Fenilalanina
Triptofano
Esculina
Reducción de nitratos a nitritos
Catalasa
Gelatina
Fuente: Autores
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
positivo
Negativo
Con base en las características macro y microscópicas la cepa fue
identificada como presuntiva de Streptomyces sp. Lo que se corroboró con
los resultados obtenidos a partir del perfil bioquímico del microorganismo
(Holt, et al, 2000).
Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como
microorganismos con alta actividad celulolítica. Muchas especies del género
Bacillus están normalmente presentes en el suelo y en la materia orgánica en
degradación, por lo que se considera que juegan un papel importante en la
biodegradación y bioconversión de componentes de alto peso molecular. Se
ha realizado el aislamiento de Bacillus licheniformis a partir de residuos
vegetales de flores en compostaje (Lu et al, 2005) y Bacillus subtilis en
muestras de suelo y agua en la región amazónica (Heck et al, 2002), en
residuos de banano (Krishna,1999), y en fibras de palma (Apun et al, 2000),
46
en los que dicho género bacteriano ha demostrado un alto potencial
celulolítico.
Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la
degradación
y
recirculación
de
biopolímeros
como
la
celulosa,
la
hemicelulosa y la lignina (Semedo et al, 2004). Los estudios realizados con
este microorganismo en cuanto a su capacidad hidrolítica en materiales
lignocelulósicos han reportado buenos resultados, como es el caso de
Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados de
muestras de suelo (Semedo et al, 2004; Grigorevski et al, 2005; Li, 1997).
Ramírez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celulolítcos
entre los cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y además
mostró los más altos niveles de actividad enzimática en el estudio.
6.6 Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico
Teniendo en cuenta la actividad hidrolítica de Streptomyces sp. y Bacillus sp
en el residuo vegetal a evaluar (Anexo 4, Tablas 16 y 18 )(Figura 20-23); y
con el objetivo de potencializar la degradación del sustrato por una posible
acción sinérgica entre las enzimas de cada cepa, se realizaron curvas en las
que los microorganismos actuaron en consorcio.
Durante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al
5% (p/v) se obtuvieron valores máximos de azúcares reductores de 0.624 y
0.849g/L, respectivamente, en la hora 18 de fermentación, (Anexo 5, Tablas
20 y 21) (Figura 27) mientras que, en SV y SVS al 10%(p/v) se alcanzaron
valores de 1.665 y 1.474g/L, (Anexo 5, Tablas 22 y 23) (Figura 28)
respectivamente, en la hora seis de fermentación. Los resultados de la
cromatografía liquida realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis
47
de las fermentaciones en los medios al 10%(p/v) mostraron la presencia de
glucosa y fructosa como azúcares reductores. En el medio SV la glucosa se
encontró en una concentración de 0.475g/L, mientras que, en el medio SVS
además de la glucosa en una concentración de 0.391g/L se detecto fructosa
en una concentración de 1.417 g/L (Anexo 7) estos resultados permitieron
inferir en primer lugar que el sustrato celulósico a concentración de 10%(p/v)
estimuló la actividad hidrolítica del consorcio microbiano, generándose
diferencias significativas (p<0.05) (Anexo 8) con la actividad hidrolítica al
5%(p/v), en segundo lugar que la adición de sales al medio de producción no
generó diferencias significativas (p>0.05) (Anexo 8) en la liberación de
azúcares reductores respecto al medio sin suplemento,
como habría de
esperarse, pues los elementos traza en un medio de cultivo, juegan un papel
importante en la síntesis de ácidos nucleicos, fosfolípidos, pared celular,
enzimas y otros constituyentes celulares, lo cual incrementa la biomasa
celular responsable de la hidrólisis del sustrato vegetal. Esto demuestra que
el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrógeno y
minerales que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el
crecimiento y la actividad metabólica de los microorganismos evaluados; lo
que puede corroborarse con los análisis fisicoquímicos realizados al sustrato
(Anexo 6), la composición de este residuo se presenta como una ventaja
para su utilización, pues, no se hace necesario suplementarlo con la adición
de compuestos químicos que generarían un costo adicional.
Finalmente, como pudo verse en los resultados obtenidos en la
cromatografía líquida se corroboró que la suplementación del medio sustrato
vegetal no generó un incremento en la conversión de celulosa a glucosa, por
el contrario la concentración de este azúcar fue mayor en el medio sin
suplemento.
48
Sin embargo, se esperaba una mayor concentración de azúcares reductores
teniendo en cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contenía un alto
porcentaje de celulosa (65.3%) de acuerdo al análisis fisicoquímico realizado
Azúcares reductores (g/L)
(Anexo 6).
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
6
12
16
18
20
22
Tiempo (h)
SV 5% (p/v)
SVS 5% (p/v)
Azúcares reductores (g/L)
Figura 27. Azúcares reductores en el cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiem po (h)
SV 10%(p/v)
SVS 10%(p/v)
Figura 28. Azúcares reductores en el cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
Por otro lado, al comparar la concentración de azúcares reductores obtenidos
en las pruebas preliminares en las que Bacillus sp y Streptomyces sp.
actuaron por separado en la degradación de SVS al 10% (p/v) (Anexo
49
4,Tablas 16 y 18)
con los obtenidos con el consorcio (Bacillus sp.-
Streptomyces sp.) en el mismo sustrato y a la misma concentración (Anexo 4
y 5,Tablas 19 y 23), demuestran que se estableció un sinergismo en el que
probablemente se logró una complementariedad entre las enzimas
celulolíticas que favorecieron la degradación del sustrato con el consecuente
aumento en la liberación de azúcares reductores.
6.6.1. Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentación
Durante las curvas de degradación del residuo vegetal realizadas, el pH y la
temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35ºC,
respectivamente (Figura 29 y 30). Krishna (1999), reportó que el pH y la
temperatura de la fermentación tienen una gran influencia en la producción
de enzimas celulolíticas, en su investigación la mayor producción se alcanzó
a un pH de 7.0 manteniendo una temperatura constante de 35ºC, sin
embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la
mayor liberación enzimática, lo que permite afirmar que tanto el pH como la
temperatura de operación en esta investigación favorecieron la hidrólisis del
residuo vegetal.
6,3
6,2
6,1
pH
6
5,9
5,8
5,7
5,6
5,5
0
6
12
16
18
20
22
Tiempo (h)
SV 5% (p/v)
SVS 5% (p/v)
Figura 29 Variación de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)
50
6,6
6,4
pH
6,2
6
5,8
5,6
5,4
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiempo (h)
SV 10% (p/v)
SVS 10% (p/v)
Figura 30 Variación de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. Y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
6.7 Actividad Enzimática y liberación de azúcares reductores a partir
del residuo vegetal de Crisantemo.
El nivel más alto de celulasas se produjo en la fermentación con SV al 10%
(p/v) en la hora 6, pH 7 37ºC con un valor de 0.1056 UC (UC definida como
la cantidad de enzima capaz de liberar un micromol de glucosa por minuto)
(Anexo 5 Tablas 22 y 23) (Figura 31) valor que coincidió con la mayor
concentración de azúcares en el mismo sustrato. Sin embargo, no existieron
diferencias significativas (p>0.05) en la concentración de celulasas liberadas
Actividad enzimática (UC)
en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiempo (h)
UC SV 10% (p/v)
UC SVS 10% (p/V)
Figura 31. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37ºC
51
Por otro lado, la actividad enzimática a pH ácido y una temperatura de 50ºC
(Figuras 32 y 33) fue menor, demostrando que dicha actividad varía de
acuerdo a las condiciones de pH y la temperatura en la que es evaluada
(p<0.05). Una explicación a este hecho puede ser
que en condiciones
naturales la actividad hidrolítica de la celulosa se ve afectada cuando el pH
del suelo es ácido, como es el caso de Cellulomonas sp. cuyo
comportamiento metabólico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd
Actividad enzimática (UC)
et al.,2002)
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiempo (h)
UC pH7 37ºC
UC pH 5 50ºC
Actividad enzimática (UC)
Figura 32. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiempo (h)
UC pH7 37ºC
UC pH5 50ºC
Figura 33. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio(Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v), bajo condiciones de pH7 37ºC
y pH5 50ºC
52
La actividad enzimática del consorcio evaluada en SV y SVS en
concentraciones de 5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados
reportados por otros estudios en los que también se ha realizado la
evaluación de microorganismos celulolíticos en residuos celulósicos (Lu et al
2005), (Krishna, 1999), debido a que el material celulósico difiere en sus
características físico-químicas como son: el tamaño y la superficie de las
fibrillas, el espacio entre las microfibrillas y las moléculas de celulosa en las
regiones amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la conformación
estereoscópica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de
polimerización de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que
la celulosa esta asociada, la naturaleza, concentración y distribución de
grupos sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et
al., 2006). Dichos parámetros condicionan drásticamente la habilidad de los
microorganismos celulolíticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual
explica que el comportamiento metabólico sea específico y por ende, la
acumulación del producto de hidrólisis difiera de un ensayo a otro.
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de
hidrolizar la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas ) y
los cambios en las características del sustrato durante la hidrólisis han sido
simulados por modelos matemáticos aplicados a una variedad de materiales
lignocelulósicos teniendo en cuenta dos propiedades importantes: la fracción
de enlaces β-glucosidicos accesibles a las celulasas y el grado de
polimerización, dicho modelo sugiere que es casi imposible la predicción del
funcionamiento hidrolítico de una mezcla de celulasas de un sustrato a otro
debido a variaciones como la concentración de celulasas, la proporción
endo/exocelulasas, el tiempo de reacción y las características del sustrato
(Zhang et al., 2006). De esta manera, la actividad celulolítica de los
53
microorganismos va a ser específica para cada sustrato celulósico a evaluar,
como ha sido reportado en diferentes estudios, Lu et al (2005) obtuvo 7.9 y
28UC en una fermentación de residuos de tallos de flores con Bacillus
pasteuri y Bacillus cereus, dichos microorganismos crecieron en un medio
que contenía sulfato, fosfato y nitrato entre otros componentes, durante 7
días a 35ºC y un pH de 6.8-7.2; Krishna (1999) reportó 3.30UC a partir de
residuos de banano utilizando Bacillus subtilis durante 72 horas de
fermentación, pH7, 35ºC, y en este estudio la mayor actividad fue de 0.1056
UC a partir de residuos vegetales de crisantemo.
(En todos los casos la actividad celulolítica fue definida como la cantidad de
enzima necesaria para producir una micromol de glucosa por minuto).
Durante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la
actividad celulolítica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar
directamente relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron
dichas pruebas, pues, según Zhang et al.,(2006), es necesario tener en
cuenta
la solubilidad o insolubilidad en agua del sustrato que se quiere
evaluar ya que determina los parámetros para realizar el screening y
determinación de la actividad enzimática de microorganismos con capacidad
celulolítica.
En esta investigación el screening se realizó en agar CMC al 1%(p/v)
(sustrato celulósico soluble), posteriormente la inducción de enzimas en
residuos vegetales de crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificación de
dichas enzimas fue llevada a cabo en CMC al 1%(p/v) buffer fosfato y buffer
ácido cítrico (pH7 y 5). La utilización de sustratos con diferente tipo de
solubilidad probablemente influyó en la variación de los resultados, pues la
relación existente entre la tasa de hidrólisis obtenida en sustratos solubles e
insolubles no es clara, principalmente porque existen diferencias en la
accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grado de polimerización (Zhang
54
et al., 2006), lo cual explica la obtención de halos de diámetro incuantificable
y su baja correlación con los niveles de azúcares reductores obtenidos y la
actividad enzimática evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas
como para el consorcio. Este mismo autor concluyó que los datos obtenidos
en la hidrólisis de sustratos solubles no pueden ser comparados con la
hidrólisis de sustratos insolubles. Un claro ejemplo de este concepto es el
reportado por Himmel et al.,(1999) quien en su estudio obtuvo una actividad
específica de endoglucanasas de Thermobifida fusca diez veces más alta
que la actividad de la endoglucanasa de Trichoderma reesei al ser evaluada
en CMC (sustrato soluble). Sin embargo, esta actividad no se mantuvo
cuando dicha enzima fue evaluada en celulosa insoluble.
Otro de los factores que pudo haber influido en la variación de los resultados
es el tiempo de fermentación y el de reacción enzima-sustrato durante las
pruebas de actividad enzimática. Teniendo en cuenta que la lignocelulosa
pretratada utilizada para evaluar la actividad enzimática de preparaciones
comerciales de celulasas, requiere un rango de tiempo que va de minutos a
horas para que inicie la hidrólisis y hasta varios días para obtener una
digestibilidad final (conversión de la celulosa) (Zhang et al, 2006), hace
pensar que probablemente las evaluaciones realizadas requerían un mayor
tiempo de reacción que diera lugar a la obtención de mejores resultados.
Finalmente se puede considerar la importancia de continuar realizando
screening de microorganismos celulolíticos pues la utilización de estos se
convierte en una alternativa viable para el tratamiento de residuos
celulósicos, pues tan solo se ha identificado y evaluado menos del 1% del
potencial de dichos microorganismos presentes en la biosfera (Howard et al,
2003)
55
7. CONCLUSIONES
ƒ
Se logró el aislamiento de ocho cepas bacterianas con actividad
celulolítica en CMC 1%(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en
compostaje
ƒ
Las pruebas de antagonismo en CMC (1%(p/v), 2% (p/v) y 3%(p/v))
permitieron seleccionar los microorganismos capaces de actuar en consorcio
en la degradación del residuo vegetal
ƒ
Las enzimas de Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron sinérgicamente
en la degradación del residuo vegetal
ƒ
La mayor concentración de azúcares reductores y actividad enzimática se
obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV
10% (p/v)
ƒ
El residuo vegetal de crisantemo aportó los nutrientes necesarios para
estimular la actividad enzimática de los microorganismos evaluados por lo
cual no se hace necesario suplementar el residuo con sales
56
8. RECOMENDACIONES
ƒ
Realizar screening de microorganismos celulolíticos termófilos que
puedan ser aprovechados en el tratamiento de residuos agroindustriales
ƒ
Realizar el aislamiento y evaluación de microorganismos con actividad
celulolítica, empleando sustratos de la misma
naturaleza de donde fueron
aislados
ƒ
Evaluar la actividad hidrolítica de los microorganismos celulolíticos en
rangos de tiempo más amplios a los empleados en este estudio
ƒ
Tener en cuenta el tamaño de partícula del sustrato vegetal,
pues,
puede generar inconvenientes en la manipulación y seguimiento de las
fermentaciones
ƒ
Establecer el tipo de interacción que ocurre entre Bacillus sp. y
Streptomyces sp., durante el desarrollo de la biomasa
ƒ
Evaluar actividad celulolítica cualitativa y cuantitativa en tiempos iguales
ƒ
Determinar el tipo de enzimas que libera cada microorganismo, evaluando
la actividad de cada una de estas en sustratos específicos
ƒ
Evaluar el sustrato fermentable obtenido, en la producción de etanol
ƒ
Lleva a cabo la determinación de azúcares reductores y evaluación de la
actividad enzimática utilizando
residuo vegetal de crisantemo en
concentraciones entre 5%(p/v) y 10%(p/v)
57
9. LITERATURA CITADA
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63
ANEXO 1
Medios de cultivo y reactivos
MEDIO DE CULTIVO
Agar CMC 1%(p/v)
REACTIVOS
Rojo congo 1%(p/v)
COMPOSICIÓN
Carboximetilcelulosa
Extracto de levadura
Peptona universal
Sulfato de amonio
Cloruro de calcio
Fosfato monobásico de potasio
Fosfato dibásico de potasio
Agar-agar
Ajustar pH 7.0+/-2
Residuo vegetal de Crisantemo
Extracto de levadura
Peptona universal
Ajustar pH 7.0+/-2
Residuo vegetal de Crisantemo
Extracto de levadura
Peptona universal
Sulfato de amonio
Cloruro de calcio
Fosfato monobásico de potasio
Fosfato dibásico de potasio
Agar-agar
Ajustar pH 7.0+/-2
Avena molida
NaCl
Agar-agar
COMPOSICIÓN
Rojo congo
NaCl 0.1 M
Nacl
Caldo Sustrato vegetal
(SV) 5%(p/v) ó 10%(p/v)
Caldo Sustrato vegetal
suplementado (SVS)
5%(p/v) ó 10%(p/v)
Agar avena
64
(g/L)
10
2.5
2.5
0.5
0.5
0.1
0.1
15
50-100
2.5
2.5
50-100
2.5
2.5
0.5
0.5
0.1
0.1
15
50
10
15
(g/L)
10
200
Preparación buffer fosfato pH 7
1. Preparación buffer fosfato 0.1 M pH 7
9
9
9
9
9
Pesar 3.5 g de Na2HPO4 y disolver en 100 ml de agua destilada
Pesar 3.45 g de NaH2PO4 y disolver en 100 ml de agua destilada
Mezclar lentamente las dos soluciones
Ajustar pH 7+/- 0.2
Enrasar en balón aforado hasta completar 500 ml
2. Preparación de Carboximetilcelulosa al 1.0%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
9 Pesar 1.0g de carboximetilcelulosa y disolver lentamente en 50ml
de buffer fosfato 0.1M pH7
9 Calentar la solución en horno microondas por un minuto
9 Ajustar pH a 7 +/-2
9 Enrasar a 100ml con el buffer fosfato 0.1M pH7 en balón
volumétrico
Preparación buffer ácido cítrico pH 5
1. Preparación buffer ácido cítrico 0.1M pH5
9
9
9
9
9
Pesar 5.37g de Na2PH4.7H2O
Pesar 2.10g de ácido cítrico
Pesar 1g de carboximetilcelulosa
Disolver todos los componentes en 100 ml de agua destilada
Ajustar a pH5
65
ANEXO 2
Determinación de azúcares reductores
por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
Preparación del reactivo de DNS
Depositar en un beaker de 250ml, 50ml de agua destilada, adicionar 1.6g de
Hidróxido de sodio y disolver mediante agitación continua en plancha
magnética a temperatura ambiente. Posteriormente adicionar lentamente
43.8g de Tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por completo.
Recubrir el beaker con papel kraft y agregar lentamente 1g de ácido 3,5dinitrosalicílico. Complete con agua destilada hasta 100ml en balón aforado.
Deje en agitación toda noche en un frasco oscuro
Preparación de la solución stock de glucosa 2g/L
Pese 2g de glucosa anhídrida y disuelva en 500ml de agua destilada
utilizando un balón volumétrico de 1000ml, homogenice y complete hasta
100ml con agua destilada
Preparación de las soluciones de concentración conocida 0.5- 2g/L
Empleando la formula V1*C1 = V2*C2. Se preparan seis soluciones que
tengan un volumen final de 2ml
Concentración g/L
Solución concentrada de
glucosa en ml
Agua destilada
ml
0.5
0.7
1
1.5
1.7
2
0.5
0.7
1
1.5
1.7
2
1.5
1.3
1
0.5
0.3
0
66
Curva patrón de glucosa Nº 1
Absorbancia
540nm
0.5
0.271
0.7
0.353
1
0.484
1.5
0.774
1.7
0.827
2
0.995
Curva patrón de Glucosa (g/L) Nº1
Abso rban cia 540n m
Concentración
g/L
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
y = 0,4883x + 0,0153
R2 = 0,996
0,5
0,7
1
1,5
1,7
2
Concentración glucosa (g/L)
Curva patrón de glucosa Nº 2
Absorbancia
540nm
0.5
0.247
0.7
0.36
1
0.529
1.5
0.746
Curva patrón de Glucosa (g/L) Nº2
Absorbancia 540 nm
Concentración
g/L
0,8
0,6
0,4
y = 0,4981x + 0,098
R2 = 0,995
0,2
0
0,5
0,7
1
Concentración glucosa (g/L)
67
1,5
ANEXO 3
Pruebas preliminares: Determinación Azúcares reductores y Actividad
enzimática cepas 1, 3,4 y 7
Tabla 8. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 1 en diferentes concentraciones
de caldo CMC
Tiempo
Azúcares reductores
(h)
(g/L),CMC 1%(p/v)
0
0.075
1
0.108
2
0.030
4
0.0076
6
0.063
8
0.32
10
0.049
12
0.028
14
0.083
16
0.062
18
0.065
Fuente: Autores
Azúcares reductores
(g/L), CMC 3%(p/v)
0.079
0.062
0.081
0.075
0.069
0.061
0.093
0.055
0.106
0.079
Azúcares reductores
(g/L), CMC 5%(p/v)
0.094
0.090
0.040
0.049
0.079
0.088
0.104
0.067
0.11
0.10
-
Tabla 9. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 3 en diferentes concentraciones
de caldo CMC
Tiempo
Azúcares reductores
(h)
(g/L), CMC 1%(p/v)
0
0.06
1
0.99
2
0.028
4
0.01
6
0.054
8
0.26
10
0.05
12
0.020
14
0.072
16
0.05
18
0.06
Fuente: Autores
Azúcares reductores
(g/L), CMC 3%(p/v)
0.055
0.048
0.076
0.072
0.065
0.060
0.089
0.052
0.1
0.05
0.070
68
Azúcares reductores
(g/L), CMC 5%(p/v)
0.084
0.085
0.037
0.048
0.076
0.081
0.1
0.058
0.13
0.09
0.069
Tabla 10 Azúcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 4 en diferentes concentraciones
de caldo CMC
Tiempo
Azúcares reductores
(h)
(g/L), CMC 1%(p/v)
0
0.071
1
0.046
2
0.049
4
0.05
6
0.06
8
0.07
10
0.058
12
0.07
14
0.072
16
0.065
18
0.063
Fuente: Autores
Azúcares reductores
(g/L), CMC 3%(p/v)
0.074
0.051
0.06
0.05
0.07
0.06
0.075
0.077
0.069
0.06
0.07
Azúcares reductores
(g/L), CMC 5%(p/v)
0.07
0.065
0.081
0.068
0.054
0.06
0.043
0.062
0.053
0.068
0.068
Tabla11. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 7 en diferentes concentraciones
de caldo CMC
Tiempo
Azúcares reductores
(h)
(g/L), CMC 1%(p/v)
0
0.075
1
0.108
2
0.030
4
0.0076
6
0.063
8
0.32
10
0.049
12
0.028
14
0.083
16
0.062
18
0.065
Fuente: Autores
Azúcares reductores
(g/L), CMC 3%(p/v)
0.079
0.062
0.081
0.075
0.069
0.061
0.093
0.055
0.106
0.079
69
Azúcares reductores
(g/L) CMC 5%(p/v)
0.094
0.090
0.040
0.049
0.079
0.088
0.104
0.067
0.11
0.10
-
Tabla 12. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo
CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
Tiempo(h)
0
2
4
6
8
11
15
19
23
Azúcares reductores (g/L)
CMC 1%(p/v)
0.0076
0.011
0.03
0.32
0.07
0.02
0
0
-
Azúcares reductores (g/L)
SVS 10%( p/v)
0.083
0.08
0.08
0.073
0.120
0.051
0.036
0.028
0.034
Fuente: Autores
Tabla 13 Actividad enzimática del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo CMC al 1%(p/v),a
pH7 37ºC y tiempos de reacción enzima –sustrato de 30’, 60’ y 120’
Tiempo (h)
Actividad enzimática
(UC) 30’
0.005
0.016
0.002
0.011
0.029
-
Actividad enzimática
(UC) 60’
0.012
0.022
0.016
0.026
0.015
0.004
0.023
Actividad enzimática
(UC) 120’
0.016
0.043
0.022
0.018
0.014
0.004
0.008
2
4
6
8
11
15
19
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH 7 37ºC
Tabla 14 Actividad enzimática del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo SVS al 10%(p/v), a
pH7 37ºC y tiempos de reacción enzima –sustrato de 30’,60’ y 120’
Tiempo (h)
Actividad enzimática
(UC) 30’
0.031
0.032
0.003
0.002
0.003
-
Actividad enzimática
(UC) 60’
0.024
0.028
0.025
0.025
0.034
0.017
0.025
Actividad enzimática
(UC) 120’
0.023
0.023
0.032
0.036
0.013
0.017
0.023
2
4
6
8
11
15
19
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC
70
ANEXO 4
Pruebas preliminares: Determinación Azúcares reductores y Actividad
enzimática de Bacillus sp. (Cepa 8) y Streptomyces sp. por separado y en
consorcio
Tabla 15. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC con tiempo de
reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. en caldo CMC al
1%(p/v)
Tiempo (h)
Azúcares reductores
(g/L)
0.26
0.23
0.19
0.23
0.20
0.15
0.16
Actividad enzimática
(UC) pH7 37ºC
0.025
0.028
0.043
0.033
0.024
0.023
0.025
12
14
16
18
20
22
24
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa
por minuto a pH 7 37ºC y pH5 50ºC
Tabla 16. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con
tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. en caldo SVS
al 10% (p/v)
Tiempo (h)
Azúcares reductores
(g/L)
1.07
0.88
0.91
0.87
0.81
0.53
0.95
Actividad enzimática
(UC) pH7 37ºC
0.03
0.03
0.03
0.06
0.04
0.04
-
Actividad enzimática
(UC) pH5 50ºC
0.04
0.035
0.04
0.05
0.05
0.02
-
12
14
16
18
20
22
24
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto
a pH7 37ºC y pH5 50ºC
71
Tabla 17. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, con tiempo de
reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Streptomyces sp. en caldo CMC al
1% (p/v)
Tiempo (h)
12
14
16
18
20
22
24
Azúcares reductores
(g/L)
0.29
0.28
0.26
0.27
0.25
0.24
0.15
Actividad enzimática
(UC) pH7 37ºC
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.02
0.02
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa
por minuto a pH7 37ºC
Tabla 18. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con
tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Streptomyces sp. en
caldo SVS al 10%(p/v)
Tiempo (h)
12
14
16
18
20
22
24
Azúcares reductores
(g/L)
1.173
1.054
0.98
1.30
1.0
0.644
0.876
Actividad enzimática
(UC) pH7 37ºC
0.04
0.04
0.03
0.06
0.04
0.03
-
Actividad enzimática
(UC) pH5 50ºC
0.04
0.03
0.03
0.05
0.04
0.02
-
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto
a pH7 37ºC y pH5 50ºC
72
Tabla 19. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con
tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo del consorcio (Bacillus sp.y
Streptomyces sp.) en caldo SVS al 10%(p/v)
Tiempo (h)
12
14
16
18
20
22
24
Azúcares reductores
(g/L)
1.109
1.085
0.96
1.092
1.197
0.501
1.095
Actividad enzimática
(UC) pH7 37ºC
0.03
0.04
0.04
0.06
0.04
0.04
-
Actividad enzimática
(UC) pH5 50ºC
0.03
0.02
0.04
0.04
0.04
0.02
-
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC y pH5 50ºC
73
ANEXO 5
Determinación de azúcares reductores y Actividad enzimática del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo en SV y SVS al
5%(p/v) y 10% (p/v)
Tabla 20. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio
celulolítico con SV al 5%(p/v)
Actividad celulolítica (UC) pH7
Tiempo (h)
pH
Azúcares reductores (g/L)
37ºC
0
6,18
0,437
6
6,15
0,591
0,0175
12
6,22
0,445
0,0149
16
5,95
0,535
0,0227
18
5,97
0,624
0,0258
20
6,1
0,296
0,0471
22
6,07
0,317
0,0178
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC
Tabla 21. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio
celulolítico con SVS al 5%(p/v)
Actividad celulolítica (UC) pH7
Tiempo (h)
pH
Azúcares reductores (g/L)
37ºC
0
5,78
0,378
6
5,82
0,435
0,01185
12
5,86
0,352
0,03027
16
5,88
0,589
0,0178
18
5,84
0,849
0,0357
20
5,81
0,423
0,035
22
5,8
0,419
0,0255
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC
74
Tabla 22. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio
celulolítico con SV al 10%(p/v)
Azúcares reductores* Actividad celulolítica* Actividad celulolítica*
Tiempo (h)
pH
(g/L)
(UC) pH7 37ºC
(UC) pH5 50ºC
0
6,27
1,38
6
5,88
1,665
0,1056
0,0394
12
5,87
1,145
0,05074
0,026
16
5,89
0,858
0,042
0,0279
18
5,99
0,856
0,0387
0,02954
20
6,24
0,9
0,0372
0,0291
22
6,31
1,27
0,0625
0,0321
25
6,23
0,647
_
_
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto
a pH7 37ºC y pH5 50ºC
*Valores hallados a partir de la curva patrón de Glucosa Nº 2
Tabla 23. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio
celulolítico con SVS al 10%(p/v)
Azúcares
reductores*
(g/L)
1,289
1,474
1,074
0,884
0,82
0,777
1,225
0,767
Actividad celulolítica* Actividad celulolítica* (UC)
Tiempo(h)
pH
(UC) pH7 37ºC
pH5 50ºC
0
6,26
6
5,79
0,08555
0,0328
12
5,98
0,0502
0,02231
16
6,01
0,04426
0,01916
18
6,08
0,0465
0,01842
20
6,3
0,04574
0,0177
22
6,29
0,0575
0,03092
25
6,41
_
_
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a
pH7 37ºC y pH5 50ºC
*Valores hallados a partir de la curva patrón de glucosa Nº 2
75
ANEXO 6
Análisis fisicoquímico del residuo vegetal de crisantemo
PARÁMETRO
RESULTADO
UNIDADES
MÈTODO
ANALÍTICO
Humedad
7.92
%
GRAVIMÉTRICO
(MET. INTERNO
GRAVIMÉTRICO
Fracción Mineral
2,84
%
(MET. INTERNO)
Pérdidas por
GRAVIMÉTRICO
89,2
%
Volatilización
(MET. INTERNO)
CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2 %)
MICRO-KJELDHAL
Proteína
5,01
%
(MET. INTERNO)
Celulosa
65,3
%
SUMATORIA
Hemicelulosa
2,03
%
SUMATORIA
Carbohidratos no
COLORIMÉTRICO
16,6
%
estructurales
(MET. INTERNO)
GRAVIMÉTRICO
Lignina
0,51
%
(MET. INTERNO)
Fuente: Laboratorio de Análisis químicos e insumos agrícolas, AGRILAB
ELEMENTO
RESULTADO
UNIDADES
MÉTODO
ANALÍTICO
FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2%)
Grasa
0,31
%
Fibra Cruda
46,4
%
Extracto no
Nitrogenado
37,5
%
68,3
%
66,3
%
Fibra detergente
neutra
Fibra detergente
ácida
GRAVIMÉTRICO
(MET. INTERNO)
GRAVIMÉTRICO
(MET. INTERNO)
SUMATORIA
GRAVIMÉTRICO
(MET. INTERNO)
GRAVIMÉTRICO
(MET. INTERNO)
NUTRIENTES
Fósforo (P2O5)
0,27
%
Calcio (CaO)
0,69
%
Sílice (SiO2)
0,55
%
Fuente: Laboratorio de Análisis químicos e insumos agrícolas, AGRILAB
76
COLORIMÉTRICO
(NTC 234)
ABS. ATÓMICA
(MET. INTERNO)
ABS. ATÓMICA
(MET. INTERNO)
ANEXO 7
Perfil cromatográfico
Sobrenadante de la hora seis de fermentación en SV al 10%(p/v)
Fuente: Laboratorio de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Colombia
77
Perfil cromatográfico
Sobrenadante de la hora seis de fermentación en SVS al 10%(p/v)
Fuente: Laboratorio de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Colombia
78
ANEXO 8
Análisis estadístico (SPSS, versión 14.)
Distribución de datos
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a)
Statistic
df
Sig.
Shapiro-Wilk
Statistic
df
Sig.
AzR
,135
28 ,200(*)
,919
et
* This is a lower bound of the true significance.
a Lilliefors Significance Correction
Resultados arrojados (F28=0,919, p=0,033)
28
,033
Datos normalizados
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a)
Shapiro-Wilk
Statistic
df
Sig.
Statistic
df
Sig.
Log
,136
28
,196
,956
28
,278
a Lilliefors Significance Correction
79
Comparación de la liberación de azúcares reductores entre sustrato vegetal
concentraciones 5%(p/v) y 10%(p/v)
Oneway Analysis of Log A.R By Concentracion
0,3
0,2
0,1
Log A.R
0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
10%
5%
Concentracion
Oneway Anova
Summary of Fit
Rsquare
Adj Rsquare
Root Mean Square Error
Mean of Response
Observations (or Sum
Wgts)
0,7622
0,742383
0,120137
-0,14997
14
t-Test
Difference
Estimate
0,398255
Std Error
0,064216
Lower 95%
0,258341
Upper 95%
0,538170
Assuming equal variances
t-Test
6,202
DF Prob > |t|
12
<.0001
80
Comparación de la liberación de azúcares reductores entre los medios SV y
SVS a concentración de 5%(p/v) y 10%(p/v)
Oneway Analysis of Log A.R By Medio
0,3
0,2
0,1
Log A.R
0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
SV
SVS
Medio
Oneway Anova
Summary of Fit
Rsquare
Adj Rsquare
Root Mean Square Error
Mean of Response
Observations (or Sum
Wgts)
0,000039
-0,03842
0,230817
-0,14859
28
t-Test
Difference
Estimate
-0,00277
Std Error
0,08724
Lower 95%
-0,18209
Upper 95%
0,17656
Assuming equal variantes
t-Test
-0,032
DF Prob > |t|
26
0,9750
81
Diana Gaitán, Liliana Pérez
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS A PARTIR DE
RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE
CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora)
Diana Gaitán, Liliana Pérez, Adriana Matiz, Balkys Quevedo
[email protected], liliana.perez @javeriana.edu.co,
amatiz @javeriana.edu.co. [email protected].
Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 Nº 43-88
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a
partir de residuos vegetales frescos y en compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesofílicas
con actividad celulolítica fueron aisladas y purificadas a partir de residuos vegetales de crisantemo en
compostaje. La actividad celulolítica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante el revelado
de halos de hidrólisis con rojo congo en medio Carboximetilcelulosa (CMC) al 1% (p/v),
posteriormente, con el objetivo de establecer un consorcio bacteriano celulolítico se realizaron
pruebas de antagonismo para determinar si existía algún tipo de inhibición entre éstas. La actividad
celulolítica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS) a partir de la cual sólo una cepa fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de
potencializar la actividad de dicha cepa se usó un actinomiceto aislado y evaluado en otro estudio.
Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y Streptomyces sp.. La capacidad
degradadora del consorcio sobre el residuo vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con
sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales (SVS) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona (SV),
determinando la concentración de azúcares reductores liberados mediante la técnica de DNS y la
actividad enzimática en CMC en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC en buffer ácido cítrico pH5 50ºC.
Los resultados obtenidos mostraron que la degradación del sustrato vegetal de crisantemo fue mejor
cuando las microorganismos actuaron en consorcio demostrando una acción sinérgica entre sus
enzimas, por otro lado, en el medio SV en una concentración del 10%(p/v) se dió la mayor liberación
de azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimática de 0.1056 UC.
Palabras clave: actividad celulolítica, azúcares reductores, celulosa, residuo vegetal
ABSTRACT
The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose degradation by
microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic activity were isolation and purified from
vegetable wastes of a composting system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism
was evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and carboximethylcellulose
(CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the objective to create a cellulolytic bacterial
association developed antagonism test for determine if any type of inhibition existed between them.
The cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid (DNS) method,
only one microorganism was selected for the bacterial association. With the aim of boost the bacteria
activity, employed a cellulolytic actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation.
This microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The degradation capacity of
bacterial association using vegetable wastes of crisantemo was evaluated employing two broths: one of
this with vegetable waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations, yeast extract and peptone
(SV) the concentration of reducing sugars was evaluated with DNS method and the cellulose activity
using CMC phosphate buffer pH7 37ºC and CMC citric acid pH5 50ºC. The obtained results indicated
that the best degradation of vegetable wastes was using the bacterial association, showing a synergetic
cellulose degradation, furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of reducing
sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.
Key words: cellulose, cellulolytic activity, reducing sugars, vegetable waste.
1
Diana Gaitán, Liliana Pérez
INTRODUCCION
La floricultura es una de las actividades más desarrolladas en Colombia. El
crisantemo ocupa el cuarto lugar en flores de exportación. Este sector libera altos
volúmenes de residuos vegetales que dificultan su manejo y debido a su lenta
degradación se convierten en un problema de alto impacto ambiental; pérdida de
espacio físico, generación de plagas, impacto paisajístico etc. (Asocolflores, 2001).
Dentro del programa de gestión ambiental los residuos vegetales generados son
tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnológica es la
utilización de microorganismos celulolíticos capaces de degradar estos residuos, con
la consecuente producción de azúcares fermentables que a su vez puedan ser usados
como sustrato glicosídico natural y permitan la reducción en el volumen de los
residuos vegetales generados.
Los microorganismos encargados de la degradación de la celulosa, principal
componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias y hongos, aerobios,
anaerobios, mesofílicos y termofílicos, los cuales cuentan con la maquinaria
enzimática necesaria para dicho propósito (Lynd, et al., 2002), por tal razón, su
aislamiento e identificación representa un importante recurso para lograr la
disminución del impacto ambiental y la generación de un sustrato fermentable cuya
utilidad podría estar en la producción de etanol, obtención de ácidos orgánicos,
edulcorantes, productos farmacéuticos y alimentos, entre otros.
METODOLOGIA
Localización y condiciones de muestreo
El muestreo del residuo vegetal se realizó a partir de residuos frescos y en compostaje
de un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) localizado en el municipio
de Tocancipá cuya temperatura promedio es 13ºC, una humedad relativa del 80% y
esta ubicado a 2606m.s.n.m. Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de
residuo fresco de 1 semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una
temperatura de 18ºC; en el caso de los residuos en degradación se muestrearon
diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradación, registrando
una temperatura de 50ºC y un pH de 8.6.
Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos
Se pesaron 10 g de las muestras de residuos vegetales frescos y en compostaje, cada
uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua peptonada 0.1%(p/v).
Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-5 en agua peptonada al
0.1%(p/v). A partir de las diluciones preparadas se realizó siembra en superficie en
agar Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v). Las cajas fueron incubadas a 35oC por
48 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se adicionó rojo congo al 1%(p/v),
luego de quince minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 0.1M, dejando reposar
2
Diana Gaitán, Liliana Pérez
por quince minutos más, para luego hacer el recuento de las colonias que presentaron
halos de hidrólisis (Teather y Wood, 1982).
Posteriormente se realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que
presentaron actividad celulolítica, llevando a incubación y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario. Realizando medición de los halos de hidrólisis
generados.
Pruebas de antagonismo
Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se siguió el método de Gauze, para lo
cual, se preparó una suspensión de cada uno de los microorganismos seleccionados a
igual concentración celular, que presentaron mayor actividad enzimática, en 10ml de
solución salina 0.85%(p/v), llevando a incubación a 100 rpm, 35ºC durante 14h.
(Moreno et al., 2000). Por triplicado se dispusieron sobre agar CMC al 1%(p/v),
2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del microorganismo a enfrentar), anillos
plásticos estériles de un centímetro de diámetro. Dentro de los anillos se inoculó una
suspensión de 50μl del microorganismo antagonista y agua destilada estéril como
control negativo. Teniendo como criterio de selección halos mayores a 5mm (Gauze,
1967).
Conservación de cepas
Las cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a tinción de
Gram y luego se procedió a obtener cultivos axénicos en agar CMC 1%(p/v). Se
llevaron a cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1% (p/v).
Estas suspensiones se mezclaron con glicerol a una concentración final de 25%(v/v),
posteriormente fueron almacenados a –20ºC como banco de cepas de la Pontificia
Universidad Javeriana (Poutou, et al., 1994).
Caracterización y procesamiento del residuo vegetal
Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron
sometidos a una caracterización físico-química. Para el procesamiento de dicho
residuo se llevó a cabo el siguiente protocolo: lavado con agua, reducción de tamaño
mediante picado, lavado con Sodio Dodecil Sulfato SDS al 1%(p/v), ebullición por
un período de media hora con SDS al 1% (p/v), lavado con agua, secado a 55ºC y
finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et al., 2003).
Proceso de fermentación en cultivo discontinuo
Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos celulolíticos
seleccionados
Para la realización de este proceso se emplearon dos medios: uno con sustrato vegetal
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) suplementado con sulfato de amonio
3
Diana Gaitán, Liliana Pérez
(0.5g/L), cloruro de calcio (0.5g/L), fosfato monobásico de potasio (0.1g/L), fosfato
dibásico de potasio (0.1g/L), llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y
otro, compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de
levadura y peptona llamado medio sustrato vegetal (SV).
Pruebas preliminares cepas seleccionadas
Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimático y la subsecuente
liberación de azúcares reductores utilizando las cepas aisladas y seleccionadas en las
pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y
5%(p/v) y caldo SVS al 10%(p/v).
Inicialmente, estas cepas fueron reactivadas del banco. A partir de cada cepa se
preparó un inoculo en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x 108
cel/ml e incubando a 35ºC y 120 rpm. Transcurrido el tiempo de incubación, 25ml de
inóculo fueron adicionados a cada uno de los caldos de fermentación, con un VET de
250ml y condiciones de operación de 35ºC y 120rpm. En cada una de las horas de
muestreo se determinaron azúcares reductores mediante la técnica de DNS y
actividad enzimática utilizando CMC en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC en buffer
ácido cítrico pH5 50ºc, evaluando tiempos de reacción enzima-sustrato de 30’, 60’ y
120’.
Pruebas Consorcio
Para evaluar la actividad hidrolítica de las cepas en consorcio se realizaron
fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en concentraciones del
5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno; incubando a 35ºC y 120 rpm. Adicionando un inóculo
de volúmenes iguales de cada cepa a evaluar. La biomasa inicial fue determinada
mediante recuento en placa, en el caso de bacterias y recuento de conidios en cámara
de Neubawer, para microorganismos filamentosos. A partir de los muestreos
realizados la determinación de azúcares reductores mediante DNS y actividad
enzimática en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH 7 37ºC y CMC al 1%(p/v) en
buffer ácido cítrico pH 5 50ºC, relación 1:1 con tiempo de reacción enzima-sustrato
de 60 minutos.
Determinación de azúcares reductores
Las muestras tomadas en cada hora de fermentación fueron inmediatamente
centrifugadas durante 20 minutos a 100 rpm, a partir del sobrenadante se tomó un
volumen de 0.25 ml, al cual se adicionó 0.25 ml de DNS, esta mezcla se sometió a
ebullición por 5 minutos, transcurrido este tiempo, la mezcla se llevó a un recipiente
con hielo durante 5 minutos y posteriormente se adicionaron 2.5 ml de agua destilada.
Esta solución fue leída en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm y
sensibilidad media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplazó en la
ecuación de la línea recta arrojada por la curva patrón previamente realizada, para la
obtención de la concentración de azúcares reductores en cada hora de muestreo
(Miller, 1959).
4
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Determinación de actividad celulolítica
Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v), una en buffer
fosfato 0.1M pH7.0 y otra en buffer ácido cítrico pH 5.0.
Preparación de la Solución de CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M pH7.0
Se tomó 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo de cada
una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1 ml de la solución de CMC
1%(p/v) en buffer fosfato pH7. Dicha preparación se realizó para evaluar la reacción
enzima-sustrato durante el tiempo de reacción establecido para cada curva, incubando
a 37ºC en baño termostatado. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras
fueron llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para frenar la reacción
enzimática, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100 rpm. A partir de
los sobrenadantes se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentración de azúcares
reductores liberados, empleando la técnica de DNS (Dávila, et al., 2002).
Solución de CMC al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico 0.1M pH5.0
La determinación de la actividad enzimática con buffer ácido cítrico pH 5.0 se llevó a
cabo haciendo reaccionar 1 ml de extracto crudo correspondiente a cada hora de
muestreo con 1ml de la solución de CMC en buffer ácido cítrico pH 5.0. Esta
preparación se realizó para evaluar la reacción enzima-sustrato durante 60 minutos a
50ºC. Transcurrido cada tiempo de incubación se detuvo la reacción en hielo por 10
minutos para posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100 rpm. A partir del
sobrenadante se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentración de azúcares
reductores liberados, empleando la técnica de DNS (Adrado, et al., 2005).
Identificación Bioquímica
La identificación bioquímica se realizó a los microorganismos que finalmente fueron
seleccionados para conformar el consorcio microbiano celulolítico, por presentar la
mejor actividad hidrolítica sobre el sustrato evaluado. Las cepas fueron identificadas
macroscópicas, microscópicas y
mediante evaluación de características
comportamiento metabólico de acuerdo con el Manual de Bergey´s de Bacteriología
Sistemática.
Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo
El extracto crudo correspondiente a la hora de fermentación en la que se presentó la
mayor liberación de azúcares reductores fue evaluado mediante cromatografía líquida
(HPLC) con el fin de determinar el tipo y concentración de los azúcares reductores
presentes.
Análisis Estadístico
5
Diana Gaitán, Liliana Pérez
El análisis estadístico de los datos obtenidos durante la prueba experimental se realizó
determinando inicialmente la distribución normal de los datos mediante la prueba de
Chapiro Wilk y como prueba paramétrica T student, utilizando el programa
estadístico SPSS, versión 14.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de microorganismos celulolíticos
Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento de
microorganismos con actividad celulolítica, mientras que a partir de los residuos
vegetales en compostaje se logró el aislamiento de 8 cepas bacterianas mesofílicas
con dicha actividad, esta diferencia probablemente se debió a que en el proceso de
compostaje la actividad metabólica microbiana se incrementa, además, el tiempo de
degradación transcurrido, la alta temperatura y el pH alcalino permitieron el
aislamiento de microorganismos celulolíticos, pues dichas condiciones facilitan que
bacterias esporógenas y actinomicetes incrementen su actividad y por ende su
población (Granados y Valderrama, 2003).
La actividad celulolítica se evidenció mediante evaluación cualitativa con el revelado
de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1%(p/v) como ha sido reportado
por diferentes autores (Hendricks et al, 1995; Lu et al, 2005; Zhang et al, 2006). El
diámetro de los halos de hidrólisis generados no fue establecido para la mayoría de
las cepas, pues, se obtuvieron zonas de aclaramiento que se difundieron en todo el
medio; una alta actividad hidrolítica en CMC 1%(p/v); sin embargo, en el caso de la
cepas 2, 6 y 8 el diámetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35 mm, respectivamente
(figura 1), que comparados con el estudio realizado por Lu, et al. (2005), en el que
los diámetros de hidrólisis de las cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar
CMC, alcanzaron valores de 6.4cm, demuestran una baja actividad celulolítica de las
cepas 2, 6 y 8 en este medio.
Cepa 1
Cepa 2
Cepa 6
Cepa 8
Fig 1. Zonas de aclaramiento en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
6
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Pruebas de Antagonismo
Con el fin de potencializar la actividad celulolítica de algunos de los
microorganismos aislados, se planteó la posibilidad de establecer un consorcio
microbiano para lo cual fue necesario realizar pruebas de antagonismo que
descartaran aquellas cepas que generaran algún tipo de inhibición sobre las demás.
Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo la mayor
actividad antagónica frente a las demás cepas evaluadas generando el máximo halo de
inhibición (7.5 mm) frente a la cepa 1 (Figura 2), por lo que en un principio fue
descartada como parte del consorcio microbiano.
Fig 2. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1
Fuente: Autores
Las pruebas de antagonismo también se realizaron en concentraciones de CMC al 2 y
3 % (p/v) con el fin de determinar si el comportamiento antagónico y crecimiento de
cada cepa se mantenía a pesar del incremento en la concentración de la fuente de
carbono y de alguna manera evaluar la inhibición por sustrato de las cepas
seleccionadas.
En la concentración de 2%(p/v) en agar CMC las cepas 2, 5 y 6 quedaron descartadas
para ser parte del consorcio.
La actividad antagónica evidenciada durante el desarrollo de las pruebas en CMC al
1%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de microorganismos aislados de
una misma fuente puede generarse inhibición entre ellos, una posible explicación a
este hecho es que existan diferencias en la complejidad del sistema enzimático que
les permite degradar el sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando
lugar a una competencia por sustrato y espacio
Los resultados obtenidos en agar CMC al 3%(p/v), permitieron seleccionar a las
cepas 1, 3, 4 y 7 como parte del consorcio microbiano celulolítico.
Pretratamiento del Residuo Vegetal
En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un
pretratamiento mecánico el cual involucró la reducción de tamaño del material
celulósico por cortado, molienda y pulverización con el fin de modificar la estructura
cristalina de la celulosa. El pretratamiento mecánico utilizado permitió la obtención
de un tamaño de partícula muy pequeño (menor a 850μ) que además de favorecer el
acceso de las enzimas hidrolíticas del consorcio facilitó la preparación de los medios
7
Diana Gaitán, Liliana Pérez
de producción y el seguimiento de las fermentaciones realizadas. Krishna (1999)
reportó la importancia de esta condición pues afecta la relación área/ volumen y la
densidad de empaquetamiento que determina la fracción de sustrato inicialmente
accesible al microorganismo. Esta relación se incrementa cuando el tamaño de
partícula disminuye determinando así el espacio vacío que es ocupado por el aire,
aumentando la tasa de transferencia de oxigeno que afecta directamente el
crecimiento de los microorganismos.
Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas aisladas
Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pruebas de antagonismo se realizaron
pruebas preliminares para evaluar la capacidad celulolítica de cada una de ellas
determinando la liberación de azúcares reductores por la técnica de DNS
(Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v), 3%(p/v), y 5%(p/v), los
resultados indicaron una actividad celulolítica nula en todas las cepas, en las tres
concentraciones y durante las veinte horas de fermentación, lo cual indicó la falta de
concordancia entre la evaluación cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicación de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneció en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubación, aumentando
así la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para degradar el polisacárido;
mientras que en la técnica de actividad cuantitativa por DNS, el extracto enzimático
entró en contacto con la celulosa con un tiempo de reacción de 60 minutos que
probablemente no fue suficiente para que se diera una reacción enzima-sustrato
completa, o, la cantidad de enzima presente en el sobrenadante no era suficiente para
hidrolizar la celulosa o para obtener cantidades de azúcares reductores que pudieran
ser detectados por esta técnica, a pesar de que la prueba se realizó en condiciones de
pH y temperatura óptimos para la detección de las enzimas encargadas de la
degradación del sustrato.
Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio
Al evaluar la actividad celulolítica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los resultados
obtenidos tanto en la fermentación realizada en caldo CMC al 1%(p/v) como en caldo
SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azúcares reductores y la actividad
enzimática del consorcio en los dos sustratos fue nula. Con base en estos resultados se
decidió buscar una segunda opción que incluyó la evaluación de la cepa 8 que había
sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual, se
realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
determinando azúcares reductores y actividad enzimática, alcanzándose valores
mayores a los obtenidos con el consorcio propuesto.
Con el objetivo de potencializar la actividad enzimática de la cepa 8, teniendo en
cuenta que fue un microorganismo “nativo” del sustrato vegetal a evaluar y, que
durante la realización de las pruebas de antagonismo se caracterizó por inhibir a las
demás cepas, probablemente por tener una alta tasa de crecimiento que lo hacía
competitivo por espacio y nutrientes y basados en que el sinergismo de las enzimas
celulolíticas hacen posible la hidrólisis de celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005;
8
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Azúcares reductores
(g/L)
Malherbe y Cloete, 2002) se evaluó el efecto sinérgico entre la cepa 8 y un
actinomiceto aislado a partir de suelo, en cultivo de Stevia con buena actividad
celulolítica cualitativa en CMC al 1% (p/v), (halos de hidrólisis de 2.14cm de
diámetro) (Gutiérrez, et al., 2002) aislado de suelo. Para lo anterior se realizaron
curvas de cada microorganismo por separado en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de
evaluar la actividad enzimática sobre dicho sustrato. Los dos microorganismos
presentaron una degradación del sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenció
con la cuantificación de azúcares reductores (Figura. 3)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo (h)
CEPA 8 EN SVS 10%(p/v)
ACTINO EN SVS 10%(p/v)
Fig.3 Azúcares reductores en el cultivo de cepa 8 y actinomicete en SVS al 10% (p/v).
Identificación Bioquímica
Los resultados del perfil bioquímico y la observación de las características macro y
microscópicas realizadas a la cepa 8 y el actimomicete permitieron identificarlos
como Bacillus sp. y Streptomyces sp.
Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como microorganismos
con alta actividad celulolítica. Muchas especies del género Bacillus están
normalmente presentes en el suelo y en la materia orgánica en degradación, por lo
que se considera que juegan un papel importante en la biodegradación y
bioconversión de componentes de alto peso molecular. Se ha realizado el aislamiento
de Bacillus licheniformis a partir de residuos vegetales de flores en compostaje (Lu et
al., 2005) y Bacillus subtilis en muestras de suelo y agua en la región amazónica
(Heck et al., 2002), en residuos de banano (Krishna, 1999), y en fibras de palma
(Apun et al., 2000), en los que dicho género bacteriano ha demostrado un alto
potencial celulolítico.
Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la degradación y
recirculación de biopolímeros como la celulosa, la hemicelulosa y la lignina (Semedo
et al., 2004). Los estudios realizados con este microorganismo en cuanto a su
capacidad hidrolítica en materiales lignocelulósicos han reportado buenos resultados,
como es el caso de Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados
de muestras de suelo (Semedo et al., 2004; Grigorevski et al., 2005; Li, 1997).
Ramírez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celulolítcos entre los
cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y además mostró los más
altos niveles de actividad enzimática en el estudio.
9
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico
Teniendo en cuenta la actividad hidrolítica de Streptomyces sp. y Bacillus sp. en el
residuo vegetal a evaluar (Figura 3); y con el objetivo de potencializar la degradación
del sustrato por una posible acción sinérgica entre las enzimas de cada cepa, se
realizaron curvas en las que los microorganismos actuaron en consorcio.
Azúcares reductores (g/L)
Durante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al 5% (p/v)
se obtuvieron valores máximos de azúcares reductores de 0.624 y 0.849g/L,
respectivamente en la hora 18 de fermentación, (Figura 4) mientras que, en SV y
SVS al 10% (p/v) se alcanzaron valores de 1.665 y 1.474g/L, respectivamente en la
hora seis de fermentación (Figura 5). Los resultados de la cromatografía liquida
realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis de las fermentaciones en los
medios al 10% (p/v) mostraron la presencia de glucosa y fructosa como azúcares
reductores. En el medio SV la glucosa se encontró en una concentración de 0.5g/L,
mientras que, en el medio SVS además de la glucosa en una concentración de 0.4g/L
se detectó fructosa en una concentración de 1.4g/L. Estos resultados permitieron
inferir en primer lugar que el sustrato vegetal de crisantemo a concentración de
10%(p/v) estimuló la actividad hidrolítica del consorcio microbiano, generándose
diferencias significativas (p<0.05) con la actividad hidrolítica al 5% (p/v), en segundo
lugar, que la adición de sales al medio de producción no generó diferencias
significativas (p>0.05) en la liberación de azúcares reductores, lo que demuestra que
el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrógeno y minerales
que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento y la
actividad metabólica de los microorganismos evaluados, así mismo, los resultados de
la cromatografía líquida corroboraron que la suplementación del medio sustrato
vegetal no generó un incremento en la conversión de celulosa a glucosa, por el
contrario la concentración de este azúcar fue mayor en el medio sin suplemento. Sin
embargo, se esperaba una mayor concentración de azúcares reductores teniendo en
cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contenía un alto porcentaje de celulosa
(65.3%) de acuerdo al análisis fisicoquímico realizado.
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
6
12
16
18
20
22
Tiempo (h)
SV 5% (p/v)
SVS 5% (p/v)
Fig. 4 Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp. en SV
y SVS al 5% (p/v)
10
Azúcares reductores (g/L)
Diana Gaitán, Liliana Pérez
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiem po (h)
SV 10%(p/v)
SVS 10%(p/v)
Fig. 5 Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp.) en
SV y SVS al 10% (p/v)
Azúcares reductores (g/L)
Por otro lado, al comparar la concentración de azúcares reductores obtenidos en las
pruebas preliminares en las que Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron
individualmente en la degradación de SVS al 10%(p/v), con los obtenidos con el
consorcio (Bacillus sp.- Streptomyces sp.) el mismo sustrato y a la misma
concentración, demuestran que se estableció un sinergismo en el que probablemente
se logró una complementariedad entre las enzimas celulolíticas que favorecieron la
degradación del sustrato con el consecuente aumento en la liberación de azúcares
reductores (Figura 6).
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
6
12
14
16
18
20
22
24
25
Tiempo (h)
Bacillus sp.
Streptomyces sp.
consorcio
Fig 6. Azúcares reductores en los cultivos de Bacillus sp.y Streptomyces sp.(individual y en
consorcio) en SVS al 10%(p/v)
Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentación
Durante las curvas de degradación del residuo vegetal realizadas, el pH y la
temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35ºC, respectivamente.
Krishna (1999), reportó que el pH y la temperatura de la fermentación tienen una gran
influencia en la producción de enzimas celulolíticas, en su investigación la mayor
producción se alcanzó a un pH de 7.0 manteniendo una temperatura constante de
35ºC, sin embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la
mayor liberación enzimática, lo que permite afirmar que tanto el pH como la
temperatura de operación en esta investigación favorecieron la hidrólisis del residuo
vegetal.
11
Diana Gaitán, Liliana Pérez
Actividad Enzimática y liberación de azúcares reductores a partir del residuo
vegetal de Crisantemo.
El nivel más alto de celulasas se produjo en la fermentación con SV al 10%(p/v) en
la hora 6, pH7 37ºC con un valor de 0.1056 UC (UC definida como la cantidad de
enzima capaz de liberar un micromol de glucosa por minuto) (Figura 7) valor que
coincidió con la mayor concentración de azúcares en el mismo sustrato. Sin embargo,
no existieron diferencias significativas (p>0.05) en la concentración de celulasas
liberadas en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.
Actividad enzimática (UC)
Por otro lado, la actividad enzimática a pH ácido y una temperatura de 50ºC fue
menor, demostrando que dicha actividad varía de acuerdo a las condiciones de pH y
la temperatura en la que es evaluada (p<0.05). Una explicación a este hecho puede ser
que en condiciones naturales la actividad hidrolítica de la celulosa se ve afectada
cuando el pH del suelo es ácido, como es el caso de Cellulomonas sp., cuyo
comportamiento metabólico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd et
al.,2002)
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
6
12
16
18
20
22
25
Tiempo (h)
UC pH7 37ºC
UC pH 5 50ºC
Fig.7 Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en
SV al 10% (p/v), bajo condiciones de pH7 37ºC y pH 5 50ºC
La actividad enzimática del consorcio evaluada en SV y SVS en concentraciones de
5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados reportados por otros
estudios en los que también se ha realizado la evaluación de microorganismos
celulolíticos en residuos celulósicos (Lu et al 2005), (Krishna, 1999), debido a que el
material celulósico difiere en sus características físico-químicas como son: el tamaño
y la superficie de las fibrillas, el espacio entre las microfibrillas y las moléculas de
celulosa en las regiones amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la
conformación estereoscópica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de
polimerización de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que la
celulosa esta asociada, la naturaleza, concentración y distribución de grupos
sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et al., 2006).
Dichos parámetros condicionan drásticamente la habilidad de los microorganismos
celulolíticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual explica que el
comportamiento metabólico sea específico y por ende, la acumulación del producto
de hidrólisis difiera de un ensayo a otro. (Zhang et al., 2006).
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de hidrolizar
la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas ) y los cambios en las
12
Diana Gaitán, Liliana Pérez
características del sustrato durante la hidrólisis han sido simulados por modelos
matemáticos aplicados a una variedad de materiales lignocelulósicos, dicho modelo
sugiere que es casi imposible la predicción del funcionamiento hidrolítico de una
mezcla de celulasas de un sustrato a otro debido a variaciones como la concentración
de celulasas, la proporción endo/exocelulasas, el tiempo de reacción y las
características del sustrato (Zhang et al, 2006). De esta manera, la actividad
celulolítica de los microorganismos va a ser específica para cada sustrato celulósico a
evaluar.
Durante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la actividad
celulolítica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar directamente
relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron dichas pruebas, pues, según
Zhang et al., (2006), es necesario tener en cuenta la solubilidad o insolubilidad en
agua del sustrato que se quiere evaluar ya que determina los parámetros para realizar
el screening y determinación de la actividad enzimática de microorganismos con
capacidad celulolítica.
En esta investigación el screening se realizó en agar CMC al 1%(p/v) (sustrato
celulósico soluble), posteriormente la inducción de enzimas en residuos vegetales de
crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificación de dichas enzimas fue llevada a
cabo en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH7 y en buffer ácido cítrico pH5. La
utilización de sustratos con diferente tipo de solubilidad probablemente influyó en la
variación de los resultados, pues la relación existente entre la tasa de hidrólisis
obtenida en sustratos solubles e insolubles no es clara, principalmente porque existen
diferencias en la accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grado de polimerización
(Zhang et al., 2006), lo cual explica la obtención de halos de diámetro incuantificable
y su baja correlación con los niveles de azúcares reductores obtenidos y la actividad
enzimática evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas como para el
consorcio. Este mismo autor concluyó que los datos obtenidos en la hidrólisis de
sustratos solubles no pueden ser comparados con la hidrólisis de sustratos insolubles.
Otro de los factores que pudo haber influido en la variación de los resultados es el
tiempo de fermentación y el de reacción enzima-sustrato durante las pruebas de
actividad enzimática, si se tiene en cuenta que la lignocelulosa pretratada utilizada
para evaluar la actividad enzimática de preparaciones comerciales de celulasas,
requiere un rango de tiempo que va de minutos a horas para que inicie la hidrólisis y
hasta varios días para obtener una digestibilidad final (conversión de la celulosa)
(Zhang et al., 2006), las evaluaciones realizadas requerían un mayor tiempo de
reacción que diera lugar a la obtención de mejores resultados.
Finalmente, se puede considerar la importancia de continuar realizando screening de
microorganismos celulolíticos pues la utilización de estos se convierte en una
alternativa viable para el tratamiento de residuos celulósicos, pues tan solo se ha
identificado y evaluado menos del 1% del potencial de dichos microorganismos
presentes en la biosfera (Howard et al., 2003)
13
Diana Gaitán, Liliana Pérez
CONCLUSIONES
ƒ
Se logró el aislamiento de ocho cepas con actividad celulolítica en CMC 1%
(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje
ƒ
No se estableció una relación directa entre la actividad celulolítica cualitativa
y cuantitativa de los microorganismos evaluados durante el estudio.
ƒ
La mayor concentración de azúcares reductores y actividad enzimática se
obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV
10% (p/v).
ƒ
El residuo vegetal de crisantemo aportó los nutrientes necesarios para
estimular la actividad enzimática de los microorganismos evaluados por lo
cual no se hace necesario suplementar el residuo con sales.
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