Instrucciones de Uso Interleukin-6 ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Interleucina-6 (IL-6) en suero y plasma humanos y sobrenadantes de cultivo celular. BE53061 96 2-8°C I B L I N T E R N A T I O N A L Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 D-22335 Hamburg, GermanyFax: +49 (0)40-53 28 91-11 G M B H [email protected] www.IBL-International.com Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO 1. USO PROPUESTO 2 2. RESUMEN 2 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 3 4. REACTIVOS SUMINISTRADOS 4 5. INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 4 6. TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 5 7. MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO 5 8. PRECAUCIONES DE USO 5 9. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 6 10. PROTOCOLO DE ENSAYO 8 11. CALCULO DE RESULTADOS 11 12. LÍMITES 12 13. PRUEBAS FUNCIONALES 13 14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS 16 15. RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS 16 16. RESUMEN DEL PROTOCOLO 17 17 REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 18 25.11.14 (24) 1/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 1. ESPAÑOL Uso Propuesto El ELISA IL-6 humana es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa de la IL-6 humana. El ELISA IL-6 humana es para el diagnóstico in vitro. No debe utilizarse en los procedimientos terapéuticos 2. Resumen La interleucina 6 (IL-6) es una citocina multifuncional que regula las respuestas inmunitarias, las reacciones de fase aguda y la hematopoyesis, y puede cumplir una función central en los mecanismos de defensa anfitriones. El gen de la IL-6 humana se localizó en el cromosoma 7p21. Se determinó la secuencia genómica. Por lo general, las células normales no producen constitutivamente la IL-6, pero su expresión se induce fácilmente por una variedad de citocinas, infecciones virales o por lipopolisacáridos. El producto del gen de la IL-6 es una proteína de cadena única con una masa molecular que va de 21 a 28 kDa, según la fuente celular. Las amplias modificaciones postransductivas, como N- y O-glucosilación, así como la fosforilación, parecen explicar esta heterogeneidad. El ADN complementario para la IL-6 predice una proteína precursora de 212 aminoácidos. La IL-6 es una citocina pleiotrópica producida por distintas células. Actúa en una amplia gama de tejidos, provocando la inducción del crecimiento, la inhibición del crecimiento y la diferenciación, respectivamente, según la naturaleza de los dianocitos. IL-6 participa en la inducción de la diferenciación de células B, la inducción de proteínas de fase aguda en células del hígado, promoción de crecimiento de células de mieloma/plasmacitoma/hibridoma, inducción de la expresión del receptor de IL-2 e IL-2, proliferación y diferenciación de células T, inhibición del crecimiento de células de ciertos líneas célulares de leucemia mioloide y inducción a su diferenciación a macrófagos, aumento de la formación de colonias celulares multipotenciales inducidas por la IL-3 en hemocitoblastos e inducción de la maduración de megacariocitos como un factor trombocitopoyético, inducción de crecimiento mesangial, inducción de diferenciación neural de las células PC 12 e inducción de crecimiento de los queratinócitos. Primero se indicó que la producción anormal de la IL-6 estaba relacionada con la activación de linfocitos B policlonales con producción de autoanticuerpos en pacientes con mixoma cardíaco. Desde entonces, se ha indicado que la IL-6 participa en la patogenia de distintas enfermedades. Así, la medición de los niveles de la IL-6 en el suero y otros líquidos corporales proporciona información más detallada sobre distintas situaciones patológicas. Infecciones: Los fluidos corporales de pacientes con infecciones agudas bactieranas locales o virales y suero de pacientes con bacteremia Gram Negativa o positiva contienen niveles elevados de IL-6 biologicamente activa. Enfermedades Obstétricas: La IL-6 ha surgido como una citocina indicadora para la infección intraamniótica. Enfermedades asociadas con un sistema inmunitario alterado (anormalías de células B policlonales o enfermedades autoinmunes): Se han detectado niveles elevados de IL-6 circolante en pacientes con mixoma cardiaco, enfermedad de Castleman artritis reumatoide, gammopatía IgM y en aquellos con síndrome de inmunodeficiencia adquerida, así como la hepátopatía alcohólica (cirrosis). Enfermedades proliferativas: Se observa el aumento de los niveles de plasma de la IL-6 en los pacientes con psoriasis y glomerulonefritis proliferativa mesangial. 25.11.14 (24) 2/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL Enfermedades neoplásicas: Se detectó un aumento de los niveles generales de la IL-6 en pacientes con mieloma múltiple, otras discracias de linfocitos B, linfoma T de Lennert, enfermedad de Castleman, carcinoma de células renales y distintos tumores sólidos. Respuestas inflamatorias: La IL-6 participa en la inducción de proteínas de fase aguda y en la inducción de fiebre. El aumento de los niveles de suero de la IL-6 también se encuentran en pacientes con quemaduras graves, en el suero y el plasma como un marcador para predecir complicaciones posoperatorias, en el suero y la orina de receptores de trasplantes de riñón antes del rechazo, en el suero de pacientes con choque septicémico y en pacientes con artritis inflamatoria y artritis traumática. 3. Principio de Ensayo Figura 1 Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos anti-IL-6 humana. Micropocillos Recubiertos Anticuerpo para el Recubrimiento Figura 2 La IL-6 humana presente en la muestra o el estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un anticuerpo anti-IL-6 humano conjugado a biotina que se une a la IL-6 humana capturada por los primeros anticuerpos. Primera Incubación Estándar o Muestra Conjugado Biotina Figura 3 Después de la incubación se elimina el conjugado no unido mediante una etapa de lavado. Se agrega una solución de estreptavidina-peroxidasa de rábano qui se une al conjugado de biotina anti-IL-6. Segunda Incubación Estreptavidina-HRP 25.11.14 (24) 3/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL Figura 4 Después de la incubación se elimina la estreptavidina-HRP no unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solución de Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa a los pocillos. Tercera Incubación Substrato Se forma un producto de color proporcional a la cantidad de la IL-6 presente en la muestra o el estándar. La reacción es terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones estándar de IL-6 y se determina la concentración de IL-6 humana en la muestra. Figura 5 Substrato Reaccionado 4. Reactivos Suministrados 1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales anti-IL-6 humana. 1 vial (70 µL) de Conjuguado de Biotina (anticuerpos monoclonales anti-IL-6 humana) 1 vial (150 µL) con Estreptavidina-HRP 2 viales de Estándar IL-6 humano liofilizado, 200 pg/mL después de la reconstitución 1 vial del Control alto 1 vial del Control bajo 1 vial (5 mL) de Solución Buffer de Ensayo Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20, BSA al 10 %) 1 frasco (50 mL) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20) 1 vial (15 mL) de Solución de Substrato (tetrametil-benzidina) 1 vial (15 mL) de Solución de Parada (1M Acido Fosfórico) 4 Tapas para placas, Adhesivas 5. Instrucciones de Almacenamiento Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C. Conservar los controles liofilizados a -20 °C. Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura fría (2 °C y 8 °C) y los controles a -20 °C. En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulación. 25.11.14 (24) 4/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 6. ESPAÑOL Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento Sobrenadantes de cultivos celulares, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina) fueron probados con este ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separar el suero o plasma del coágulo o de las células lo antes posible después de la coagulación y separación. Las muestras que contienen un precipitado visible deben ser aclararadas antes de su uso en el ensayo. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas. Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congeladar a -20 °C para evitar la pérdida de IL-6 humana bioactiva. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2 °C y 8 °C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5). Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente. 7. Material Requirido Pero No Suministrado - Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL - Micropipetas monocanales de 5 µL a 1000 µL con puntas desechables - Micropipetas multicanales de 50 µL a 300 µL con puntas desechables - Depósito para micropipetas multicanales - Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos - Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación - Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio - Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión 8. Precauciones de Uso - Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto, recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones específicas. - Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en procedimientos terapéuticos. - No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No usar reactivos caducados - No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación. - No pipetear con la boca - No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos - Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas. - Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las muestras y reactivos. - Evitar el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales. - Evitar salpicaduras y la generación de aerosoles. 25.11.14 (24) 5/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL - Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso. - Usar recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato. - La exposición a los ácidos inactiva el conjugado. - Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos. - La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso. - Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado durante un mínimo de 1 hora a 121.5 °C. - Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sódico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico. 9. Preparación de los Reactivos Las Soluciónes de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluídas antes de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Soluciónes de Buffer Concentradas se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución. 9.1. Solución Buffer de Lavado (1x) Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma. Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2 °C y 25 °C. La Solución Buffer de Lavado (1x) permanece estable durante 30 días En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado (1x) de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras 1-6 1 - 12 Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (mL) 25 50 Agua Destilada (mL) 475 950 9.2. Solución Buffer de Ensayo (1x) Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio aforado de 100 mL. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada aun volumen final de 100 mL. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma. Conserve la solución a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. La Solución Buffer de Ensayo permanece estable durante 30 días. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras 1-6 1 - 12 25.11.14 (24) Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL) 2.5 5.0 Agua Destilada (mL) 47.5 95.0 6/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL 9.3. Preparación de Conjugado de Biotina Utilice el Conjugado de Biotina antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución. Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluirlo en una proporción de 1:100 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras 1-6 1 - 12 Conjugado de Biotina (mL) 0.03 0.06 Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 2.97 5.94 9.4. Estreptavidina-HRP Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución. Justo antes de utilizar la solución concentrada de Estreptavidina-HRP, se debe diluirlo en una proporción de 1:200 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras 1–6 1 - 12 Estreptavidina-HRP (mL) 0.03 0.06 Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 5.97 11.94 9.5. Estándar IL-6 Humano Reconstituir el Estándar IL-6 humano añadiendo agua destilada. El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar reconstituido = 200 pg/mL). Permitir que el estándar reconstituido se asiente durante 10-30 minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones. Tras su uso los restos del estándar no pueden ser almacenados y deben ser descartados. Las diluciones estándares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.c) o alternativamente en tubos (véase 9.5.1). 9.5.1. Dilución Estándar Externa Rotular 7 tubos, uno para cada curva estándar. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación: Pipetear 225 µL de Solución Buffer Ensayo (1x) a todos los tubos. Pipetear 225 µL de estándar reconstituido (concentración del estándar = 200 pg/mL) en el primer tubo, etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 100 pg/mL). Pipetear 225 µL de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como S2, y mezclar completamente antes de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 6). La Solución Buffer de Ensayo (1x) sirve como blanco. 25.11.14 (24) 7/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL Figura 6 Transferir 225 µL S1 IL-6 Humano Estándar Reconstituido S2 S3 Solución Buffer de Ensayo (1x) 225 µL S4 - S7 Descartar 225 µL 9.6. Controles Solubilizar añadiendo 300 µL de agua destilada al controles liofilizados. Permitir que il controles liofilizados se asiente durante 10-30 minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones. Vortear concienzudamente para asegurar una solubilización homogénea y completa. A partir de aquí, tratar il controles de la misma forma que las muestras. El rango del control viene indicado en el certificado de calidad y en la etiqueta del vial. Almacenar il controles reconstituidos y alicuotado a -20 °C. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. 10. Protocolo de Ensayo a. Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y además añada las tiras para blancos y estándares (de color). Cada muestra, estándar, blanco y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8 °C. b. Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µL de Solución Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos. Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo 15 minutos. No deje secar los pocillos. c. Dilución Estándar en la placa de microtitración (Alternativamente, la dilución estándar puede ser preparada en tubos – véase 9.5.1) Añadir 100 µL de Solucón Buffer de Ensayo (1x) en duplicado a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.5, concentración = 200 pg/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Tabla 1). Mezclar el contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la pipeta (concentración del estándar 1, S1 = 100 pg/mL), y transferir 100 µL a los pocillos B1 y B2, respectivamente. (véase Figura 7). Cuidar de no rascar la superficie interior de los micropocillos con la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones estándar del human IL-6 ordenadas desde 100 a 1.56 ng/mL. Descartar 100 µL de los contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados. 25.11.14 (24) 8/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL Figura 7 Transferir 100 µL S1 S2 IL-6 Humana Estándar Reconstituido S3 S4 - Solución Buffer de Ensayo (1x) 100 µL S7 Descartar 100 µL En caso de una dilución estándar externa (véase 9.5.1), pipetear 100 µL de estas diluciones estándares (S1-S7) en los pocillos estándares correspondientes de acuerdo con la Tabla 1. Tabla 1 Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras de los micropocillos A B C D E F G H 25.11.14 (24) 1 2 Estándar 1 (100.00 pg/mL) Estándar 2 (50.00 pg/mL) Estándar 3 (25.00 pg/mL) Estándar 4 (12.50 pg/mL) Estándar 5 (6.25 pg/mL) Estándar 6 (3.13 pg/mL) Estándar 7 (1.56 pg/mL) Estándar 1 (100.00 pg/mL) Estándar 2 (50.00 pg/mL) Estándar 3 (25.00 pg/mL) Estándar 4 (12.50 pg/mL) Estándar 5 (6.25 pg/mL) Estándar 6 (3.13 pg/mL) Estándar 7 (1.56 pg/mL) Blanco Blanco 3 4 Muestra 1 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 8 9/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL d. Añadir 100 µL de Solución Buffer de Ensayo (1x) en duplicado a los pocillos del blanco. e. Añadir 50 µL de cada Solución Buffer de Ensayo (1x) a los pocillos con la muestra. f. Añadir 50 µL de cada muestra en duplicado a los pocillos designados. g. Prepare el Conjugado de Biotina (véase la preparación del Conjugado de Biotina 9.3) h. Añada 50 µL el Conjugado de Biotina a todos los pocillos. i. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible. j. Prepare Estreptavidina-HRP (véase la preparación de estreptavidina-HRP 9.4). k. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 4 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso. l. Añada 100 µL Estreptavidina-HRP a todos los pocillos. m. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora (en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible) n. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 4 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso. o. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos, incluidos los del blanco. p. Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25 °C) durante aproximadamente 10 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa. Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato (véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar correctamente los pocillos positivos. La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de forma individual para cada ensayo. Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una DO entre 0.9 y 0.95. q. Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µL de la Solución de Parada en cada pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente después de añadir la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 °C en un lugar oscuro. r. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la absorbancia de las muestras y de los IL-6 humana. Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados más abajo. De todas formas los resultados siguen siendo válidos. 25.11.14 (24) 10/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 11. ESPAÑOL CALCULO DE RESULTADOS - Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio - Construir una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada estándar frente a la concentración de IL-6 humana con el valor de absorbancia en el eje-y y la concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics. - Para determinar la concentración de la IL-6 humana circulante para cada muestra, primero encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva estándar. En el punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la concentración la IL-6 humana. - Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 µL de muestra + 50 µL de Solución Buffer de Ensayo (1x)), la concentración leída a partir de la curva estándar se debe multiplicar por el factor de dilución (2x). - Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a concentraciones incorrectas, bajas en IL-6 humana. Estas muestras requieren más predilución externa según los valores esperados de IL-6 humana con la Solución Buffer de Ensayo (1x) para cuantificar con precisión la concentración real de IL-6 humana. - Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de IL-6 humana y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no válidos. - En la figura 8 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo de tiras ensayadas. Figura 8 Representativa curva estándar para el ELISA IL-6 humana. Se diluyó la IL-6 humana en serie de 2 etapas en la Solución Buffer de Ensayo (1x). No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas. Interleukin-6 ELISA DO (450 nm) 10.0 1.0 0.1 1 10 100 1000 (pg/m L) 25.11.14 (24) 11/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL Tabla 2 Datos típicos del ELISA IL-6 humana Longitud de onda: 450 nm Longitud de onda de referencia: 620 nm 1 Concentración IL-6 humana (pg/mL) 100.00 2 50.00 3 25.00 4 12.50 5 6.25 6 3.13 7 1.56 Blanco 0.00 Estándar D.O. (450 nm) D.O. Media C.V. (%) 1.848 1.854 1.005 1.002 0.553 0.570 0.355 0.343 0.201 0.212 0.146 0.158 0.116 0.125 0.075 0.086 1.851 0.2 1.004 0.2 0.562 2.1 0.349 2.4 0.207 3.8 0.152 5.6 0.121 5.3 0.081 Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo válidas. 12. LÍMITES - Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estándar para cada prueba. - La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada entre los reactivos puede dar resultados erróneos. - Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser eliminados por un enjuague minucioso. - Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo o que se secan. - Por la aplicación de radioinmunoterapia, el número de pacientes con los anticuerpos humanos IgG antiratón (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden todavía ser ensayadas en ensayos de este tipo si se añaden inmunoglobulinas murinas (suero, líquido ascítico o anticuerpos monoclonales no específicos) a la muestra. 25.11.14 (24) 12/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 13. ESPAÑOL PRUEBAS FUNCIONALES 13.1. Sensibilidad El límite de detección de IL-6 humana definido como la concentración del analito resultando en una absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar), se determinó de ser 0.92 pg/mL (media de 6 ensayos independientes). 13.2. Recuperación 13.2.1. Intra-ensayo La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IL-6 humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IL-6 humana y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3). El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 3.4 %. Tabla 3 La concentración media de IL-6 humana y el coeficiente de variación para cada muestra Muestra Experimento 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 3 4 5 6 7 8 25.11.14 (24) Concentración Media IL-6 humana (pg/mL) 40.7 42.2 40.1 40.1 43.2 41.7 65.6 65.4 47.2 78.0 34.1 37.8 27.3 35.2 37.8 42.6 Coefficiente de Variación (%) 7.8 1.6 4.1 2.6 1.1 3.5 2.3 4.6 1.6 2.1 2.5 5.4 0.2 7.7 4.1 2.4 13/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL 13.2.2. Inter-ensayo La recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en dos experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IL-6 humana. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IL-6 humana y el coeficiente de variación calculado en 18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variación total calculado de inter-ensayo fue del 5.2 % Tabla 4 La concentración media de IL-6 humana y el coeficiente de variación para cada muestra Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Concentración Media de IL-6 Humana (pg/mL) 41.5 40.1 42.5 65.5 47.6 35.9 31.3 40.2 Coefficiente de Variación (%) 2.6 0.0 4.4 0.2 1.2 7.3 17.8 8.4 13.3. Recuperación después del Enriquecimiento La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo cuatro niveles de IL-6 humana en muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en dos experimentos independientes con 8 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido sirvó como blanco en estos experimentos. La recuperación varió entre 78 % a 105 % con una recuperación total media de 88 %. 13.4. Dilución en Paralelo Se analizaron muestras de suero con diferentes concentraciones de IL-6 humana mediante 2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno. La recuperación varió entre 98 % a 111 %, con una recuperación total de 105 % (ver Tabla 5). Tabla 5 Muestra 1 2 3 25.11.14 (24) Dilución 1:2 1:4 1:8 1:2 1:4 1:8 1:2 1:4 1:8 Concentración Expectada de IL-6 Humana (pg/mL) 23.2 11.6 47.5 23.8 26.0 13.0 Concentración Observada de IL-6 Humana (pg/mL) 46.4 22.7 11.8 95.0 50.3 23.4 51.9 28.8 14.4 Recuperación de Concentración Expectada (%) 98 102 106 99 111 111 14/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) ESPAÑOL 13.5. Estabilidad de Muestras 13.5.1. Estabilidad Congelación - Descongelación Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C y posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determinó las concentraciones del IL-6 humana. No hubo pérdidas significativas de la inmunoreactividad de IL-6 humana por la congelación y descongelación. 13.5.2. Estabilidad de Almacenamiento Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C, 2-8 °C, temperatura ambiente (TA) y a 37 °C, y la concentración de IL-6 humana fue determinada después de las 24 horas. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad del Il-6 humana durante el almacenamiento en condiciones descritos anteriormente. 13.6. Comparación de Suero y Plasma Se obtuvieron muestras de suero así como plasma EDTA, citrato y heparina al mismo tiempo de dos donantes y se ensayó la concentración de IL-6 humana. Las concentraciones no fueron significativamente diferentes y por tanto todas estas fluidos corporales son adecuadas para su uso en este ensayo. Sin embargo, se recomienda asegurar la uniformidad de los preparaciones de sangre. 13.7. Especificidad La interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de IL-6 humana. No se ha detectado reactividad cruzada. 13.8. Valores Esperados Un panel de muestras procedentes de donantes aparentement sanos seleccionados al azar (hombres y mujeres ) fue probado por Il-6 humana. Los niveles medidos pueden variar con la colección de la muestra utilizada. Los niveles de IL-6 humana detectados se detallan en la Tabla 6. Tabla 6 Matriz de Muestra Suero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Heparina) Número de Muestras Evaluadas 40 40 40 40 Rango (pg/mL) nd* - 12.7 nd* - 13.0 nd* - 6.6 nd* - 6.5 % Detectable 47.5 17.5 2.5 30.0 Media de Detectable (pg/mL) 5.8 6.4 6.6 5.0 *n.d. = non-detectable (no detectable), muestras medidas por debajo del punto estándar más bajo se consideran no detectables 13.9. Calibración El inmunoensayo es calibrado con recombinante IL-6 humana altamente purificada, que ha sido evaluado según el estándar de referencia internacional NIBSC 89/548 y se ha demostrado que son equivalentes. NIBSC 89/548 se cuantifica en unidades internacionales (UI) de una IU que corresponde a 10 pg de la IL-6 humana. 25.11.14 (24) 15/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 14. ESPAÑOL INFORMACIÓN DE PEDIDOS Para los pedidos póngase en contacto con: Véase la última página. Para preguntas técnicas comuníquese con: e-mail: [email protected] www.IBL-International.com 15. Resumen: Preparación de Reactivos 15.1. Solución Buffer de Lavado (1x) Añadir 50 mL de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada. Número de Tiras 1-6 1-12 Solución Buffer de Lavado Concentrada (mL) 25 50 Agua Destilada (mL) 475 950 15.2. Solución Buffer de Ensayo Añadir 5 mL Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) a 95 mL de agua destilada. Número de Tiras 1-6 1-12 Solución Buffer de Ensayo Concentrada (mL) 2.5 5.0 Agua Destilada (mL) 47.5 95.0 15.3. Conjugado de Biotina Hacer una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x): Número de Tiras 1-6 1-12 Conjugado de Biotina (mL) 0.03 0.06 Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 2.97 5.94 15.4. Estreptavidina-HRP Hacer una dilución 1:200 del Estreptavidina-HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x): Número de Tiras 1-6 1-12 Conjugado de Biotina (mL) 0.03 0.06 Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 5.97 11.94 15.5. Estándar IL-6 Humana Reconstituir el estándar liofilizado IL-6 humana con agua destilada. (El volumen de reconstitución se indica en la etiqueta del frasco estándar.) 15.6. Controles Añadir 300 µL de agua destilada a los controles liofilizados. 25.11.14 (24) 16/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 16. ESPAÑOL Resumen de Protocolo de Ensayo 1. Determinar el número requirido de tiras de la placa de microtitulación. 2. Lavar las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado. 3. Dilución estándar en la placa de microtitración: Añadir 100 µL de Solución Buffer de Ensayo (1x), por duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado en los primeros pocillos y crear diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µL de pocillo a pocillo. Deseche 100 µL de los últimos pocillos. Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.5.1): Pipetear 100 µL de estas diluciones estándares en las tiras de los micropocillos. 4. Añadir 100 µL de Solución Buffer de Ensayo (1x), por duplicado, a los pocillos blancos. 5. Añadir 50 µL de Solución Buffer de Ensayo (1x) a los pocillos de muestra. 6. Añadir 50 µL de muestras por duplicado a los pocillos respectivos. 7. Preparar el Conjugado de Biotina. 8. Añadir 50 µL de Conjugado de Biotina a todos los pocillos. 9. Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 °C). 10. Preparar Estreptavidina-HRP. 11. Vaciar y lavar los pocillos 4 veces con Solución Buffer de Lavado. 12. Añadir 100 µL de la Solución de Substrato TMB a todos los pocillos. 13. Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 °C). 14. Vaciar y lavar los pocillos 4 veces con Solución Buffer de Lavado. 15. Añadir 100 µL de Solución Substrato TMB a todos los pocillos. 16. Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25 °C). 17. Añadir 100 µL de Solución de Parada a todos los pocillos. 18. Ajustar el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm. Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2 (50 µL de muestra, 50 µL de Solución Buffer de Ensayo (1x)), la concentración leída de la curva estándar debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2). 25.11.14 (24) 17/18 Interleukin-6 (IL-6) ELISA (BE53061) 17. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. ESPAÑOL REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO Helfgott,D.C.; Tatter,S.B.; Santhanam,U.; Clarick,R.H.; Bhardwaj,N.; May,L.T.; Sehgal,P.B.. Multiple forms of IFN-beta 2/IL-6 in serum and body fluids during acute bacterial infection. J.Immunol. 1989; 142:948-953. Ueyama,M.; Maruyama,I.; Osame,M.; Sawada,Y.. Marked increase in plasma interleukin-6 in burn patients. J.Lab Clin.Med. 1992; 120:693-698. May,L.T.; Santhanam,U.; Tatter,S.B.; Bhardwaj,N.; Ghrayeb,J.; Sehgal,P.B.. Phosphorylation of secreted forms of human beta 2-interferon/hepatocyte stimulating factor/interleukin-6. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1988; 152:11441150. Martinez-Maza,O.. IL6 and AIDS. Res.Immunol. 1992; 143:764-769. Santhanam,U.; Avila,C.; Romero,R.; Viguet,H.; Ida,N.; Sakurai,S.; Sehgal,P.B.. Cytokines in normal and abnormal parturition: elevated amniotic fluid interleukin-6 levels in women with premature rupture of membranes associated with intrauterine infection. Cytokine 1991; 3:155-163. 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Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1987; 84:228-231. 25.11.14 (24) 18/18 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.: LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC LYO IVD Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: E-MAIL: WEB: Tel.: E-MAIL: WEB: + 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11 [email protected] http://www.IBL-International.com +1 (416) 645 -1703 Fax: -1704 [email protected] http://www.IBL-International.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20