UNIVERSIDAD VERACRUZANA “Validacion de un metodo para la

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANALISIS
“EXPERIENCED RECEPCIONAL”
CAT: Q.C. Sandra Luz Gonzalez Herrera
“Validacion de un metodo para la detection de la gestation
mediante la determination del peso corporal en ratones de la cepa
BALB/c”
TESIS
A NA GABRIELA GORDILLO AGUILAR
Director: Dr. Enrique Juarez Aguilar
Asesor
M. en C. Isela Santiago Roque
Sinodales:
Dr. Jorge Aquino Carballo
M en C. Jose Luis Perez Miranda
Biol. Mercedes Acosta
Xalapa, Ver.
9 de mayo del 2013
AGRADECIMIENTOS
A dios, por haberme acompanado a lo largo de mi camera, por ser mi fortaleza en
momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de buenas experiencias y mucha
felicidad.
A mis padres Jorge y Maria Elena por apoyarme incondicionalmente en todo momento
de mi vida, por los valores que han ensenado, por la oportunidad de estudiar la camera
que elegi y tener su comprension en todo momento. Pero sobre todo por ser mi ejemplo
a seguir.
A mi querida hermana Gladys por ser parte fundamental de mi vida y por llenarla
siempre de alegrias y amor cuando mas lo he necesitado.
A mi novio, por ser una de las personas mas importantes en mi vida, por apoyarme en
todo momento, por su amor y paciencia.
A mi director de tesis, el Dr Enrique Juarez Aguilar, por su apoyo incondicional, su
ensenanzas, amistad y consejos que me dieron la oportunidad de crecer
profesionalmente y como persona.
A mi asesora de tesis, la M. en C. Isela Santiago Roque, por su apoyo incondicional,
por el asesoramiento a lo largo del desarrollo de la tesis y por las facilidades de realizar
la parte experimental de la tesis en su laboratorio.
Al Q.C Juan David Olivares Hernandez. Por el apoyo en el analisis estadisticos de los
datos, por su gran amistad y por el apoyo brindado en todo momento.
RESUMEN
La detection de la gestation en animales de laboratorio, especialmente en roedores, se
lleva a cabo mediante metodos indirectos como la palpation y la determination de la presencia
del tapon vaginal post-coito. La eficiencia en la deteccion del embarazo mediante estos metodos
no es del todo adecuada, presentandose falsos positivos. Esta situation reviste gran importancia
cuando se considera la necesidad de contar con hembras prenadas en un determinado estadio de
desarrollo para el estudio del desarrollo embrionario.
Se han realizado diversos intentos para
mejorar la deteccion de la gestation en roedores, algunos de los cuales resultan muy costosos
(ultrasonido) o bien de muy dificil realization (determination de gonadotropina corionica).
Recientemente, se describio un metodo de deteccion de la gestation mediante el registro del peso
corporal de hembras de raton, el cual permite la confirmation del embarazo y el seguimiento del
mismo. Este metodo consiste en la sincronizacion del ciclo estral de las hembras mediante viruta
impregnada con orina de macho, seguida de un periodo de 48 horas de cruzamiento entre un
macho y dos hembras sincronizadas para la fertilization. Terminado este periodo, el peso de las
hembras es monitoreado observandose un incremento significativo en las hembras gestantes a
partir de, aproximadamente, el decimo dia post-coito. Este metodo ha sido implementado de
manera exitosa en el Laboratorio de Neurotoxicologia de la Universidad Veracruzana para la
production de ratones necesarios para el desarrollo de proyectos de investigation. Inicialmente,
la implementation de este metodo se llevo a cabo utilizando un numero reducido de hembras lo
que limita la demostracion de la eficacia de este metodo como una altemativa para la deteccion
temprana de la gestation en ratones. En el presente trabajo se aumento la poblacion de ratones
hembra (n=38) bajo el seguimiento de gestation utilizando el metodo de registro del peso
corporal post-coito. Ademas, de la realization de un seguimiento de exudados vaginales que nos
permitio evaluar la eficacia del metodo de sincronizacion utilizado (Efecto Withen). Finalmente,
evaluamos la eficacia del tapon vaginal post-coito como un indicador de gestation. Los
resultados demuestran que el peso es un parametro confiable para la deteccion temprana del
embarazo dentro de los 7- 8 dias post- coito, tambien se demuestra que la realization de citologia
vaginal, previo a la cruza, es indispensable para incrementar las posibilidades de fecundation, y
que la presencia de tapon vaginal no es un indicador tan confiable de gestation como lo es el
peso corporal post-coito. Los resultados de este proyecto nos permitieron validar el metodo de
registro de peso post-coito como una altemativa confiable para la deteccion y seguimiento de la
gestacion en ratones de experimentacion.
INDICE
1. INTRODUCCION................................................................................................ 7
2. ANTECENTES............ ............................
'
8
1
2.1 HISTORIA NATURAL DEL RATON..............................................
9
2.2 EL RATON COMO ANIMAL DE LABORATORIO............................................. 9
2.3 CARACTERISTICAS REPRODUCTIVAS DEL RATON...:................................10
2.4 CICLO ESTRAL DEL RATON...............
11
2.5FASE DEL CICLO ESTRAL...............
13
2.5.1 PROESTRO........................................................................
13
2.5.2 ESTRO............................................................................................................13
2.5.3 METAESTRO...................................................................................................14
2.5.4 DIESTRO....... .........
14
2.6DESARROLLO GESTACIONAL...............................
14
2.7DESARROLLO EMBRIONARIO...........................................................................15
2.8METODOS PARA LA DETECCION TEMPRANA DE LA GESTACION............... 18
2.8.1 PALPACION ABDOMINAL.......................................................
18
2.8.2 RAYOS X .........................................................................................................18
2.8.3 TOMOGRAFIA COMPUTARIZADA...................................
19
/
2.8.4 TOMOGRAFIA POR EMISION DE POSITRONES....... .................................19
2.8.5 ULTRASONIDOS............................................................................................ 19
2.9
METODOS PARA REPRODUCCION ASISTIDA........................................... 20
2.9.1 INSEMINACION ARTIFICIAL..........................................................................20
2.9.2 TRANSPLANTE DE OVARIOS....................................................................... 20
2.9.3 FERTILIZACION INVITRO............................................................................. 21
2.9.4 METODO ICSI.......................................................................................
21
3.
JUSTIFICACION...................
22
4.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA............................................................. 23
5.
HIPOTESIS......................................................................................................24
6.
OBJETIVO GENERAL..................................................................................... 24
6.1
OBJETIVOS ESPECIFICOS...................................................................
7.
METODO.......................................................................................................... 25
7.1
AMBIENTACION...............................................................................................26
7.2
SINCRONIZACION...........................................................................................26
7.3
IDENTIFICACION DE LAS ETAPAS DEL CICLO ESTRAL.............................26
7.3.1
24
TECNICA DE FROTIS VAGINAL CON HISOPO DE ALGODON.................. 27
7.4 CRUZAMIENTO........................................................................................... ..... 28
7.5 DETECION DE EMBARAZO............................................................................. 28
7.6 EVALUACION DE LOS INDICES DE SINCRONIZACION...............................28
7.7 EVALUACION DE LOS INDICES DE EMBARAZOS........................................ 28
7.8 ANALISIS ESTADISTICOS.........................................................................
29
8. RESUL7ADOS.....................................................................................................30
8.1 LA SINCRONIZACION DEL CICLO ESTRAL Y LA EFICACIA DEL SICLO
WITTHEN...........................................................................
30
8.2 DETECCION DE EMBARAZO............................................................................ 31
8.2.1 SEGUIMIENTO DEL PESO CORPORAL POST-COITO............................... 31
8.3 INDICES DE GESTACION Y SINCRONIZACION.............................................. 34
9. DISCUSION......................................................................................................... 37
10. CONCLUCIONES....... ......................................................
39
11. BIBLIOGRAFIA................................................................................................... 40
1. INTRODUCCION
El raton es el animal de laboratorio mas utilizado en investigacion por poseer caracteristicas
especiales como su pequeno tamafio, y por lo tanto, su facil manejo, as! como su corto ciclo vital
y reproductive.
El raton de laboratorio es una especie altamente prollfica, a pesar de ello existen algunas
cepas como la BALB/c cuya tasa de fecundidad es baja, aunado a la influencia de factores
externos que pueden afectar su reproduccion como un reducido espacio de alojamiento, la
sobrepoblacion, la inadecuada limpieza de las cajas, as! como el estres causado por una
ineficiente manipulacion de los animales (Flavia et al., 2013).
Conseguir un adecuado manejo reproductive que incluya la deteccion oportuna y
seguimiento de la gestacion resulta de gran interes en multiples investigaciones cientificas, ya
que facilita la obtencion de grupos experimentales homogeneos, as! como la obtencion de
embriones de una edad gestacional determinada. La ineficacia en la deteccion de la gestacion y
del seguimiento del desarrollo genera, en muchas ocasiones, la eutanasia innecesaria de muchos
ratones hembra.
Hoy en dia, existen varios metodos para asegurar la fecundacion en el raton hembra tales
como la inseminacion artificial, la fertilizacion in vitro, y la inyeccion intracitoplasmatica de
esperfnas; sin embargo, estos metodos son sumamente costosos y de diflcil realizacion (LerenaCano 2011) Del mismo modo, la deteccion del embarazo resulta importante para asegurar la
adecuada expansion de la colonia, as! como el adecuado suministro de animales para la
experimentacion.
De esta manera, resulta necesario el desarrollo de procedimientos adecuados para optimizar
la fecundacion, la deteccion y seguimiento de la gestacion en ratones de laboratorio.
8
2. ANTECEDENTES
La utilizacion de animales como modelo para estudios experimentales ha aumentado de manera
paralela al desarrollo de la actividad de investigacion. Sin embargo, fue a partir del siglo XIX
cuando la experimentacion animal se multiplico rapidamente.
Uno de los requisites para el
empleo de animales en investigacion es el conocimiento exhaustivo de sus caracteristicas
bioiogicas y de sus condiciones de manejo. El animal de laboratorio por excelencia es el raton y
la especie mas utilizada es Mus musculus, este representa aproximadamente (el 80% de los
animales empleados para fines cientlficos.
2.1 Historia natural del raton
El raton, llamado tambien raton casero, raton domestico o raton de laboratorio (Musser G. y cols.
2010) es una especie que se adapta a una gran variedad de condiciones ambientales, desde zonas
frias hasta regiones tropicales. Es un mamifero de sangre caliente, su comportamiento esta
influenciado por feromonas. Su sentido del olfato esta muy desarrollado, su vision es muy pobre
y no pueden percibir los colores. Por su tamano son muy susceptibles a cambios ambientales,
puesto que una variacion de la temperalura entre 2 a 3 °C, puede afectar su temperatura corporal
y modificar su fisiologia. El tamano del raton adulto varia entre 12 a 15cm desde la punta de la
nariz a la punta de la cola, tiene un peso aproximado de 30gr. Las crias al nacer tienen un peso
aproximado de 1 a 2g y ganan peso rapidamente durante la lactancia. Tienen una vida util de 10 a
12 meses y se obtiene de ocho a diez camadas.
El raton es un animal sociable; sin embargo, los machos de algunas cepas muestran
agresividad, por ello es recomendable mantenerlos separados. En la hembras generalmente no
pasa esto, ellas pueden estar agrupadas incluso ya en la edad adulta. La hembra es poliestrica
continua (es decir, que su ciclo ovarico se continua durante todo el ano). Tras el parto, se produce
un estro fertil, por lo que puede utilizarse el estro posparto. Hay que tener en cuenta que la
lactancia y gestacion simultaneas puede retrasar entre ties a cinco dias la implantacion del
embrion. Al nacer, las crias presentan los ojos y oidos cerrados, sin pelo y son muy activos. Al
tercer dia comienza a observarse el desarrollo del pelaje, llegando a cubrirse totalmente desde los
siete a diez dias. A los 12 dias empiezan abrir los ojos y el conducto auditivo externo, entre los
dias 13 y 14 inician a ingerir alimento solido y agua del bebedero. Generalmente se les desteta a
9
los 21 di'as de edad con un peso de aproximadamente 11 a 14 gramos. Cuando no se ha utilizado
el estro posparto, las hembras empiezan a ciclar a los cinco di'as post-destete. El ciclo estral tiene
una duracion de cuatro a cinco di'as, en tanto que el celo dura 12 horas (Musser G. y cols. 2010)
2.2 El raton como animal de laboratorio
Las caracteristicas que han hecho del raton la herramienta mas utilizada en investigacion
cientlfica estan relacionadas principalmente con su tamano, facil manipulacion y su corto ciclo
vital. El raton es el animal mas utilizado en las pruebas de diagnostico, educacion e investigacion
porque es el mamifero que mas conocemos, ya que ningiin otro se ha estudiado tanto, hay datos
que indican que desde mediados del siglo XVII se ha empezado a utilizar en investigacion.
(Mouse Genome Sequencing Consortium Asist T, 2002). Su talla es pequena, son dociles, su
mantenimiento en cautiverio es facil y economico, tiene un gran rendimiento reproductive, entre
otras ventajas que convierten al raton en el modelo ideal en la investigacion.
A1 publicarse el primer mapa detallado del genoma del raton se hallo que al menos el 80%
del ADN de los ratones es identico al de los humanos. De esta manera, el 97% de los animales
geneticamente modificados utilizados en investigacion son ratones. El raton es la linica especie
hasta el momento en la que se ha logrado desarrollar tecnicas de mutagenesis dirigida, las cuales
producen alteraciones heredables en el genoma. (Mouse Genome Sequencing Consortium Asist
T, 2002). Este hecho proporciona a los investigadores una herramienta fundamental para estudiar
el origen genetico de muchas enfermedades y probar nuevos tratamientos.
2.3 Caracteristicas reproductivas del raton
El tiempo de gestacion del raton de laboratorio varia entre 18 a 20 di'as, segun la cepa
utilizada. El tiempo de produccion de una nueva generacion de ratones es de aproximadamente
12 semanas (Olivares, 2011). Para la produccion de ratones en un laboratorio de investigacion es
necesario contar con animales sexualmente maduros, entre 5 a 6 semanas de edad. Los ratones se
pueden seguir reproduciendo durante 7 u 8 meses mas, aunque el niimero de camadas asi como el
numero de crias puede variar segun la cepa. A pesar que el raton por naturaleza es un animal
fertil, no todas las cepas de raton tienen la misma capacidad reproductiva. Mientras que para
algunas cepas el 100% de sus parejas son fertiles, para otras el porcentaje puede disminuir hasta
10
la mitad o menos. Por otra parte, el raton es una especie politoca (ovulacion multiple) y por lo
tanto porta varios fetos en la misma gestacion. El eventual aborto de uno de los fetos no impide la
llegada a termino de los otros; lo que constituye una ventaja evolutiva. (Almeida et al, 2001).
La mayor actividad sexual del raton ocurre durante la noche, la monta varia de 10 minutos
hasta 1 hora, siendo un rasgo especifico de cada cepa. En los ratones el esperma del macho
coagula dentro de la vagina, formando un tapon vaginal, que persiste unas 6 a 12 horas, la
hembra puede ser fecundada solo por un macho. La hembra, se ocupa en forma meticulosa de las
crlas, desde el parto hasta el destete. Apenas nacidas las cri'as, la madre devora la placenta y el
cordon umbilical, lame los pequenos hasta que comiencen a respirar y los coloca en el nido;
luego expulsa el proximo feto, del cual se ocupara con la misma dedicacion. Todo el proceso de
parto puede durar hasta dos horas. Los ratones paren en general entre 4 y 8 crias. (Flavia et al.,
2013).
La lactancia dura entre 19 y 21 dlas y las crias comparten las mamas disponibles de la
hembra. La leche de esos roedores es muy rica en grasas y con porcentajes mas bajos de agua que
la leche de otros mamiferos. A partir del dia 14 de vida, las crias, ya con pelaje completo y los
ojos abiertos, abandonan el nido y comienzan a explorar, mientras la madre y el padre los toman
por la piel del cuello para devoiverlos al nido. Alrededor de los 16 dias de vida, el
amamantamiento se convierte en facultativo y las crias comienzan a alimentarse por si mismas,
ingiriendo alimentos solidos por primera vez. (Almeida et al, 2005??)
11
2.4 Ciclo estral del raton
El ciclo estral del raton puede dividirse en ciclo fases: proestro, estro, metaestro I,
metaestro II y diestro: en los cuales se diferencian por el cambio en la celularidad de cada fase,
ademas que se manifiestan cambios morfologicos en los ovarios, utero, vagina y glandulas
mamarias. La transition de las etapas puede ser monitoreada mediante el uso de citologia de
frotis vaginal (Almeida et al, 2001).
Figura 1. Frotis vaginales tenidos en cada una de las etapas del ciclo reproductivo del raton hembra. (A)
Diestro, gran cantidad de leucocitos y algunas celulas nucleadas. (B) Proestro, poca cantidad de leucocitos y gran
cantidad de celulas nucleadas. (C) Estro, gran cantidad de celulas comificadas, sin leucocitos, pocas celulas
nucleadas. (D) Metaestro, leucocitos, celulas nucleadas y comificadas en igual cantidad. Tincion de Wright. 40x.
(Olivares, 2011)
12
La pared vaginal del raton sufre cambios ci'clicos que corresponden con los cambios del
ciclo del endometrio. (Flavia et al., 2013) estos cambios se hallan bajo la influencia de hormonas
ovaricas. Las fases del ciclo estral pueden identificarse a traves de las celulas descamadas
obtenidas de la vagina. Los cambios en las distintas fases indican que el efecto de los estrogenos
sobre la mucosa vaginal es mucho mas pronunciado que el de la progesterona. Los estrogenos
son responsables de los procesos de: proliferacion, diferenciacion (incremento en el tamano y
cambio de forma de la celula, presencia de precursores de queratina y degeneracion del nucleopicnosis-) y exfoliacion de las celulas. El grado de cambios en el epitelio vaginal y en el frotis
refleja la cantidad de estrogenos circulante (mayor concentracion de estrogenos en proestro y
estro). (Flavia et al., 2013).
2.5 Fases del ciclo estral
2.5.1 Proestro
Esta etapa se caracteriza por un incremento en las capas celulares, division celular activa,
y un predominio de celulas epiteliales nucleada. Estas celulas pueden aparecer en grupos o
individualmente. Algunas celulas cornificadas pueden aparecer en la muestra. Esta etapa
corresponde con el dia previo a la ovulacion, cuando aumenta el estradiol E2 (Walmer et al,
1996) y, en consecuencia, durante la noche, la hormona luteinizante LH y la hormona foliculo
estimulante [FSH] aumentan y ocurre la ovulacion (Parkening et al, 1992); el orificio vaginal
posee un color rojo-rosado, humedo y dilatado.
2.5.2 Estro.
En esta etapa las capas de celulas cornificadas coinienzan a descamarse, se reduce el
niimero de mitosis y no hay presencia de leucocitos, por tanto es claramente caracterizada por
celulas escamosas epiteliales cornificadas, que se producen en grupos, no tienen nucleo visible, y
el citoplasma es granular y de forma irregular. La E2 se mantiene elevada durante toda la manana
y vuelve a niveles basales por la tarde (Walmer et al, 1996); el orificio vaginal se encuentra
dilatado, pero con un color mas claro que en el proestro.
13
2.5.3. Metaestro
En esta etapa, hay una combinacion de tipos celuiares con un predominio de los
leucocitos y algunas celulas nucleadas epiteliales y / o celulas escamosas comificadas epiteliales.
La concentracion plasmatica de E2 es baja (Walmer et al, 1996); el orificio vaginal se encuentra
seco.
2.5.4. Diestro
Representa el retomo al crecimiento activo del epitelio, en la muestra vaginal es posible
observar la presencia de moco. Esta etapa corresponde a un predominio en el numero de
leucocitos. Durante esta etapa, los niveles de E2 empezaran a aumentar (Walmer et al, 1996).
Durante el estro, metaestro y diestro la circulacion plasmatica de LH y FSH son bajos (Parkening
et al., 1992); el orificio vaginal se encuentra contraido, humedo y con un color palido.
2.6. Desarrollo Gestacional
Las hembras de raton, portan en sus ovarios miles de oocitos, que proceden de las celulas
germinales primordiales denominadas ovogonias; estas celulas entran en meiosis y quedan
detenidas en la profase de la primera division meiotica, constituyendo el oocito. El oocito esta
rodeado de una sola capa de celulas planas (pregranulosa); al conjunto se le denomina foliculo
primordial. En su evolucion posterior, la capa de celulas que circunda al oocito sufrira procesos
de diferenciacion y proliferacion, dando lugar a varias capas de celulas ciibicas (granulosa); el
conjunto se denomina foliculo primario. Posteriormente, el foliculo evolucionara hacia los
estadios secundario, terciario y preovulatorio, con la diferenciacion de las capas interna y externa
de las celulas de la teca, la formacion del antrum folicular y los cambios funcionales que
condicionaran su desarrollo hasta el estadio ovulatorio. Momentos antes de la ovulacion, y con la
consiguiente liberacion del oocito, se completa la primera division meiotica, en que se forma el
primer cuerpo polar, y se jnicia inmediatamente despues la segunda division meiotica, que queda
detenida en metafase. Tras la ovulacion, las celulas del foliculo ovarico se luteinizan y el foliculo
se transforma en cuerpo luteo. Los oocitos permanecen viables por 10-15 horas tras la ovulacion
14
y, en el caso de que se produzca fertilizacion, se finaliza la segunda division meiotica, lo que
genera el segundo cuerpo polar. (Tam et al 1992)
2.7 Desarrollo embrionario
El desarrollo embrionario, comienza con la fertilizacion del oocito por el espermatozoide. El
embrion ha ido generando las dos prim eras tineas tisulares, trofoectodermo y endodermo
primitivo, y a partir de ellas, se formaran la placenta y el saco vitelino extraembrionario;
estructuras imprescindibles para la interaccion con la madre. Tras la implantacion, el embrion
tiene 3 lineas tisulares distintas, trofoectodermo, endodermo primitivo y epiblasto o ectodermo
primitivo. Esas celulas estan unidas pero son apolares y, tras la implantacion, se reorganizan
como un epitelio alrededor de una cavidad central (cavidad proamniotica). La gastrulacion
comienza en el dia 6 despues del coito y, en raton, se asocia con una rapida proliferacion de las
celulas del epiblasto, aumentando su numero de unas 120 a -8.000, entre el dia 5.5 y el dia 7.5
post-coito; la gran mayoria de ellas son pluripotentes, es decir, pueden original- cualquier tipo de
tejido. La gastrulacion, por tanto, es un periodo muy importante en el que se ongina el
mesodermo, se produce la elongacion del embrion, y cuando termina (entre los dias 6.5 y 8.5
post-coito) estan ya formadas las tres lineas germinales primarias, el cuerpo basico y los organos
primordiales del futuro raton. En este momento, los somitos estan comenzando a diferenciarse a
cada lado de la notocorda del embrion; y, como cada somito es el origen de un segmento
vertebral y del tejido conjuntivo asociado, daran lugar a la columna vertebral.
El embrion de raton, durante estas fases, esta curvado dorsalmente en forma de "U::
debido a que las lineas germinales inicialmente estan invertidas; es decir, el ectodermo esta en el
interior de la vesicula y el endodermo (que formara el intestino) en el exterior. (Tam et, al 1992)
En este proceso, se curva ventralmente primero, luego gira y se cierra el tubo neural;
posteriormente, aparecen pequenas protuberancias que corresponden a las futuras extremidades y
al primer y segundo arco branquial y, a los 9.5 dias post-coito, adquiere la forma caracteristica de
embrion vertebrado en forma de “C”. Este giro, ademas, es responsable de que el embrion se vea
envuelto completamente por las membranas extraembrionarias. En este estadio ya se puede
observar el pnmordio cardiaco como una estructura globular asimetrica, se establece el
15
mesonefro que dara lugar a los rinones y el intestino aparece bien definido como un divertlculo
que se extiende caudalmente. En el sistema nervioso aparecen grandes cambios en la region
cefalica. La somitogenesis se extiende desde el di'a 8.5 hasta el dia 14.5 de la gestacion (Tam et
al, 1992) formandose 65 pares de somitos con un gradiente de maduracion rostrocaudal. En el dia
10.5 post-coito, se observa la primera evidencia de la formacion y diferenciacion del arco aortico
pulmonar y se pueden reconocer la arteria carotida interna, la arteria aorta dorsal y los vasos
umbilicales. Los miembros posteriores se hacen mas evidentes y comienza la formacion del
lobulo olfatorio, el tercer y cuarto arcos branquiales, la cola y la cresta urogenital; ademas,
comienza la diferenciacion del aparato digestivo y la apertura de la cavidad oral. En el dia 11.5
post-coito, los ojos ya aparecen pigmentados, los lobulos pulmonares comienzan a diferenciarse,
el estomago esta considerablemente dilatado y se comunica el intestino con cordon umbilical. En
el dia 12.5 post-coito, se origina la interdigitacion de los dedos, la formacion del meato acustico y
se cierra la fisura nasomaxilar. Ademas, comienzan a diferenciarse la glandula tiroides, la faringe,
y los primordios pancreaticos; el hlgado ocupa ya un gran espacio en la cavidad abdominal. En el
dia 13.5 post-coito, aparecen follculos pilosos bajo el labio y se forma la pituitaria; las cuatro
camaras cardiacas se evidencian fuera del cuerpo facilmente. Entre los dias 14.5 y 15.5 postcoito, todo el cuerpo tiene follculos pilosos, se fusiona el paladar, finaliza la interdigitacion y se
eleva la cabeza. Entre el dia 15.5 post-coito y el parto (dlas 19.5-21.5), el embrion aumenta mas
de peso y todos los organos van madurando, preparandose para el nacimiento; aunque en el raton,
parte del desarrollo continua despues del parto, ya que las crlas nacen sin pelo y no abren los ojos
hasta pasados unos dlas. Estos estadios han sido minuciosamente estudiados por Theiler (1989),
observando que pueden existir cambios morfologicos del embrion/feto en el transcurso de pocas
horas. Theiler diferencia un total de 27 estadios, desde el dia de la fertilizacion post-coito. Figura
2.
16
Estadios dedesarrollo embrionario del raton
2.8. Metodos para la deteccion temprana de gestacion
El diagnostico precoz de gestacion es de gran importancia para diversos estudios de
investigacion. En la actualidad se han desarrollado diferentes metodos para ello,entre los cuales
se encuentran los metodos indirectos; principalmente la deteccion de hormonas, aunque en el
raton no es factible por el volumen y la frecuencia de extraccion de sangre necesarios, y los
metodos directos, como son las tecnicas de imagen principalmente la ultrasonografia. (Pallares,
2008).
2.8.1 Palpation abdominal:
Este es un metodo tradicional, esta tecnica presenta muchos inconvenientes, principalmente,
no es un metodo que detecte el embarazo temprano ya que se realiza a partir del dia 12 o 13 de
gestacion ademas de estar condicionada por la experiencia del manipulador.
17
/
2.8.2 Ray os X:
Es un metodo poco eficiente ya que es solamente util en el ultimo tercio de la gestacion que
es cuando se empiezan a formar los huesos, ademas que no permite realizar el seguimiento de
gestacion, por que requiere de anestesia e inmovilizacion total del animal al momento de la
exposicion de los rayos (Pallares, 2008).
2.8.3 Tomografia computarizada:
Es una evolucion de los rayos X que produce imagenes detalladas de cortes axiales del cuerpo
mediante haces de rayos X convencionales que se procesan por secciones, el haz de rayos X
incide sobre el objeto que se estudia y parte de la radiacion del haz lo atraviesa. Esta es una
tecnica utilizada en medicina ya que se obtienen cortes transversales a lo largo de una region
concreta o de todo el cuerpo, es muy util para el estudio de canceres; ya que permite la
visualizacion nitida de huesos, estructuras medulares, tejido graso, pero, para el estudio de tejidos
blandos, necesita combinarse con un medio de contraste. Es por este rnotivo que no es un metodo
eficaz para el diagnostico de la gestacion, ademas que durante el proceso se reciben altas dosis de
radiacion ionizante (Brown SD et al 2006).
2.8.4 Tomografia por Emision de Positrones
Esta es una tecnica de imagen no invasiva capaz de rnedir la actividad metabolica de los
diferentes tejidos en tiempo real y mediante una imagen topografica dimensional. Sin embargo,
no resulta util para el diagnostico y seguimiento de gestacion, ya que es necesario anestesiar a los
ratones y esto puede afectar la investigacion. (Brown SD et al 2006).
2.8.5 Ultrasonidos:
Es un procedimiento sencillo, no invasivo en que las observaciones se realizan in vivo y en
tiempo real, esto hace que la tecnica sea una de las mas seguras y confiables para visualizar
estructuras (Pallares, 2008). Presenta como limitante de su alto costo, esto hace que no cualquier
laboratorio de investigacion pueda utilizar este metodo.
18
2.9 Metodos para reproduccion asistidas
2.9.1 Inseminacion artificial.
Esta tecnica no es muy usada en los bioterios para la reproduccion de ratones ya que una de
las principales desventajas en el raton, es el hecho de tener que sacrificar al macho para la
obtencion del esperma. Otra razon historica del poco desarrollo de la inseminacion artificial en
los bioterios es el hecho de que el transporte de ratones entre institutes es muy?? o poco??
accesible. Una razon viable en la que la inseminacion artificial es recomendada en un bioaterio es
cuando existen problemas reproductivos en alguna linea transgenica; por ejemplo, cuando se
quieren cruzar ratones pertenecientes a especies de distinto genero (Jayo et al 1999).
2.9.2 Trasplante de ovarios.
Esta tecnica consiste en la ablacion quirurgica de los ovarios de la hembra y el trasplante de los
mismos dentro de la bolsa ovarica de una hembra receptora. (Jayo et al 1999). Este metodo es
poco utilizado en los laboratories de investigacion, es util para ratones mutantes o transgenicos,
ya que es un metodo de elevado costo, dificil realizacion y muchos animates tienen que ser
sacrificados.
2.9.3 Fertilizacion in vitro.
La fertilizacion in vitro es una tecnologia de reproduccion asistida en la que se fecundan uno
o varios ovulos fuera del organismo materho. Esta tecnica no es muy utilizada en los bioterios
que crian roedores, ya que es una tecnica muy costosa y de dificil realizacion. En particular, los
laboratories de investigacion pueden utilizar esta tecnica con hembras transgenicas de mucho
valor para alguna investigacion que presenten problemas de fertilidad. La probabilidad de
fecundacion es del 40 - 60% de los ovulos, dependiendo de la calidad del esperma, la linea de
origen y la edad del macho donante. Alrededor del 50% de los embriones trasplantados llegan a
termino. El uso de semen congelado es un complemento ideal de esta tecnica, con miras a la
produccion rapida y masiva de distintas cruzas experimentales de ratones (Eddy et al, 1991)
19
2.9.4 Metodo ICSI
El metodo ICSI (del ingles m/racytoplasmic sperm injectionj es una variante de las tecnicas de
fertilizacion asistida, esta tecnica consiste en la inyeccion de un espermatozoide directamente
dentro del citoplasma del ovulo. Es utilizada en el caso de ratones con espermatozoides de baja
calidad o cantidad insuficiente. Se utiliza un sistema de micro manipulation que contiene una
pipeta de sujecion (para sujetar al ovulo) y una aguja de inyeccion. La aguja debe tener un
tamano similar al espermatozoide y se carga con un solo espermatozoide. Luego, se la introduce
atravesando la zona pelucida y el citoplasma del ovulo, donde se inyecta el espermatozoide con el
menor volumen posible de liquido. Si bien su uso esta bastante extendido en medicina humana,
todavla no se ha desarrollado lo suficiente en el raton como para ser incorporada como una
fecnica de uso general. Los reportes en el raton muestran que la tecnica es eficiente solo cuando
se utilizan ovocitos provenientes de hibridos FI y que las combinaciones de esperma y ovocito de
la misma Ifnea consanguinea. A pesar de esto la eficiencia que se obtiene es de aproximadamente
un 5% esto hace que este metodo no sea eficiente para utilizarlo en laboratories de reproduction
de roedores. (Jayo et al 1999)
20
3. JUSTIFICACION
La determinacion temprana del embarazo en el raton y el seguimiento del tiempo de
desarrollo embrionario se realiza mediante metodos indirectos como la presencia de tapon
vaginal, palpacion y observacion del vientre, o mediante metodos directos como la
ultrasonografia. Sin embargo, estos metodos tienen muchas desventajas, la ultrasonografia es
muy costosa y los metodos indirectos son poco confiables. La deteccion oportuna y seguimiento
de la gestacion resulta de gran interes en multiples investigaciones cientificas, ya que facilita la
obtencion de grupos experimentales homogeneos, asi como la obtencion de embriones de una
edad gestacional determinada. La ineficacia en la deteccion de la gestacion y del seguimiento del
desarrollo genera, en muchas ocasiones, la eutanasia innecesaria de muchos ratones hembra. El
presente trabajo propone validar un metodo para incrementar el exito en la fecundacion de las
hembras y en la determinacion del tiempo de desarrollo embrionario del raton BALB/c.
\
21
4. PLANTEAMIENTO EL PROBLEMA
La deteccion de la gestacion en animales de laboratorio, especialmente en roedores, se lleva
a cabo mediante metodos indirectos como la palpacion y la determinacion de la presencia del
tapon vaginal post-coito. La eficiencia en la deteccion del embarazo mediante estos metodos no
es del todo adecuada, presentandose falsos positivos. Como antecedente al presente proyecto, se
llevo a cabo la implementacion de un metodo para la deteccion y seguimiento de la gestacion en
ratones hembra de la cepa BALB/c basado en el registro del peso corporal despues de un periodo
de copulacion de 48 horas (Mader et al., 2009).
Los resultados preliminares de esta
implementacion sugieren fuertemente que el metodo de registro del peso corporal constituye una
alternativa confiable para la expansion de la colonia de ratones BALB/c asi como la produccion
de animales de experimentacion (Olivares, 2011). A pesar de ello, la muestra con la que se llevo
a cabo dicha implementacion fue muy reducida (n=6) por lo que se hace necesaria un mayor
seguimiento de este metodo antes de poder asegurar que este es realmente eficaz como metodo de
deteccion y seguimiento de la gestacion.
22
5. HIPOTESIS
El metodo de registro de peso corporal pos-coito es un instrumento confiable para la
deteccion y seguimiento de la gestacion en ratones de laboratorio.
6. OBJETIVO GENERAL
Validar el metodo de registro de peso corporal post-coito como instrumento para la deteccion y
seguimiento de la gestacion en ratones de laboratorio.
6.1 OBJETIVOS PARTICULARES
•
Determinar el porcentaje de hembras prenadas detectadas con el metodo de registro de
peso.
•
Determinar el porcentaje de hembras sincronizadas en las fases de pro-estro y estro
mediante el metodo de orina de raton macho.
•
Determinar la relacion entre la presencia de tapon vaginal post-coito y el porcentaje de
hembras en gestacion.
23
7. METODO
El proyecto se llevo a cabo en el laboratorio de Neurotoxicologia de la facultad de
Bioanalisis utilizando ratones de la cepa BALB/c sexualmente maduros (6 a 8 semanas de
edad) los cuales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad 12:12 (encendido de luz 11:00
PM) y a una temperatura de 21± 1.0 °C. Los animales tuvieron acceso ad libitum a agua
purificada y a alimento (Rodent Chow, purina) durante el transcurso de todo el experimento.
Las jaulas se limpiaron tres veces por semana.
Para la validation del metodo para la detection de la gestation mediante la determinacion
del peso corporal en ratones de la cepa BALB/c fue necesario seguir las siguientes fases:
j
7
^
Ambtentacion
0
4
^
Sincromzacion
1
2
,____________________14
Cruza
11
20
S e g u i m i e n t o
13
27
33
Duration
por fase
(Dias)
Dias
totales
Figura 3: Esquema del protocolo para la produccion de embriones. El protocolo consta de 4 fases: A)
Ambientacion, las hembras se colocan en jaulas sin el macho durante 7 dlas. B) Sincronizacion. las hembras se
exponen a viruta impregnada con orina de macho durante 4 dlas. C) Cruza, dos hembras se colocan en la jaula de
un macho (previamente ambientado) durante 48 horas. D) Seguimiento, las hembras son pesadas al lermino de la
fase de cruza durante 14 dlas o bien hasta el alumbramiento(01ivares, 2011).
7.1 AMBIENTACION
Previo al inicio de la cruza, los roedores se aislaron en dos grupos:
1. Ratones hembra. Un par de hembras sexualmente maduras se colocaron en una caja de
policarbonato de 47x33x19cm, por siete dias.
2. Ratones machos. Un raton macho se aislo en una caja de policarbonato de 47x33x19cm, por
siete dias. El aislamiento empezo 4 dias despues del inicio de la ambientacion en las hembras.
24
Se realizo limpieza de las cajas y cambio de viruta 3 veces por semana.
7.2 Sincronizacion.
Para los experimentos de sincronizacion, las hembras sexualmente maduras fueron expuestas
a viruta impregnada con orina del macho durante cinco dias. La eficacia de la sincronizacion se
corroboro mediante la realizacion de frotis vaginales que permiten observar los cambios
citologicos debido a la entrada del ciclo estral.
7.3 Identification de las etapas del ciclo estral.
Con el objeto de confirmar la sincronizacion del ciclo de las hembras y la entrada al ciclo
estral, se realizo un frotis vaginal que se tino con colorante de Wright (Clark,? George. 1981).
Para la realizacion del frotis, se utilizo la tecnica de frotis vaginal con hisopo de algodon
(Olivares, 2011), la muestra de exudado vaginal se recolecto por las mananas (9:00 horas.). Con
el hisopo se realizo un frotis el cual se tino con colorante de Wright. La observation microscopica
k
se realizo con el objetivo de 40x.
7.3.1 Tecnica de frotis vaginal con hisopo de algodon
Este metodo consiste en introducir un hisopo de algodon humedecido en solucion salina en la
vagina del raton, suavemente se frota en las paredes y la secretion obtenida se transfiere a un
portaobjetos de vidrio. Es el metodo mas facil para la obtencion de muestras vaginales, los frotis
conservan su aspecto original por largo tiempo. Los hisopos adecuados para la muestra consisten
en palos de madera con pequenas puntas de algodon (aproximadamente 5mm de ancho y 12 mm
de largo). La punta del algodon se humedece ligeramente por inmersion en un frasco de solucion
salina. El raton se sostiene alrededor del torax con la cara ventral hacia arriba, proporcionando
apoyo lumbar. Se sujeta el hisopo del palillo permitiendo un maximo control y agarre, ademas
con la misma mano agarrar suavemente la cola permitiendo un mejor apoyo y minimizando el
movimiento del raton. Se inserta la punta del hisopo cuidadosamente en la vagina del raton
hembra aproximadamente 1.0 cm, con una accion giratoria del hisopo, procurando tener el cuerpo
del animal a 45°: La accion giratoria del hisopo es continua en la misma direccion hasta que se
25
retira, con el fin de lograr una sola accion de adentro y hacia afuera, de modo que cualquier
estimulacion cervical sea minima e insuficiente para inducir una respuesta de pseudoprenes. La
buena habilidad en el manejo de los animales es importante ya que el animal lucha y puede
moverse, lo que no es deseable en terminos de bienestar. El hisopo debe introducirse
horizontalmente para garantizar que las celulas de toda la longitud de la vagina se transfieran. La
punta del hisopo se frota sobre un portaobjetos de vidrio limpio pre-etiquetado con el numero
correspondiente al animal. El hisopo se descarta por cada animal. Los portaobjetos se pre-marcan
utilizando un marcador permanente con el numero de estudio, el numero del animal y la fecha, y
se coloca en una bandeja. Hasta 5 extensiones se pueden colocar en un portaobjetos. Para un
grupo de animales es conveniente tener un portaobjetos por jaula de 4 o 5 hembras. Es importante
evitar demasiado liquido en el portaobjetos (generalmente como resultado de demasiada presion
al rodar el hispo en el portaobjetos) y evitar la contaminacion con la orina, estos factores pueden
enmascarar las celulas y hacer que la lectura sea dificil. (Olivares 2011)
7.4 Cruzamiento.
Al termino de este periodo, las hembras se transfieren a la jaula de un macho. El periodo de
cruzamiento es de 48 horas. A partir de las 24 horas las hembras se revisan para evaluar la
presencia del tapon rnucoso durante las mananas (9:00 am). 7.5 Detection del embarazo
Las hembras fueron pesadas diariamente despues de haber
retirado al macho. La confirmation del embarazo se realizo mediante el registro del aumento de
peso post-coito.7.6 Evaluacion de los indices de sincronizacion.
Indice de hembras sincronizadas en las fases de pro-estro= (numero de hembras en periodo proestro/numero total de hembras x 100%).
Indice de hembras sincronizadas en las fases de estro= (numero de hembras en periodo
estro/niimero total de hembras x 100%).
7.7 Evaluacion de indices de embarazo.
- Indice embarazos= (numero de hembras gestantes/numero total de hembras x 100%)
26
- Indice de presencia de tapon mucoso—(numero de hembras con tapon mucoso/numero total de
hembras x 100%).
- Indice de hembras gestantes con tapon mucoso= (numero de hembras gestantes con tapon
mucoso/numero total de hembras x 100%).
- Cambio Relativo del Peso corporal (peso inicial -peso final)
7.8 Analisis estadi'stico.
Los datos se presentan como media y desviacion estandar (x ± DS). Para el analisis de los datos
se utilizo una ANOVA de dos vi'as de medidas repetidas con datos ranqueados. Se determine un ,
nivel de significancia de p< 0.05
27
8. RESULTADOS
8.1 LA SINCRONIZACION DEL CICLO ESTRAL Y LA EFICACIA DEL EFECTO
WITTEN
Se sincronizaron 26 hembras, estas fueron expuestas a viruta impregnada con orina de
macho (efecto Whitten) para sincronizar sus respectivos ciclos reproductivos. Doce hembras no
fueron expuestas a viruta impregnada con orina de macho. A1 quinto dia se les realizo citologia a
las 38 hembras, sincronizadas y no sincronizadas. La citologia vaginal de las hembras
sincronizadas demostro una transition del ciclo hacia el estro, al contrario de las hembras no
sincronizadas. (Figura 4)
^ S in c r o n iz a d a s
CSS No sin cro n iza d as
</>
'r e
**
c
o
o
o
Ql
Diestro
Proestro Estro
Etapas
Metaestro
FIGURA 4: Frecuencias de las fases del ciclo estral en hembras de la cepa BALB/c. Veintiseis hembras fueron
sincronizadas exponiendolas a viruta impregnada con orina de macho, durante cinco dias. Al final de la
sincronizacion el 56 % de ellas estuvieron en fase estro, el 8% en proestro, un 24% estuvieron en la fase de diestro y
un 12% en metaestro. Las 12 hembras no sincronizadas presentaron un 25% en cada etapa del ciclo.
28
8.2 DETECCION DEL EMBARAZO
8.2.1 SEGUIMIENTO DEL PESO CORPORAL POST-COITO
El registro del peso posterior a la cruza revelo que a partir del septimo dla las hembras gestantes
tienen un aumento gradual del peso;mientras que en las hembras no gestantes el peso se mantiene
constante. (Figura 5).
GESTANTES
NO GESTANTES
FIGURA 5: Seguimiento del peso post-coito registro durante 14 dias de seguimiento en ratones BALB/c. En
este grefico se muestra el registro de peso corporal diario. El grupo de gestantes muestra un incremento en los pesos
desde el dia 4 mientras que el grupo de las no gestantes no no presentan incremento. Se encontraron diferencias
estadisticamente significativas a partir del cuarto dia entre ambos grupos p<0.005.
La diferencia de peso por dia resulto ser un parametro mas significativo que el aumento
absoluto de peso por dia. A partir del 7° dia se observa un incremento exponencial en el peso de
las hembras consideradas gestantes. A1 10° dia, la diferencia de peso fue mas notoria y para el
14° dia esta fue evidente. Y esto se ve mas reflejado aun en la ganancia de peso (figura 4)
29
Data 1
GESTANTES
NOGESTANTES
FIGURA 6. Diferencia de peso corporal post-cruza en ratones hembra BALB/c. Se muestra una diferencia
signiflcativa desde el septimo dla en el grupo de las hembras gestantes (p<0.001), contrario al grupo de no
gestantes que no mostraron diferencias significativas de pesos.
®
gestantes
E53 no gestantes
30
FIGURA 7. Ganancia de peso corporal post-coito en ratones hembras de la cepa BALB/c. El grupo de las
hembras gestantes (azul), muestra una clara ganancia del peso corporal de un promedio de 6.3 g ± 0.2. Estas
hembras ganaron peso a medida que avanzaba la gestacion mientras que el grupo de los ratones no gestantes a
penas y presento una ganancia de peso de 0.42g ± 0.4
8.3 INDICES DE GESTACION Y SINCRONIZACION
Los datos de los indices de gestacion y sincronizacion calculados se resumen en las
siguientes cuadros.
INDICE DE GESTACION
(HEMBRAS SINCRONIZADAS)
n=26
INDICES
Embarazos
Tapon vaginal
Embarazo y tapon vaginal
Hembras que estuvieron en estro
Hhembras que estuvieron en pro-estro
Hembras en estro prefiadas
Hembras en pro-estro prefiadas
n
18
11
8
14
3
14
4
INDICE DE GESTACION
(HEMBRAS NO SINCRONIZADAS)
n= 12
n
%
25.00
3
33.33
4
41.66
3
INDICES
Embarazo
Tapon vagjnal
Embarazo y tapon vaginal
31
%
69.23
42.30
30.02
56.00
12.00
100
100
8.4 Registro de ratones machos.
El registro de los machos que fueron utilizados en este trabajo se rosumen en el siguiente cuadro.
N uum ero
de m acho
C ruzas
efectivas
M 1
15
6
M2
12
M3
C ruzas no
F ecu nd id ad (°/l 0
efectivas
Edad
(m eses)
Total de
cruzas
71.42
2
21
8
60.00
2
20
17
6
73.91
2
23
M4
9
4
69.23
2
13
X±DS
13.25 ±3.5
6± 1.6
68.64 ±6.06
32
19.25±4.3
9. DISCUSION
Los resultados del presente trabajo confirman que el metodo para la deteccion temprana de la
gestacion en ratones de la cepa BALB/c es un metodo confiable y un excelente indicador de
gestacion y desarrollo como se habia reportado inicialmente (Olivares, 2011). Es importante
resaltar que la citologia vaginal despues de la fase de sincronizacion es un elemento importante
para la eficacia de este metodo, ya que nos permite identificar la fase fertil de la hembra
aumentando las posibilidades de fecundacion. Anteriormente lllader y colaboradores (2009)
reportaron que la sincronizacion de las hembras y el peso poit coito fue una variable mas
confiable de confirmacion del embarazo que la presencia del tajon mucoso post coito, en este
estudio no se realizo citologia vaginal despues de la sincronizacion. Existe, sin embargo nueva
informacion generada en nuestro trabajo que es importante resaltac Rutinariamente se sugieren 4
dias de sincronizacion sin evaluacion de citologia vaginal (Olivares, 2011), al quinto dia se
realiza una citologia vaginal para determinar la fase fertil en la que se encuentra la hembra
Nuestros resultados demostraron que la llegada a las fases de pioestro y estro en las hembras
varia desde 3 a 5 dias.
La sincronizacion del ciclo estral de las hembras puede inducirse mediante la administracion
de gonadotropina de suero de yegua prenada o gonadotropina corionica humana (Pritchett et al,
2007). Del mismo modo, el estro puede inducirse mediante la exposition de las hembras a orina
de raton (Witthen,1986). Este ultimo metodo fue el que utilizamos en nuestro estudio. En las
hembras que fueron expuestas a orina de raton (n=26) el 56 % de ellas Uegaron al estro y un 12%
llegaron al proestro. En las hembras que no fueron sincronizadas (n=12) se observo que estas
tenian solo el 25% de probabilidad de llegar al estro. Un factor que se debe tomar en cuenta, es la
frecuencia en la que se realiza el exudado vaginal para evitar el fenomeno de pseudo-prenez.
(Tekel, 1988). La pseudo-prenez se refiere a un estado en el cual el utero sufre una reaction
desidual en respuesta a un trauma uterino puede ser inducida coitalmente o por estimulacion
mecanica del cerviz uterino. La pseudo-prenez puede ser determinada observando la presencia de
diestro permanentemente por examination de exudado vaginal durante 13 y 14 dias despues de la
estimulacion cervical. (Tekel, 1988). Por otra parte, la variation en el tiempo de sincronizacion
hacia el estro se puede deber a variaciones en la cantidad de ferominas presentes en la viruta con
orina de macho (efecto Whitten). Del mismo modo, los factores ambientales pueden producir
33
variaciones en el desarrollo normal de los ciclos, estos factores como horas de luz, temperatura y
humedad ambiental producen variaciones en las concentraciones lie estradiol circulante (Jayo et
al 1999). Nuestros resultados demuestran que la sincronizacion de las hembras aumentan las
probabilidades de entrada al estro, esto resalta la importancia de a citologia vaginal despues de
la sincronizacion ya que resulta indispensable para asegurar el cruzamiento con hembras
receptivas.
Para nuestro trabajo utilizamos como parametros indicatives de gestacion la diferencia y la
ganancia de peso, las graficas de diferencia de peso demuestran que a partir del septimo dia es
posible identificar aquellos animales que inician con un aumento de su peso corporal, mientras
que las graficas de ganancia de peso nos indican que la hemfra prenada llega a ganar un
promedio de 6.55 g a diferencia de las no gestantes que tienen un oromedio de ganancia de peso
de 0.42 g. Finalmente, es importante senalar que la presencia del tapon vaginal no se relaciona
con el exito de la cruza. La presencia del tapon vaginal dentro de las primeras 24 horas se ha
considerado como un indicador del inicio de la fecundacion, aunque en realidad solo indica la
. realizacion de la copula. En nuestro estudio, encontramos tapon vaginal en el 23.68% del total de
hembras y solo el 18.42% en las hembras gestantes.
Otro aspecto que debemos tomar en cuanta al analizar el porcentaje de fecundacion se
relaciona con los antecedentes del macho que se ocupa para la cruza debiendo ser animales
sexualmente experimentados ya que se ha reportado que machos jo yenes y poco experimentados
tienen un bajo rendimiento y bajas posibilidades de embarazar a 1is hembras. En nuestro caso,
contamos con 4 machos los cuales tenian dos meses de edad al memento de las cruzas? Asi, el
macho #1 realizo un total de 21 cruzas de las cuales 15 fueron ifectivas y 6 no efectivas, el
macho #2 realizo 20 cruzas, 12 cruzas efectivas, 8 no efectivas; el Lacho #3 tuvo 23 cruzas, 17
efectivas y 6 no efectivas; finalmente, el macho # 4 solo se cruzd 13 veces teniendo 9 cruzas
efectivas y 4 no efectivas. Es de gran importancia tener un registro de las caracteristicas de los
machos utilizados ya que la productividad puede estar influenciada por estas.
Hoy en dia existen otros metodos que pueden detectar el embanzo como la ultrasonografia o
palpacion abdominal (Pallares, 2008). Sin embargo, estos metodos tienen varias desventajas
como el tiempo de evaluacion, el equipo necesario y su costo. En uiestro trabajo se determino
34
que el registro post-coito del peso de las hembras previamente sincronizadas a la fase estral este
un metodo viable en la deteccion de embarazo ya que requiere de bajos costos, conocimientos
tecnicos generales y poco material y equipo.
10. CONCLUCIONES:
1. El registro de peso post-coito es un indicador confiable de determinacion de gestacion
temprana asi como un parametro de seguimiento del desarrollo embrionario.
2. La sincronizacion y la citologia vaginal en las hembras aumenta las posibiIidades de
fecundacion.
3. El metodo de deteccion temprana de la gestacion en la ratones de la cepa BALB/c es
efectivo para detectar embarazo temprano.
35
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