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UNIVERSIDAD RICARDO PALMA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INFLUENCIA DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA
FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA p70 DE Leishmania
peruviana (Kinetoplastida: Tripanosomatidae).
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADA
EN BIOLOGÍA
Rafaela Elías Letts.
Lima – Perú
2007
MIEMBROS DEL JURADO QUE APROBÓ LA TESIS
______________________
Dra. LIDIA CRUZ NEYRA
PRESIDENTE
_______________________
Dr. FRED GARCÍA ALAYO
MIEMBRO
________________________
Blgo. ENZIO FOY VALENCIA
MIEMBRO
ASESOR DE TESIS
____________________________
Dr. HUGO GONZALES FIGUEROA
ÍNDICE.
Resumen
3
Summary
5
I. INTRODUCCIÓN.
7
II. ANTECEDENTES.
8
1. Leishmania
8
1.1 Adhesión Leishmania-macrófago
9
1.2 Entrada de Leishmania al macrófago
10
1.3 Supervivencia dentro del macrófago
11
1.4 Diferenciación intracelular de Leishmania
12
1.5 Multiplicación intracelular de Leishmania
14
1.6 Clasificación
15
2. Fosforilación de proteínas
15
2.1 Proteína quinasas
16
2.1.1 El dominio catalítico
16
2.2 Fosfoproteína fosfatasas
18
2.2.1 Fosfoproteína Serina/Treonina fosfatasas
19
3. Fosforilación de proteínas en Leishmania
21
III. MATERIALES Y MÉTODOS.
26
3.1. MATERIALES.
26
Reactivos
26
Instrumentos
28
3.2. MÉTODOS.
29
1. Caracterización parcial de la fosfoproteína p70
29
1.1. Preparación de material biológico
Leishmania peruviana (cepa Hb22)
29
Cultivo de mantenimiento
29
Determinación de la curva de crecimiento
29
Cultivo en masa de promastigotes
29
1.2. Generación de amastigote-semejante mediante variación
de pH y temperatura
1.3. Determinación del peso molecular
30
30
1.4. Influencia del pH y temperatura sobre la
fosforilación de p70
30
1.5. Detección de diferentes residuos fosforilados en p70
31
Lisis de Parásitos
31
Cuantificación de proteínas
31
Electroforesis, Transferencia e inmunodetección
32
1.6. Determinación de la fosforilación o
expresión diferencial de p70
32
1.7. Purificación de la fosfoproteína p70 mediante electroelusión
33
1.8. Isoelectroenfoque
33
IV. RESULTADOS.
35
1. Caracterización parcial de p70
35
1.1. Determinación del peso molecular (MW)
35
1.2.
Influencia del pH y temperatura sobre la
fosforilación de p70
36
1.3. Determinación de residuos fosforilados en p70
37
1.4. Determinación de la fosforilación o expresión
diferencial de p70
37
1.5. Isoelectroenfoque y determinación
del punto isoelectrico de p70
38
V. DISCUSIÓN.
CONCLUSIONES.
39
41
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
42
VIII. ANEXOS.
49
Apéndice
49
Abreviaturas
53
RESUMEN.
VI.
La Leishmaniosis es una enfermedad causada por especies del genero
Leishmania. Los estadios de desarrollo del parásito se presentan como
amastigote en el hospedero vertebrado y promastigote en el hospedero
invertebrado. La enfermedad es causada por la multiplicación de los
amastigotes dentro de los macrófagos, donde sufren cambios bioquímicos y
morfológicos en respuesta a señales extracelulares. Aunque la fosforilación de
proteínas juega un rol importante en muchos procesos celulares en
eucariontes, y es un evento principal en las rutas de transmisión de señales, se
conoce poco acerca de este proceso durante la diferenciación celular de
Leishmania peruviana.
Debido a la dificultad para obtener amastigotes puros y libres de proteínas no
propias del parásito que puedan dar un falso positivo, se generaron en
laboratorio lo que llamaremos amastigotes-like, estos parásitos son obtenidos
por pasajes de promastigotes en un medio M-199, 20% Suero Fetal Bovino
(FBS) a pH 7 e incubados a 28 °C a un medio M-199, 20% FBS a pH 5 y 37 °C
el cambio en estos dos factores inducen a la transformación del estadio
promastigote en un estadio semejante al amastigote que cuenta con las
características bioquímicas y moleculares para ser validado como un buen
modelo de estudio.
En trabajos previos se establecieron los patrones de fosforilación incubando
con [32 P]ATP los extractos de proteínas totales de el estadio promastigote
como para el estadio amastigote-semejante de la cepa Hb22 de L. peruviana.
Las proteínas totales fueron separadas por SDS-PAGE, transferidas a PVDF y
sometidas a autoradiografía para detectar actividad de proteína quinasa así
como parásitos intactos y lisados fueron fosforilados con ATP frío y las
proteínas resueltas por SDS-PAGE, transferidas a PVDF e inmunodetectadas
con anticuerpos antifosfoaminoácidos.
La inmunodetección reveló una proteína de 70 kDa fuertemente fosforilada en
residuos de Treonina presente únicamente en “amastigotes-like” la cual fue
caracterizada en base a su afinidad por otros anticuerpos afines a residuos
fosforilados, asimismo se determinó la fosforilación diferencial de esta proteína
descartando una ausencia en la señal de fosforilación debido a una expresión
diferencial de p70.
SUMMARY.
Leishmaniosis is a disease caused by species from the Leishmania gender. The
parasite`s different stages of development are known as amastigote when in the
vertebrate host and promastigote when in hte invertebrate host. Sickness
developes from the multiplication of amatigotes within the macrophages, where
they undergo biochemical and morphological changes in reply to extracellular
signals. Even though protein phosphorilation plays an important role in many
cellular process en eucarionts, and is a main event in the routes for the
transmission of signals, little is known about this process during the cellular
diferentiation of Leishmania peruviana.
Due to the difficulty in obtaining pure amastigotes, free of proteins not proper to
the parasite which could give a false positive, what we could call amastigotesemejante parasites where developed in laboratory.
These parasites were
obtained passing promastigotes in a media M-199, 20% Sheep Fetal Serum
(FBS) at pH 7 and incubated at 28 °C in a media M-199, 20% FBS at pH 5 and
37 °C. The change in these two factors promote the transformation from the
promastigote stage to one similar to the amastigote, which has the biochemical
and molecular characteristics to be validated as a good model for study.
Previous documents have established the phosphorilation patterns incubating
with [32 P]ATP the extracts of total proteins from the promastigote stage as
well as for the amastigote-semejante stage of the Hb22 variety of L. peruviana.
Total proteins were separated by SDS-PAGE, transfered to PVDF and undergo
a selfradiography to detect activity of kinase proteins as well as phosphorilating
intact and damaged parasites by cold ATP and proteins resolved by SDSPAGE, transfered to
PVDF and immunedeted by antiphosphoaminoacid
antibodies.
Inmunodetection revealed a 70 kDa strongly phosphorilated protein in treonine
residues present only in “amastigote-semejante” parasites, which was
characterized based on its afinity with other antibodies familiar with
phosphorilated residues. At the same time a differential phosphorilation of this
protein was determined so the abscence of a phosphorilation signal due to the
diferential expression of p70 could be disregarded.
I. INTRODUCCIÓN.
Leishmania peruviana (Kinetoplastida: Tripanosomatidae) es el protozoario
parásito causante de la enfermedad humana conocida como Leishmaniosis
andina “Uta”, una de las principales enfermedades parasitarias en nuestro país
(Pérez et al., 1991; Pérez et al., 1994; Grimaldi y Tesh, 1993). L. peruviana
presenta dos estadíos de desarrollo: promastigotes o células móviles con
flagelo, en el tracto digestivo del insecto vector Lutzomyia peruensis, y
amastigotes (células no móviles y sin flagelo) dentro de los macrófagos del
hospedero vertebrado; donde los parásitos sufren profundos cambios a niveles
morfológico, antigénico y molecular que son necesarios para la transición
desde una vida extracelular hacia una intracelular, y deben ser el resultado de
cambios programados en la expresión génica en respuesta a distintas señales
en el ambiente externo del parásito (Chang, 1987; Dell y Engel, 1994).
La fosforilación y desfosforilación de proteínas es la principal modificación posttraduccional usada por las células eucariontes para controlar la actividad de
sus proteínas. La importancia de la fosforilación y desfosforilación de proteínas
en
el
control
del
ciclo
celular,
desarrollo,
diferenciación,
regulación
transcripcional y activación de linfocitos, entre otros procesos, ha sido
ampliamente demostrada, así como su participación en cascadas de
señalización que trazan las rutas de los efectos de estímulos extracelulares
desde la membrana externa hasta el núcleo de la célula. (Hunter, 1995; Hunter,
1991; Hanks y Hunter, 1995).
El presente trabajo viene a ser la primera aproximación al estudio de la
fosfoproteína estadío-específica p70 de Leishmania peruviana, y permitirá
mediante su purificación y evaluación de sus características frente a
variaciones de pH y temperatura, determinar el probable rol que ésta juega en
la diferenciación celular del parásito.
II. ANTECEDENTES.
1.
Leishmania.
Las
especies
de
Leishmania
(Kinetoplastida:
Tripanosomatidae)
son
protozoarios parásitos del hombre y animales transmitidos por la picadura de
mosquitos hematófagos hembras de Phlebotomus spp. en el viejo mundo, y
Lutzomyia spp. en el nuevo mundo. Leishmania presenta dos estadíos de
desarrollo en su ciclo de vida: promastigote en el hospedero invertebrado y
amastigote en el hospedero vertebrado (Pérez et al., 1991; Pérez et al.,1994;
Grimaldi y Tesh, 1993).
En el tracto digestivo del insecto vector los parásitos viven extracelularmente
bajo la forma de promastigotes móviles (o células con un flagelo en el extremo
anterior); los cuales, después de ser inoculados dentro de la piel del hospedero
vertebrado, pueden infectar macrófagos y transformarse en amastigotes
intracelulares no móviles. La multiplicación subsecuente de los amastigotes
conlleva a la lisis de los macrófagos y liberación de parásitos (que infectan a
nuevos macrófagos), resultando en una enfermedad crónica llamada
Leishmaniosis. La enfermedad puede ser cutánea, mucocutánea o visceral
dependiendo de la virulencia de las especies y cepas de Leishmania y de la
respuesta inmune del hospedero. (Chang, 1987; Soulsby, 1987; Glew et al.,
1988).
El establecimiento del parasitismo intracelular de los macrófagos sigue
múltiples pasos de interacciones celulares hospedero-parásito. Los eventos
secuenciales de tales interacciones son: (1) adhesión Leishmania-macrófago;
(2) entrada de parásitos al macrófago; (3) supervivencia del parásito dentro del
macrófago; (4) diferenciación intracelular de Leishmania, de promastigote a
amastigote; y (5) multiplicación intracelular del parásito. Esta secuencia
precede todos los síntomas clínicos y consecuencias patológicas (Chang y
Fong, 1993; Chang, 1987).
Las interacciones moleculares en la interfaz célula hospedera - parásito son
cruciales para que se produzca la infección por Leishmania; los estudios en
sistemas Leishmania-macrófago in vitro indican que las interacciones entre las
membrana plasmáticas de ambas células inician muchos eventos celulares
subsecuentes. Al entrar al macrófago, los parásitos sufren profundos cambios
en su membrana plasmática a niveles morfológico, antigénico y molecular; la
mayoría de estos cambios probablemente reflejan pasos necesarios para la
transición desde una vida extracelular hacia una intracelular, y deben ser el
resultado de cambios programados en la expresión génica en respuesta a
distintas señales en el ambiente externo del parásito. La supervivencia en el
lisosoma del macrófago puede deberse a ciertas estructuras intrínsecas y a
propiedades dinámicas de la membrana celular de Leishmania (Chang y Fong,
1983; Chang, 1987; Dell y Engel, 1994).
1.1.
Adhesión Leishmania-Macrófago.
La adhesión es el requisito previo para el ingreso de Leishmania al macrófago,
y debe ocurrir para ambos estadíos de desarrollo del parásito: para los
promastigotes, inoculados por el insecto vector dentro de la piel del hospedero
vertebrado, en la infección primaria; y para los amastigotes, liberados de
macrófagos fuertemente parasitados, en la infección subsecuente (Chang
1987, Bogdan et al., 1990).
Leishmania tiene una fuerte predisposición para adherirse más ávidamente a
los macrófagos que a otras células como fibroblastos y linfocitos. La unión
sigue una cinética de saturación y puede ser bloqueada por ligandos de bajo
peso molecular (moléculas purificadas de la superficie del parásito) y por
anticuerpos específicos contra receptores del macrófago o contra moléculas de
la membrana celular de Leishmania, por lo que debe estar mediada por
interacciones de tipo ligando-receptor (Moll et al., 1989; Chang, 1987).
En la superficie de la membrana plasmática de Leishmania se han encontrado
varias moléculas antigénicas y varias enzimas. Dos moléculas: gp63 y LPG,
son las que han sido mejor caracterizadas en la superficie del parásito, y se ha
demostrado que median la adhesión y entrada de Leishmania al macrófago. La
glicoproteína gp63, es una proteasa que ayuda a la fijación del complemento:
adsorción de C3 y su conversión en C3b y C3bi, incrementando la fagocitosis.
El lipofosfoglicano (LPG) es otra molécula de superficie de membrana del
parásito que puede ser reconocida por receptores en los macrófagos (Russell,
1987; Bodgan et al., 1990).
1.2.
Entrada de Leishmania al macrófago.
Una vez que los parásitos se han unido a la membrana plasmática de la célula
hospedera deben ingresar para lograr el parasitismo intracelular. La actividad
fagocítica de los macrófagos juega un papel importante en este ingreso. El
anclaje de los parásitos a la membrana del macrófago dispara la fagocitosis por
mecanismos que involucran una unión secuencial de moléculas en las
superficies de ambas células, semejante a una cremallera, en un proceso que
requiere gasto de energía por parte del macrófago y participación de elementos
citocinéticos como la Actina (Chang, 1987).
1.3.
Supervivencia dentro del macrófago.
Después de la entrada al macrófago los parásitos se localizan dentro del
fagolisosoma, en donde sobreviven en un medio ambiente hostil, ya que los
macrófagos experimentan un fenómeno llamado explosión respiratoria, que
involucra un alto consumo de oxígeno y generación de metabolitos oxidativos
como peroxido de hidrógeno, radicales hidroxilo, y moléculas de oxígeno
desapareado (Bodgan et al., 1990).
Una vez localizados intracelularmente, los parásitos pueden sobrevivir gracias
a la acción de mecanismos de evasión de la respuesta inmune, haciendo que
los sistemas de defensa del macrófago disminuyan. Varias moléculas están
implicadas en esta evasión de la respuesta inmune; por ejemplo, se ha
encontrado una fosfatasa ácida de superficie en L. donovani que es capaz de
bloquear la producción de radicales libres de oxígeno en fagocitos; la actividad
de esta enzima se relaciona con la virulencia del parásito, ya que en clonas
virulentas se ha encontrado dos veces más actividad que en clonas no
virulentas (Glew et al., 1988).
La neutralización y eliminación de metabolitos oxidativos tóxicos producidos por
el macrófago constituye otro mecanismo de supervivencia dentro del
macrófago. Los amastigotes de L. donovani muestran una alta actividad de
enzimas como glutationa peroxidasa, superoxido dismutasa y catalasa, cuyos
substratos (que degradan) son metabolitos tóxicos producidos por los
macrófagos (Pearson et al., 1991; Bodgan et al., 1990). Así mismo, se ha
demostrado que el lipofosfoglicano (LPG) tiene una función protectora contra
radicales hidroxilo (Chan et al., 1989).
La proteasa gp63 juega un papel importante dentro del fagolisosoma. Su
actividad proteolítica con un pH óptimo de 4 inactiva a las enzimas proteolíticas
del macrófago y protege al parásito de degradación lisosomal. La observación
de que las cepas virulentas presentan dos a tres veces más actividad de gp63
que las cepas no virulentas ilustra la importancia de esta proteína en la
supervivencia del parásito dentro del macrófago (Kweider et al., 1987; Bodgan
et al., 1990).
1.4.
Diferenciación intracelular de Leishmania.
Profundos cambios morfológicos y bioquímicos ocurren durante el proceso de
diferenciación celular de Leishmania. La diferenciación de promastigote a
amastigote involucra cambios como la regresión del flagelo, el acortamiento en
longitud, la reducción en el número de microtúbulos y organelos y una
reducción en las actividades metabólicas, que podrían representar un
fenómeno de “atenuación” biológica; sin embargo este concepto parecer ser
erróneo ya que también se ha observado un incremento en la síntesis de
nucleótidos cíclicos, de enzimas del metabolismo de nucleósidos, de enzimas
que participan en la biosíntesis de ácidos grasos y colesterol, de moléculas
antigénicas de superficie y proteínas de choque térmico (Chang, 1987; Dell y
Engel, 1994; Glew et al., 1988). Los análisis de ADN genómico y ADN del
kinetoplasto han demostrado que existe una expresión diferencial de genes
durante la transición de promastigote a amastigote (Chang, 1987).
En el fagolisosoma, Leishmania se diferencia de promastigote a amastigote,
una adaptación necesaria para su supervivencia durante la transición desde
una vida extracelular a una intracelular. Algunas veces los parásitos se
diferencian hacia una forma similar a amastigote en fibroblastos, lo que sugiere
que la diferenciación celular no es dependiente de la activación de enzimas
fagolisosomales del macrófago (Chang 1987).
Se ha demostrado la actividad de cisteino proteinasas en la diferenciación
celular in vivo (dentro de macrófagos) de L. amazonensis, la cual se detecta
después del tercer día de la infección de macrófagos (Galvao-Quintao et al.,
1990). Mediante experimentos de Northern y Western Blot, se ha demostrado
que una metaloproteasa de superficie de L. major presenta una expresión
diferencial entre promastigotes y amastigotes, encontrándose que los
amastigotes presentan sólo el 1 % de actividad con respecto a los
promastigotes (Schneider et al., 1992).
La temperatura es un factor importante en la diferenciación celular de
Leishmania, ya sea in vivo como in vitro. Se han observado cambios en la
fosforilación extracelular de proteínas (substratos exógenos) durante la
transformación por choque térmico en L. major y L. mexicana, las cuales
difieren en su capacidad de diferenciación celular de promastigotes a
amastigotes-semejantes cuando se les somete a choque térmico (Hermoso et
al., 1994).
Otro factor importante en la diferenciación celular es el pH. Dentro del
fagolisosoma, los parásitos sufren un estrés de pH ácido, el cual se ha
demostrado que induce la fosforilación de proteínas en residuos de Tirosina en
L. pifanoi; fosforilación que se revierte cuando se neutraliza el pH del medio
(Rivero-Lezcano et al., 1997).
Desde el año 1996 en el Laboratorio de Biología Molecular y Bioquímica del
Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt” Universidad Peruana
Cayetano Heredia. Se ha desarrollado un modelo de diferenciación celular in
vitro basado en someter un cultivo de promastigotes a cambios de temperatura
y pH simulando las condiciones que el parásito encuentra dentro de la vacuola
fagolisosomal de los macrófagos. El modelo ha permitido obtener parásitos en
una forma celular no móvil y sin flagelo, y presentan además un alto grado de
infectividad respecto a promastigotes. Asimismo las células amastigotesemejante fueron comparadas con amastigotes verdaderos en cuanto a su
composición de lípidos, mediante una caracterización por cromatografía de
gases. Este análisis dio como resultado la validación de las células generadas
in vitro como células modelo para el estudio de amastigotes. (Fernandez R.
Neyra E. Santa Cruz, C. Albrech,M. Garcia, R. Lopéz, M, 2001).
1.5.
Multiplicación Intracelular de Leishmania.
Después de la diferenciación de promastigote a amastigote, los parásitos se
reproducen dentro del macrófago por fisión binaria. La división del axonema,
núcleo y kinetoplasto precede la división de la célula. Los parásitos se
reproducen dentro de las vacuolas, las cuales tienen propiedades de lisosomas
secundarios; este compartimiento representa una parte del sistema vacuolar
fagosoma-lisosoma, y está accesible a las moléculas presentes en el ambiente
inmediato de las células infectadas (Chang, 1987)
Los parásitos deben tener un metabolismo ácido-resistente y ser capaces de
utilizar los nutrientes que se encuentran dentro de la vacuola, o que son
tomados dentro del sistema vacuolar fagosoma-lisosoma vía endocitosis o por
transporte activo por parte de los macrófagos. Sin embargo, no todos los
nutrientes pueden ser suministrados por los macrófagos, por lo que Leishmania
posee ectoenzimas como nucleotidasas, proteasas y fosfatasas ácidas,
importantes para la obtención de nutrientes (Chang, 1987; Glew et al., 1988).
Las nucleotidasas son utilizadas para producir bases nitrogenadas libres, que
pueden ser utilizadas por medio de la vía de recuperación de las purinas. Las
proteasas degradan proteínas lisosomales del macrófago generando productos
que pueden ser utilizados por los parásitos; de hecho algunos inhibidores de
proteasas tienen actividad anti-leishmania. Los roles fisiológicos de las
fosfatasas no están bien entendidos pero pueden proveer al parásito de una
fuente de fosfato inorgánico. Las fosfoproteína fosfatasas deben mediar las
interacciones célula y los mecanismos de transmisión de señales al igual que
las ecto-proteína quinasas (Glew et al., 1988; Hermoso et al., 1991).
1.6. Clasificación.
Super reino:
Eukaryota
Reino:
Protista
Subreino:
Protozoa
Phylum:
Sarcomastigophora
Subphylum:
Mastigophora
Clase:
Zoomastigophorea
Orden:
Kinetoplastida
Familia:
Trypanosomatidae
Género:
Leishmania
Subgénero:
Viannia
Complejo de especies:
Leishmania braziliensis
Especie:
Leishmania peruviana
Soulsby (Soulsby, 1987) y del servicio WEB Taxonomy, National Center for
Biotechnology Information:
www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?id=5681&lvl=3
2.
Fosforilación de proteínas.
La fosforilación reversible de proteínas es la principal estrategia usada por las
células eucariontes para controlar la actividad de sus proteínas, y juega un
papel importante en la fisiología celular al regular muchos procesos y ser un
evento principal en las rutas de transmisión de señales. Las proteínas substrato
son fosforiladas en sitios específicos por una o más proteína quinasas,
generando fosfoproteínas cuyos fosfatos pueden ser luego removidos por
acción de fosfoproteína fosfatasas específicas. En principio, la fosforilación en
un sitio particular puede ser regulada al cambiar la actividad de la proteína
quinasas y fosfoproteína fosfatasas implicadas (Hunter, 1995; Ingebritsen,
1983).
2.1.
Proteínas quinasa.
Las proteínas quinasa son enzimas que catalizan la transferencia de un grupo
fosfato desde un donador hacia un aminoácido aceptor en una proteína
substrato. Estas fosfotransferasas utilizan el fosfato γ de nucleósidos trifosfato
de purina (ATP o GTP) para generar monoésteres de fosfato, usando como
aceptores los grupos alcohol o fenol de los aminoácidos, aunque otros grupos
también pueden ser usados (Hunter, 1991; Hanks y Hunter, 1995).
La mayoría de proteína quinasas se han identificado principalmente a partir del
clonamiento molecular de genes más que a partir de purificación enzimática, y
esto debido a que todas las proteína quinasas, aunque con una gran diversidad
en estructura, modo de regulación y especificidad de substrato, presentan una
notable similitud en el dominio catalítico
(Hunter, 1987; Hunter, 1991).
2.1.1. El dominio catalítico.
El dominio quinasa, con una extensión de 250 a 300 aminoácidos, es el que
imparte la actividad catalítica de las proteínas quinasas. El dominio está
dividido en 12 pequeños sub-dominios (I al XII), los cuales son regiones que
contienen patrones característicos de residuos conservados y que no están
interrumpidas por grandes inserciones de aminoácidos (Hanks y Hunter, 1995;
Hunter, 1991).
Tres roles separados se pueden atribuir al dominio quinasa: (1) Unión y
orientación del ATP (o GTP) donador de fosfato en complejo con cationes
divalentes de Mg2+ (o Mn2+); (2) unión y orientación de la proteína (o péptido)
substrato; y (3) transferencia del fosfato γ desde el ATP (o GTP) al residuo
hidroxilo de la Serina, Treonina o Tirosina, en la proteína substrato (Hunter,
1991; Hanks y Hunter, 1995).
Las características conservadas de las estructuras primarias de los dominios
quinasa han sido identificadas a través de una inspección de alineamientos
múltiples de secuencias de aminoácidos (Hanks y Quinn, 1991, Hanks y
Hunter, 1995; Hunter 1991). La naturaleza homóloga que presentan tales
dominios implica que el plegamiento de sus estructuras tridimensionales debe
tener una topología similar, y que la fosfotransferencia debe ocurrir de acuerdo
a un mecanismo común.
La obtención de la estructura tridimensional por cristalografía de rayos X de la
proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA), una Serina/Treonina
quinasa, en complejo con un péptido inhibidor y Mg-ATP, reveló la topología
general del dominio catalítico (proteína quinasa), el cual se pliega formando
una estructura bilobular (Taylor, 1989; Reiner et al., 1994).
Los sub-dominios I al IV, hacia el amino terminal,
forman el lóbulo más
pequeño, el cual está involucrado en el anclaje y orientación del nucleósido
trifosfato, y tiene una estructura formada principalmente por hojas β
antiparalelas. Los subdominios VI-A al XI, hacia el carboxilo terminal, forman el
lóbulo más grande, el cual está formado predominantemente por hélices α, e
implicado en la unión del péptido substrato y la iniciación de la
fosfotransferencia. El subdominio V une a ambos lóbulos. La hendidura que se
forma entre los dos lóbulos es reconocida como el sitio de catálisis (Hanks y
Hunter, 1995; Taylor, 1989).
Las estructuras tridimensionales de otras proteína Serina/Treonina quinasas de
eucariontes como la quinasa 2 dependiente de ciclinas (Cdk2), la quinasa
activada por mitógeno MAPK (Erk2) (Zhang et al., 1993), caseína quinasa–1
(Carmel et al., 1994); y proteína Tirosina quinasas como c-Src (Xu et al., 1997)
y Hck (Sicheri et al., 1997) también muestran dominios quinasa plegados en
forma bilobular, muy similares al dominio quinasa de PKA.
2.2.
Fosfoproteína fosfatasas.
La fosforilación reversible de proteínas es ampliamente reconocida como un
mecanismo importante para el control de una amplia variedad de procesos
celulares. La fosforilación de proteínas claves, con cambios asociados en sus
propiedades biológicas, promueven una respuesta fisiológica. El contenido de
fosfato en dichas proteínas debe ser el resultado de un balance entre proteína
quinasas y fosfoproteína fosfatasas (Shenolikar y Nairn, 1991).
En comparación con las proteína quinasas, se aceptó ampliamente que eran
muy pocas las fosfoproteína fosfatasas implicadas en la desfosforilación de
proteínas; un punto de vista basado en las propiedades bioquímicas de las
Serina/Treonina fosfatasas. Sin embargo, este punto de vista cambió en los
últimos años gracias a los estudios de clonamiento molecular que pusieron de
manifiesto que el número de fosfoproteínas fosfatasas fue largamente
subestimado (Shenolikar y Nairn, 1991; Hunter, 1995).
Mientras que la fosforilación de proteínas, principalmente en residuos de
Tirosina tomaba importancia como parte central en muchos procesos celulares
durante la década pasada, los estudios sobre la desfosforilación de las mismas
estaban siendo relegados a un segundo plano. No fue sino hasta 1988, año en
que se obtuvo la primera secuencia parcial de aminoácidos de una
fosfoproteína Tirosina fosfatasa PTP 1B, que estas enzimas comenzaron a
llamar la atención (Hunter 1995, Shenolikar y Nairn, 1991).
La secuencia de la PTP 1B era particularmente reveladora ya que no
presentaba similitud a las Serina/Treonina fosfatasas ya conocidas. Una
búsqueda en bases de datos para secuencias similares a PTP 1B identificó a
una proteína CD45, la cual es un constituyente principal de células T y B, y está
involucrada en la respuesta inmune de estas células. CD45 es el prototipo para
la estructura general de las fosfoproteína Tirosina fosfatasas de tipo receptor,
mientras que PTP 1B es considerada como un prototipo para las fosfoproteína
Tirosina fosfatasas de tipo intracelular (Tonks et al., 1993).
Los roles funcionales de fosfoproteína Serina/Treonina fosfatasas han
aumentado debido al descubrimiento de que son componentes esenciales en la
regulación de la transcripción de genes y división celular en eucariontes. La
identificación de fosfoproteína Tirosina fosfatasas ligadas a receptores apunta a
una nueva ruta de señalización intracelular mediada por desfosforilación de
proteínas, controlando la proliferación celular y la comunicación célula a célula
(Shenolikar y Nairn, 1991; Fischer et al., 1991).
2.2.1. Fosfoproteína Serina/Treonina fosfatasas.
Debido a su amplio rango y sobreposición en la especificidad de substrato, se
ha introducido un método de clasificación basado en sus actividades (Cohen
1991; Shenolikar y Nairn, 1991).
Las enzimas son divididas en dos grupos, tipo 1 y tipo 2: las tipo 1 (PP1)
desfosforilan específicamente la subunidad β de la fosforilasa quinasa y son
inhibidas por concentraciones nanomolares de dos pequeñas proteínas calorácido estables, llamadas inhibidor 1 (I-1) e inhibidor 2 (I-2); mientras que las
tipo 2 (PP2) desfosforilan preferencialmente a la subunidad α de la fosforilasa
quinasa y son insensibles a los inhibidores 1 y 2 (Cohen, 1991).
Las fosfoproteína fosfatasas tipo 2 pueden ser subdivididas en tres grupos,
PP2A, PP2B y PP2C en base a su dependencia de iones divalentes. PP2B y
PP2C tienen un requerimiento absoluto de Ca2+ y Mg2+, respectivamente,
mientras que PP2A (semejante a PP1) es parcialmente activa sobre la mayoría
de substratos en ausencia de cationes divalentes. (Cohen, 1991).
En base a sus actividades enzimáticas se han identificado cuatro tipos de subunidades catalíticas de las fosfoproteínas fosfatasas de todos los tejidos de
mamíferos que han sido examinados (PP1, PP2A, PP2B y PP2C). Los ADN
complementarios también han sido clonados (Cohen, 1991).
Las secuencias de PP1 muestran un alto grado de conservación a través de la
evolución. Más del 80% de identidad estructural se ha mantenido entre estas
enzimas desde hongos hasta mamíferos. También se ha observado un alto
grado de conservación entre las secuencias de PP2A, con más del 96% de
identidad. PP2B, llamada calcineurina y única en su tipo debido a que es
regulada por Ca2+ (un segundo mensajero intracelular), también presenta
secuencias altamente conservadas. Los análisis de las estructuras primarias de
las subunidades catalíticas de PP1, PP2A y PP2B muestran una homología
estructural substancial entre ellas; sin embargo PP2C, la cual presenta una
amplia especificidad de substrato, muestra poca homología (Cohen, 1991;
Shenilokar y Nairn, 1991).
Las estructuras primarias de las fosfoproteínas Serina/Treonina fosfatasas no
presentan una similitud discernible con la fosfoproteína Tirosina fosfatasas.
Tampoco existe una identidad aparente entre las proteínas Serina/Treonina
fosfatasas y las fosfatasas ácidas o alcalinas (Shenolikar y Nairn, 1991).
Hay seis regiones de las sub-unidades catalíticas de PP1, PP2A y PP2B que
son altamente conservadas (I - VI) y que podrían formar elementos
estructurales del dominio catalítico. PP2C presenta varios aminoácidos
conservados en las regiones II, III, IV y V, sin embargo no se sabe si estos
aminoácidos son esenciales para la catálisis. Se han encontrado residuos
conservados de cisteína en las regiones IV y V en todas las clases
fosfoproteína Serina/Treonina fosfatasas y se ha sugerido que tales residuos
son esenciales para la actividad catalítica (Cohen, 1991; Shenolikar y Nairn,
1991).
3.
Fosforilación de proteínas en Leishmania.
En eucariontes, la fosforilación de proteínas es el principal mecanismo de
regulación de la respuesta celular a señales medioambientales, incluyendo
interacciones célula-célula. Las proteína quinasas y fosfoproteína fosfatasas
participan en complejas cascadas de señales que controlan la diferenciación
celular, el metabolismo, crecimiento y expresión génica entre otros procesos.
Sin embargo, se conoce muy poco acerca de la fosforilación de proteínas en
Leishmania, proceso que debe ser importante en la relación célula hospedera –
parásito así como en la diferenciación celular, supervivencia y multiplicación del
parásito.
En L. major se ha estudiado la fosforilación de componentes del sistema del
complemento, encontrándose que la proteína quinasa 1 de Leishmania (LPK-1)
aislada de promatigotes es capaz de fosforilar C3, C5 y C9; sólo las cadenas α
de C3 y C5 pueden ser fosforiladas, mientras que las cadenas β no son un
buen substrato para LPK-1. La fosforilación de C3 inactiva tanto a la vía alterna
como a la vía clásica de activación del complemento por lo que podría jugar un
papel importante en la supervivencia del parásito; Leishmania utilizaría los
receptores del complemento del macrófago para conseguir su entrada en dicha
células (Hermoso et al., 1991).
La presencia de PKC, PKA, caseína quinasa, calmodulina quinasa y quinasa
activada por poliaminas fue estudiada en L. major; sin embargo, ninguno de los
activadores o inhibidores conocidos para estas enzimas tuvo un efecto
significativo en la fosforilación de substratos endógenos en un sistema libre de
células. Las proteína quinasas encontradas, que fosforilan residuos de Serina
en substratos endógenos, solamente fosforilaron a los substratos exógenos de
amplio espectro como Protamina y mezcla de Histonas, indicando que estas
actividades enzimáticas no encajan dentro de cualquiera de las principales
clases de proteína Serina/Treonina quinasas. Otro hallazgo importante en este
parásito fue la localización en membrana tanto de las proteína quinasas como
de las proteínas substratos y la casi completa ausencia de ambas en la fracción
citosólica, además de una fuerte actividad de ectofosforilación, es decir, la
presencia de proteína quinasas externamente orientadas en la membrana
celular y que pueden ser extremadamente importantes en la regulación de los
procesos celulares en la interacción parásito - célula hospedera (Lester et al.,
1990).
Se ha estudiado la fosforilación extracelular de substratos exógenos durante la
transformación por choque térmico en L. major y L. mexicana, observándose un
incremento máximo en la fosforilación después de 360 minutos de exposición al
choque térmico para L. major y 10 minutos para L. mexicana. (Hermoso et al.,
1994). Así mismo, se ha demostrado la liberación de ecto-proteína quinasas
que fosforilan tanto substratos endógenos como exógenos en L. major: dos
ectoproteína quinasas, una constitutiva y otra inducible pueden ser liberadas
hacia el medio (Sacerdoti-Sierra y Jaffe, 1997).
La ectofosforilación es un proceso poco común hasta ahora, quizás porque no
se ha estudiado en detalle y no porque no ocurra. La ectofosforilación ha sido
encontrada en linfocitos T en donde se evidencia que el ATP media la
fosforilación de proteínas extracelulares a través de la acción de ecto-proteína
quinasas; la ectofosforilación fue dependiente de temperatura así como de
Mg2+, Mn2+, ATP y GTP, indicando la presencia de ectoenzimas en linfocitos
intactos (Redegeld et al., 1997). También se ha demostrado que ocurre en la
osteopontina y la sialoproteína es decir en osteoblastos durante la formación in
vitro del hueso (Redegeld et al., 1997). Asimismo, se ha encontrado una
actividad de ectoquinasa en cultivo de tejido neuronal que fosforila una proteína
de 45 KDa (Volonté et al., 1994).
Además de la actividad de proteína quinasas externamente orientadas en la
membrana celular, se ha encontrado desfosforilación de proteínas mediada por
fosfoproteína fosfatasas en células intactas y fracciones ricas en membrana
celular del parásito L.major; evidenciando que el proceso de fosforilación y
desfosforilación de proteínas podría tener un papel importante y significativo
en la relación célula hospedera-parásito (Lester et al., 1991).
Se ha demostrado que existen cambios estadío-específicos en la fosforilación
de proteínas durante el ciclo de vida de L. major: usando un ensayo de
renaturalización de proteína quinasas se detectaron varias actividades proteína
quinasas en cada estadío de desarrollo del parásito, en particular una proteína
quinasa de 50 kDa de peso molecular que es activa en promastigotes pero no
en amastigotes. Ensayos de fosforilación in vitro demostraron que el patrón de
proteínas fosforiladas en residuos de Serina y Treonina es regulado en forma
estadío específica y que el patrón de proteínas fosforiladas en residuos de
Tirosina no cambia durante el desarrollo del parásito. Además, se encontró que
los cambios en la fosforilación de varias proteínas fueron debido a la activación
de fosfoproteína fosfatasas de amastigotes (Dell y Engel, 1994).
El estrés de pH ácido induce la fosforilación de proteínas en residuos de
Tirosina en el parásito L. pifanoi, donde la fosforilación de proteínas de 51, 43,
27 kiloDaltons fue observada a pH inferior a 5 y podría relacionarse con la
capacidad de Leishmania para desarrollarse en el ambiente de la vacuola
parasitófora del macrófago. Los resultados sugieren que la fosforilación
detectada refleja un evento biológico importante para el desarrollo del parásito
aunque las implicancias funcionales son aún desconocidas (Rivero-Lezcano et
al., 1997).
Trabajos previos realizados en el Laboratorio de Biología Molecular
y
Bioquímica del Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”
Universidad Peruana Cayetano Heredia. Han descrito los patrones de
fosforilación de los estadios de promastigote y amastigote de Leihmania
peruviana, mediante incorporación de [γ32P]ATP. Estableciendo la presencia de
una proteína de aproximadamente 70 kDa altamente fosforilada en el estadio
de amastigote (Fernandez R. Neyra E. Santa Cruz, C. Albrech, M. Garcia, R.
Lopéz, M, 2001). Proteína que fue seleccionada para el presente trabajo.
OBJETIVOS.
1. Objetivo general:
Determinar la influencia del pH y la temperatura sobre la fosforilación de la
proteína p70 kDa de Leishmania peruviana.
2. Objetivos específicos:
- Determinar la presencia de residuos fosforilados en la fosfoproteína.
- Determinar si la diferencia de fosforilación entre los estadios se debe o no a
una expresión diferencial.
- Determinar el punto isoeléctrico mediante isoelectroenfoque.
III. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. MATERIALES.
Reactivos.
Aceite de inmersión (SIGMA)
Aceite mineral (SIGMA)
Ácido Succínico (SIGMA)
Ácido Clohídrico (MERCK)
Ácido fosfórico (SIGMA)
Ácido acético glacial (MERCK)
Acrilamida (BIORAD)
Agar (DIFCO)
Albúmina sérica de bovino (SIGMA)
Anfolitos (BIO-RAD)
AntifosfoTreonina (ZYMED)
AntifosfoSerina (ZYMED)
AntifosfoTirosina (ZYMED)
Antirabbit conjugado con fosfatasa alcalina (BIO RAD)
Aprotinina (SIGMA)
Azul de Bromofenol (BIORAD)
Azul de tripán (SIGMA)
Bálsamo de Canadá (SIGMA)
Bicarbonato de sodio (SIGMA)
Bicarbonato de amonio (MERCK)
Bis acrilamida (BIORAD)
Cloruro de sodio (MERCK)
Cloruro de potasio (SIGMA)
Coomasie R-250 (BIO-RAD)
Coadyuvante de Freund completo (SIGMA)
Coadyuvante de Freund incompleto (SIGMA)
Ditiotreitol (SIGMA)
Diaminobencidina (SIGMA)
EDTA (SIGMA)
Fosfato de sodio dibásico (SIGMA)
Fosfato de potasio monobásico (SIGMA)
Glicerol (SIGMA)
Glicina (SIGMA)
Glucosa (SIGMA)
Hidroxido de sodio (MERCK)
Hemocitómetro (FISHER)
HEPES (SIGMA)
Kit para detección con quimioluminiscencia (BIORAD)
Kit para tinción de proteínas con plata (BIORAD)
Leupeptina (SIGMA)
M-199 (GIBCO BRL)
Marcador de peso molecular (BIORAD)
Marcador de peso molecular pre-coloreado (BIORAD)
2-β-Mercaptoetanol (SIGMA)
Metavanadato de Sodio (SIGMA)
Metanol absoluto (MERCK)
MgCl2 (SIGMA)
MnCl2 (SIGMA)
NaCl (SIGMA)
Papel WATTMAN 3M
Películas, solución reveladora y solución fijadora (KODAK)
Persulfato de Amonio (BIORAD)
PMSF (GIBCO BRL)
PVDF (MILLIPORE)
Quimitripsinogeno (SIGMA)
Reactivo de Bradford (BIO RAD)
SDS (SIGMA)
Suero fetal bovino (SIGMA)
Sustrato quimiluminicente para fosfatasa alkalina (BIO RAD)
TBS (BIO RAD)
TEMED (BIO RAD)
Tripsina (BERINGER)
TPCK (SIGMA)
TLCK (SIGMA)
Tris HCl (BIO RAD)
Tween - 20 (BIO RAD)
Instrumentos.
Centrifuga refrigerada (BIO RAD)
Cámara de electroforesis vertical pequeña (BIORAD)
Cámara de electroforesis vertical grande (AMESCHAM)
Cámara de electroforesis horizontal grande (SIGMA)
Sistema de refrigeración (LKB)
Fuente de poder (LKB)
3.2. MÉTODOS.
1. Caracterización parcial de p70.
1.1. Preparación del Material Biológico Leishmania peruviana (cepa Hb22).
Cultivo de mantenimiento
Los parásitos, promastigotes de Leishmania peruviana cepa Hb22, fueron
mantenidos en medio de Cultivo bifásico de agar sangre (apéndice 1), y
repicados a medio nuevo con solución salina estéril (0,85 % NaCl), una vez a la
semana.
Determinación de curva de crecimiento
Se tomaron tubos de mantenimiento con parásitos del tercer día, estos
parásitos fueron contados y repicados en una densidad de 10 6 parásitos/mL de
solución salina a un frasco de Agar sangre con un volumen final de 5 mL.
Finalmente se contaron los parásitos cada 24 horas durante 8 días en cámara
de Neubauer y para determinar el número total de parásitos en el cultivo.
(Figura 1)
Cultivo en masa de promastigotes
Los parásitos fueron cultivados en Medio 199 (apéndice 2) suplementado con
20% de suero fetal bovino (FBS) inactivado, 20mM de HEPES y 0,35g de
Bicarbonato de sodio a pH 7.0 y mantenidos a 26°C agregando medio 199
nuevo cada 48 horas, para mantener a los parásitos en fase logarítmica de
crecimiento.
1.2. Generación de “amastigotes-semejante” mediante variación de pH y
temperatura.
Para la generación de amastigotes-like se utilizaron promastigotes en fase
estacionaria (96 horas de crecimiento) los cuales fueron centrifugados a 2500
rpm durante 10 minutos, resuspendidos en Medio 199 suplementado con 20 %
de FBS inactivado, a pH 5.0 (acidificado con ácido succínico) y mantenidos a
34ºC y 5% de CO2 durante 48 horas. Según la metodología descrita por
(Fernandez R. Neyra E. Santa Cruz, C. Albrech,M. Garcia, R. Lopéz, M, 2001).
Los parásitos fueron cosechados mediante centrifugación a 3000 rpm a 4 ºC
durante 10 minutos y lavados dos veces con tampón de lavado (20 mM Tris, pH
7,5; 2 mM glucosa, 150 mM NaCl)
1.3. Determinación del peso molecular
El peso molecular (MW) de la proteína de estudio será determinado generando
un ploteo del logaritmo del MW de las bandas que comprende el marcador de
peso molecular de amplio rango (BIO-RAD) vs. la movilidad relativa (Rf),
aplicando la siguiente formula.
Rf =
1.4.
distancia migrada por la proteína
_________________________________
distancia migrada por el frente de corrida
Influencia del pH y temperatura sobre la fosforilación de la p70.
Cultivos de promastigote del 4to día (fase estacionaria) fueron usados para
generar amastigotes in vitro teniendo cada cultivo diferentes condiciones:
promastigotes a pH 5 incubados a 26°C, pH 7 incubados a 34°C, pH 5
incubados a 34°C. Con la finalidad de comprobar si la fosforilación de la p70 es
inducido por alguno de estos factores o es la participación de ambos factores.
1.5.
Detección de diferentes residuos fosforilados en p70.
La proteína electroeluida detectada por anti-fosfoTreonina fue usada para
realizar ensayos de western-blot con dos diferentes anticuerpos, uno dirigido a
residuos fosforilados en Tirosina y el otro dirigido a residuos fosforilados en
Serina usando la técnica ya descrita.
Lisis de parásitos.
Los parásitos son resuspendidos en tampón de lisis (20mM Tris pH 7.5, 150mM
NaCl, 1mM PMSF, 5μg/mL Leupeptina, 2μg/mL Aprotinina, 1μg/mL Inhibidor de
Tripsina, 50μg/mL TLCK, 1mM Metavanadato de Sodio, 1μM Microcystin.) y
lisados por Shock térmico mediante pasajes entre dos temperaturas 37ºC y 70ºC durante 8 ciclos, la lisis de los parásitos fue monitoreada y verificada en el
microscopio.
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford.
La concentración de proteínas del lisado total de promastigote como el de
amastigote-semejante fue cuantificada según el método de (Bradford, M. M.
1976). Para lo cual se realizó una curva estándar usando una proteína de
concentración conocida, en este caso se usó Albúmina de Suero Bovino (BSA),
de la cual se preparó diluciones desde 0.97 a 8.73 μg en agua destilada hasta
un volumen final de 800 μL, a cada dilución se le agregó 200 μL del reactivo
de Bradford, se mezclo bien evitando la formación de burbujas y después de 15
min. Se realizaron las lecturas a 595 nm en espectrofotómetro de doble haz.
Electroforesis, Transferencia, inmunodetección y autorradiografía.
Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis discontinua bajo
condiciones denaturantes en geles de poliacrilamida al 10 %, aplicando
corriente constante de 18 mA durante 8 horas (apéndice 4). Con algunas
modificaciones del sistema de (Laemmli, 1970). Para determinar los pesos
moleculares se utilizó marcador de peso molecular.
Una vez separadas, las proteínas fueron transferidas del gel a la membrana de
difluoruro de polivinilo (PVDF) siguiendo la metodología descrita por (Towbin, et
al. 1979). Usando un sistema de transferencia semiseco Trans-Blot (BIO-RAD)
a 15 voltios durante 45 minutos (apéndice 4).
Las membranas de PVDF fueron inmunodetectadas con anticuerpos dirigidos a
residuos fosforilados en Treonina y
reveladas por quimioluminicencia y
sometidas a autorradiografía durante 30 minutos, para determinar la presencia
y ubicación exacta de la fosfoproteína de interés (apéndice 6).
1.6.
Determinación de la fosforilación o expresión diferencial de p70.
Proteínas totales de promastigote y amastigote serán corridas en Cámara de
electroforesis vertical (SIGMA) a través de un gel de electroforesis SDS-PAGE.
Luego serán transferidos a membrana de PVDF (polivinil difluoruro) por
Western blot usando un sistema de transferencia semiseco (BIO-RAD) y se
realizará la inmunodetección de la banda de interés usando anticuerpos antip70. La información que se obtenga permitirá establecer si la presencia de una
proteína de 70 kDa fosforilada en Treonina únicamente en el estadio de
amastigote se debe a una falta de expresión de esta proteína en el estadio de
promastigote o a una fosforilación diferencial de esta proteína en los dos
estadios.
1.7. Purificación de la fosfoproteina mediante electroelusión .
Se retiró la banda de interés de los geles tanto de promastigote como de
amastigote, esta banda fue eluída del gel de poliacrilamida usando un sistema
(BIO-RAD), con buffer (0,5X) (Trizma base 0,75g; Glicina 3,6 g; SDS 0,25g y
agua hasta completar 500mL).
La electroelusión se realizará durante 4 hrs. a 100 V. Sin desensamblar el
sistema se cambió el buffer de elusión por un buffer de diálisis (Trizma base
0,75g; Glicina 3,6g y agua hasta completar 500mL), este buffer fue cambiado
tres veces cada 4 hrs. (tanto electroelusión como electrodiálisis de la proteína
fueron realizados en cuarto frío a 4ºC).
La proteína eluída fue inmunodetectada con anticuerpos dirigidos a residuos
fosforilados en Treonina, verificando así el aislamiento de la fosfoproteína.
1.8.
Isoelectroenfoque.
La proteína de amastigote electroeluída y electrodiálizada fue usada para
realizar el ensayo de Isoelectroenfoque según (Görg, 1998). Determinando así
el grado de pureza de la proteína eluída como el punto isoeléctrico de la misma
mediante el uso de marcadores de punto isoeléctrico:
Se usaron como marcadores de punto isoelectrico: Quimotripsinogeno pI= 9,5
e inhibidor de tripsina pI= 4,5. (apéndice 7)
El Isoelectroenfoque de realizó bajo las siguientes condiciones: pre-corrida a
400V durante 10 min. corrida de 400V hasta llegar a 1200 V durante 20 min. El
gel fue posteriormente teñido con plata.
La distribución de los anfolitos usados en el isoelectroenfoque se distribuye de
manera equidistante a lo largo del gel, generando una gradiente de pH de 3 a
10. El pI se determinara por un calculo lineal entre la movilidad relativa (Rf) de
la banda de correspondiente a la p70 durante el isoelectroenfoque vs. el
logaritmo del pI de los marcadores usados. El pI obtenido se corroborará
midiendo el pH con cinta de papel indicador en el punto final de migración de la
proteína así como por el cálculo de la distancia de migración de la proteína en
relación a la distancia de distribución de los anfolitos en el gel. El gel
posteriormente
será
transferido
a
una
membrana
de
PVDF
para
inmunodetectar la proteína con anticuerpos contra residuos fosforilados en
Treonina.
IV. RESULTADOS.
1.
Caracterización parcial de p70.
N° de Parásitos x 10 6
CURVA DE CRECIMIENTO DE Leishmania
peruviana (cepa Hb22)
50
40
30
20
10
0
0
24
48
72
96
120
144
168
Tiem po (h)
Figura 1. Curva de crecimiento de Leishmania peruviana (cepa Hb22)
La curva de crecimiento mostró una fase de crecimiento logarítmica desde la
24 h hasta las 72 h, con una fase de crecimiento exponencial hasta las 96 h y
finalmente se alcanza un plató a partir del cual se inicia el decremento de la
concentración de células en el cultivo.
1.1. Determinación del peso molecular (MW).
Rf
0.2696
0.255
0.459
0.655
0.918
1
log MW
5.2081
4.8208
4.6532
4.4913
4.1583
3.8129
y = -0.2511x + 5.1405
R2 = 0.9671
6
Log MW
1
2
3
4
5
6
MW
70000
66200
45000
31000
14400
6500
5
4
3
1
2
3
4
5
Rf
Tabla 1. En la fila 1, se muestran los valores obtenidos en el cálculo del peso molecular (MW)
para la proteína de estudio; las filas 2-6, corresponden a los valores calculados para el
marcador de peso molecular usado.
Figura 2. Electroforesis SDS-PAGE. 1: BSA, 2: crudo de promastigote, 3: crudo de
amastigote, 4: MW.
1.2. Influencia de pH y temperatura sobre la fosforilación de p70.
Figura 3. Western-blot con anti-fosfoTreonina. 1: tratamiento a pH 5 y 26C; 2: tratamiento a
pH 7 y 34C; 3: tratamiento a pH 5 y 34C; 4: promastigostes sin tratamiento.
Los diferentes tratamientos no generaron una expresión ni fosforilación
diferencial, en las células tratadas con las diferentes condiciones de pH y
temperatura, encontrándose ambos factores con determinantes de la
fosforilación en Treonina presente en esta proteína.
1.3. Determinación de residuos fosforilados en p70.
Figura 4. Western-blot de crudos de amastigote 1: con anti-fosfoTirosina, 2: con anti-fosfo
Serina, 3: con anti-fosfoTreonina.
Los ensayos con anticuerpos dirigidos a diferentes residuos fosforilados en
extractos crudos de amastigote-semejante, únicamente reaccionaron con el
anticuerpo dirigido a resíduos fosforilados en Treonina.
1.4. Determinación de la fosforilación o expresión diferencial en p70.
Figura 5. Western-blot con anti-p70. 1: promastigote, (12 μg); 2: amastigote-semejante, (12
μg).
La expresión de la proteína p70 fue detectada en ambos extractos
determinando que la proteína se encuentra presente en ambos estadios, sin
embargo la fosforilación de la proteína p70 se encuentra únicamente en el
estadio de amastigote-semejante.
1.5. Isoelectroenfoque y determinación del punto isoeléctrico (pI)
Rf
0.1829
0.2073
0.829
Log pI
0.9182
0.977
0.653
pI
8.9
9.5
4.5
y = -0.2287x + 0.8764
2
R =1
0.9
0.8
pI
1
2
3
0.7
0.6
0.5
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Rf
Tabla 2. En la fila 1, se encuentran los valores calculados para el punto isoelectrico (pI) de la
proteína de estudio, las filas 2 y 3, corresponden a los valores calculados para los maracadores
de punto isoeléctrico, Quimotripsinogeno, pI 9.5 y BSA, pI 4.5 respectivamente.
Figura 6. Isoelectroenfoque en gradiente de anfolitos de (3-10). 1: Quimotripsinogeno, pI =
9,5; 2 y 3: p70 purificada de promastigote, 4: BSA, pI= 4,5. Tinción con plata.
La separación por punto isoeléctrico de la proteína p70 eluída, descarta la
posibilidad de la presencia de otras proteínas comigrantes al no aparecer otras
bandas en el gel, mas aun cuando la tinción del gel fue realizado con plata
método con una sensibilidad del rango de nanogramos de muestra.
Figura 7. Western blot de IEF usando anti-Treonina. 1: Quimotripsinogeno, marcador de pI 9.5;
2: p70 purificada de promastigote, 80 ng; 3: p70 purificada de promastigote, 120 ng ; 4: BSA,
marcador de pI 4.5.
La detección con anticuerpos dirigidos a residuos fosforilados en Treonina
indica que la banda apreciada en el isoelectroenfoque corresponde a la
proteína p70 estudiada estableciendose como pI para esta proteína un valor
de 8.9.
V. DISCUSIÓN.
Hasta la fecha se estudian los mecanismos que estén ligados al cambio
conformacional del parásito causante de la Leishmaniosis, siendo los
mecanismos de fosforilación y desfosforilación regulados por proteínas
quinasas y fosfatasas respectivamente los más señalados en la señalización
celular.
El uso de parásitos extraídos de biopsias, así como procedentes de animales
infectados son un buen camino para la obtención de amastigotes, estos pueden
ser cultivados y generados axenicamente por transformación del estadio de
promastigote a amastigote. Aun cuando la metodología para el cultivo de
promastigotes este bien establecida (Evans, D.A. 1987), y este estadio es de
suma importancia para obtener información sobre el ciclo del parásito, es sin
duda el estadio de amastigote el que podrá generar información más relevante
sobre el comportamiento del parasito en su estadio infectivo, debido a sus
potenciales implicancias para la salud humana (Bates, P.A. 1993).
Una variedad de especies de Leishmania han sido cultivadas axenicamente
como formas tipo amastigotes. Todas estas cepas requieren de ser cultivadas a
temperaturas próximas a 37°C , este proceso debe ser acompañado por una
reducción del pH del medio de cultivo a aproximadamente 5.4 valor similar a los
reportados como presentes en los fagosomas, estas condiciones han
demostrado ser requerimientos necesarios para la generación de un alto
número de amastigotes-like, así mismo se ha demostrado in vivo en
amastigotes aislados de los fagosomas, que las condiciones optimas para la
actividad metabólica fue a pH de 5.0 (Bates, P.A. 1993).
Ensayos realizados en Saccharomyces cerevisiae
para la activación de la
membrana plasmática que se le atribuye a la acidificación del medio de pH 6.5
a pH 3.5 que es causado por el acido succínico, ácido débil generalmente
usado como acidulante. Esta activación está evidenciado ocurre tanto en
presencia como en ausencia de glucosa. Demostrando que la homeostasis
vacuolar así como la activación de membrana de los mismos en presencia de
acido succínico vs. ácido acético e incluso ácido clorhídrico decrece en los dos
últimos casos. (Carmelo V, et. al. 1997).
Los parásitos dimórficos que durante su estadio en el hospedero intermediario
experimenta temperaturas alrededor de 26 C al ingresar al macrófago del
hospedero final se someten a temperaturas de 37C. Estos estímulos de
cambios de temperatura han sido demostrado que generan una respuesta de
las Heat Shock Proteins en diversas especies de Leishmania (Lawrence et al.
1985). Estos cambios alcanzan su máximo grado de alteración después de las
18 horas post infección, tiempo en que coincide con la transformación del
parásito de la forma promastigote a la de amastigote. (Salotra et. al. 1997).
Esto podría explicar el resultado de la presencia de fosforilación de
promastigotes tratados con diferentes factores de exposición a pH y
temperatura, si bien in vivo los parásitos terminan su transformación al estadio
infectivo 18 horas después de realizada la infección, in vitro se requiere de por
lo menos 48 horas de exposición a los cambios de pH y temperatura para que
se generen un 82 de amastigotes-like. La activación o inactivación de
proteínas quinasas como de fosfatasas puede depender del estado de la célula
y ser afectadas por condiciones de stress como variación en el pH y
temperatura.
En estudios realizados en proteínas como la familia de las HSPs se observó
que los niveles de síntesis inducida por calor en experimentos realizados con L.
donovani corresponden con un incremento de la concentración intracelular de
la proteína. Durante estos experimentos se cuantificaron estas proteínas
mediante inmunoblot de Hsp100 en promastigostes de
L. donovani en un
medio a 25°C y después de 24 h fueron transferidos a 37°C. Los resultados
mostraron un incremento de 6–7 veces de Hsp100 durante las primeras 24 h
de iniciado el estrés con calor. Teniendo además resultados de una incubación
prolongada a 37°C que mostró un incremento mucho mayor (2.3-105 moléculas
de Hsp100 por célula) después de 36 h (Krobitsch S. et al., 1998)
Demostrándose con los ensayos realizados por (Krobitsch S. et al., 1998) que
la expresión de Hsp en Leishmania donovani inducida únicamente por un
estrés térmico es insuficiente y debe ser complementado con una estimulo de
cambio de pH en un rango de acidez similar al encontrado en el interior de los
fagosomas de macrófagos de mamíferos lo cual gatilla la diferenciación de la
célula y posterior formación del estadio amastigote. (Krobitsch S. et al., 1998)
Estudios generados en Leishmania pifanoi muestran que en los patrones de
fosforilación de células que fueron incubadas a pH ácido incluyen proteínas que
son desfosforiladas cuando las células son nuevamente retornadas al estadio
de promastigote. En contraste a esto se tiene proteínas como las HSPs que por
efecto de la temperatura la fosforilación que presenta en Tirosina no se
manifiesta, pero si estas células son expuestas a un pH de 5.0 esta
fosforilación ocurre. (Rivero-Lezcano, 1997).
Leustek, T., (1992) señala a las Hsp70 como un grupo de proteínas que
normalmente presentan grados de fosforilación in vivo, y recientemente se han
descrito eventos de autofosforilación estimulados por Ca 2+ o el requerimiento
de Ca2+ puede ser inhibido por Mg2+ generando una fosforilación únicamente
en residuos de Treonina.
VI. CONCLUSIONES.
1. El Western blot realizado a los extractos crudos tanto de promastigote como
de amastigote-semejante permitieron detectar una proteína de 70 kDa,
fuertemente fosforilada en residuos de Treonina, fosforilación que resulta
ser específica de amastigote-semejante. La
p70 purificada no presento
señal de fosforilación cuando se le sometió a anticuerpos dirigidos a
residuos fosforilados en Tirosina y Serina.
2. El pI encontrado fue de 8.9 lo cual brinda información sobre las
características de esta proteína.
3. La fosforilación observada únicamente en el estadio de amastigotesemejante, no se debe a la ausencia de la p70 en el estadio de
promastigote, ya que esta se expresa en este estadio también, pero no
muestra señal de fosforilación.
4. En el caso de la fosforilación de la proteína p70 las variaciones de pH y
temperatura no generan un cambio significativo en el grado de fosforilación de
esta proteína.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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Autophosphorylation of 70 kDa heat shock proteins. Cell Mol Biol., Feb;38(1):110.
VIII. ANEXOS.
Apéndice.
1. Agar sangre.
Disolver 0,3 g de penicilina en 10 mL de agua bidestilada. Esterilizar esta
solución por filtración.
Agregar 1 mL de la solución de penicilina por 100 mL de sangre.
Disolver 4 g de Blot Agar Sangre en 85 mL de agua destilada desionizada
autoclavada. Autoclavar.
Completar con 15 mL de sangre de conejo tratada con penicilina.
2. composición del medio de cultivo M199 (con sales de Earle, L-glutamina
sin bicarbonato de sodio)
Peso Concentración
COMPONENTES
Molaridad
Molecular
(mg/L)
(mM)
SALES INORGÁNICAS
Cloruro de Calcio (CaCl2)(anhyd.)
Nitrato férrico (Fe(NO3)-9H2O)
Cloruro de Potasio (KCl)
Sulfato de Magnesio (MgSO4)(anhid.)
Cloruro de Sodio (NaCl)
Fosfato monosódico (NaH2PO4-H2O)
111
404
75
120
58
138
200,00
0,70
400,00
97,67
6800,00
140,00
1,8018
0,0017
5,33
0,8139
117,24
1,01
OTROS COMPUESTOS
Sulfato De adenina
Trifosfato 5 de adenosina
Fosfato 5 de adenosina
Colesterol
Desoxirribosa
D-Glucosa
Glutation (reducido)
Clorhidrato de guanina
Hipoxantina-Na
Rojo de fenol
Ribosa
Acetato de Sodio
Timina
Tween 80
Uracilo
Xantina-Na
404
605
347
387
134
180
307
188
136
398
150
82
126
112
152
AMINO ÁCIDOS
10,00
1,00
0,20
0,20
0,50
1000,00
0,05
0,30
0,40
20,00
0,50
50,00
0,30
20,00
0,30
0,30
0,0248
0,00165
0,0005
0,000517
0,00373
5,55
0,0001
0,0016
0,0029
0,0502
0,00333
0,6098
0,00238
0,00268
0,00197
DL-Alanina
Clorhidrato de L-Arginina
Ácido DL-Aspartico
L-Cisteina HCl-H2O
L-Cistina-2HCl
Ácido DL-Glutamico
L-Glutamina
Glicine
L-Histidina -HCl-H2O
L-Hidroxiprolina
L-Isoleucina
DL-Leucina
Clorhidrato de L-Lisina
DL-Metionina
DL-Fenilalanina
L-Prolina
DL-Serina
DL-Treonina
DL-Triptofano
L-Tirosina-2Na-2H20
DL-Valina
89
211
133
176
240
165
146
75
210
131
131
131
183
149
165
115
105
119
204
181
117
50,00
70,00
60,00
0,10
26,00
150,00
100,00
50,00
21,88
10,00
40,00
120,00
70,00
30,00
50,00
40,00
50,00
60,00
20,00
58,00
50,00
0,56
0,33
0,11
0,0006
0,1083
0,9091
0,685
0,667
0,104
0,763
0,305
0,916
0,383
0,201
0,303
0,348
0,476
0,504
0,098
0,320
0,427
VITAMINAS
Ácido Ascórbico
Fosfato de Alf-tocoferol
Biotina
Calciferol (Vitamina D2)
Pantotenato de D-Calcio
Cloruro de Colina
Ácido Fólico
i-Inositol
Menadiona
Niacina
Niacinamida
Ácido Para-aminobenzoico
Clorhidrato de Piridoxal
Clorhidrato de Piridoxina
Riboflavina
Clorhidrato de Tiamina
Vitamina A (acetato)
176
702
244
397
477
140
441
180
172
123
122
137
204
206
376
337
328
0,05
0,01
0,01
0,10
0,01
0,50
0,01
0,05
0,01
0,025
0,025
0,05
0,025
0,025
0,01
0,01
0,10
0,0002
0,0000143
0,000041
0,000252
0,000021
0,0035
0,0002
0,000278
0,000581
0,000203
0,0002
0,0003
0,0001
0,0001
0,0000266
0,0000297
0,000305
3. Preparación de Giemsa y May-Grünwland.
Agregar 1g de May-Grünwland o Giemsa a 66ml de Glicerol, calentar a 60 °C
con agitación constante durante 2 hrs.
Dejar enfriar y agregar 66ml de metanol absoluto, mantener en reposo durante
24 hrs.
Filtrar en papel Whathman #1, Guardar a temperatura amb. y diluir 1:5 antes de
usar.
Coloración de parásitos:
Tomar una gota de medio de cultivo y colocar sobre una lámina porta objeto
limpia, dejar evaporar.
Fijar durante 5 min. con Glutaraldehido 1% cubriendo toda la superficie, luego
lavar con agua destilada.
Colorear con May-Grünwland por 5 min. luego retirar el colorante.
Colorear con Giemsa por 3 min. lavar con agua destilada 3 veces y dejar secar,
luego montar la lamina con bálsamo de canadá.
4. Electroforesis:
Stacking gel [4%] : T = 30% , C = 2,6%
Agua ...................................3,05ml
Acrilamida (30%) ................0,65ml
Tris-HCl 0,5M pH 6,8 .......... 1,25ml
SDS (10%) .............................. 50µl
APS (10%) .............................. 25µl
TEMED ..................................... 5µl
Separating gel [10%] : T = 30% , C = 2,6%
Agua......................................2,01ml
Acrilamida (30%) ...............1,665ml
Tris-HCl 1,5M pH 8,8 ..........1,25ml
SDS (10%) ...............................50µl
APS (10%) .............................. 25µl
TEMED .................................. 2,5µl
El gel fue corrido en cámara vertical PROTEAN II (BIO-RAD) durante 1 hr y 40
min a 90 V constante, en tampón de corrida 1X (Tris-HCl 1,5g; Glicina 7,2; SDS
0,25g; agua hasta completar 500 ml).
5. Transferencia a membrana de PVDF:
Una vez que la Electroforesis termina, se coloca el gel en abundante Towbin
Transfer Buffer (TTB) durante 30 min. a agitación constante.
Cortar los filtros y la membrana según las dimensiones del gel, hidratar la
membrana en metanol durante 10 min. Luego pasar la membrana a TTB por 10
min.
Hidratar los filtros en TTB por 10 min. ensamblar el sistema de transferencia y
transferir durante 30 min. a 15V.
Towbin Transfer Buffer:
(25mM Tris-HCL; 192mM Glicina; 20% Metanol pH 8, 3)
Disolver el Tris-HCl y la Glicina en agua luego agregar el metanol)
6. Inmuno-detección:
Terminada la transferencia, retirar la membrana y lavarla en TBS durante 10
min. con agitación constante.
Bloquear durante 2 h a temperatura ambiente y agitación constante con TBS +
5% de BSA ó 5% de Leche descremada, retirar la solución de bloqueo, lavar 1
vez con TTBS durante 10 min. a temperatura amb. y agitación constante
Agregar el primer anticuerpo, resuspendido en TTBS + 1% de BSA ó 1% de
leche descremada, incubar durante 2 h a temperatura amb. y agitación
constante, retirar la solución del primer anticuerpo, lavar 2 veces con TTBS
durante 10 min. cada lavado a temperatura amb. con agitación constante.
Agregar el segundo anticuerpo, resuspendido en el mismo buffer del primero,
incubar durante 1 h a temperatura amb. con agitación constante, retirar la
solución del primer anticuerpo, lavar 2 veces con TTBS a temperatura amb. con
agitación constante.
Tris Buffer Salino (TBS) :
(20 mM Tris-HCL; 500mM NaCl pH 7,5)
TTBS = TBS + 0,05% de Tween-20
Detección por quimiluminicencia autoradiografía.
Colocar sobre el casete de radiografía un plástico para aislar la membrana del
film de radiografía. Colocar la membrana sobre el plástico con la cara que
contiene a las proteínas transferidas hacia arriba, colocar sobre la membrana el
sustrato quimioluminiscente, y cubrir la membrana con el plástico, esperar 1
min. y colocar sobre la membrana un film de radiografía (KODAK), tapar el
casete y espera 30 min. para revelar el film. Después de 30 minutos de
exposición, colocar la película en solución reveladora KODAK hasta que
aparezcan las bandas. Enjuagar en agua destilada, Colocar la película en
solución fijadora KODAK durante 3 minutos, lavar con abundante agua y dejar
secar a temperatura ambiente. Todo este proceso debe ser realizado en cuarto
oscuro bajo luz roja.
7.
Isoelectroenfoque.
Gel de contacto: (acrilamida (30%) 0,348ml; agua 1,592ml; APS (10%) 30μl;
TEMED 6ul.); Gel en gradiente: (acrilamida (30%) 0,567ml; agua 2,6ml;
anfolitos (3-10) 131,32μl; APS (10%) 52,5μl; TEMED 6,3μl).
Abreviaturas.
ADN
Ácido desoxirribonucleico
ATP
Trifosfato de Adenosina
BSA
Albúmina sérica de bovino
C3
Proteína del complemento
C3b
Producto de la hidrólisis de C3
C3bi
Producto de la hidrólisis de C3
cAMP
Monofosfato cíclico de adenosina
CD45
Antígeno común de leucocitos, proteína Tirosina fosfatasa
Cdk2
Proteína quinasa dependiente de ciclinas 2
cGMP
Monofosfato cíclico de guanosina
Erk2
Proteína quinasa regulada por señal extracelular 2
FBS
Suero fetal bovino
gp63
Glicoproteína de 63 kDa
GTP
Trifosfato de guanosina
HEPES
N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-ácido etanosulfónico
Hck
Proteína quinasa de células hematopoyéticas
IR
Receptor de insulina
IGFR
Factor de crecimiento similar a insulina
LPG
Lipofosfoglicano
LPK1
Proteína quinasa 1 de Leishmania
MAPK
Proteína quinasa activada por mitógeno
PKA
Proteína quinasa dependiente de cAMP
PKC
Proteína quinasa C (originalmente dependiente de Calcio)
PMSF
Fenil metil sulfonil fluoruro
PP1
Proteína fosfatasa 1
PP2
Proteína fosfatasa 2
PTP 1B
Proteína Tirosina fosfatasa 1B
PVDF
Difluoruro de polivinilo
SDS
Dodecil Sulfato de Sodio
SDS-PAGE
Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
SH1
Homología 1 a Src, dominio proteína quinasa
SH2
Homología 2 a Src
SH3
Homología 3 a Src
SH4
Homología 4 a Src
Src
Proteína quinasa del virus del sarcoma de Rous
TBS
solución salina tamponada con tris
Tris
Tris-hidroximetilaminometano
TTB
Solución de transferencia
TTBS
solución salina con tween tamponada con tris
GRACIAS
Sin duda alguna a Raúl,
por compañero y a mi
mamá por todo.