Anti-HBs S

S
Anti-HBs
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila
contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del
ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una
fila a otra, con un período de incubación en cada etapa.
Para comenzar la prueba, las muestras de suero o plasma son
agregadas al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de
Desarrollo. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A.
Los anticuerpos anti-HBs, en caso de estar presentes en las
muestras, se unirán con el HBsAg en los puntos inferiores del diente
del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la
fila B. En la fila C, los anticuerpos anti-HBs capturados en los puntos
inferiores del diente reaccionarán con el HBsAg biotinilado. En la fila
D el complejo antígeno biotinilado/anticuerpo en los puntos inferiores
del diente, y la albúmina de suero bovino biotinilada de los puntos
superiores (Control Interno) reaccionarán con estreptavidina
conjugada con fosfatasa alcalina (FA). En la fila E, los componentes
no ligados son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la
fosfatasa alcalina unida reaccionará con un sustrato cromogénico.
Los resultados pueden verse como puntos azul grisáceos en la
superficie del diente del Peine.
Formación del complejo
HBsAg-anticuerpo;
120 min/37°C
anti-HBs
0459
Código: 60453002
Formato: 3 x 12 pruebas
HBsAg
biotinilado
Para diagnóstico in vitro únicamente
Uso Previsto
FA
FA
B
El kit ImmunoComb® II Anti-HBs es una prueba cuantitativa
rápida para la detección de anticuerpos contra el antígeno de
superficie de la Hepatitis B en suero o plasma humano.
B SA
SA
Reacción enzimática de color;
10 min/37°C
FA
El vírus de la hepatitis B (HBV) pertenece a una nueva familia de
vírus de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un
marcado hepatotropismo y un singular medio de replicación a
través de un mecanismo de transcripción inversa. El virión
completo, o partícula Dane, consiste de una molécula de ADN
circular protegida por un antígeno nucleocáspide/nuclear (HBcAg)
y rodeada por un envoltorio de lipoproteína conocido como
antígeno de superficie (HBsAg). El HBsAg también se encuentra
en la sangre en forma de partículas incompletas esféricas o
filamentosas no infecciosas. Un componente menor del
nucleocáspide HBV, el antígeno HBe (HBeAg), también puede
detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus.
El vírus de la hepatitis B es un vírus ubicuo de distribución global.
Las principales rutas de trasmisión viral son horizontales, a través
de la contaminación sexual y parenteral, y vertical, a través de la
trasmisión prenatal de la madre infectada al feto.
Las consecuencias clínicas de la infección de HBV varían entre
las totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis
ictérica aguda. La mayoría de los pacientes se recuperan
completamente seis meses después del comienzo de la
enfermedad. Una pequeña proporción de la población infectada
(<1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante, a menudo con
consecuencias fatales. En una proporción sustancial (hasta 10%)
de los pacientes adultos, el HBV puede persistir, progresando
eventualmente hasta la hepatitis crónica con desarrollo final de
cirrosis y hépatocarcinoma. Los portadores crónicos de hepatitis B
(200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva
del virus y contribuyen a la diseminación de la enfermedad.
Los anticuerpos contra HBsAg (anti-HBs) son los principales
anticuerpos neutralizadores de HBV, que usualmente persisten
durante toda la vida y protegen contra la reinfección. El nivel de
anti-HBs, por lo tanto, sirve como un indicador para evaluar la
recuperación de la infección de HBV, o el éxito de la vacunación
utilizando partículas de HBsAg. Concentraciones de anticuerpos
de ≥10 IU/L indican inmunidad al HBV.
Principio de la Prueba
®
La prueba ImmunoComb II Anti-HBs es un inmunoensayo
enzimático de fase sólida (EIA), basado en un principio de
reconocimiento doble. La fase sólida es un Peine con
12 proyecciones ("dientes").
Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas:
punto superior — albúmina de suero bovino biotinilada (Control Interno)
punto inferior — HBsAg recombinante
Unión de la estreptavidina-FA;
20 min/37°C
estreptavidina
(SA) - FA
Introducción
60453002/S16/OR/CE
Unión del HBsAg biotinilado;
30 min/37°C
B
B
B SA
sustrato
cromogénico
Figura 1. Principio de la Prueba
El kit incluye un Control Positivo (anti-HBs) y un Control Negativo,
que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al término de
ésta, el diente utilizado con el Control Positivo debe mostrar dos
puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Control Negativo
debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue o la
ausencia del mismo. El punto superior también deberá aparecer en
todos los demás dientes para confirmar que el kit funciona
apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente.
Contenido del Kit
Peines
El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes,
uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente es sensibilizado en
dos areas reactivas:
punto superior — albúmina de suero bovino biotinilada
(Control Interno)
punto inferior — HBsAg recombinante
ImmunoComb® II
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Control Interno
HBsAg recombinante
Figura 2. Peine
Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que
contienen una bolsa desecante.
Bandejas de Desarrollo
El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertas con papel de
aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos
los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo
consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una.
1
Los contenidos de cada fila son los siguientes:
Fila A diluyente de la muestra
Fila B solución de lavado
Fila C HBsAg biotinilado
Fila D estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina
Fila E solución de lavado
Fila F solución de sustrato cromogénico que contiene
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul
tetrazolio (NBT)
Figura 3. Bandeja de Desarrollo
Control Positivo — 1 frasco (tapa roja) de 1,5 mL, de plasma
humano inactivado con calor, diluído a un nivel crítico de 10 IU/mL
para anti-HBs.
Control Negativo — 1 frasco (tapa verde) de 1,5 mL de plasma
humano diluído, inactivado con calor y negativo a anti-HBs.
Perforador — para perforar el papel de aluminio que cubre los
pocillos de la Bandeja de Desarrollo.
CombScale™ — para leer los resultados de la prueba.
Seguridad y Precauciones
•
•
•
•
•
•
Todos los materiales de origen humano usados en la preparación
del kit pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a
HBsAg, así como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C.
Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo
la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de
referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas
como si fueran potencialmente infecciosas.
Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los
procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con
suero o plasma humano.
No use la pipeta aspirando con la boca.
Deseche todas las muestras, Peines* usados, Bandejas de
Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos
biocontaminantes.
No mezcle reactivos de lotes diferentes.
No use este kit luego de la fecha de caducidad.
Procedimiento de la Prueba
Equipo Necesario
•
•
•
Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables con
capacidad de 100 μl.
Tijeras
Cronómetro de laboratorio o reloj.
Preparación para la Prueba
Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente
y realice la prueba a temperatura 37°C.
Preparacion de la Bandeja de Desarrollo
1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37°C por
45 minutos.
2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado
como desecho biocontaminante al concluir la prueba.
3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo.
Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo;
rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador,
sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen.
Preparación del Peine
Precaución: para asegurar el funcionamiento apropiado de la
prueba, no toque los dientes del Peine.
1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine.
2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o
solamente una parte. Para utilizar parte del Peine:
a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las
muestras y los controles. Se necesita un diente para cada
prueba. Cada diente tiene impreso el número de código del
kit, "53", para permitir la identificación de los dientes sueltos.
b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con
tijeras (ver Figura 4) para separar el número requerido
para las pruebas (Nro. de pruebas mas 2 controles).
c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el
empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre
bien el envoltorio (con un clip, por ejemplo) a fin de
mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original
del kit a temperaturas de 2° a 8°C para su uso posterior.
ImmunoComb® II
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Conservación y estabilidad del kit
•
•
•
•
•
•
El kit es enviado a 2-8º C. Durante el transporte el kit puede
ser conservado a menos de 30º C durante cortos períodos de
tiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internos
indican que el kit no ha sido dañado durante el transporte.
Conservar el kit en su caja original a 2-8º C.
No congelar el kit.
Después de abrir el kit inicialmente, los componentes deben
ser conservados a 2-8º C.
El funcionamiento del kit después de su apertura inicial, es
estable hasta la fecha de caducidad del mismo si se
conserva a 2-8º C.
Después del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos no
pueden ser utilizados más de tres veces.
Manejo de las Muestras
• Es posible usar suero o plasma en la prueba.
• Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a
temperaturas de 2° a 8°C antes de la prueba. Para almacenar
las muestras por más de 7 días, congélelas a -20°C o a
temperaturas más bajas.
• Todas las muestras congeladas deben centrifugarse a 10.000
rpm, por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover
cuidadosamente el líquido sobrenadante. Si se forma una
capa de lípidos en la superficie, asegurese de tomar la
muestra del líquido claro debajo de la capa. Evite congelar y
descongelar repetidamente.
• Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han
mostrado tener efecto sobre los resultados del test.
Figura 4. Fraccionamiento del Peine
Instrucciones de la Prueba
Nota: Realice las incubaciones a 37°C. Las etapas de lavado
deben llevarse a cabo a temperatura ambiente (22°–26°C).
Reacción Antígeno-Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo)
1. Pipetee 100 μl de muestra. Perfore la cubierta de papel aluminio
en un pocillo de la fila A de la Bandeja de Desarrollo con la punta
de la pipeta o el perforador y vierta la muestra en el fondo del
pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución
con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta.
2. Repita el paso 1 para las demás muestras. Use un nuevo pocillo
en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o
control.
3. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los
pocillos de la Fila A conteniendo las muestras y controles.
Mezcle: retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces.
b. Deje el Peine en la Fila A e incube por 120 minutos a 37°C.
Programe el cronómetro. Hacia el final de los
120 minutos, perfore el papel de aluminio de la Fila B
usando el perforador. No abra más pocillos de los
necesarios.
c. Al cumplirse los 120 minutos, saque el Peinte de la Fila A.
Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes
apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque
la superficie frontal del diente.
Primer Lavado (Fila B)
4. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Agite: inserte y retire
vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos 10 segundos
para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces
agitando en el trascurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el
* A menos que sea archivado para consulta posterior
60453002/S16/OR/CE
2
papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y
absorba el líquido adherido como en el paso 3c.
Unión del HBsAg Biotinilado (Fila C)
5. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle igual que
en el paso 3a. Incube la Bandeja de Desarrollo con el Peine
por 30 minutos (use el cronómetro) a 37°C. Perfore el papel
aluminio de la fila D. Después de 30 minutos, retire el Peine y
absorba el líquido adherido.
Unión de la Estreptavidina /Fosfatasa alcalina (Fila D)
6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Mezcle. Incube la
Bandeja de Desarrollo con el Peine por 20 minutos (use el
cronómetro) a 37°C. Perfore el papel aluminio de la fila E.
Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido
adherido.
Segundo Lavado (Fila E)
7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite
repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 4.
Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Después
de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido.
Reacción de Color (Fila F)
8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Incube la Bandeja
de Desarrollo con el Peine por exactamente 10 minutos (use el
cronómetro) a 37°C. Después de 10 minutos, retire el Peine.
Detención de la Reacción (Fila E)
9. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Después de un minuto,
retire el Peine y déjelo secar al aire.
Interpretación Semicuantitativa por Lectura Visual
El nivel de anti-HBs en cada muestra puede ser evaluado
comparando la intensidad del color del punto inferior en cada
diente, con la escala de color del CombScale™ suministrado con
el kit. Esto se hace como sigue (Figura 7):
Calibración del CombScale™
1. Calibre el CombScale™. Coloque el punto inferior en el diente del
Control Positivo bajo la intensidad de color más similar en la
escala de colores. Ajuste la regla hasta que aparezca la lectura
"10; C+" en la ventanilla sobre la intensidad de color seleccionada.
2. Lea los resultados sin cambiar la posición calibrada de la regla.
Compare la intensidad de color de cada punto inferior con la
intensidad más similar en la escala de colores. Registre el valor
indicado en la ventanilla sobre esa intensidad como el título
aproximado de anti-HBs para la muestra correspondiente.
Orgenics CombScale™
ANTI-HBs IU/L
5
Resultados de la Prueba
Para confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y
demostrar la validez de los resultados, deben cumplirse las
siguientes tres condiciones (ver Figura 5):
1. El Control Positivo debe producir dos puntos en el diente del
Peine.
2. El Control Negativo debe producir un punto superior
(Control Interno). El punto inferior no aparece o aparece muy
ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados.
3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior
(Control Interno).
Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la
prueba no son válidos y las muestras y controles deben ser
reexaminados.
Control
Negativo
Resultados
Inválidos
Figura 5. Validación de la Prueba
Lectura e Interpretación de los Resultados
Lectura Cualitativa
Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de la muestra
con la del punto inferior al diente del Control Positivo (Figura 6)
• Un punto con una intensidad mayor que o igual a la del Control
Positivo indica la presencia de anti-HBs a un título de ≥ 10 IU/L.
• Un punto con una intensidad menor que la del Control
Positivo es considerado como un resultado negativo.
≤
Resultado Negativo
50
100
Figura 7. CombScale™
Documentación de los Resultados
Debido a que el color que aparece en los Peines es estable, es
posible archivar los Peines para consulta posterior.
Limitaciones
Como ocurre con otras pruebas ideadas para ser usadas en
diagnósticos in vitro, los resultados de esta prueba deben ser
evaluados en relación con todos los síntomas, historial clínico y
otras pruebas de laboratorio del paciente.
Características del Ensayo*
Validación
Control
Positivo
25
™
Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit
Bandeja de Desarrollo
Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede
almacenarla para ser usada posteriormente:
• Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de
que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de
que la Bandeja de Desarrollo sea volcada.
Otros Materiales del Kit
• Vuelva a colocar la(s) Bandejas(s) de Desarrollo, Peine(s),
perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit
y almacene a temperaturas de 2°C a 8°C.
10
C+
Control
Muestra
Positivo
Anti-HBs a titulo de = 10 IU/L
Figura 6. Resultados de la Prueba
®
La sensibilidad y especificidad del kit ImmunoComb II
Anti-HBs fueron evaluadas en un panel de 170 muestras de
suero, en comparación con dos ensayos de referencia EIA. Los
resultados combinados son resumidos en la Tabla 2.
Tabla 2. Resultados de la Prueba
®
Ensayo de Referencia
ImmunoComb II Anti-HBs
Positivo
Negativo
Positivo
50
0
Negativo
2
118
Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los
siguientes reultados:
• Sensibilidad — 100 %
• Especificidad — 98.3 %
Repetibilidad
Cada uno de 6 sueros fue evaluado 12 veces en un solo peine, y
los resultados fueron cuantificados en lectura de absorbancia.
El CV de la medida de los valores no excedió el 10 %.
Reproducibilidad
Seis sueros fueron evaluados por duplicado en 10 kits separados,
y los resultados fueron cuantificados en lectura de absorbancia. El
coeficiente de variación (% C.V.) de los resultados no excedió el
10% .
Reacción cruzada
Reacción cruzada con muestras positivas para agentes tales
como el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis C,
citomegalovirus y toxoplasma no fueron significativas.
Interferencia
No se observó interferencia en muestras hemolisadas
(hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta
* Datos detallados disponibles
60453002/S16/OR/CE
3
281.6 mg/dL; Triglicéridos hasta 381.0 mg/dL) y bilirubina alta
(hasta 20 mg/dl).
Bibliografía
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McMillan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted
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Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical
Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology,
Washington, DC. pp 959-983.
Leyenda de los símbolos
®
CARD
ImmunoComb tarjeta
PLATE
Bandejas de Desarrollo
CONTROL
CONTROL
+
-
PERFORATOR
IVD
Control positivo
Control negativo
Perforador
Consulte las instrucciones de
uso
Atención,ver instrucciones de
uso
Producto sanitario para
diagnóstico in vitro
Limite de temperatura
Σ
n
Contenido suficiente para n
ensayos
Fabricante
Representante autorizado en
la Comunidad Europea
REF
Número de catálogo
COMBSCALE
CombScale
LOT
™
Código de lote
Fecha de caducidad
Numero de serie
Version: 60453002/S16/OR/CE
(03/2009)
60453002/S16/OR/CE
4
Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba
1
2
Preincubación de la Bandeja de
Desarrollo: 45 minutos a 37°C
Tomar muestras y controles
5
Agregar las muestras y
controles a la Fila A.
Mezclar
6
Insertar el Peine y mezclar en la
Fila A. Incubar a 37°C
Sacar el Peine del
empaque
8
7
Perforación de la Fila B
Luego de mezclar/agitar
e incubar en las Filas
C, D y E …
4
3
Absorber el líquido
adherido a los dientes
10
9
Reacción de color en la Fila F
Insertar el Peine y Agitar
en la Fila B. Incubar
Resultados
Resumen del Procedimiento de la Prueba
Las instrucciones abreviadas abajo son para los usuarios experimentados en el uso del kit
®
ImmunoComb II Anti-HBs.
(Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo)
1. Incube la Bandeja de Desarrollo en un incubador a 37ºC por 45 minutos.
2. Vierta 100 µl de cada muestra y control en los pocillos de la Fila A de la Bandeja de Desarrollo y
mezcle.
3. Inserte el Peine en la Fila A y continúe como se describe en la Tabla 1.
Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba
Paso
Fila
Proceda como sigue
Reacción Antígeno-Anticuerpo
A
Mezcle;incube 2 horas a 37ºC; absorba.
Lavado
B
Agite; incube 2 minutos; absorba.
Unión de HBsAg biotinilado
C
Mezcle; incube 30 minutos a 37ºC; absorba.
Unión de estreptavidina/
fosfatasa alcalina
D
Mezcle; incube 20 minutos a 37ºC; absorba.
Lavado
E
Agite; incube 2 minutos; absorba.
Reacción de color
F
Mezcle; incube 10 minutos a 37ºC.
Detención de la reacción
E
Incube 1 minuto; seque al aire.
1
2
Manera de romper el Peine
60453002/S16/OR/CE
5