Papel de la vía de señalización Sonic Hedgehog (Shh) en el

Papel de la vía de señalización Sonic Hedgehog (Shh) en el comportamiento
de células troncales musculares de ratón.
Sara Betania Cruz-Migoni, Universidad de Sheffield.
El músculo esquelético es el tejido más abundante del cuerpo, pues representa alrededor del
40% del peso total de un individuo. Este tejido no sólo es responsable del soporte y de la
locomoción de un organismo, sino que también es esencial en el mantenimiento y en la
regulación de funciones metabólicas. Dada la complejidad de este sistema, la pérdida de
actividad muscular puede traer consigo efectos devastadores en la capacidad del cuerpo para
funcionar, yendo desde debilitamiento y dolor hasta la pérdida de movimiento o parálisis.
La musculatura esquelética puede verse afectada por diversos desórdenes fisiológicos
como denervaciones, distrofias musculares, cáncer y pérdida de masa muscular asociada a la
edad (sarcopenia). Además, los músculos se someten constantemente a presiones mecánicas y
deben adaptarse a cambios drásticos durante el crecimiento y el ejercicio físico. De manera
interesante, el músculo esquelético adulto es capaz de regenerarse en respuesta al daño, a
lesiones y a enfermedades. Lo anterior se debe principalmente a la existencia de células
troncales específicas conocidas como células satélite1. Estas células se encuentran en una
posición peculiar dentro del músculo esquelético, empaquetadas por tejido conectivo
alrededor de la membrana citoplasmática de las fibras musculares. En el ratón, cada fibra
muscular contiene de 6 a 7 células satélite, por lo que se estima que éstas son las células
troncales tejido-específicas más abundantes en mamíferos y probablemente en la mayoría de
los vertebrados2.
Las células satélite se encuentran en el músculo adulto normal en un estado quiescente,
es decir, sin dividirse, y sólo se activan y multiplican en respuesta a estímulos externos
generados durante el crecimiento, el estrés y el trauma físico. Como ocurre con otras células
troncales, las células satélite se dividen para dar origen a dos tipos de progenie. Por un lado,
estas células se auto-renuevan para generar más células troncales y también producen células
hijas capaces de transformarse en células musculares maduras3. Estas últimas se multiplican
rápidamente, expresan proteínas específicas del músculo esquelético y finalmente se
diferencian hasta fusionarse para reparar fibras musculares dañadas. Reportes recientes
1
Mauro, A. 1961. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol 9, 493-5.
Tedesco, F. et al. 2010. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J Clin
Invest 120, 11-9. 3 Shinin, V. et al. 2006. Asymmetric division and cosegregation of template DNA strands in adult muscle
satellite cells. Nat Cell Biol 8, 677-87.
2
señalan que la regeneración muscular in vivo depende totalmente de las células satélite, las
cuales pueden llevar a cabo ciclos múltiples de regeneración sin agotar sus reservas dentro del
músculo4. Así, las células satélite son excelentes candidatos para tratar músculos lesionados o
enfermos. No obstante, la efectividad de futuras terapias reside en el grado de entendimiento
de las señales y moléculas que controlan o modifican el microambiente donde se encuentran
dichas células, así como su activación y expansión y cómo estas señales pueden promover
respuestas específicas durante trasplantes o tratamientos de regeneración in situ.
La regeneración celular en el músculo esquelético adulto comparte muchas similitudes
con la formación de tejido muscular (miogénesis) en el embrión. De hecho, se considera que
la activación y la diferenciación subsecuente de las células satélite en células musculares
maduras recapitula, en cierta medida, el desarrollo muscular embrionario. De manera
importante, se han descrito diferentes señales extrínsecas que controlan la miogénesis en el
embrión. Tal es el caso de las vías de señalización, las cuales son mecanismos de
comunicación celular necesarios para transmitir, amplificar, distribuir y modular señales
provenientes de una célula a otra y así llevar a cabo funciones fundamentales como división,
migración, metabolismo, supervivencia, muerte y diferenciación celular. La cascada de
señalización denominada Sonic Hedgehog (Shh), por ejemplo, es una vía de comunicación
celular esencial durante el desarrollo embrionario, pues controla la formación de los sistemas
nervioso, muscular y digestivo. En esta vía participan diferentes actores, desde proteínas que
fungen como mensajeros y receptores, hasta moléculas que activan o reprimen la expresión de
genes necesarios para la proliferación y la diferenciación celular. La pérdida de la actividad
de Shh en humanos resulta en malformaciones del cráneo y de la cara, así como defectos en el
sistema nervioso central y en los músculos5. En contraste, un incremento excesivo en la
actividad de esta vía contribuye a la aparición de diversos tipos de cáncer, debido a un
aumento descontrolado en la tasa de división celular.
En el embrión, la vía de señalización Shh controla genes que promueven la formación
de la musculatura esquelética6 , así como genes que codifican componentes de la matriz
extracelular, la cual es una red tridimensional de proteínas y moléculas necesarias para el
4
Lepper, C. et al. 2011. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal
muscle regeneration. Development 138, 3639-4 5
Ingham, P. et al. 2001. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes Dev
15(23): 3059-3087.
6 Borycki, A.G. et al. 1998. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response
genes. Development 125, 777-90. soporte y la correcta migración de las células progenitoras musculares durante el desarrollo7.
En el músculo adulto se sabe que los componentes de la vía Shh se expresan en respuesta a
lesiones así como en células satélite activadas (mioblastos); sin embargo, el papel de esta vía
en el comportamiento y funcionamiento de dichas células ha sido poco caracterizado. En
particular, preguntas fundamentales acerca de la capacidad de la vía Shh para afectar la
proliferación o diferenciación celular durante la regeneración muscular permanecen sin
contestar.
En este trabajo, planteo como hipótesis que la vía de señalización de Shh controla la
función de las células satélite en músculos adultos de mamífero de manera reminiscente a su
efecto en células progenitoras musculares en el embrión. Así, mi objetivo es investigar la
expresión de los componentes de la vía Shh en células satélite en estado quiescente y
activadas. Además pretendo esclarecer el papel de esta vía de señalización en el
comportamiento de las células troncales musculares durante su proliferación y diferenciación.
Para lograr mi objetivo he empleado como estrategia experimental un sistema de cultivo
basado en el uso de fibras musculares de ratón, el cual nos permite estudiar la miogénesis
mediada por las células satélite ex vivo. Adicionalmente, planeo corroborar la influencia de
esta cascada en las células satélite in vivo a través del uso de ratones transgénicos que tengan
afectada o sobre activada la vía Shh específicamente en células troncales musculares.
La parte experimental ex vivo ha consistido en el uso de ratones adultos jóvenes, tanto
de cepas silvestres como modificadas genéticamente. A estos ratones se les ha diseccionado el
músculo esquelético extensor digital largo (EDL), el cual se sitúa en la parte inferior de la
pierna. Este músculo es fácil de separar y posee fibras musculares lo suficientemente largas
para ser analizadas en cultivo. Una vez extraído, el músculo se incuba en una solución
enzimática para digerir el tejido conectivo que lo rodea. Finalmente, las fibras musculares se
aíslan manualmente por acción mecánica y posteriormente se incuban en condiciones
fisiológicas por periodos de tiempo determinados. Interesantemente, el sistema de cultivo de
fibras musculares recapitula los mecanismos moleculares que ocurren durante la regeneración
muscular in vivo. En este sistema, las células satélites mantienen su posición nativa dentro de
la fibra muscular y pueden diferenciarse en respuesta a las condiciones de cultivo. De manera
importante, las fibras pueden colectarse a diferentes intervalos de tiempo, lo cual permite el
análisis de eventos celulares discretos tales como quiescencia (fibras recién aisladas),
7 Anderson, C. et al. 2009. Sonic hedgehog-dependent synthesis of laminin alpha1 controls basement membrane
assembly in the myotome. Development 136, 3495-504. activación (24 horas), proliferación (48 horas) y diferenciación (72 horas)8. Además, cada uno
de estos eventos puede ser identificado con ayuda de proteínas específicas, como los
marcadores de células satélite Pax7 y Caveolina y los marcadores de diferenciación muscular
como Myf5, MyoD y Miogenina. Consecuentemente, las fibras musculares cultivadas
siguiendo este protocolo pueden ser analizadas con diferentes propósitos. Por un lado pueden
manipularse en cultivo al agregar sustancias que activen o bloqueen vías de señalización o
funciones como la división o la muerte celular. Posteriormente, estas fibras pueden marcarse
con anticuerpos específicos para detectar la expresión de diferentes proteínas por microscopía
de fluorescencia y cuantificar la población celular afectada después de un tratamiento dado.
Adicionalmente, las fibras pueden procesarse para aislar material genético (ARN) y estudiar
su perfil de expresión por técnicas moleculares cualitativas y cuantitativas.
Los datos preliminares obtenidos durante la experimentación ex vivo indican que los
componentes de las vía de señalización Shh se expresan en fibras musculares que poseen
células satélites en estado quiescente, incrementando su expresión durante la proliferación y
diferenciación de las mismas. Por otro lado, se ha encontrado que la estimulación de la vía
Shh a través del uso de agonistas resulta en un incremento en el número de células satélite en
proceso de diferenciación, efecto que puede ser contrarrestado con el uso de diferentes
antagonistas específicos de la cascada. Estos resultados indican que la vía de señalización Shh
tiene un efecto en el comportamiento de las células satélite y que dicha vía puede tener un
posible papel en la activación y la expansión de estas células en respuesta a su estimulación.
Finalmente, dadas las funciones críticas de la vía de señalización Shh en la miogénesis
embrionaria, resulta imperativo aclarar el papel de dicha vía en la regeneración muscular
adulta, sobre todo en el contexto de las enfermedades musculares degenerativas y el cáncer
muscular. Además, es importante descifrar la función de la cascada de señalización Shh en la
miogénesis adulta para entender éste y otros sistemas de células troncales tejido-específicas.
Finalmente, el impacto de esta investigación radicará en la identificación y la imitación
eventual de los requerimientos biológicos de las células satélite para su uso terapéutico.
8 Zammit, P. et al. 2004. Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal? J Cell Biol
166, 347-57.